JP2021525100A - 増殖性肝細胞を培養する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)まず、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器において上記動物細胞を培養することと、
b)次に、コラーゲンまたは切り詰め型コラーゲン、すなわちゼラチンを含む培養培地に上記動物細胞を移すことにより、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに上記動物細胞を埋め込むことと、
c)上記コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を得ること
を含む、方法に関する。
a)まず、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器において上記動物細胞を培養することと、
b)次に、コラーゲン、好ましくは線維性コラーゲンを含む培養培地に上記動物細胞を移すことにより、コラーゲンマトリックス、好ましくは線維性コラーゲンマトリックスに上記動物細胞を埋め込むことと、
c)上記コラーゲンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を得ること
を含む、方法に関する。
a)まず、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器において上記動物細胞を培養することと、
b)次に、メタクリル酸修飾ゼラチン(GelMa)を含む培養培地に上記動物細胞を移すことにより、GelMaマトリックスに上記動物細胞を埋め込むことと、
c)上記GelMaマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を得ること
を含む、方法に関する。
d)コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞の培養物に、MAPK MEK1/2−ERK1/2経路の阻害剤を添加することにより、動物細胞の1つ以上のさらなる増殖の波(wave(s) of proliferation)を誘導すること
をさらに含む。
e)コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を、コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物と共にインキュベートすることにより、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスから増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を単離すること
をさらに含む。
a)本明細書で上述される方法により、増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドを得ることと、
b)増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドを、薬物または化合物と接触させることと、
c)増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドに及ぼす薬物または化合物の毒性、遺伝毒性、および/または効果を評価すること
を含む、方法に関する。
本発明において、以下の用語は以下の意味を有する。
本発明は、動物細胞を培養する方法であって、
a)まず、非接着性培養容器において動物細胞を培養することと、
b)次に、コラーゲンまたは切り詰め型コラーゲン、すなわちゼラチンを含む培養培地に動物細胞を移すことにより、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
c)コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を得ること
を含む、方法に関する。
a)まず、非接着性培養容器において動物細胞を培養することと、
b)次に、コラーゲンを含む培養培地に動物細胞を移すことにより、コラーゲンマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
c)コラーゲンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を得ること
を含む、方法に関する。
a)まず、非接着性培養容器において動物細胞を培養することと、
b)次に、切り詰め型コラーゲン、すなわちゼラチンを含む培養培地に動物細胞を移すことにより、ゼラチンマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
c)ゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を得ること
を含む、方法に関する。
a)まず、非接着性培養容器において動物細胞を培養することと、
b)次に、メタクリル酸修飾ゼラチン(GelMa)を含む培養培地に動物細胞を移すことにより、GelMaマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
c)GelMaマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を得ること
を含む、方法に関する。
a)まず、本明細書で上述される非接着性培養容器において動物細胞を培養することと、
b)次に、コラーゲンまたは切り詰め型コラーゲン、すなわちゼラチンを含む培養培地に動物細胞を移すことにより、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
c)コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を得ることと、
