JP6789572B2

JP6789572B2 - 多能性幹細胞を減少させる方法、多能性幹細胞を減少させた細胞集団の製造方法

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Publication number: JP6789572B2
Application number: JP2017537771A
Authority: JP
Inventors: 勝久松浦; 清水　達也; 達也清水; 博允瀬田
Original assignee: Tokyo Womens Medical University
Current assignee: Tokyo Womens Medical University
Priority date: 2015-08-31
Filing date: 2016-08-23
Publication date: 2020-11-25
Anticipated expiration: 2036-08-23
Also published as: EP3346002A1; JPWO2017038562A1; EP3346002B1; WO2017038562A1; EP3346002A4; US10711247B2; US20180245047A1

Description

本発明は、多能性幹細胞を減少させる方法に関する。また、多能性幹細胞を減少させた細胞集団の製造方法に関する。

近年、細胞を用いた治療技術の開発が活発化しており、国内外の多くの機関において臨床応用が試みられている。患者の生体から採取した細胞を生体外において培養し、再び患者本人に細胞を移植する方法、採取した細胞にある特定の遺伝子を導入して生体に戻す方法や、細胞をスキャフォールドと呼ばれる足場に播種し、三次元的に組織を構築して移植する方法など、様々な方法が開発されている。これらは再生医療分野の医療技術として用いられるものであり、従来の治療では根治が困難であった疾患に対しても治療できる可能性を秘めている。そのため、数多くの疾患に適用できる細胞を用いた根治治療技術の早期実用化が待ち望まれているところである。

再生医療では、患者本人の生体から採取した組織や血液等より単離された細胞（自家細胞）、他人の生体から採取した組織や血液等より単離された細胞（他家細胞）、株化された細胞などが治療に用いられる。疾患部位や病態に応じて細胞種は適宜選択される。細胞移植を行う場合に問題となるのが免疫による拒絶反応である。自己の細胞とは異なる細胞（他家細胞）が移植される場合、通常、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の型が一致せず、拒絶反応が起こり生着しない。一方、自家細胞を用いる場合、元々自分の細胞であるためＭＨＣの型が一致し拒絶反応は起こらない。そのため、免疫拒絶の観点から考えると自家細胞を用いた再生医療の方が好ましいが、自家細胞を用いた場合は患者ごとに細胞又は組織を採取し、オーダーメードで培養等の処理を行わなければならず、莫大なコストを要する。一方で他家細胞を用いた治療であれば、あらかじめ必要とする細胞や組織を確保することが可能であり、移植が必要となった時に、保管しておいた他家細胞を用いることが出来、コストを低減させる観点からは他家細胞を用いた方が好ましい。この場合、移植した他家細胞が非移植者の体内で免疫拒絶を受けないようにするために、免疫抑制剤を用いることで免疫拒絶を回避することができる。

再生医療に用いられる細胞種の中には、生体外の培養環境において、分裂・増殖しない、又はほとんど増殖しない細胞が存在する。心筋細胞や神経細胞などがそれにあたり、こうした細胞を再生医療に用いることは困難であった。しかし、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞が発見されたことにより、分裂・増殖しないような細胞であっても、多能性幹細胞から分化誘導し、心筋細胞や神経細胞を作ることができるようになり、こうした細胞であっても供給可能となった。

ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、生体を構成するほぼ全ての細胞へと分化できる性質を有している。また、分化前の未分化能を維持したＥＳ細胞やｉＰＳ細胞は、自己複製能を有していることから、基本的には無限に増殖させることが出来る。そのため、大量の細胞が必要とされる場合であっても、理論的には要求される細胞数まで多能性幹細胞を増殖させることができる。こうして得られた多能性幹細胞を任意の体細胞へと分化誘導させることで必要な細胞数を確保することが可能となった。

ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞は、無限に増殖させることが出来、任意の体細胞へと分化誘導することが可能である一方、未分化能を維持したままの細胞を生体内へ移植すると、その多分化能のために、腫瘍の一種である奇形種（テラトーマ）を形成してしまう恐れがある。ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から分化誘導した体細胞集団に、未分化状態のＥＳ細胞やｉＰＳ細胞が残存していなければ問題無いが、未分化性を維持したままのＥＳ細胞やｉＰＳ細胞が体細胞集団に残ったまま生体内へ移植されてしまうとテラトーマを形成してしまう危険性があり、安全性の面から課題を抱えていた（非特許文献１）。そのため、多能性幹細胞から分化誘導した細胞集団から、未分化状態の多能性幹細胞を減少させる技術が求められていた。

こうした課題を解決するために、分化誘導処理を行った細胞集団から未分化な多能性幹細胞を除去する又は減少させる方法として、セルソーターを用いた方法（非特許文献２）や、自殺遺伝子を組み込む方法（非特許文献３）、化学阻害剤（非特許文献４、非特許文献５）などが開発されている。しかし、セルソーターを用いる方法の場合、細胞表面の抗原を認識するための抗体を大量に用いなければならず、膨大なコストを要し、また、処理に時間がかかるなどの課題を抱えていた。また、自殺遺伝子を組み込む方法は、移植後においても遺伝子を組み込んだ細胞の安全性が不明であり、臨床応用については課題があった。また、化学阻害剤を用いる方法は、多能性幹細胞を除去する又は減少させる効率や安全性について課題があった。

国際公開第１３／１８７３５９号

Ｇｒｏｐｐ，Ｍ．，ｅｔａｌ．（２０１２）．ＳｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｅｒａｔｏｍａａｓｓａｙｆｏｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｏｆｈｕｍａｎＥＳｃｅｌｌｓａｎｄｂｉｏｓａｆｅｔｙｏｆｔｈｅｉｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｐｒｏｇｅｎｙ．ＰＬｏＳＯＮＥ７，ｅ４５５３２．Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄ，Ｕ．，ｅｔａｌ．（２０１３）．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｔａｒｇｅｔｉｎｇｏｆｔｈｅｔｉｇｈｔ−ｊｕｎｃｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＣｌａｕｄｉｎ−６ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．４，１９９２．Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ，Ｍ．，ｅｔａｌ．（２００３）．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｂｌａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａ‘‘ｓｕｉｃｉｄｅ’’ｇｅｎｅ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２１，２５７-２６５．Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄ，Ｕ．，ｅｔａｌ．（２０１３）．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｙａｎｏｌｅａｔｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｉｎａｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎ．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ１２，１６７-１７９．Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｍ．，ｅｔａｌ．（２０１４）．Ａｎｅｗｃｌａｓｓｏｆｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｃｙｔｏｔｏｘｉｃｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．ＰＬｏＳＯＮＥ９，ｅ８５０３９．

本発明は、上述のような多能性幹細胞集団を分化誘導した際に残存する多能性幹細胞を除去する又は減少させるための問題点を解決することを課題としてなされたものである。すなわち、本発明は、多能性幹細胞を除去する又は減少させる方法、多能性幹細胞を除去した又は減少させた細胞集団の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、驚くべきことに、多能性幹細胞は、培養温度を一定時間上昇させるという極めて簡単、かつ安価な方法によりアポトーシスが誘導され、死滅することを見いだし、一方で分化誘導されて体細胞となった多能性幹細胞は、高温に対して耐性であることを見いだした。また、高温感受性のＴＲＰチャンネルであるａｃｔｉｖａｔｅｓｔｒａｎｓｉｅｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｖａｎｉｌｌｏｉｄ１（ＴＲＰＶ−１）のアゴニストを用いたときも高温での培養と同様、多能性幹細胞にアポトーシスを誘導し、多能性幹細胞集団を分化誘導した際に残存する未分化状態の多能性幹細胞を減少させることができることを見出した。すなわち、本発明は、以下のとおりである。

[１] 多能性幹細胞と多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団を、４０．５℃以上の温度で培養し、前記細胞集団に含まれる前記多能性幹細胞を減少させる方法。
[２] 前記温度が、４１℃〜４３℃である、[１]に記載の方法。
[３] 前記温度で培養する時間が、１０時間〜７２時間の範囲である、[１]又は[２]に記載の方法。
[４] 前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞及び／又は胚性幹細胞である、[１]〜[３]のいずれか１項に記載の方法。
[５] 前記分化細胞が、心筋細胞、心筋芽細胞、線維芽細胞、壁細胞及び／又は血管内皮細胞を含む、[１]〜[４]のいずれか１項に記載の方法。

[６] [１]〜[５]のいずれか１項に記載の方法によって得られた、前記多能性幹細胞を減少させた細胞集団。

[７] 多能性幹細胞と、多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団から、多能性幹細胞を減少させる方法であって、前記細胞集団に含まれる前記多能性幹細胞に発現するＴＲＰＶ−１を活性化する工程、を含むことを特徴とする方法。
[８] 前記ＴＲＰＶ−１を活性化する工程が、４０．５℃以上の温度で培養して前記ＴＲＰＶ−１を活性化する工程である[７]に記載の方法。
[９] 前記温度が、４０．５℃〜４５℃である[８]に記載の方法。
[１０] 前記温度が、４１℃〜４３℃である[８]又は[９]に記載の方法。
[１１] 前記温度で培養して前記ＴＲＰＶ−１を活性化する工程の時間が、１０時間〜７２時間の範囲である[８]〜[１０]に記載の方法。
[１２] 前記ＴＲＰＶ−１を活性化する工程が、ＴＲＰＶ−１に対するアゴニストを添加する工程である[７]に記載の方法。
[１３] 前記アゴニストが、カプサイシン、Ｎ−ｏｌｅｏｙｌｄｏｐａｍｉｎｅ（ＯＬＤＡ）、アルバニル、オルバニル、ＡＭ４０４（アナンダミド）、２−ＡＰＢ、ＮＡＤＡ、ＰＰＡＨＶ、抗ＴＲＰＶ−１抗体からなる群から選択された１又は２以上のアゴニストである[１２]に記載の方法。
[１４] 前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞及び／又は胚性幹細胞である[７]〜[１３]に記載の方法。
[１５] 前記分化細胞が、心筋細胞、心筋芽細胞、線維芽細胞、壁細胞及び／又は血管内皮細胞を含む[７]〜[１４]に記載の方法。

