CN107207557B - miRNA对m6A修饰水平的调控方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
公开了一种miRNA对RNA分子上的6‑甲基腺嘌呤(N6‑methyladenosine,m6A)修饰水平的调控方法及相关的进一步应用。通过提高或降低miRNA可以相应的提高或者降低m6A修饰水平，并进一步调节m6A修饰介导的功能。还公开了一种通过调节m6A而影响细胞重编程的调节方法及其利用的调节剂。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物技术领域，具体的，涉及一种通过miRNA对RNA分子上的 6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)修饰水平的调控方法及相关的进一步应用。
背景技术
RNA转录后的修饰为RNA功能的多样化奠定了化学基础，2011年更新的RNA修饰数据库RNAMDB共收录了109种RNA的修饰形式，其中甲基化修饰占80％。6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)，是发生在碱基A第六位N原子上的甲基化，作为真核生物中最常见的一种RNA转录后修饰，因其含量丰富，且保守性强，近年来得到了广泛的关注和研究。m6A由一个多组份甲基转移酶复合体催化生成，这个复合体包括至少三个核心蛋白，METTL3,METTL14和WTAP。m6A修饰可以被RNA去甲基化酶移除，已经鉴定出的两个去甲基化酶分别是FTO和ALKBH5。YTH结构域蛋白(YTHDF1–3) 是近年来发现的与m6A及ssRNA结合的蛋白家族，其中YTHDF2与m6A的结合能力最强。人类YTHDF2“阅读器”蛋白通过选择性识别m6A调控了mRNA降解。
虽然m6A修饰不影响被修饰的腺嘌呤的编码能力及与胸腺嘧啶或尿嘧啶互补配对的能力,但是它会影响非经典的腺嘌呤:鸟嘌呤(A:G)配对并可能影响RNA的二级结构。在m6A甲基化酶和去甲基化酶缺陷的细胞中信使核糖核酸的表达水平、翻译效率、核保留时间和稳定性会受到很大影响，因此m6A修饰被认为主要影响信使核糖核酸的代谢。核糖核酸上m6A修饰的可塑性和动态性使其成为一种新的表观调控标记，并且参与到生物钟、减数分裂和胚胎干细胞的增殖等重要生物进程(Fustin,J.M.,et al.； Okamura,H.；2013.RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadianclock.Cell 155,793-806.；Schwartz,S.,et al.；High-resolution mapping reveals aconserved,widespread,dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis.Cell155,1409-1421.；Geula,S.,et al.；2015.m6A mRNA methylation facilitatesresolution of naive pluripotency toward differentiation.Science.)，但是它的功能和调节机制在很大程度上是未知的。
随着m6A-Seq测序技术的诞生，人、小鼠和酵母的组织或细胞中m6A修饰的基本特征已经被鉴定出来。更重要的是，研究人员发现m6A存在于与人类疾病相关的基因编码的大量mRNAs中，包括癌症和几种脑疾病例如自闭症、阿尔茨海默氏症和精神分裂症，这表明这种修饰可以作为疾病治疗的靶标(Fu,Y.,et al.；2014.Gene expression regulationmediated through reversible m6A RNA methylation.Nat Rev Genet 15, 293-306.)。此后陆续的一些研究表明这种RNA修饰具有许多重要的功能，如去年1月，研究人员发现这种修饰的一个主要功能是控制RNA的寿命和降解，这一过程对于健康细胞发育极为重要。RNA寿命延长将会导致生成更多的蛋白。如果这一去甲基化机制存在缺陷，就有可能大大地影响细胞蛋白质水平。其中的一些蛋白质有可能对于人类机体的能量调控至关重要，影响了肥胖。为了能完成精确沉默各种不同mRNA的任务，生物机体需要通过加工过程和成熟后处理等多种微调机制，确保其稳定性和有效性。了解 RNA的修饰过程，将有助于科学家们解析这一作用机制，以及这一机制出现问题后，如何进行弥补。
miRNA是真核生物基因组中广泛存在的长度约为21～25个碱基(nt)的非编码微小RNA。它一般由位于基因间区及内含子中的miRNA基因转录，形成原始miRNA (pri-miRNA)，在动物细胞核内被加工成70nt左右的miRNA前体(pre-miRNA)，再转运到胞质加工为成熟miRNA。成熟miRNA进入miRNA诱导的基因沉默复合物 (miRNA-induced silencingcomplex；miRISC)，与目标mRNA配对，通过降解目标mRNA 或阻碍蛋白质翻译来负向调控基因表达。之前的报道提到m6A修饰可能会影响miRNA 结合到mRNA靶区域(Wang,Y.,et al.；2014b.N(6)-methyladenosine modification destabilizes developmental regulatorsin embryonic stem cells.Nat Cell Biol 16,191-198.)，但是miRNA是否直接调控m6A还没有被证明。
发明内容
本发明的目的是通过分析m6A修饰在多个多能性干细胞和分化的细胞中的分布图谱，鉴定了细胞类型特异的和之前未被报道的m6A修饰的特征。发现m6A修饰位点是潜在的miRNA靶区域，进一步研究结果表明miRNA在小鼠和人的细胞中都参与到m6A 总体修饰丰度和靶区域特异的修饰丰度的调节，改变miRNA的序列还可以产生新的m6A 修饰。还证实m6A修饰的改变会影响细胞重编程效率。本发明首次把miRNA和m6A修饰连接到一起，证实可以通过改变m6A修饰参与到细胞状态的调节，将会为研究m6A和 miRNA的调控机制和功能提供新的思路，通过miRNA调节RNA修饰可能是细胞命运调控和疾病治疗新的调控层面。
