CA2858465A1 - Procedes pour le diagnostic et le suivi therapeutique de dystrophies musculaires - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne le diagnostic, le suivi et l'évaluation de l'efficacité d'un traitement d'une dystrophie musculaire par détection de microARN dans un liquide corporel, notamment dans l'urine.
Description
PROCEDES POUR LE DIAGNOSTIC ET LE SUIVI THERAPEUTIQUE DE
DYSTROPHIES MUSCULAIRES
DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention concerne le diagnostic, le suivi et l'évaluation de l'efficacité
d'un traitement d'une dystrophie musculaire par détection de microARN dans un liquide corporel, notamment dans l'urine.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les dystrophies musculaires de Duchenne (DMD) ou de Becker (BMD) sont causées par des mutations ou des délétions du gène codant la dystrophine (Muntoni, Torelli et al. 2003). Dans le premier cas, où le phénotype est le plus sévère, la dystrophine est totalement absente. Le complexe DAPC (Dystrophine Associated Protein Complex), qui permet de relier les filaments intracellulaires d' actine à la matrice extracellulaire (Le Rumeur, Winder et al.), est également manquant. Ce complexe protège habituellement la membrane des fibres musculaires qui sont soumises aux contractions et aux relâchements. En son absence, les fibres ne sont plus protégées, on observe dans les muscles des cellules musculaires en dégénérescence et des nouvelles cellules qui témoignent d'une régénération tendant à
contrebalancer le phénomène (Batchelor and Winder 2006). A terme, la régénération est insuffisante et les fibres sont remplacées par du tissus adipeux.
Sur le plan thérapeutique, de grands espoirs reposent actuellement sur la technique du saut d' exon (Cirak, Arechavala-Gomeza et al.; Lu, Yokota et al.). En effet, la BMD, qui mène à un phénotype moins grave, est également due à une ou plusieurs mutations dans le gène codant pour la dystrophine mais les domaines fondamentaux de la protéine sont conservés :
- un domaine N-terminal de liaison aux filaments d' actine, - un domaine C-terminal riche en cystéines qui se lie au complexe DAPC.
Pour les patients DMD, il est donc possible d'obtenir un phénotype Becker en excluant les exons porteurs de mutations non-sens au sein des ARN messagers (ARNm) et ainsi rétablir le cadre de lecture ouvert. La protéine produite, plus courte, est alors partiellement fonctionnelle. Cette stratégie est actuellement testée via plusieurs essais cliniques.
DYSTROPHIES MUSCULAIRES
DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention concerne le diagnostic, le suivi et l'évaluation de l'efficacité
d'un traitement d'une dystrophie musculaire par détection de microARN dans un liquide corporel, notamment dans l'urine.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les dystrophies musculaires de Duchenne (DMD) ou de Becker (BMD) sont causées par des mutations ou des délétions du gène codant la dystrophine (Muntoni, Torelli et al. 2003). Dans le premier cas, où le phénotype est le plus sévère, la dystrophine est totalement absente. Le complexe DAPC (Dystrophine Associated Protein Complex), qui permet de relier les filaments intracellulaires d' actine à la matrice extracellulaire (Le Rumeur, Winder et al.), est également manquant. Ce complexe protège habituellement la membrane des fibres musculaires qui sont soumises aux contractions et aux relâchements. En son absence, les fibres ne sont plus protégées, on observe dans les muscles des cellules musculaires en dégénérescence et des nouvelles cellules qui témoignent d'une régénération tendant à
contrebalancer le phénomène (Batchelor and Winder 2006). A terme, la régénération est insuffisante et les fibres sont remplacées par du tissus adipeux.
Sur le plan thérapeutique, de grands espoirs reposent actuellement sur la technique du saut d' exon (Cirak, Arechavala-Gomeza et al.; Lu, Yokota et al.). En effet, la BMD, qui mène à un phénotype moins grave, est également due à une ou plusieurs mutations dans le gène codant pour la dystrophine mais les domaines fondamentaux de la protéine sont conservés :
- un domaine N-terminal de liaison aux filaments d' actine, - un domaine C-terminal riche en cystéines qui se lie au complexe DAPC.
Pour les patients DMD, il est donc possible d'obtenir un phénotype Becker en excluant les exons porteurs de mutations non-sens au sein des ARN messagers (ARNm) et ainsi rétablir le cadre de lecture ouvert. La protéine produite, plus courte, est alors partiellement fonctionnelle. Cette stratégie est actuellement testée via plusieurs essais cliniques.
2 Une surveillance médicale régulière, pluridisciplinaire, permet d'évaluer l'évolution de la pathologie et de proposer une prise en charge permettant d'améliorer la vie des patients. Il s'agit de prévention des rétractions, d'apport d'aides techniques, kinésithérapie, surveillance cardiaque, orthopédie et aide respiratoire. Le suivi diagnostique est réalisé
entre autre par l'évaluation des fonctions motrices, par des biopsies musculaires ou par le dosage d'une enzyme sécrétée dans la circulation, la créatine kinase (Bushby, Finkel et al.).
L'analyse de biopsie musculaire permet d'observer les fibres lésées, des fibres plus petites témoignant de la régénération musculaire, ainsi que des zones de nécrose remplacées par du tissu adipeux. Cette méthode a pour inconvénient d'être très invasive pour le patient.
Une autre méthode consiste à doser la créatine kinase (CK) dans le sang. Cette enzyme est liée au métabolisme énergétique présent dans plusieurs types de cellules.
L'augmentation de sa concentration dans le sang témoigne de l'état de dégradation des fibres musculaires.
Cependant, ce biomarqueur n'est pas totalement fiable car son niveau dépend également de stress comme l'activité physique (Nicholson, Morgan et al. 1986). Il existe d'autres enzymes telles que l'aldolase ou la lactate déshydrogénase mais, comme pour la CK, leur abondance n'est pas uniquement dépendante de l'état pathologique (Lott and Landesman 1984).
Par conséquent, il apparait nécessaire d'identifier de nouveaux biomarqueurs plus fiables dans le cadre de la dystrophie musculaire de Duchenne, marqueurs qui pourraient être dosés à
partir de prélèvements non invasifs, comme le prélèvement d'urine.
Les microARN (ou miARN) sont des biomarqueurs prometteurs. Ils sont exprimés dans tous les tissus de l'organisme et notamment dans le muscle squelettique. On sait également qu'ils existent à l'état circulant dans tous les fluides biologiques (Weber, Baxter et al.). Des travaux récents de la littérature ont montré qu'il existait une signature spécifique de la myopathie de Duchenne dans le muscle (Cacchiarelli, Martone et al.; Greco, De Simone et al.
2009) et dans le sérum (Cacchiarelli, Legnini et al.).
A ce jour, aucune étude n'a montré l'utilisation potentielle des miARN comme marqueurs de dystrophies musculaires dans l'urine. Les inventeurs ont étudié le profil de présence de miARN dans l'urine de patients atteints d'une dystrophie musculaire afin d'identifier une signature spécifique de ce type de pathologies.
entre autre par l'évaluation des fonctions motrices, par des biopsies musculaires ou par le dosage d'une enzyme sécrétée dans la circulation, la créatine kinase (Bushby, Finkel et al.).
L'analyse de biopsie musculaire permet d'observer les fibres lésées, des fibres plus petites témoignant de la régénération musculaire, ainsi que des zones de nécrose remplacées par du tissu adipeux. Cette méthode a pour inconvénient d'être très invasive pour le patient.
Une autre méthode consiste à doser la créatine kinase (CK) dans le sang. Cette enzyme est liée au métabolisme énergétique présent dans plusieurs types de cellules.
L'augmentation de sa concentration dans le sang témoigne de l'état de dégradation des fibres musculaires.
Cependant, ce biomarqueur n'est pas totalement fiable car son niveau dépend également de stress comme l'activité physique (Nicholson, Morgan et al. 1986). Il existe d'autres enzymes telles que l'aldolase ou la lactate déshydrogénase mais, comme pour la CK, leur abondance n'est pas uniquement dépendante de l'état pathologique (Lott and Landesman 1984).
Par conséquent, il apparait nécessaire d'identifier de nouveaux biomarqueurs plus fiables dans le cadre de la dystrophie musculaire de Duchenne, marqueurs qui pourraient être dosés à
partir de prélèvements non invasifs, comme le prélèvement d'urine.
Les microARN (ou miARN) sont des biomarqueurs prometteurs. Ils sont exprimés dans tous les tissus de l'organisme et notamment dans le muscle squelettique. On sait également qu'ils existent à l'état circulant dans tous les fluides biologiques (Weber, Baxter et al.). Des travaux récents de la littérature ont montré qu'il existait une signature spécifique de la myopathie de Duchenne dans le muscle (Cacchiarelli, Martone et al.; Greco, De Simone et al.
2009) et dans le sérum (Cacchiarelli, Legnini et al.).
A ce jour, aucune étude n'a montré l'utilisation potentielle des miARN comme marqueurs de dystrophies musculaires dans l'urine. Les inventeurs ont étudié le profil de présence de miARN dans l'urine de patients atteints d'une dystrophie musculaire afin d'identifier une signature spécifique de ce type de pathologies.
3 Par ailleurs, les inventeurs ont également recherché de nouveaux marqueurs circulants des dystrophie musculaires.
RESUME DE L'INVENTION
Les inventeurs ont notamment étudié des échantillons d'urine de patients DMD
afin de déterminer si des miARN spécifiques de cette pathologie pouvaient être identifiés. Ces travaux ont permis de mettre en évidence une signature spécifique relative à
l'abondance de certains miARN dans l'urine de patients DMD par rapport à l'urine de donneurs sains.
La constatation d'une telle variation de l'expression d'un ou plusieurs miARN
chez un individu malade par rapport à un individu sain trouve une application dans le domaine du diagnostic. La présente invention se rapporte ainsi à l'utilisation d'au moins un miARN choisi parmi les miARN du tableau 1, pour la mise en oeuvre d'un procédé de diagnostic d'une dystrophie musculaire. Elle concerne par ailleurs l'utilisation d'un ou plusieurs desdits miARN
pour l'évaluation du risque de développer ou présenter une dystrophie musculaire.
Tableau 1:
miARN urinaire séquence seq id#
hsa-let-7a UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 1 hsa-let-7b UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU 2 hsa-let-7c UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU 3 hsa-let-7d AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU 4 hsa-let-7e UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU 5 hsa-let-7f UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU 6 hsa-let-7g UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU 7 hsa-miR-1244 AAGUAGUUGGUUUGUAUGAGAUGGUU 8 hsa-miR-139-5p UCUACAGUGCACGUGUCUCCAGU 9 hsa-miR-151-5p UCGAGGAGCUCACAGUCUAGU 10 hsa-miR-155 UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU 11 hsa-miR-15a UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG 12 hsa-miR-15b UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA 13 hsa-miR-182 UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU 14 hsa-miR-183 UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU 15 hsa-miR-192* CUGCCAAUUCCAUAGGUCACAG 16 hs a-miR-193 a-3p AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU 17 hsa-miR-196b UAGGUAGUUUCCUGUUGUUGGG 18 hsa-miR-198 GGUCCAGAGGGGAGAUAGGUUC 19 hsa-miR-200b* CAUCUUACUGGGCAGCAUUGGA 20
RESUME DE L'INVENTION
Les inventeurs ont notamment étudié des échantillons d'urine de patients DMD
afin de déterminer si des miARN spécifiques de cette pathologie pouvaient être identifiés. Ces travaux ont permis de mettre en évidence une signature spécifique relative à
l'abondance de certains miARN dans l'urine de patients DMD par rapport à l'urine de donneurs sains.
