JP4792566B2 - 樹状細胞を含む三次元培養ヒト皮膚モデル - Google Patents

Description

本発明は、新規の三次元培養ヒト皮膚モデルおよびその作製方法、それを使用するアッセイ方法およびアッセイキットに関する。

従来、アレルギー感作性の試験には、動物が使用されてきた。近年、動物愛護の観点から、アレルギー感作性のin vitro評価法開発のために、より生体に近い、三次元培養ヒト皮膚モデルおよび感作性in vitro評価方法を開発する試みが進められている。

これまでに、特許文献１、特許文献２等に記載されている皮膚モデルが開発されてきた。しかし、特許文献１および特許文献２に記載された皮膚モデルは、線維芽細胞および表皮角化細胞は含むものの、皮膚免疫に関与する樹状細胞を含んでいないため、アレルギー感作性のin vitro評価モデルとしては不充分であった。

一方、特許文献３に記載されているin vitro評価法においては、アレルギー感作性に関与するＣＤ８６陽性細胞である単層の樹状細胞が用いられている。しかし、これまで報告されている皮膚のバリヤー機能に加え、最近皮膚免疫への関与が報告されている表皮角化細胞や、真皮を構成する線維芽細胞を含まない。そのため、特許文献３に記載されている方法は、被験物質の皮膚への影響を過大に評価する恐れがある。したがって、より生体に近い条件で行うことのできる評価法の開発が求められている。

これに対して、特許文献４および非特許文献１に記載されている方法では、線維芽細胞を含む支持体上でランゲルハンス細胞または樹状細胞と表皮角化細胞とを６日間共培養し、その後、共培養している細胞を空気に曝して１４日間培養し、特許文献５に記載されている方法でアレルギー感作性のin vitro評価を行っている。しかし、この方法ではランゲルハンス細胞または樹状細胞と表皮角化細胞を６日間共培養し、ランゲルハンス細胞または樹状細胞を分化させてから表面を空気に曝しているため、支持体上で共培養を開始してから皮膚モデルが形成されるまで長期間かかる上、ランゲルハンス細胞または樹状細胞層と表皮角化細胞とを分離することが困難なため、免疫反応等、樹状細胞に特異的な反応の検出が困難になる可能性がある、などの課題が残っている。
国際公開ＷＯ９１／１６０１０号公報 欧州特許第２０７５３号公報 特開２００４−２２２５８２号公報 特開平９−２０１４１０号公報 特開平１０−２３２２２５号公報 Regnier M. et. al., J. Invest. Dermatol., 1997, Vol.109, No.4, 510-512

そこで、本発明は、皮膚免疫に関与する樹状細胞、皮膚のバリヤー機能および皮膚免疫に関与する表皮角化細胞および真皮を構成する線維芽細胞をすべて含み、より生体に近い条件でアレルギー感作性の評価を行うことを可能にする皮膚モデルであって、より短期間に構築でき、より簡便なアレルギー感作性のin vitro評価法に用いることのできる皮膚モデル、および同様の利点を有するin vitro評価方法および評価用キットを提供することを目的とする。