[１６] [７]〜[１５]のいずれか１項に記載の方法によって得られた、前記多能性幹細胞を減少させた細胞集団。

[１７] 多能性幹細胞と多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団を、ＴＲＰＶ−１に対するアゴニストを添加した培地で培養し、前記細胞集団に含まれる前記多能性幹細胞を減少させる方法。

[１８] 前記アゴニストが、カプサイシン、Ｎ−ｏｌｅｏｙｌｄｏｐａｍｉｎｅ（ＯＬＤＡ）、アルバニル、オルバニル、ＡＭ４０４（アナンダミド）、２−ＡＰＢ、ＮＡＤＡ、ＰＰＡＨＶ、抗ＴＲＰＶ−１抗体からなる群から選択された１又は２以上のアゴニストである[１７]に記載の方法。

[１９] [１７]又は[１８]に記載の方法によって得られた、前記多能性幹細胞を減少させた細胞集団。

[２０] 多能性幹細胞と、多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む第一細胞集団から、前記多能性幹細胞を減少させた第二細胞集団を製造する方法であって、前記第一細胞集団に含まれる前記多能性幹細胞に発現するＴＲＰＶ−１を活性化する工程、を含むことを特徴とする方法。
[２１] 前記ＴＲＰＶ−１を活性化する工程が、４０．５℃以上の温度で培養してＴＲＰＶ−１を活性化する工程である[２０]に記載の方法。
[２２] 前記温度が、４１℃〜４３℃である[２０]又は[２１]に記載の方法。
[２３] 前記ＴＲＰＶ−１を活性化する工程が、ＴＲＰＶ−１に対するアゴニストを添加する工程である[２０]に記載の方法。
[２４] 前記アゴニストが、カプサイシン、Ｎ−ｏｌｅｏｙｌｄｏｐａｍｉｎｅ（ＯＬＤＡ）、アルバニル、オルバニル、ＡＭ４０４（アナンダミド）、２−ＡＰＢ、ＮＡＤＡ、ＰＰＡＨＶ、抗ＴＲＰＶ−１抗体からなる群から選択された１又は２以上のアゴニストである[２３]に記載の方法。

本発明によれば、多能性幹細胞を分化誘導して得られた分化誘導された多能性幹細胞と、分化誘導されずに残存した未分化な多能性幹細胞とを含む細胞集団から、未分化な多能性幹細胞を、簡便に除去する又は減少させることが可能となる。また、これにより得られた細胞集団は、未分化な多能性幹細胞の割合が減少しており、移植物として使用した際、腫瘍を形成する確率が低くなる。

フィーダーレスで培養したヒトｉＰＳ細胞に対する培養温度の影響を示す図である。（Ａ）ラミニンＥ８フラググメント上で培養したヒトｉＰＳ細胞を３７℃、４０℃、４１℃、４２℃にて１日間又は２日間培養した。上段列は位相差画像を示す図であり、バーは１００μｍを示す。中段列はヘキスト染色（青）を示す図であり、バーは２００μｍを示す。下段列はヘキスト染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像を示す図である。（Ｂ）それぞれの温度条件に対する細胞数の変化を示す図である（ｎ＝３）。（Ｃ）ＴＵＮＥＬ陽性細胞（緑）を示す図である。細胞核はヘキスト（青）で示す。（Ｄ）ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を示す図である（ｎ＝３）。４２℃で培養したフィーダーフリーｉＰＳ細胞の細胞数を示す図である。（Ａ）ラミニンＥ８フラグメントで培養したヒトｉＰＳ細胞を３７℃又は４２℃において、１日及び２日間培養した。上段は位相差画像を示し、バーは１００μｍを示す。中段はＯｃｔ４（緑）及びヘキスト（青）染色の画像を示し、バーは２００μｍを示す。下段はＯｃｔ４染色の３６視野（６×６）モンタージュ画像を示す。（Ｂ）３６視野（６×６）におけるＯｃｔ４陽性細胞の数を示す（ｎ＝３）。フィーダーレスで培養したヒトｉＰＳ細胞に対する培養温度の影響を示す図である。ラミニンＥ８フラグメント上で培養したｉＰＳ細胞を１時間、３時間、６時間、９時間、１２時間４２℃で培養し、続いて培養開始から２４時間まで３７℃で培養した。（Ａ）上段列は位相差画像を示す図であり、バーは１００μｍを示す。中段列はヘキスト染色（青）を示す図であり、バーは２００μｍを示す。下段列はヘキスト染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像を示す図である。（Ｂ）それぞれの温度条件に対する細胞数の変化を示す図である。３６視野の合計の細胞数を示している。ｉＰＳ細胞と他の細胞との共培養における４２℃培養の影響を示す図である。（Ａ）ＭＥＦ上で培養したヒトｉＰＳ細胞を４２℃で１日間及び２日間培養した。上段列は位相差画像を示す図であり、バーは１００μｍを示す。中段列はＯｃｔ４（緑）及びヘキスト染色（青）を示す図であり、バーは２００μｍを示す。下段列はＯｃｔ４染色画像の８１視野（９×９）モンタージュ画像を示す図である。（Ｂ）それぞれの時間における８１視野中のＯｃｔ４陽性細胞の数を示す図である（ｎ＝３）。（Ｃ）ｉＰＳ細胞とｉＰＳ細胞由来心筋細胞の共培養実験の結果を示す図である。ｉＰＳ細胞の細胞凝集塊とｉＰＳ細胞由来細胞とを共培養開始２日後、ＡＫ０３培地又は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭにて３７℃又は４２℃で培養した。最上段列は位相差画像を示す図であり、バーは１００μｍを示す。３段目列はＯｃｔ４（緑）の蛍光画像を示す図である。４段目列はｃＴｎＴ（赤）の蛍光画像を示す図である。最下段はヘキスト（青）で染色した細胞核を示す図である。バーは２００μｍを表す。２列目はＯｃｔ４蛍光画像、ｃＴｎＴ蛍光画像、ヘキスト蛍光画像のマージ画像である。（Ｄ）３６視野中のＯｃｔ４陽性細胞の数の変化を示す図である。ｉＰＳ細胞由来心筋細胞と線維芽細胞に対する温度の影響を確認した図である。（Ａ）心筋細胞を示す図である。１列目はＮｋｘ２．５（赤）、ｃＴｎＴ（緑）、ヘキスト（青）の蛍光画像のマージ画像である。２列目はｃＴｎＴ染色画像の３６視野（６×６）のモンタージュ画像である。３列目はＮｋｘ２．５染色像である。４列名はＮｋｘ２．５染色像の３６視野（６×６）モンタージュ画像である。バーは２００μｍを示す。（Ｂ）ｃＴｎＴ陽性細胞、及びＮｋｘ２．５陽性細胞の数を示す図である（ｎ＝２）。（Ｃ）線維芽細胞を示す図である。１列目は位相差画像を示す図であり、バーは１００μｍを示す。２列目はビメンチン（緑）及びヘキスト染色（青）を示す図である。３列名はビメンチン染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像である。４列名はＳＭ２２（赤）及びヘキスト染色（青）を示す図である。５列目はＳＭ２２染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像である。（Ｄ）ビメンチン陽性細胞及びＳＭ２２陽性細胞の数の変化を示す図である（ｎ＝４）。＊ｐ＜０．０５ｖｓ．Ｄａｙ０．＊＊ｐ＜０．０１ｖｓ．Ｄａｙ０．心筋細胞シート作製におけるｉＰＳ細胞の除去効果を示す図である。（Ａ）４２℃培養の各時間における心筋分化誘導後のヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞ｍＲＮＡの発現量を示す図である（ｎ＝３）。Ｙ軸はＧＡＰＤＨｍＲＮＡの発現量で比較している。＊ｐ＜０．０５ｖｓ．ｐｒｅ．（Ｂ）４２℃培養の各時間における心筋分化誘導後のヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞のＬｉｎ２８及びＯｃｔ４ｍＲＮＡの発現量を示す図である（ｎ＝３）。Ｙ軸はＧＡＰＤＨｍＲＮＡの発現量で比較している。＊ｐ＜０．０５ｖｓ．ｐｒｅ．（Ｃ）ｉＰＳ細胞由来心筋細胞のＬｉｎ２８及びＯｃｔ４ｍＲＮＡの相対的発現量を示す図である（ｎ＝３）。ｉＰＳ細胞の発現量を１００％としたときの相対値である。（Ｄ）４２℃培養が細胞シート作製に与える効果を示す図である。左図は培養スケジュールを示す。右図は、細胞シートの状態を示す図である。４２℃培養がＴＲＰＶ−１を介してｉＰＳ細胞を減少させることを示す図である。（Ａ）フィーダーレスｉＰＳ細胞（左、ｎ＝３）及びｉＰＳ細胞由来心筋細胞（右、ｎ＝３）のＴＲＰＶ−１ｍＲＮＡの発現量を示す。Ｙ軸はβーアクチンで補正した相対的なＴＲＰＶ−１遺伝子発現量を示す。＊ｐ＜０．０５ｖｓ．ｐｒｅ．＊＊ｐ＜０．０１ｖｓ．ｐｒｅ．（Ｂ）培養開始前及び４２℃培養２４時間後におけるフィーダーレスｉＰＳ細胞及びｉＰＳ細胞由来心筋細胞のＴＲＰＶ−１ｍＲＮＡ発現量の比較を示す図である（ｎ＝３）。（Ｃ）ＴＲＰＶ−１ｓｉＲＮＡ又はコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｉＰＳ細胞のＴＲＰＶ−１ｍＲＮＡ発現量を示す図である（ｎ＝４）。（Ｄ）ＴＲＰＶ−１ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｉＰＳ細胞を３７℃又は４２℃で１日間培養した結果を示す図である。上段は位相差画像を示し、バーは１００μｍを示す。中段はヘキスト染色の画像を示し、バーは２００μｍを示す。下段はヘキスト染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像である。（Ｅ）それぞれの培養条件における細胞数を示した図である（ｎ＝３）。ＴＲＰＶ−１アゴニストを使用したｉＰＳ細胞の除去効果について示す図である。（Ａ、Ｂ）ラミニンＥ８フラグメント上で培養したｉＰＳ細胞をカプサイシンを添加して培養した結果を示す。Ｖｅｈｉｃｌｅ−１は２×１０^-4Ｍカプサイシンを添加した実験におけるコントロール、Ｖｅｈｉｃｌｅ−２は１×１０^-4Ｍカプサイシンを添加した実験におけるコントロール、Ｖｅｈｉｃｌｅ−３は１×１０^-5Ｍカプサイシンを添加した実験におけるコントロールを表す。（Ａ）上段は位相差画像を示し、バーは１００μｍを示す図である。中段はヘキスト染色画像を示し、バーは２００μｍを示す。下段はヘキスト染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像を示す。（Ｂ）それぞれの条件における３６視野分の細胞数を示した図である。（Ｃ、Ｄ）ラミニンＥ８フラグメント上で培養したｉＰＳ細胞にカプサイシンを添加して培養したＮｋｘ２．５陽性細胞を示す。Ｖｅｈｉｃｌｅ−１は２×１０^-4Ｍカプサイシンを添加した実験におけるコントロール、Ｖｅｈｉｃｌｅ−２は１×１０^-4Ｍカプサイシンを添加した実験におけるコントロールを表す。（Ｃ）上段は位相差画像を示し、バーは１００μｍを示す図である。下段はヘキスト染色（青）及びＨｋｘ２．５染色（緑）のマージ画像を示し、バーは２００μｍを示す。（Ｄ）それぞれの条件における３６視野分の細胞数を示した図である。ＴＲＰＶ−１アゴニストを使用したｉＰＳ細胞の除去効果について示す図である。（Ａ、Ｂ）ラミニンＥ８フラグメント上で培養したｉＰＳ細胞をＯＬＤＡを添加して培養した結果を示す。（Ａ）上段は位相差画像を示し、バーは１００μｍを示す。中段はヘキスト染色（青）画像を示し、バーは２００μｍを示す。下段はヘキスト染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像を示す。（Ｂ）ＯＬＤＡを添加して培養した条件における３６視野分の細胞数を示した図である（ｎ＝３)。（Ｃ、Ｄ）ｉＰＳ細胞由来心筋細胞をＯＬＤＡを添加して培養した結果を示す。（Ｃ）上段はｃＴｎＴ染色（緑）、Ｎｋｘ２．５染色（赤）、ヘキスト染色（青）のマージ画像を示し、バーは２００μｍを示す図である。中段はｃＴｎＴ染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像を示す。下段はＨｋｘ２．５染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像を示す。（Ｄ）ｉＰＳ細胞由来心筋細胞にＯＬＤＡを添加して培養した後のｃＴｎＴ陽性及びＮｋｘ２．５陽性細胞の細胞数（３６視野分）を示す図である。（Ｅ）ｉＰＳ細胞由来心筋細胞を４２℃、又はＯＬＤＡ（５μＭ）３７℃で２日間培養した後のＬｉｎ２８ｍＲＮＡの発現量を示す図である（ｎ＝３）。Ｙ軸は、ＭＥＦ上で培養した未分化ｉＰＳ細胞に対するｉＰＳ細胞由来心筋細胞の相対的なＬｉｎ２８の遺伝子発現量を示す。ＴＲＰＶ−１アゴニストを使用したｉＰＳ細胞の除去効果について示す図である。（Ａ、Ｂ）ラミニンＥ８フラグメント上で培養したｉＰＳ細胞にアルバニルを添加して１日間培養した結果を示す。（Ａ）上段は位相差画像を示し、バーは１００μｍを示す。中段はヘキスト染色（青）画像を示し、バーは２００μｍを示す。下段はヘキスト染色画像の３６視野（６×６）モンタージュ画像を示す。（Ｂ）アルバニルを添加して培養した条件における３６視野分の細胞数を示した図である（ｎ＝３）。