d)任意選択で、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞の培養物に、上述されるMAPK MEK1/2−ERK1/2経路の阻害剤を添加することにより、動物細胞の1つ以上のさらなる増殖の波(wave(s) of proliferation)を誘導することと、
e)任意選択で、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を、コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物とインキュベートすることにより、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスから増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を単離すること
を含む、方法に関する。
a)まず、本明細書で上述される非接着性培養容器において動物細胞を培養することと、
b)次に、コラーゲン、好ましくは線維性コラーゲンを含む培養培地に動物細胞を移すことにより、コラーゲンマトリックス、好ましくは線維性コラーゲンマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
c)コラーゲンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を得ることと、
d)任意選択で、コラーゲンマトリックスに埋め込まれた動物細胞の培養物に、上述されるMAPK MEK1/2−ERK1/2経路の阻害剤を添加することにより、動物細胞の1つ以上のさらなる増殖の波(wave(s) of proliferation)を誘導することと、
e)任意選択で、コラーゲンマトリックスに埋め込まれた増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を、コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物と共にインキュベートすることにより、コラーゲンマトリックスから増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を単離すること
を含む、方法に関する。
a)まず、低接着性または超低接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性プレートにおいて動物細胞を培養することと、
b)次に、約0.25mg/mL〜約3mg/mL、好ましくは約0.5mg/mL〜約2.5mg/mL、より好ましくは約0.75mg/mL〜約1.5mg/mLの範囲の濃度で線維性コラーゲン、好ましくはI型コラーゲンを含む培養培地に動物細胞を移すことにより、線維性コラーゲンマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
c)コラーゲンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を得ることと、
d)任意選択で、コラーゲンマトリックスに埋め込まれた動物細胞の培養物に、上述されるMAPK MEK1/2−ERK1/2経路の阻害剤を添加することにより、動物細胞の1つ以上のさらなる増殖の波(wave(s) of proliferation)を誘導することと、
e)任意選択で、コラーゲンマトリックスに埋め込まれた増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を、コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物とインキュベートすることにより、コラーゲンマトリックスから増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を単離することを含む、方法に関する。
a)まず、本明細書で上述される非接着性培養容器において動物細胞を培養することと、
b)次に、メタクリル酸修飾ゼラチン(GelMa)を含む培養培地に動物細胞を移すことにより、GelMaマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
c)GelMaマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を得ることと、
d)任意選択で、GelMaトリックスに埋め込まれた動物細胞の培養物に、上述されるMAPK MEK1/2−ERK1/2経路の阻害剤を添加することにより、動物細胞の1つ以上のさらなる増殖の波(wave(s) of proliferation)を誘導することと、
e)任意選択で、GelMaマトリックスに埋め込まれた増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を、コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物とインキュベートすることにより、GelMaマトリックスから増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を単離すること
を含む、方法に関する。
a)まず、低接着性または超低接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性プレートにおいて動物細胞を培養することと、
b)次に、約1(w/v)%〜約20(w/v)%、好ましくは約2.5(w/v)%〜約10(w/v)%、より好ましくは約5(w/v)%の範囲の濃度でメタクリル酸修飾ゼラチンを含む培養容器に動物細胞を移すことにより、GelMaマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
c)GelMaマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を得ることと、
d)任意選択で、GelMaトリックスに埋め込まれた動物細胞の培養物に、上述されるMAPK MEK1/2−ERK1/2経路の阻害剤を添加することにより、動物細胞の1つ以上のさらなる増殖の波(wave(s) of proliferation)を誘導することと、
