CN112739208A - 人类多能成体干细胞 - Google Patents

Abstract

存在于成年人类组织中的某些小细胞群可以进行活化/发育以形成人类多能干细胞群。这些小细胞的直径通常小于六微米，且为CD49f阳性，在本文中被称为人早期前体或CD49f⁺细胞。因此，提供了具有富集的来自成年人类组织样品的CD49f⁺细胞的细胞群和组合物，以及用于促进这些CD49f⁺细胞的活化/发育的方法和组合物。分化后，活化的干细胞可用于各种治疗目的。

Description

人类多能成体干细胞

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2018年9月21日提交的美国临时申请序列号62/734,740的利益，其内容通过引用整体并入本文中。

背景技术

基于干细胞的疗法在治疗严重疾病和损伤方面具有广阔的前景。干细胞自我更新的能力及其分化能力提供了巨大的潜力，可以帮助受损细胞、组织或器官的修复、置换或再生。目前，在临床前和临床研究中已对各种类型的干细胞进行了研究，包括胚胎干细胞（ESC）、从成年组织分离的干细胞（例如间充质干细胞（MSC）、造血干细胞（HSC）等）、诱导多能干细胞（iPS细胞或iPSC）、以及通过从上述细胞来源分化而获得的各种专门细胞。

多能干细胞相对于其他来源的多能或单能体干细胞具有多种优势，因为多能干细胞在体外具有强大的自我更新能力和“多能性”，“多能性”是分化成三个胚芽层的衍生物的能力。多能干细胞的当前实例包括ESC和iPSC。关于人类ESC，许多问题阻碍了它们在细胞治疗中的使用，例如伦理问题、致瘤性和免疫排斥，因为生产患者匹配的ESC是不可行的。尽管直接从患者自身细胞衍生的iPSC可以避免其中的某些问题，例如道德问题和免疫排斥，但仍无法解决iPSC衍生的致瘤性和低频性。因此，在干细胞疗法中仍存在对源自成年人类组织的人多能干细胞来源的未满足需求，其具有所需的安全性、功效和培养物扩展用于临床的可行性。

干细胞疗法的主要挑战之一是使用动物模型将干细胞研究转化为人类。例如，小鼠ESC是在80年代初首次分离并在小鼠中进行研究的，而直到1998年研究人员首次开发出一种体外分离和培养人类胚胎干细胞的技术时，才取得了突破。尽管小鼠被认为是人类生物学研究中最重要的模型生物，但小鼠和人类的干细胞可能存在巨大差异。小鼠ESC和人类ESC之间的分子标记、信号传导途径、菌落形状、生长速率、表面标记和发育潜能存在根本差异。

因此，需要鉴定从成年人类组织分离的人多能干细胞，其可以在体外扩增，具有高分化效率并且是非致瘤性的。还需要建立用于体外培养这些人多能干细胞用于基于细胞的治疗的方案。从成年人类组织中分离出的这种多能干细胞将为基于细胞的实用疗法铺平道路，用于治疗组织损伤以及与慢性和衰老相关疾病。

概述

鉴定来自成年人类组织的可扩展的多能干细胞并建立用于体外培养它们的方案将为基于细胞的实用疗法铺平道路，用于治疗组织损伤以及慢性和衰老相关疾病。

本发明提供了一种制备细胞群的方法，包括：（1）从血液样品中移除至少一部分红细胞；（2）将样品以3,000xg-15,000xg进行离心并得到沉淀，（3）将沉淀中的细胞悬浮在溶液中；以及（4）富集溶液中的CD49f⁺细胞。在一些实施方案中，溶溶液中至少40％的细胞是表达CD49f且直径小于6 µm的CD49f⁺细胞。在一些方面，样品以大于5,000xg、6,000xg或7,000xg进行离心。在一些方面，CD49f⁺细胞的特征还在于为SSEA4阳性。在一些方面，CD49f⁺细胞的特征还在于为ABCG2和Lin阴性。在一些方面，CD49f⁺细胞的特征还在于为CD73和CD45阳性，并且为CD4和Lin28阴性。在一些方面，CD49f⁺细胞进一步表达选自Oct4、Nanog、CD31、CD117和CD105的一种或多种标记物。在一些方面，CD49f⁺细胞不表达选自CD3、CD4、CD8、CD11b和CD41的一种或多种标记物。在一些方面，少于20％的细胞是红细胞。

还提供了一种包含至少1000个细胞的组合物，并且至少40％的细胞是表达CD49f且直径小于6 µm的CD49f⁺细胞。在一些方面，CD49f⁺细胞的特征还在于为SSEA4阳性。在一些方面，CD49f⁺细胞的特征还在于为ABCG2和Lin阴性。在一些方面，CD49f⁺细胞的特征还在于为CD73和CD45阳性，并且为CD4和Lin28阴性。在一些方面，CD49f⁺细胞进一步表达选自Oct4、Nanog、CD31、CD117和CD105的一种或多种标记物。在一些方面，CD49f⁺细胞不表达选自CD3、CD4、CD8、CD11b和CD41的一种或多种标记物。在一些方面，少于20％的细胞是红细胞。在一些方面，CD49f⁺细胞可以被包含一种或多种因子的培养基激活，并且激活的细胞表达ABCG2。

还提供了培养细胞的方法，该方法包括在培养基中培养多个人类细胞，所述培养基与选自原代肝细胞和肝细胞系的至少一个接触或已被用选自原代肝细胞和肝细胞系的至少一个进行了培养（condition）。在一些方面，肝细胞系包括衍生自肝癌的细胞系、永生化肝细胞、从转基因动物分离的永生肝细胞、肝细胞/肝癌杂交细胞、基因工程肝细胞、肝祖细胞或其组合。在某些方面，人类细胞（a）直径小于6 μm，并且（b）是CD49f⁺细胞。在一些方面，CD49f⁺细胞的特征还在于为SSEA4阳性。在一些方面，CD49f⁺细胞的特征还在于为ABCG2和Lin阴性。在某些方面，在培养后，细胞表达ABCG2。在一些方面，人类细胞包括一种或多种类型的干细胞。

本发明进一步提供了一种分离的人类细胞，其表达CD49f，但不表达Lin。在一些方面，人类细胞的特征还在于为ABCG2阳性。在一些方面，人类细胞的特征还在于为SSEA4阳性。在一些方面，人类细胞的特征还在于为Oct4、Nanog、Lin 28、CD73和CD105阳性。在一些方面，人类细胞不表达CD45、CD14和/或CD19。在一些方面，人类细胞在包含一种或多种因子的培养基中培养一段时间后，发展成集落。还提供了本文公开的细胞的群体。

还提供了一种衍生自人类细胞群的干细胞，所述人类细胞（a）直径小于6 µm，（b）表达CD49f，并且（c）不表达ABCG2，其中所述干细胞群表达ABCG2 ，并且是异质细胞群。本发明的实施方案还提供了从如本文公开的干细胞分化的细胞。

还提供了一种组合物，其包含至少1000个细胞，并且至少40％的细胞表达CD49f和ABCG2，而不表达Lin。在一些方面，至少40％的细胞的特征还在于为CD73和/或SSEA4阳性。在一些方面，至少40％的细胞的特征还在于为Oct4、Nanog和/或CD105阳性。

还提供了一种组合物，其在药学上可接受的载体或赋形剂中包含本文公开的早期（early stage）前体（precursor）和/或干细胞。在一些实施方案中，还提供了一种组合物，其在药学上可接受的载体或赋形剂中包含本文公开的分化细胞。还提供了一种在有需要的对象中治疗疾病或病症的方法，其包括向该对象施用有效量的本文所公开的组合物。

附图说明

图1显示了包括从人外周血分离的早期前体的细胞群的显微镜图像。

图2显示了在活化/发育（activation/development）系统中接种后的早期前体的细胞核染色。

图3显示了在活化/发育系统中培养的早期前体中早期标志物的表达。

图4示出了在活化/发育系统中早期前体的生长和扩增。

图5显示了在活化/发育系统中衍生自早期前体的干细胞集落。

图6显示了当用衍生自人早期前体的活化干细胞治疗时，免疫缺陷小鼠中的伤口加速愈合。

详细说明

在整个本发明中，本文引用了各种出版物、专利和公开的专利说明书。这些出版物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用整体结合到本发明中。

在描述组合物和方法之前，应理解，本发明不限于所描述的特定方法、方案、细胞系、测定法和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文所用的术语旨在描述本发明的特定实施方案，并且绝不旨在限制如所附权利要求书所述的本发明的范围。

除非另有说明，否则本发明的实施将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域技术范围内。参见例如Sambrookand Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd edition;Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology系列;Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)系列; MacPherson et al.(1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press);MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds.(1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of AnimalCells: A Manual of Basic Technique, 5^th edition; Gait ed. (1984)Oligonucleotide Synthesis; 美国专利号4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984)Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hamesand Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells andEnzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to MolecularCloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for MammalianCells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer andExpression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) ImmunochemicalMethods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Herzenberg etal. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology; Manipulating theMouse Embryo: A Laboratory Manual, 3^rd edition (Cold Spring Harbor LaboratoryPress (2002)); Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al.eds., (1987)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds.(1995)); Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual; Harlowand Lane, eds. (1999) Using Antibodies, A Laboratory Manual; Animal CellCulture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Zigova, Sanberg and Sanchez-Ramos, eds.(2002) Neural Stem Cells。

所有数字指定（包括范围），例如pH、温度、时间、浓度、以及分子量，都是近似值，其在适当时以1.0或0.1的增量（（+）或（-））变化。应该理解的是，尽管并非总是明确地说明，但是所有的数字值前面都有术语“约”。适当时，术语“约”除了包括精确值“X”之外，还包括“X”的较小增量，例如“X + 0.1或1”或“X-0.1或1”。还应该理解的是，尽管并非总是明确地说明，但是本文所述的试剂仅是示例性的，并且这些试剂的等效物在本领域是已知的。

1. 定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。如本文所用，以下术语具有以下含义。

除非上下文另有明确说明，否则如说明书和权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代。因此，例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

