JP2011512146A - 上皮細胞のクローン培養のための系および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞生物学および組織工学の分野に関する。
a)上皮組織の生体サンプルから直接1以上の上皮細胞を抽出する工程、
b)所望により、工程a)で抽出された細胞から少なくとも一つの上皮細胞集団および/または部分集団を選択する工程、
c)工程a)またはb)から直接生じた異なる単一の上皮細胞を播種したクローン培養物を製造する工程、および
d)工程c)のクローン培養物における細胞増殖を定性的および/または定量的に評価する工程。
表皮などの上皮組織を取り扱うin vitro系および方法は、医学的研究および臨床開発、組織工学、および毒性学などの多様な分野で適用が見出せる。
a)上皮組織の生体サンプルから直接1以上の上皮細胞を抽出する工程、
b)所望により、工程a)で抽出された細胞から少なくとも一つの上皮細胞集団および/または部分集団を選択する工程、
c)工程a)またはb)から直接生じた異なる単一の上皮細胞を播種したクローン培養物を製造する工程、および
d)工程c)のクローン培養物における細胞増殖を定性的および/または定量的に評価する工程。
−播種された培養物の数に対して得られたクローンの頻度、すなわち、クローン形成率[CFE]、
−クローンの増殖能、すなわち、所定の培養時間における各クローンを構成している細胞の数、
−クローンの表現型、すなわち、クローンを構成している細胞の分化程度、分子マーカーの発現。
よって、本発明者らは、各予測に対して、本発明のクローン培養法に従って培養された細胞の増殖能が標準的な手法に従って培養された細胞の増殖能よりも高いことが観察できた(下記の実施例B参照)。
a)上皮組織の生体サンプルから直接1以上の上皮細胞を単細胞懸濁液の形態で抽出する工程、
b)工程a)で抽出された細胞から少なくとも一つの上皮細胞集団および/または部分集団を選択する工程、
c)工程b)から生じた異なる単一の上皮細胞を播種したクローン培養物を製造する工程、および
d)工程c)のクローン培養物における細胞増殖を定性的および/または定量的に評価する工程。
−目的の生物活性を有する薬剤を同定および選択するため。「薬剤」は、その生物活性に関して試験され、本適用に応じて選択される候補分子であってよく、該活性は陽性(例えば、医薬、治療薬、化粧品として着目されるエフェクターを選択するため)であっても、または陰性(例えば、毒性分子を選択するため)であってもよい。あるいは、「薬剤」は、非化学的性質のもの、例えば、紫外線、可視光、電磁放射線、磁気波などであってもよい。
−細胞および/または遺伝子療法分野、特に、移植分野における治療および/または診断(特に、in vitro)および/または予後診断(特に、in vitro)のため。
−単一細胞、細胞サブタイプ、細胞部分集団または細胞集団に特異的な挙動および/または構造的および/または機能的個特性を試験するため。
−機能ゲノム科学の1以上のツール、特に、生物活性の獲得または喪失の現象を誘導するため、医学的目的のため、および/またはいずれかの種類の機能的探求において有用なものを製造するため。例えば、干渉RNA、過剰発現および/または抑制、ウイルス、または非ウイルスベクターなどが挙げられる。
−薬剤または化粧品として目的とされる分子などの生物活性を有する薬剤の有効性を評価するため、および/またはこのような薬剤(分子またはその他の種類の刺激、例えば、波、光、放射線、物理的パラメーターなど)による治療の有効性を評価するため。
(i)単一細胞から始まる並行微小培養系列を製造できること。これにより実際に、細胞材料を多く消費する標準的モデルでは考えることができないような、組織内で典型的であるとは言えない希少な部分集団を標的とする大規模試験戦略の適用を可能とする。
(ii)選択された表現型の個々の播種細胞から、例えば、マイクロウェル内で、組織から選択された直後にクローン培養を開始することができること。これにより、培養での増殖工程を受けていない細胞材料に対して試験戦略の設定を考える可能性が得られ、従って、特に処置または刺激が微小培養物の播種直後に適用される場合には、試験を行う前に人工的培養パラメーターにより改変されている可能性が低くなる。
(iii)個々に培養下に置かれた細胞の挙動に初めて取り組めるということ。これにより、生物特性および目的の集団を形成している種々の細胞の特異的な応答を表現および定量する可能性が得られ、細胞集団全体を用いる標準的なモデルでは不可能な細胞のヘテロ性の分析が可能となる。
・有益な生物活性を有する化合物(例えば、薬剤として着目される、化粧品として活性な分子)の有効性の評価:
−単一の単離細胞の規模で生物活性の影響、すなわち、実際の標的細胞に対する処置の作用、その後代に対する影響の定量を可能とするスクリーニング戦略を行う。
−正常または病的幹細胞などの典型的であるとは言えない集団を標的とする評価試験の戦略を開発することができる。
・例
−1)多層上皮組織の幹細胞または前駆細胞の増殖を誘導し、2)単離幹細胞の後代の培養において幹的性質の維持を増進することができるエフェクターの試験、