e)任意選択で、GelMaマトリックスに埋め込まれた増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を、コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物とインキュベートすることにより、GelMaマトリックスから増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を単離すること
を含む、方法に関する。
a)まず、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性プレートにおいて初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞を培養することと、
b)次に、本明細書で上述されるコラーゲンまたはゼラチン、特にメタクリル酸修飾ゼラチン(GelMa)を含む培養培地に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞を移すことにより、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にGelMaマトリックスに初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞を埋め込むことと、
c)コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にGelMaマトリックスに埋め込まれた初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞を培養することにより、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドを得ることと、
d)任意選択で、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にGelMaマトリックスに埋め込まれた初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞の培養物に、上述されるMAPK MEK1/2−ERK1/2経路の阻害剤を添加することにより、初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞の1つ以上のさらなる増殖の波(wave(s) of proliferation)を誘導すること
を含む、方法に関する。
極性化した増殖性初代肝細胞、好ましくは極性化した増殖性PHH;
フェトプロテイン、アルブミン、および/またはアルドラーゼB、好ましくはアルブミン、および/またはアルドラーゼBを発現する、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性PHH;
アルブミンを分泌する、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性PHH;
フェーズI、フェーズII、および/またはフェーズIIIの代謝酵素を発現する、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性PHH;ならびに/または
MRP2および/またはMRP3などの薬物輸送体を発現する、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性PHH;
の少なくとも1つであるとさらに特徴づけられる、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性PHHを含む。
a)まず、低接着性または超低接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性プレートにおいて初代肝細胞を培養することと、
b)次に、本明細書で上述されるコラーゲンまたはゼラチン、特にメタクリル酸修飾ゼラチン(GelMa)を含む培養培地に初代肝細胞を移すことにより、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にGelMaマトリックスに初代肝細胞を埋め込むことと、
c)コラーゲンマトリックスにまたはゼラチンマトリックスに、特にGelMaマトリックスに埋め込まれた初代肝細胞を培養することにより、増殖性初代肝細胞を含むスフェロイドを得ることと、
d)任意選択で、コラーゲンマトリックスにまたはゼラチンマトリックスに、特にGelMaマトリックスに埋め込まれた増殖性初代肝細胞を含むスフェロイドを、コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物とインキュベートすることにより、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にGelMaマトリックスから、増殖性初代肝細胞を含むスフェロイドを単離すること
を含む、方法に関する。
a)本明細書で上述される増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を得ることと、
b)増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を、薬物または化合物と接触させることと、
c)増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物に及ぼす薬物または化合物の毒性および/または効果を評価すること
を含む、方法に関する。
a)本明細書で上述される方法により増殖性初代ヒト肝細胞(PHH)を含むスフェロイドを得ることと、
b)増殖性PHHを含むスフェロイドを、薬物または化合物と接触させることと、
c)増殖性PHHを含むスフェロイドに及ぼす薬物または化合物の毒性および/または効果を評価すること
を含む、方法に関する。
本発明を、以下の実施例によりさらに例示する。
材料および方法
材料
細胞
