CN104271760A - 用于肌营养不良的诊断和治疗随访的方法 - Google Patents

用于肌营养不良的诊断和治疗随访的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及通过检测体液中、尤其是尿液中的微RNA来进行肌营养不良的诊断、随访和治疗效能评估。

Description

用于肌营养不良的诊断和治疗随访的方法
技术领域
本发明涉及通过检测体液中、尤其是尿液中的微RNA来进行肌营养不良的诊断、随访和治疗效能评估。
背景技术
Duchenne型肌营养不良(DMD)和Becker型肌营养不良(BMD)由编码肌养蛋白的基因的突变或缺失造成(Muntoni,Torelli等，2003)。在表型最为严重的第一种情形中，肌养蛋白完全不存在。允许细胞内肌动蛋白微丝附着于细胞外基质(Le Rumeur,Winder等)的DAPC复合物(肌养蛋白结合蛋白复合物)也不存在。这种复合物通常保护经历收缩和松弛的肌纤维的膜。在它不存在的情况下，纤维不再受到保护，并且我们在肌肉中观察到经历变性的肌细胞和作为倾向于抵消这种现象的再生的证据的新细胞(Batchelor和Winder 2006)。最终，再生不充分，并且纤维被脂肪组织代替。
在治疗上，目前将最大的希望放在外显子跳跃技术上(Cirak,Arechavala-Gomeza等；Lu,Yokota等)。事实上，引起严重性较低的表型的BMD也是由编码肌养蛋白的基因中的一个或多个突变造成的，但是蛋白质的基本结构域被保留：
-与肌动蛋白微丝结合的N-端结构域，
-与DAPC复合物结合的富含半胱氨酸的C-端结构域。
因此，对于DMD患者来说，可以通过排除信使RNA(mRNA)内带有无义突变的外显子来获得Becker表型，并因此恢复开放阅读框。这样产生的较短的蛋白有部分功能。这种策略目前正在几项临床试验中进行试验。
定期的多学科医学监测能够评估病理进展并提出管理方案以延长患者的寿命。它包括防止退缩、提供技术帮助、物理疗法、心脏监测、整形外科和呼吸辅助。诊断随访通过例如运动功能评估，通过肌肉活检或通过循环中分泌的酶，肌酸激酶的测定等来进行(Bushby,Finkel等)。
肌肉活检分析能够观察受损的纤维、表明肌肉再生的较小纤维以及被脂肪组织代替的坏死区。这种方法的缺点在于它对患者具有非常大的侵入性。
另一种方法由测定血液中的肌酸激酶(CK)构成。这种酶与几种细胞类型中存在的能量代谢相关。它在血液中浓度的增加表明了肌纤维的降解状态。然而，这种生物标志物不是完全可靠的，因为他的水平也取决于应激，例如体力活动(Nicholson,Morgan等，1986)。还存在其他的酶例如醛缩酶或乳酸脱氢酶，但是与CK的情况相同，它们的丰度不仅仅依赖于病理状态(Lott和Landesman 1984)。
因此，在Duchenne型肌营养不良的情形中，似乎必需鉴定更可靠的新的生物标志物，可以在非侵入性样品例如尿液样品的基础上测定的标志物。
微RNA(或miRNA)是有希望的生物标志物。它们在身体的所有组织中，尤其是骨骼肌中表达。还已知道，它们以“循环”状态存在于所有生物流体中(Weber,Baxter等)。文献中的最近工作显示，Duchenne型肌病的特有识别标志存在于肌肉(Cacchiarelli,Martone等；Greco,DeSimone等，2009)和血清(Cacchiarelli,Legnini等)中。
到目前为止，没有研究显示出miRNA用作在尿液中肌营养不良标志物的潜在用途。本发明人调查了在患有肌营养不良的患者的尿液中miRNA的存在情况，以便鉴定这种类型的障碍特有的识别标志。
此外，本发明人还调查了肌营养不良的新的循环标志物。
发明概述
本发明人尤其是调查了DMD患者的尿液样品，以便确定是否可以鉴定这种障碍特有的miRNA。这一工作显示，存在与某些miRNA在DMD患者的尿液中比在健康供体的尿液中更加丰富的表达相关的特异性识别标志。
一种或多种miRNA在患病个体中相对于健康个体中的表达的这种变化的发现，在诊断领域中找到应用。因此，本发明涉及将选自表1中的miRNA的至少一种miRNA应用于诊断肌营养不良的方法。它还涉及使用一种或多种所述miRNA来评估发生或出现肌营养不良的风险。
表1：
更具体来说，本发明涉及用于在对象中诊断肌营养不良或评估发生或出现肌营养不良的风险的方法，所述方法包括测量所述对象的体液样品(例如尿液样品)中至少一种miRNA的表达水平。本发明尤其可以包括将在所述样品中测量到的所述表达水平与在健康参比样品中获得的水平进行比较，所述表达水平相对于所述参比水平之间的差异，指示了所述对象中的肌营养不良。
本发明还涉及用于诊断肌营养不良或评估发生或出现肌营养不良的风险的方法，所述方法包括在对象的体液样品(例如尿液样品)中确定选自表1中列出的miRNA的至少一种miRNA的存在或其表达水平。
本发明尤其涉及用于诊断肌营养不良、特别是Duchenne型肌营养不良的方法，所述方法包括比较：
a)对象的体液(例如尿液)样品(试验样品)中至少一种miRNA的表达水平，所述miRNA选自表1中的miRNA，与
b)健康参比样品中所述miRNA的表达水平，
所述试验样品中相对于所述参比样品中的表达水平之间的统计上显著的差异，指示了所述对象中的肌营养不良。
根据特定方面，本发明涉及一种用于诊断肌营养不良的方法，所述方法包括下列步骤：
-测量从待试验对象(例如被怀疑患有肌营养不良的对象)获得的体液(尤其是尿液)样品中选自表1中的miRNA的至少一种miRNA的表达水平；以及
-在所述样品中至少一种所述miRNA的表达水平与健康参比样品中所述miRNA的表达水平之间，或
-在从被怀疑患有肌营养不良的患者获得的样品中至少第一种所述miRNA的表达水平与从患有肌营养不良、尤其是DMD的患者获得的参比样品中所述miRNA的表达水平之间，
进行比较。
因此，可以在从被怀疑患有肌营养不良的患者获得的样品与健康参比样品或从患有肌营养不良的患者获得的参比样品之间，比较所述miRNA的表达水平。