本発明は、多能性幹細胞を除去する又は減少させる方法、多能性幹細胞を除去した又は減少させた細胞集団の製造方法に関するものである。本発明において、多能性幹細胞とは、自己複製能と多分化能を有する細胞であり、体を構成するあらゆる細胞を形成する能力（ｐｌｕｒｉｏｐｏｔｅｎｔ）を備える細胞をいう。自己複製能とは、１つの細胞から自分と同じ未分化な細胞を２つ作る能力のことをいう。本発明で用いられる多能性幹細胞には、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｉｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、胚性癌腫細胞（ｅｍｂｒｉｏｎｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌ：ＥＣ細胞）、栄養芽幹細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｓｔｅｍｃｅｌｌ：ＴＳ細胞）、エビブラスト幹細胞（ｅｐｉｂｌａｓｔｓｔｅｍｃｅｌｌ：ＥｐｉＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｉｏｎｉｃｇｅｒｍｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｇｅｒｍｌｉｎｅｓｔｅｍｃｅｌｌ：ｍＧＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）などが含まれる。

本発明に用いられる多能性幹細胞とは、（１）未分化状態でアルカリフォスファターゼ活性を有し、及び／又は（２）転写因子であるＯｃｔ３／４（Ｏｃｔ３、Ｏｃｔ４ともいう）、Ｎａｎｏｇ若しくはＳｏｘ２を発現し、及び／又は（３）ＳｔａｇｅＳｐｅｃｉｆｉｃＥｍｂｒｉｏｎｉｃＡｎｔｉｇｅｎ（ＳＳＥＡ）−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１６０、Ｔｒａ−１８１若しくはＬｉｎ２８のタンパク質を発現し（これらの抗原は、多能性幹細胞のステージによって発現量に若干の違いがある）、並びに（４）内胚葉、中胚葉、外胚葉の三胚葉由来の組織へと分化する能力を有する細胞と定義することができる。三胚葉由来の組織へと分化する能力があるかどうかは、対象となる細胞をマウスなどの皮下に移植し、テラトーマ（奇形種）を形成する能力を有するかどうかで評価できる。

本発明に用いられる多能性幹細胞は、上記の定義を満たす細胞（細胞集団）として予め確認されてストックされている細胞、例えば公的機関（例えば、京都大学ｉＰＳ細胞研究所、理化学研究所等）又は民間機関（ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社等）が有する細胞バンク等から配布される細胞（細胞集団）であることが好ましく、この場合、アルカリフォスファターゼ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＴＲＡ−１６０、ＴＲＡ−１８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｌｉｎ２８などの多能性マーカーのうち、少なくとも１つ以上の多能性マーカーの遺伝子発現量及び／又はタンパク質の発現量が、非多能性幹細胞と比較して高いかどうかを確認するだけで、細胞集団における多能性幹細胞が含まれる割合を簡便に確認することができる。本発明において、多能性幹細胞の多能性マーカーを測定する方法は定法に従えばよく、例えばＲＴ−ＰＣＲ法、フローサイトメーターによる測定法、ウエスタンブロットによる測定法、免疫組織化学染色による測定法、マイクロアレイ法などの手法を用いることができる。

本発明で用いられる多能性幹細胞は、分化した非多能性幹細胞、例えば、体細胞を初期化（リプログラミング）することにより得られる多能性幹細胞であってもよい。例えば、未受精卵の核を除去して体細胞の核を移植する方法、体細胞とＥＳ細胞との細胞融合を行う方法、体細胞へ特定のリプログラム（初期化）因子（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４など）を導入して初期化する方法などが挙げられるが限定されない。リプログラム因子を細胞へ導入する方法も特に限定されず、ウイルスベクターを用いた方法、プラスミドベクターを用いた方法、ｍＲＮＡとして導入する方法、リプログラム因子をタンパク質として導入する方法などを用いてもよい。

本発明の実施形態において、非多能性幹細胞とは、上記の多能性幹細胞の定義を満たさない細胞をいうが、具体的には、生体組織を構成する体細胞であって、内胚葉、中胚葉、外胚葉のいずれかの胚葉へと分化する能力を失った分化細胞をいう。例えば、心筋細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、肝実質細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、星細胞、ピット細胞、胆管上皮細胞、腎細胞、顆粒細胞、集合管上皮細胞、壁側上皮細胞、足細胞、メサンギウム細胞、平滑筋細胞、尿細管細胞、間在細胞、糸球体細胞、副腎髄質細胞、副腎皮質細胞、球状層細胞、束状層細胞、網上層細胞、表皮角化細胞、メラノサイト、立毛筋細胞、毛包細胞、頬側粘膜細胞、胃粘膜細胞、腸管粘膜細胞、嗅上皮細胞、口腔粘膜細胞、子宮粘膜細胞、中脳ドーパミン神経細胞、大脳神経細胞、網膜細胞、小脳細胞、視床下部内分泌細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、単球等の生体を構成する細胞、又は、一系統の細胞型を形成し得る能力（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）を有する体性幹細胞が含まれる。体細胞には、生殖細胞は含まれない。

本発明に用いられる細胞の動物種の由来は、特に制約されるものではないが、例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物などの哺乳類動物、鳥類、爬虫類、両生類、両生類、魚類、昆虫等が挙げられる。本発明により得られる細胞集団をヒトの治療に用いる場合はヒト、ブタの治療に用いる場合はブタ、サルの治療に用いる場合はサル、チンパンジーの治療に用いる場合はチンパンジー由来の細胞を用いる方が望ましい。また、治療を行うのがヒトである場合、患者本人から採取した細胞であってもよく（自家細胞）、他人の細胞から採取した細胞を用いてもよく（他家細胞）、市販の細胞株であってもよい。