−癌腫から単離された幹細胞に対する新規な抗癌分子の試験。
・特定の基準に基づいて選択した後、単離状態の被処置細胞の規模でストレスおよび毒物の影響を評価する。これらの試験は上皮組織の長期更新(幹細胞)および短期更新(前駆体)を担う細胞に選択的に適用することができる。
・それらはまた、標的細胞の種類に応じて、予後診断または組織もしくは器官への急性もしくは遅発性有害作用の識別に適合した試験の設計を可能とする。
−治療の無害性の評価または他方でその毒性作用、すなわち、実際の単離細胞に対する短期作用、その後代への結果の定量を可能とする毒理学的試験を行う。
−遺伝毒性攻撃の影響、すなわち、単離状態で試験される細胞の規模で、DNAへの傷害の獲得、突然変異の伝達および/または後代に対する遺伝子異常、器官形成などに対する結果を評価する。
−二次元細胞培養物および/または三次元器官型モデルに対する機能ゲノム科学のスクリーニング
−生物活性を有する分子のハイスループットスクリーニング/有害特性の検出(「ハイスループットスクリーニング」[HTS])
・移植を意図した、および/または再構築組織の移植片を製造するために使用することを意図した細胞サンプルの定量:
−臨床使用を意図した細胞の再生能、すなわち、臨床条件下で細胞に対して個々に評価される増殖能の評価を可能とする培養における試験
−in vitroで再構築された組織の移植能の予後診断試験:移植片を製造するために用いる細胞の増殖能の維持または喪失の評価
・臨床的展望における遺伝子導入プロトコールのバリデーション:
−遺伝子修復プロトコールの有効性の評価:遺伝子導入法の終了時に実際に修復された細胞の頻度の評価
−遺伝子修復の安定性、すなわち、個別化された細胞の後代への伝達の評価
単離状態の細胞およびそれらの後代に対する試験の適用と適合する細胞系および器官型モデル:
−それぞれ培養下および単離下に置かれた単一細胞の後代により形成される細胞バンクの並行製造
−クローン条件下で培養中の単一細胞の後代からなる、in vitroで再構築された正常または病的組織のモデル
A−1−細胞材料の調製
A−1−1−クローン培養に用いることを目的とした上皮細胞
まず、組織生検(ここに記載される実施例では、成人皮膚生検)を、例えば、それらをベタジン含有溶液に浸漬することにより除菌した。次に、上皮組織と会合している結合組織(この場合、表皮と真皮)を分離させるために、これらのサンプルを酵素溶液中、4℃で10〜15時間インキュベートした(Gibcoトリプシン)。酵素的消化工程の終了時に、組織サンプルを鋭いピンセットで切開して組織(ここでは、毛包間表皮)の上皮部分を単離した。ピペットで吸ったり出したりすることによる機械的解離工程によって完了されるこの酵素処理により、上皮の断片を構成するケラチノサイトの抽出が可能となる。最後に、細胞凝集物を除去するために細胞懸濁液を50〜70ミクロンメッシュの篩(BD Falcon)で濾過した。これらの工程の終了時に、細胞サンプルは単細胞懸濁液となり、クローン培養物を播種するために使用可能である。
記載されている例において、上皮細胞(毛包間表皮から得られたケラチノサイト)を、線量60グレイのγ線照射により複製不能とした繊維芽細胞の栄養層を支持体として用いた培養系のクローン条件下で研究した。よって、これらの細胞は静止状態に留まるが、生きており、それらは供試上皮細胞の増殖を支えた。これらの繊維芽細胞は特に皮膚生検の真皮部分から抽出することができる。これを行うために、真皮断片を、ディスパーゼ(Roche)とコラゲナーゼ(Roche)の混合物を含有する酵素溶液中、37℃で2〜4時間インキュベートした。酵素による消化を機械的攪拌と組み合わせることで繊維芽細胞の抽出が可能となる。非消化組織断片を篩(BD Falcon)で濾過し、次に洗浄することにより除去した後、得られた繊維芽細胞を増殖させるために、90%DMEM(Gibco)および10%ウシ起源血清(Gibco)からなる媒体中での培養下に置いた。培養増殖後、繊維芽細胞を照射した後、使用するまで保存のために冷凍した。
本発明の特定の実施形態を示すために用いる上皮細胞は、α6インテグリン(Itgα6またはCD49f)の発現レベルが強く、トランスフェリン受容体(CD71)の発現レベルが弱いケラチノサイトである:表現型Itgα6strongCD71weak。この表現型を定義するために必要な蛍光抗体による標識を達成するため、細胞サンプルを2%ウシアルブミン血清(SAB)(Sigma)を添加した生理食塩水バッファー(PBS)中に懸濁した状態とし、その後、抗体の非特異的結合部位を飽和させるためにマウス免疫グロブリン(Jackson Immuno-Reasearch)とともに4℃で10分間インキュベートした。次に、抗原CD49fおよびCD71の標識を、蛍光色素:抗CD49f−PE(フィコエリトリン)(クローンGoH3、BD Pharmingen)および抗CD71−APC(アロフィコシアニン)(クローンM−A712、BD Pharmingen)と結合させた特異的抗体を加えた後、4℃で30分間インキュベートすることにより行った。余分な抗体を洗浄した後、これらのサンプルをそのままクローン培養物の播種に用いた。