一方面，通过对小鼠胚胎干细胞、诱导多能性干细胞、神经干细胞和睾丸支持细胞进行转录组测序，m6A富集测序(m6A-Seq)，并对测序数据进行系统分析。在4个细胞系中稳定表达的有m6A修饰的基因的已知功能涉及很多重要的生物进程，包括转录调节，细胞周期调节，核糖核酸(RNA)加工，染色体修饰，程序性死亡和细胞内部的信号通路。
我们随后系统地检查了m6A修饰区域和miRNA的关系。结果表明表达的miRNA可以靶向大部分m6A修饰区域(75％)。与小鼠细胞系中的发现相似，HeLa细胞中75％的 m6A修饰区域是表达的miRNA的靶位点。
另一方面，在NSC和人的HeLa细胞中，利用小干涉RNA(siRNA)敲低或利用质粒过表达提高miRNA生成酶Dicer(负责剪切miRNA前体的内切酶)的表达，可以相应的降低或提高m6A丰度，同时也表明Dicer调控m6A整体水平的修饰在人和啮齿动物中是保守的。
再一方面，在NSC细胞中，过表达miRNA或敲低miRNA的表达，可以相应的提高或降低相应靶区域的m6A丰度，表明miRNA调控m6A特定位点的修饰。
再一方面，在NSC细胞中，突变的小分子RNA可以在新的与突变后小分子RNA互补的mRNA上产生m6A。
还一方面，本发明提供一种m6A甲基化酶抑制剂及敲低甲基化转移酶降低iPS效率的方法，说明m6A的修饰水平与细胞命运转变相关。
因此，本发明提供如下的技术方案：
本发明提供一种调控m6A修饰水平的试剂，所述试剂包括miRNA、miRNA调节剂或外源导入与miRNA类似的小分子RNA。
优选的，所述试剂能够提高或者降低m6A的修饰水平。
优选的，所述小分子RNA是具有与m6A基序配对的外源设计的小分子RNA。更优选的，所述小分子RNA是相对于内源性miRNA序列结构突变的小分子RNA。更优选的，所述序列结构突变的小分子RNA可以在新的与突变后小分子RNA互补的mRNA上产生 m6A。更优选的，所述突变的小分子RNA在与m6A基序匹对的位点上进行突变。更优选的所述突变的小分子RNA如SEQ ID No.29-32任一序列所示。
优选的，所述miRNA调节剂能够提高或者降低内源miRNA数量水平。
优选的，能够提高内源miRNA数量水平的miRNA调节剂包括但不限于过表达miRNA的mimics、miRNA生成相关的酶、miRNA生成相关的酶的基因、包含miRNA生成相关的酶的基因的表达载体或宿主细胞、或其他任一种外源设计的能提高miRNA表达水平的小分子RNA。
更优选的，所述miRNA生成相关的酶是miRNA生成酶Dicer。
优选的，能够降低内源miRNA数量水平的miRNA调节剂包括但不限于miRNA抑制剂或任一种外源设计的能降低miRNA表达水平的小分子RNA。更优选的，所述miRNA 抑制剂是miRNA降解相关的酶、miRNA降解相关的酶的基因、或者包含miRNA降解相关的酶的基因的表达载体或宿主细胞。
更优选的，所述小分子RNA是miRNA生成相关的酶的siRNA。更优选的，所述miRNA生成相关的酶是miRNA生成酶Dicer。更优选的，所述miRNA生成酶Dicer的siRNA 如SEQ IDNo.1-6任一序列所示。
优选的，所述试剂为药物组合物。更优选的，所述药物组合物用于治疗癌症和几种脑部疾病，例如，自闭症、阿尔茨海默氏症和精神分裂症等。
本发明还提供一种上述试剂在调控m6A修饰水平或者m6A修饰介导的功能中的应用。
本发明还提供一种上述试剂在制备调控m6A修饰水平或者m6A修饰介导的功能的调控制剂中的用途。
本发明还提供一种调控m6A修饰水平或者m6A修饰介导的功能的方法，其中，包括用上述试剂对m6A修饰进行调控。
优选的，所述m6A修饰介导的功能包括但不限于细胞命运调控、机体生物功能或疾病治疗的调控。更优选的，所述m6A修饰介导的功能包括m6A修饰参与的生物钟、减数分裂和胚胎干细胞的增殖等重要生物进程；癌症和几种脑部疾病，例如，自闭症、阿尔茨海默氏症和精神分裂症等。更优选的，所述m6A修饰介导的功能包括细胞重编程。更优选的，所述方法在体外进行。更优选的，所述方法不是治疗方法。
本发明还提供一种m6A调节剂在调节细胞重编程中的应用。
优选的，m6A调节剂是m6A抑制剂或促进剂。更优选的所述m6A抑制剂是环亮氨酸或其他作用于甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基化转移酶抑制剂，如3-脱氮腺苷、甲基化转移酶的siRNA等。更优选的，所述甲基化转移酶的siRNA如SEQ ID No. 41-43任一序列所示。所述m6A促进剂是m6A甲基化转移酶。
本发明还提供一种细胞重编程的调节方法，其中所述方法采用上述m6A调节剂进行调节。
本发明还提供一种上述m6A调节剂在制备调节细胞重编程的制剂的应用。
本发明的技术方案，从技术层面：本发明提出通过分析m6A修饰在多个多能性干细胞和分化的细胞中的分布图谱，鉴定了细胞类型特异的和之前未被报道的m6A修饰的特征。发现m6A修饰位点是潜在的miRNA靶区域，进一步研究结果表明miRNA在小鼠和人的细胞中都参与到m6A总体修饰丰度和靶区域特异的修饰丰度的调节。本发明还发现m6A修饰的改变会影响细胞重编程效率。从应用层面：通过操控miRNA的表达，可以实现：1)m6A整体修饰水平的改变；2)miRNA特定m6A位点修饰水平的改变；3) 改变小分子RNA的序列可以产生新的m6A修饰；4)调节m6A修饰参与的生物钟、减数分裂和胚胎干细胞的增殖等重要生物进程；5)通过miRNA调控m6A可以作为癌症和自闭症、阿尔茨海默氏症、精神分裂症和肥胖等疾病治疗靶标。6)总之，本发明提供了一种新的利用miRNA调控RNA m6A修饰的方法。本发明的方法首次实现对m6A水平紊乱引发疾病的治疗方面有重要应用价值。
附图的简要说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1为实施例1中四个细胞系中共有m6A修饰的特征。(A)在4个细胞系中稳定表达的有m6A修饰的基因富集的生物通路。(B)m6A修饰区域在细胞系稳定表达的且有一致性修饰图谱的转录本上的分布。每一条黑线表示对应区域存在m6A修饰。TcSS:转录起始位点区域；5′UTR:5′非翻译区域；CDS:编码区域；TsTS:翻译终止位点区域；3′UTR:3′非翻译区域。