如本文使用的，术语“包含”旨在意为组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素。“基本上由……组成”当被用来定义组合物和方法时，应该意为排除对于预期目的的组合来说具有任何实质性作用的其他元素。因此，如本文定义的基本上由该元素组成的组合物，将不排除不会实质性影响要求保护的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由……组成”应当意为排除多于微量元素的其他成分和实质性方法步骤。通过这些过渡性术语的每一个进行定义的方面都在本发明的范围之内。

如本文所用，术语“分离的”意指与细胞的和其他的成分分离，其中细胞、组织、多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段通常在性质上相关。例如，分离的多核苷酸与3'和5'连续的核苷酸分离，它在其天然的或自然的环境中（例如在染色体上）通常与其相连。对于本领域技术人员显而易见的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”来将其与其天然存在的对应物区分开。分离的细胞是从不相似的表型或基因型的组织或细胞中分离的细胞。

如本文所用，“干细胞”定义了能够在培养基中无限期分裂并产生特化细胞的细胞。干细胞的类型的非限制性实施例包括体细胞（成体）干细胞、胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞（参见Cibelli et al. (2002) Science 295(5556):819；美国专利公开号20100069251和20080299091）、和/或诱导的多能干细胞（iPS细胞或iPSC）。体细胞干细胞是在分化组织中发现的未分化细胞，其能够自我更新（克隆）和（具有某些限制）分化来产生其起源自的组织的所有特化细胞类型。胚胎干细胞是来自胚胎的原始（未分化）细胞，其有可能成为多种特化细胞类型。胚胎干细胞的非限制性实施例包括：可从ESI, Singapore获得的HES2（也称为ES02）细胞系和可从WiCell, Madison, WI获得的H1或H9（也称为WA01）细胞系。其他细胞系正在等待NIH审查。参见，例如，grants.nih.gov/stem_cells/registry/current.htm（最后访问时间为2017年3月13日）。通过使用包括但不限于以下的标记物能够将多能胚胎干细胞与其他类型的细胞区分开：Oct-4、碱性磷酸酶、CD30、TDGF-1、GCTM-2、Genesis、生殖细胞核因子、SSEA1、SSEA3和SSEA4。诱导的多能干细胞（iPSC）是衍生自非多能细胞的人工衍生的干细胞（通常是成体体细胞），其通过诱导一种或多种干细胞特异性基因的表达而产生。iPSC表达的特异性基因包括但不限于：八聚体转录因子家族，例如Oct-3/4；Sox基因家族，例如Sox1、Sox2、Sox3、Sox15和Sox18；Klf基因家族，例如Klf1、Klf2、Klf4和Klf5；Myc基因家族，例如c-myc和L-myc；Nanog基因家族，例如Octamer-4（OCT4）、NANOG和REX1；或LIN28。iPSC的实施例描述于Takahashi et al. (2007) Cell （ 2007年11月20日提前在线出版）、Takahashi & Yamanaka (2006) Cell 126:663–76、Okita et al. (2007) Nature 448:260–262、Yu et al. (2007) Science （ 2007年11月20日提前在线出版）、以及Nakagawaet al. (2007) Nat. Biotechnol（2007年11月30日提前在线出版）。

如本文所用，术语“繁殖”意指生长或改变细胞或细胞群的表型。术语“生长”或“扩增”是指在获得所需数量的细胞或细胞类型所必需的支持培养基、营养物、生长因子、支持细胞或任何化学或生物化合物的存在下细胞的增殖。在一个实施方案中，细胞的生长/扩增导致组织的再生。

如本文所用，术语“培养”是指细胞或生物体在各种培养基上或培养基中的体外繁殖。应理解，培养中生长的细胞的后代可能与亲本细胞不完全相同（即，在形态学上、遗传上或表型上）。“扩增”是指细胞的任何增殖或分裂。

如本文所用并且如下文更详细地陈述，“条件培养基（conditioned medium）”是与成熟细胞一起培养的培养基，该成熟细胞向培养基提供细胞的因子，例如细胞因子、生长因子、激素、细胞外基质、以及将会促进细胞生长、发育和分化的一些材料。

如本文所用，术语“分化”描述了非特化细胞通过其而获得特化细胞（例如皮肤、心脏、肝或肌肉细胞）的特征的过程。“定向分化”指操作干细胞培养条件来诱导分化成特定的细胞类型。“去分化”定义了在细胞谱系中恢复到较不定型（committed）位置的细胞。如本文所用，术语“分化或已分化的”定义了在细胞谱系内呈现更定型（“已分化的”）位置的细胞。

如本文所用，细胞的“谱系”定义细胞的遗传，即其前体和后代。细胞的谱系将细胞置于发育和分化的遗传的方案之内。如本文所用，“分化成中胚层（或外胚层或内胚层）谱系的细胞”定义了分别变为特定中胚层（或外胚层或内胚层）谱系的细胞。分化成中胚层谱系或产生特定中胚层细胞的细胞的实施例包括但不限于以下细胞：脂肪生成的、平滑肌生成的、软骨生成的、心源性的、皮肤生成的、造血的、血管生成的、肌源性的、肾源性的、泌尿生成的、成骨的、心包起源的、或基质的。分化成外胚层谱系的细胞的实施例包括但不限于表皮细胞、神经原细胞和神经胶质细胞。分化成内胚层谱系的细胞的实施例包括但不限于产生胰腺、肝、肺、胃、肠和甲状腺的细胞。

如本文所用，术语“多能干细胞”是指具有以下性质的细胞：（i）能够在未分化状态下在体外无限增殖；（ii）通过长期培养维持正常的核型；以及（iii）即使在长时间培养后，仍保持分化为所有三个胚胎胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的衍生物的潜力。目前可获得的多能干细胞的非限制性实施例包括胚胎干细胞和iPSC。如本文所用，术语“胚胎样干细胞”是指衍生自组织、器官或血液的细胞，其具有胚胎干细胞的多能特征。

如本文所用，术语“多谱系干细胞”或“多潜能干细胞（multipotent stem cell）”是指自身繁殖的干细胞和来自不同发育谱系的至少两个进一步分化的子代细胞。谱系可以能够来自相同的胚层（即中胚层、外胚层或内胚层），或来自不同的胚层。来自多谱系干细胞的分化的具有不同发育谱系的两个子代细胞的实施例是肌原细胞和脂肪细胞（两者都来源于中胚层，但产生不同的组织）。另一个实施例是神经源性细胞（来源于外胚层）和脂肪细胞（来源于中胚层）。

如本文所用，术语“可自我再生的”是指细胞能够在多次传代中自我更新而细胞性质没有显著变化。一方面，传代的数量为至少约2，或者至少约5，或者至少10，或者替代地至少约15、20、30、50或100。

如本文所用，术语“基本上同源的”描述了一群细胞，其中大于约50％、或者大于约60％、或者大于70％、或者大于75％、或者大于80％、或者大于85％、或者大于90％、或者大于95％、或者大于99％的细胞具有相同或相似的表型。表型能够通过预先选择的细胞表面标记物或其他标记物来确定。

如本文所用，术语感兴趣细胞的“纯化的群体”是指从存在于其天然环境中的基本上所有其他细胞分离出的细胞群，也指当细胞混合物中感兴趣细胞的比例大于其天然环境中发现的比例时的细胞群。例如，纯化的细胞群代表富集的感兴趣的细胞群，即使其他细胞和细胞类型也存在于富集群体中。在一些实施方案中，纯化的细胞群代表至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％的混合细胞群，条件是“纯化的”群体中感兴趣的细胞占总细胞群的百分比比其在纯化前的群体中占总细胞群的百分比更大。

如本文所用，术语“细胞群/细胞的群体”是指一种以上的在表型和/或基因型上相同（克隆）或不相同的细胞的集合。

如本文所用，术语“细胞集落”或“集落”是指一群由于细胞生长而形成的紧密相关的细胞。这些术语与构成集落的细胞数无关地使用。

如本文所用，术语“休眠”或“静止”意在涵盖处于如下状态的细胞：其在能够进行生长、分裂和/或分化之前必须被活化。

如本文所用，术语“前体”或“前体细胞”旨在涵盖可以产生一种或多种特定类型的细胞的细胞。如本文所用，术语“早期前体”旨在涵盖表达某些早期标记物的前体细胞。在一些实施方案中，早期前体在活化/发育后产生一个或多个干细胞群体。在一些实施方案中，早期前体在活化/发育之前保持休眠/静止状态。

如本文所用，术语细胞的“激活/活化”或“发育”是指细胞的休眠/静止状态中的可测量的形态、表型和/或功能变化。这种活化/发育通常与活化细胞的特异性标记物的表达同时发生。在一个实施方案中，活化/发育与细胞生长、分裂和/或发育的变化同时发生。 在一些实施方案中，早期前体的活化/发育包括细胞融合、细胞质和/或遗传物质的混合、核转移、遗传物质交换、重编程和/或杂交细胞的形成。

如本文所用，术语“活化的干细胞”旨在包含处于活化状态并且能够在特定条件下经历生长和/或分化的干细胞。

如本文所用，术语“组合物”旨在包含活性剂和另一种载体（例如化合物或组合物，惰性的（例如可检测的试剂或标记）或活性的（例如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等））的组合。载体还包括药物赋形剂和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物（例如，糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生的糖，例如，醛醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物），它们可以单独存在或组合存在，包含以1-99.99％的重量或体积单独或以组合存在。示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白（例如，人血清白蛋白（HSA）、重组人白蛋白（rHA））、明胶、酪蛋白等。代表性的氨基酸/抗体组分（其也能够起缓冲作用）包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也包括在本发明的范围内，其实施例包括但不限于：单糖，例如，果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及醛糖醇，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇（葡萄糖醇）和肌醇。在某些实施方案中，组合物包括细胞群或细胞混合物。在某些实施方案中，组合物被配制成膜、凝胶、贴剂、3-D结构或液体溶液。