A−3−1−播種
記載されている例示的実施形態では、ケラチノサイトのクローン微小培養物を、クローニングモジュール(MoFlo、Cytomation)を備えたフローサイトメーターを用いて自動的に播種した。標識抗体と結合させた蛍光色素の励起は、488nmアルゴンレーザー(Coherent)および630nmレーザーダイオードを用いることで行った。フィコエリトリン(PE)およびアロフィコシアニン(APC)により放出されたシグナルをそれぞれ検出し、580±30nmおよび670±30nmの波長枠で定量した。この場合に選択された選別基準は、表皮幹細胞が豊富であると記載されているケラチノサイトの部分集団(Liら, 1998)であるItgα6strongCD71weakを有するケラチノサイトに相当し、全ケラチノサイトの約1%を占めた。
試験および研究に使用することを目的としたクローン培養(培養条件は以下に記載)と並行して、細胞を定着させるための手順をバリデートする目的で一連のクローン播種を行った。これらの定着は、細胞の増殖に用いられるものよりも細胞の位置決定に好適な培地であること以外は、厳密に同じ技術条件下で行った。この観察培地は、例えば、Hoechst 33342(Sigma)を10マイクログラム/mlの濃度で加えた生理食塩水バッファー(PBS)であってもよい。このHoechstは、UV励起下で蛍光性であるDNA着色剤である。これらの条件下で、多数の培養ウェルに個々に播種された細胞を位置決定することができ、これにより本方法の有効性のバリデーションが可能となる。各微小培養は単一の細胞を含まなければならず、2個のウェルや空のウェルの頻度は最小でなければならない。
A−4−1−一次クローン増殖
記載されている例において、ケラチノサイトの微小培養は、I型コラーゲンが吸着された96ウェルを含む培養プレート(Biocoat、Becton Dickinson)で行った。クローン条件下、上皮細胞の播種前日に、照射繊維芽細胞の栄養層を培養ウェルに設置した。これらの支持細胞を6,000細胞/cm2の密度で播種した。
記載されている例において、最初に個々に培養下に置かれたケラチノサイトの後代の組織の再構築能を、表皮を剥離した死んだヒト真皮上の表皮再構築モデル(Regnier ら, 1986)で示した。真皮支持体を作製するために、ヒト皮膚サンプルをPBSバッファー中、37℃で10日間インキュベートして、それらから表皮を剥離し、それを除去した。表皮を含まない真皮サンプルを約1cm2角に切った。次に、それらに数回連続して冷凍/解凍サイクルを行ったところ、真皮細胞を死滅させるに至った。得られた無細胞真皮を使用まで−20℃で保存した。三次元表皮を再構築するためのプロセスは2連続の培養工程からなった。まず、クローン微小培養由来の細胞サンプルを真皮支持体上に播種し、一次クローン培養に用いたものと類似の匹敵する培養培地(上記の組成例)に浸漬して1週間培養した。表皮再構築法の第二の工程は、形成される表皮を液体培地とインキュベーターの周囲空気との間の界面に置くことからなった。次に、完全な分化に達するまで1〜2週間培養を続けた。固定し、ヘマラム−エロシン−サフラン(HES)で染色した後に再構築された三次元組織の組織学的特徴を観察した。
クローン微小培養由来のケラチノサイトをトリプシン処理(Gibco)により分離した後、各供試クローンについて個別に大量培養下に置いた。これらの培養は、I型コラーゲンが吸着されたプラスチック表面(例えば、Petri、Biocoat、Becton−Dickinsonプレート)上で行った。培養条件は一次クローン増殖に用いたものと同等であった:照射繊維芽細胞の栄養層、同様の組成の培養培地。1週間後、培養物は50%〜80%の集密度に達した。次に、ケラチノサイトをトリプシン処理により分離し、計数した後に、同じ条件下、2,000〜3,000細胞/cm2の密度で再播種した。その後、培養物を移植し、細胞の拡大能が消耗するまで1週間おきに継代培養した。一次クローンの増殖工程および連続的継代培養の終了時に、細胞増殖を拡大係数および達成された集団倍加数に関して評価し、最初に個別培養に置かれたケラチノサイトの全体的拡大能を定量した。
集団倍加数=(Log N/N0)/Log2
N0=播種された細胞の数
N=培養工程の終了時に得られた細胞の数
課題は、クローン化されたケラチノサイトの後代を形成している細胞からのコロニー形成能の維持または喪失の評価についてである。これを行うために、一次クローンの細胞をトリプシン処理(Gibco)により分離した後、長期拡大能の評価に関して上記されたものと類似の条件下で、互いに分離したコロニーの増殖が得られるように低密度(例えば、5細胞/cm2)で播種した。14日後、培養物を70%エタノールで固定し、乾燥させた後、エオジン(RAL reagents)およびRAL 555(RAL reagents)の二つの連続槽により染色した。供試細胞のクローン形成能を定量するために考慮に入れるパラメーターは、特に、得られるコロニーの数と大きさであった。