图2为实施例2中m6A修饰位点是潜在的miRNA靶区域；(A)预测的小鼠细胞中可被miRNA靶向的m6A修饰区域的比例和对照区域的比例。‘***’代表Fisher精确检验p<2.2e-16。(B)在HeLa细胞中表达的miRNA靶向的m6A修饰区域的比例和对照区域的比例。‘***’代表Fisher精确检验p<2.2e-16。
图3为实施例3在NSC细胞中，利用小干涉RNA(siRNA)miRNA生成酶敲低Dicer 对m6A修饰丰度的影响(图3A)。在人的HeLa细胞中敲低Dicer降低了细胞水平的m6A 修饰丰度(图3B)；‘**’代表Student’s t-检验p<0.01；‘***’代表 Student’s t-检验p<0.001。
图4为实施例4中过表达miRNA生成酶Dicer，利用dot-blot方法检测m6A丰度。利用过表达Dicer质粒提高了细胞水平的m6A修饰丰度(图4A)。在人的HeLa细胞中过表达Dicer提高了细胞水平的m6A修饰丰度(图4B)；‘***’代表Student’s t- 检验p<0.001。
图5为实施例5中用m6A-QPCR的方法检测过表达miR-668-3p、miR-1981-5p、 miR-1224-5p、miR-330-5p和miR-455-3p对其靶位点miR-668-3p:KIF1B，miR-1981-5p: TAF5L，miR-1224-5p:SSRP1，miR-330-5p:TCF4和miR-455-3p:PIGT的m6A修饰丰度的影响。‘*’代表Student’s t-检验p<0.05；‘***’代表Student’s t- 检验p<0.001。
图6为实施例6中用m6A-QPCR的方法检测敲低miR-668-3p、miR-1981-5p、 miR-484、miR-330-5p和miR-455-3p对其靶位点miR-668-3p:KIF1B，miR-1981-5p: TAF5L，miR-484:NFE2L1，miR-330-5p:TCF4和miR-455-3p:PIGT的m6A修饰丰度的影响。‘*’代表Student’s t-检验p<0.05；‘**’代表Student’s t-检验p< 0.01；‘***’代表Student’s t-检验p<0.001。
图7为实施例7中用m6A-QPCR的方法检测过表达miR-330-5p-突变体、 miR-668-3p-突变体、miR-1981-5p-突变体和miR-1224-5p-突变体，对其新产生的靶位点miR-330-5p-突变体：FBXO21、miR-668-3p-突变体：TAGAP1、miR-1981-5p-突变体：FAM129B和miR-1224-5p-突变体：DDX6的m6A修饰丰度的影响。‘**’代表 Student’s t-检验p<0.01。
图8为实施例8中m6A甲基化酶抑制剂对iPS效率影响的AP染色(A)及克隆数目统计结果(B)，‘***’代表Student’s t-检验p<0.001。
图9为实施例9中敲低m6A甲基化转移酶对iPS效率影响的AP染色(A)及克隆数目统计结果(B)，‘**’代表Student’s t-检验p<0.01。
具体实施方式
可以理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，其并不作为对本发明的限制。在不偏离于本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能够确认，仅仅使用常规实验，许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤中。这些等同物被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。
除非特别指明，以下实施例中的胚胎干细胞(ESC)、诱导多能性干细胞(iPSC)、神经干细胞(NSC)和睾丸支持细胞(SC)均购自中国科学院动物研究所。
其中SC细胞的培养基配方为450ml DMEM加入50ml FBS，5ml 100x青链霉素。NSC培养基为N2B27培养基加入EGF和bFGF(浓度均为20ng/ml)，小鼠ES细胞和iPS细胞培养基为含20％胎牛血清(FBS,Gibco)的DMEM，并添加1000U的LIF(白血病抑制因子，Chemicon)、2mM的谷氨酰胺(glutamine，Sigma)、1mM的丙酮酸钠 (sodium pyruvate，Sigma)、以及0.1mM的β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol，Sigma)、 0.1mM的非必需氨基酸(non-essential aminoacid，Gibco)等。
除非特别指明，以下实施例中所用的荧光定量PCR仪型号为Stratagene Mx 3000P荧光定量PCR仪，购自吉泰公司。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级的试剂，且可从常规渠道商购获得。
实施例1
对小鼠胚胎干细胞、诱导多能性干细胞、神经干细胞和睾丸支持细胞进行转录组测序，m6A富集测序(m6A-Seq)和m6A修饰位点验证。从细胞中分离出总的RNA，并富集出高纯度和高完整度的mRNA。随后mRNA被打断成大约100个核苷酸大小的片段，然后用乙醇沉淀备用。一部分片段化的mRNA用于构建转录组测序文库。转录组文库构建和测序都按Illumia公司提供的标准流程操作。另一部分片段化的mRNA则用于富集包含m6A的片段，并采用与转录组测序相同的方法对富集的包含m6A的mRNA进行测序。以转录组测序数据为对照，我们在每个细胞系的m6A-Seq数据中鉴定了分布在 7,000-8,000个基因上的33,000-43,000个m6A富集区域。为了检查m6A修饰在4个细胞系稳定表达的转录本上的分布特征，我们采用基于香农熵的方法鉴定出在所有样品稳定表达的基因及这些基因是否有一致的m6A修饰模式。首先把转录本分成五个区域，转录起始区域(TcSS)，5′非翻译区(5′UTR)，蛋白编码区域(CDS)，翻译终止区域 (TsTS)，和3′非翻译区(3′UTR)，并且根据每个区域是否含有m6A修饰绘制了每个基因在4个样品中的m6A修饰图谱。