在较早发表的工作中尚未报道过尿液中肌营养不良、尤其是DMD所特有的miRNA的存在。此外，尚未报道过下列miRNA存在于体液中并指示肌营养不良：let-7f，let-7a，miR-548d-5p，miR-183，miR-490-3p，miR-520a-3p，miR-590-3p，miR-15a，miR-1244，miR-328，miR-494，miR-668，miR-208，miR-521，miR-597，miR-874，miR-224，miR-182，miR-23b，miR-492，let-7c，let-7e，miR-15b，miR-487b，miR-410，miR-139-5p，miR-216b，miR-423-5p，miR-484，miR-23a，miR-376c，miR-412，miR-433，miR-335，miR-33a*，miR-193a-3p，miR-381，miR-34c-5p，miR-628-3p，miR-659，miR-505*，let-7b，let-7d，let-7g，miR-196b，miR-26b，miR-942，miR-200b*，miR-523，miR-346，miR-155，miR-548b-5p，miR-548c-5p，miR-518f，miR-886-3p，miR-650，miR-720，miR-593，miR-657，miR-502-3p，miR-198，miR-214，miR-220，miR-373，miR-511，miR-517b，miR-518a-3p，miR-518b，miR-518e，miR-520g，miR-493，miR-151-5p，miR-192*，miR-28-5p，miR-30d和miR-30e-3p。因此，根据特定实施方式，本发明的方法包括测量选自上一句中列出的miRNA的至少一种miRNA的水平。
根据另一种特定实施方式，本发明的方法包括在对象的尿液样品中测量选自下列的至少一种miRNA的水平：let-7f，let-7a，miR-548d-5p，miR-183，miR-490-3p，miR-520a-3p，miR-590-3p，miR-15a，miR-1244，miR-328，miR-494，miR-668，miR-208，miR-521，miR-597，miR-874，miR-224，miR-182，miR-23b，miR-492，let-7c，let-7e，miR-15b，miR-487b，miR-410，miR-139-5p，miR-216b，miR-423-5p，miR-484，miR-23a，miR-376c，miR-412，miR-433，miR-206，miR-335，miR-33a*，miR-193a-3p，miR-381，miR-34c-5p，miR-628-3p，miR-659，miR-505*，let-7b，let-7d，let-7g，miR-196b，miR-26b，miR-942，miR-200b*，miR-523，miR-346，miR-155，miR-548b-5p，miR-548c-5p，miR-518f，miR-886-3p，miR-650，miR-720，miR-593，miR-657，miR-502-3p，miR-198，miR-214，miR-220，miR-373，miR-511，miR-517b，miR-518a-3p，miR-518b，miR-518e，miR-520g，miR-493，miR-151-5p，miR-192*，miR-28-5p，miR-30d和miR-30e-3p，在所述对象的样品中相对于所述健康参比样品中所述miRNA水平的差异的测量，指示了可能的肌营养不良。
本发明还涉及监测肌营养不良的演变的方法，以及用于评估肌营养不良的治疗性治疗的效能的方法。在这种情形中，所述方法包括在对象的体液(尤其是尿液)的第二样品中测量至少一种上面提到的miRNA的表达水平，将所述对象样品中的这一水平与第一参比样品中所述miRNA的水平进行比较，所述第一参比样品对应于之前从同一对象获取的样品。在监测治疗的效能时，所述第一样品可以在向所述对象施用治疗性治疗之前获取，并且所述第二样品可以在施用所述治疗性治疗之后(例如施用所述治疗性治疗之后几天/几周/几个月)获取。或者，所述第一和第二样品两者都可以在施用所述治疗性治疗之后获取(例如，第一样品在治疗后、在这一治疗的当天或所述治疗后几天/几周/几个月获取，并且第二样品在所述第一样品之后几天/几周/几个月获取)。
本发明还涉及用于诊断肌营养不良的试剂盒和多孔支持物。
发明详述
“微RNA”(或miRNA)是长度约为17至26个核苷酸的非编码单链RNA，其通过抑制其靶mRNA的翻译来调控基因表达。已被鉴定的miRNA被记录在miRBase数据库第14版中(http://microarn.saner.ac.uk)。
在本发明的情形中，在提到“健康样品”时，“参比样品”对应于从未患肌营养不良的一个或多个、优选为两个或更多对象获得的样品。参比样品也可以对应于从一个或多个患有肌营养不良的患者获得的样品。参比表达水平可以通过测量一个或多个对象中待探查的miRNA的表达水平来确定。这些参比水平也可以随着特定对象的群体进行调整。在优选实施方式中，参比样品从一群健康对象获得。参比样品中miRNA的表达分布情况优选地可以从两个或超过两个对象的群体开始产生。例如，所述群体可以包含2、4、5、10、15、20、30、40、50个或更多对象。在用于监测肌营养不良或用于监测治疗效能的方法的情形中，参比样品是从待监测的对象，但是在监测开始之前获取的样品。
“肌营养不良”尤其是指Duchenne型肌营养不良、Becker型肌营养不良、肢带型肌营养不良例如α-和γ-肌聚糖病。更具体来说，本发明涉及Duchenne型肌营养不良或Becker型肌营养不良、更具体为Duchenne型肌营养不良的调查。
术语“体液”或“生物流体”是指对象、尤其是人类对象的体液，即从对象获取的任何流体，例如血清、血浆、全血、尿液、脑脊液或唾液。根据优选实施方式，在本发明中使用的体液是尿液样品。
“对象”是指哺乳动物、人类或非人类，优选为人类。对象可以具有肌营养不良倾向(通过例如遗传分析或基于家族史的怀疑来揭示)，或者可能患有已诊断的肌营养不良。本发明还可以在对象不具有任何症状或已知倾向时应用于筛查。具体来说，本发明的方法可以应用于在症状外显的经典年龄(0-5岁)之前在幼儿中进行大规模筛查。本发明还可应用于在治疗的临床前开发期间监测疾病的动物模型，尤其是狗或小鼠模型，更具体是在狗中：GRMD(金毛猎犬肌营养不良)，LMD(拉布拉多猎犬肌营养不良)或CXMDj(日本的犬科动物X-连锁肌营养不良)。
术语样品中miRNA的“表达水平”对应于miRNA的特征性测量值，但是用分子或浓度的任意单位或质量单位表示，或者表示成相对于另一个测量值归一化的值，尤其是相对于参比样品(健康的或来自于患有肌营养不良的患者)中同一miRNA的量归一化的值。
miRNA的表达水平可以通过任何常规方法来测量，例如：
-在“DNA芯片”上杂交，
-对大量个体化miRNA进行高通量测序的方法，
-实时或数字定量PCR，
-Northern印迹，
-或通过专门针对miRNA的任何其他方法。
miRNA的表达水平可以通过“DNA芯片”技术来测量。“DNA”芯片技术对于本领域技术人员来说是公知的。它包括将提取到的miRNA在由尼龙膜、硅或玻璃表面、任选地纳米珠子或粒子构成的固相支持物上杂交，所述支持物带有固定在支持物或附连于支持物的已知序列的寡核苷酸。固定的寡核苷酸与微RNA或其转化产物(扩增产物、cDNA、RNA或cRNA)的序列的互补性，允许根据所使用的标记技术，在固定在支持物(DNA芯片)上的寡核苷酸的水平上产生信号(荧光、发光、放射活性、电信号等)。这一信号被特殊设备检测，并因此记录每个miRNA特有的这种信号的强度值。旨在用于miRNA检测的几种类型的芯片已经有售，例如由Affymetrix销售的GeneChip(R)miRNA、由销Exiqon售的miRcury阵列、由Miltenyi销售的miRXplore微阵列。