本発明は、
（１） 下から順に、
Ａ 線維芽細胞を含む支持体層、
Ｂ 樹状細胞を含む支持体層、および
Ｃ 表皮角化細胞層、
を含むことを特徴とする三次元培養ヒト皮膚モデル；
（２） 前記Ａが、少なくとも１つの孔を有する環状支持体上に存在する、前記（１）記載の三次元培養ヒト皮膚モデル；
（３） 前記Ａ、ＢおよびＣの各層が、互いに物理的に分離可能である、前記（１）または（２）記載の三次元培養ヒト皮膚モデル；
（４） 前記Ａにおける支持体が、コラーゲンゲルまたはコラーゲンスポンジからなるものである、前記（１）〜（３）のいずれか１項記載の三次元培養ヒト皮膚モデル；
（５） 前記Ｂにおける支持体が、前記Ａの線維芽細胞を含む支持体層上に置かれた枠内に形成されたコラーゲンゲルである、前記（１）〜（４）のいずれか１項記載の三次元培養ヒト皮膚モデル；
（６） 前記Ｃにおける表皮角化細胞が、前記Ｂの樹状細胞を含む支持体層の上に播種される、前記（１）〜（５）のいずれか１項記載の三次元培養ヒト皮膚モデル；
（７） 前記Ｂにおける樹状細胞が、ＣＤ８６^＋細胞である、前記（１）〜（６）のいずれか１項記載の三次元培養ヒト皮膚モデル；
（８） 単層の線維芽細胞用培地、単層の樹状細胞用培地および単層の表皮角化細胞用培地の等量混合物からなり、且つ細胞分化に必要な濃度のカルシウムを含む培地中で維持される、前記（１）〜（７）のいずれか１項記載の三次元培養ヒト皮膚モデル；
（９） 下から順に、
Ａ 線維芽細胞を含む支持体層、
Ｂ 樹状細胞を含む支持体層、および
Ｃ 表皮角化細胞層、
を含むことを特徴とする三次元培養ヒト皮膚モデルの作製方法であって、
線維芽細胞を含む支持体層の上に樹状細胞を含む支持体層を形成させ、その上に表皮角化細胞を播種して積層培養物を作製し、前記積層培養物を、単層の線維芽細胞用培地、単層の樹状細胞用培地および単層の表皮角化細胞用培地の等量混合物からなり、且つ細胞分化に必要な濃度のカルシウムを含む培地中で培養した後、前記積層培養物の最上層表面を空気に曝すことを特徴とする、方法；
（１０） 前記Ｂの樹状細胞を含む支持体層を形成させる前に、前記Ａの線維芽細胞を含む支持体層を、少なくとも１つの孔を有する環状支持体上に載せる工程をさらに含む、前記（９）記載の方法；
（１１） 前記Ｂの樹状細胞を含む支持体層が、前記Ａの線維芽細胞を含む支持体上に置かれた枠内に形成される、前記（９）または（１０）記載の方法；
（１２） 下から順に、
Ａ 線維芽細胞を含む支持体層、
Ｂ 樹状細胞を含む支持体層、および
Ｃ 表皮角化細胞層、
を含むことを特徴とする三次元培養ヒト皮膚モデルを、培地中の被検物質と接触させ、前記皮膚モデルに生じた変化の有無または量を検出または測定することを特徴とする、被検物質の影響のアッセイ方法；
（１３） 培地中に放出されたサイトカインまたはＣＤ８６の発現を指標として、前記皮膚モデルに生じた変化の有無または量を検出または測定する、前記（１２）記載のアッセイ方法；
（１４） 下から順に、
Ａ 線維芽細胞を含む支持体層、
Ｂ 樹状細胞を含む支持体層、および
Ｃ 表皮角化細胞層、
を含むことを特徴とする三次元培養ヒト皮膚モデルと、前記皮膚モデルに生じた変化の有無または量の検出または測定に必要な少なくとも１つの試薬とを含む、被検物質の影響のアッセイ用キット、
を提供する。

本発明によれば、従来より短期間、効率的に樹状細胞を含む三次元培養ヒト皮膚モデルを作製できる。

また、本発明によれば、皮膚免疫に関与する樹状細胞、皮膚のバリヤー機能および皮膚免疫に関与する表皮角化細胞および真皮を構成する線維芽細胞をすべて含み、より生体に近い条件でアレルギー感作性の評価を行うことを可能にする皮膚モデルが提供される。また、本発明の皮膚モデルは、従来よりも短期間で効率的に作製することができる。さらに、本発明の皮膚モデルは、特許文献４、非特許文献１に記載されている方法より少ない細胞数で作製することができる。

さらに、本発明の皮膚モデルにおいては、樹状細胞を含む支持体層と表皮角化細胞層とを分離することが可能なため、免疫染色反応等、それぞれの細胞に特異的な反応の検出がより容易になると同時に表皮角化細胞層からのサイトカイン放出の樹状細胞への影響等、相互反応も検出可能である。

さらに、本発明によれば、このような皮膚モデルを用いることにより、生体に近い条件でアレルギー感作性の評価を行うことができる、より簡便なアレルギー感作性のin vitro評価法および評価用キットが提供される。

本発明の三次元培養ヒト皮膚モデルにおいては、下から順に、
Ａ 線維芽細胞を含む支持体層、
Ｂ 樹状細胞を含む支持体層、および
Ｃ 表皮角化細胞層、
が含まれている。
本発明において用いられる線維芽細胞は、当該技術分野で公知の任意の方法によって調製することができ、生体由来の正常細胞であっても不死化された培養細胞であってもよく、あるいはこれらに由来する細胞であってもよい。また、線維芽細胞は、他のタイプの細胞を実質的に含まないものであってもよく、他のタイプの細胞と共存していてもよい。好ましくは、実質的に他のタイプの細胞を含まないものである。支持体層を形成させる際に播種する線維芽細胞の数（または濃度）は、通常、２〜８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲であることができ、好ましくは３〜６×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲である。