ヒト肝臓サンプルを、Centre de Ressources Biologiques(CRB)−Sante of Rennes(CHRU Pontchaillou, Rennes, France)を介して、原発性肝細胞癌または肝臓転移のため肝臓切除術を受ける患者から入手した。研究プロトコルを、フランス政府のガイドラインおよび地方制度の倫理委員会の下で行った。ヒト肝臓サンプルの臨床的な特徴を、以下の表1に詳述する。
細胞増殖試薬WST−1、リベラ―ゼ(10μg/mL)およびコルセミド(1μm)を、Rocheから入手した。シスプラチンを、Mylanから入手した。I型コラーゲン、エトキシレゾルフィン、メトキシレゾルフィン、ヘキスト、5(6)−カルボキシ−2’,7’−ジクロロFDA(CDFDA、10μM)、1×ITS(インスリン、トランスフェリン、セレン)、および抗βアクチン抗体(A−5441、1/1000)を、Sigma−Aldrichから入手した。BrdU(RPN201V、1:1000)および抗−BrdU抗体(RPN202、1:100)は、GE Healthcare(Chicago, USA)から入手した。rhEGFを、Promega(Fitchburg, USA)から入手し、rhHGFを、R&D Systemsから入手した。抗HSC−70抗体(sc−7298、1:5000)を、Santa−Cruz Biotechnologyから入手した。抗Ki67(MA5−14520、1:400)抗体を、Invitrogenから入手した。ホスホ−p44/42 MAPK(Thr202/Tyr204)(9106、1:1000)、E−カドヘリン(3195、1:100)、アポトーシス促進性Bcl−2ファミリー(1:500)、および生存促進性Bcl−2ファミリー(1:500)に対する抗体を、Cell Signalingから入手した。抗Nカドヘリン抗体(610921、1:100)は、BD Biosciencesから入手した。MRP2(ab3373、1:100)およびサイクリンD1(ab16663、1:100)に対する抗体を、Abcamから入手した。抗ビメンチン抗体(M0725、1:1000)を、Dakoから入手した。抗ホスホ−ヒストンH3(Ser10)抗体(06−570、1:100)を、Merkから入手し、抗アルブミン抗体(A80−229A、1:100)を、Bethyl Laboratories, Inc.から入手した。MEK阻害剤U0126(50μM)は、Promegaから入手した。
初代ヒト肝細胞2D培養
対照として、後述される低接着性プレートで形成される初代ヒト肝細胞(PHH)の凝集体を、標準的なマルチウェルプレートに播種し、同じ培地、すなわち本明細書で上述のWE HH培地で培養した。
図1に示されるように、上述のように単離された初代ヒト肝細胞(PHH)を、まず低接着性プレートで培養した(図1A)。次に、これにより得られたPHHの凝集体を、コラーゲンマトリックス(コラーゲンゲルとも呼ばれる)に埋め込み、コラーゲンマトリックスでさらに培養した(図1B)。
ホルモル(ホルムアルデヒドとして知られている)での固定の後に、4%のコラーゲンゲルを、増加する濃度のアルコールおよびキシレン槽で連続してインキュベーションすることにより脱水した後、EXCELSIOR ESツール(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)を使用してパラフィンに含侵させた。含侵の後、ゲルを、パラフィンブロックに包含し、4μmの切片を作製した。
チミジン類縁体BrdUの組み込みを、細胞増殖の指標として使用した。24時間の組み込みの後、コラーゲンゲル中の細胞を、エタノール−グリシンで固定し、上述のようにパラフィンに包含した。BrdU陽性細胞を、抗BrdU抗体(RPN202、1:100)を使用して検出した。
免疫組織化学染色を、Discovery Rhodamine kit(Ventana Medical Systems, Tucson, USA)を使用して、Discovery Automated IHC stainerで行った。75℃で8分間のVentana EZ Prep溶液での脱パラフィン化の後、抗原賦活化(antigen retrieval)を、Trisベースのバッファー溶液CC1(Ventana Medical Systems, Tucson, USA)を使用して95℃〜100℃で36分間行った。内因性(Endogen)ペルオキシダーゼを、3%のH2O2(Ventana Medical Systems, Tucson, USA)を用いて37℃で8分間阻害した。反応バッファー(Roche, Basel, Switzerland)ですすいだ後、スライドを、所望の一次抗体の適切な希釈物と、37℃で60分間インキュベートした。すすいだ後、シグナルの亢進を、Ventana Rhodamineキットを使用して行い、二次抗体抗ウサギHRP(Roche, Basel, Switzerland)とのインキュベーションを、16分間行った。器具から取り出した後、スライドを手ですすぎ、アルブミン(1:100)、アルブミン検出のため二次抗体(ロバ抗ヤギ655。1:250)、およびヘキスト(1:1500)で染色し、カバーガラスをかけた。
細胞を、37℃、15分間のリベラーゼ酵素混合物10μg/mL(Roche, Basel, Switzerland)の作用によりコラーゲンゲルから抽出した。次に、総RNAを、NucleoSpin RNA(Macherey−Nagel, Hoerdt, France)を使用して細胞のペレットから抽出し、総RNAの濃度を、NanoDrop ND−1000(NanoDrop Technologies, Wilmington, USA)で測定した。総RNAを、High Capacity cDNA reverse transcription kit(Applied Biosystems, Saint Aubin, France)を使用するcDNA合成に使用した。すべての遺伝子についてのリアルタイムPCRを、製造社の推奨に従いPower SYBR Green PCR master mix(Applied Biosystems, Saint Aubin, France)およびCFX384 Real−Time System(Biorad)を用いるSYBR green技術を使用して行った。使用されるプライマー配列を、以下の表2および3に記載する。