在通过测序进行高通量分析的情形中，从样品提取并纯化miRNA，并通过由测序设备供应商例如Roche、Invitrogen提供的方法彼此分离。这种类型的分析由下述步骤构成：将不同的微RNA分子个体化，执行扩增步骤，以及对由此产生的产物(“核酸的克隆”)进行测序。通过执行大量测序以鉴定每个这些“克隆”(几千个)，可以产生样品中存在的微RNA的名单，并通过对每个序列在所述详细名单中出现的次数进行计数，相当简单地定量每个这些miRNA。
在本发明的优选实施方式中，miRNA测定法通过定量PCR(实时PCR或数字PCR)来进行。实时PCR能够获得被称为Ct的值，该值对应于由其开始发射出的荧光超过一定阈值的循环数，所述阈值由用户在指数期开始时固定。该Ct值与样品中最初存在的cDNA(由miRNA被反转录酶反转录成cDNA而得到)的量成正比。在不存在特异性针对每种cDNA的标准范围的情况下，只能进行样品之间的相对定量。首先，为了能够比较样品中存在的且被分别地获取的每种miRNA的关联性(contingent)，将每种miRNA的测定值用对非编码RNA获得的数据进行归一化。也可以将miRNA的表达相对于PCR板(384孔TLDA板，每个孔包含不同的待检测miRNA，进一步详情参考实施例)的所有miRNA的平均Ct进行归一化。因此，可以将结果相对于在尿液中丰度显示出微乎其微的变化的几种参比miRNA进行归一化。数字PCR能够在将PCR反应在大量微孔中稀释后(数字PCR技术，Life Technologies或Roche)或在将PCR反应分散在油的微滴中后(微滴技术，Bio-Rad)，从起始样品确定它所包含的miRNA的精确拷贝数。
然后使用例如软件SDS2.3,RQ manager(Applied Biosystems)，并通过Microsoft Excel电子数据表上的ΔΔCt方法或用于复杂计算的任何其他软件，获得两种类型的样品之间miRNA的相对定量。
当通过在“DNA芯片”上杂交或通过Northern印迹或通过测序来分析miRNA的表达水平时，所述表达水平可以用公式I来表示：
(I)miRNAx的量＝miRNAx的检测信号的强度
其中“信号强度”表示通过适合的检测器在“DNA芯片”上记录的荧光、放射活性或发光的量，或通过测序通过高通量分析检测到的一致序列的数目。量用任意单位表示。
可以将miRNA的量相对于另一测定法、尤其是浓度在所分析的不同样品类型中不变的RNA(RNAnorm)进行归一化。这种归一化能够保证我们是在提取物中RNA浓度相近的情况下，比较在这些各种纯化的提取物中可检测到的miRNA的表达水平。在这种情形中，样品中miRNA的归一化的表达水平用公式II表示：
(II)归一化的miRNAx的量＝miRNAx的检测信号的强度/RNAnorm的信号强度
当通过实时PCR分析miRNA的表达水平时，它们可以用公式III表示，所述公式定义了当扩增循环数目等于Ct时，所述测定反应混合物中存在的miRNA的量(Ct时的miRNAx量)：
(III)Ct时的miRNAx量＝t0时的miRNA量x效率-Ct。
其中“t0时的miRNA量”表示在通过PCR扩增进行的测定反应开始的瞬间miRNA或其在cDNA中的等同物的量。公式(III)中的表述“效率”是指PCR的效率值(在通过ΔΔCt方法计算的情况下，被任意地固定为2)。该值依赖于各种实验条件，尤其是依赖于所使用的实时PCR装置。一旦为特定方案测量该值并对PCR机器进行配置后，不再必需在计算之前每次测量该值，除非对于给定实验来说改变了实验方案和/或机器的操作条件。
在特定实施方式中，通过实时定量PCR测定miRNA的表达水平。
下面的表2和3描述了相对于在健康对象中观察到的表达情况，在DMD患者中表达被改变的miRNA的表达情况。本发明人能够证实患者之间根据他们的年龄的表达差异，因此按照这一准则对信息进行分类。
表2：在3-8岁的患者/对象中指示性miRNA的表达情况
表3：在13-18岁的患者/对象中指示性miRNA的表达情况
表2和3的说明：提高：相对于健康对象，在患者中表达更高；降低：相对于健康对象，在患者中表达更低。
在来自于患者的样品中，相对于健康对象，上面列出的所有miRNA有变化。因此，本发明涉及(a)用于诊断肌营养不良、(b)用于监测肌营养不良的演变和(c)用于评估肌营养不良的治疗性治疗的效能的方法，所述方法包括确定来自于对象的体液样品中一种或多种这些miRNA的表达水平相对于参比样品中的表达水平的变化。
在特定实施方式中，第一类miRNA对应于在DMD患者的尿液中比例超出(over-represented)的miRNA(由表2和3中的类别“提高”表示)。如果将该第一类别的一种或多种miRNA用于本发明的方法：
-相对于在来自于健康对象的样品中获得的参比，在试验对象中较高的表达指示了肌营养不良(诊断方法)；
-在时间T2时从试验对象获取的样品中相对于在时间T1时(T1在时间顺序上先于T2)从同一试验对象获取的样品的较高的表达，将指示疾病的发展(预后方法或用于监测肌营养不良的方法)；
-在治疗患者中的肌营养不良的情形中，在时间T2时从试验对象获取的样品中相对于在时间T1时(T1在时间顺序上先于T2)从同一试验对象获取的样品的较低的表达，将指示疾病的有效治疗(监测肌营养不良的治疗的效能的方法)。
第二类miRNA在DMD患者的尿液中相对于健康对象中比例低下(under-represented)(由表2和3中的类别“降低”表示)。如果将该第二类别的一种或多种miRNA用于本发明的方法：
-相对于在来自于健康对象的样品中获得的参比，在试验对象中较低的表达将指示肌营养不良(诊断方法)；
-在时间T2时从试验对象获取的样品中相对于在时间T1时(T1在时间顺序上先于T2)从同一试验对象获取的样品的较低的表达，将指示疾病的发展(预后方法或用于监测肌营养不良的方法)；
-在治疗患者中的肌营养不良的情形中，在时间T2时从试验对象获取的样品中相对于在时间T1时(T1在时间顺序上先于T2)从同一试验对象获取的样品的较高的表达，将指示疾病的有效治疗(监测肌营养不良的治疗的效能的方法)。
“较高的表达水平”或“较低的表达水平”是指根据本领域技术人员公知的程序，其变化在统计上显著的表达水平。
鉴定到的两类miRNA以及它们在本发明的诊断方法中的利用的上述描述，使用了从健康对象获得的参比样品。当然，当参比样品来自于患有肌营养不良的患者时，所调查的表达变化将被反转。
本发明的方法尤其包括选自表2和3中的miRNA的至少一种miRNA的检测。