上皮細胞の増殖能を分析するのに用いられるパラメーターは、低密度培養物においてはコロニー(CFEは「コロニー形成率」を指す)、またはこれらが単一細胞が播種された培養物である場合にはクローン(CFEは「クローン形成率」を指す)を形成するそれらの能力である。本方法が高いCFE値を示すことができるほど、それらは上皮細胞の増殖能を有効に定量するのにより有用となる。
それぞれ単一細胞の後代から複数のケラチノサイトのバンクを製造するための並行クローン微小培養のモデルの使用(図2)。
−成人皮膚生検(乳房縮小術)から得られる表皮からケラチノサイトを抽出し、分離し、懸濁させる。
−「幹」細胞の表現型を選別する可能性を与える蛍光色素と結合された抗体で懸濁ケラチノサイトを標識する(強い発現レベルのインテグリンα6(Itgα6)および低い発現レベルのトランスフェリン受容体(CD71):表現型Itgα6strong CD71weak、選択モデルLiら, 1998)。
−フローサイトメトリーによるクローニングモジュールを用い、多ウェル培養プレートに1ウェル当たり単一「幹」表現型細胞1個の量で自動播種する。
−培養2週間後、クローン化されたケラチノサイトが細胞クローンを生じたウェルの位置決定を行う。
−細胞増殖を促進する条件下で各クローン微小培養物から大量培養の播種を行う。
−種々の増殖段階(例えば、「若い」または「古い」培養段階)で最初にクローン化された細胞の後代を得るために培養物を連続的に移植し、このクローン化細胞から生じた細胞材料の量は冷凍細胞のバンクの形成に適合している。
−単一のケラチノサイトから始まった各培養が達成可能であった連続的継代培養の最大数を試験し、長期培養の終了時に産生されたケラチノサイトの全累積数を評価する。
ケラチノサイトのバンクを製造するそれらの能力に関して試験された五つの細胞クローンのコホートにおいて、それらは総て継代培養することができ、それらの後代は冷凍するのに十分に増殖させることができた。
−一つのクローンは、培養増殖8週間以内にケラチノサイト8.48×1012個の累積後代を生成し(No.1)、これは累積平均集団倍加数42.95に相当する。
−二つのクローンは、ケラチノサイト6.36×1011および2.4×1011個の累積後代を生成し(No.2およびNo.3)、これはそれぞれ平均集団倍加数39.21および37.80に相当する。
−一つのクローンは、培養増殖6週間以内にケラチノサイト2.03×1010個の累積後代を生成し(No.4)、これは累積平均集団倍加数34.24に相当する。
−一つのクローンは、培養増殖6週間以内にケラチノサイト2.15×109の累積後代を生成し(No.5)、これは累積平均集団倍加数31.00に相当する。
−本発明による並行クローン微小培養のモデルは、それぞれ組織サンプルから直接単離された単一細胞の後代からの複数のケラチノサイトバンクの標準的製造を可能とする技術に相当する。
−それはまた、異なる細胞種(例えば、前駆体、表皮幹細胞)の増殖能の、個々の細胞の規模での評価および比較を可能とする。
それぞれ単一細胞の後代から複数の再構築表皮を製造するためのクローン微小培養の系の使用(図3)
−成人皮膚生検(乳房縮小術)から得られる表皮からケラチノサイトを抽出し、分離し、懸濁させる。
−「幹」細胞の表現型をフローサイトメトリーで選別する可能性を与える蛍光色素と結合された抗体で懸濁ケラチノサイトを標識する(強い発現レベルのインテグリンα6(Itgα6)および低い発現レベルのトランスフェリン受容体(CD71):表現型Itgα6strong CD71weak、選択モデルLi ら, 1998)。
−フローサイトメトリーによるクローニングモジュールの手段により、多ウェル培養プレートに1ウェル当たり単一「幹」表現型細胞1個の量で自動播種する。
−培養週間2週間後、クローン化されたケラチノサイトが細胞クローンを生じたウェルの位置決定を行う。
−それらのそれぞれについて個別に、細胞クローンを形成しているケラチノサイトを用い、再構築された表皮(例えば、表皮を剥離した死んだヒト真皮上の表皮の再構築:Regnierら, 1986)を製造する。
5つの細胞クローンのコホートを各クローンの三次元再構築された表皮を製造する個々の能力に関して試験した。
−本発明による並行クローン微小培養の技術は一連の再構築表皮の製造を可能とし、その特殊性がそれぞれ単一細胞の後代に由来し、一方、大規模試験戦略のための慣用モデルは細胞の混合物に由来するバンクから製造される。
−本発明の目的である方法に従って製造された再構築表皮は組織から抽出された直後にクローン化細胞から製造され、その特徴を改変する可能性がある培養増殖工程の後ではない。
−この例示的実施形態においては、これらのクローンを〜16〜17の連続細胞世代に相当する増殖段階における表皮再構築に用いた。他の実施形態においては、表皮の再構築は、クローン化細胞のより早いまたはより遅い増殖段階から達成され得る。
目的の組織の場所に存在するケラチノサイトのクローン形成能を特徴付けるための並行クローン微小培養のモデルの使用。特に、課題は、細胞クローンを生じるそれらの能力を評価することであり、その大きさはそれらの短期増殖能の指標を提供する(図4)。
E−1−材料および方法
−成人皮膚生検(乳房縮小術)から得られる表皮からケラチノサイトを抽出し、分離し、懸濁させる。