本発明において、線維芽細胞を含む支持体層は、細胞の生存に適した任意の支持体に少なくとも線維芽細胞が含まれているものであればよい。たとえば、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、膜またはフィルター等のシート状担体または多孔性担体等に線維芽細胞を含ませたものでもよく、または予め表皮が除去された真皮等、従来から知られているもののいずれであってもよい。好ましくは、線維芽細胞を含む支持体層は、コラーゲンゲルまたはコラーゲンスポンジに線維芽細胞を含むものである。

本発明における線維芽細胞を含む支持体層は、少なくとも１つの孔を有する環状支持体上に載せて皮膚モデル作製および／または感作性アッセイに使用される。この環状支持体は、線維芽細胞を含む支持体層と同等またはそれより大きい支持体であって、少なくとも１つの孔を有するものであれば、特に制限されない。形状は、四角形以上の多角形または円形であればよく、対称のものが好ましい。好ましくは円形または円形に近い多角形であり、最も好ましくは円形である。材質は細胞の生存に悪影響を及ぼさない限り特に制限されないが、取り扱いおよび加工の容易さ等の観点から、プラスチックが最も好ましい。

この環状支持体を用いることにより、モデルの形状を保持し、モデル表面を適切に空気に曝すと同時に、孔部分を通してモデル底面を培地に接触させることが容易になり、モデルの作製およびモデルの性能維持に有利である。

本発明で用いられる樹状細胞は、当該技術分野で公知の任意の方法によって調製することができる。たとえば、樹状細胞は、末梢血液、骨髄、臍帯血等から精製することにより得ることができる。好ましくは、樹状細胞は、末梢血液由来であり、ＣＤ８６^＋のものである。

本発明で用いられる樹状細胞を含む支持体層は、細胞の生存に適した任意の支持体に少なくとも樹状細胞が含まれているものであればよい。支持体の例としては、線維芽細胞について記載したものと同じものが挙げられる。好ましくは、樹状細胞を含む支持体はコラーゲンゲルからなり、線維芽細胞を含む支持体の上に乗せられた枠、たとえばガラスリング内に形成される。この枠は、前記の環状支持体と同様、円形またはそれに近い多角形のものが好ましいが、細胞の生存に悪影響を及ぼさないものであれば、材質・形状に特に制限はない。通常、入手の容易さの観点から、ガラス製のリング状のものが好都合である。また、枠の大きさは、線維芽細胞を含む支持体層と同等またはそれより小さいことが好ましい。支持体層を形成させる際に播種する樹状細胞の数（または濃度）は、通常、５×１０^４〜１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲であることができ、好ましくは１〜４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲である。

本発明で用いられる表皮角化細胞は、当該技術分野で公知の任意の方法によって調製することができ、生体由来の正常細胞であっても不死化された培養細胞であってもよく、あるいはこれらに由来する細胞であってもよい。また、表皮角化細胞は、他のタイプの細胞を実質的に含まないものであってもよく、他のタイプの細胞と共存していてもよい。好ましくは、実質的に他のタイプの細胞を含まないものである。表皮角化細胞層を形成させる際に播種する表皮角化細胞の数（または濃度）は、通常３×１０^５〜３×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲であることができ、好ましくは５×１０^５〜２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲である。

上記のそれぞれの細胞は、適当な条件下でそれぞれの細胞に分化するよう誘導され得る前駆体細胞の形態であってもよく、本発明のヒト皮膚モデルの作製に関して、線維芽細胞、樹状細胞および表皮角化細胞は、それぞれそのような前駆体細胞も包含する。

これらの各細胞は、それぞれに適した培地で培養される。本発明で用いられる単層の線維芽細胞用培地、樹状細胞用培地および表皮角化細胞培養用培地は、それぞれ線維芽細胞、樹状細胞および表皮角化細胞の増殖および分化を可能にする限りにおいて、公知の任意の培地であってよい。たとえば、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコ変成イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル培地、５％ヒト血清含有ＬＧＭ−３培地およびＥｐｉ−ｌｉｆｅ−ＫＧ２培地等が挙げられる。