根据第一实施方式变化形式，所检测的miRNA选自表4中的miRNA。
表4
let-7f miR-23b miR-193a-3p miR-518f
let-7a miR-492 miR-381 miR-886-3p
miR-548d-5p let-7c miR-34c-5p miR-650
miR-183 let-7e miR-628-3p miR-720
miR-490-3p miR-15b miR-659 miR-593
miR-520a-3p miR-487b miR-505* miR-657
miR-590-3p miR-410 let-7b miR-502-3p
miR-15a miR-139-5p let-7d miR-198
miR-1244 miR-216b let-7g miR-214
miR-328 miR-423-5p miR-196b miR-220
miR-494 miR-484 miR-26b miR-373
miR-668 miR-23a miR-942 miR-511
miR-208 miR-376c miR-200b* miR-517b
miR-521 miR-412 miR-523 miR-518a-3p
miR-597 miR-433 miR-346 miR-518b
miR-874 miR-206 miR-155 miR-518e
miR-224 miR-335 miR-548b-5p miR-520g
miR-182 miR-33a* miR-548c-5p miR-493
根据第二实施方式变化形式，所检测的miRNA选自表5中的miRNA。
表5
根据第三实施方式变化形式，所检测的miRNA选自表6中的miRNA。
表6
根据特定实施方式，体液样品、尤其是尿液样品，来自于人类对象，并且所检测的一种或多种miRNA选自表2和3中的miRNA，或者选自表2或3中并且也出现在表4、5和6之一中的miRNA。
在本发明的方法之后，可以进一步在包括用于评估肌营养不良的已知步骤(例如测定肌酸激酶的水平、在肌肉活检样品中搜索特定标志物、基因组分析等)的程序中证实诊断(或风险评估)、预后或治疗效能。因此，如上所述的本发明的诊断方法的特定实施方式还包括使用用于评估肌营养不良的可替选方法来证实诊断的步骤。
本发明还涉及用于诊断肌营养不良的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测或测定选自下列的至少一种miRNA的用品：let-7f，let-7a，miR-548d-5p，miR-183，miR-490-3p，miR-520a-3p，miR-590-3p，miR-15a，miR-1244，miR-328，miR-494，miR-668，miR-208，miR-521，miR-597，miR-874，miR-224，miR-182，miR-23b，miR-492，let-7c，let-7e，miR-15b，miR-487b，miR-410，miR-139-5p，miR-216b，miR-423-5p，miR-484，miR-23a，miR-376c，miR-412，miR-433，miR-206，miR-335，miR-33a*，miR-193a-3p，miR-381，miR-34c-5p，miR-628-3p，miR-659，miR-505*，let-7b，let-7d，let-7g，miR-196b，miR-26b，miR-942，miR-200b*，miR-523，miR-346，miR-155，miR-548b-5p，miR-548c-5p，miR-518f，miR-886-3p，miR-650，miR-720，miR-593，miR-657，miR-502-3p，miR-198，miR-214，miR-220，miR-373，miR-511，miR-517b，miR-518a-3p，miR-518b，miR-518e，miR-520g，miR-493，miR-151-5p，miR-192*，miR-28-5p，miR-30d和miR-30e-3p。根据特定实施方式，试剂盒包含用于检测或测定这一名单中上的所有miRNA的用品。根据特定实施方式，试剂盒包含用于检测或测定选自表4、表5或表6中列出的miRNA的一种或多种miRNA(特别是所有)的用品。根据特定实施方式，试剂盒中用于检测或测定的用品，由用于检测或测定表2和3中的一种或多种miRNA或在表4、5和6的每个中列出的一种或多种miRNA的用品构成。根据特定实施方式，使用试剂盒检测或测定的miRNA由表4中的所有miRNA、更特别地表5中的所有miRNA、甚至更特别地表6中的所有miRNA构成。
作为示例，本发明的试剂盒可以是用于执行实时PCR的试剂盒，并且还可以含有反转录酶、DNA聚合酶、适合于所使用的反应的一种或多种缓冲剂、被扩增区域的特异性探针(例如Taqman？探针)或双链DNA的特异性标志物例如SYBR Green。
本发明还涉及一组核苷酸序列，所述组包含可用于在PCR实验中特异性扩增选自下列的至少两种miRNA的引物对：let-7f，let-7a，miR-548d-5p，miR-183，miR-490-3p，miR-520a-3p，miR-590-3p，miR-15a，miR-1244，miR-328，miR-494，miR-668，miR-208，miR-521，miR-597，miR-874，miR-224，miR-182，miR-23b，miR-492，let-7c，let-7e，miR-15b，miR-487b，miR-410，miR-139-5p，miR-216b，miR-423-5p，miR-484，miR-23a，miR-376c，miR-412，miR-433，miR-206，miR-335，miR-33a*，miR-193a-3p，miR-381，miR-34c-5p，miR-628-3p，miR-659，miR-505*，let-7b，let-7d，let-7g，miR-196b，miR-26b，miR-942，miR-200b*，miR-523，miR-346，miR-155，miR-548b-5p，miR-548c-5p，miR-518f，miR-886-3p，miR-650，miR-720，miR-593，miR-657，miR-502-3p，miR-198，miR-214，miR-220，miR-373，miR-511，miR-517b，miR-518a-3p，miR-518b，miR-518e，miR-520g，miR-493，miR-151-5p，miR-192*，miR-28-5p，miR-30d和miR-30e-3。根据一种变化形式，所述核苷酸序列允许扩增来自于表4、5和6的每个的一种或多种miRNA。根据特定实施方式，所述核苷酸序列组包含允许特异性扩增上面列出的所有miRNA的引物对。根据一种实施方式的变化形式，所述核苷酸序列组还可以包含可作为标记探针用于检测和定量被扩增的片段的核苷酸序列(例如可用于TaqMan实时PCR系统中的探针)。