本発明において、多能性幹細胞から分化誘導して得られる非多能性幹細胞は特に限定されるものではない。例えば、心筋組織の再生、或いは心筋機能を評価する方法を目的とした場合、多能性幹細胞から分化誘導して得られる細胞としては心筋細胞、心筋芽細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられる。肝組織の再生、肝組織を模擬した人工肝臓の作製、或いは肝組織の機能を評価する方法等を目的とした場合、例えば、多能性幹細胞から分化誘導して得られる細胞としては、肝実質細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、星細胞、ピット細胞、胆管上皮細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられる。腎組織の再生、腎組織を模擬した人工腎臓の作製、或いは腎機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、多能性幹細胞から分化誘導して得られる細胞としては、腎細胞、顆粒細胞、集合管上皮細胞、壁側上皮細胞、足細胞、メサンギウム細胞、平滑筋細胞、尿細管細胞、間在細胞、糸球体細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられる。副腎組織の再生、副腎を模擬した人工副腎の作製、或いは副腎機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、副腎髄質細胞、副腎皮質細胞、球状層細胞、束状層細胞、網上層細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられる。皮膚の再生、或いは皮膚機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、多能性幹細胞から分化誘導して得られる細胞としては、表皮角化細胞、メラノサイト、立毛筋細胞、毛包細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられる。粘膜組織の再生、或いは粘膜組織の機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、多能性幹細胞から分化誘導して得られる細胞としては、頬側粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宮粘膜の細胞のうち、いずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられる。神経系の再生、あるいは神経の機能を評価する細胞を得る目的として場合、例えば、多能性幹細胞から分化誘導して得られる細胞としては、中脳ドーパミン神経細胞、大脳神経細胞、網膜細胞、小脳細胞、視床下部内分泌細胞のうち、いずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられるが特に限定されない。血液を構成する細胞を得る目的とした場合、例えば、多能性幹細胞から分化誘導して得られる細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、単球、血小板、赤血球、のうち、いずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられるが特に限定されない。

本明細書において、「培地」とは、細胞、特に動物細胞を培養するための細胞培養培地のことを指す。培地は、細胞培養液と同義の意味として用いられる。そのため、本発明において用いられる培地とは、液体培地のことを指す。培地の種類は、通常使用される培地を使用することが可能であり、培養する細胞の種類によって適宜決定される。

本発明において、分化誘導前の多能性幹細胞の未分化性を維持する培養方法については定法に従えばよく、特に限定されない。また、多能性幹細胞を分化誘導する方法としては目的とする細胞を得るために最適化された分化誘導法を用いればよく、特に限定されない。多能性幹細胞の未分化性を維持するための培養方法や、分化誘導を行うための培養は、平面の細胞培養皿で行ってもよく、浮遊撹拌三次元培養で行ってもよく特に限定されない。

本発明において、多能性幹細胞を「減少させる」とは、多能性幹細胞と多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団（本明細書において、「第一細胞集団」ともいう。）から目的とする多能性幹細胞の全て若しくは一部を除去、又は、全滅若しくは一部を死滅、又は、目的とする多能性幹細胞の細胞増殖を停止若しくは遅延させることにより、細胞集団における多能性幹細胞の相対的な数を減少させることをいう。本発明における多能性幹細胞の減少は、アポトーシス又はネクローシスの誘導、又は、多能性幹細胞の細胞周期のみ停止若しくは遅延により、細胞集団における多能性幹細胞の相対的な数が減少することで引き起こされる。本発明において、多能性幹細胞を「減少させる」とは、本発明の方法を用いない従来の培養方法により、多能性幹細胞を含む細胞集団を培養した場合と比較して、例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％の多能性幹細胞が減少することを意味する。本明細書において、本発明の方法によって、多能性幹細胞と多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団（第一細胞集団）から、多能性幹細胞を減少させて得られる細胞集団を「第二細胞集団」ともいう。

従来、多能性幹細胞や、多能性幹細胞から分化誘導された分化細胞は、恒温動物の体温である３７℃前後の温度にて培養される。本発明では、体温よりも高温で培養することで多能性幹細胞を除去する又は減少させることが可能である。本発明において、多能性幹細胞を除去する又は減少させるための培養温度としては、４０．５℃以上であればよく、例えば、４０．５℃、４０．６℃、４０．７℃、４０．８℃、４０．９℃、４１．０℃、４１．１℃、４１．２℃、４１．３℃、４１．４℃、４１．５℃、４１．６℃、４１．７℃、４１．８℃、４１．９℃、４２．０℃、４２．１℃、４２．２℃、４２．３℃、４２．４℃、４２．５℃、４２．６℃、４２．７℃、４２．８℃、４２．９℃、４３．０℃、４３．１℃、４３．２℃、４３．３℃、４３．４℃、４３．５℃、４３．６℃、４３．７℃、４３．８℃、４３．９℃、４４．０℃、４４．１℃、４４．２℃、４４．３℃、４４．４℃、４４．５℃、４４．６℃、４４．７℃、４４．８℃、４４．９℃、４５．０℃であってもよい。また、多能性幹細胞を除去する又は減少させるための培養温度としては４０．５℃〜４５．０℃であってもよく、４０．７℃〜４３．７℃でもよく、４０．８℃〜４３．５℃でもよく、４０．９℃〜４３．３℃でもよく、４１．０℃〜４３．０℃でもよい。特に、４１．０℃〜４３．０℃の範囲での培養は、多能性幹細胞の細胞増殖が停止し、また、多能性幹細胞が分化誘導された後の分化細胞は傷害をほとんど受けないため、好ましい。本発明において、多能性幹細胞と多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団を、４０．５℃以上の温度で培養する工程は、後述のＴＲＰＶ−１を活性化して多能性幹細胞を減少させるものであってもよく、また、ＴＲＰＶ−１を活性化する以外の作用によって多能性幹細胞を減少させるものであってもよい。

本発明において、多能性幹細胞を除去する又は減少させるために、体温より高温の条件にて培養する時間としては、培養温度に応じて適宜選択すればよいが、例えば、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、３７時間、３８時間、３９時間、４０時間、４１時間、４２時間、４３時間、４４時間、４５時間、４６時間、４７時間、４８時間、４９時間、５０時間、５１時間、５２時間、５３時間、５４時間、５５時間、５６時間、５７時間、５８時間、５９時間、６０時間、６１時間、６２時間、６３時間、６４時間、６５時間、６６時間、６７時間、６８時間、６９時間、７０時間、７１時間、７２時間、７３時間、７４時間、７５時間、７６時間、７７時間、７８時間、７９時間、８０時間であってもよい。また、６時間〜８０時間であってもよく、９時間〜７５時間であってもよく、１０時間〜７２時間であってもよく、１１時間〜７０時間であってもよく、１２時間〜６８時間であってもよい。例えば、４１．０℃〜４３．０℃で培養した場合は、１０時間〜７２時間の範囲で培養すれば、多能性幹細胞の細胞増殖が減少し、また、多能性幹細胞が分化誘導された後の分化細胞の傷害活性が抑えられ、好ましい。

本発明おいて、分化誘導後の残存した多能性幹細胞を評価する方法としては定法に従えばよいが、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３又はＯｃｔ３／４ともいう）、Ｌｉｎ２８、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１６０、Ｔｒａ−１８１などの発現を指標として評価すれば良く、特に限定されない。評価する方法としては、フローサイトメーターによる確認、ウエスタンブロット法によるタンパク発現の確認、リアルタイムＰＣＲ法をもちいたｍＲＮＡの発現量を確認する方法などが挙げられるが特に限定されない。また、分化誘導した後の体細胞が含まれる割合を評価する方法としても定法に従えばよい。例えば心筋細胞の割合を評価する場合は、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）やＮｋｘ２．５など心臓を構成する細胞に発現しているタンパク質や遺伝子を発現する細胞の割合を評価すればよい。例えば、線維芽細胞の割合を評価する場合は、ビメンチンやＳＭ２２など、繊維芽細胞に発現しているタンパク質や遺伝子を発現する細胞の割合を評価すれば良い。その他の体細胞が含まれる割合を評価する場合は、目的とする細胞が特異的に発現するタンパク質や遺伝子を発現する細胞の割合を評価すればよく、特に限定されない。

本発明において、ＴＲＰＶ−１（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｃａｔｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｓｕｂｆａｍｉｌｙＶｍｅｍｂｅｒ１）とは、カプサイシン受容体としてクローニングされた膜タンパク質のことをいう。内因性及び外因性の物理的及び化学的刺激の幅広い刺激に対して活性化される非選択性陽イオンチャネルとして知られている。４３℃より高い温度で活性化したり、カプサイシンやアリルイソチアネートなどに対しても活性化する。ＴＲＰＶ−１が活性化すると、陽イオンが細胞内に流入し、神経細胞を脱分極させて電位作動性Ｎａ⁺チャネルの活性化から活動電位の発生をもたらし、痛みが引き起こされる。また、低ｐＨによっても活性化される。ＴＲＰＶ−１は主に感覚神経系に発現しているが、中枢神経系や他の組織においても発現しており、主に痛み刺激の調節や伝達に関与する分子であると考えられている分子である。

本発明は、多能性幹細胞と、分化誘導後の多能性幹細胞由来分化細胞のＴＲＰＶ−１は、温度及び化学物質に感受性の違いがあることを見出し、ＴＲＰＶ−１を活性化することにより、多能性幹細胞と多能性幹細胞由来分化細胞を含む細胞集団から多能性幹細胞を除去する又は減少させる方法に関する。ＴＲＰＶ−１のアゴニスト（作動薬）としては、カプサイシンの他、Ｎ−ｏｌｅｏｙｌｄｏｐａｍｉｎｅ（ＯＬＤＡ）、アルバニル、オルバニル、ＡＭ４０４（アナンダミド）、２−ＡＰＢ、ＮＡＤＡ、ＰＰＡＨＶ、抗ＴＲＰＶ−１抗体などが挙げられるが、本発明ではＴＲＰＶ−１に結合し、アゴニスト活性を示すものであればよく、限定されない。本発明において、カプサイシンの濃度は２０μＭ〜１００ｍＭであってもよく、３０μＭ〜５０ｍＭであってもよく、４０μＭ〜２０ｍＭであってもよく、５０μＭ〜１０ｍＭであってもよい。本発明において、ＯＬＤＡの濃度は６００ｎＭ〜１００ｍＭであってもよく、７５０ｎＭ〜１０ｍＭであってもよく、１μＭ〜１ｍＭであってもよく、２μＭ〜７５０μＭであってもよい。本発明において、アルバニルの濃度は７μｇ／ｍＬ（０．０１６ｍＭ）〜１０ｍｇ／ｍＬ（２２．７４６ｍＭ）であってもよく、１０μｇ／ｍＬ（０．０２３ｍＭ）〜５ｍｇ／ｍＬ（１１．３７３ｍＭ）であってもよく、１５μｇ／ｍＬ（０．０３４ｍＭ）〜３ｍｇ／ｍＬ（６．８２４ｍＭ）であってもよい。