本発明の三次元培養ヒト皮膚モデルの作製方法としては、まず、線維芽細胞を含む支持体を用意し、その上に次々に上層の細胞含有層を形成させる。上記のように、線維芽細胞を含む支持体層は、好ましくは環状支持体の上に載せた後、他の細胞含有層の形成等に使用される。

たとえば、線維芽細胞を含む支持体層の上に、樹状細胞を含む支持体層を、前記のように枠内にコラーゲンゲルとして形成させる。その上に表皮角化細胞を播種し、単層の表皮角化細胞培養用の培地で約１日（約１８〜３６時間、好ましくは約２０〜３０時間、最も好ましくは約２２〜２６時間）程度培養する。播種して約１日（約１８〜３６時間、最も好ましくは約２０〜３０時間、最も好ましくは約２２〜２６時間）後に、培地を細胞分化に必要な濃度のカルシウムを含む単層の線維芽細胞用培地、単層の樹状細胞用培地、単層の表皮角化細胞用培地の等量混合物（以下、「三次元培養用培地」ということがある）に換え、さらに培養する。本発明のヒト皮膚モデルの作製においては、三次元培養用培地で一般的には約１日（約１８〜３６時間、好ましくは約２０〜３０時間、最も好ましくは約２２〜２６時間）培養した後、培地量を減少させることにより、このように作製した積層培養物の最上層表面を空気に曝す。このようにすることにより、より短期間（表皮角化細胞を播種した時点から約１３日〜１６日；平均１５日間）で皮膚モデルを構築することが可能になる。ヒト皮膚モデルの作製手順の具体的な一例を図１（Ａ）に示す。

表面を空気に曝してから４〜７日間培養後に、樹状細胞もＣＤ８６陽性反応を示すようになり、その反応は、少なくとも表面を空気に曝してから１４日目までは維持される。

このようにして得られた三次元培養ヒト皮膚モデルは、物理的に互いに分離可能な、表皮角化細胞層、樹状細胞を含む支持体層、線維芽細胞を含む支持体層からなる。

本発明のヒト皮膚モデルにおいては、三次元培養用培地の組成に変更を加えることにより、表皮角化細胞層または樹状細胞を含む支持体内（好ましくは樹状細胞を含む支持体内）に、容易にメラノサイトや肥満細胞、Ｔ細胞等の他の種類の細胞を含有させることが可能である。これらの細胞の含有量（細胞数）は、樹状細胞と同程度でよい。

これらの他の種類の細胞を含有させることにより、皮膚に対する被検物質の他のタイプの影響のアッセイまたは他のタイプの感作性のアッセイも可能となる。たとえば、メラノサイトを含有させることにより、本発明の皮膚モデルを被検物質のメラノサイトに対する影響を調べるアッセイに使用することができ、紫外線カット剤や美白剤等のスクリーニングまたは安全性の試験等を短期間で容易に行うことが可能となる。また、肥満細胞を含有させた場合、被検物質との接触によるヒスタミン放出量の変化を検出または測定することにより、即時型食物アレルギーを起こす性質についてのアッセイに使用することが可能となる。

以上のように、本発明によれば、従来よりも短期間で効率的に、樹状細胞を含む三次元培養ヒト皮膚モデルの作製およびそれを用いた各種の試験を行うことが可能となる。

被検物質の影響、たとえば感作性のアッセイは、少なくとも、本発明の三次元培養ヒト皮膚モデルを、培地中の被検物質と接触させる工程、および被検物質との接触によって生じた細胞の変化を検出または測定する工程を含む。

被検物質の感作性による細胞の変化は、培地中に放出されたサイトカイン、または細胞におけるＣＤ８６の発現等を指標として検出または測定することによって把握することができる。このような検出または測定の手法は公知であり、本発明においては公知のいずれの手法を用いてもよい。このようなアッセイ手順の一例を、図１（Ｂ）に示す。

本発明は、さらに、本発明の三次元培養ヒト皮膚モデルと、被検物質との接触によって生じる細胞の変化（たとえばサイトカイン放出量またはＣＤ８６発現量）の検出または測定に必要な少なくとも１つの試薬とを、組合せて含む、被検物質の感作性アッセイ用キットを提供する。このようなキットは、たとえば検出用ＣＤ８６抗体、発色試薬等を含むことができる。