我们鉴定出8,558在所有样品稳定表达的基因。其中，3,880个转录本在所有检测的细胞中都有m6A修饰，并且2,489个转录本共享至少一个m6A修饰区域。编码这 3,880个转录本的基因倾向于参与到细胞周期调控、转录调节、RNA加工和表观修饰相关的生物进程(图1A)。我们随后研究了在所有样品都有修饰的3,880个稳定表达的转录本在4个细胞系中是否有一致的m6A修饰模式。在所有检测的细胞类型中，有大约50％的转录本在编码区和翻译终止区域有稳定的m6A修饰，而转录起始区域和5′非翻译区的比例只有5％。在检测的4个细胞系中，只有437(11％of 3,880)个转录本共享一致的m6A修饰模式，其中325个转录本至少共享1个m6A修饰区域(图1B)。
实施例2
从数据库miRBase(版本号20)下载小鼠成熟的miRNA序列，并与m6A修饰区域富集的基序比对。之前报道的m6A修饰基序是RRACH基序。在允许一个错配的条件下，种子区与m6A基序反向互补的miRNA被筛选出来。为了评估与miRNA种子区匹配的m6A 基序的比例是否为随机事件，我们对每个细胞系产生了500组模拟序列并使用相同的标准筛选出于miRNA种子区域互补配对的基序并计算其比例。为了系统地比较miRNA 和m6A修饰区域的关系，我们使用工具miRanda将成熟的miRNA序列比对到m6A修饰区域。为了研究miRNA和m6A修饰区域之间的靶向关系是否在人中是保守的,我们借助了人HeLa细胞中已经发表的m6A-Seq数据分析HeLa细胞中m6A修饰区域与miRNA的关系。
我们系统地检查了m6A修饰区域和miRNA的关系。通过把miRBase收集的小鼠成熟miRNA的序列比对到鉴定出来的m6A修饰区域，结果表明表达的miRNA可以靶向大部分m6A修饰区域(75％)，这一比例显著地高于对照区域(Fisher’s exact test, p<2.2e-16)(图2A)。鉴于在实验中我们只检测了小鼠细胞中m6A修饰的规律，为了研究miRNA和m6A修饰区域之间的靶向关系是否在人中是保守的,我们借助了人HeLa细胞中已经发表的m6A-Seq数据。与小鼠细胞系中的发现相似，HeLa细胞中75％的m6A 修饰区域是表达的miRNA的靶位点，这一比例显著地高于对照区域(Fisher’s exact test,p<2.2e-16)(图2B)。
实施例3
正常培养NSC和HeLa细胞，接种24h后，细胞融合度为50％时分别利用Lipofecamine RNAi Max(Invitrogen,13778150)和RFect siRNA Transfection reagent(Bio-Tran)试剂进行转染，转染的Dicer siRNA为三个siRNA的混合物，三个小鼠Dicer的siRNA的序列为：
GAGCGCCGAUCUCUAAUUA(SEQ ID No.1)；
GGGAAAGAGACUGUUAAAU(SEQ ID No.2)；
GGUGCUCCCAGUAAUCAAA(SEQ ID No.3)；
三个人Dicer的siRNA的序列为：
UGCUUGAAGCAGCUCUGGA(SEQ ID No.4)；
AAGGGCACCCAUCUCUAAU(SEQ ID No.5)；
GCCAAGGAAAUCAGCUAAA(SEQ ID No.6)。
每种siRNA的终浓度为60nM。转染24小时后收集细胞，利用TRIzol法提取总 RNA，使用
mRNA purification kit(Ambion,61006)提取mRNA。将准备好的mRNA转移到尼龙膜上，用兔抗m6A抗体(1:1000)(Synaptic Systems,202003) 4℃孵育过夜，洗膜后孵育二抗HRP-conjugated Goat anti-rabbit IgG (DakoCytomation,p0448)(1:5000)室温孵育30min后加上曝光液(A，B液等量混合)(GE Healthcare,RPN2232)1ml常温孵育1min后进行曝光并拍照。dot-blot 的信号强度使用Gel-Pro analyzer软件(MediaCybernetics)进行定量统计。
在NSC细胞中，利用小干涉RNA(siRNA)敲低miRNA生成酶Dicer的表达，使用dot-blot法检测m6A的丰度，结果表明敲低Dicer可以相应的降低m6A丰度(图3A左)，对dot-blot的结果进行灰度扫描及统计学分析，敲低Dicer后m6A丰度的降低, 设对照组为1，敲低Dicer后m6A丰度的降低为0.528，与对照组比有显著差异(图3A右)。在人的HeLa细胞中，利用小干涉RNA(siRNA)敲低Dicer的表达，使用dot-blot 法检测m6A的丰度，结果表明敲低Dicer可以相应的降低m6A丰度(图3B左)，对 dot-blot的结果进行灰度扫描及统计学分析，敲低Dicer后m6A丰度的降低，设对照组为1，敲低Dicer后m6A丰度的降低为0.131，与对照组比有显著差异(图3B右)，说明Dicer调控m6A整体水平的修饰在人和啮齿动物中是保守的。
实施例4
正常培养NSC和HeLa细胞，接种24h后，细胞融合度为50％时分别利用Lipofecamine 2000(Invitrogen,11668019)和polyethylenimine(Polysciences, 24765)试剂与pCI-Myc-Dicer质粒(小鼠的转录本号；NM_148948.2；人的转录本号： NM_030621.4)一起进行转染，转染24h后收集细胞，利用TRIzol法提取总RNA，使用
mRNApurification kit(Ambion,61006)提取mRNA。将准备好的mRNA 转移到尼龙膜上，用兔抗m6A抗体(1:1000)(Synaptic Systems,202003)4℃孵育过夜，洗膜后孵育二抗HRP-conjugated Goat anti-rabbit IgG (DakoCytomation,p0448)(1:5000)室温孵育30min后加上曝光液(A，B液等量混合)(GE Healthcare,RPN2232)1ml常温孵育1min后进行曝光并拍照。dot-blot 的信号强度使用Gel-Pro analyzer软件(Media Cybernetics)进行定量统计。
在NSC细胞中，利用质粒过表达提高Dicer的表达，使用dot-blot法检测m6A 的丰度，结果表明过表达Dicer可以相应的提高m6A丰度(图4A左)，对dot-blot 的结果进行灰度扫描及统计学分析，过表达Dicer后m6A丰度的提高，设对照组为1，过表达Dicer后m6A丰度提高至4.461，与对照组比有显著差异(图4A右)。在人的 HeLa细胞中，利用质粒过表达提高Dicer的表达，使用dot-blot法检测m6A的丰度，结果表明过表达Dicer可以相应的提高m6A丰度(图4B左)，对dot-blot的结果进行灰度扫描及统计学分析，过表达Dicer后m6A丰度的提高，设对照组为1，过表达 Dicer后m6A丰度提高至8.668，与对照组比有显著差异(图4B右)，说明Dicer调控m6A整体水平的修饰在人和啮齿动物中是保守的。