如本文所用，术语“药学上可接受的”，表示考虑到待治疗的疾病或病症以及相应的施用途径，所指出的材料不具有引起合理谨慎的医师避免将该材料施用于患者的性质。例如，通常要求这种材料基本上是无菌的。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体（或培养基）”，其可以与术语“生物相容的载体（或培养基）”互换使用，是指试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂量这些形式不仅与治疗上施用的细胞和其他药物相容，而且在健全的医学判断范围内，适合于与人类和动物的组织接触，没有过多的毒性、刺激、过敏反应、或其他与合理的利益/风险比相称的并发症。适合于本发明的药学上可接受的载体包括液体、半固体（例如，凝胶）和固体材料（例如，细胞支架和基质、管板和本领域已知的并且在本文中更详细描述的其他此类材料）。这些半固体和固体材料可以被设计成抵抗体内降解（不可生物降解），或者它们可以被设计成在体内降解（可生物降解的、可生物腐蚀的）。可生物降解的材料可以进一步是生物可再次吸收的或生物可吸收的，即它可以溶解并被吸收到体液中（水溶性植入物是一个例子），或者可以通过转换成其他材料或通过自然途径分解和消除。对于局部使用，药学上可接受的载体适合于制成乳膏、软膏、果胶、凝胶、溶液、悬浮液等。这些载体在本领域是常规的，例如，局部施用聚乙二醇（PEG）。这些制剂可以任选地包含另外的药学上可接受的成分，例如，稀释剂、稳定剂、和/或佐剂。

如本文所用，术语“溶液”是指溶液、悬浮液、乳液、滴剂、软膏、液体洗液、喷雾剂和脂质体，其是本领域熟知的。在一些实施方案中，液体溶液含有水性pH缓冲剂，当加入少量酸或碱时，其抵抗pH的变化。

如本文所用，术语“pH缓冲剂”是指当向其中加入少量酸或碱时抵抗pH变化的水性缓冲溶液。pH缓冲溶液通常包含弱酸和其共轭碱的混合物，反之亦然。例如，pH缓冲溶液可以包含：磷酸盐，例如，磷酸钠、磷酸二氢钠、二水合磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、十二水合磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾；硼酸和硼酸盐，例如，硼酸钠和硼酸钾；柠檬酸和柠檬酸盐，例如，柠檬酸钠和柠檬酸二钠；乙酸盐，例如乙酸钠，乙酸钾；碳酸盐，例如，碳酸钠和碳酸氢钠等。pH调节剂可以包括：例如，酸，如盐酸、乳酸、柠檬酸、磷酸和乙酸；以及碱，如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸氢钠等。在一些实施方案中，pH缓冲剂是磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（即，含有磷酸钠、氯化钠并且在一些制剂中，含有氯化钾和磷酸钾）。

如本文所用，术语“配制”或“制剂”是指将包括一种或多种药物活性成分的不同物质组合以产生剂型的过程。在某些实施方案中，能够将两种或更多种药物活性成分共同配制成单一剂型或组合剂量单位，或单独配制并随后组合成组合剂量单位。持续释放制剂是一种设计用于在延长的时间内在体内缓慢释放治疗剂的配方，而速释制剂是一种设计用于在缩短的时间内在体内快速释放治疗剂的配方。

如本文所用，术语“治疗”是指在伤害或干预之前、期间和/或之后预防、治愈、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制、制止和/或停止疾病或病症的一种或多种临床症状。

如本文所用，术语“患者”或“对象”是指用药物组合物或根据本文所述的方法治疗的动物，包括哺乳动物，例如，鼠、犬、马、牛、猿或人。

如本文所用，术语“递送”是指用于在体内运输药物组合物以便安全地实现其期望的治疗效果的途径、方法、制剂、技术和系统。递送途径可以是任何合适的途径，包括但不限于血管内的、静脉内的、动脉内的、肌肉内的、皮肤的、皮下的、经皮的、皮内的和表皮内的途径。在一些实施方案中，有效量的组合物被配制用于施用于患者的皮肤或递送到患者的皮肤中。在一些实施方案中，有效量的组合物被配制用于递送到患者的血流中。

如本文所用，术语“有效量”是指组合物或试剂（例如，本文所述的组合物、细胞群或其他试剂）的浓度或量，其对于产生预期结果（包括体外或体内的细胞生长和/或分化）是有效的，或对于治疗有此需要的患者的疾病、障碍或病症是有效的。应当理解，待施用的细胞数量将根据待治疗病症的具体情况而变化，包括但不限于待治疗的尺寸或总体积/表面积、以及施用部位与待治疗区域的位置的接近度、以及医学生物学家和/或治疗医师熟悉的其他因素。

如本文所用，术语“有效期（或时间）”和“有效条件”是指药剂或组合物达到其预期结果（例如，细胞分化为预定的细胞类型）所必需或优选的一段时间或其他可控条件（例如，体外方法的温度、湿度）。

如本文所用，术语“对照”或“对照组”是指实验中使用的用于比较目的的替代对象或样品。对照可以是“阳性”或“阴性”。

如本文所用，术语“同时”是指同时（即，联合）施用。在一个实施方案中，施用是共同施用，使得两种或更多种药物活性成分（包括其任何固体形式）一次一起被递送。

如本文所用，术语“依次/按顺序地”是指分开（即，在不同时间）施用。在一个实施方案中，交错施用使得两种或更多种药物活性成分（包括其任何固体形式）在不同时间分开被递送。

如本文所用，术语“靶组织”或“靶器官”是指在施用于对象后，如本文所公开的干细胞和/或衍生自如本文所公开的干细胞的分化细胞累积的预期位点。例如，在一些实施方案中，本文公开的方法涉及已经受损（例如，通过局部缺血或其他损伤）的靶组织或靶器官。

如本文所用，术语“自体转移”、“自体移植”、“自身移植”等是指细胞供体也是细胞替代疗法的接受者的治疗。术语“同种异体转移”、“同种异体移植”等是指细胞供体与细胞替代疗法的接受者属于同一物种但不是同一个体的治疗。其中供体的细胞与受体组织相容性匹配的细胞转移有时被称为同源转移。术语异种转移、异种移植等是指细胞供体与细胞替代疗法的受体是不同的物种的治疗。

如本文所用，术语“Oct4”、“Oct3/4”或“八聚体结合转录因子4”是指八聚体转录因子家族的成员，并且经常用作未分化细胞的标记，并且具有基因符号POU5F1。Oct4也称为Pou5f1（POU域，第5类，转录因子1，van Eijk et a., 1999）。GENBANK®数据库公开了人类（例如NM_002701.5）、小鼠（NM_013633.3）、大鼠（NM_001009178.2）、猫（NM_001173441.1）、牛（NM_174580.3）和其他物种的Oct4的氨基酸和核酸序列。

如本文所用，术语“ABCG2”或“ATP结合盒（ABC）转运蛋白G2”是指属于ABCG/白色亚家族的ABCG家族的半转运蛋白，并且具有基因符号ABCG2。ABCG2也称为CD338或CDw338（分化簇w338，Leccia et al., 2014）、MXR（米托蒽醌抗性蛋白，Miyake et al., 1999）、BCRP（乳腺癌抗性蛋白，Doyle et al.,1998 ）或ABCP（胎盘特异性ABC转运蛋白，Allikmets etal.,1998）。GENBANK®数据库公开了来自人（例如AAG52982）、小鼠（NM_011920.3）、大鼠（BAC76396.1）、猫（XP_019684813.1）、狗（NP_001041486.1）、猪（NP_999175.1）、牛（NP_001032555.2）和其他物种的ABCG2的氨基酸和核酸序列。

如本文所用，术语“CD49f”是指蛋白质的整联蛋白α链家族的成员，并且具有基因符号ITGA6。CD49f也称为ITGA6或ITGA6B（整联蛋白亚基Alpha 6，Cariati et al., 2008）或VLA-6（Hemler et al., 1989）。GENBANK®数据库公开了来自人（例如NM_001079818.2）、小鼠（NM_008397.4）、大鼠（NM_053725.1）、牛（NM_001109981.1）和其他物种的CD49f的氨基酸和核酸序列。

如本文所用，术语“CD34”是指在某些造血和非造血干细胞上发现的细胞表面标记，并且具有基因符号CD34。GENBANK®数据库公开了人类（例如AAB25223）、小鼠（NP_598415.1）、大鼠（NP_001100672.1）、猫（NP_001009318.1）、猪（NP_999251.1）、牛（NP_776434.1）和其他物种的CD34的氨基酸和核酸序列等。

如本文所用，术语“CD117”是指在造血干细胞以及其他细胞类型的表面上表达的的细胞因子受体，并且具有基因符号KIT。CD117也称为KIT（Giebel et al., 1991）、c-Kit（(Yarden et al., 1987）、PBT（Piebald性状蛋白，Fleischman et al., 1991）或SCFR（肥大/干细胞生长因子） 受体，Spritz, et al., 1992）。GENBANK®数据库公开了来自人（例如NM_000222.2）、小鼠（NM_001122733.1）、大鼠（NM_022264.1）、猫（NM_001009837.3）、狗（NM_001003181.1）、猪（NM_001044525.1）和其他物种的CD117的氨基酸和核酸序列。

如本文所用，术语“CD184”是指对基质衍生因子-1（SDF-1，也称为CXCL12）具有特异性的α趋化因子受体，并且具有基因符号CXCR4。CD184也被称为CXCR4（4型C-X-C趋化因子受体，Endres et al., 1996）、LAP 3或LAP-3（脂多糖相关蛋白3，Kageyama et al., 2008）或Fusin（Dimitrov, 1996）。GENBANK®数据库公开了来自人（例如AJ224869.1）、小鼠（BC098322.1）、大鼠（NM_022205.3）、猫（NM_001009826.1）、狗（NM_001048026.1）、猪（DQ124104.1）、牛（NM_174301.3）和其他物种的CD184的氨基酸和核酸序列。

如本文所用，术语“CD45”是指酪氨酸磷酸酶，并且具有基因符号PTPRC。CD45也称为PTPRC（蛋白酪氨酸磷酸酶，受体类型C，Goff et al., 1999）、或L-CA或LCA（白细胞常见抗原，Pingel et al., 1989）。该基因对应于GENBANK®登录号NP_002829（人）、NP_035340（小鼠）、NP_612516（大鼠）、XP_002829（狗）、XP_599431（牛）和AAR16420（猪）。GENBANK®数据库中还存在其他CD45同源物的氨基酸序列，包括来自几种鱼类和几种非人类灵长类动物的氨基酸序列。存在CD45的各种同种型，例如CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RAB、CD45RAC、CD45RBC、CD45R0和CD45R（ABC）。