La constatation d'une telle variation de l'expression d'un ou plusieurs miARN
chez un individu malade par rapport à un individu sain trouve une application dans le domaine du diagnostic. La présente invention se rapporte ainsi à l'utilisation d'au moins un miARN choisi parmi les miARN du tableau 1, pour la mise en oeuvre d'un procédé de diagnostic d'une dystrophie musculaire. Elle concerne par ailleurs l'utilisation d'un ou plusieurs desdits miARN
pour l'évaluation du risque de développer ou présenter une dystrophie musculaire.
Tableau 1:
miARN urinaire séquence seq id#
hsa-let-7a UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 1 hsa-let-7b UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU 2 hsa-let-7c UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU 3 hsa-let-7d AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU 4 hsa-let-7e UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU 5 hsa-let-7f UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU 6 hsa-let-7g UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU 7 hsa-miR-1244 AAGUAGUUGGUUUGUAUGAGAUGGUU 8 hsa-miR-139-5p UCUACAGUGCACGUGUCUCCAGU 9 hsa-miR-151-5p UCGAGGAGCUCACAGUCUAGU 10 hsa-miR-155 UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU 11 hsa-miR-15a UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG 12 hsa-miR-15b UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA 13 hsa-miR-182 UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU 14 hsa-miR-183 UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU 15 hsa-miR-192* CUGCCAAUUCCAUAGGUCACAG 16 hs a-miR-193 a-3p AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU 17 hsa-miR-196b UAGGUAGUUUCCUGUUGUUGGG 18 hsa-miR-198 GGUCCAGAGGGGAGAUAGGUUC 19 hsa-miR-200b* CAUCUUACUGGGCAGCAUUGGA 20
4 hs a-miR-206 UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG 21 hs a-miR-208 AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU 22 hs a-miR-214 UGCCUGUCUACACUUGCUGUGC 23 hs a-miR-216b AAAUCUCUGCAGGCAAAUGUGA 24 hs a-miR-220 CCACACCCiUAUCUCiACACUUU 25 hs a-miR-224 CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU 26 hs a-miR-23a AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC 27 hs a-miR-23b AUCACAUUGCCAGGGAUUACC 28 hs a-miR-26b UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU 29 hsa-miR-28-5p AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG 30 hs a-miR-30d UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG 31 hs a-miR-30e-3p UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG 32 hs a-miR-328 CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU 33 hs a-miR-335 UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU 34 hs a-miR-33 a* CAAUGUUUCCACAGUGCAUCAC 35 hs a-miR-346 UGUCUGCCCGCAUGCCUGCCUCU 36 hs a-miR-34c-5p AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC 37 hs a-miR-373 ACUCAAAAUGGGGGCGCUUUCC 38 hs a-miR-376c GGUGGAUAUUCCUUCUAUGUU 39 hs a-miR-381 AGCGAGGUUGCCCUUUGUAUAU 40 hs a-miR-410 AAUAUAACACAGAUGGCCUGU 41 hs a-miR-412 ACUUCACCUGGUCCACUAGCCGU 42 hs a-miR-423 -5p UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU 43 hs a-miR-433 AUCAUGAUGGGCUCCUCGGUGU 44 hs a-miR-484 UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU 45 hs a-miR-487b AAUCGUACAGGGUCAUCCACUU 46 hs a-miR-490-3p CAACCUGGAGGACUCCAUGCUG 47 hs a-miR-492 AGGACCUGCGGGACAAGAUUCUU 48 hs a-miR-493 UUGUACAUGGUAGGCUUUCAUU 49 hs a-miR-494 UGAAACAUACACGGGAAACCUC 50 hsa-miR-502-3p AAUGCACCUGGGCAAGGAUUCA 51 hs a-miR-505* GGGAGCCAGGAAGUAUUGAUGU 52 hs a-miR-511 GUGUCUUUUGCUCUGCAGUCA 53 hs a-miR-517b AUCGUGCAUCCCUUUAGAGUGU 54 hsa-miR-518a-3p GAAAGCGCUUCCCUUUGCUGGA 55 hs a-miR-518b CAAAGCGCUCCCCUUUAGAGGU 56 hsa-miR-518e AAAGCGCUUCCCUUCAGAGUG 57 hs a-miR-518f GAAAGCGCUUCUCUUUAGAGG 58 hsa-miR-520a-3p AAAGUGCUUCCCUUUGGACUGU 59 hs a-miR-520g ACAAAGUGCUUCCCUUUAGAGUGU 60 hs a-miR-521 AACGCACUUCCCUUUAGAGUGU 61 hs a-miR-523 GAACGCGCUUCCCUAUAGAGGGU 62 hsa-miR-548b-5p AAAAGUAAUUGUGGUUUUGGCC 63 hsa-miR-548c-5p AAAAGUAAUUGCGGUUUUUGCC 64 hsa-miR-548d-5p AAAAGUAAUUGUGGUUUUUGCC 65 hsa-miR-590-3p UAAUUUUAUGUAUAAGCUAGU 66 hsa-miR-593 UGUCUCUGCUGGGGUUUCU 67 hsa-miR-597 UGUGUCACUCGAUGACCACUGU 68 hsa-miR-628-3p UCUAGUAAGAGUGGCAGUCGA 69 hsa-miR-650 AGGAGGCAGCGCUCUCAGGAC 70 hsa-miR-657 GGCAGGUUCUCACCCUCUCUAGG 71 hsa-miR-659 CUUGGUUCAGGGAGGGUCCCCA 72 hsa-miR-668 UGUCACUCGGCUCGGCCCACUAC 73 hsa-miR-720 UCUCGCUGGGGCCUCCA 74 hsa-miR-874 CUGCCCUGGCCCGAGGGACCGA 75 hsa-miR-886-3p CGCGGGUGCUUACUGACCCUU 76 hsa-miR-942 UCUUCUCUGUUUUGGCCAUGUG 77 L'invention concerne plus spécifiquement un procédé pour le diagnostic d'une dystrophie musculaire ou d'évaluation du risque de développer ou présenter une dystrophie musculaire chez un sujet, comprenant la mesure du niveau d'expression d'au moins un miARN
dans un
dans un
5 échantillon de liquide corporel (par exemple un échantillon d'urine) dudit sujet. L'invention peut notamment comprendre la comparaison dudit niveau d'expression mesuré dans ledit échantillon à un niveau obtenu dans un échantillon de référence sain, une différence entre le niveau d'expression par rapport au niveau de référence étant indicative d'une dystrophie musculaire chez le sujet.
L'invention concerne également un procédé pour le diagnostic d'une dystrophie musculaire ou pour l'évaluation du risque de développer ou présenter une dystrophie musculaire, comprenant la détermination dans un échantillon de liquide corporel (par exemple un échantillon d'urine) d'un sujet de la présence ou du niveau d'expression d'au moins un miARN choisi dans le groupe constitué des miARN listés dans le tableau 1.
La présente invention se rapporte notamment à un procédé de diagnostic d'une dystrophie musculaire, en particulier de la dystrophie musculaire de Duchenne, comprenant la comparaison:
a) du niveau d'expression d'au moins un miARN dans un échantillon de liquide corporel (e.g.
d'urine) d'un sujet (échantillon test), le miARN étant choisi dans le groupe constitué des miARN du tableau 1, et
L'invention concerne également un procédé pour le diagnostic d'une dystrophie musculaire ou pour l'évaluation du risque de développer ou présenter une dystrophie musculaire, comprenant la détermination dans un échantillon de liquide corporel (par exemple un échantillon d'urine) d'un sujet de la présence ou du niveau d'expression d'au moins un miARN choisi dans le groupe constitué des miARN listés dans le tableau 1.
La présente invention se rapporte notamment à un procédé de diagnostic d'une dystrophie musculaire, en particulier de la dystrophie musculaire de Duchenne, comprenant la comparaison:
a) du niveau d'expression d'au moins un miARN dans un échantillon de liquide corporel (e.g.
d'urine) d'un sujet (échantillon test), le miARN étant choisi dans le groupe constitué des miARN du tableau 1, et
6 b) du niveau d'expression dudit miARN dans un échantillon sain de référence, une différence statistiquement significative entre le niveau d'expression dans l'échantillon test par rapport à l'échantillon de référence étant indicative d'une dystrophie musculaire chez le sujet.
Selon un aspect particulier, l'invention se rapporte à un procédé de diagnostic d'une dystrophie musculaire comprenant les étapes suivantes:
- mesure du niveau d'expression d'au moins un miARN choisi parmi les miARN
du tableau 1, dans un échantillon de liquide corporel (en particulier d'urine) provenant d'un sujet à tester (par exemple un sujet suspecté de présenter une dystrophie musculaire); et - la comparaison:
- entre le niveau d'expression d'au moins un desdits miARN dans ledit échantillon et le niveau d'expression dudit miARN dans un échantillon sain de référence, ou - entre le niveau d'expression d'au moins un premier desdits miARN dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une dystrophie musculaire et le niveau d'expression dudit miARN dans un échantillon de référence provenant d'un patient présentant une dystrophie musculaire, en particulier une DMD.
Ainsi, la comparaison des niveaux d'expression des miARN peut être réalisée entre un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une dystrophie musculaire et un échantillon sain de référence, ou un échantillon de référence provenant d'un patient présentant une dystrophie musculaire.
L'existence dans l'urine de miARN spécifiques d'une dystrophie musculaire, et en particulier de la DMD, n'a jamais été rapportée par des publications antérieures. Par ailleurs, les miARN
suivants n'ont jamais été rapportés comme présents dans un liquide corporel et comme indicatifs d'une dystrophie musculaire: let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511,
Selon un aspect particulier, l'invention se rapporte à un procédé de diagnostic d'une dystrophie musculaire comprenant les étapes suivantes:
- mesure du niveau d'expression d'au moins un miARN choisi parmi les miARN
du tableau 1, dans un échantillon de liquide corporel (en particulier d'urine) provenant d'un sujet à tester (par exemple un sujet suspecté de présenter une dystrophie musculaire); et - la comparaison:
- entre le niveau d'expression d'au moins un desdits miARN dans ledit échantillon et le niveau d'expression dudit miARN dans un échantillon sain de référence, ou - entre le niveau d'expression d'au moins un premier desdits miARN dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une dystrophie musculaire et le niveau d'expression dudit miARN dans un échantillon de référence provenant d'un patient présentant une dystrophie musculaire, en particulier une DMD.
Ainsi, la comparaison des niveaux d'expression des miARN peut être réalisée entre un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une dystrophie musculaire et un échantillon sain de référence, ou un échantillon de référence provenant d'un patient présentant une dystrophie musculaire.