−表皮の基底層に相当するケラチノサイトの集団を選別する可能性を与える蛍光色素と結合された抗体で懸濁ケラチノサイトを標識する(強い発現レベルのインテグリンα6(Itgα6):表現型Itgα6strong)。
−フローサイトメトリーによるクローニングモジュールの手段により、多ウェル培養プレートに1ウェル当たり単一基底ケラチノサイト1個の量で自動播種する。
−培養週間2週間後、クローン化されたケラチノサイトが細胞クローンを生じたウェルの位置決定を行い、次に、各クローンについて個々にそのケラチノサイトを分離および計数する。
−これらの異なるクローンをそれらの個々の大きさに応じて分類する。
〜800クローンの累積コホートに対して行った表皮の基底層由来のケラチノサイトにより生成されたクローンの大きさの分布の分析により、この細胞コンパートメントの機能的ヘテロ性が明らかになる(図4)。
−この階層の上位には、著しい短期増殖能を特徴とするクローンの少数画分が見られ、このサイズは2週間以内にケラチノサイト15×104個を超え得る。
−これに対し、この階層の下位には、極めて限定された増殖能を特徴とするクローン画分が見られる。これらのこれらの発育不全クローンの大きさは培養2週間後にもケラチノサイト104個を超えない。
−これらの極値の間に、大多数のクローンが見られ、これらは大きさの勾配に従って分布しているようであり、多数が呈する大きさの値はケラチノサイト9×104個前後に位置している。
−本発明による並行クローン微小培養の技術は、目的のサンプルに由来する細胞(この例示的実施形態では、表皮の基底ケラチノサイト)の個々のクローン形成能の特異的評価を可能とする。
−特に、この方法は組織に典型的な「機能的特徴」または組織内の部分的局在特性(この場合には、成人ヒト毛包間表皮の基底層)を提供するクローン増殖特性を定義するための解決法となることが分かる。
−さらに、この系を用いれば、目的の細胞サンプル内で、それらの短期クローン増殖能に応じた異なる能力を有する細胞を識別することができる。
目的のサンプルからのケラチノサイトの長期増殖能を特徴付けるためのための並行クローン微小培養のモデルの使用。特に、課題は、表皮幹細胞に関連した機能的特性の一つ、すなわち、培養で少なくとも100回集団倍加を行う能力を有するケラチノサイトの存在を検出することである(図5)。
−成人皮膚生検(乳房縮小術)から得られる表皮からケラチノサイトを抽出し、分離し、懸濁させる。
−表皮の基底層に相当するケラチノサイトの集団を選別する可能性を与える蛍光色素と結合された抗体で懸濁ケラチノサイトを標識する(強い発現レベルのインテグリンα6(Itgα6):表現型Itgα6strong)。
−フローサイトメトリーによるクローニングモジュールの手段により、多ウェル培養プレートに1ウェル当たり単一基底ケラチノサイト1個の量で自動播種する。
−培養週間2週間後、クローン化されたケラチノサイトが細胞クローンを生じたウェルの位置決定を行う。
−細胞増殖を促進する条件下で、クローン微小培養物の典型的コホートから大量培養の播種を行う。
−異なる培養物を個別に、1週間おきに、それらの個々の増殖能の限界に達するまで連続的に移植する。
−クローン起源の各培養物が持続可能であった連続的継代培養の数を評価し、各移植時に、また、長期培養の終了時に、起こった集団倍加の全累積数を評価する。
基底ケラチノサイトからの23クローンのコホートの長期増殖能の分析により、このコンパートメントの著しい能力のヘテロ性が明らかになる(図5)。
−観察される能力階層の下層では、制限された増殖能を有するクローンが見られ、これらは6〜7週間培養維持できるに過ぎず、合計30〜40回集団倍加を行えるに過ぎない。
−能力階層の上位には、24週間を超えても著しい増殖能の減退無く継代培養可能な、従って、集団倍加数100の拡大レベルを超え得る極めて大きな増殖能を有するクローンが見られる。
−これらの極地の間に、広い能力勾配に応じて分布したクローンが見られ、それらは9〜18週間継代培養可能であり、大多数は40〜80回集団倍加を行うことができる。
−本発明による技術または並行クローン微小培養は、目的のサンプル(本例示的実施形態では、表皮の基底ケラチノサイトの調製物)由来の細胞の長期増殖能の特異的評価を可能にする。
−特に、本方法は、幹細胞から生じたクローンを、前駆細胞から生じたクローン(それらの長期増殖能はもっと限定され、一般に集団倍加数30〜80までの間である)から、累積で少なくとも100回集団倍加を行うそれらの能力によって帰納的に識別するための解決法となることが分かる。
−この系を用いれば、幹細胞の後代および前駆細胞の抗体に相当する細胞サンプルを製造することができ、それらの特性を研究し、それらの長期増殖の種々の段階と比較することができる。
異なる表現型の表皮ケラチノサイトに対する照射の影響を単一の単離細胞の規模で定量するための並行クローン微小培養の機能試験の使用(図6)。
−成人皮膚生検(乳房縮小術)から得られる表皮からケラチノサイトを抽出し、分離し、懸濁させる。