如本文所用，术语“谱系标记物”或“Lin”是指细胞谱系的特征分子，例如，细胞表面标记物、mRNA或内部蛋白质。谱系阳性（Lin⁺）细胞是指表达成熟细胞谱系标记物的细胞混合物。谱系阴性（Lin^－）细胞包括干细胞和祖细胞，其不是分化的成熟细胞。在一个方面，“Lin”是指一组标记物。如本文所用，FITC抗人类谱系抗体混合物经过优化，用于检测人类外周血T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞。该混合物由CD3、CD14、CD16、CD19、CD20和CD56组成。

如本文所用，术语“肝细胞系”是指源自肝脏的细胞系。肝细胞系的非限制性实例包括衍生自肝瘤的细胞系、永生化肝细胞、从转基因动物分离的永生肝细胞、肝细胞/肝癌杂交细胞、基因工程肝细胞、肝祖细胞或其组合。在一方面，衍生自肝癌的细胞系可以包括但不限于HepG2、HepG2.2.15、HLE、HLF、HuH-7、Hep3B、PLC/PRF-5、SNU182、SNU354、SNU368、SNU387、SNU398、SNU423、SNU449、SNU475和HepaRG。在另一方面，肝细胞系也可以通过永生化肝细胞来产生。在一个实施方案中，永生化的肝细胞可以包括通过用病毒基因或癌基因（即猿猴病毒SV40大T抗原，c-myc、cH-ras）转化或通过使用重组质粒的转染而产生的肝细胞。在另一个实施方案中，可以从表达病毒转化基因、癌基因或生长因子的转基因动物中分离出永生的肝细胞。在又一个实施方案中，可以产生表达成年肝酶时保持永久生长的肝细胞/肝癌杂交细胞。在另一个实施方案中，肝细胞系还包括表达人药物代谢酶的基因工程肝细胞。在另一个实施方案中，肝细胞系还包括肝祖细胞，例如肝脏中的卵形细胞。

2. 从成年人类组织中分离早期前体

研究人员长期以来一直在寻找来自成年人类组织的多能干细胞的来源以用于潜在的临床用途。本发明证明可以从成年人类组织中分离出具有相对较小尺寸的早期前体群体。这些早期前体可以通过活化/发育成为人类多能干细胞。细胞具有分化为所有三个胚层的能力，从而证明了其多能性。此外，利用本文开发的新的活化/发育系统，可以获得人多能干细胞并在体外扩增。此外，从成年人类组织中获得的多能干细胞在伦理和政治上都没有争议，并且不需要基因操作。本技术的另一个优点是证明人类多能干细胞是非致瘤性的。因此，当前公开的技术将为基于细胞的实用疗法铺平道路，用于治疗组织损伤以及与慢性和衰老相关疾病。

在一个实施方案中，本发明提供了富集了表达CD49f并且直径小于6 μm的人细胞的组合物或细胞群。此类人类细胞在本文中称为“CD49f⁺细胞”或“早期前体”。在一些实施方案中，组合物或细胞群包括总共至少100个细胞、1000个细胞、10,000个细胞、100,000个细胞、或1,000,000个细胞，以及它们的至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％是早期前体。在一些实施方案中，富集了早期前体的组合物或细胞群是从人类对象的成人组织样品中分离的。在一些实施方案中，所述组合物或细胞群还包含除早期前体以外的细胞，其百分比小于约70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。在一些实施方案中，富集了早期前体的组合物或细胞群是从人类对象的血液样品中分离的。在一些实施方案中，组合物还包含血细胞，例如红细胞和白细胞。在一些实施方案中，富集了早期前体的组合物或细胞群包括血细胞的百分比小于约70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％ 、25％、20％、15％、10％或5％。

在一些实施方案中，组合物中的早期前体包括完整的和破碎的前体。在一些实施方案中，细胞群中完整的早期前体与破碎的早期前体的数目之比小于1:1，至少约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1。

在一些实施方案中，人类早期前体的直径为约1 μm、或约1.5 μm、或约2 μm、或约2.5 μm、或约3 μm、或约3.5 μm、或约4 μm、或约4.5 μm、或约5 μm、或约5.5 μm、或约6 μm、或约1-2 μm、或者约1-3 μm、或约1-4 μm、或约1-5 μm、或约1-6 μm、或约2-3 μm、或约2-4 μm、或约2-5 μm、或约2-6 μm、或约3-4 μm、或约3-5 μm、或约3-6 μm、或约4-5 µm、或约4-6 µm、或约5-6 µm、或小于6 μm、或小于5 μm、或小于4 μm、或小于3 μm、或小于2 μm、或小于1 μm。在一些实施方案中，分离的人类早期前体具有非常高的细胞核-细胞质比率（v/v，也称为N:C比率或N/C）。在一些实施方案中，本文公开的早期前体的细胞核/细胞质比可以为至少9:1、或至少8:1、或至少7:1、或至少6:1、或至少5:1。在一些实施方案中，本文所公开的早期前体中被核占据的细胞面积的百分比可以为至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少98％。在一些实施方案中，本文公开的早期前体的细胞质可以是最小的。在一些实施方案中，当体外接种于常规细胞培养基（例如具有10％FBS的α-MEM）中时，人类早期前体不增殖并在几天内衰老。

在一些实施方案中，人类早期前体的分离群体是异质细胞混合物，包括以不同组的标记物为特征的细胞的各种亚群。在一些实施方案中，人类早期前体的分离群体包括表达CD49f和/或SSEA4并且不表达ABCG2和/或Lin的细胞亚群。在一些实施方案中，人类早期前体的分离群体包括表达选自CD49f、SSEA4、CD117、Oct4、Nanog、CD45和CD105的一种或多种标记物的细胞亚群。在一些实施方案中，人类早期前体的分离群体包括表达选自CD49f、CD31、SSEA4、CD117、Oct4、Nanog、CD45和CD105的一种或多种标记物的细胞亚群。在一些实施方案中，人类早期前体的分离群体包括表达选自CD49f、CD73、CD31、SSEA4、CD117、Oct4、Nanog、CD184、CD45和CD105的一种或多种标记物的细胞亚群。在一些实施方案中，人类早期前体的分离群体表达非常低水平的CD34。

在一些实施方案中，人类早期前体的分离群体不表达标记物ABCG2（CD338）。在某些实施方案中，人类早期前体的进一步特征是Lin^－。在一些实施方案中，人类早期前体的分离群体不表达选自CD90、Lin28、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD19和CD41的一种或多种标记物。

可以使用细胞表面标记物和细胞内标记物，诸如下表1中所示的那些，来分析人类早期前体。

表1

抗原或标记物	示例性GenBank登录号
		CD49f (ITGA6)	NM_001079818.2
CD34	NM_001025109.1
		CD31	NM_000442.5
CD117 (c-KIT)	NM_000222.2
		CD45 (PTPRC)	NM_002838.4
CD184 (CXCR4)	NM_001008540.2
		CD105	NM_007932.2
Oct4	NM_002701.5
		Nanog	NM_024865.3
ABCG2 (CD338)	NM_004827.2

在一些实施方案中，本文公开的人早期前体表达一种或多种早期干细胞标记物（例如Oct4、Nanog和SSEA4）。在一些实施方案中，本文公开的人类早期前体表达造血标记物组中的一种或多种标记物（例如CD117和CD45）。在一些实施方案中，本文公开的人类早期前体表达MSC标记组中的一种或多种标记物（例如CD105和CD73）。在一些实施方案中，本文公开的人类早期前体表达一种或多种增殖标记物（例如Cyclin D1^Low和c-Myc）。在一些实施方案中，本文公开的人类早期前体表达一种或多种细胞因子（例如VEGF和IL10）。在一些实施方案中，本文公开的人类早期前体是HLA-I^Low/HLA-II^-。在一些实施方案中，本文公开的人类早期前体的分离群体包括表达表1中鉴定的一种或多种标记物的细胞的两个或更多个亚群。在一方面，存在表1中鉴定的标记物中的两个、或三个、或四个、或五个，并增加到所有标记物都存在。在一些实施方案中，本文公开的早期前体中的细胞亚群表达表1中鉴定的标记物的各种组合。在一些实施方案中，本文公开的早期前体不表达Lin。

在一些实施方案中，提供了一种从成年人类组织样品中分离本文公开的早期前体的方法。成人人体组织的非限制性例子包括人体外周血、脐带血、骨髓、脐带、胎盘、脂肪组织、脑、血管、骨骼肌、皮肤、牙齿、牙髓、心脏、肝脏、卵巢上皮、睾丸、肾脏、视网膜、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨骼、韧带和肌腱。在一些实施方案中，提供了一种从人血液样品中分离本文公开的早期前体的方法。人血液样品的非限制性实例包括人外周血和脐带血。

在一些实施方案中，可以通过允许分离细胞的任何方式从成年人类组织样品中分离早期前体。例如，为了从人血样品中分离早期前体，本文公开的方法可以包括从血液样品中去除至少一部分红细胞，以及将样品离心以获得包括早期前体的沉淀。在另一个实例中，本文公开的方法可以包括从成年人类组织样品中获取（retrieving）细胞悬浮液（例如，通过消化组织样品并去除未消化的组织），并离心细胞悬浮液以获得包括早期前体的沉淀。在其他方面，该方法可以包括基于一种或多种识别标记物的细胞分选和细胞分离方法。例如，可以使用荧光激活细胞分选（FACS）或磁性激活细胞分选（MACS）来分选和分离早期前体。在一些实施方案中，可以使用其他方法来分离本文公开的早期前体。下文实施例1中提供了一些分离程序的例子。

在一方面，分离人早期前体的方法包括：（1）从人血液样品中去除至少一部分红细胞；（2）以3,000xg-15,000xg离心样品，以及（3）获得包含本文所述的人类早期前体的沉淀。在一些方面，步骤（2）中的样品可以以约3,000xg、或以约3,500xg、或以约4,000xg、或以约4,500xg、或以约5,000xg、或以约5500xg、或以约6,000xg、或以约6500xg、或以约7,000xg、或以约7500xg、或以约8,000xg、或以约8,500xg、或以约9,000xg、或以约9,500xg、或以约10,000xg、或以约10,500xg、或以约11,000xg、或以约11,500xg、或以约12,000xg、或以约12,500xg、或以约13,000 xg、或以约13500xg、或以约14000xg、或以约14500xg、或以约15000xg离心。