L'existence dans l'urine de miARN spécifiques d'une dystrophie musculaire, et en particulier de la DMD, n'a jamais été rapportée par des publications antérieures. Par ailleurs, les miARN
suivants n'ont jamais été rapportés comme présents dans un liquide corporel et comme indicatifs d'une dystrophie musculaire: let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511,
7 miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-28-5p, miR-30d et miR-30e-3p. Ainsi, selon un mode particulier de réalisation, le procédé selon l'invention comprend la mesure du niveau d'au moins un miARN
choisi dans le groupe constitué des miARN listés dans la phrase précédente.
Selon un autre mode particulier de réalisation, le procédé selon l'invention comprend la mesure du niveau dans un échantillon d'urine d'un sujet d'au moins un miARN
choisi dans le groupe constitué de let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-5p, miR-30d et miR-30e-3p, la mesure d'une différence du niveau dudit miARN
dans l'échantillon du sujet par rapport à l'échantillon de référence sain étant indicative d'une possible dystrophie musculaire.
L'invention concerne également un procédé de suivi de l'évolution d'une dystrophie musculaire, et un procédé pour l'évaluation de l'efficacité d'un traitement thérapeutique d'une dystrophie musculaire. Dans ce cas, le procédé comprend la mesure du niveau d'expression d'au moins l'un des miARN mentionnés ci-dessus dans un second échantillon de liquide corporel (notamment d'urine) d'un sujet, ce niveau dans l'échantillon du sujet étant comparé
au niveau dudit miARN dans un premier échantillon de référence qui correspond à un échantillon prélevé antérieurement sur le même sujet. Dans le cas du suivi de l'efficacité d'un traitement, le premier échantillon pourra avoir été prélevé avant l'administration du traitement thérapeutique au sujet, et le second échantillon sera prélevé après administration du traitement thérapeutique (par exemple plusieurs jours/semaines/mois après administration du traitement thérapeutique). Alternativement, les premier et second échantillons peuvent être prélevés tous les deux après administration du traitement thérapeutique (par exemple, le premier échantillon est prélevé après traitement, le même jour que ce traitement, ou plusieurs jours/semaines/mois
choisi dans le groupe constitué des miARN listés dans la phrase précédente.
Selon un autre mode particulier de réalisation, le procédé selon l'invention comprend la mesure du niveau dans un échantillon d'urine d'un sujet d'au moins un miARN
choisi dans le groupe constitué de let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-5p, miR-30d et miR-30e-3p, la mesure d'une différence du niveau dudit miARN
dans l'échantillon du sujet par rapport à l'échantillon de référence sain étant indicative d'une possible dystrophie musculaire.
L'invention concerne également un procédé de suivi de l'évolution d'une dystrophie musculaire, et un procédé pour l'évaluation de l'efficacité d'un traitement thérapeutique d'une dystrophie musculaire. Dans ce cas, le procédé comprend la mesure du niveau d'expression d'au moins l'un des miARN mentionnés ci-dessus dans un second échantillon de liquide corporel (notamment d'urine) d'un sujet, ce niveau dans l'échantillon du sujet étant comparé
au niveau dudit miARN dans un premier échantillon de référence qui correspond à un échantillon prélevé antérieurement sur le même sujet. Dans le cas du suivi de l'efficacité d'un traitement, le premier échantillon pourra avoir été prélevé avant l'administration du traitement thérapeutique au sujet, et le second échantillon sera prélevé après administration du traitement thérapeutique (par exemple plusieurs jours/semaines/mois après administration du traitement thérapeutique). Alternativement, les premier et second échantillons peuvent être prélevés tous les deux après administration du traitement thérapeutique (par exemple, le premier échantillon est prélevé après traitement, le même jour que ce traitement, ou plusieurs jours/semaines/mois
8 après le traitement, et le second échantillon est prélevé plusieurs jours/semaines/mois après le premier échantillon).
L'invention concerne par ailleurs une trousse et un support multipuits utiles pour le diagnostic d'une dystrophie musculaire.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les "microARN" (ou miARN) sont des ARN simple brin non codants d'environ 17 à
nucléotides de long, qui régulent l'expression génique en réprimant la traduction de leur ARNm cible. Les miARN qui ont été identifiés sont enregistrés dans la base de données miRB ase, 14' version (http ://micro am. saner. ac.uk).
Dans le cadre de l'invention, un "échantillon de référence", lorsqu'il est fait mention d'un "échantillon sain", correspond à un échantillon obtenu à partir d'un ou plusieurs sujets, de préférence deux ou plus, qui ne souffrent pas de dystrophie musculaire.
L'échantillon de référence peut également correspondre à un échantillon obtenu à partir d'un ou plusieurs patients souffrant d'une dystrophie musculaire. Les niveaux d'expression de référence peuvent être déterminés en mesurant le niveau d'expression des miARN à explorer dans un ou plusieurs sujets. Ces niveaux de référence peuvent également être ajustés en fonction de populations de sujets spécifiques. Dans un mode préféré de réalisation, l'échantillon de référence est obtenu à partir d'un pool de sujets sains. Le profil d'expression des miARN dans l'échantillon de référence peut, de préférence, être généré à partir d'une population de deux ou plus de deux sujets. Par exemple, la population peut comprendre 2, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 sujets, ou plus. Dans le cadre de méthodes pour le suivi d'une dystrophie musculaire ou pour le suivi de l'efficacité d'un traitement, l'échantillon de référence est un échantillon prélevé sur le sujet qui sera suivi, mais avant que le suivi ait débuté.
Par "dystrophie musculaire", on désigne notamment la dystrophie musculaire de Duchenne, la dystrophie musculaire de Becker, les dystrophies musculaires des ceintures telles les alpha- et gamma-sarcoglycanopathies. L'invention se rapporte plus particulièrement à
l'étude d'une dystrophie musculaire de Duchenne ou d'une dystrophie musculaire de Becker, plus particulièrement de Duchenne.
L'invention concerne par ailleurs une trousse et un support multipuits utiles pour le diagnostic d'une dystrophie musculaire.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les "microARN" (ou miARN) sont des ARN simple brin non codants d'environ 17 à
nucléotides de long, qui régulent l'expression génique en réprimant la traduction de leur ARNm cible. Les miARN qui ont été identifiés sont enregistrés dans la base de données miRB ase, 14' version (http ://micro am. saner. ac.uk).
Dans le cadre de l'invention, un "échantillon de référence", lorsqu'il est fait mention d'un "échantillon sain", correspond à un échantillon obtenu à partir d'un ou plusieurs sujets, de préférence deux ou plus, qui ne souffrent pas de dystrophie musculaire.
L'échantillon de référence peut également correspondre à un échantillon obtenu à partir d'un ou plusieurs patients souffrant d'une dystrophie musculaire. Les niveaux d'expression de référence peuvent être déterminés en mesurant le niveau d'expression des miARN à explorer dans un ou plusieurs sujets. Ces niveaux de référence peuvent également être ajustés en fonction de populations de sujets spécifiques. Dans un mode préféré de réalisation, l'échantillon de référence est obtenu à partir d'un pool de sujets sains. Le profil d'expression des miARN dans l'échantillon de référence peut, de préférence, être généré à partir d'une population de deux ou plus de deux sujets. Par exemple, la population peut comprendre 2, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 sujets, ou plus. Dans le cadre de méthodes pour le suivi d'une dystrophie musculaire ou pour le suivi de l'efficacité d'un traitement, l'échantillon de référence est un échantillon prélevé sur le sujet qui sera suivi, mais avant que le suivi ait débuté.
Par "dystrophie musculaire", on désigne notamment la dystrophie musculaire de Duchenne, la dystrophie musculaire de Becker, les dystrophies musculaires des ceintures telles les alpha- et gamma-sarcoglycanopathies. L'invention se rapporte plus particulièrement à
l'étude d'une dystrophie musculaire de Duchenne ou d'une dystrophie musculaire de Becker, plus particulièrement de Duchenne.
9 Le terme "liquide corporel" ou "fluide biologique" se réfère au liquide corporel d'un sujet, notamment d'un sujet humain, c'est-a-dire tout liquide prélevé sur un sujet, tel que le sérum, le plasma, le sang total, l'urine, le liquide céphalo-rachidien ou encore la salive. Selon un mode préféré de réalisation, le liquide corporel utilisé dans la présente invention est un échantillon d'urine.
On entend par "sujet" un mammifère, humain ou non humain, de préférence humain. Le sujet peut présenter une prédisposition pour une dystrophie musculaire (révélée par exemple par analyse génétique, ou une suspicion pouvant résulter d'antécédents familiaux) ou souffrir d'une dystrophie musculaire déclarée. L'invention peut également être appliquée en dépistage, le sujet ne présentant aucun symptôme ou prédisposition connue. En particulier, la méthode selon l'invention peut être appliquée au dépistage de masse chez les jeunes enfants avant l'âge classique de déclaration des symptômes (0-Sans). L'invention peut également être appliquée au suivi d'animaux modèles de la maladie, notamment de chiens ou de souris modèles et plus particulièrement aux chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), LMD
(Labrador Muscular Dystrophy) ou CXMDj (Canine X-linked Muscular Dystrophy in Japan), lors de la mise au point préclinique de traitements.
Le terme "niveau d'expression" d'un miARN dans un échantillon correspond à une valeur de mesure propre à un miARN, mais exprimé soit en unité arbitraire, soit en unité
de masse, de molécules ou de concentration, ou en valeur normalisée par rapport à une autre mesure, en particulier en valeur normalisée par rapport aux quantités du même miARN dans un échantillon de référence (sain ou d'un patient atteint d'une dystrophie musculaire).
Le niveau d'expression des miARN peut être mesuré par toute méthode conventionnelle, telle que - l'hybridation sur "puces à ADN", - des méthodes de séquençage à haut débit d'un grand nombre de miARN
individualisés, - la PCR quantitative en temps réel ou digitale, - le Northern blot, - ou encore par toute autre méthode spécifique des miARN.
Le niveau d'expression des miARN peut être mesuré par la technique de la "puce à ADN". La technique de la "puce à ADN" est bien connue de l'homme du métier. Il s'agit de l'hybridation de miARN extraits sur un support solide composé d'une membrane nylon, d'une surface de silicium ou de verre, éventuellement de nano-billes ou particules, comportant des oligonucléotides de séquences connues fixés sur le support ou adhérents à
celui-ci. La complémentarité des oligonucléotides fixés avec les séquences des microARN ou de leurs produits de conversion (produits d'amplification, cDNA, ARN ou cARN) permet de générer un signal (fluorescence, luminescence, radioactivité, signal électrique...) selon les techniques de marquage employées, au niveau des oligonucléotides immobilisés sur les supports (puces à
ADN). Ce signal est détecté par un équipement spécifique et une valeur d'intensité de ce signal propre pour chaque miARN est ainsi enregistrée. Plusieurs types de puces destinées à
On entend par "sujet" un mammifère, humain ou non humain, de préférence humain. Le sujet peut présenter une prédisposition pour une dystrophie musculaire (révélée par exemple par analyse génétique, ou une suspicion pouvant résulter d'antécédents familiaux) ou souffrir d'une dystrophie musculaire déclarée. L'invention peut également être appliquée en dépistage, le sujet ne présentant aucun symptôme ou prédisposition connue. En particulier, la méthode selon l'invention peut être appliquée au dépistage de masse chez les jeunes enfants avant l'âge classique de déclaration des symptômes (0-Sans). L'invention peut également être appliquée au suivi d'animaux modèles de la maladie, notamment de chiens ou de souris modèles et plus particulièrement aux chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), LMD
(Labrador Muscular Dystrophy) ou CXMDj (Canine X-linked Muscular Dystrophy in Japan), lors de la mise au point préclinique de traitements.