本发明还涉及一组核苷酸序列，其包含可用于在例如Northern印迹实验中特异性检测表1中的至少两种miRNA的一种或多种标记的寡核苷酸。在特定实施方式中，所述序列组含有用于表1、表2、表3、表4、表5或表6中的每个miRNA的特异性寡核苷酸。
本发明还涉及用于PCR的多孔支持物，其包含各自特异性针对来自于表1、表2、表3、表4、表5或表6的不同miRNA的至少两种PCR引物对，每种引物对被安排在支持物的不同孔中。根据特定变化形式，支持物含有由特异性针对表1、2、3、4、5或6中的至少两种miRNA的引物构成的引物对，每种引物对被安排在支持物的不同孔中。根据特定实施方式，多孔支持物包含特异性针对表1、表2、表3、表4、表5或表6中的所有miRNA的引物对，这些引物对中的每一种被安排在不同的孔中。根据另一种特定实施方式，支持物含有由特异性针对表1、2、3、4、5或6中的所有miRNA的引物构成的引物对，每种引物对被安排在支持物的不同孔中。
本发明通过下面的图和实施例进行说明。
附图说明
图1：(顶部)在通过TLDA卡A和B(3-8岁患者)或TLDA A(13-18岁患者)进行表达情况分析后，每个样品类型中检测到的不同miRNA的数目。(底部)每种样品类型的平均Ct。3-8岁的健康对象(5个样品)，3-8岁的DMD(5个样品)，13-18岁的健康对象(3个样品)，13-18岁的DMD(2个样品)。
图2：热图，其包含了为每个试验的供体鉴定的每种miRNA的丰度，根据候选miRNA的表达进行的供体的层次分组。(顶部)3-8岁的供体的热图。(底部)13-18岁的供体的热图。热图和层次分组的计算使用软件CIMminer(http://discover.nci.nih.gov/cimminer/)来进行。
图3：在DMD患者的尿液中失调miRNA的实例。示出了miRNA的丰度随患者组的变化。
实施例
材料和方法：
将尿液收集在无菌容器中。在接下来的半个小时内，将它以2000rpm离心5分钟，以便除去存在的细胞。然后将上清液回收，分成等分试样并在-80℃冷冻。
在卡A上的调查是基于来自于3至8岁的4位DMD患者和6位健康对象的尿液样品，或基于13至18岁的2位DMD患者和3位健康对象。
在卡B上的调查是基于来自于4位DMD患者和5位健康对象的尿液样品。
使用来自于Norgen Biotek的试剂盒“尿液总RNA大提试剂盒，浆状形式(Urine total RNA maxi kit,slurry format)”，按照供应商的流程，使用10ml尿液来提取含有微RNA的总RNA。将RNA在2次连续的100μL洗脱中洗脱。然后按照Ambion的流程，在乙酸钠、无水乙醇和直链丙烯酰胺(Ambion)存在下，在-20℃沉淀过夜。然后将RNA重悬浮在无RNAse的水中。
然后在3个步骤中进行RNA的质量控制：1)通过260nm处的吸收(Nanodrop8000，Thermo Scientific)进行测定；2)在小型皮摩尔级RNA芯片(Agilent Technologies)上进行毛细管电泳；3)通过RT-qPCR扩增3个小的对照尿液RNAs(miR-16、miR-377*、U6)。
然后对100ng总RNA进行多路反转录(Megaplex pools，Appliedbiosystems)。我们从两种不同的引物合并物开始进行2个反转录：合并物A和B。它们合在一起覆盖762种不同微RNA的检测，这代表了1424种已知人类miRNA(miRbase,www.mirbase.org，2011年4月17日公布)的约一半。然后对获得的互补DNA进行预扩增步骤(preAmp主混合物和preAmp引物合并物，Applied Biosystems)，随后沉积在TLDA(Taqman低密度阵列)板上。这种技术由Applied Biosystems开发，并且由在384孔板上通过RT-qPCR同时检测381种miRNA构成。每种miRNA的相对量，通过用每种样品的平均Ct(循环阈值)进行归一化，并通过使用来自于健康供体的样品作为参比(ddCt方法)来确定。然后确定在健康供体群体与DMD患者群体之间每种miRNA的相对量的比率。
相对量通过ΔΔCt方法来计算。其中dCt(miR)＝Ct miR–Ct校准物；
ddCt(miR)＝dCt(参比)–dCt(miR)；并且
相对量(miR)＝2^ΔΔCt(miR)。
参比对应于在健康供体中对给定miR获得的平均值。校准物对应于整个TLDA板的平均Ct。
结果：
我们只考虑了按照RQ manager软件(Applied Biosystems)，被检测到对于0.1的阈值来说具有低于35的Ct的miRNA。在3-8岁的对象中，考虑仅仅使用TLDA卡的A组，并且对于每个尿液样品来说，我们检测了平均172种不同miRNA，每个样品的平均Ct等于28.2(图1)。在13-18岁的对象中，考虑仅仅使用TLDA卡的A组，并且对于每个尿液样品来说，我们检测了平均210种不同miRNA，每个样品的平均Ct等于27.8(图1)。B组仅仅对3-8岁的供体进行了试验，并且能够检测平均160种其他miRNA(即可以在3-8岁供体的尿液中检测到约330种不同miRNA)。因此，我们在尿液中观察到了相当大的miRNA丰度和品种。
最后，我们通过比较等同年龄的对象(1：3-8岁组；2：13-18岁组)，确定了相对于健康供体在DMD患者的尿液中占比不同的miRNA的名单。miRNA示出在表7中，标出了对于每种miRNA来说，它在3-8岁组和13-18岁组的尿液中的失调水平(差异系数)、它的类别(在DMD患者中相对于健康对象提高、降低)及其作为生物标志物的潜力(按4分制评分)。具有非常高潜力(潜力＝4)的miRNA在2个年龄组中显示出大的改变系数和/或失调。具有良好潜力(潜力＝1)的miRNA显示出小但显著的差异系数。具有高潜力或具有中等潜力的miRNA具有3或2的分值。图2以2张热图的形式示出了这些结果，每个年龄组一张热图。根据表7中所选的不同尿液miRNA的丰度数据，所使用的层次分类算法(http://discover.nci.nih.gov/cimminer/)允许将供体根据它们的健康或DMD状态有效地分开。因此，这一结果显示，鉴定到的miRNA的表达可用作DMD病理的识别标志。图3给出了在DMD患者中失调miRNA的实例。
表7
参考文献
Batchelor,C.L.和S.J.Winder(2006)，“瞬态放电、信号和减震器：肌养蛋白的丧失如何引起肌营养不良”(Sparks,signals and shockabsorbers:how dystrophin loss causes muscular dystrophy)，Trends Cell Biol16(4):198-205.