本発明において、多能性幹細胞と分化誘導後の多能性幹細胞由来の分化細胞を含む細胞集団から、多能性幹細胞を除去する又は減少させる方法は、分化誘導処理後に得られた細胞集団に上記処理を行ってもよく、細胞シートなどのティッシュエンジニアリングによる加工を行った後の細胞組織に対して行ってもよく、適宜目的に応じて選択すればよい。また、従来の多能性幹細胞を除去する又は減少させる方法と組み合わせて利用してもよく限定されない。また、多能性幹細胞が死滅する温度であり、多能性幹細胞由来の分化細胞が死滅しない温度で処理しつつ、上記ＴＲＰＶ−１のアゴニストを作用させる方法を用いる方法であってもよい。

本発明において、細胞集団とは、細胞以外のものも含み、特に限定されない。例えば、細胞と細胞外マトリックスを構成するコラーゲン、プロテオグリカン、ラミニン、ラミニン５、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、エンタクチン、テネイシン、エラスチン等が混合された細胞集団であってもよく、細胞とその細胞が産生する細胞外マトリックスを含む組成物であってもよい。また、細胞外マトリックスを構成するタンパク質は、遺伝子組み換えタンパク質であってもよく、それをコードする遺伝子が組み込まれた、又はベクター等により遺伝子導入された細胞から産生されるタンパク質であってもよい。また、細胞集団の形態は、層状の細胞（例えば、細胞シート）が複数積層された形態であってもよく、細胞を細胞外マトリックスを含むゲルに懸濁して、型（モールド）に流し込んで得られた物であってもよい。

本発明における細胞シートは、細胞培養器材上で培養し、細胞器材上から剥離させて得られる１層、または複数層のシート状の細胞層からなる細胞群をいう。細胞シートを得る方法としては特に限定されるものではないが、例えば、温度、ｐＨ、光等の刺激によって分子構造が変化する高分子を被覆した細胞培養器材上で細胞を培養し、温度、ｐＨ、光等の条件を変えて、細胞培養器材表面を変化させることで、細胞間の接着状態は維持しつつ、細胞培養器材表面から細胞をシート状に剥離する方法、任意の細胞培養器材にて細胞を培養し、細胞培養器材の端部から、物理的にピンセット等により剥離する方法等が挙げられる。特に好ましいのが、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、その後、培地をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで培養し、細胞をシート状に剥離させる方法である。その際、細胞は０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力の弱い温度域で培養される。その温度とは通常、細胞を培養する温度である３７℃が好ましい。本発明に用いる温度応答性高分子はホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。

細胞種によっては、細胞培養器材上に接着しにくいものがあり、そのような場合は、例えば、コラーゲン、ラミニン、ラミニン５、フィブロネクチン、マトリゲル等の単独、もしくは２種以上の混合物を細胞培養器材上に被覆して培養してもよい。これらの細胞接着性タンパク質の被覆方法は常法に従えば良く、通常、細胞接着性タンパク質の水溶液を器材表面に塗布し、その後その水溶液を除去しリンスする方法が挙げられる。

本発明の方法において、細胞シートを作製するために播種する細胞数は使用細胞の動物種や細胞種によって異なるが、一般的に０．３×１０⁴〜１０×１０⁶個／ｃｍ²が良く、好ましくは０．５×１０⁴〜８×１０⁶個／ｃｍ²が良く、さらに好ましくは０．７×１０⁴〜５×１０⁶個／ｃｍ²が良い。本発明においては、培養した細胞シートを温度応答性培養器材から剥離回収するには、培養された細胞の付着した培養器材の温度を被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって剥離させることができる。その際、培地中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。細胞をより早く、より高効率に剥離、回収する目的で、培養器材を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、更にはピペットを用いて培地を撹拌する方法、ピンセットを用いる方法等を単独で、あるいは併用して用いてもよい。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。

本発明において用いられる多能性幹細胞由来の心筋細胞を用いた心筋細胞シートは、心筋細胞以外にも多能性幹細胞から分化誘導される線維芽細胞、壁細胞、血管内皮細胞などの非心筋細胞が含まれてもよい。目的に応じて細胞をセルソーターや抗体を用いて不要な細胞を除いたり、逆に必要な細胞を加えることができる。本明細書における実施例中の「心筋細胞シート」は、心筋細胞以外に、線維芽細胞、壁細胞、血管内皮細胞、非心筋細胞などの多能性幹細胞から分化誘導された細胞が含まれる。

以上のことを、温度応答性ポリマーとしてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を例にとり説明する。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集し、白濁する。逆に３１℃以下の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明では、このポリマーがシャーレなどの器材表面に被覆、固定されたものである。したがって、３１℃以上の温度であれば、培養器材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が培養器材表面に被覆、固定されているため、培養器材表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃以下の温度では、培養器材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が培養器材表面に被覆、固定されているため、培養器材表面が親水性を示すようになる。このときの疎水的な表面は細胞が付着、増殖できる適度な表面であり、また、親水的な表面は細胞が付着できないほどの表面となり、培養中の細胞、もしくは細胞シートも冷却するだけで剥離させられることになる。

本発明に用いられる細胞シート作製用の細胞培養器材の形状は特に制約されるものではないが、例えばディッシュ、マルチプレート、フラスコ、多孔膜上で培養するセルインサートのような形態のもの、或いは平膜状のものなどが挙げられる。培養する細胞が上皮系の細胞である場合、セルインサートを用いると、細胞の上下に培地が触れさせることができ、細胞が重層化し、好ましい。被覆を施される細胞培養器材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス類などが挙げられる。

本発明における細胞シートは、培養時にディスパーゼ、トリプシン等で代表される蛋白質分解酵素による損傷を受けていないものである。そのため、細胞培養器材から剥離された細胞シートは接着性蛋白質を有し、細胞をシート状に剥離させた際には細胞−細胞間のデスモソーム構造が保持されている。このことにより、細胞シートを生体患部に貼付したり、細胞シートを積層する場合、接着することができ、効率良く生着できるようになる。一般に蛋白質分解酵素であるディスパーゼに関しては、細胞−細胞間のデスモソーム構造については１０〜４０％保持した状態で剥離させることができることで知られているが、細胞−器材間の基底膜様蛋白質等を殆ど破壊してしまうため、得られる細胞シートは強度の弱いものとなる。これに対して、本発明の細胞シートは、デスモソーム構造、基底膜様蛋白質共に６０％以上残存された状態のものであり、上述したような種々の効果を得ることができるものである。

本発明における複数の細胞層を有する細胞組成物を作製する方法については、特に限定されるものではないが、例えば、細胞を細胞培養器材に播種し、その上に細胞外マトリックスタンパクを構成するタンパク（ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、カドヘリン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、フィブリン、エラスチン、キチン、キトサン、ビトロネクチン等）を含むゲルを塗布後、さらに細胞を播種して積層し、細胞層を有する細胞組成物を得る方法や、培養細胞をシート状で剥離させ、必要に応じ培養細胞移動治具を用いて培養細胞シート同士を積層化させる方法などにより得られる。その際、培地の温度は、培養器材表面に被覆された前記ポリマーが上限臨界溶解温度を有する場合はその温度以下、また前記ポリマーが下限臨界溶解温度を有する場合はその温度以上であれば特に制限されない。しかし、培養細胞が増殖しないような低温域（例えば、１０℃以下）、あるいは培養細胞が死滅するような高温域（例えば５０℃以上）における培養が不適切であることは言うまでもない。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。また、必要に応じ、細胞シートを移動させるための治具を利用しても良い。そのような治具としては、剥離した細胞シートを捕捉できるものであれば材質、形状は何ら限定されるものではないが、それらの材質としては、通常、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコン、ポリビニルアルコール、ウレタン、セルロース及びその誘導体、キチン、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、フィブリングルー等の材料を膜状、多孔膜状、不織布状、織布状として細胞シートに接触させて使用される。

以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。

（抗体）
本実施例中の免疫細胞化学、フローサイトメトリーに用いた抗体は以下の通りである。
・抗心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ、サーモサイエンティフィック社、ロックフォード、イリノイ州、米国）
・抗Ｔｒａ−１６０マウス単クローン抗体（ミリポア社、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）
・抗ＳＭ２２ウサギポリクローナル抗体（アバカム社、ケンブリッジ、英国）
・抗心筋トロポニンＴウサギポリクローナル抗体（アバカム社、ケンブリッジ、英国）
・抗Ｎｋｘ２．５ヤギポリクローナル抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社、サンタクルズ、カリフォルニア州、米国）
・抗Ｏｃｔ４ヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステム社）
２次抗体はジャクソンイムノリサーチラボラトリー社（ウエストグローブ社、ペンシルベニア州、米国）から購入した。特に明記しない限り、試薬はライフテクノロジーズ社（カリフォルニア州、米国）より購入したものを使用した。

（ヒトｉＰＳ細胞の培養）
ヒトｉＰＳ細胞２５３Ｇ１株及び２０１７株は、国立研究開発法人理化学研究所（筑波、日本）より購入した。ヒトｉＰＳ細胞１２３１Ａ３株は京都大学より譲渡を受けた。フィーダー細胞を用いた実験は、マイトマイシンＣで処理したマウス線維芽細胞（ＭＥＦ）（リプロセル社、東京）上にｉＰＳ細胞を載せ、５ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、リプロセル社、日本）を含有した霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（リプロセル社、日本）を用いて５％ＣＯ_２、３７℃の加湿雰囲気条件にて維持培養を行った。ｉＰＳ細胞は３〜４日毎にＥＳ／ｉＰＳ細胞剥離液（ＣＴＫ溶液）（リプロセル社、日本）を用い、小さな細胞塊として継代を行った。フィーダー細胞を用いない実験では、ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０３（味の素社、東京、日本）を培地として用い、ｉＭａｔｒｉｘ５１１（ニッピ社、東京、日本）上でｉＰＳ細胞を培養して適応させ、維持培養を行った。ｉＰＳ細胞は７〜８日毎に、ＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔ（ライフテクノロジー社、カリフォルニア州、米国）を使用してシングルセルとして継代を行った（参考：ＮａｋａｇａｗａＭ．，ｅｔａｌ．Ａｎｏｖｅｌｅｆｆｉｃｉｅｎｔｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍｆｏｒｔｈｅｄｅｒｉｖａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＳｃｉＲｅｐ．２０１４；４：３５９４．）。実験に応じて、ｉＰＳ細胞は、４０℃、４１℃、４２℃の加湿、５％ＣＯ₂濃度の雰囲気にて培養を行った。試料の写真は倒立顕微鏡（ニコン社、東京、日本）及びＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウエア（ニコン社、東京、日本）にて撮影して解析した。