Le terme "niveau d'expression" d'un miARN dans un échantillon correspond à une valeur de mesure propre à un miARN, mais exprimé soit en unité arbitraire, soit en unité
de masse, de molécules ou de concentration, ou en valeur normalisée par rapport à une autre mesure, en particulier en valeur normalisée par rapport aux quantités du même miARN dans un échantillon de référence (sain ou d'un patient atteint d'une dystrophie musculaire).
Le niveau d'expression des miARN peut être mesuré par toute méthode conventionnelle, telle que - l'hybridation sur "puces à ADN", - des méthodes de séquençage à haut débit d'un grand nombre de miARN
individualisés, - la PCR quantitative en temps réel ou digitale, - le Northern blot, - ou encore par toute autre méthode spécifique des miARN.
Le niveau d'expression des miARN peut être mesuré par la technique de la "puce à ADN". La technique de la "puce à ADN" est bien connue de l'homme du métier. Il s'agit de l'hybridation de miARN extraits sur un support solide composé d'une membrane nylon, d'une surface de silicium ou de verre, éventuellement de nano-billes ou particules, comportant des oligonucléotides de séquences connues fixés sur le support ou adhérents à
celui-ci. La complémentarité des oligonucléotides fixés avec les séquences des microARN ou de leurs produits de conversion (produits d'amplification, cDNA, ARN ou cARN) permet de générer un signal (fluorescence, luminescence, radioactivité, signal électrique...) selon les techniques de marquage employées, au niveau des oligonucléotides immobilisés sur les supports (puces à
ADN). Ce signal est détecté par un équipement spécifique et une valeur d'intensité de ce signal propre pour chaque miARN est ainsi enregistrée. Plusieurs types de puces destinées à
10 la détection des miARN sont déjà mis sur le marché, comme par exemple les GeneChip(R) miARN commercialisés par Affymetrix, miRcury arrays par Exiqon, miRXplore microarrays par Miltenyi.
Dans le cas de l'analyse haut débit par séquençage, les miARN sont extraits et purifiés d'un échantillon, isolés les uns des autres par des méthodes proposées par les fournisseurs d'équipements de séquençage tels que Roche, Invitrogen. Ce genre d'analyse consiste à
individualiser les molécules des différents microARNs, de procéder à une étape d'amplification et de séquencer les produits (" clones d'acides nucléiques ") ainsi générés. La réalisation de très nombreuses séquences pour identifier chacun de ces "
clones " (plusieurs milliers) permet de générer une liste des microARNs présents dans un échantillon et de quantifier chacun de ces miARN en comptant tout simplement combien de fois chaque séquence est retrouvée dans la liste détaillée.
Dans un mode de réalisation préférée de l'invention, les dosages de miARN sont réalisés par PCR quantitative (PCR en temps réel ou PCR digitale). La PCR en temps réel permet d'obtenir des valeurs, appelées Ct, correspondant au nombre de cycles à partir duquel la fluorescence émise dépasse un certain seuil, le seuil étant fixé par l'utilisateur en début de phase exponentielle. Cette valeur de Ct est proportionnelle à la quantité de cDNA (provenant de la transcription inverse des miARN en cDNA par la Reverse Transcriptase) présent initialement dans l'échantillon. En l'absence de gamme-étalon spécifique pour chaque cDNA, seule une quantification relative entre échantillons est possible. Dans un premier temps, afin de pouvoir comparer le contingent de chaque miARN pris individuellement et présent dans les échantillons, les valeurs de dosage pour chaque miARN sont normalisées avec les données obtenues pour un ARN non-codant. Il est également possible de normaliser l'expression d'un
Dans le cas de l'analyse haut débit par séquençage, les miARN sont extraits et purifiés d'un échantillon, isolés les uns des autres par des méthodes proposées par les fournisseurs d'équipements de séquençage tels que Roche, Invitrogen. Ce genre d'analyse consiste à
individualiser les molécules des différents microARNs, de procéder à une étape d'amplification et de séquencer les produits (" clones d'acides nucléiques ") ainsi générés. La réalisation de très nombreuses séquences pour identifier chacun de ces "
clones " (plusieurs milliers) permet de générer une liste des microARNs présents dans un échantillon et de quantifier chacun de ces miARN en comptant tout simplement combien de fois chaque séquence est retrouvée dans la liste détaillée.
Dans un mode de réalisation préférée de l'invention, les dosages de miARN sont réalisés par PCR quantitative (PCR en temps réel ou PCR digitale). La PCR en temps réel permet d'obtenir des valeurs, appelées Ct, correspondant au nombre de cycles à partir duquel la fluorescence émise dépasse un certain seuil, le seuil étant fixé par l'utilisateur en début de phase exponentielle. Cette valeur de Ct est proportionnelle à la quantité de cDNA (provenant de la transcription inverse des miARN en cDNA par la Reverse Transcriptase) présent initialement dans l'échantillon. En l'absence de gamme-étalon spécifique pour chaque cDNA, seule une quantification relative entre échantillons est possible. Dans un premier temps, afin de pouvoir comparer le contingent de chaque miARN pris individuellement et présent dans les échantillons, les valeurs de dosage pour chaque miARN sont normalisées avec les données obtenues pour un ARN non-codant. Il est également possible de normaliser l'expression d'un
11 miARN par rapport au Ct moyen de tous les miARNs d'une plaque de PCR (plaques TLDA à
384 puits, comprenant un miARN différent détecté par puits ¨ cf les exemples pour plus de détails). Ainsi, les résultats peuvent être normalisés par rapport à plusieurs miARN références dont l'abondance varie peu dans l'urine. La PCR digitale permet, à partir d'un échantillon de départ de déterminer le nombre exact de copies d'un miARN qu'il contient, suite soit à une dilution de la réaction de PCR en un nombre important de micropuits (technologie PCR
digitale Life Technologies ou Roche) soit à une dispersion de la réaction de PCR en microgouttes d'huile (technologie Droplet, Bio-Rad).
La quantification relative d'un miARN entre 2 types d'échantillons est obtenue ensuite grâce par exemple aux logiciels SDS2.3, RQ manager (Applied Biosystems), et par la méthode de delta delta de Ct sur feuille de calcul Miscrosoft Excel ou tout autre logiciel permettant un calcul complexe.
Lorsque les niveaux d'expression des miARN sont analysés par hybridation sur "puces à
ADN", ou par Northem blot, ou par séquençage, ils peuvent être exprimés par la formule T:
(I) Quantité de miARNx = intensité du signal de détection pour miARNx Où "intensité de signal" signifie quantité de fluorescence, de radioactité ou de luminescence enregistrée sur les "puces à ADN" par le détecteur adapté, ou nombre de séquences identiques détectées par l'analyse à haut débit par séquençage. Les quantités sont exprimées en unités arbitraires.
Les quantités de miARN peuvent être normalisées par rapport à un autre dosage, notamment un ARN (ARN...) dont la concentration ne varie pas dans les différents types d'échantillons analysés. Cette normalisation permet de garantir que l'on compare les niveaux d'expression des miARN détectables dans des extraits dont les concentrations en ARN sont similaires entre ces différents extraits purifiés. Dans ce cas, le niveau d'expression normalisé pour un miARN
dans un échantillon est exprimé par la formule II:
(II) Quantité de miARNx normalisée = intensité du signal de détection pour miARNx /
intensité du signal pour ARNnorm
384 puits, comprenant un miARN différent détecté par puits ¨ cf les exemples pour plus de détails). Ainsi, les résultats peuvent être normalisés par rapport à plusieurs miARN références dont l'abondance varie peu dans l'urine. La PCR digitale permet, à partir d'un échantillon de départ de déterminer le nombre exact de copies d'un miARN qu'il contient, suite soit à une dilution de la réaction de PCR en un nombre important de micropuits (technologie PCR
digitale Life Technologies ou Roche) soit à une dispersion de la réaction de PCR en microgouttes d'huile (technologie Droplet, Bio-Rad).
La quantification relative d'un miARN entre 2 types d'échantillons est obtenue ensuite grâce par exemple aux logiciels SDS2.3, RQ manager (Applied Biosystems), et par la méthode de delta delta de Ct sur feuille de calcul Miscrosoft Excel ou tout autre logiciel permettant un calcul complexe.
Lorsque les niveaux d'expression des miARN sont analysés par hybridation sur "puces à
ADN", ou par Northem blot, ou par séquençage, ils peuvent être exprimés par la formule T:
(I) Quantité de miARNx = intensité du signal de détection pour miARNx Où "intensité de signal" signifie quantité de fluorescence, de radioactité ou de luminescence enregistrée sur les "puces à ADN" par le détecteur adapté, ou nombre de séquences identiques détectées par l'analyse à haut débit par séquençage. Les quantités sont exprimées en unités arbitraires.
Les quantités de miARN peuvent être normalisées par rapport à un autre dosage, notamment un ARN (ARN...) dont la concentration ne varie pas dans les différents types d'échantillons analysés. Cette normalisation permet de garantir que l'on compare les niveaux d'expression des miARN détectables dans des extraits dont les concentrations en ARN sont similaires entre ces différents extraits purifiés. Dans ce cas, le niveau d'expression normalisé pour un miARN
dans un échantillon est exprimé par la formule II:
(II) Quantité de miARNx normalisée = intensité du signal de détection pour miARNx /
intensité du signal pour ARNnorm
12 Lorsque les niveaux d'expression des miARN sont analysés par la PCR en temps réel, ils peuvent être exprimés par la formule III, qui définit la quantité de miARN
présente dans le milieu réactionnel de dosage lorsque le nombre de cycles d'amplification est égal à Ct (Quantité de miARNx à Ct) :
(III) Quantité de miARNx à Ct = Quantité de miARN à tO x Efficacité-ct.
Où "Quantité de miARN à tO" désigne la quantité de miARN, ou son équivalent en cDNA, au moment où la réaction de dosage par amplification PCR est initiée.
L'expression "efficacité"
dans la formule (III) signifie la valeur de l'efficacité de PCR (fixée arbitrairement à 2 dans le cas de calculs par la méthode delta delta Ct). Cette valeur dépend de divers paramètres expérimentaux, et notamment de l'appareil effectuant la PCR en temps réel mis en oeuvre. Une fois que cette valeur est mesurée pour un protocole particulier et une machine de PCR
configurée, il n'est plus nécessaire de mesurer cette valeur chaque fois avant le calcul, sauf si le protocole expérimental et/ou la condition de fonctionnement de la machine ont été modifiés pour l'expérience donnée.
Dans un mode particulier de réalisation, le niveau d'expression des miARN est dosé par PCR
quantitative en temps réel.