Bushby,K.,R.Finkel等，“Duchenne型肌营养不良的诊断和管理，第1部分：诊断以及药理和社会心理管理”(Diagnosis and managementof Duchenne muscular dystrophy,part1:diagnosis,and pharmacologicaland psychosocial management)，Lancet Neurol9(1):77-93.
Cacchiarelli,D.,I.Legnini等，“miRNA作为Duchenne型肌营养不良的血清标志物”(miRNAs as serum biomarkers for Duchenne musculardystrophy)，EMBO Mol Med3(5):258-65.
Cacchiarelli,D.,J.Martone等，“包含在与Duchenne型肌营养不良病理发生相关的分子电路图中的微RNA由肌养蛋白/nNOS途径控制”(MicroRNAs involved in molecular circuitries relevant for the Duchennemuscular dystrophy pathogenesis are controlled by the dystrophin/nNOSpathway)，Cell Metab12(4):341-51.
Cirak,S.,V.Arechavala-Gomeza等，“在患有Duchenne型肌营养不良的患者中，在磷酰二胺吗啉代寡核苷酸的系统治疗后的外显子跳跃和肌养蛋白恢复：开放标记的2期剂量提升研究”(Exon skipping anddystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy aftersystemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment:anopen-label,phase2,dose-escalation study)，Lancet.
Gidlof,O.,P.Andersson等，“在患有ST升高心肌梗塞的患者中，心脏特异性微RNA的血浆水平与肌钙蛋白和心功能相关，选择性依赖于肾消除并且可以在尿液样品中检测”(Cardiospecific microRNAPlasma Levels Correlate with Troponin and Cardiac Function in Patientswith ST Elevation Myocardial Infarction,Are Selectively Dependent onRenal Elimination,and Can Be Detected in Urine Samples)，Cardiology118(4):217-226.
Greco,S.,M.De Simone等，(2009)，“由Duchenne型肌营养不良和急性局部缺血引起骨骼肌损伤和再生中常见的micro-RNA识别标志”(Common micro-RNA signature in skeletal muscle damage andregeneration induced by Duchenne muscular dystrophy and acuteischemia)，Faseb J23(10):3335-46.
Hanke,M.,K.Hoefig等，“研究作为肿瘤标志物的尿液微RNA的可靠方法：微RNA-126和微RNA-182与膀胱癌相关”(A robustmethodology to study urine microRNA as tumor marker:microRNA-126and microRNA-182are related to urinary bladder cancer)，Urol Oncol28(6):655-61.
Le Rumeur,E.,S.J.Winder等，“肌养蛋白：远超其部分的加和”(Dystrophin:more than just the sum of its parts)，Biochim Biophys Acta1804(9):1713-22.
Lott,J.A.和P.W.Landesman(1984)，“骨骼肌障碍的酶学”(Theenzymology of skeletal muscle disorders)，Crit Rev Clin Lab Sci20(2):153-90.
Lu,Q.L.,T.Yokota等，“外显子跳跃作为Duchenne型肌营养不良的治疗方法的现状”(The status of exon skipping as a therapeuticapproach to duchenne muscular dystrophy)，Mol Ther19(1):9-15.
Muntoni,F.,S.Torelli等，(2003)，“肌养蛋白和突变：一个基因，几种蛋白，多种表型”(Dystrophin and mutations:one gene,severalproteins,multiple phenotypes)，Lancet Neurol2(12):731-40.
Nicholson,G.A.,G.J.Morgan等，(1986)，“有氧运动对血清肌酸激酶活性的影响”(The effect of aerobic exercise on serum creatinekinase activities)，Muscle Nerve9(9):820-4.
Wang,G.,L.S.Tam等，“在患有系统性红斑狼疮的患者中的血清和尿液的游离微RNA水平”(Serum and urinary free microRNA level inpatients with systemic lupus erythematosus)，Lupus20(5):493-500.
Weber,J.A.,D.H.Baxter等，“12种体液中的微RNA谱”(ThemicroRNA spectrum in12body fluids)，Clin Chem56(11):1733-41.
Yamada,Y.,H.Enokida等，“尿液中miR-96和miR-183的检测起到尿路上皮癌的潜在肿瘤标志物的作用：与阶段和等级的相关性以及与尿液细胞学的比较”(MiR-96and miR-183detection in urine serve aspotential tumor markers of urothelial carcinoma:correlation with stage andgrade,and comparison with urinary cytology)，Cancer Sci102(3):522-9.