以下において実施例によって本発明をさらに説明するが、これらは本発明を限定するものではない。

１． 三次元培養ヒト皮膚モデル（ＫＤＦ−Ｓｋｉｎ）の作製
氷冷下プラスチックチューブ内に３×ＤＭＥＭ（３倍濃度のＤＭＥＭ培地）１０ｍｌ、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）２．２ｍｌ、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ ２．８ｍｌ、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ（コラーゲン）−Ｔｙｐｅ−Ｉ Ａ（商品名「Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ−Ｔｙｐｅ−Ａ」、新田ゼラチン社製）１０ｍｌ、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳに懸濁したＮＨＳＦ４６細胞（正常ヒト線維芽細胞：理研Cell bankより入手、２．４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）５ｍｌを添加し、均一に混合した。その後、この混合物を５ｍｌずつ６０ｍｍシャーレに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２存在下、７日間培養した。
培地をＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ：Ｅｐｉ−ｌｉｆｅ−ＫＧ２（１：１； ５ｍｌ）（商品名「Ｅｐｉ−ｌｉｆｅ−ＫＧ２」、クラボウ社製）に換え、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で３時間培養し、次にＥｐｉ−ｌｉｆｅ−ＫＧ２ ５ｍｌに換え、さらに３時間培養した。
６穴プレートに、中央に孔を有する環状支持体（プラスチック製のアッセイリング；外径２１ｍｍ、内径１０ｍｍ）を置き、前記で用意した線維芽細胞を含む支持体層を載せた。さらに、この支持体層の表面にガラスリング（商品名「ＲＩＮＧ−１２」、岩城ガラス社製、内径１０ｍｍ、高さ１０ｍｍ、外径１２ｍｍ）を載せた。
氷冷下プラスチックチューブ内にＬＧＭ−３（商品名「ＬＧＭ−３」(登録商標)、Clonetics社製）＋５％ヒト血漿（Human Plasma） ２ｍｌに懸濁したＮＨＤＣ細胞（正常ヒト樹状細胞、ＣＤ８６^＋：Cambrex社より入手、３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）及びコラーゲン（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ−Ｔｙｐｅ−Ｉ Ａ） １ｍｌを添加し、均一に混合した後、０．５ｍｌずつリング内に静かに播いた。これを２時間培養し、樹状細胞を含むコラーゲンゲル層を形成させた。
その後、Ｅｐｉ−ｌｉｆｅ−ＫＧ２培地に懸濁したＡ４３１細胞（ヒト類上皮癌細胞：理研Cell bankより入手、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、０．２ｍｌ）をリング内に静かに播いた。その１時間後、Ｅｐｉ−ｌｉｆｅ−ＫＧ２をガラスリングを覆うくらいまで（２ｍｌ）加え、１日培養した。
培地を三次元培養用培地（ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ：Ｅｐｉ−ｌｉｆｅ−ＫＧ２：ＬＧＭ^ＴＭ−３＋５％ヒト血漿＝１：１：１； Ｃａ^２＋ １．８ｍｍｏｌ／ｌ、アスコルビン酸 ５０μｇ／ｍｌを含有する）に換え、さらに１日間培養した。
培地を除去した後、新鮮な培地を表皮角化細胞層のレベルまで（１ｍｌ）添加し、積層培養物の表面が空気に曝されるよう培養液量を調節した。
２日間ごとに培地交換し、空気に曝してから２週間培養を継続した。このようにしてヒト三次元培養皮膚モデルを得た。
作製されたヒト皮膚モデルの写真（表面を空気に曝した直後に上から写した写真である）を図２に示す。図２において、「Ａ」はガラスリング、「Ｂ」はアッセイリングを示す。また、「Ｃ」はＮＨＳＦ４６細胞を含む層、「Ｄ」はＮＨＤＣ細胞を含む支持体層およびＡ４３１細胞を含む支持体層を示す（ＮＨＤＣ細胞を含む支持体層はＡ４３１細胞を含む支持体層の下に位置し、写真においては見えない）。

２． ＫＤＦ−Ｓｋｉｎを用いた皮膚感作性評価法
Ａ． ＣＤ８６免疫染色法
前記のようにして作製した皮膚モデルを用いて、被検物質の感作性を、ヘマトキシリン＝エオシン（ＨＥ）染色およびＣＤ８６免疫染色によって調べた。
被検物質としては、表１に示す濃度のジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）、硫酸ニッケル（ＮｉＳＯ_４）、コンパウンド４８／８０（Compound 48/80）、ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を使用した。陽性対照（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）としては、被検物質を加えない培地および一次抗体を使用した。この場合、正常な樹状細胞の機能によって陽性対照は「＋」を示す。