Les tableaux 2 et 3 ci-dessous décrivent le profil d'expression de miARN dont l'expression est modifiée chez des patients atteints d'une DMD, par rapport au profil d'expression observé
chez des sujets sains. Les inventeurs ayant pu mettre en évidence une différence d'expression entre les patients selon leur âge, les informations sont classées selon ce critère.
Tableau 2: profil d'expression des miARN indicatifs chez des patients/sujets de 3-8 ans Expression chez les patients par rapport aux miARN urinaire sujets sains let-7a Augmentation let-7b Augmentation let-7c Augmentation let-7d Augmentation let-7e Augmentation let-7f Augmentation let-7g Augmentation
présente dans le milieu réactionnel de dosage lorsque le nombre de cycles d'amplification est égal à Ct (Quantité de miARNx à Ct) :
(III) Quantité de miARNx à Ct = Quantité de miARN à tO x Efficacité-ct.
Où "Quantité de miARN à tO" désigne la quantité de miARN, ou son équivalent en cDNA, au moment où la réaction de dosage par amplification PCR est initiée.
L'expression "efficacité"
dans la formule (III) signifie la valeur de l'efficacité de PCR (fixée arbitrairement à 2 dans le cas de calculs par la méthode delta delta Ct). Cette valeur dépend de divers paramètres expérimentaux, et notamment de l'appareil effectuant la PCR en temps réel mis en oeuvre. Une fois que cette valeur est mesurée pour un protocole particulier et une machine de PCR
configurée, il n'est plus nécessaire de mesurer cette valeur chaque fois avant le calcul, sauf si le protocole expérimental et/ou la condition de fonctionnement de la machine ont été modifiés pour l'expérience donnée.
Dans un mode particulier de réalisation, le niveau d'expression des miARN est dosé par PCR
quantitative en temps réel.
Les tableaux 2 et 3 ci-dessous décrivent le profil d'expression de miARN dont l'expression est modifiée chez des patients atteints d'une DMD, par rapport au profil d'expression observé
chez des sujets sains. Les inventeurs ayant pu mettre en évidence une différence d'expression entre les patients selon leur âge, les informations sont classées selon ce critère.
Tableau 2: profil d'expression des miARN indicatifs chez des patients/sujets de 3-8 ans Expression chez les patients par rapport aux miARN urinaire sujets sains let-7a Augmentation let-7b Augmentation let-7c Augmentation let-7d Augmentation let-7e Augmentation let-7f Augmentation let-7g Augmentation
13 miR-151-5p Augmentation miR-15 a Augmentation miR-15b Augmentation miR-182 Augmentation miR-183 Augmentation miR-192* Augmentation miR-196b Augmentation miR-200b* Augmentation miR-206 Augmentation miR-224 Augmentation miR-23b Augmentation miR-26b Augmentation miR-28-5p Augmentation miR-30d Augmentation miR-30e-3p Augmentation miR-335 Augmentation miR-33 a* Augmentation miR-487b Augmentation miR-490-3p Augmentation miR-492 Augmentation miR-502-3p Augmentation miR-505* Augmentation miR-520a-3p Augmentation miR-548d-5p Augmentation miR-590-3p Augmentation miR-628-3p Augmentation miR-659 Augmentation miR-942 Augmentation miR-1244 Diminution miR-328 Diminution miR-484 Diminution miR-494 Diminution miR-593 Diminution miR-650 Diminution miR-657 Diminution miR-668 Diminution miR-720 Diminution miR-886-3p Diminution
14 Tableau 3: profil d'expression des miARN indicatifs chez des patients/sujets de 13-18 ans Expression chez les patients par rapport aux miARN urinaire sujets sains miR-183 Augmentation miR-193 a-3p Augmentation miR-198 Augmentation miR-208 Augmentation miR-214 Augmentation miR-220 Augmentation miR-328 Augmentation miR-346 Augmentation miR-34c-5p Augmentation miR-373 Augmentation miR-381 Augmentation miR-410 Augmentation miR-433 Augmentation miR-490-3p Augmentation miR-493 Augmentation miR-494 Augmentation miR-511 Augmentation miR-517b Augmentation miR-518a-3p Augmentation miR-518b Augmentation miR-518e Augmentation miR-518f Augmentation miR-520a-3p Augmentation miR-520g Augmentation miR-521 Augmentation miR-523 Augmentation miR-548b-5p Augmentation miR-548c-5p Augmentation miR-548d-5p Augmentation miR-597 Augmentation let-7b Diminution let-7c Diminution let-7e Diminution let-7f Diminution miR-139-5p Diminution miR-155 Diminution miR-15 a Diminution miR-216b Diminution miR-23 a Diminution miR-376c Diminution miR-412 Diminution miR-423-5p Diminution miR-492 Diminution miR-502-3p Diminution miR-874 Diminution Légende des tableaux 2 et 3 augmentation: expression supérieure chez les patients par rapport aux sujets sains; diminution: expression inférieure chez les patients par rapport aux sujets sains.
Les miARN listés ci-dessus varient tous dans les échantillons de patients par rapport aux sujets sains. L'invention concerne donc un procédé (a) de diagnostic d'une dystrophie musculaire, (b) de suivi de l'évolution d'une dystrophie musculaire, et (c) d'évaluation de l'efficacité d'un traitement thérapeutique d'une dystrophie musculaire, comprenant la 10 détermination d'une variation du niveau d'expression d'un ou plusieurs de ces miARN dans un échantillon de fluide corporel d'un sujet par rapport au niveau d'expression dans un échantillon de référence.
Dans un mode particulier de réalisation, une première catégorie de miARN
correspond à ceux
Les miARN listés ci-dessus varient tous dans les échantillons de patients par rapport aux sujets sains. L'invention concerne donc un procédé (a) de diagnostic d'une dystrophie musculaire, (b) de suivi de l'évolution d'une dystrophie musculaire, et (c) d'évaluation de l'efficacité d'un traitement thérapeutique d'une dystrophie musculaire, comprenant la 10 détermination d'une variation du niveau d'expression d'un ou plusieurs de ces miARN dans un échantillon de fluide corporel d'un sujet par rapport au niveau d'expression dans un échantillon de référence.
Dans un mode particulier de réalisation, une première catégorie de miARN
correspond à ceux
15 qui sont sur-représentés dans l'urine de patients DMD, (désignés par la catégorie "augmentation" dans les tableaux 2 et 3). Si un ou plusieurs miARN de cette première catégorie sont exploités dans une méthode selon l'invention:
- une expression supérieure chez le sujet testé par rapport à une référence obtenue dans un échantillon d'un sujet sain sera indicative d'une dystrophie musculaire (méthode de diagnostic);
- une expression supérieure dans un échantillon du sujet testé prélevé à un temps T2 par rapport à un échantillon du même sujet testé prélevé à un temps Ti (Ti précédant T2 chronologiquement) sera indicative d'une progression de la maladie (méthode de pronostic, ou méthode pour le suivi d'une dystrophie musculaire);
- dans le cadre d'un traitement d'une dystrophie musculaire chez un patient, une expression inférieure dans un échantillon du sujet testé prélevé à un temps T2 par rapport à un échantillon du même sujet testé prélevé à un temps Ti (Ti précédant T2 chronologiquement)
- une expression supérieure chez le sujet testé par rapport à une référence obtenue dans un échantillon d'un sujet sain sera indicative d'une dystrophie musculaire (méthode de diagnostic);
- une expression supérieure dans un échantillon du sujet testé prélevé à un temps T2 par rapport à un échantillon du même sujet testé prélevé à un temps Ti (Ti précédant T2 chronologiquement) sera indicative d'une progression de la maladie (méthode de pronostic, ou méthode pour le suivi d'une dystrophie musculaire);
- dans le cadre d'un traitement d'une dystrophie musculaire chez un patient, une expression inférieure dans un échantillon du sujet testé prélevé à un temps T2 par rapport à un échantillon du même sujet testé prélevé à un temps Ti (Ti précédant T2 chronologiquement)
16 sera indicative d'un traitement efficace de la maladie (méthode de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une dystrophie musculaire).
Une deuxième catégorie de miARN sont sous représentés dans l'urine de patients DMD, par rapport au sujets sains (désignés dans la catégorie "diminution" dans les tableaux 2 et 3).. Si un ou plusieurs miARN de cette deuxième catégorie sont exploités dans une méthode selon l'invention:
- une expression inférieure chez le sujet testé par rapport à une référence obtenue dans un échantillon d'un sujet sain sera indicative d'une dystrophie musculaire (méthode de diagnostic);
- une expression inférieure dans un échantillon du sujet testé prélevé à un temps T2 par rapport à un échantillon du même sujet testé prélevé à un temps Ti (Ti précédant T2 chronologiquement) sera indicative d'une progression de la maladie (méthode de pronostic, ou méthode pour le suivi d'une dystrophie musculaire);
- dans le cadre d'un traitement d'une dystrophie musculaire chez un patient, une expression supérieure dans un échantillon du sujet testé prélevé à un temps T2 par rapport à un échantillon du même sujet testé prélevé à un temps Ti (Ti précédant T2 chronologiquement) sera indicative d'un traitement efficace de la maladie (méthode de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une dystrophie musculaire).
Par "niveau d'expression supérieur" ou "niveau d'expression inférieur", on entend un niveau d'expression dont la variation est statistiquement significative, selon des procédures bien connues de l'homme du métier.
La description faite ci-dessus des deux catégories de miARN identifiées et leur exploitation dans une méthode de diagnostic selon l'invention met en oeuvre un échantillon de référence provenant d'un sujet sain. Bien entendu, les variations d'expression recherchées seront inversées lorsque l'échantillon de référence proviendra d'un patient malade atteint d'une dystrophie musculaire.
Les procédés selon l'invention comprennent notamment la détection d'au moins un miARN
choisi dans le groupe constitué des miARN des tableaux 2 et 3.
Selon une première variante de réalisation, les miARN détectés sont choisis parmi les miARN
du tableau 4.
Une deuxième catégorie de miARN sont sous représentés dans l'urine de patients DMD, par rapport au sujets sains (désignés dans la catégorie "diminution" dans les tableaux 2 et 3).. Si un ou plusieurs miARN de cette deuxième catégorie sont exploités dans une méthode selon l'invention:
- une expression inférieure chez le sujet testé par rapport à une référence obtenue dans un échantillon d'un sujet sain sera indicative d'une dystrophie musculaire (méthode de diagnostic);
- une expression inférieure dans un échantillon du sujet testé prélevé à un temps T2 par rapport à un échantillon du même sujet testé prélevé à un temps Ti (Ti précédant T2 chronologiquement) sera indicative d'une progression de la maladie (méthode de pronostic, ou méthode pour le suivi d'une dystrophie musculaire);
- dans le cadre d'un traitement d'une dystrophie musculaire chez un patient, une expression supérieure dans un échantillon du sujet testé prélevé à un temps T2 par rapport à un échantillon du même sujet testé prélevé à un temps Ti (Ti précédant T2 chronologiquement) sera indicative d'un traitement efficace de la maladie (méthode de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une dystrophie musculaire).
Par "niveau d'expression supérieur" ou "niveau d'expression inférieur", on entend un niveau d'expression dont la variation est statistiquement significative, selon des procédures bien connues de l'homme du métier.