Claims (15)

1.一种用于诊断或评估在对象中发生或出现肌营养不良的风险的方法，所述方法包括测量所述对象的尿液样品中至少一种微RNA的表达水平，并将在所述尿液样品中测量到的所述表达水平与在健康参比样品中获得的水平进行比较，所述表达水平相对于所述参比样品之间的差异指示了所述对象中的营养不良。
2.权利要求1中所要求的方法，其中所述至少一种微RNA选自let-7f、let-7a、miR-548d-5p、miR-183、miR-490-3p、miR-520a-3p、miR-590-3p、miR-15a、miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、miR-182、miR-23b、miR-492、let-7c、let-7e、miR-15b、miR-487b、miR-410、miR-139-5p、miR-216b、miR-423-5p、miR-484、miR-23a、miR-376c、miR-412、miR-433、miR-206、miR-335、miR-33a*、miR-193a-3p、miR-381、miR-34c-5p、miR-628-3p、miR-659、miR-505*、let-7b、let-7d、let-7g、miR-196b、miR-26b、miR-942、miR-200b*、miR-523、miR-346、miR-155、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、miR-502-3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、miR-517b、miR-518a-3p、miR-518b、miR-518e、miR-520g、miR-493、miR-151-5p、miR-192*、miR-28-5p、miR-30d和miR-30e-3p。
3.一种用于诊断或评估在对象中发生或出现肌营养不良的风险的方法，所述方法包括在所述对象的体液样品中测量至少一种微RNA的表达水平，所述微RNA选自let-7f、let-7a、miR-548d-5p、miR-183、miR-490-3p、miR-520a-3p、miR-590-3p、miR-15a、miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、miR-182、miR-23b、miR-492、let-7c、let-7e、miR-15b、miR-487b、miR-410、miR-139-5p、miR-216b、miR-423-5p、miR-484、miR-23a、miR-376c、miR-412、miR-433、miR-335、miR-33a*、miR-193a-3p、miR-381、miR-34c-5p、miR-628-3p、miR-659、miR-505*、let-7b、let-7d、let-7g、miR-196b、miR-26b、miR-942、miR-200b*、miR-523、miR-346、miR-155、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、miR-502-3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、miR-517b、miR-518a-3p、miR-518b、miR-518e、miR-520g、miR-493、miR-151-5p、miR-192*、miR-28-5p、miR-30d和miR-30e-3p。
4.一种用于监测肌营养不良的演变的方法，所述方法包括在对象的第二体液样品中中测量至少一种微RNA的表达水平，所述微RNA选自let-7f、let-7a、miR-548d-5p、miR-183、miR-490-3p、miR-520a-3p、miR-590-3p、miR-15a、miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、miR-182、miR-23b、miR-492、let-7c、let-7e、miR-15b、miR-487b、miR-410、miR-139-5p、miR-216b、miR-423-5p、miR-484、miR-23a、miR-376c、miR-412、miR-433、miR-335、miR-33a*、miR-193a-3p、miR-381、miR-34c-5p、miR-628-3p、miR-659、miR-505*、let-7b、let-7d、let-7g、miR-196b、miR-26b、miR-942、miR-200b*、miR-523、miR-346、miR-155、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、miR-502-3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、miR-517b、miR-518a-3p、miR-518b、miR-518e、miR-520g、miR-493、miR-151-5p、miR-192*、miR-28-5p、miR-30d和miR-30e-3p，将所述对象的样品中的这一水平与第一参比样品中所述微RNA的水平进行比较，所述第一参比样品对应于之前从同一对象获取的样品；
所选的一种或多种微RNA的表达水平的演变，指示了肌营养不良的发展。
5.一种用于在对象中确定肌营养不良的治疗性治疗的效能的方法，所述方法包括：
a)测量所述对象的体液中一种或多种微RNA的表达水平，由此确定参比水平；然后
b)在施用所述治疗性治疗之后的给定时间，测量在从同一对象获取的生物流体的第二样品中在步骤a)中选择的所述至少一种微RNA的表达水平，由此确定试验水平；以及
c)比较对照水平和试验水平，所选的微RNA的表达水平的演变指示了所述对象的有效治疗；
所述一种或多种miRNA选自let-7f、let-7a、miR-548d-5p、miR-183、miR-490-3p、miR-520a-3p、miR-590-3p、miR-15a、miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、miR-182、miR-23b、miR-492、let-7c、let-7e、miR-15b、miR-487b、miR-410、miR-139-5p、miR-216b、miR-423-5p、miR-484、miR-23a、miR-376c、miR-412、miR-433、miR-335、miR-33a*、miR-193a-3p、miR-381、miR-34c-5p、miR-628-3p、miR-659、miR-505*、let-7b、let-7d、let-7g、miR-196b、miR-26b、miR-942、miR-200b*、miR-523、miR-346、miR-155、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、miR-502-3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、miR-517b、miR-518a-3p、miR-518b、miR-518e、miR-520g、miR-493、miR-151-5p、miR-192*、miR-28-5p、miR-30d和miR-30e-3p。
6.权利要求3至5任一项中所要求的方法，所述样品是尿液样品。
7.一种用于在对象中(a)监测肌营养不良的演变或(b)确定肌营养不良的治疗性治疗的效能的方法，所述方法包括测量所述对象的尿液样品中至少一种微RNA的表达水平，所述微RNA选自let-7f、let-7a、miR-548d-5p、miR-183、miR-490-3p、miR-520a-3p、miR-590-3p、miR-15a、miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、miR-182、miR-23b、miR-492、let-7c、let-7e、miR-15b、miR-487b、miR-410、miR-139-5p、miR-216b、miR-423-5p、miR-484、miR-23a、miR-376c、miR-412、miR-433、miR-206、miR-335、miR-33a*、miR-193a-3p、miR-381、miR-34c-5p、miR-628-3p、miR-659、miR-505*、let-7b、let-7d、let-7g、miR-196b、miR-26b、miR-942、miR-200b*、miR-523、miR-346、miR-155、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、miR-502-3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、miR-517b、miR-518a-3p、miR-518b、miR-518e、miR-520g、miR-493、miR-151-5p、miR-192*、miR-28-5p、miR-30d和miR-30e-3p。
8.权利要求1至7任一项中所要求的方法，所述一种或多种microRN选自let-7f、let-7a、miR-548d-5p、miR-183、miR-490-3p、miR-520a-3p、miR-590-3p、miR-15a、miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、miR-182、miR-23b、miR-492、let-7c、let-7e、miR-15b、miR-487b、miR-410、miR-139-5p、miR-216b、miR-423-5p、miR-484、miR-23a、miR-376c、miR-412、miR-433、miR-206、miR-335、miR-33a*、miR-193a-3p、miR-381、miR-34c-5p、miR-628-3p、miR-659、miR-505*、let-7b、let-7d、let-7g、miR-196b、miR-26b、miR-942、miR-200b*、miR-523、miR-346、miR-155、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、miR-502-3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、miR-517b、miR-518a-3p、miR-518b、miR-518e、miR-520g和miR-493。
9.权利要求1至8任一项中所要求的方法，所述一种或多种miRNA选自let-7f、let-7a、miR-548d-5p、miR-183、miR-490-3p、miR-520a-3p、miR-590-3p、miR-15a、miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、miR-182、miR-23b、miR-492、let-7c、let-7e、miR-15b、miR-487b、miR-410、miR-139-5p、miR-216b、miR-423-5p、miR-484、miR-23a、miR-376c、miR-412、miR-433、miR-206、miR-335、miR-33a*、miR-193a-3p、miR-381和miR-34c-5p。