（α−ＭＨＣプロモーター及びｒｅｘ−１プロモーター誘導薬剤耐性遺伝子発現ヒトｉＰＳ細胞の準備）
マウスα−ミオシン重鎖（α−ＭＨＣ）プロモーター制御ピューロマイシン耐性遺伝子及びｒｅｘ−１プロモーター制御ネオマイシン耐性遺伝子の両方を含むレンチウイルスベクター（α−ＭＨＣ−ｐｕｒｏｒｅｘ−１−ｎｅｏ）はアドジーン社（ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）より購入した。当該レンチウイルスベクターを用いることで、ヒトｉＰＳ細胞を増殖させるときにＧ４１８によって未分化状態のｉＰＳ細胞だけを選別することができ、また、心筋へと分化誘導された後は、ピューロマイシンによって分化誘導した心筋細胞を選別することができる。遺伝子組み換えｉＰＳ細胞は以下の手順により得た。

（ｉ）組み換えレンチウイルスベクターの調整
ベクターの遺伝子導入は、商業的販売されている遺伝子導入キットのリポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）にて行い、組み換えレンチウイルスベクターの調整はＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）レンチウイルスパッケージングミックス（インビトロジェン社）を用いて行った。
１００ｍｍポリスチレン培養皿（ベクトンディッキンソンアンドカンパニー社、フランクリンレイク、ニュージャージー州、米国）上に５×１０⁴細胞／ｃｍ²のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を播種した。２４時間培養後、リポフェクタミン２０００キット及びＯＰＴＩ−ＭＥＭ（インビトロジェン社）を用い、ベクター（３μｇ／培養皿）を遺伝子導入して８時間３７℃にて培養した。その後、ベクターを含む培地を除去し、新鮮な培地を加えてさらに培養した。遺伝子導入してから７２時間後、遺伝子組み換えレンチウイルスを含む培養上清を回収した。大きな細胞の破片を取り除くために１７００×ｇ、５分間、培養上清を遠心分離し、細かい破片を取り除くために上清を０．４５μｍのフィルター（メルクミリポア社、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）に通した。その後、上清を８７，０００×ｇ、４℃の条件にて１．５時間、超遠心機（ＣＰ８０β、日立工機社、東京、日本）にて超遠心処理を行って１００倍濃縮を行い、ヒトｉＰＳ細胞に感染させるために用いる濃縮ウイルスを得た。

（ｉｉ）レンチウイルス感染手順
レンチウイルスを感染させる方法についてはＮａｋａｇａｗａらの方法（ＮａｋａｇａｗａＭ．，ｅｔａｌ．Ａｎｏｖｅｌｅｆｆｉｃｉｅｎｔｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍｆｏｒｔｈｅｄｅｒｉｖａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＳｃｉＲｅｐ．２０１４；４：３５９４．）に改変を加えた手順で行った。以下にその手順を説明する。
ヒトｉＰＳ細胞を６ウェル培養皿（ベクトンディッキンソンアンドカンパニー社）の１つのウェルにてコンフルエントになるまで培養し、ＣＴＫ溶液を用いて剥離した。小さな細胞凝集塊を１ｍＬの培地（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地）にて再懸濁し、１５ｍＬの遠沈管（ベクトンディッキンソンアンドカンパニー社）に移して５分間室温にて静置した。５００μＬの上清を除いた後、８μｇポリブレン（シグマアルドリッチ社）を含む４００μＬの新鮮な培地を添加した。１００μＬの濃縮ウイルス上清を添加し、細胞と混ぜ、３７℃で６時間保温した。６時間の保温の間、時々細胞とウイルス懸濁液を撹拌した。６ウェル培養皿の２つのウェルに播種したネオマイシン耐性フィーダー細胞ＳＬ１０（リプロセル社）の上に、レトロウイルスを感染させた細胞を播種し、３７℃で培養した。一晩培養した後、１ｍＬの培地を細胞に加え、感染後３６時間後に培地交換を行うことでウイルス粒子を洗い流した。感染４日後、Ｇ４１８硫酸塩（４００μｇ／ｍＬ）（インビトロジェン社）にて３６時間処理した。その後、Ｇ４１８硫酸塩を洗い流すためにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて２回リンスし、さらに数日間培養した。必要に応じてＧ４１８硫酸塩で再処理を行った。

（バイオリアクターを用いた心筋分化誘導及び心筋細胞シートの調整）
ｉＰＳ細胞の心筋分化誘導は、バイオリアクターシステム（エイブル社、日本）を用いて、Ｍａｔｓｕｕｒａらの方法（ＭａｔｓｕｕｒａＫ．，ｅｔａｌ．Ｃｒｅａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｃａｒｄｉａｃｃｅｌｌｓｈｅｅｔｓｕｓｉｎｇｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．２０１２Ａｕｇ２４；４２５（２）：３２１−７．、特許文献１参照）に従って実施した。細胞を播種する前に、温度応答性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）、セルシード社、東京、日本）、もしくは細胞培養皿（コーニング社、コーニング、ニューヨーク州、米国）の表面をウシ胎児血清（ＦＢＳ）にて２時間コーティングした。ｉＰＳ細胞を心筋細胞へ分化誘導した後、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて剥離し、細胞凝集塊はストレーナー（ＢＤバイオサイエンス社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）を使用してシングルセルとし、１０％ＦＢＳを含んだＤＭＥＭ（シグマアルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）を用いて２．１×１０⁵細胞／ｃｍ²の細胞を培養皿に播種し、３７℃、５％ＣＯ₂、加湿雰囲気下で培養した。いくつかの実験では、ピューロマイシン（シグマアルドリッチ社、１．５μｇ／ｍＬ）で１日間処理し、ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株、αＭＨＣ−ｐｕｒｏ／Ｒｅｘ１−ｎｅｏ）由来の心筋細胞を純化した。

ｉＰＳ細胞由来の線維芽細胞は培養皿にあらかじめ播種する技法（プレプレーティング法）によって得た。すなわち、ｉＰＳ細胞から心筋へと分化誘導後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いてコーティングしていない培養皿上に播種し、培養した。その後、培養皿に接着しなかった細胞を捨て、接着している細胞をＰＢＳ（−）で３回しっかりと洗浄し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて培養した。９９％以上の細胞がＳＭ２２陽性であり、ｃＴｎＴ陽性の割合は１％未満であった。継代２〜３回行ったｉＰＳ細胞由来の線維芽細胞を実験に使用した。

（２次元共培養試験）
ヒトｉＰＳ細胞から心筋へ分化誘導した後の細胞は、２４ウェル培養皿（コーニング社）にて２．１×１０⁵細胞／ｃｍ²で播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＤを用いて３７℃、５％ＣＯ₂、加湿雰囲気下にて２日間培養した。共培養実験を行う１日前、ｉＭａｔｒｉｘ５１１上で培養したｉＰＳ細胞をＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔで剥離し、細胞凝集塊を形成させるためにＹ２７６３２（化合物一般名）（１０μＭ）（和光純薬工業社、日本）を含有するＡＫ０３培地を用い、シングルセル懸濁液をＥＺＳｐｈｅｒｅ（旭硝子社、東京、日本）上で１日間培養した。次の日、２４ウェルプレート上でＡＫ０３培地を用い、ｉＰＳ細胞の凝集塊５０個とｉＰＳ細胞由来の心筋細胞とを１日間、共培養した。続いて、３７℃（ＡＫ０３培地）、４２℃（ＡＫ０３培地）、３７℃（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）、又は４２℃（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）の条件にて、それぞれ２日間培養を行った。

（バイオリアクターを用いた共培養試験）
ＭＥＦ上で培養したｉＰＳ細胞はＡｃｃｕｍａｘ（イノベーティブセルテクノロジーズ社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を用いてシングルセルとして剥離した。１００ｍＬバイオリアクターを用い、Ｙ２７６３２（１０μＭ）を含有したｍＴｅＳＲ１（ステムセルテクノロジー社、カナダ）培地を使用して、２×１０⁷個のｉＰＳ細胞（ＭＥＦを含む）と心筋分化誘導後１２日目の心筋細胞を共培養した（Ｄａｙ０）。翌日、Ｙ２７６３２を含まないｍＴｅＳＲ１培地へと交換した。共培養開始２日後（Ｄａｙ２）、ｍＴｅＳＲ１培地にて３７℃４８時間、又は４２℃６時間培養後に３７℃４２時間（合計４８時間）培養した。培養開始４日後（Ｄａｙ４）、それぞれの条件の細胞をＡｃｃｕｍａｘで剥離し、ＦＢＳをあらかじめコーティングしていた２４ウェル培養皿上に２．１×１０⁵細胞／ｃｍ²で再播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて３７℃で培養し、ＦＡＣＳ解析用に４％パラホルムアルデヒドで固定した。培養皿上の細胞は４２℃で再び２日間培養し（Ｄａｙ５からＤａｙ７）、その後、３７℃で１日間培養した（Ｄａｙ７からＤａｙ８）。

（免疫細胞化学）
細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｍａｔｓｕｕｒａらの方法（ＭａｔｓｕｕｒａＫ．，ｅｔａｌ．Ｃｒｅａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｃａｒｄｉａｃｃｅｌｌｓｈｅｅｔｓｕｓｉｎｇｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．２０１２Ａｕｇ２４；４２５（２）：３２１−７．）に従い免疫染色を行った。ＴＵＮＥＬ解析を行うために、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴＴＵＮＥＬＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８イメージングキット（ライフテクノロジー社、カリフォルニア州、米国）を用い、説明書に従って染色を行った。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（シグマアルドリッチ社）にて染色した。染色した試料は、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ（モレキュラーデバイス社、サニーベール、カリフォルニア州、米国）及びＭｅｔａｘｐｒｅｓｓａｎｄＡｃｕｉｔｙＸｐｒｅｓｓソフトウエア（モレキュラーデバイス社）を用いて撮影した。