实施例5
正常培养NSC细胞，接种24h后，细胞融合度50％时利用Lipofecamine RNAi Max(Invitrogen,13778150)试剂转染miR-668-3p、miR-1981-5p、miR-1224-5p、 miR-330-5p和miR-455-3p,每种miRNA的终浓度为20nM。所用序列均合成自 Genepharma公司。转染24h时后收集细胞。利用TRIzol法提取总RNA，使用
mRNA purification kit(Ambion,61006)将提取mRNA。利RNA Fragmentation Reagents(Ambion,AM8740)试剂94℃，30s将mRNA打断成约300nt大小的片段。利用2倍于RNA量的m6A抗体(Synaptic Systems,202003)在IPP缓冲液中(150mM NaCl,0.1％NP-40,10mM Tris-HCl,pH 7.4)4℃孵育2h。再将混合物和50μl Protein A(Sigma,P9424)4℃继续孵育2h。清洗三遍，用0.5mg/ml m6A(BERRY &ASSOCIATES,PR 3732)洗脱结合在珠子上RNA，后用TRIzol(Invitrogen,15596-018) 提取RNA。富集的m6A结合RNA经过MMLV酶(Promega)反转录后，利用Real-TimeQuantitative PCR(qRT-PCR)检测其靶区域的m6A修饰丰度。
所用miR-668-3p的序列为：
UGUCACUCGGCUCGGCCCACUACC(SEQ ID No.7)；
所用miR-1981-5p的序列为：
GUAAAGGCUGGGCUUAGACGUGGC(SEQ ID No.8)；
所用miR-1224-5p的序列为：
GUGAGGACUGGGGAGGUGGAG(SEQ ID No.9)；
所用miR-330-5p的序列为：
UCUCUGGGCCUGUGUCUUAGGC(SEQ ID No.10)；
所用miR-455-3p的序列为：
GCAGUCCACGGGCAUAUACAC(SEQ ID No.11)；
扩增miR-668-3p靶位点KIF1B的
上游引物为：CCTTCTACCGTTTCGAGGC(SEQ ID No.12)；
下游引物为：TGCAATGATCCAACTCCAGA(SEQ ID No.13)；
扩增miR-1981-5p靶位点TAF5L的
上游引物为：TTGGCATCTGCTGGTGAG(SEQ ID No.14)；
下游引物为：CCATGGAGGCAGAAGCA(SEQ ID No.15)；
扩增miR-1224-5p靶位点SSRP1的
上游引物为：AAGGACCCAAGTCCTCAGC(SEQ ID No.16)；
下游引物为：GGCCTGACTTGGCATGA(SEQ ID No.17)；
扩增miR-330-5p靶位点TCF4的
上游引物为：TGCAACTTGAGGGACGACT(SEQ ID No.18)；
下游引物为：AGTGTGGGAGGATTGCCA(SEQ ID No.19)；
扩增miR-455-3p靶位点PIGT的
上游引物为：AGCGGTACGTGAGTGGCTA(SEQ ID No.20)；
下游引物为：CACGACATCCAGCAGCA(SEQ ID No.21)。
m6A-qRT-PCR结果显示过表达miRNA的靶位点的m6A水平变化。检测的miR-668-3p、miR-1981-5p、miR-1224-5p、miR-330-5p和miR-455-3p的靶向的m6A修饰区域分别定位在miR-668-3p:KIF1B，miR-1981-5p:TAF5L，miR-1224-5p:SSRP1，miR-330-5p: TCF4和miR-455-3p:PIGT的转录本上。与对照组相比，过表达miRNA可以相应的提高相应靶区域的m6A丰度。我们设对照组为1，miR-668-3p、miR-1981-5p、miR-1224-5p、 miR-330-5p和miR-455-3p对应区域的m6A分别升高至7.587，5.847，2.793，4.857 和4.407，且差异有统计学意义。
实施例6
正常培养NSC细胞，接种24h后，细胞融合度为50％时利用Lipofecamine RNAi Max(Invitrogen,13778150)试剂转染miR-668-3p抑制剂、miR-1981-5p抑制剂、 miR-484抑制剂、miR-330-5p抑制剂和miR-455-3p抑制剂，每种miRNA抑制剂的终浓度为100nM。所用序列均设计合成自Genepharma公司。转染24h后收集细胞。利用TRIzol法提取总RNA，使用
mRNA purification kit(Ambion,61006) 将提mRNA。利用RNA FragmentationReagents(Ambion,AM8740)试剂94℃，30s 将mRNA打断成约300nt大小的片段。利用2倍于RNA量的m6A抗体(Synaptic Systems, 202003)在IPP缓冲液中(150mM NaCl,0.1％NP-40,10mM Tris-HCl,pH 7.4)4℃孵育2h。再将混合物和50μl Protein A(Sigma,P9424)4℃继续孵育2h。清洗三遍，用0.5mg/ml m6A(BERRY&ASSOCIATES,PR 3732)洗脱结合在珠子上的RNA，后用TRIzol(Invitrogen,15596-018)提取RNA。富集的m6A结合RNA经过MMLV酶(Promega)反转录后，利用Real-Time Quantitative PCR(qRT-PCR)检测其靶区域的 m6A修饰丰度。
所用miR-668-3p抑制剂的序列为：
GGUAGUGGGCCGAGCCGAGUGACA(SEQ ID No.22)；
所用miR-1981-5p抑制剂的序列为：
GCCACGUCUAAGCCCAGCCUUUAC(SEQ ID No.23)；