−「幹」細胞の表現型をフローサイトメトリーで選別する可能性を与える蛍光色素と結合された抗体で懸濁ケラチノサイトを標識する(強い発現レベルのインテグリンα6(強い発現レベルのインテグリンα6(Itgα6)および低い発現レベルのトランスフェリン受容体(CD71):表現型Itgα6strong CD71weak)および「前駆細胞」の表現型(強い発現レベルのインテグリンα6(Itgα6)および強い発現レベルのトランスフェリン受容体(CD71):表現型Itgα6strong CD71strong)(選択モデル:Liら, 1998)。
−フローサイトメトリーによるクローニングモジュールの手段により、二つの供試細胞表現型のそれぞれについて、多ウェル培養プレートに1ウェル当たり単一細胞1個の量で自動播種する。
−播種20時間後に、各単離細胞に線量2Gy(γ線)を1回照射する。
−培養2週間後に、細胞クローンが発達したウェルを計数し、次に、各クローンのついて個々にケラチノサイトの分離と計数を行う。
G−2−結果
G−2−1−単離ケラチノサイトのクローン形成能に対する照射の影響(図6A)
−表現型Itgα6strong CD71weakの、個々に播種されたケラチノサイト(幹細胞が豊富な部分集団)の70.3%が細胞クローンを生じた。
−表現型Itgα6strong CD71strongのケラチノサイト(前駆体が豊富な部分集団)の61.7%がクローンを生じた。
−クローンを生じた表現型Itga6strong CD71weakのケラチノサイトのパーセンテージは70.3%(対照条件)から47.3%(2Gyの照射)に低下し、これらの細胞のクローン形成能の維持は67.3%と推定可能であった。
−表現型Itga6strong CD71strongのケラチノサイトのクローン形成能は照射により劇的に低下し、対照条件下では61.7%の細胞がクローンを生じるのに対して、照射下では23.0%であり、これらの細胞のクローン形成能は37.3%でしかないと推定可能であった。
対照条件下で、生産されたクローンの大きさは、両種類の供試ケラチノサイトの明確な識別を可能とする基準となることは明らかにならなかった。
−両表現型のケラチノサイトは、少なくとも5×104個のケラチノサイトを含む大型のクローンの大集団を形成することが分かった。
−照射後に大型のクローンを生じる、クローン化ケラチノサイトの能力の中程度の減退(対照条件下でのクローンサイズの中央値:10.1×104細胞/クローン、照射群のサイズの中央値:6.8×104細胞/クローン)。
−照射後に大型のクローンを生じる、ケラチノサイトItga6strong CD71strongの能力の強い顕著な減退(対照群のクローンサイズの中央値:8.5×104細胞/クローン、照射群のサイズの中央値:1.2×104細胞/クローン)。
−本発明による並行クローン微小培養のモデルは、特定の表現型のケラチノサイトの増殖能を個々の細胞の規模で分析するために行われることが分かる。実際、このモデルで得られたクローン形成率の値がクローン化細胞の60〜70%に達すると、それらは、組織生検から直接生じたケラチノサイトを考えれば、従来の培養系で一般に記載されているもの(その値は10%程度である)よりも極めて優れていることが分かる。
−このモデルはまた、細胞増殖能に対する有害な作用を検出、定性、および定量するために行われることも分かる。本実施例は、in vitro放射能毒性試験の開発により有用となる系の能力を示す。
その後代の増殖能に対する単一細胞の照射の結果を評価するための、並行クローン微小培養の機能試験の使用。表皮ケラチノサイトと異なる表現型との挙動の比較(図7)。
例示的実施形態No.5の範囲に記載されている手順に従う。
−個別化されたコロニーを得るために、クローンから生じたケラチノサイトの一部を低密度播種する(本実施例では、ケラチノサイト5個/cm2の密度)。
−培養2週間後、顕微鏡観察および肉眼的観察を行うことができるように、コロニーの固定および染色を行う。
対照条件下(個々に培養下に置かれた最初の細胞の照射無し)、それらの二次コロニー形成能に関して調べたクローン群は、この基準に非常に類似した特徴を示した。
−それぞれケラチノサイトItgα6strong CD71weak[クローン(1)〜(5)]およびケラチノサイトItgα6strong CD71strong[クローン(11)〜(15)]から生じた2系統のクローンからの二次コロニー生産能は匹敵するものであることが分かった。
−これらの両群は、大型の二次コロニーを豊富に生じる細胞クローン[例えば、クローン(1)と(11)]およびあまり豊富でないコロニーを生じ、小型である[例えば、クローン(5)と(15)]の双方を含んでなった。
−ケラチノサイトItgα6strong CD71weakから生じたクローン群[クローン(6)〜(10)]は、非照射群と同等の二次コロニー形成能を示した。
−他方、照射を受けたケラチノサイトItgα6strong CD71strongから生じたクローン群は[クローン(16)〜(20)]は二次クローン形成能の低下(直径5mm以上のコロニーの消失)を示した。
本発明による並行クローン微小培養のモデルを、個々に検討されるケラチノサイトで行われる照射の非即時的な結果を実証、定性、および定量するために適合させる。この場合、示される有害作用はクローン培養下に置かれた細胞の後代において測定された増殖能の低下であった。