（ＲＮＡ抽出及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
全量ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲはＭａｔｓｕｕｒａＫ．、ＫｏｄａｍａＦ．らの方法（ＭａｔｓｕｕｒａＫ，ＫｏｄａｍａＦ．ｅｔａｌ．，ＥｌｉｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｒｅｍａｉｎｉｎｇｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｉＰＳｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｈｕｍａｎｃａｒｄｉａｃｃｅｌｌｓｈｅｅｔｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎｕｓｉｎｇａｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ−ｆｒｅｅｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．ＴｉｓｓｕｅＥｎｇＰａｒｔＣＭｅｔｈｏｄｓ．２０１４Ｓｅｐ２３．）に従い行った。使用したプライマーペアとＴａｑｍａｎＭＧＢプローブは上記ＭａｔｓｕｕｒａＫ、ＫｏｄａｍａＦ．らの方法と同一のものを使用した。具体的なプライマーの情報は表１に示し、いずれのプライマーもライフテクノロジーズ社より購入したものを使用した。定量的ＰＣＲは７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社）を用いて解析した。相対的ｍＲＮＡ発現レベルはＧＡＰＤＨ、またはβ−アクチンｍＲＮＡ発現レベルの標準曲線を用いて計算した。

（フローサイトメトリー解析）
それぞれの条件の細胞凝集塊は、Ａｃｃｕｍａｘを用いて１０分間３７℃で剥離し、Ｍａｔｓｕｕｒａらの方法（ＭａｔｓｕｕｒａＫ，ｅｔａｌ．Ｃｒｅａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｃａｒｄｉａｃｃｅｌｌｓｈｅｅｔｓｕｓｉｎｇｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．２０１２Ａｕｇ２４；４２５（２）：３２１−７．）らの方法に従ってＴｒａ−１６０または心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）を染色した。細胞の割合はＧａｌｌｉｏｓ（ベックマンコールター社、ブレア、カリフォルニア州、米国）及びＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏｖｅｒｓｉｏｎ５．２ソフトウエアを用いて解析した。

（ＴＲＰＶ−１ノックダウン）
ｉＭａｔｒｉｘ５１１上で培養したｉＰＳ細胞は、説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ライフテクノロジー社）を使用してＴＲＰＶ−１ｓｉＲＮＡ（ライフテクノロジーズ社、カタログ番号：４３９２２４０）、及びネガティブコントロール（ライフテクノロジーズ社、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）ＳｅｌｅｃｔＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌＮｏ．１ｓｉＲＮＡ、製品番号：４３９０８４３)をトランスフェクトした。

（ＴＲＰＶ−１アゴニスト）
ＴＲＰＶ−１のアゴニストとしては以下の試薬を用いた。
・カプサイシン（シグマアルドリッチ社）
・アルバニル（和光純薬工業社）
・ＯＬＤＡ（トクリス（Ｔｏｃｒｉｓ）社）
・溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）：エタノール（和光純薬工業社）

（統計解析）
データは平均値±標準偏差で表している。２つのグループ間を比較した統計学的解析は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔを用いて行った。複数グループ間の比較統計解析は一元配置分散分析（Ｏｎｅ−ｗａｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｖａｒｉａｎｃｅ）を行い、続いてＤｕｎｎｅｔｔ検定にて比較を行った。ｐ値が０．０５より小さいものを統計学的に有意であるとした。

（実施例１）
高い培養温度がｉＰＳ細胞へ傷害を与えるかどうかを確かめるために、まず初めにラミニンＥ８フラグメント上で培養したｉＰＳ細胞を３７℃、４０℃、４１℃、又は４２℃の条件にて、１日間又は２日間培養した（図１Ａ、Ｂ）３７℃及び４０℃で培養したｉＰＳ細胞は培養時間に依存して有意に細胞数が増加した（３７℃；Ｄａｙ０；１０３１１±１３９５、Ｄａｙ１；２３７４８±１６１１、Ｄａｙ２；４１５６３±７６０、４０℃；Ｄａｙ１；２１７５８±３２１９、Ｄａｙ２；４０７０６±５９１）。興味深いことに、４１℃で培養したｉＰＳ細胞はＤａｙ１で細胞増殖が停止されており（１３２２８±２０３７）、Ｄａｙ２では細胞数が減少していた（４２７８±８４８）。しかしながら、４２℃で培養したｉＰＳ細胞は培養時間依存的に細胞数が有意に減少していた（Ｄａｙ１；２４５９±９３４、Ｄａｙ２；１２１６±２２９）。それに伴い、Ｏｃｔ４を発現するｉＰＳ細胞の数は３７℃において顕著に増加し（Ｄａｙ０；８８３４±２５４５、Ｄａｙ１；１７１３４±５７３１、Ｄａｙ２；３１１００±２８９４）、一方、４２℃で培養したＯｃｔ４を発現するｉＰＳ細胞の数は有意に減少した（Ｄａｙ１；２２７１±１２０８、Ｄａｙ２；９６１±２６）（図２）。４２℃での細胞数の減少に伴い、ＴＵＮＥＬ陽性の細胞が培養時間依存的に有意に増加した（Ｄａｙ０；３．４±０．２、Ｄａｙ１；９．４±４．１、Ｄａｙ２；３３．０±５．６）（図１Ｃ、Ｄ）。これらの結果から、４２℃という温度はヒトｉＰＳ細胞がアポトーシスを引き起こす重要な温度であることを示唆している。４２℃におけるこれらの細胞傷害効果は、フィーダー細胞無しで培養した異なったｉＰＳ細胞株（１２３１Ａ３株）においても同様の結果が観察された。

次に、ｉＰＳ細胞が死滅する４２℃の最小限の培養時間を確かめた。ｉＰＳ細胞を４２℃で１時間、又は３時間培養し、その後、それぞれ培養開始から２４時間になるまで３７℃で培養した。３７℃で２４時間培養した時と同様、いずれの培養時間においてもＤａｙ０の細胞数と比較して細胞数は有意に増加した（培養開始前；１１８９７±２０７、３７℃２４時間；２５７２１±３４７７、４２℃１時間＋３７℃２３時間；２３３９１±８４２、４２℃３時間＋３７℃２１時間；２０８３４±１９４２）（図３Ａ、Ｂ）。４２℃で６時間及び９時間培養した場合、細胞数はほとんど変化しなかった（４２℃６時間＋３７℃１８時間；９９０９±１７１４、４２℃９時間＋３７℃１５時間；１１９３４±２０３２）。しかし、４２℃で１２時間以上培養した場合は、Ｄａｙ０と比較して有意に細胞数が減少していた（４２℃１２時間＋３７℃１２時間；５１７２±１１６８、４２℃２４時間；２１６０±３３２）。これらの結果から、４２℃で１２時間以上培養することがｉＰＳ細胞を減少させることに重要である可能性が示唆された（図３Ａ、Ｂ）。

フィーダー細胞がｉＰＳ細胞との相互作用により細胞を生存させている可能性もあるので、その影響を確認するために、ＭＥＦ上で培養したｉＰＳ細胞に対しても４２℃の培養温度が効果的であるかどうかを確かめた。ＭＥＦ上で培養されたｉＰＳ細胞を４２℃で培養すると、コロニーを形成した多くの細胞はＤａｙ２までに死滅したが、コロニーの周囲の細胞は残ったままであった（図４Ａ）。共焦点ハイコンテント画像解析（Ｃｏｎｆｏｃａｌｈｉｇｈｃｏｎｔｅｎｔｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ）の結果より、Ｏｃｔ４陽性細胞の数は培養時間依存的に有意に減少したが（Ｄａｙ０；９９３１±２５０、Ｄａｙ１；５２５０±１８６６、Ｄａｙ２；７６７±２１５）、Ｏｃｔ４陰性細胞の数はＤａｙ２までほとんど変化しないことが明らかとなった（Ｄａｙ０；１１３２３±１８３５、Ｄａｙ１；１１８４３±９２５、Ｄａｙ２；１２９６７±１４４０）（図４Ａ、Ｂ）。これらのことは、４２℃はｉＰＳ細胞にとって細胞傷害性を与える温度であるが、フィーダー細胞のような分化した細胞には影響がないことを示唆している。細胞種間で細胞―細胞間相互作用に違いがある可能性があり、再生医療に用いられる生物工学的に作製される組織において、残存したｉＰＳ細胞が４２℃で除去されるかどうかを明らかにすることは重要である。ｉＰＳ細胞の凝集塊をｉＰＳ細胞由来の心筋細胞と１日間共培養すると、ｉＰＳ細胞は心筋細胞と生着した（Ｄａｙ０；７５３１±１２２９）（図４Ｃ、Ｄ）。これらの共培養した細胞を、３７℃でさらに２日間、ｉＰＳ細胞用培地（ＡＫ０３）中、又は心筋細胞用培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）中で培養すると、いずれの条件においても顕著に増殖してコロニーのサイズが増大し、コロニー周辺に心筋細胞が配置するようになった（Ｄａｙ２（ＡＫ０３）；１５０６５±２１６６、Ｄａｙ２（ＤＭＥＭ）；１６９８４±３５２０）（図４Ｃ、Ｄ）。一方、前述の共培養した細胞を４２℃で２日間培養したものは、Ｏｃｔ４陽性細胞の数が減少し、コロニー中のｉＰＳ細胞は、まばらな状態で存在していた（Ｄａｙ２（ＡＫ０３）；７９０±６６、Ｄａｙ２（ＤＭＥＭ）；２７３０±４２１）（図４Ｃ、Ｄ）。これらの結果により、ｉＰＳ細胞は、様々なタイプの細胞と共培養条件しても、４２℃で培養することにより除去できることが示唆された。

（実施例２）
本発明のｉＰＳ細胞を減少させる方法を再生医療の用途で適用するには、４２℃の培養条件が、生物工学的に作製する組織に用いる分化した細胞に対して、どのような影響を与えるかを確かめる必要がある。ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞シートは、主に心筋細胞、線維芽細胞等から構成されているので、４２℃培養条件が、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞及び線維芽細胞にどのように影響を及ぼすのかを確認した。