在一些方面，分离人类早期前体的方法包括：（1）消化人类组织样品并去除未消化的组织以获得细胞悬浮液；（2）以3,000xg-15,000xg离心细胞悬浮液，以及（3）获得包含本文公开的人早期前体的沉淀。在一些方面，步骤（2）中的样品可以以约3,000xg、或以约3,500xg、或以约4,000xg、或以约4,500xg、或以约5,000xg、或以约5500xg、或以约6,000xg、或以约6500xg、或以约7,000xg、或以约7500xg、或以约8,000xg、或以约8,500xg、或以约9,000xg、或以约9,500xg、或以约10,000xg、或以约10,500xg、或以约11,000xg、或以约11,500xg、或以约12,000xg、或以约12,500xg、或以约13,000 xg、或以约13500xg、或以约14000xg、或以约14500xg、或以约15000xg离心。

在一些实施方案中，提供了基于早期前体的特定标记物分离人早期前体的特定富集群体的方法。在一些实施方案中，提供了基于其特异性标记物分离人早期前体的异质群体（包括细胞的多个亚群）的方法。例如，该方法可用于分离富集CD49f⁺细胞的细胞群（例如通过FACS或MACS）。在另一个实例中，该方法可用于分离富集CD49f⁺/ABCG2^－细胞的细胞群。在另一个例子中，该方法可用于分离富集CD49f⁺/Lin^－细胞的细胞群。在另一个例子中，该方法可用于分离富集CD49f⁺/SSEA4⁺/Lin^－细胞的细胞群。在其他实施方案中，该方法可用于分离富集具有某些特定标记物（例如，如本文所公开的用于鉴定早期前体的标记物的各种组合）的细胞的细胞群。

在一些实施方案中，可以从其他来源/组织分离早期前体，只要该组织包含本文公开的可行的早期前体即可。在一些实施方案中，可以从任何年龄的对象分离早期前体。在一些实施方案中，可以在任何时间从对象分离早期前体。在一些实施方案中，可以从动物中分离早期前体，所述动物例如但不限于马、犬、猪、牛、鼠、猿猴和人。

3. 活化和发育

为了促进体外早期前体的分离群体的活化/发育，已经建立了活化/发育系统。

在一些实施方案中，活化/发育系统包括一种或多种选自原代肝细胞和肝细胞系的细胞/细胞系。肝细胞系的非限制性实例包括衍生自肝瘤的细胞系、永生化肝细胞、从转基因动物分离的永生肝细胞、肝细胞/肝癌杂交细胞、基因工程肝细胞和肝祖细胞。衍生自肝癌的细胞系的非限制性实例包括HepG2、HepG2.2.15、HLE、HLF、HuH-7、Hep3B、PLC/PRF-5、SNU182、SNU354、SNU368、SNU387、SNU398、SNU423、SNU449、SNU475和HepaRG。在一个实施方案中，永生化肝细胞包括通过用病毒基因或癌基因（例如猿猴病毒SV40大T抗原，c-myc、cH-ras）转化而产生的肝细胞，以及通过使用重组质粒转染而产生的肝细胞。例如，永生化的肝细胞可以包括但不限于THLE-2、THLE-3、L-02（HL-7702）、人肝细胞系（HHL）。在一个实施方案中，永生肝细胞包括从表达病毒转化基因、癌基因或生长因子的转基因动物分离的肝细胞。在一个实施方案中，肝细胞系还包括通过融合肝细胞和肝癌细胞而产生的肝细胞/肝癌细胞杂交细胞。在一个实施方案中，肝细胞系还包括表达人药物代谢酶的基因工程肝细胞。在一个实施方案中，肝细胞系还包括肝祖细胞，例如肝脏中的卵形细胞。在一些实施方案中，活化/发育系统可以包括其他类型的细胞和/或细胞系。在一些方面，活化/发育系统可以包括上述细胞/细胞系中的至少一个、或至少两个、或至少三个、或至少四个。

在一方面，活化/发育系统包括至少原代肝细胞和选自肝细胞系中的一种或多种的细胞混合物。在另一方面，活化/发育系统包括选自肝细胞系的至少一种。在另一方面，活化/发育系统包括选自肝细胞系的至少两种的细胞混合物。在另一方面，活化/发育系统包括选自肝细胞系的至少三种的细胞混合物。在另一方面，活化/发育系统包括至少原代肝细胞和HepG2的细胞混合物。在另一方面，活化/发育系统包括至少HepG2的细胞混合物。在另一方面，活化/发育系统包括至少原代肝细胞、HepG2和HepaRG的细胞混合物。在另一方面，活化/发育系统包括至少HepG2和HepaRG的细胞混合物。在另一方面，活化/发育系统包括至少原代肝细胞和选自THLE-2、THLE-3、L-02（HL-7702）和HHL中的至少一种的细胞混合物。在另一方面，活化/发育系统包括选自THLE-2、THLE-3、L-02（HL-7702）和HHL中的至少一种的细胞混合物。在另一方面，活化/发育系统包括至少HepaRG和选自THLE-2、THLE-3、L-02（HL-7702）和HHL中的至少一种的细胞混合物。在另一方面，活化/发育系统包括至少原代肝细胞和HepaRG的细胞混合物。在另一方面，活化/发育系统至少包括HepaRG。在另一方面，活化/发育系统至少包括原代肝细胞。

在一些实施方案中，本文提供了促进细胞培养物中早期前体的活化和发育的方法。 在一些实施方案中，在细胞培养物中促进早期前体的活化和发育的方法包括：在培养基中培养早期前体，所述培养基与本文公开的细胞/细胞系或细胞混合物接触或已经用其进行了培养。

在一个方面，本文提供了一种在具有本文所公开的细胞/细胞系或细胞混合物的共培养系统中促进早期前体的活化和发育的方法。在一些实施方案中，可以使用Transwell板制备共培养系统。例如，可以制备细胞或上述细胞/细胞系的细胞混合物，并用丝裂霉素C处理以使细胞有丝分裂失活。然后可以将细胞/细胞混合物接种在共培养基中的细胞培养板的底部。分离的早期前体群体可以接种在Transwell膜上，与细胞/细胞混合物共培养。共培养基可以包括具有5-50％的FBS（胎牛血清）的α-MEM培养基。例如，共培养基可包括具有约5％、或约10％、或约15％、或约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％的FBS的α-MEM培养基。在另一个实施方案中，共培养基可以包括具有5-50％的人血清的培养基。在另一个实施方案中，共培养基可以包括具有5-50％的血清替代物的培养基。在另一个实施方案中，共培养基可以包括不含血清的培养基。在一些实施方案中，其他培养基可以用于本文公开的方法中。任选地，可以将其他试剂和因子添加到共培养基中。

在另一方面，本文提供了一种使用条件培养基促进早期前体的活化和发育的方法。在一些方面，在用于活化/发育系统中之前，可以用上述细胞/细胞系或细胞混合物对培养基进行调节/培养。例如，可以将上述细胞/细胞混合物悬浮在细胞培养基中，然后接种在细胞培养皿/板中。用于培养细胞/细胞混合物的细胞培养基可以包括具有5-50％的FBS的DMEM。例如，培养基可以包括具有约5％、或约10％、或约15％、或约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％的FBS的DMEM。在另一个实施方案中，用于培养细胞/细胞混合物的细胞培养基可以包括具有5-50％的人血清的培养基。在另一个实施方案中，用于培养细胞/细胞混合物的细胞培养基可以包括具有5-50％的血清替代物的培养基。在另一个实施方案中，用于培养细胞/细胞混合物的细胞培养基可以包括不含血清的培养基。在一些实施方案中，其他培养基可以用于本文公开的方法中。任选地，可以将其他试剂和因子添加到培养基中。可以从细胞培养皿/板收集条件培养基，并且可以在使用培养基培养分离的早期前体之前除去培养基中的剩余细胞（例如，通过离心和/或过滤）。一方面，收集的条件培养基可以直接用于培养如本文所公开的分离的早期前体。另一方面，可以将收集的条件培养基与上述细胞培养基混合，以培养早期前体。例如，基于培养基混合物的总体积，本文公开的条件培养基可以为约5％（v/v）、或约10％、或约15％、或约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％、或约55％、或约60％、或约65％、或约70％、或约75％、或约80％、或约85％、或约90％、或约95％、或约100％。可选地，可以将其他试剂和因子添加到培养基的混合物中。

在一些实施方案中，活化/发育系统包括促进细胞融合的组合物和/或系统。细胞融合的非限制性实例包括电细胞融合（或电融合）、化学（例如聚乙二醇或PEG）介导的细胞融合、病毒（例如仙台病毒）诱导的细胞融合、由机械张力（例如显微注射）驱动的细胞融合、以及由高强度/高速离心导致的细胞融合。在一些实施方案中，活化/发育系统包括促进电细胞融合、化学介导的细胞融合、病毒诱导的细胞融合、机械张力驱动的细胞融合、离心驱动的细胞融合或其组合的组合物和/或系统。在一些实施方案中，诱导细胞融合的任何其他组合物和/或系统可以被包括在本文公开的活化/发育系统中。

在一个实施方案中，本文提供了一种在体外促进早期前体的活化和发育的方法。在一些实施方案中，促进早期前体的活化和发育的方法包括促进细胞融合。在一些实施方案中，还提供了促进早期前体的活化和发育的方法，包括诱导细胞融合的电方法、介导细胞融合的化学方法/处理（例如PEG）、病毒（例如仙台病毒）诱导的细胞融合、驱动细胞融合的机械方法（例如显微注射）、导致细胞融合的高速离心方法或其组合。

在一些实施方案中，促进早期前体的活化和发育的方法包括促进如本文所公开的细胞融合，以及在培养基中同时或按顺序地培养如本文所公开的早期前体。在一些实施方案中，促进细胞融合对于早期前体的活化和发育可能是必需的，也可能不是必需的。在一些实施方案中，促进细胞融合的步骤是任选的。