所用miR-484抑制剂的序列为：
AUCGGGAGGGGACUGAGCCUGA(SEQ ID No.24)；
所用miR-330-5p抑制剂的序列为：
GCCUAAGACACAGGCCCAGAGA(SEQ ID No.25)；
所用miR-455-3p抑制剂的序列为：
GUGUAUAUGCCCGUGGACUGC(SEQ ID No.26)；
扩增miR-668-3p靶位点KIF1B、miR-1981-5p靶位点TAF5L、miR-330-5p靶位点TCF4、miR-455-3p靶位点PIGT的扩增引物如实施例5所示。
扩增miR-484靶位点NFE2L1的
上游引物为：TCGGCGACAGGAGAGAA(SEQ ID No.27)；
下游引物为：TGTTAGGTCCAGGCCCA(SEQ ID No.28)。
m6A-qRT-PCR结果显示抑制miRNA表达相应靶位点的m6A水平变化。检测的 miR-668-3p、miR-1981-5p、miR-484、miR-330-5p和miR-455-3p的靶向的m6A修饰区域分别定位在miR-668-3p:KIF1B，miR-1981-5p:TAF5L，miR-484:NFE2L1， miR-330-5p:TCF4和miR-455-3p:PIGT的转录本上。与对照组相比，抑制miRNA表达可以相应的降低相应靶区域的m6A丰度。我们设对照组为1，miR-668-3p、 miR-1981-5p、miR-484、miR-330-5p和miR-455-3p对应区域的m6A分别降低为0.171， 0.214，0.606，0.619和0.601，且差异有统计学意义。
实施例7
正常培养NSC细胞，接种24h后，细胞融合度50％时利用Lipofecamine RNAi Max(Invitrogen,13778150)试剂转染miR-330-5p-突变体、miR-668-5p-突变体、 miR-1981-5p-突变体和miR-1224-5p-突变体，突变体的设计原则是突变miR-330-5p、 miR-668-5p、miR-1981-5p和miR-1224-5p种子区(5′2-8nt)的3个核苷酸,使其靶向不同于原始miRNA的新的m6A修饰区域。每种miRNA的终浓度为20nM。所用序列均合成自Genepharma公司。转染24h时后收集细胞。利用TRIzol法提取总RNA，使用
mRNA purification kit(Ambion,61006)将提取mRNA。利RNA Fragmentation Reagents(Ambion,AM8740)试剂94℃，30s将mRNA打断成约300 nt大小的片段。利用2倍于RNA量的m6A抗体(Synaptic Systems,202003)在IPP缓冲液中(150mM NaCl,0.1％NP-40,10mM Tris-HCl,pH 7.4)4℃孵育2h。再将混合物和50μl Protein A(Sigma,P9424)4℃继续孵育2h。清洗三遍，用 0.5mg/ml m6A(BERRY&ASSOCIATES,PR 3732)洗脱结合在珠子上RNA，后用TRIzol (Invitrogen,15596-018)提取RNA。富集的m6A结合RNA经过MMLV酶(Promega)反转录后，利用Real-TimeQuantitative PCR(qRT-PCR)检测其靶区域的m6A修饰丰度。
所用miR-330-5p突变体的序列为：
UGUCAGCGCCUGUGUCUUAGGC(SEQ ID No.29)；
所用miR-668-3p突变体的序列为：
UGACUCACGGCUCGGCCCACUACC(SEQ ID No.30)；
所用miR-1981-5p突变体的序列为：
GAAAACGGUGGGCUUAGACGUGGC(SEQ ID No.31)；
所用miR-1224-5p突变体的序列为：
GAGAGCAGUGGGGAGGUGGAG(SEQ ID No.32)；
扩增miR-330-5p-突变体靶位点FBXO21的
上游引物为：TTACGGGAAGCGGAGCA(SEQ ID No.33)；
下游引物为：GCATCAGGCAGAAGCCA(SEQ ID No.34)；
扩增miR-668-5p-突变体靶位点TAGAP1的
上游引物为：CCTCTCCCAACAGGCAA(SEQ ID No.35)；
下游引物为：ACGCTGGACTCTGAGCTTG(SEQ ID No.36)；
扩增miR-1981-5p-突变体靶位点FAM129B的
上游引物为：TGTGGGAAAGGTGGCTG(SEQ ID No.37)；
下游引物为：AGCCCACAGAAAACGGG(SEQ ID No.38)；
扩增miR-1224-5p-突变体靶位点DDX6的
上游引物为：TGCCAACCTTGGACTGC(SEQ ID No.39)；
下游引物为：TCCAAGTGCCACCCTCA(SEQ ID No.40)。
m6A-qRT-PCR结果显示过表达miRNA突变体相应的新产生的靶位点m6A水平变化。检测的miR-330-5p-突变体、miR-668-5p-突变体、miR-1981-5p-突变体和 miR-1224-5p-突变体的靶向的m6A修饰区域分别定位在miR-330-5p-突变体：FBXO21、miR-668-3p-突变体：TAGAP1、miR-1981-5p-突变体：FAM129B和miR-1224-5p-突变体： DDX6的转录本上。与对照组相比，过表达miRNA突变体可以相应的增加新产生的靶区域的m6A丰度。我们设对照组为1，miR-330-5p-突变体、miR-668-5p-突变体、 miR-1981-5p-突变体和miR-1224-5p-突变体新的靶向的m6A修饰区域的m6A分别升高至1.494，1.407，1.142和1.290,且差异有统计学意义。
实施例8
接种约1x104个MEF细胞，转染4个转录因子Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc，利用KOSR体系进行iPS细胞诱导，为了检测m6A抑制剂环亮氨酸对细胞重编程的影响,每天用m6A抑制剂环亮氨酸来处理实验组MEF细胞一直到诱导第10天，而对照细胞加 DMSO(二甲基亚砜)处理。诱导15天后，采用碱性磷酸酶染色来检测重编程效率，并对诱导的重编程细胞克隆进行计数，并做统计学分析。结果显示，与对照组相比，用 m6A抑制剂环亮氨酸处理组显著降低iPS的克隆形成数，我们设对照组为1，实验组降低至0.513(图8A)，且有统计学意义(图8B)。结果表明在iPS诱导过程中，m6A 抑制剂可以显著降低iPS效率。