ｉＰＳ細胞由来心筋細胞を３７℃又は４２℃の条件で培養したところ、心筋細胞は自立拍動を示し、３７℃及び４２℃で２日間培養したいずれの条件においても多くの細胞は生き残ったままであった。３７℃及び４２℃で１日（Ｄａｙ１）又は２日（Ｄａｙ２）培養した場合において、ｃＴｎＴ陽性及びＮｋｘ２．５陽性心筋細胞の数はほとんど変わらなかった（ｃＴｎＴ陽性細胞：３７℃（Ｄａｙ１）；１１０８４±１８１０、３７℃（Ｄａｙ２）；１２６２５±７６８、４２℃（Ｄａｙ１）；１２３４３±１０５、４２℃（Ｄａｙ２）；９９１７±２５２、Ｎｋｘ２．５陽性細胞：３７℃（Ｄａｙ１）；１１２４９±１７８３、３７℃（Ｄａｙ２）；１２２７２±６０７、４２℃（Ｄａｙ１）；１３４３２±１０５、４２℃（Ｄａｙ２）；１０５８６±３０９）（図５Ａ、Ｂ）。これらの結果は、心筋細胞が４２℃の培養条件に対しても耐性であることを示唆している。

次に、ｉＰＳ細胞由来の線維芽細胞に対する４２℃培養条件の影響を調べた。ｉＰＳ細胞由来の線維芽細胞を３７℃で培養すると、ビメンチン陽性又はＳＭ２２陽性ｉＰＳ細胞由来線維芽細胞は、Ｄａｙ０と比較して有意に増加した（ビメンチン陽性：Ｄａｙ０；１０４５１±８３５、Ｄａｙ１；１２６８６±５９３、Ｄａｙ２；１６３５３±８６８、ＳＭ２２陽性：Ｄａｙ０；１０５５３±８７６、Ｄａｙ１；１２７７７±６１５、Ｄａｙ２；１６７５２±９４０）（図５Ｃ、Ｄ）。一方、ｉＰＳ細胞由来線維芽細胞の数は、４２℃で培養するとＤａｙ１において有意に増加したが（ビメンチン陽性；１１８１８±６８９、ＳＭ２２陽性；１１８９５±６９３）（図５Ｃ、Ｄ）、Ｄａｙ２では有意差は生じなかった（ビメンチン陽性；１１５９２±２９３、ＳＭ２２陽性；１１７３８±２７８）（図５Ｃ、Ｄ）。これらのことより、ｉＰＳ細胞由来線維芽細胞もまた４２℃に対して耐性である可能性を示唆している。

心筋及び細胞外マトリックス遺伝子のｍＲＮＡの発現解析を行い、４２℃という温度が、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞及び線維芽細胞の遺伝子発現においてどのような影響を与えるかを調べた。心筋や線維芽細胞を含むｉＰＳ細胞を４２℃で培養した場合、ＭＹＬ２、ＭＹＬ７、Ｃｏｌ１Ａ、Ｃｏｌ３Ａ、ＮＰＰＡ及びＮＰＰＢのｍＲＮＡ発現は４８時間まで変化しなかったが、ＴＮＮＴ２の発現量は４８時間で有意に増加していた（図６Ａ）。このことは、４２℃培養条件においても転写活性は維持されていることを示唆していた。これらの結果とは逆に、４２℃で培養すると、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞中のＬＩＮ２８の発現量は有意に減少し（図６Ｂ）、４２℃で４８時間培養した細胞のＬＩＮ２８の発現量はｉＰＳ細胞の発現量の約０．３％であった（図６Ｃ）。これらのことから、４２℃での培養はｉＰＳ細胞由来の細胞に残存したｉＰＳ細胞を減少させるための方法として極めて有用であることを示している。

ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞に対する４２℃での培養はほとんど影響を与えないが、４２℃培養法が再生医療に用いられる生体工学的組織の構築においてどのような影響を与えるかを明らかにすることは重要である。心筋分化誘導後のｉＰＳ細胞由来心筋細胞は、３７℃４日間温度応答性培養皿上で培養すると自立拍動することが確認され、その培養温度を低下させると単層細胞シートが作製された（図６Ｄ）。興味深いことに、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞を４２℃で２日間（Ｄａｙ１からＤａｙ３）又は３日間（Ｄａｙ１からＤａｙ４）培養した後に培養温度を下げても細胞シートが得られた（図６Ｄ）。これは、細胞−細胞間ジャンクションタンパク質、基底膜タンパク質及び細胞外マトリックスを含む生物工学的に作製される組織を構築するために重要な様々な構成要素が、４２℃で培養したとしても維持されることを示唆している。しかしながら、４２℃で３日間（Ｄａｙ１からＤａｙ４）培養した場合は、心筋拍動が時々弱くなることがあった。一方、４２℃で２日間（Ｄａｙ１からＤａｙ３）培養した場合は、心筋の拍動に影響は与えなかった。これらのことから、細胞シート作製過程における４２℃２日間の培養は、残存しているｉＰＳ細胞を除去し、心筋細胞の生存率に影響しない最適な条件である可能性を示唆している。

（実施例３）
（ヒト心筋組織におけるＴＲＰＶ−１介在型残存ｉＰＳ細胞の除去）
高温条件は、温度感受性ＴＲＰチャンネルであるａｃｔｉｖａｔｅｓｔｒａｎｓｉｅｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｖａｎｉｌｌｏｉｄ１（ＴＲＰＶ−１）を活性化することが知られている。我々は、次にｉＰＳ細胞やｉＰＳ細胞由来心筋細胞におけるＴＲＰＶ−１の発現を明らかにした。ｉＰＳ細胞のＴＲＰＶ−１ｍＲＮＡの発現量は、４２℃で９時間培養した場合に有意に上昇し、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞のＴＲＰＶ−１ｍＲＮＡの発現は４２℃で１２時間培養後に上昇した（図７Ａ）。一方、ＴＲＰＶ−１の発現量は、ベースライン（４２℃培養前）のｉＰＳ細胞由来心筋細胞及び４２℃で２４時間培養したｉＰＳ細胞由来心筋細胞よりも、ｉＰＳ細胞の発現量の方が有意に高かった（図７Ｂ）。これらの結果は、４２℃培養によるＴＲＰＶ−１の活性の違いが、４２℃培養におけるｉＰＳ細胞とｉＰＳ細胞由来心筋細胞に対する除去効果の違いを説明しているのかもしれない。

ｉＰＳ細胞に対する４２℃培養の細胞傷害効果が、ＴＲＰＶ−１の相互作用によるものかを確かめるため、ｉＰＳ細胞に、ＴＲＰＶ−１に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。４２℃培養に付随して起こるＴＲＰＶ−１発現量の上昇が、ＴＲＰＶ−１ノックダウンによって阻害されたことが確認でき（図７Ｃ）、そのことと一致して、４２℃培養後のｉＰＳ細胞の細胞数の減少もＴＲＰＶ−１ｓｉＲＮＡのトランスフェクトにより阻害されていた（図７Ｄ、Ｅ）。これらの結果から、ＴＲＰＶ−１は４２℃培養におけるｉＰＳ細胞の除去に重要な役割を果たしていることが示唆された。

最後に、ＴＲＰＶ−１の薬理学的活性がｉＰＳ細胞には細胞傷害効果を与え、心筋細胞には効果を示さないかどうかを確かめた。フィーダーレスのｉＰＳ細胞を、カプサイシン（図８）、ＯＬＤＡ（図９）、アルバニル（図１０）、を含むＴＲＰＶ−１アゴニストと一緒に培養したところ、カプサイシンを用いた場合は細胞数が濃度依存的に有意に減少し（図８Ａ、Ｂ）、他のＴＲＰＶ−１アゴニストでの処理もまたｉＰＳ細胞に対して細胞傷害活性を示した（図９、図１０）。逆に、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞を、ｉＰＳ細胞では有毒である濃度（２００μＭ及び１００μＭ）のカプサイシンを含む培地で培養したところ、心筋細胞の自立拍動は維持されたままであり、Ｎｋｘ２．５陽性細胞の数は、溶媒で培養した時と変わらなかった（図８Ｃ、Ｄ）。これらのことから、ＴＲＰＶ−１のアゴニストは心筋細胞の生存率に影響を与えることなく、ｉＰＳ細胞を減少させるのに有効であることが示唆された。

本発明に示される方法であれば、多能性幹細胞が含まれる細胞集団を分化誘導して得られた細胞集団から、未分化の多能性幹細胞を減少させることができる。このような細胞集団は、再生医療等の移植材として使用する際の腫瘍化を形成するリスクが低くすることが可能となり、産業上有用である。また、実験等の用途で使用される多能性幹細胞由来の分化細胞集団から、未分化の多能性幹細胞を簡便かつ安価に除去することが出来きるようになり、有用である。

Claims

多能性幹細胞と多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団を、４１℃〜４３℃の温度で培養し、前記細胞集団に含まれる前記多能性幹細胞を減少させる方法であって、
前記温度で培養する時間が、１２時間〜７２時間の範囲である、前記方法。
前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞及び／又は胚性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
前記分化細胞が、心筋細胞、心筋芽細胞、線維芽細胞、壁細胞及び／又は血管内皮細胞を含む、請求項１又は２に記載の方法。
多能性幹細胞と、多能性幹細胞由来の分化細胞とを含む細胞集団から、多能性幹細胞を減少させる方法であって、
前記細胞集団に含まれる前記多能性幹細胞に発現するＴＲＰＶ−１を活性化する工程、を含むことを特徴とする方法であり、
前記ＴＲＰＶ−１を活性化する工程は少なくとも４１℃〜４３℃の温度で１２時間〜７２時間の範囲で培養して前記ＴＲＰＶ−１を活性化する工程を含む、前記方法。
前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞及び／又は胚性幹細胞である請求項４に記載の方法。
前記分化細胞が、心筋細胞、心筋芽細胞、線維芽細胞、壁細胞及び／又は血管内皮細胞を含む請求項４又は５に記載の方法。