本发明的实施方案还提供了衍生自如本文公开的早期前体的活化干细胞群体。可以通过在上述活化/发育系统中培养早期前体一段有效的时间来获得活化的干细胞。在一些方面，对于活化早期前体有效的培养时间可以包括但不限于至少1小时、或至少2小时、或至少4小时、或至少12小时、或至少1天、或至少2天、或至少3天、或至少4天、或至少5天、或至少8天、或至少10天、或至少12天、或至少15天、或至少18天、或至少20天、或至少25天、或至少30天。细胞培养基可以每1天、或每2天、或每3天、或每4天、或每5或更多天更换一次。在一些实施方案中，可以通过在其他培养系统、培养基或条件中培养早期前体一段有效的时间来获得活化的干细胞。在一些实施方案中，活化的干细胞被表征为异质细胞混合物，包括以不同组的标记物为特征的细胞的各种亚群。

在一些实施方式中，可以使用其他细胞培养基和/或细胞培养条件来活化和/或培养本文公开的干细胞。在一些实施方案中，在本文公开的活化/发育系统中使用的细胞培养基和/或细胞培养条件可以用于培养其他类型的细胞和/或其他类型的干细胞。例如，在活化/发育系统中使用的细胞培养基和/或细胞培养条件可用于培养选自胚胎干细胞（ES）、造血干细胞（HSC）、间充质干细胞（MSC）、内皮干细胞（ESC）、乳腺干细胞（MaSC）、肠干细胞（ISC）、神经干细胞（NSC）、成人嗅觉干细胞（OSC）、神经嵴干细胞（NCSC） 、睾丸干细胞（TSC）和诱导性多能干细胞（iPSC）的细胞中的一种或多种。

在一些实施方案中，衍生自早期前体的活化的干细胞包括表达ABCG2的细胞群，其在早期前体中不表达。在一些方面，核酸染色剂（例如Hoechst 33342）逐渐排出到在活化/发育系统中培养的活化干细胞之外，而早期前体中的核酸染色剂在本文公开的常规培养基中不排出。

在一些实施方案中，本文还提供了衍生自早期前体的CD49f⁺/Lin^－的活化干细胞群。在一些实施方案中，活化的干细胞群体表达ABCG2。在一些实施方案中，活化的干细胞群体表达选自CD49f、ABCG2和SSEA4的一种或多种标记物，并且不表达Lin。在一些实施方案中，活化的干细胞群体表达选自CD49f、ABCG2、SSEA4和Lin28的一种或多种标记物，并且不表达Lin。在一些实施方案中，活化的干细胞群体表达选自CD49f、ABCG2、Oct4、Nanog、SSEA4、Lin28、CD44和CD105的一种或多种标记物。在一些实施方案中，活化的干细胞群体表达选自CD49f、CD73、ABCG2、Oct4、Nanog、SSEA4和CD105的一种或多种标记物。在一些实施方案中，活化的干细胞群体表达选自Lin28、CD44、CD184和CD106的一种或多种标记物。在一些实施方案中，活化的干细胞群体表达非常低水平的CD34。在一些实施方案中，本文公开的活化的干细胞群体表达一种或多种增殖标记物（例如，细胞周期蛋白D1和c-Myc）。在一些实施方案中，本文公开的活化的干细胞群体表达一种或多种细胞因子（例如，VEGF、TGF-β、HGF、IL-6和IL10）。在一些实施方案中，活化的干细胞群体不表达选自CD117、CD31、CD38、CD45、CD150、CD90和Lin的一种或多种标记物。在一些实施方案中，活化的干细胞群体不表达选自CD3、CD4、CD11b、CD14、CD19、CD8和CD41的一种或多种标记物。在一些实施方案中，本文公开的活化的干细胞群体是HLA-I^Low/HLA-II^-。在一些实施方案中，活化的干细胞群体表达一种或多种内胚层特异性标记物，例如白蛋白和α胎儿蛋白（AFP）。在一些实施方案中，活化的干细胞群体表达一种或多种中胚层特异性标记物，例如骨钙蛋白和结蛋白。在一些实施方案中，活化的干细胞群体表达一种或多种外胚层特异性标记物，例如巢蛋白。

在一些实施方案中，本文还提供了包含至少1000个人类细胞的组合物，并且至少40％的细胞是本文公开的活化干细胞。 一方面，该组合物包含至少2000个、或至少5000个、或至少10000个、或至少50000个、或至少100000个人类细胞，并且至少40％、或者至少50％、或者至少60％、或者至少70％、或者至少80％、或者至少90％、或者至少95％、或者至少98％的细胞是活化的干细胞。

在一些实施方案中，活化的干细胞群体是异质细胞群体，其包括一个或多个细胞亚群体。在一些实施方案中，本文公开的活化的干细胞的一个或多个亚群可以在体外在活化/发育系统中扩增。在一些实施方案中，活化的干细胞的亚群的倍增时间可以变化。在一些实施方案中，活化/发育系统中活化的干细胞的一个或多个亚群的倍增时间可以大于80小时、或小于75小时、或小于70小时、或小于65小时、或小于60小时、或小于55小时、或小于50小时、或小于45小时、或小于40小时、或小于35小时、或小于30小时、或小于25小时、或少于20小时、或者大约20至大约80小时、或者大约20至大约75小时、或者大约20至大约70小时、或者大约20至大约65小时、或者大约20至大约60小时、或者大约20至大约55小时、或者大约20至大约50小时、或者大约20至大约40小时、或者大约20至大约30小时、或者大约30至大约75小时、或者大约35至大约75小时、或者大约40至大约75小时、或者大约45至大约75小时、或者大约50至大约75小时、或者大约55至大约75小时、或者大约60至大约75小时、或者大约40至大约70小时、或者大约40至大约65小时、或者大约40至大约60小时、或者大约45至大约70小时、或者大约45至大约65小时、或者大约50至大约70小时、或者大约50至大约65小时、或者大约55至大约65小时。在一些实施方案中，活化的干细胞的一个或多个亚群可以在其他细胞培养系统中和/或在其他培养条件下体外扩增。

本文还提供了纯化衍生自本文公开的早期前体的活化的干细胞的亚群的方法。在一个方面，提供了一种用于纯化衍生自本文公开的早期前体的活化的干细胞的亚群的方法，所述亚群具有标记物的某些组。

在一个实施方案中，在活化/发育系统中培养一段时间（例如5-10天）后，发育了一个或多个细胞集落。在某些方面，在常规培养基（例如，含10％FBS的α-MEM培养基）中培养的早期前体不会生长和扩增，也不会发育成细胞集落。

在一些实施方案中，本文提供了分离衍生自本文公开的早期前体的细胞集落的方法。例如，可以使用克隆圆柱体拾取细胞集落。替代地，可以通过胰蛋白酶消化并从细胞培养板/培养皿上分离菌落来分离细胞菌落。应当理解，也可以采用其他方法来分离细胞集落。

本文还提供了从如本文公开的分离的集落中纯化活化的干细胞群体的方法。在一些实施方案中，诸如MACS或FACS的方法可用于从活化的干细胞中纯化特定群体或富集的细胞群体。在一些实施方案中，可以使用其他方法从活化的干细胞中纯化特定群体或富集的细胞群体。

4. 活化干细胞的分化

衍生自本文公开的早期前体的活化的干细胞群体和/或其中的各种亚群，可以使用适当的培养条件和培养基通过它们的多能性来鉴定，所述多能性例如是从所有三个胚层（外胚层、中胚层和内胚层）分化为细胞类型的能力。如本领域技术人员已知的，可以通过鉴定细胞类型特异性标记物来进行细胞分化状态的确认。

本发明提供了诱导衍生自本文公开的早期前体的活化的干细胞群体分化为外胚层谱系的方法。还提供了外胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体，其衍生自活化的干细胞群体，该活化的干细胞群体衍生自本文公开的早期前体。一方面，活化的干细胞能够分化为外胚层谱系中的至少一种细胞类型。在另一方面，活化的干细胞能够分化为外胚层谱系中的至少两种、至少三种并且增加至所有细胞类型。分化为外胚层谱系的细胞的非限制性实例包括但不限于上皮细胞、神经原性细胞和神经胶质原性细胞。

在其他方面，还提供了诱导衍生自本文公开的早期前体的活化的干细胞群体中的各种亚群分化为外胚层谱系的方法。还提供了外皮谱系中分化的细胞的组合物或群体，其衍生自活化的干细胞群体中的各种亚群，该活化的干细胞群体衍生自本文公开的早期前体。在其他方面，还提供了诱导如本文公开的活化的干细胞的亚群分化为外胚层谱系的方法。还提供了外胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体，其衍生自如本文公开的活化的干细胞的亚群。

本发明还提供了诱导衍生自本文公开的早期前体的活化的干细胞群体分化为中胚层谱系的方法。还提供了在中胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体，其衍生自活化的干细胞群体，该活化的干细胞群体衍生自本文公开的早期前体。在另一方面，活化的干细胞能够分化为中胚层谱系中的至少一种细胞类型。在另一方面，活化的干细胞能够分化为中胚层谱系中的至少两种、或至少三种、或至少四种、并增加至所有细胞类型。分化为中胚层谱系的细胞的非限制性实例包括但不限于成脂性、促生肌性、成软骨性、心源性、生皮性、造血性、血管生成性、生肌性、肾源性、泌尿生殖性、成骨性、心包性或间质细胞。

在其他方面，还提供了诱导衍生自本文公开的早期前体的活化的干细胞群体中的各种亚群分化为中胚层谱系的方法。还提供了在中胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体，其衍生自活化的干细胞群体中的各种亚群，该活化的干细胞群体衍生自本文公开的早期前体。在其他方面，还提供了诱导如本文公开的活化的干细胞的亚群分化为中胚层谱系的方法。还提供了中胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体，其衍生自如本文公开的活化的干细胞的亚群。