La description faite ci-dessus des deux catégories de miARN identifiées et leur exploitation dans une méthode de diagnostic selon l'invention met en oeuvre un échantillon de référence provenant d'un sujet sain. Bien entendu, les variations d'expression recherchées seront inversées lorsque l'échantillon de référence proviendra d'un patient malade atteint d'une dystrophie musculaire.
Les procédés selon l'invention comprennent notamment la détection d'au moins un miARN
choisi dans le groupe constitué des miARN des tableaux 2 et 3.
Selon une première variante de réalisation, les miARN détectés sont choisis parmi les miARN
du tableau 4.
17 Tableau 4 let-7f miR-23b miR-193 a-3p miR-518f let-7a miR-492 miR-381 miR-886-3p miR-548d-5p let-7c miR-34c-5p miR-650 miR-183 let-7e miR-628-3p miR-720 miR-490-3p miR-15b miR-659 miR-593 miR-520a-3p miR-487b miR-505* miR-657 miR-590-3p miR-410 let-7b miR-502-3p miR-15a miR-139-5p let-7d miR-198 miR-1244 miR-216b let-7g miR-214 miR-328 miR-423-5p miR-196b miR-220 miR-494 miR-484 miR-26b miR-373 miR-668 miR-23 a miR-942 miR-511 miR-208 miR-376c miR-200b* miR-517b miR-521 miR-412 miR-523 miR-518a-3p miR-597 miR-433 miR-346 miR-518b miR-874 miR-206 miR-155 miR-518e miR-224 miR-335 miR-548b-5p miR-520g miR-182 miR-33 a* miR-548c-5p miR-493 Selon une seconde variante de réalisation, les miARN détectés sont choisis parmi les miARN
du tableau 5.
Tableau 5 let-7f miR-494 let-7c miR-376c let-7a miR-668 let-7e miR-412 miR-548d-5p miR-208 miR-15b miR-433 miR-183 miR-521 miR-487b miR-206 miR-490-3p miR-597 miR-410 miR-335 miR-520a-3p miR-874 miR-139-5p miR-33 a*
miR-590-3p miR-224 miR-216b miR-193 a-3p miR-15a miR-182 miR-423 -5p miR-381
du tableau 5.
Tableau 5 let-7f miR-494 let-7c miR-376c let-7a miR-668 let-7e miR-412 miR-548d-5p miR-208 miR-15b miR-433 miR-183 miR-521 miR-487b miR-206 miR-490-3p miR-597 miR-410 miR-335 miR-520a-3p miR-874 miR-139-5p miR-33 a*
miR-590-3p miR-224 miR-216b miR-193 a-3p miR-15a miR-182 miR-423 -5p miR-381
18 miR-1244 miR-23b miR-484 miR-34c-5p 1 miR-328 miR-492 miR-23a Selon une troisième variante de réalisation, les miARN détectés sont choisis parmi les miARN du tableau 6.
Tableau 6 let-7f miR-590-3p miR-208 let-7a miR-15a miR-521 miR-548d-5p miR-1244 miR-597 miR-183 miR-328 miR-874 miR-490-3p miR-494 miR-520a-3p miR-668 Selon un mode particulier de réalisation, l'échantillon de liquide corporel, en particulier un échantillon d'urine, provient d'un sujet humain et le ou les miARN détectés sont choisis dans le groupe constitué des miARN du tableau 2 et 3, ou parmi les miARN du tableau 2 ou 3 et figurant également dans l'un des tableaux 4, 5 et 6.
Le diagnostic (ou l'évaluation du risque), le pronostic ou l'efficacité du traitement pourra par ailleurs être confirmé dans des procédures suivant les procédés selon l'invention, comprenant des étapes connues d'évaluation d'une dystrophie musculaire (par exemple, détermination du niveau de créatine kinase, recherche de marqueurs spécifiques dans des biopsies musculaires, analyse génomique, etc.) Ainsi, un mode particulier de réalisation de la méthode de diagnostic selon l'invention telle que décrite ci-dessus comprend en outre une étape de confirmation du diagnostic par utilisation d'une méthode alternative d'évaluation d'une dystrophie musculaire.
L'invention concerne également une trousse de diagnostic d'une dystrophie musculaire, cette trousse comprenant des moyens de détection ou de dosage d'au moins un miARN
choisi parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657,
Tableau 6 let-7f miR-590-3p miR-208 let-7a miR-15a miR-521 miR-548d-5p miR-1244 miR-597 miR-183 miR-328 miR-874 miR-490-3p miR-494 miR-520a-3p miR-668 Selon un mode particulier de réalisation, l'échantillon de liquide corporel, en particulier un échantillon d'urine, provient d'un sujet humain et le ou les miARN détectés sont choisis dans le groupe constitué des miARN du tableau 2 et 3, ou parmi les miARN du tableau 2 ou 3 et figurant également dans l'un des tableaux 4, 5 et 6.
Le diagnostic (ou l'évaluation du risque), le pronostic ou l'efficacité du traitement pourra par ailleurs être confirmé dans des procédures suivant les procédés selon l'invention, comprenant des étapes connues d'évaluation d'une dystrophie musculaire (par exemple, détermination du niveau de créatine kinase, recherche de marqueurs spécifiques dans des biopsies musculaires, analyse génomique, etc.) Ainsi, un mode particulier de réalisation de la méthode de diagnostic selon l'invention telle que décrite ci-dessus comprend en outre une étape de confirmation du diagnostic par utilisation d'une méthode alternative d'évaluation d'une dystrophie musculaire.
L'invention concerne également une trousse de diagnostic d'une dystrophie musculaire, cette trousse comprenant des moyens de détection ou de dosage d'au moins un miARN
choisi parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657,
19 miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-28-5p, miR-30d et miR-30e-3p. Selon un mode particulier de réalisation, la trousse comprend les moyens de détection ou de dosage de tous les miARN de cette liste. Selon un mode particulier de réalisation, la trousse comprend des moyens de détection ou de dosage d'un ou plusieurs miARN (en particulier tous) choisis parmi les miARN listés dans le tableau 4, le tableau 5 ou le tableau 6. Selon un mode spécifique de réalisation, les moyens de détection ou de dosage dans la trousse consistent en des moyens de détection ou de dosage d'un ou plusieurs des miARN des tableaux 2 et 3, ou d'un ou plusieurs des miARN listés dans chacun des tableaux 4, 5 et 6. Selon un mode particulier de réalisation, les miARN détectés ou dosés grâce au kit consistent en l'ensemble des miARN du tableau 4, plus particulièrement en l'ensemble des miARN du tableau 5, et encore plus particulièrement en l'ensemble des miARN du tableau 6.
A titre illustratif, la trousse selon l'invention peut être une trousse pour la réalisation d'une PCR en temps réel et également contenir une reverse transcriptase, une ADN
polymérase, un ou plusieurs tampon(s) adaptés aux réactions à mettre en oeuvre, des sondes spécifiques des régions amplifiées (par exemple sondes Taqman0), ou des marqueurs spécifiques de l'ADN
double brin comme le SYBR Green.
L'invention concerne également un ensemble de séquences nucléotidiques, cet ensemble comprenant des paires d'amorces utilisables pour amplifier spécifiquement au moins deux miARN choisi parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-5p, miR-30d et miR-30e-3 dans une expérience de PCR. Selon une variante, les séquences nucléotidiques permettent l'amplification d'un ou plusieurs miARN de chacun des tableaux 4, 5 et 6. Selon un mode particulier de réalisation, l'ensemble de séquences nucléotidiques comprend des paires d'amorces permettant l'amplification spécifique de tous les miARN listés ci-avant. Selon une variante de réalisation, l'ensemble de séquences nucléotidiques peut également comprendre une séquence nucléotidique utilisable comme sonde marquée pour la détection et quantification des fragments amplifiés (par exemple une sonde utilisable dans le système de PCR en temps réel TaqMan).
L'invention concerne également un ensemble de séquences nucléotidiques comprenant un ou plusieurs oligonucléotides marqués utilisables pour la détection spécifique d'au moins deux miARN du tableau 1, par exemple dans une expérience de Northern Blot. Dans un mode particulier de réalisation, l'ensemble de séquences contient des oligonucléotides spécifiques 10 de chacun des miARN du tableau 1, du tableau 2, du tableau 3, du 4, du tableau 5 ou du tableau 6.
L'invention concerne également un support multipuits pour PCR, comprenant au moins deux paires d'amorces PCR spécifiques chacune d'un miARN différent du tableau 1, du tableau 2, 15 du tableau 3, du 4, du tableau 5 ou du tableau 6, chacune des paires d'amorce étant disposées dans un puits différent du support. Selon une variante spécifique, le support contient des paires d'amorces consistant en des amorces spécifiques d'au moins deux miARN
du tableau 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, chacune des paires d'amorces étant disposées dans un puits différent du support. Selon un mode particulier de réalisation, le support multipuits comprend des paires
A titre illustratif, la trousse selon l'invention peut être une trousse pour la réalisation d'une PCR en temps réel et également contenir une reverse transcriptase, une ADN
polymérase, un ou plusieurs tampon(s) adaptés aux réactions à mettre en oeuvre, des sondes spécifiques des régions amplifiées (par exemple sondes Taqman0), ou des marqueurs spécifiques de l'ADN
double brin comme le SYBR Green.
L'invention concerne également un ensemble de séquences nucléotidiques, cet ensemble comprenant des paires d'amorces utilisables pour amplifier spécifiquement au moins deux miARN choisi parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-5p, miR-30d et miR-30e-3 dans une expérience de PCR. Selon une variante, les séquences nucléotidiques permettent l'amplification d'un ou plusieurs miARN de chacun des tableaux 4, 5 et 6. Selon un mode particulier de réalisation, l'ensemble de séquences nucléotidiques comprend des paires d'amorces permettant l'amplification spécifique de tous les miARN listés ci-avant. Selon une variante de réalisation, l'ensemble de séquences nucléotidiques peut également comprendre une séquence nucléotidique utilisable comme sonde marquée pour la détection et quantification des fragments amplifiés (par exemple une sonde utilisable dans le système de PCR en temps réel TaqMan).
L'invention concerne également un ensemble de séquences nucléotidiques comprenant un ou plusieurs oligonucléotides marqués utilisables pour la détection spécifique d'au moins deux miARN du tableau 1, par exemple dans une expérience de Northern Blot. Dans un mode particulier de réalisation, l'ensemble de séquences contient des oligonucléotides spécifiques 10 de chacun des miARN du tableau 1, du tableau 2, du tableau 3, du 4, du tableau 5 ou du tableau 6.
L'invention concerne également un support multipuits pour PCR, comprenant au moins deux paires d'amorces PCR spécifiques chacune d'un miARN différent du tableau 1, du tableau 2, 15 du tableau 3, du 4, du tableau 5 ou du tableau 6, chacune des paires d'amorce étant disposées dans un puits différent du support. Selon une variante spécifique, le support contient des paires d'amorces consistant en des amorces spécifiques d'au moins deux miARN
du tableau 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, chacune des paires d'amorces étant disposées dans un puits différent du support. Selon un mode particulier de réalisation, le support multipuits comprend des paires
20 d'amorces spécifiques de tous les miARN du tableau 1, du tableau 2, du tableau 3, du 4, du tableau 5 ou du tableau 6, chacune de ces paires d'amorces étant disposées dans un puits différent. Selon un autre mode spécifique de réalisation, le support contient des paires d'amorces consistant en des amorces spécifiques de tous les miARN du tableau 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, chacune des paires d'amorces étant disposées dans un puits différent du support.