实施例9
接种约1x104个MEF细胞，转染4个转录因子Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc，利用KOSR体系进行iPS细胞诱导，为了检测敲低甲基化转移酶METTL3对细胞重编程的影响,每3天使用Lipofecamine RNAi Max(Invitrogen,13778150)试剂转染METTL3 的三个siRNA，每个siRNA的终浓度为60nM，共转染4次，对照组转染无意义的siRNA。三个siRNA的序列为：
GGAGAUCCUAGAGCUAUUA(SEQ ID No.41)；
CUGCACUUCAGACGAAUUA(SEQ ID No.42)；
GCUACCGUAUGGGACAUUA(SEQ ID No.43)。
无意义的siRNA的序列为：
UAGAACGUCUAGGUAUCCC(SEQ ID No.44)。
所用序列均合成自Genepharma公司。诱导15天后，采用碱性磷酸酶染色来检测重编程效率，并对诱导的重编程细胞克隆进行计数，并做统计学分析。结果显示，与对照组相比，METTL3敲低显著降低iPS的克隆形成数，我们设对照组为1，实验组降低至0.214(图9A)，且有统计学意义(图9B)。结果表明在iPS诱导过程中，利用 siRNA敲低METTL3可以显著降低iPS效率。
序列表
<110> 中国科学院动物研究所,中国科学院北京基因组研究所,中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> miRNA对m6A修饰水平的调控方法及其应用
<160> 44
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 1
gagcgccgau cucuaauua 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 2
gggaaagaga cuguuaaau 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 3
ggugcuccca guaaucaaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 4
ugcuugaagc agcucugga 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 5
aagggcaccc aucucuaau 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 6
gccaaggaaa ucagcuaaa 19
<210> 7
<211> 24
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 7
ugucacucgg cucggcccac uacc 24
<210> 8
<211> 24
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 8
guaaaggcug ggcuuagacg uggc 24
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 9
gugaggacug gggaggugga g 21
<210> 10
<211> 22
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 10
ucucugggcc ugugucuuag gc 22
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 11
gcaguccacg ggcauauaca c 21
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 12
ccttctaccg tttcgaggc 19
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 13
tgcaatgatc caactccaga 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 14
ttggcatctg ctggtgag 18
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 15
ccatggaggc agaagca 17
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 16
aaggacccaa gtcctcagc 19
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 17
ggcctgactt ggcatga 17
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 18
tgcaacttga gggacgact 19
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 19
agtgtgggag gattgcca 18
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 20
agcggtacgt gagtggcta 19
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 21
cacgacatcc agcagca 17
<210> 22
<211> 24
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 22
gguagugggc cgagccgagu gaca 24
<210> 23
<211> 24
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 23
gccacgucua agcccagccu uuac 24