被検物質添加２４時間後、皮膚モデルを１０％中性緩衝ホルマリンで２４〜４８時間固定し、パラフィン切片を取得した。この切片を、３７℃で一晩乾燥後、脱パラフィンし、２回水洗した。８０％メタノールおよび０．６％過酸化水素をこの切片に３０分間反応させ、水洗後、６．３％過酸化水素を１５分間反応させた。水洗後、ＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ）に５分間浸潤させ、正常ヤギ血清（１０倍希釈）を３０分間反応させ、一次抗体（抗ヒトＣＤ８６・マウスモノクローナル抗体）１０μｇ／ｍｌを４℃で一晩反応させた。続いて、ＴＢＳＴで洗浄後、二次抗体（抗マウス・ビオチン化ヤギＩｇ：２００倍希釈）を室温で３０分間反応させた。ＴＢＳＴで洗浄後、ストレプトアビジンを室温で３０分間反応させ、３，３’−ジアミノベンジジン−テトラヒドロクロライド（ＤＡＢ；商品名「ＤＡＢ＋リキッドシステム」、カタログNo.Ｋ−３４６８、ダコーサイトメーション社より）で発色させた。水洗後、ヘマトキシリン＝エオシンで１分間染色し、脱水後、透徹、封入を行い、染色標本を作成した。
標本を位相差顕微鏡で観察し、樹状細胞層の染色を陰性対照（一次抗体を加えないもの）と比較し、以下の５段階で評価した：−（青：陰性対照と同じ）、±（灰色）、＋（うす茶）、＋〜＋＋（茶）、＋＋（濃い茶色）。

また、２４時間後に培地を取り出し、ＬＤＨアッセイによって細胞障害性も評価した。すなわち、採取した培地１０μｌ、新鮮な培地４０μｌ、発色試薬(商品名「ＬＤＨ細胞毒性テストワコー」、カタログNo.２９９−５０６１、和光純薬より)５０μｌを加えて室温で４５分間放置し、反応停止液（商品名「ＬＤＨ細胞毒性テストワコー」、カタログNo.２９９−５０６１、和光純薬より）１００μｌを加えてマイクロプレートリーダーにより５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。新鮮な培地のみを添加したコントロールとモデルから採取した培地を添加したものとの吸光度を比較し、採取した培地から得られた吸光度がコントロールと同程度なら「ＮＴ」＝非障害性（non-toxic）、コントロールより明らかに増加していれば「Ｔｏｘｉｃ」＝障害性と判定した。
結果を表１および図３に示す。

表１によれば、感作性物質のＤＮＣＢ、ＤＮＦＢ、ＮｉＳＯ_４またはCompound 48/80添加時は陽性対照よりも発現の増強が見られたが、非感作性物質のＳＤＳまたはＤＭＳＯ添加時は陽性対照と同程度の発現であったことがわかる。したがって、本発明のヒト皮膚モデルは、このアッセイにおいて、被検物質の感作性について公知の感作性と相関する結果を示した。

図３は、ヘマトキシリン＝エオシン（ＨＥ）染色またはＣＤ８６免疫染色の後のヒト皮膚モデルの切片の写真である。パネル（ａ）は、培養１１日目のＨＥ染色されたＡ４３１細胞層（Ｂ）およびＮＨＤＣ細胞層（Ａ）を示す（拡大倍率８００倍）。（Ｃ）は、角層（Horny layer）である。パネル（ｂ）は、培養１１日目のＨＥ染色されたＮＨＳＦ４６細胞層を示す（拡大倍率８００倍）。パネル（ｃ）および（ｄ）は、培養１４日目のＣＤ８６免疫染色されたＡ４３１細胞層およびＮＨＤＣ細胞層を示す（拡大倍率６００倍）。丸で囲んだ部分は、ＣＤ８６発現が陽性（＋）（パネルｃ）または陰性（−）（パネルｄ）であることを示す。
この結果から、表面を空気に曝してから１１日目までには角層が形成され、モデルが完成していること、また、少なくとも１４日目までは樹状細胞の免疫機能が評価に適した程度発現していることがわかった。