細胞を、37℃で15分間、リベラーゼ酵素混合物10μg/mL(Roche, Basel, Switzerland)の作用によりコラーゲンから抽出した。タンパク質サンプルを、細胞のペレットから抽出し、用量設定(dose)した。タンパク質サンプルを次に、SDS−PAGEを使用して分離し、転写バッファー(25mMのTris、200mMのグリシン、エタノール20%)中でニトロセルロース膜に移した。ブロットを、トリスバッファー生理食塩水(65mMのTris pH、7.4、150mMのNaCl)中5%の低脂肪ミルクで、室温で1時間ブロッキングした。このブロットを、所望の一次抗体と4℃で一晩インキュベートした。ブロットをTBSで洗浄し、TBS中5%の低脂肪ミルク中で、マウス―IgG HRPまたはウサギIgG HRP二次抗体(1:10000)と室温で1時間インキュベートした。これらのブロットを次に、TBSで洗浄した。免疫複合体を、イモビロン(Immobilon)ウェスタン化学発光HRP基質(Millipore, Merck, Darmstadt, Germany)を使用する化学発光反応の後にFujifilm LAS−3000撮像装置(Fujifilm, Tokyo, Japan)を使用して視覚化した。バンドの濃度測定解析を、MultiGaugeソフトウェア(Fujifilm, Tokyo, Japan)を使用して行った。
蛍光ベースの排出アッセイを使用して、3D 初代ヒト肝細胞(PHH)培養におけるMRP2の輸送体活性を調査した。膜透過性および非蛍光性の基質5−(および−6)−カルボキシ−2’,7’−ジクロロFDA(CDFDA)は、肝細胞の中に進み、ここで細胞内の非特異的なエラスターゼによるこの物質の加水分解は蛍光産物をもたらす。膜輸送体MRP−2の基質であるこの産物は、肝細胞から毛細胆管中に排出される。
それぞれCYP 1A1/2および1A2活性に関連するエトキシレゾルフィンO−脱エチル(EROD)およびメトキシレゾルフィン O−脱エチル(MROD)を、BurkeおよびMayer(Burke and Mayer, 1983)が記載するように培養された肝細胞で測定した。簡潔に述べると、細胞を、37℃にてリン酸塩バッファー生理食塩水で洗浄した後に、サリチルアミド(1.5mM)とインキュベートして、フェーズIIの結合酵素を阻害した。7−エトキシレゾルフィンまたは7−メトキシレゾルフィンを1分後に添加し、基質の酸化を、37℃にて20分間、2分ごとに蛍光検出により測定した。反応速度は時間と線形であった。P450 1A1/2および1A2の活性の評価の後、比色分析のWST−1ベースのアッセイを、生細胞の量で上記活性を正規化するために行った。値(pmol/分/OD)は、3連の測定値の平均値±標準偏差に対応する。
本発明の方法により確立された3D培養で培養されたPHHの有糸分裂指数を測定するために、微小管を脱重合する薬物のコルセミドを使用して中期の細胞を停止させた。細胞を、コルセミドで24時間処理した後、ホルモル4%で固定した。有糸分裂指数の定量化を、リン酸化したヒストンH3の免疫染色により行った。
培養した肝細胞の観察およびイメージングを、2光子励起蛍光(TPEF)顕微鏡(非線形、多光子、または2光子のレーザー走査顕微鏡とも呼ばれる)を使用して行った。TPEF顕微鏡は、深く解像度の高い3次元のイメージングに特に適している共焦点およびデコンボリューション顕微鏡の代替である。TPEFは、内在性の自己蛍光する染色されていないまたは染色されたサンプルの観察を可能にする。1型または3型のコラーゲンなどの過分極線維性タンパク質の観察を可能にする第二次高調波発生(SHG)と共に、これらの方法は、細胞およびコラーゲンマトリックスの空間的に解像された3次元構造の画像を提供する。SHGイメージングシステムは、DMI 6000倒立顕微鏡(Leica Microsystems)上に搭載され、MAITAIフェムト秒レーザー(Spectra Physics, Santa Clara, CA)を備えるconfocal SP5 scanning head(Leica Microsystems, Mannheim, Germany)からなった。高いNA水浸対物レンズ(LUMFL 60W×1.1NA;Olympus, Tokyo, Japan)を使用した。SHGシグナルを、水浸コンデンサー(S1,NA=0.9;Leica Microsystems)を使用して順方向で収集した。405−20バンドパスフィルターを、光電子増倍管および油浸対物レンズ10x/0.4HC PL APO oilまたは20x/0.7 HC PL APO oilの前に載置した。
結果を、平均値±標準偏差として表す。データを、両側スチューデントt検定で解析した。差異を、p<0.05(*)、p<0.01(**)、またはp<0.001(***)である場合、有意であるとみなした。すべての実験を、少なくとも3回行った。
LAPでの前培養後のコラーゲンマトリックスでの3D培養は、成年初代ヒト肝細胞の長期間の生存を可能にする。
本明細書で上述されるように、まず、初代ヒト肝細胞を、15時間低接着性プレートで培養した後、適切な増殖因子/サイトカインカクテルの存在下にてコラーゲンゲルに埋め込んだ。図2A〜2Bに示されるように、コラーゲンゲルへの包含から2日後(d2)に、初代ヒト肝細胞は、膜の伸長を全く示さずかついずれの特定の編成も伴わない、単離された細胞または円形の細胞の小さなクラスターとして出現した(3D再構築に関しては図2Bを参照)。これらのクラスターは、著しく不均一な大きさを有し、良好に編成されなかった。しかしながら、図2C〜Dに示されるように、コラーゲンゲルへの包含から7日後(d7)に、初代ヒト肝細胞のクラスターの数は多く、上記クラスターはより大きく、よって、コラーゲンマトリックスが培養時間にわたりクラスター形成に影響を与え得ることを示した。図2E〜Fで例示されるように、7日目に行われたTPEFイメージングおよびZスタックの再構築は、初代ヒト肝細胞のクラスターが、中空内腔を有する異なる大きさの腺房様構造に編成されたことを示した。