La présente invention est illustrée par les figures et exemples suivants.
Légende des figures Figure 1 : (haut) nombre de miARN différents détectés par catégorie d'échantillons après profil d'expression par cartes TLDA A et B (patients 3-8ans) ou TLDA A
(patients 13-18ans).
(bas) Ct moyen par catégorie d'échantillon. Sains 3-8ans (5 échantillons), DMD
3-8 ans (5 échantillons), sains 13-18ans (3 échantillons), DMD 13-18ans (2 échantillons).
Figure 2 : heatmaps comprenant les abondances de chaque miARN identifié pour chaque donneur testé, et regroupement hiérarchique des donneurs selon l'expression des miARN
La présente invention est illustrée par les figures et exemples suivants.
Légende des figures Figure 1 : (haut) nombre de miARN différents détectés par catégorie d'échantillons après profil d'expression par cartes TLDA A et B (patients 3-8ans) ou TLDA A
(patients 13-18ans).
(bas) Ct moyen par catégorie d'échantillon. Sains 3-8ans (5 échantillons), DMD
3-8 ans (5 échantillons), sains 13-18ans (3 échantillons), DMD 13-18ans (2 échantillons).
Figure 2 : heatmaps comprenant les abondances de chaque miARN identifié pour chaque donneur testé, et regroupement hiérarchique des donneurs selon l'expression des miARN
21 candidats. (haut) heatmap pour les 3-8ans. (bas) heatmap pour les 13-18ans.
Les heatmaps et les calculs de regroupement hiérarchique sont réalisés via le logiciel CIMminer (http://discover nci.nih.gov/cimminer/) Figure 3 : exemple de miARN dérégulés dans l'urine de patients DMD.
L'abondance de miARN est représentée en fonction du groupe de patients.
EXEMPLES
Matériel et Méthodes :
L'urine est collectée dans des récipients stériles. Dans la demi-heure qui suit, elle est centrifugée à 2000rpm pendant 5min afin d'éliminer les cellules présentes. Le surnageant est ensuite récupéré, aliquoté et congelé à -80 C.
L'étude sur la carte A est basée sur des échantillons d'urine de 4 patients DMD et 6 sujets sains âgés de 3 à 8 ans ou sur 2 patients DMD et 3 sujets sains âgés de 13 à
18 ans.
L'étude sur la carte B est basée sur des échantillons d'urine de 4 patients DMD et 5 sujets sains.
10m1 d'urine sont utilisés afin d'extraire les ARN totaux contenant les microARN grâce au kit (< Urine total RNA maxi kit, slurry format de Norgen Biotek, selon le protocole du fournisseur. Les ARN sont élués dans 2 élutions successives de 100 L. Ils sont ensuite précipités sur la nuit à -20 C en présence d'acetate de sodium, d'éthanol absolu et d'acrylamide linéaire (Ambion) selon le protocole d'Ambion. Les ARN sont ensuite resuspendus dans de l'eau sans RNAse.
Un contrôle qualité des ARN est ensuite réalisé en 3 étapes : 1) dosage par l'absorbance à
260nm (Nanodrop 8000, Thermo Scientific) 2) électrophorèse capillaire sur puce RNA small et pico (Agilent Technologies) 3) amplification de 3 petits ARN urinaires contrôles par RT-qPCR (miR- 16, miR-377*, U6).
10Ong d'ARN total sont ensuite soumis à une transcription inverse multiplexe (Megaplex pools, Applied biosystems). Nous réalisons 2 transcriptions inverses à partir de 2 pools d'amorces différents : pools A et B. A eux deux, ils couvrent la détection de 762 microARN
différents, ce qui représente environ la moitié des 1424 miARN humains connus (miRbase, www.mirbase.org, release 17, avril 2011). Les ADN complémentaires obtenus subissent
Les heatmaps et les calculs de regroupement hiérarchique sont réalisés via le logiciel CIMminer (http://discover nci.nih.gov/cimminer/) Figure 3 : exemple de miARN dérégulés dans l'urine de patients DMD.
L'abondance de miARN est représentée en fonction du groupe de patients.
EXEMPLES
Matériel et Méthodes :
L'urine est collectée dans des récipients stériles. Dans la demi-heure qui suit, elle est centrifugée à 2000rpm pendant 5min afin d'éliminer les cellules présentes. Le surnageant est ensuite récupéré, aliquoté et congelé à -80 C.
L'étude sur la carte A est basée sur des échantillons d'urine de 4 patients DMD et 6 sujets sains âgés de 3 à 8 ans ou sur 2 patients DMD et 3 sujets sains âgés de 13 à
18 ans.
L'étude sur la carte B est basée sur des échantillons d'urine de 4 patients DMD et 5 sujets sains.
10m1 d'urine sont utilisés afin d'extraire les ARN totaux contenant les microARN grâce au kit (< Urine total RNA maxi kit, slurry format de Norgen Biotek, selon le protocole du fournisseur. Les ARN sont élués dans 2 élutions successives de 100 L. Ils sont ensuite précipités sur la nuit à -20 C en présence d'acetate de sodium, d'éthanol absolu et d'acrylamide linéaire (Ambion) selon le protocole d'Ambion. Les ARN sont ensuite resuspendus dans de l'eau sans RNAse.
Un contrôle qualité des ARN est ensuite réalisé en 3 étapes : 1) dosage par l'absorbance à
260nm (Nanodrop 8000, Thermo Scientific) 2) électrophorèse capillaire sur puce RNA small et pico (Agilent Technologies) 3) amplification de 3 petits ARN urinaires contrôles par RT-qPCR (miR- 16, miR-377*, U6).
10Ong d'ARN total sont ensuite soumis à une transcription inverse multiplexe (Megaplex pools, Applied biosystems). Nous réalisons 2 transcriptions inverses à partir de 2 pools d'amorces différents : pools A et B. A eux deux, ils couvrent la détection de 762 microARN
différents, ce qui représente environ la moitié des 1424 miARN humains connus (miRbase, www.mirbase.org, release 17, avril 2011). Les ADN complémentaires obtenus subissent
22 ensuite une étape de préamplification (preAmp master mix et preAmp primer pools, Applied Biosystems) avant d'être déposés sur des plaques TLDA (Taqman Low Density Array). Cette technologie a été développée par Applied Biosystems, et consiste en la détection simultanée de 381 miARN sur plaque 384 puits par RT-qPCR. La quantité relative de chaque miARN est déterminée en normalisant par le Ct (cycle threshold) moyen de chaque échantillon (Mestdagh, Genome Biol 2009), et en utilisant un échantillon de donneur sain comme référence (méthode du ddCt). On détermine ensuite les ratios des quantités relatives de chaque miARN entre la population de donneurs sains et la population de patients DMD.
Les quantités relatives sont calculées selon la méthode des delta delta de Ct.
Avec dCt (miR) = Ct miR ¨ Ct calibrateur;
ddCt (miR) = dCt (référence) ¨ dCt (miR); et Quantité relative (miR) = 2Adelta delta Ct (miR).
La référence correspond à la valeur moyenne obtenue pour un miR donné chez les donneurs sains. Le calibrateur correspond au Ct moyen de toute la plaque TLDA.
Resultats :
Nous avons considéré uniquement les miARN détectés avec un Ct inférieur à 35 pour un seuil de 0,1, selon le logiciel RQ manager (Applied Biosystems). Parmi les sujets 3-8 ans, en considérant uniquement le panel A des cartes TLDA utilisées, et pour chaque échantillon urinaire, nous avons détecté une moyenne de 172 miARN différents, le Ct moyen de chaque échantillon étant égal à 28,2 (figure 1). Parmi les sujets 13-18 ans, en considérant uniquement le panel A des cartes TLDA utilisées, et pour chaque échantillon urinaire, nous avons détecté
une moyenne de 210 miARN différents, le Ct moyen de chaque échantillon étant égal à 27,8 (figure 1). Le panel B a uniquement été testé pour les donneurs 3-8ans et a permis de détecter une moyenne de 160 miARN supplémentaires (soit environ 330 miARN différents détectables dans l'urine des donneurs de 3-8ans). Nous observons donc une abondance et une variété
assez importantes de miARN dans l'urine.
Nous avons enfin déterminé la liste des miARN différemment représentés dans l'urine des patients DMD par rapport aux donneurs sains, en comparant les sujets d'âge équivalent (1:
groupe 3-8 ans; 2: groupe 13-18 ans). Les miARN sont représentés dans le tableau 7 et pour chaque miARN est indiqué son niveau de dérégulation dans l'urine des groupes 3-8ans et 13-18 ans (facteur de différence), sa catégorie (augmenté, diminué chez les DMD
par rapport
Les quantités relatives sont calculées selon la méthode des delta delta de Ct.
Avec dCt (miR) = Ct miR ¨ Ct calibrateur;
ddCt (miR) = dCt (référence) ¨ dCt (miR); et Quantité relative (miR) = 2Adelta delta Ct (miR).
La référence correspond à la valeur moyenne obtenue pour un miR donné chez les donneurs sains. Le calibrateur correspond au Ct moyen de toute la plaque TLDA.
Resultats :
Nous avons considéré uniquement les miARN détectés avec un Ct inférieur à 35 pour un seuil de 0,1, selon le logiciel RQ manager (Applied Biosystems). Parmi les sujets 3-8 ans, en considérant uniquement le panel A des cartes TLDA utilisées, et pour chaque échantillon urinaire, nous avons détecté une moyenne de 172 miARN différents, le Ct moyen de chaque échantillon étant égal à 28,2 (figure 1). Parmi les sujets 13-18 ans, en considérant uniquement le panel A des cartes TLDA utilisées, et pour chaque échantillon urinaire, nous avons détecté
une moyenne de 210 miARN différents, le Ct moyen de chaque échantillon étant égal à 27,8 (figure 1). Le panel B a uniquement été testé pour les donneurs 3-8ans et a permis de détecter une moyenne de 160 miARN supplémentaires (soit environ 330 miARN différents détectables dans l'urine des donneurs de 3-8ans). Nous observons donc une abondance et une variété
assez importantes de miARN dans l'urine.
Nous avons enfin déterminé la liste des miARN différemment représentés dans l'urine des patients DMD par rapport aux donneurs sains, en comparant les sujets d'âge équivalent (1:
groupe 3-8 ans; 2: groupe 13-18 ans). Les miARN sont représentés dans le tableau 7 et pour chaque miARN est indiqué son niveau de dérégulation dans l'urine des groupes 3-8ans et 13-18 ans (facteur de différence), sa catégorie (augmenté, diminué chez les DMD
par rapport
23 aux sains), et son potentiel en tant que biomarqueurs (note sur 4). Les miARN
à très haut potentiel (potentiel=4) montrent des facteurs de modification importants et/ou une dérégulation dans les 2 groupes d'âge. Les miARN à bon potentiel (potentiel=1) montrent des facteurs de différence faibles mais significatifs. Les miARN à haut potentiel ou à potentiel intermédiaires ont la note de 3 ou 2. La figure 2 représente ces résultats sous la forme de 2 heatmaps, une par groupe d'âge. A partir des données d'abondance des différents miARN
urinaires sélectionnées dans le tableau 7, l'algorithme de regroupement hierarchique utilisé
(http://discover.nci.nih.gov/cimminer/) permet de séparer efficacement les donneurs en fonction de leur statut sain ou DMD. Ainsi, ce résultat montre que l'expression des miARN
identifiés peut être utilisée comme signature de la pathologie DMD. La figure 3 représente des exemples de miARN dérégulés chez les patients DMD.