Ｂ．サイトカインアッセイ
培養１３日目の前記ヒト皮膚モデルの表面に、０．２ｍｌの三次元培養用培地に溶解または分散させた被検物質を添加した。３７℃で１時間インキュベーションした後、表面をＰＢＳで２回洗い、添加２４時間後の培地中のＩＬ−１α、２、４放出量を、センサーチップにＩＬ−１α、２、４の抗体を各１００μｇ／ｍｌの濃度で固定したビアコア３０００（ビアコア社製）を用い、以下の条件で測定した。

サンサーチップ：ＣＭ５
測定温度：２５℃
移動相：ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ：Ｅｐｉ−Ｌｉｆｅ−ＫＧ２：ＬＧＭ−３＋５％ ヒト血漿（Human Plasma）＝１：１：１、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸および１．８μｍｏｌ／ｌＣａ^２＋含有
流速：２０μｌ／ｍｉｎ
検出モード：４−１、３−１、２−１（フローセル１：リファレンス、フローセル２：ＩＬ−４、フローセル３：ＩＬ−２、フローセル４：ＩＬ−１α）
注入量：４０μｌ
解離時間：１２０秒間
再生溶液：１０ｍｍｏｌ／ｌ グリシン緩衝液（ｐＨ２）
再生溶液添加量：５μｌ
レポートポイント：サイトカイン添加１０秒前および１０秒後、再生溶液添加３０秒後

各サイトカインの標準品を添加した時のサンサーグラムの高さから放出量を求め、そしてコントロールの放出量に対する被検物質の放出量の割合を指標として評価した。
結果を図４および５に表す。

被検物質としてＤＮＣＢ（２ｍｍｏｌ／ｌ）を用い、インキュベーション時間を１、４または２４時間に変化させた場合の結果を図４に示す。
対照としては、培地のみを添加したものを用いた。図４において、データは３回の測定値の平均±標準偏差である。「ｎ．ｄ．」は検出されなかったことを表す。「＊」は対照と比較して有意差（Ｐ＜０．０５）があることを表す。図４から、１〜４時間以降、サイトカイン放出量が経時的に増大すること、およびＤＮＣＢ添加によってサイトカイン放出量が有意に増加することがわかる。また、この結果から、以下においては２４時間インキュベーションをした後に評価することとした。

図５は、図中に示した種々の被検物質を用いて２４時間インキュベーションした場合の結果を示す。対照としては、培地のみを添加したものを用いた。図５において、データは３回の測定値の平均±標準偏差である。「＊」「＊＊」「＊＊＊」は対照と比較して有意差（それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１）があることを表す。図５から、ＤＮＣＢ、ＤＮＦＢ、Compound 48/80添加時はサイトカイン放出量が有意に増大し、特にＩＬ−２放出量の増加率が他のサイトカインより増加率が大きいことがわかる。一方、ＣＤ８６発現増強作用の弱いＮｉＳＯ_４を添加した場合では、サイトカイン放出量への影響も弱いことがわかる。
これらのＣＤ８６染色およびサイトカインアッセイの結果は、相互に矛盾なく一致していた。

ヒト皮膚モデルの作製手順（Ａ）およびその後のアッセイ手順（Ｂ）の具体的な一例を示す図である。 表面を空気に曝した直後に上から写した、ヒト皮膚モデルの写真である。 ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色またはＣＤ８６免疫染色の後のヒト皮膚モデルの切片の写真である。パネル（ａ）は、ＨＥ染色されたＡ４３１細胞層（Ｂ）およびＮＨＤＣ細胞層（Ａ）を示す（拡大倍率８００倍）。（Ｃ）は、角層である。パネル（ｂ）は、ＨＥ染色されたＮＨＳＦ４６細胞層を示す（拡大倍率８００倍）。パネル（ｃ）および（ｄ）は、ＣＤ８６免疫染色されたＡ４３１細胞層およびＮＨＤＣ細胞層を示す（拡大倍率６００倍）。丸で囲んだ部分は、ＣＤ８６発現が陽性（＋）（パネルｃ）または陰性（−）（パネルｄ）であることを示す。 ヒト皮膚モデルを用いた、種々の時間の被検物質との接触による感作性（サイトカイン放出刺激活性）の評価試験の結果を示す図である。 ヒト皮膚モデルを用いた、種々の被検物質の感作性（サイトカイン放出刺激活性）の評価試験の結果を示す図である。

Claims (13)