これらの腺房様構造は、ヘパトスフィアまたはスフェロイドとも呼ばれ、コラーゲンマトリックスに埋め込まれた良好に編成された肝細胞の1つの層の存在を特徴とした。コラーゲンゲルへの包含から15日後(d15)に、SHG顕微鏡は、スフェロイドから少し離れて、コラーゲン線維が、平滑であり無作為に配向されたナノ線維を伴い弛緩して現れたことを示した(図2G)。これらのコラーゲン線維は、スフェロイドの密接した微小環境中でより濃縮されかつまた伸長されるように現れることから、スフェロイドの体積を抑制している(図2H上のコラーゲンシグネチャーCS−1を参照)。特に、コラーゲン線維の平行線維束が、密接したスフェロイドと平行に分布した(図2H上のコラーゲンシグネチャーCS−2を参照)。よって、これらの全ての知見は、成年の初代ヒト肝細胞が、コラーゲンゲルに埋め込まれると、腺房様の構造、すなわちスフェロイドを形成し得ることを証明した。このプロセスは、動的であるように見え、スフェロイドは、経時的にコラーゲンマトリックスをリモデル化できるようである。
図4に示されるように、RT−qPCRおよびウェスタンブロッティングによる解析は、3D培養におけるPHHの長期間の生存が、上皮マーカー(E−カドヘリン)の発現の増加および間葉系マーカー(N−カドヘリン、ビメンチン、サイトケラチン8、サイトケラチン18)の発現の減少に関連していたことを示した。N−カドヘリンおよびビメンチンの発現は、mRNAレベル(図4A)およびタンパク質レベル(図4B)の両方で、対照2D培養におけるPHHよりも3D培養におけるPHH(これらは同じ増殖因子/サイトカインにより刺激された)で有意に低かった。特に、N−カドヘリンの発現は、対照2D培養でのPHHにおいて、培養の2日目からおよびそれ以降、迅速に増加した。mRNAレベルでのE−カドヘリンは、3D培養におけるPHHで著しく発現され、この発現は経時的にさらに増加した。さらに、PHHスフェロイドにおける免疫検出は、頂端膜、側膜、および基底膜でN−カドヘリンおよびE−カドヘリンの明確に異なる局在化を示した。より正確には、E−カドヘリン標識の増大が、頂端膜および側膜にて、5日目〜15日目で明確にみることができ、一方でN−カドヘリンは、ヒト肝臓の肝細胞におけるそれらの特異的な局在化と一致して側膜および基底膜に優先的に位置していた(データ不図示)。興味深いことに、力を介して依存性(force−mediated dependent)であることが記載されている(Willer et al., 2017; Flouriot et al. 2014)、MKL1/MRTF−A 転写因子(巨核芽球性白血病1/ミオカルディン−関連転写因子)は、3D培養におけるPHHでのみ核局在化を示した。この転写因子は、核でも細胞質でも、2D培養におけるPHHでは検出できなかった(データ不図示)。
ヒト肝細胞の分化に及ぼす3D培養の影響を確認するために、RT−qPCRによる解析を行って、α−フェトプロテイン、アルブミン、アルドラーゼB、およびフェーズI−II−IIIの異物代謝酵素(解毒酵素とも呼ばれる)のmRNA発現レベルを調査した。図5Aに示されるように、αフェトプロテイン、アルブミン、およびアルドラーゼBのmRNA発現は、対照2D培養におけるPHHよりも3D培養におけるPHHで有意に高かった(これらは同じ増殖因子/サイトカインカクテルにより刺激された)。図5B〜Dに示されるように、フェーズI(CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1)、フェーズII(GSTA1/2、UGT1A1、NAT2)、およびフェーズIII(MRP2、OCT1)の解毒酵素もまた、3D培養におけるPHHで著しく発現された。
へパトスフェロイドの大きさおよび形態を、2週間の培養にわたり評価した(図7)。細胞を、ヘマトキシリン−エオジン−サフラン(HES)染色の後に観察し、スフェロイドの直径の平均を定量化した。2週間の培養にわたり、すべてのスフェロイドは、1層の細胞のみを示し、中空内腔を有する腺房様構造を呈した(図6および7A参照)。
上述されるように、スフェロイドの大きさは、経時的に徐々に増加した。特に、60μm未満の直径を有する肝細胞−スフェロイドの数は減少し、一方で60μmを超える直径を有するスフェロイドの数は、漸進的に増加した(図7C)。以下の表4に示されるように、大きさの定量化は、2日目の47.62μm±1.61μmから、10日目の72.04μm±6.92μmへと、スフェロイドの平均直径の増加を示し、これは、スフェロイドの体積のおよそ3倍の増加に対応する。15日目に、スフェロイドの大きさは安定化し、またはわずかに減少し、それ以降一定した状態を保っていた(表4および結果は示されない)。
本明細書で上述されるように、異なるドナー(HL−a〜HL−j、表1参照)から単離した肝細胞由来の本発明の方法により確立された全ての3D培養の解析は、ドナーに応じた増殖応答のわずかなバリエーションを伴う、2日目〜15日目の成年ヒト肝細胞の増殖能力を示した。培養の2週間後には、さらなる増殖は検出できなかった。MEK/ERK経路の一時的な活性化がげっ歯類の肝細胞でDNAの複製を刺激すること、およびMEK/ERK経路の阻害がげっ歯類肝細胞の増殖を阻害することが、以前に示された。MEK/ERK経路の持続される活性化がラットの肝細胞の増殖に負の役割を有し得ること(Fremin et al., 2009)およびカスケードの過剰な活性化もヒト肝細胞癌細胞株HuH−7で細胞の複製を阻害し得ること(Guegan et al., 2015)もまた示された。初代ヒト肝細胞の増殖を、12日目または15日目に本明細書で上述されるように確立された3D培養においてMEK阻害剤U0126でMAPK MEK1/2−ERK1/2経路を48時間一時的に阻害した後に、評価した。ERK1/2リン酸化の対照は、すべての培養条件でU0126の終了時にERK1/2活性の強力な阻害を確認した(図12A)。MEK阻害剤を除去した後、累積的なKi67(図12B)およびサイクリンD1(図12C)陽性細胞は、細胞の50%〜70%が新規細胞周期を経験し得た(Ki67+/Alb+およびサイクリンD1+/Alb+)ことを示した。陽性細胞は、同様の一時的なMEK/ERK阻害の後のDMSO対照実験でまたは対照2D培養で検出できなかった(データ不図示)。