クローン条件下に置かれた細胞に適用された遺伝毒性ストレスの長期結果を分析するための、並行クローン微小培養モデルの使用。課題は、細胞を個別の培養ウェルに個々に播種した後、数時間ストレスをかけること、および次に、細胞が分裂した後に長期培養を開始することである。次に、ゲノムレベルでの異常の存在を、所定の集団倍加数を行った後にクローン化細胞の後代のレベルで探索した。この探索は例えばゲノム中のDNA配列の表現不平衡(representation disequilibria)(欠失、増幅)の検出を可能とする技術、すなわち、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)を用いることにより行われる(図8)。
−成人皮膚生検(乳房縮小術)から得られる表皮からケラチノサイトを抽出し、分離し、懸濁させる。
−表皮の基底層に相当するケラチノサイトの集団を選別する可能性を与える蛍光色素と結合された抗体で懸濁ケラチノサイトを標識する(強い発現レベルのインテグリンα6(Itgα6):表現型Itgα6strong)。
−フローサイトメトリーによるクローニングモジュールの手段により、多ウェル培養プレートに1ウェル当たり基底ケラチノサイト1個の量で自動播種する。
−クローン微小培養物を、1)播種19時間後に線量2グレイのγ線照射を1回受ける群と2)非照射対照群の2群に分ける。
−培養2週間後、これらの2群それぞれについて、クローン化ケラチノサイトが細胞クローンを生じたウェルを位置決定する。
−細胞増殖を促進する条件下、これら2群のそれぞれに典型的なクローン微小培養物のコホートから大量培養に播種を行う。
−異なる培養物を個別に、1週間おきに、それらの個々の増殖能の限界に達するまで連続的に移植する。
−クローン起源の各培養物が持続可能であった連続的継代培養の数を評価し、各移植時に、また、長期培養の終了時に、起こった集団倍加の全累積数を評価する。
−これらの対照群および照射群から、極めて有意な長期増殖能を示す、特に、少なくとも150回の集団倍加が起こり得る培養物を選択する。
−各選択候補について、後期長期増殖段階(この場合、クローン播種後約150回集団倍加を行った培養物)に相当するゲノムDNAサンプルを調製する。
−対照群および照射群から生じた生成DNAサンプルに対して、参照DNAに対する比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)(CGHチップConstitutionalチップ(登録商標)4.0、PerkinElmer, Inc.、製造業者が推奨する方法に従う)により、欠失型および/または増幅の異常を有するゲノム領域を探索する。
クローン起源の長期培養物のCGHチップによる細胞遺伝学的分析は、検討した線量2グレイのγ線が、獲得された染色体異常が後代に伝達されるという結果を持つことを示し、遺伝毒性ストレスを適用した後に多数の細胞分裂において検出可能であることが分かる(図8)。
−本実施例において、第10染色体に位置する44.3メガベースの大きさの遺伝子座(10q11.21〜10q23.1の領域)の増幅が、照射後150回集団倍加した後のケラチノサイトの後代のDNAレベルで検出される。
−他方、この同じ供試ゲノムセグメントは、照射を受けなかった二つの例示的ケラチノサイトの後代のDNAレベルでは、この種のゲノム変化を示さなかった。
−クローン微小培養技術を用いれば、表皮の基底ケラチノサイトを個々に遺伝毒性ストレス(この場合、γ線照射)に曝し、次に、後代に対するその長期結果を評価することができる。
−特に、本方法は、基底ケラチノサイトのゲノムの完全性に対するストレスの影響をクローン規模で分析するのに有効であることが分かる。
−この例示的実施形態において、この系は、表皮の基底層から生じたケラチノサイトに対するγ線照射の遺伝毒性作用の検出を可能にする。
Claims (22)
- 培養支持体が健常または罹患上皮組織の生体サンプルから直接抽出された単一の上皮細胞を播種した少なくとも一つのクローン培養物を含んでなり、単一細胞の特定の特性を評価および利用するために至適化された、上皮細胞のクローン培養のための系。
- 前記培養支持体が少なくとも二つの並行クローン培養物を含んでなり、前記培養物がそれぞれ前記生体サンプルから直接抽出された異なる単一の上皮細胞が播種されていることを特徴とする、請求項1に記載の系。
- バイオチップであることを特徴とする、請求項1または2に記載の系。
- 単一細胞に特定の特性を評価および利用するために至適化された上皮細胞のクローン培養のための方法であって、少なくとも
a)健常または罹患上皮組織の生体サンプルから直接1以上の上皮細胞を抽出する工程、
b)所望により、工程a)で抽出された細胞から少なくとも一つの上皮細胞集団および/または部分集団を選択する工程、
c)工程a)またはb)から直接生じた異なる単一の上皮細胞を播種したクローン培養物を製造する工程、および
d)工程c)のクローン培養物における細胞増殖を定性的および/または定量的に評価する工程