Tableau 7 Facteur de différence augmente/diminue miARN urinairepotentiel /4 (DMD / sains) chez DMD 3-8ans 3-8ans hsa-let-7f 80000 augmente 4 hsa-let-7a 20000 augmente 4 hsa-miR-548d-5p 4000 augmente 4 hsa-miR-183 2000 augmente 4 hsa-miR-490-3p 2000 augmente 4 hsa-miR-520a-3p 1000 augmente 4 hsa-miR-590-3p 80 augmente 4 hsa-miR-15a 9 augmente 4 hsa-miR-224 8000 augmente 3 hsa-miR-182 25 augmente 3 hsa-miR-23b 8 augmente 3 hsa-miR-492 6 augmente 3 hsa-let-7c 5 augmente 3 hsa-let-7e 5 augmente 3 hsa-miR-15b 5 augmente 3 hsa-miR-206 3 augmente 3 hsa-miR-335 3 augmente 3 hsa-miR-33a* 3 augmente 3 hsa-miR-487b 3 augmente 3 hsa-miR-628-3p 12 augmente 2 hsa-miR-659 9 augmente 2 hsa-miR-505* 7 augmente 2 hsa-let-7b 5 augmente 2
à très haut potentiel (potentiel=4) montrent des facteurs de modification importants et/ou une dérégulation dans les 2 groupes d'âge. Les miARN à bon potentiel (potentiel=1) montrent des facteurs de différence faibles mais significatifs. Les miARN à haut potentiel ou à potentiel intermédiaires ont la note de 3 ou 2. La figure 2 représente ces résultats sous la forme de 2 heatmaps, une par groupe d'âge. A partir des données d'abondance des différents miARN
urinaires sélectionnées dans le tableau 7, l'algorithme de regroupement hierarchique utilisé
(http://discover.nci.nih.gov/cimminer/) permet de séparer efficacement les donneurs en fonction de leur statut sain ou DMD. Ainsi, ce résultat montre que l'expression des miARN
identifiés peut être utilisée comme signature de la pathologie DMD. La figure 3 représente des exemples de miARN dérégulés chez les patients DMD.
Tableau 7 Facteur de différence augmente/diminue miARN urinairepotentiel /4 (DMD / sains) chez DMD 3-8ans 3-8ans hsa-let-7f 80000 augmente 4 hsa-let-7a 20000 augmente 4 hsa-miR-548d-5p 4000 augmente 4 hsa-miR-183 2000 augmente 4 hsa-miR-490-3p 2000 augmente 4 hsa-miR-520a-3p 1000 augmente 4 hsa-miR-590-3p 80 augmente 4 hsa-miR-15a 9 augmente 4 hsa-miR-224 8000 augmente 3 hsa-miR-182 25 augmente 3 hsa-miR-23b 8 augmente 3 hsa-miR-492 6 augmente 3 hsa-let-7c 5 augmente 3 hsa-let-7e 5 augmente 3 hsa-miR-15b 5 augmente 3 hsa-miR-206 3 augmente 3 hsa-miR-335 3 augmente 3 hsa-miR-33a* 3 augmente 3 hsa-miR-487b 3 augmente 3 hsa-miR-628-3p 12 augmente 2 hsa-miR-659 9 augmente 2 hsa-miR-505* 7 augmente 2 hsa-let-7b 5 augmente 2
24 hsa-let-7d 5 augmente 2 hsa-let-7g 5 augmente 2 hsa-miR-196b 5 augmente 2 hsa-miR-26b 5 augmente 2 hsa-miR-942 5 augmente 2 hsa-miR-200b* 3 augmente 2 hsa-miR-502-3p 3 augmente 2 hsa-miR-151-5p 3 augmente 1 hsa-miR-192* 3 augmente 1 hsa-miR-28-5p 3 augmente 1 hsa-miR-30d 3 augmente 1 hsa-miR-30e-3p 3 augmente 1 hsa-miR-668 -100 diminue 4 hsa-miR-1244 -20 diminue 4 hsa-miR-494 -20 diminue 4 hsa-miR-328 -10 diminue 4 hsa-miR-484 -5 diminue 3 hsa-miR-657 -17 diminue 2 hsa-miR-593 -13 diminue 2 hsa-miR-650 -12 diminue 2 hsa-miR-720 -12 diminue 2 Facteur de différence augmente / diminue chez potentiel miARN urinaire (DMD / sains) DMD 13-18ans /4 13-18ans hsa-miR-521 40000 augmente 4 hsa-miR-597 30000 augmente 4 hsa-miR-208 54 augmente 4 hsa-miR-490-3p 20 augmente 4 hsa-miR-328 7 augmente 4 hsa-miR-494 7 augmente 4 hsa-miR-34c-5p 26 augmente 3 hsa-miR-433 20 augmente 3 hsa-miR-381 15 augmente 3 hsa-miR-410 14 augmente 3 hsa-miR-198 84 augmente 2 hsa-miR-511 58 augmente 2 hsa-miR-373 36 augmente 2 hsa-miR-548c-5p 29 augmente 2 hsa-miR-220 26 augmente 2 hsa-miR-346 24 augmente 2 hsa-miR-518b 24 augmente 2 hsa-miR-214 22 augmente 2 hsa-miR-520g 22 augmente 2 hsa-miR-548b-5p 21 augmente 2 hsa-miR-517b 17 augmente 2 hsa-miR-518e 17 augmente 2 hsa-miR-518f 17 augmente 2 hsa-miR-493 13 augmente 2 hsa-miR-523 12 augmente 2 hsa-miR-874 -2000 diminue 4 hsa-let-7f -171 diminue 4 hsa-miR-183 -162 diminue 4 hsa-miR-15a -16 diminue 4 hsa-miR-412 -620 diminue 3 hsa-miR-216b -533 diminue 3 hsa-miR-23a -464 diminue 3 hsa-miR-139-5p -216 diminue 3 hsa-miR-376c -128 diminue 3 hsa-miR-492 -123 diminue 3 hsa-miR-423-5p -120 diminue 3 hsa-let-7e -11 diminue 3 hsa-let-7c -10 diminue 3 has-miR-155 -17 diminue 2 hsa-let-7b -10 diminue 2 REFERENCES
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Claims (15)
1. Procédé pour le diagnostic ou pour l'évaluation du risque de développer ou présenter une dystrophie musculaire chez un sujet, comprenant la mesure du niveau d'expression d'au moins un microARN dans un échantillon d'urine dudit sujet et la comparaison dudit niveau d'expression mesuré dans ledit échantillon d'urine à un niveau obtenu dans un échantillon de référence sain, une différence entre le niveau d"expression par rapport à
l'échantillon de référence étant indicative d'une dystrophie chez le sujet.
l'échantillon de référence étant indicative d'une dystrophie chez le sujet.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le au moins un microARN est choisi parmi les let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-28-5p, miR-30d et miR-30e-3p.
3. Procédé pour le diagnostic ou pour l'évaluation du risque de développer ou présenter une dystrophie musculaire chez un sujet, comprenant la mesure du niveau d'expression dans un échantillon de liquide corporel dudit sujet d'au moins un microARN choisi parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-28-5p, miR-30d et miR-30e-3p.
4. Procédé de suivi de l'évolution d'une dystrophie musculaire comprenant la mesure du niveau d'expression d'au moins un microARN choisi parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-28-5p, miR-30d et miR-30e-3p dans un second échantillon de liquide corporel d'un sujet, ce niveau dans l'échantillon du sujet étant comparé au niveau dudit microARN dans un premier échantillon de référence qui correspond à un échantillon prélevé
antérieurement sur le même sujet;
l'évolution du niveau d'expression du ou des microARN choisis étant indicative d'une progression de la dystrophie musculaire.
antérieurement sur le même sujet;
l'évolution du niveau d'expression du ou des microARN choisis étant indicative d'une progression de la dystrophie musculaire.
5. Procédé pour déterminer l'efficacité d'un traitement thérapeutique d'une dystrophie musculaire chez un sujet, comprenant a) la mesure du niveau d'expression dans un liquide corporel dudit sujet, d'un ou plusieurs microARN, moyennant quoi un niveau de référence est déterminé; puis b) la mesure du niveau d'expression dudit au moins un microARN choisi dans l'étape a) dans un second échantillon de liquide biologique prélevé au même sujet à un temps donné après l'administration du traitement thérapeutique, moyennant quoi un niveau de test est déterminé;
et c) la comparaison des niveaux contrôle et de test, l'évolution du niveau d'expression des microARN choisis étant indicative d'un traitement efficace du sujet;
ledit ou lesdits miARN étant choisi(s) parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-28-5p, miR-30d et miR-30e-3p.
et c) la comparaison des niveaux contrôle et de test, l'évolution du niveau d'expression des microARN choisis étant indicative d'un traitement efficace du sujet;
ledit ou lesdits miARN étant choisi(s) parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-28-5p, miR-30d et miR-30e-3p.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, l'échantillon étant un échantillon d'urine.
7. Procédé pour (a) le suivi de l'évolution d'une dystrophie musculaire ou (b) déterminer l'efficacité d'un traitement thérapeutique d'une dystrophie musculaire chez un sujet, comprenant la mesure du niveau d'expression dans un échantillon d'urine dudit sujet d'au moins un microARN choisi parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-28-5p, miR-30d et miR-30e-3p.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ledit ou lesdits microARN étant choisi(s) parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p, miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g et miR-493.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ledit ou lesdits miARN étant choisi(s) parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381 et miR-34c-5p.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ledit ou lesdits miARN étant choisi(s) parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597 et miR-874.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, le procédé
comprenant la mesure de l'ensemble des miARN listés.
comprenant la mesure de l'ensemble des miARN listés.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour le diagnostic, l'évaluation du risque, le suivi de l'évolution ou le suivi de l'efficacité d'un traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne ou de la dystrophie musculaire de Becker, en particulier de la dystrophie musculaire de Duchenne.
13. Trousse comprenant des moyens de détection ou de dosage de microARN, les moyens de détection ou de dosage dans la trousse consistant en des moyens de détection ou de dosage d'un ou plusieurs miARN choisis parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-28-5p, miR-30d et miR-30e-3p.
14. Trousse selon la revendication 13, chacun des miARN étant détectés ou dosés au moyen d'une sonde et/ou paire d'amorces spécifique.
15. Support multipuits pour PCR comprenant des paires d'amorces PCR consistant en des amorces spécifiques d'au moins deux miARN choisis dans le groupe constitué de let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-28-5p, miR-30d et miR-30e-3p, chacune des paires d'amorce étant disposée dans un puits différent du support.
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