材料および方法
細胞
初代ヒト肝細胞(PHH)を、本明細書で上述されるように入手した。
初代ヒト肝細胞培養
初代ヒト肝細胞の3D培養を、本明細書で上述されるように(実施例1参照)設定した。簡潔に述べると、PHHをまず、低接着性プレートで培養した。次に、その結果得られるPHHの凝集体をコラーゲンマトリックスに埋め込み、コラーゲンマトリックスでさらに培養した。
PHHを、本明細書で上記に定義されるWE HH培地(実施例1参照)で培養した。
PHHの増殖を評価するために、免疫組織化学染色を本明細書で上述されるように行った。
本発明に係る3D培養におけるPHHの増殖での増殖因子の刺激の重要性を、さらに試験した。コラーゲンマトリックスにおけるPHHを、EGF、HGF、および/またはITS(インスリン、トランスフェリン、および亜セレン酸ナトリウム)を欠くWE EE培地中で、本明細書で上述されるように培養した。またコラーゲンマトリックス中のPHHを、FCSを欠くWE HH培地中にて本明細書で上述されるように培養した。以下の表5に示されるように、異なる培養培地で培養したPHHの増殖を、培養対照(WE HH培地)中の陽性細胞のパーセンテージに対するサイクリンD1+/Alb+細胞の数の定量化により評価し、検出された細胞数に関連させた。
材料および方法
細胞
初代ヒト肝細胞3D培養を、本明細書で上述されるように設定した(実施例1参照)。
初代ヒト肝細胞の培養
コラーゲンマトリックスにおける初代ヒト肝細胞の2D培養および3D培養を、本明細書で上述されるように(実施例1参照)設定した。PHHを本明細書で上述されるようにWE HH培地で培養した。
対照2D培養(2D)でまたはコラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された3D培養(3D)でのいずれかにおけるPHHを、培養の開始から、表記された濃度の表記された遺伝毒性薬物(表7参照)とインキュベートした。9日後に、PHHを、精製したコラゲナーゼの作用によりコラーゲンマトリックスから抽出した。細胞のペレットを、0.5%の低融点のアガロースに再懸濁し、通常のアガロースで覆われた従来の顕微鏡スライド上に載置した。電気泳動を処理し、ヨウ化プロピジウムで染色した後に、少なくとも100枚の画像を、蛍光顕微鏡を使用して獲得した。画像を、Comet Assay IVソフトウェアを使用して解析した。個々の細胞におけるDNA損傷の度合いを、tail DNAのパーセンテージにより評価した。
本発明の方法により確立されたコラーゲンマトリックスでの3D培養(3D)でのPHHを、培養の開始から、表記の濃度の表記の遺伝毒性薬物(表7参照)とインキュベートした。9日後に、免疫組織化学染色を、本明細書で上述されるように行って、PHH中の、DNA二本鎖切断のマーカーであるリン酸化H2AX(すなわちγH2Ax)の存在を検出した。
薬物により誘導される遺伝毒性を試験するためのモデルとしての増殖性PHHを含むスフェロイドの感受性を評価するために、上記スフェロイドに及ぼす2つのクラスの化合物:代謝されることなくDNAに直接的な作用を発揮する、アルカリ化剤、すなわちシスプラチン(リン酸化ヒストンγH2Axアッセイ、図14参照):代謝的活性化後にのみ遺伝毒性となる、2つの証明されている発がん物質、すなわち4−ABP(4−アミノビフェニル)およびAFB−1(アフラトキシンB1)(図13および図14)、の作用を試験した。初代ヒト肝細胞を、3D培養の開始から、増殖する期間の間、遺伝毒性薬物と9日間インキュベートした。
材料および方法
材料
細胞
初代ヒト肝細胞3D培養を、本明細書で上述されるように設定した(実施例1参照)。
メタクリル酸修飾ゼラチンを、ART Bio−encres(Accelerateur de Recherches Technologiques de l’Inserm, Bordeaux)から入手した。リチウム フェニル−2,4,6−トリメチルベンゾイルホスフィナート(LAP)を、TCIから入手した。
ゼラチンメタクリラート(GelMa)での初代ヒト肝細胞の培養
図1に示される方法と同様の方法で、上述(実施例1参照)のように単離した初代ヒト肝細胞(PHH)を、まず、低接着性プレートで培養した(図1A)。次に、これにより得られるPHHの凝集体を、GelMaマトリックス(GelMaハイドロゲルとも呼ばれる)に埋め込み、GelMaマトリックスでさらに培養した(図1B)。
LAPでの前培養後のGelMaマトリックスでの3D培養におけるPHHスフェロイドの形成
へパトスフェロイドの大きさおよび形態を、2週間の培養にわたり評価した(図15)。これらの細胞を、ヘマトキシリン−エオジン−サフラン(HES)染色の後に観察した。2週間の培養にわたり、すべてのスフェロイドは、細胞の1層のみを示し、中空内腔を有する腺房様構造を呈した(図15および16参照)。
GelMaマトリックスにおける初代ヒト肝細胞の増殖を、GelMaマトリックスで本発明の方法により確立された3D培養へ播種後30日間にわたるサイクリンD1およびアルブミン(Alb)の発現の解析を介して評価した(図17)。
Claims (15)
- 動物細胞を培養して増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を得る方法であって、
a)まず、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器中で前記動物細胞を培養することと、
b)次に、コラーゲンまたは切り詰め型コラーゲン、すなわちゼラチンを含む培養培地に前記動物細胞を移し、それによりコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス中に前記動物細胞を埋め込むことと、
c)前記コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス中に埋め込まれた動物細胞を培養し、それにより増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を得ること