を含んでなる、方法。 - 工程c)のクローン培養の細胞集団またはその後代を、1回以上の連続的継代培養により増殖することからなる工程e)をさらに含んでなることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 三次元組織を再構築してその組織の再構築能を評価するために、工程c)のクローン培養物またはその後代の細胞集団を用いることからなる工程f)をさらに含んでなることを特徴とする、請求項4または5に記載の方法。
- 前記細胞集団の長期拡大能を評価するために、拡大能が消耗するまで細胞拡大を促進する条件下で、工程c)のクローン培養物の細胞集団を継代培養することからなる工程g)をさらに含んでなることを特徴とする、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 厳密にクローン性の二次培養物および/または個別化されたコロニーの増殖を可能とする低密度培養物が形成されるクローン形成能の定量的試験により、工程c)のクローン培養物の後代の細胞集団のクローン形成能を評価することからなる工程h)をさらに含んでなることを特徴とする、請求項4〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 工程c)が少なくとも二つの並行クローン培養物の製造を含んでなり、その各培養物が工程a)またはb)から直接生じた異なる単一の上皮細胞が播種されていることを特徴とする、請求項4〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 上皮組織の前記生体サンプルが、哺乳類、好ましくはヒトにおいて生検により得られることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の系または請求項4〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記上皮組織が上皮、例えば、成人または新生児皮膚の毛包間表皮、角膜、粘膜、毛包から選択されることを特徴とする、請求項1〜3および10のいずれか一項に記載の系または請求項4〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体サンプルから直接抽出された上皮細胞が前駆細胞、幹細胞、ケラチノサイトから選択される単一の健常または罹患細胞であることを特徴とする、請求項1〜3、10、および11のいずれか一項に記載の系または請求項4〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項4に記載の方法の少なくとも工程a)〜c)を適用することにより得られることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の系。
- 請求項5に記載の方法の工程e)の終了時に得ることのできる、クローン細胞バンク。
- 請求項6に記載の方法の工程f)の終了時に得ることのできる、クローン培養物から再構築された三次元組織。
- 上皮、皮膚、表皮から選択されることを特徴とする、請求項15に記載の組織。
- 請求項15または16に記載の少なくとも一つの組織を含んでなるバイオチップ。
- 目的の生物活性を有する薬剤を同定および選択するための、
請求項1〜3および10〜13のいずれか一項に記載の系、もしくは
請求項14に記載の細胞バンク、もしくは
請求項15または16に記載の組織、もしくは
請求項17に記載のバイオチップ
の使用、または
請求項4〜12のいずれか一項に記載の方法。 - 細胞および/または遺伝子療法分野、特に移植分野においてin vitro診断および/またはin vitro予後診断のための、
請求項1〜3および10〜13のいずれか一項に記載の系、
請求項14に記載の細胞バンク、
請求項15または16に記載の組織、もしくは
請求項17に記載のバイオチップ
の使用、または
請求項4〜12のいずれか一項に記載の方法。 - 単一細胞、細胞サブタイプ、細胞部分集団または細胞集団に特異的な挙動および/または構造的および/または機能的個特性を試験するための、
請求項1〜3および10〜13のいずれか一項に記載の系、
請求項14に記載の細胞バンク、
請求項15または16に記載の組織、もしくは
請求項17に記載のバイオチップ
の使用、または
請求項4〜12のいずれか一項に記載の方法。 - 機能ゲノム科学の1以上のツールを製造するための、
請求項1〜3および10〜13のいずれか一項に記載の系、
請求項14に記載の細胞バンク、
請求項15または16に記載の組織、もしくは
請求項17に記載のバイオチップ
の使用、または
請求項4〜12のいずれか一項に記載の方法。 - 特に生物活性を有する薬剤、ストレス、毒物、遺伝毒性攻撃による治療の有効性または影響を評価するための、
請求項1〜3および10〜13のいずれか一項に記載の系、
請求項14に記載の細胞バンク、
請求項15または16に記載の組織、もしくは
請求項17に記載のバイオチップ
の使用、または
請求項4〜12のいずれか一項に記載の方法。
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