<210> 24
<211> 22
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 24
aucgggaggg gacugagccu ga 22
<210> 25
<211> 22
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 25
gccuaagaca caggcccaga ga 22
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 26
guguauaugc ccguggacug c 21
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 27
tcggcgacag gagagaa 17
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 28
tgttaggtcc aggccca 17
<210> 29
<211> 22
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 29
ugucagcgcc ugugucuuag gc 22
<210> 30
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<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 30
ugacucacgg cucggcccac uacc 24
<210> 31
<211> 24
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 31
gaaaacggug ggcuuagacg uggc 24
<210> 32
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 32
gagagcagug gggaggugga g 21
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<212> DNA
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<220>
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ttacgggaag cggagca 17
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
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gcatcaggca gaagcca 17
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
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cctctcccaa caggcaa 17
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acgctggact ctgagcttg 19
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tgtgggaaag gtggctg 17
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agcccacaga aaacggg 17
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<400> 44
uagaacgucu agguauccc 19
Claims (8)
1.一种调控RNA分子上m6A修饰水平的试剂，其特征在于，所述试剂包括miRNA、miRNA调节剂或外源导入与miRNA类似的小分子RNA；所述试剂能够提高或者降低m6A的修饰水平，所述试剂的序列如SEQ ID No:1-6，7-11，22-26，29-32,41-43所示。
2.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1所述的试剂。
3.一种调控RNA分子上m6A修饰水平的试剂在调控m6A修饰水平或者m6A修饰介导的功能中的应用，其特征在于，所述应用不是治疗方法，所述试剂包括miRNA、miRNA调节剂或外源导入与miRNA类似的小分子RNA，所述试剂能够提高或者降低m6A的修饰水平，所述试剂的序列如SEQ ID No:1-6，7-11，22-26，29-32,41-43所示。
4.一种调控RNA分子上m6A修饰水平的试剂在制备调控m6A修饰水平或者m6A修饰介导的功能的调控制剂中的用途，其特征在于，所述试剂包括miRNA、miRNA调节剂或外源导入与miRNA类似的小分子RNA，所述试剂能够提高或者降低m6A的修饰水平，所述试剂的序列如SEQ ID No:1-6，7-11，22-26，29-32,41-43所示。
5.一种调控m6A修饰水平或者m6A修饰介导的功能的方法，其特征在于，包括用调控RNA分子上m6A修饰水平的试剂对m6A修饰进行调控，其特征在于，所述方法，不是治疗方法，所述试剂包括miRNA、miRNA调节剂或外源导入与miRNA类似的小分子RNA，所述试剂能够提高或者降低m6A的修饰水平，所述试剂的序列如SEQ ID No:1-6，7-11，22-26，29-32,41-43所示。
6.一种m6A调节剂在调节细胞重编程中的应用，其特征在于，所述m6A调节剂的序列如SEQ ID No:1-6，7-11，22-26，29,32,41-43所示。
7.一种m6A调节剂在制备调节细胞重编程的制剂中的应用，其特征在于，所述m6A调节剂的序列如SEQ ID No:1-6，7-11，22-26，29-32,41-43所示。
8.一种细胞重编程的调节方法，其特征在于，包括用m6A调节剂对细胞重编程进行调节，所述m6A调节剂的序列如SEQ ID No:1-6，7-11，22-26，29-32,41-43所示。
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