を含む、方法。 - a)まず、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器中で前記動物細胞を培養することと、
b)次に、コラーゲン、好ましくは線維性コラーゲンを含む培養培地に前記動物細胞を移し、それによりコラーゲンマトリックス、好ましくは線維性コラーゲンマトリックス中に前記動物細胞を埋め込むことと、
c)前記コラーゲンマトリックス中に埋め込まれた動物細胞を培養し、それにより増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を得ること
を含む、請求項1に記載の方法。 - ステップb)で前記動物細胞が、約0.25mg/mL〜約3mg/mLの範囲の濃度で、コラーゲン、好ましくは線維性コラーゲンを含む培養培地に移される、請求項2に記載の方法。
- ステップb)で前記動物細胞が、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、XI型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXVII型コラーゲンおよびそれらのいずれかの混合物を含む群から選択される線維性コラーゲンを含む培養培地移される、請求項2または3に記載の方法。
- a)まず、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器中で前記動物細胞を培養することと、
b)次に、メタクリル酸修飾ゼラチン(GelMa)を含む培養培地に前記動物細胞を移し、それによりGelMaマトリックス中に前記動物細胞を埋め込むことと、
c)前記GelMaマトリックス中に埋め込まれた動物細胞を培養し、それにより増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を得ること
を含む、請求項1に記載の方法。 - ステップb)で前記動物細胞が、約1(w/v)%〜約20(w/v)%の範囲の濃度でメタクリル酸修飾ゼラチン(GelMa)を含む培養培地に移される、請求項5に記載の方法。
- ステップa)で前記動物細胞が、約1h〜約96hの範囲の期間の間、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器中で培養される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- d)前記コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス中に埋め込まれた動物細胞の培養物にMAPK MEK1/2−ERK1/2経路の阻害剤を添加し、それにより前記動物細胞の1つ以上のさらなる増殖の波を誘導すること
をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 - e)コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物と前記コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス中に埋め込まれた増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物をインキュベートし、それにより前記コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスから増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物を単離すること
をさらに含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。 - 前記動物細胞が、初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、かつ前記増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物が、スフェロイドであり、好ましくは前記スフェロイドが、中空内腔を有する腺房様構造を有し、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス中に埋め込まれた増殖性初代肝細胞を含むスフェロイドであって、中空内腔を有する腺房様構造を有する、スフェロイド。
- 前記増殖性初代肝細胞が、増殖性初代ヒト肝細胞である、請求項11に記載のスフェロイド。
- 人工肝臓モデルまたは人工肝臓臓器を操作するための増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドの使用であって、前記スフェロイドが、中空内腔を有する腺房様構造を有する、使用。
- 薬物または化合物のin vitroでの肝毒性、特に肝臓の遺伝毒性、および/または効果を評価するための増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドの使用であって、前記スフェロイドが、中空内腔を有する腺房様構造を有する、使用。
- 薬物または化合物の毒性および/または効果を評価するin vitroでの方法であって、
a)請求項1〜10のいずれか1項の方法により、増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドを得ることと、
b)薬物または化合物と、前記増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドを接触させることと、
c)前記増殖性動物細胞を含む3D動物細胞構造物、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドに対する前記薬物または化合物の毒性、遺伝毒性、および/または効果を評価すること
を含む、方法。
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