10.权利要求1至9任一项中所要求的方法，所述一种或多种miRNA选自let-7f、let-7a、miR-548d-5p、miR-183、miR-490-3p、miR-520a-3p、miR-590-3p、miR-15a、miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597和miR-874。
11.权利要求1至10任一项中所要求的方法，所述方法包括测量列出的所有miRNA。
12.权利要求1至11任一项中所要求的方法，用于Duchenne型肌营养不良或Becker型肌营养不良、尤其是Duchenne型肌营养不良的诊断、风险评估、演变监测或治疗效能监测。
13.一种试剂盒，其包含用于微RNA的检测或测定的用品，所述试剂盒中用于检测或测定的用品由用于一种或多种miRNA的检测或测定的用品构成，所述miRNA选自let-7f、let-7a、miR-548d-5p、miR-183、miR-490-3p、miR-520a-3p、miR-590-3p、miR-15a、miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、miR-182、miR-23b、miR-492、let-7c、let-7e、miR-15b、miR-487b、miR-410、miR-139-5p、miR-216b、miR-423-5p、miR-484、miR-23a、miR-376c、miR-412、miR-433、miR-206、miR-335、miR-33a*、miR-193a-3p、miR-381、miR-34c-5p、miR-628-3p、miR-659、miR-505*、let-7b、let-7d、let-7g、miR-196b、miR-26b、miR-942、miR-200b*、miR-523、miR-346、miR-155、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、miR-502-3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、miR-517b、miR-518a-3p、miR-518b、miR-518e、miR-520g、miR-493、miR-151-5p、miR-192*、miR-28-5p、miR-30d和miR-30e-3p。
14.权利要求13中所要求的试剂盒，每个所述miRNA利用探针和/或特异性引物对来检测或测定。
15.一种用于PCR的多孔支持物，其包含由至少两种miRNA的特异性引物构成的PCR引物对，所述miRNA选自let-7f、let-7a、miR-548d-5p、miR-183、miR-490-3p、miR-520a-3p、miR-590-3p、miR-15a、miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、miR-182、miR-23b、miR-492、let-7c、let-7e、miR-15b、miR-487b、miR-410、miR-139-5p、miR-216b、miR-423-5p、miR-484、miR-23a、miR-376c、miR-412、miR-433、miR-206、miR-335、miR-33a*、miR-193a-3p、miR-381、miR-34c-5p、miR-628-3p、miR-659、miR-505*、let-7b、let-7d、let-7g、miR-196b、miR-26b、miR-942、miR-200b*、miR-523、miR-346、miR-155、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、miR-502-3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、miR-517b、miR-518a-3p、miR-518b、miR-518e、miR-520g、miR-493、miR-151-5p、miR-192*、miR-28-5p、miR-30d和miR-30e-3p，各个引物对被安排在所述支持物的不同孔中。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017084610A1 (zh) * 2015-11-20 2017-05-26 昆山彭济凯丰生物科技有限公司 miR-183或其抑制剂的用途
CN108359725A (zh) * 2018-01-11 2018-08-03 中国科学院微生物研究所 微RNA hsa-mir-593-5p及其类似物的应用和表达该微RNA载体的应用
CN112430645A (zh) * 2020-12-09 2021-03-02 北京华瑞康源生物科技发展有限公司 一种多重实时荧光pcr法检测人dmd基因拷贝数的相对定量方法及试剂盒

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140004646A (ko) 2010-12-15 2014-01-13 미라젠 세러퓨틱스 잠금 뉴클레오티드를 포함하는 마이크로rna 억제제
CA2850223A1 (en) 2011-10-06 2013-04-11 Eva Van Rooij Control of whole body energy homeostasis by microrna regulation
CN104685056A (zh) 2012-06-21 2015-06-03 米拉根医疗股份有限公司 包含锁核酸基序的基于寡核苷酸的抑制剂
US20140309280A1 (en) * 2013-04-12 2014-10-16 Emory University Assays for micro-rna-182 as a biomarker for muscle atrophy and therapeutic applications
EA201791644A1 (ru) 2015-01-20 2018-01-31 Мираджен Терапьютикс, Инк. Ингибиторы mir-92 и их применение
CN106296524A (zh) * 2016-08-19 2017-01-04 北京大学人民医院 随访方法及系统
JP2019528081A (ja) * 2016-08-30 2019-10-10 イェール ユニバーシティーＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 子宮内膜症についてのバイオマーカーとしてのマイクロｒｎａ
KR102359603B1 (ko) * 2019-09-24 2022-02-08 건국대학교 글로컬산학협력단 근육질환 및 혈관질환 진단용 마커로서의 miR-5739의 용도

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010136415A1 (en) * 2009-05-25 2010-12-02 Università Degli Studi Di Roma "La Sapienza" miRNA BIOMARKERS FOR THE DIAGNOSIS OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY, ITS PROGRESSION AND FOR MONITORING THERAPEUTIC INTERVENTIONS

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4215197A (en) * 1978-08-04 1980-07-29 Miles Laboratories, Inc. Test means and method for creatinine determination
US5360740A (en) * 1992-07-02 1994-11-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Assay system for degenerative muscle disease

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010136415A1 (en) * 2009-05-25 2010-12-02 Università Degli Studi Di Roma "La Sapienza" miRNA BIOMARKERS FOR THE DIAGNOSIS OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY, ITS PROGRESSION AND FOR MONITORING THERAPEUTIC INTERVENTIONS

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
THOMAS C ROBERTS,ET AL: "Expression Analysis in Multiple Muscle Groups and Serum Reveals Complexity in the MicroRNA Transcriptome of the mdx Mouse with Implications for Therapy", 《CITATION: MOLECULAR THERAPY–NUCLEIC ACIDS》 *
THOMAS C ROBERTS,ET AL: "Expression Analysis in Multiple Muscle Groups and Serum Reveals Complexity in the MicroRNA Transcriptome of the mdx Mouse with Implications for Therapy", 《CITATION: MOLECULAR THERAPY–NUCLEIC ACIDS》, 14 August 2012 (2012-08-14), pages 1 - 11 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017084610A1 (zh) * 2015-11-20 2017-05-26 昆山彭济凯丰生物科技有限公司 miR-183或其抑制剂的用途
CN108359725A (zh) * 2018-01-11 2018-08-03 中国科学院微生物研究所 微RNA hsa-mir-593-5p及其类似物的应用和表达该微RNA载体的应用
CN112430645A (zh) * 2020-12-09 2021-03-02 北京华瑞康源生物科技发展有限公司 一种多重实时荧光pcr法检测人dmd基因拷贝数的相对定量方法及试剂盒

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