1. 下から順に、
   Ａ 線維芽細胞を含む支持体層、
   Ｂ 樹状細胞を含む支持体層、および
   Ｃ 表皮角化細胞層、
   を含むこと、および単層の線維芽細胞用培地、単層の樹状細胞用培地および単層の表皮角化細胞用培地の等量混合物からなり、且つ細胞分化に必要な濃度のカルシウムを含む培地中で維持されること、を特徴とする三次元培養ヒト皮膚モデル。
2. 前記Ａが、少なくとも１つの孔を有する環状支持体上に存在する、請求項１記載の三次元培養ヒト皮膚モデル。
3. 前記Ａ、ＢおよびＣの各層が、互いに物理的に分離可能である、請求項１または２記載の三次元培養ヒト皮膚モデル。
4. 前記Ａにおける支持体が、コラーゲンゲルまたはコラーゲンスポンジからなるものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の三次元培養ヒト皮膚モデル。
5. 前記Ｂにおける支持体が、前記Ａの線維芽細胞を含む支持体層上に置かれた枠内に形成されたコラーゲンゲルである、請求項１〜４のいずれか１項記載の三次元培養ヒト皮膚モデル。
6. 前記Ｃにおける表皮角化細胞が、前記Ｂの樹状細胞を含む支持体層の上に播種される、請求項１〜５のいずれか１項記載の三次元培養ヒト皮膚モデル。
7. 前記Ｂにおける樹状細胞が、ＣＤ８６^＋細胞である、請求項１〜６のいずれか１項記載の三次元培養ヒト皮膚モデル。
8. 下から順に、
   Ａ 線維芽細胞を含む支持体層、
   Ｂ 樹状細胞を含む支持体層、および
   Ｃ 表皮角化細胞層、
   を含むこと、および単層の線維芽細胞用培地、単層の樹状細胞用培地および単層の表皮角化細胞用培地の等量混合物からなり、且つ細胞分化に必要な濃度のカルシウムを含む培地中で維持されること、を特徴とする三次元培養ヒト皮膚モデルの作製方法であって、
   線維芽細胞を含む支持体層の上に樹状細胞を含む支持体層を形成させ、その上に表皮角化細胞を播種して積層培養物を作製し、前記積層培養物を、単層の線維芽細胞用培地、単層の樹状細胞用培地および単層の表皮角化細胞用培地の等量混合物からなり、且つ細胞分化に必要な濃度のカルシウムを含む培地中で培養した後、前記積層培養物の最上層表面を空気に曝すことを特徴とする、方法。
9. 前記Ｂの樹状細胞を含む支持体層を形成させる前に、前記Ａの線維芽細胞を含む支持体層を、少なくとも１つの孔を有する環状支持体上に載せる工程をさらに含む、請求項８記載の方法。
10. 前記Ｂの樹状細胞を含む支持体層が、前記Ａの線維芽細胞を含む支持体上に置かれた枠内に形成される、請求項８または９記載の方法。
11. 下から順に、
    Ａ 線維芽細胞を含む支持体層、
    Ｂ 樹状細胞を含む支持体層、および
    Ｃ 表皮角化細胞層、
    を含むこと、および単層の線維芽細胞用培地、単層の樹状細胞用培地および単層の表皮角化細胞用培地の等量混合物からなり、且つ細胞分化に必要な濃度のカルシウムを含む培地中で維持されること、を特徴とする三次元培養ヒト皮膚モデルを、培地中の被検物質と接触させ、前記皮膚モデルに生じた変化の有無または量を検出または測定することを特徴とする、被検物質の影響のアッセイ方法。
12. 培地中に放出されたサイトカインまたはＣＤ８６の発現を指標として、前記皮膚モデルに生じた変化の有無または量を検出または測定する、請求項１１記載のアッセイ方法。
13. 下から順に、
    Ａ 線維芽細胞を含む支持体層、
    Ｂ 樹状細胞を含む支持体層、および
    Ｃ 表皮角化細胞層、
    を含むこと、および単層の線維芽細胞用培地、単層の樹状細胞用培地および単層の表皮角化細胞用培地の等量混合物からなり、且つ細胞分化に必要な濃度のカルシウムを含む培地中で維持されること、を特徴とする三次元培養ヒト皮膚モデルと、前記皮膚モデルに生じた変化の有無または量の検出または測定に必要な少なくとも１つの試薬とを含む、被検物質の影響のアッセイ用キット。
    

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