本公开还提供了诱导衍生自本文公开的早期前体的活化的干细胞群体分化为内胚层谱系的方法。还提供了内胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体，其衍生自活化的干细胞群体，该活化的干细胞群体衍生自本文公开的早期前体。一方面，活化的干细胞能够分化为内胚层谱系中的至少一种细胞类型。在另一方面，活化的干细胞能够分化成内胚层谱系中的至少两种、或者至少三种、或者至少四种、或者至少五种、并且增加至所有细胞类型。分化为内胚层谱系的细胞的非限制性实例包括但不限于胰腺、肝、肺、胃、肠和甲状腺中的细胞。

在其他方面，还提供了诱导衍生自本文公开的早期前体的活化的干细胞群体中的各种亚群分化为内胚层谱系的方法。还提供了内胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体，其衍生自活化的干细胞群体中的各种亚群，该活化的干细胞群体衍生自本文公开的早期前体。在其他方面，还提供了诱导如本文公开的活化的干细胞的亚群分化为内胚层谱系的方法。还提供了内胚层谱系中分化的细胞的组合物或群体，其衍生自本文公开的活化的干细胞的亚群。

5. 使用方法

本发明提供了使用衍生自如本文公开的早期前体的活化的干细胞在有需要的对象中治疗疾病的方法。在一些实施方案中，提供了使用衍生自本文公开的早期前体的活化的干细胞群体中的一个或多个亚群治疗有需要的对象中的疾病的方法。在一些实施方案中，提供了使用分化的细胞来治疗有需要的对象中的疾病的方法，所述分化的细胞衍生自活化的干细胞，所述活化的干细胞衍生自本文公开的早期前体。再生医学包括旨在帮助受损细胞、组织或器官的修复、置换或再生的疗法。本文所公开的方法可以用于再生医学中的基于细胞的疗法中。

在一些方面，本文公开的方法和组合物可以被用于治疗疾病或病症，例如，退化性疾病、增生性疾病、遗传性疾病、损伤和/或器官衰竭。疾病或病症的非限制性实施例包括神经退行性疾病、神经系统疾病（例如，认知障碍和情绪疾病）、听觉疾病（例如，耳聋）、骨质疏松症、心血管疾病、糖尿病、代谢紊乱、呼吸道疾病、药物敏感性疾病、眼部疾病（如黄斑变性）、免疫性疾病、血液疾病、肾脏疾病、增生性疾病、遗传疾病、外伤、中风、器官衰竭或肢体缺失。疾病的其他实施例包括神经退行性疾病、神经系统疾病、眼部疾病、情绪疾病、呼吸疾病、听觉疾病、心血管疾病、免疫疾病、血液疾病、代谢疾病、肾脏疾病、增殖性疾病、遗传疾病、自身免疫性疾病、药物敏感性疾病、认知障碍、抑郁症、耳聋、骨质疏松症、糖尿病、黄斑变性、肥胖症、亚历山大氏病（Alexander's disease）、阿尔珀氏病（Alper's disease）、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张症、巴顿病（Battendisease）、卡纳万病（Canavan disease）、柯凯因氏症候群（Cockayne syndrome）、皮质基底变性、克雅氏病（Creutzfeldt-Jakob disease）、亨廷顿氏病（Huntington's disease）、HIV相关痴呆、肯尼迪病（Kennedy's disease）、克拉贝病（Krabbe's disease）、路易体痴呆、马查多-约瑟夫病（Machado-Joseph disease）、多发性硬化症、多系统萎缩、发作性睡病、神经型疏螺旋体症（neuroborreliosis）、帕金森氏病、Pelizaeus-Merzbacher病、Pick病、原发性侧索硬化、朊病毒病、Refsum病、Sandhoffs病、Schilder病、继发于恶性贫血的脊髓亚急性合并变性、精神分裂症、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩症（SMA）、Steele-Richardson-Olszewski病、脊髓痨、后天性免疫缺乏、白血病、淋巴瘤、超敏反应（过敏）、严重的合并免疫缺陷、急性弥漫性脑脊髓炎、艾迪生氏病（addison's disease）、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、大疱性类天疱疮、乳糜泻、皮肌炎、1型糖尿病、2型糖尿病、肺出血肾炎综合症（Goodpasture's syndrome）、格雷夫斯病（Graves' disease）、格林-巴利综合征（Guillain-Barre syndrome）、桥本病（Hashimoto's disease）、特发性血小板减少性紫癜、红斑狼疮、重症肌无力、天疱疮、恶性贫血、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、类风湿性关节炎、干燥综合征（Sjogren's syndrome）、颞关节炎、血管炎、韦格纳氏（Wegener's）肉芽肿病、动脉瘤、心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、心肌病、钙化主动脉瓣疾病（CAVD）、脑血管意外（中风）、脑血管疾病、先天性心脏病、充血性心力衰竭、心肌炎、冠状动脉瓣膜病、心肌病、舒张功能障碍、心内膜炎、高血压、肥厚型心肌病、二尖瓣脱垂、心肌梗塞、静脉血栓栓塞、酸性脂肪酶病、、变性、Barth综合征、生物素酶缺乏症、肉碱棕榈酰转移酶缺乏症II型、桥脑中央髓鞘溶解、肌营养不良症、Farber's病、6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症、神经节苷脂沉积症、三甲基胺尿症、Lesch-Nyhan综合征、脂质贮积病、代谢性肌病、甲基丙二酸尿症、线粒体肌病、黏多醣贮积症、粘脂质贮积病、粘脂质贮积病、黏多醣贮积症、多种CoA羧化酶缺乏症、非酮性高甘氨酸血症、庞贝氏症（Pompedisease）、丙酸血症、肝糖原累积症I型、尿素循环代谢障碍、高草酸尿症、草酸盐沉积症、癌、肉瘤、生殖细胞肿瘤、母细胞瘤、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、膀胱癌、皮肤黑色素瘤、乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌。

一方面，提供了使用本文所公开的活化的干细胞或由其衍生的分化细胞来治疗有此需要的对象中的皮肤伤口的方法。一方面，提供了使用本文所公开的活化的干细胞或由其衍生的分化细胞来治疗有此需要的对象中的肝损伤的方法。一方面，提供了使用本文所公开的活化的干细胞或由其衍生的分化细胞来治疗有此需要的对象中的骨损伤或病症（例如，关节炎、骨质疏松等）的方法。一方面，提供了使用本文所公开的活化的干细胞或由其衍生的分化细胞来治疗有此需要的对象中的神经损伤或神经元退行性疾病的方法。一方面，提供了使用本文所公开的活化的干细胞或由其衍生的分化细胞来治疗有此需要的对象中的心脏组织损伤或心力衰竭的方法。一方面，提供了使用本文所公开的活化的干细胞或由其衍生的分化细胞来治疗有此需要的对象中的慢性疾病（例如，糖尿病）的方法。

一方面，提供了本文所公开的活化的或分化的细胞的自体转移方法。一方面，提供了本文所公开的活化的或分化的细胞的同种异体转移的方法。一方面，提供了本文所公开的活化的或分化的细胞的同源转移的方法。

实施例

实施例1

从成人人体组织中分离早期前体

使用以下方法从成年人类组织中分离早期前体。受试的成人人体组织包括人外周血、脐带血、骨髓和脐带等。在一个实验中，人类外周血是在加利福尼亚州斯坦福市的斯坦福血液中心收集的。所有献血者均提供了书面知情同意书。在锂肝素管（BD诊断）中收集5-10 ml人外周血，并保持在4℃下。在另一个实验中，在产科分娩期间收集了脐带血，并保持在4℃下。还收集了脐带组织并将其保持在4℃。在另一个实验中，收集骨髓用于分离人类早期前体。其他人体组织样本已成功使用。

以下方法用于从血液样品（例如外周血和脐带血）中分离早期前体。为了裂解红细胞（RBC），将采集的血液样品与人用RBC裂解缓冲液（Alfa Aesar）以1:10的比例混合，并在室温下孵育5分钟。然后将悬浮液在4℃下以3,000-15,000xg离心40分钟。将沉淀洗涤并重悬于5ml 1X PBS中，然后在4℃以3,000-15,000xg离心40分钟。除去上清液，并将包含早期前体的沉淀重悬于5 ml PBS或培养基（例如，含10％FBS的α-MEM）中以进行进一步分析，或在如下在实施例2中描述的活化/发育系统中培养。

重悬浮的沉淀物包含相对较小的细胞的富集的群体，其平均直径低于6 μm（图1）。如下所示，这些细胞中至少有很大一部分是早期前体。Hoechst 33342染色显示，这些分离的早期前体具有非常高的细胞核-细胞质比（图2，虚线箭头）。当在活化/发育系统中培养1天时，Hoechst 33342核酸染色在某些早期前体中扩散到细胞膜的外部（图2，实心箭头）。一些分离的早期前体聚集，似乎与另一些融合（图2，圈出）。使用免疫荧光（IF）和荧光激活细胞分选（FACS）分析来检查早期标记物表达的细胞标记物。结果表明，富集的小细胞群包括细胞的异质混合物。能够活化的大多数细胞表达CD49f、CD73、CD31、SSEA4、CD117、Oct4、Nanog、CD45、CD105和非常低水平的CD34。被调查但未在这些细胞上检测到的标记物包括ABCG2（活化前体细胞的标记物）和Lin（血淋巴谱系标记）、以及CD90、Lin28、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD19和CD41。

从细胞沉淀中进一步纯化或富集早期前体。按照制造商（Miltenyi Biotec Inc.San Diego, CA）推荐的方案，通过MACS或FACS富集CD49f⁺细胞级分。然后准备富集的细胞群以用于进一步分析或活化/发育系统。在另一个方法中，在活化/发育系统中培养分离的包括早期前体的相对较小的细胞，然后进行富集/纯化。

实施例2

早期前体的体外活化/发育

以下方法用于促进如以上实施例1中所述从成年人类组织获得的早期前体的活化/发育。开发了活化/发育系统以在体外激活和培养人类早期前体。

细胞融合

在培养包括从成年人类组织获得的早期前体的相对小的细胞群期间观察到细胞融合。将包含人类早期前体的细胞沉淀轻轻重悬于1 ml 50％PEG 1500中，并在室温下孵育2分钟。然后缓慢加入1 ml无血清的α-MEM，并将细胞在室温下孵育30分钟。然后将悬浮液在4℃下以3,000-15,000xg离心10分钟。除去上清液，将细胞沉淀轻轻重悬并在活化/发育系统中培养。

测试的其他细胞融合方法包括电细胞融合（或电融合）、病毒（例如仙台病毒）诱导的细胞融合、由机械张力（例如显微注射）驱动的细胞融合、和/或由强/高速离心引起的细胞融合。

体外活化/发育

为了促进细胞培养中早期前体的活化/发育，制备了活化/发育系统。该系统采用的培养基包括原代肝细胞和/或肝细胞系的细胞或细胞混合物，以及其他试剂和因子。活化/发育系统可以是使用Transwells的共培养系统，也可以使用条件培养基，如下所述。

在共培养系统中，将细胞（原代肝细胞或培养的肝细胞系、或细胞混合物）用丝裂霉素C处理2小时以使细胞有丝分裂失活。然后将细胞接种在含10％FBS的DMEM/F12中的6孔板上。接种后约十六小时，细胞粘附于孔并约80％汇合。然后将分离出的早期前体放入Transwell（24毫米插入物，Corning，Corning，New York）的上腔室中，与上述细胞在具有10％FBS的α-MEM的共培养基中共培养。分离的早期前体通过Transwell膜（0.4 μm孔径）与失活的细胞分离。使用相同的培养基，上下隔室均隔天更换一次，持续约10至20天。

以不同的方法，用原代肝细胞或培养的肝细胞系或混合物培养/调节细胞培养基。将细胞悬浮在具有10％FBS或人血清的DMEM培养基中，然后接种在细胞培养皿中。每两天从细胞培养皿中收集一次培养基，然后将新培养基添加到细胞培养皿中，直到细胞达到100％汇合。可以将在不同时间收集的培养基混合在一起，可以将其在-20℃下短期存储，或在-80℃下长期存储。使用前，将条件培养基以3000xg离心，以沉淀培养基中剩余的细胞。条件培养基也可以用0.22 μm过滤器过滤以除去剩余的细胞。然后将条件培养基与常规培养基（例如，具有10％FBS或人血清的α-MEM）以约1:3至约3:1的比率（v/v）混合。在另一个实验中，将条件培养基不混合直接用于培养分离的早期前体。将分离的早期前体轻轻重悬在上述培养基中，然后接种到培养皿或平板中。每隔一天更换一次培养基。每天在显微镜下观察细胞培养物的细胞生长和细胞集落的形成。挑选细胞集落并纯化干细胞用于进一步分析，例如，使用免疫荧光染色和FACS分析。

免疫荧光（IF）染色结果表明，在活化/发育系统中培养12天后，观察到一些早期前体之间发生了细胞融合。在包括表达Oct4的早期前体的相对较小的细胞之间（图3A，实心箭头）以及在Oct4⁺和Oct4^－细胞之间（图3A，虚线箭头）观察到了细胞融合。融合的细胞还表达SSEA1（图3B和3D）和CD34（图3C-D）。

在上述活化/发育系统中培养激活的干细胞4周后，研究其标记物表达。结果表明，衍生自实施例1的早期前体的活化的干细胞表达CD49f、CD73、CD105、Oct4、Nanog、SSEA4和ABCG2。活化的细胞还表达Lin28、CD44、CD184和CD106、以及低水平的CD34。这些活化的干细胞不表达Lin、CD117、CD31、CD38、CD45、CD150、CD90、CD3、CD4、CD11b、CD14、CD19、CD8或CD41。

在活化/发育系统中培养12天后，活化的干细胞变得比早期前体更大，并发生形状变化（图4）。在常规培养基（例如，具有10％FBS的α-MEM）中培养的早期前体不生长（图4）。在活化/发育系统中观察到了衍生自早期前体的细胞集落（参见如图5所示第5天的细胞集落）。活化的干细胞为CD49f⁺，并从集落中进一步纯化。

实施例3

增殖标记物、生长因子和细胞因子的表达

使用以下方法评估如以上实施例2中所述的活化的干细胞中增殖标记物、生长因子和细胞因子的表达水平。进行RT-PCR检测增殖标记物的表达水平，增殖标记物包括Cyclin D-1和c-Myc，以及生长因子和细胞因子，包括转化生长因子β（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、IL-6和IL10。GAPDH用作内部对照。还通过IF和其他方法评估了生长因子和细胞因子的水平。结果表明，活化的干细胞群体表达了增殖标记物Cyclin D1和c-Myc以及生长因子和细胞因子，包括VEGF、TGF-β、HGF、IL-6和IL10。活化的干细胞为HLA-I^Low/HLA-II^-，表明免疫原性低。结果进一步表明，活化的干细胞群体表达白蛋白和AFP（内胚层特异性标记）、骨钙素和结蛋白（中胚层特异性标记）和巢蛋白（外胚层特异性标记），证明了活化干细胞的多能性。

实施例4

皮肤伤口的治疗

使用下面的方法来使用实施例2中讨论的活化干细胞群来治疗皮肤伤口。

纤维蛋白凝胶支架和3-D构建体的制备

通过将纤维蛋白原和凝血酶的储备溶液解冻，并将最终浓度为12.5 mg/ml的纤维蛋白原和2.5 U/ml的凝血酶加CaCl₂（最终浓度：45 mM）在1.5 ml试管中混合，制成纤维蛋白凝胶。将200 μl混合物轻轻移液至24孔板中。使纤维蛋白原含量在37℃下2小时以形成纤维蛋白凝胶支架。实施例2中制备的活化的干细胞以每孔2.5 x 10⁵接种在24孔或48孔板上纤维蛋白凝胶支架顶部，然后在每孔0.5或1 ml的条件培养基中培养过夜。然后将细胞/支架3-D构建体准备好进行移植。在另一种方法中，将活化的干细胞与纤维蛋白原、凝血酶和条件培养基预混合，然后接种到24孔或48孔板中。在纤维蛋白凝胶形成后（例如，在约两个小时内），将0.5或1ml的条件培养基添加到每个孔中，并将细胞/支架3-D构建体培养过夜，并准备用于移植。在实验之前，还进行了流式细胞术来表征细胞/支架3-D构建体中的培养的细胞。

全层皮肤伤口的治疗

皮肤准备后，十只10-12周大的免疫缺陷（nude）雄性小鼠（Simonsen Labs）在异氟烷麻醉下在中背部皮肤上接受了直径6毫米的全层穿孔活检伤口。为了抑制伤口收缩，将由1.6 mm厚的硅胶片（Press-to-Seal Silicone Sheet JTR-S-2.0, Grace Bio-Labs,Bend, OR）制成的甜甜圈形夹板（内径10毫米，外径14毫米）放在伤口区域周围，并使用6-0尼龙缝线（6-0 Ethilon Nylon Suture, Ethicon LLC., Cornelia, GA）用八根间断缝线固定。然后将上述细胞/支架3-D构建体（约250,000个细胞/单位）移植到创面中（n = 5）。不含干细胞的纤维蛋白凝胶（仅支架）也被移植到创面中作为对照（n = 5）。将修剪过的无菌Tegaderm透明薄膜敷料（3M）连接到夹板的顶部以覆盖伤口。

皮肤伤口愈合分析

伤口产生后，每天使用固定距离的数码相机拍摄伤口的图像。为了大致评估伤口面积，通过计算当前伤口相对于原始伤口面积的百分比来分析伤口面积。当伤口面积大致等于零时，认为伤口完全闭合。

在治疗后第20天（D20）通过CO₂使小鼠安乐死。收集皮肤伤口区域和邻近组织（约2.5 cm），并在10％（v/v）的甲醛缓冲液中于4℃固定16小时以上或在液氮中速冻，然后进行石蜡包埋或冷冻切片。将样品切成5 μm厚的切片，并用苏木精和曙红（H＆E）染色以检查局部细胞变性和炎症。进行Masson三色胶原蛋白染色以评估伤口区域的组织纤维化。考虑的组织学参数是伤口闭合率、表皮细胞再生、真皮再生、纤维沉积和炎症。通过计算创面中毛囊或皮脂腺的数量来评估皮肤附件的再生。对一些石蜡皮肤切片（5 μm）进行进一步处理以进行免疫组织化学（IHC）或免疫荧光（IF）。

使用ImageJ软件分析图像以计算伤口闭合率的百分比、疤痕面积的百分比。胶原蛋白沉积分析基于红色区域（细胞结构区域）除以蓝色区域（胶原沉积）。使用配对的双尾学生t检验对两组进行比较，以进行统计分析。 p <0.05的值被认为具有统计学意义。

糖尿病皮肤伤口的治疗

使用糖尿病小鼠（db/db, Jackson Labs）研究上述细胞/支架3-D构建体的伤口愈合作用。皮肤准备后，在异氟烷麻醉下，使用十只6个月以上（体重60-80g）的糖尿病小鼠在中背皮肤上形成慢性伤口。 然后将上述细胞/支架3-D构建体（约250,000个细胞/构建体）移植到创面中（n=5）。 没有干细胞的纤维蛋白凝胶（仅支架）也被移植到创面中作为对照（n= 5）。 伤口产生后每天拍摄伤口的照相图像，并如上所述进行评估。在治疗后第65天（D65），通过CO₂对糖尿病小鼠实施安乐死。如上所述收集皮肤伤口区域和邻近组织用于组织学分析和评估治疗功效。

结果

为了研究实施例2中制备的这些活化的干细胞在伤口愈合中的治疗潜力，创建了3-D细胞/支架构建体并将其应用于免疫缺陷小鼠的全层皮肤伤口。活化的干细胞接种在预制的血纤蛋白凝胶上（或预混在血纤蛋白凝胶中），并在移植前培养过夜，表现出细胞生长强劲，并在血纤蛋白凝胶上汇合。

治疗组（具有细胞/支架3-D构建体）表现出显著减少的闭合时间、疤痕面积和创面内部增强的血管生成（图6）。形态学图像分析表明，使用3-D构建体进行治疗最早可在创面后第5天显著改善伤口恢复，并在第6天变得更加明显。累积图像分析显示，与对照组相比，治疗后创面愈合具有统计学上的显著改善。在第10天，所有使用3-D构建体治疗的伤口均已闭合，而对照组中的伤口仍开放至第15天。

组织学评估显示，在处死的最后一天（第20天），与对照组相比，治疗组中动物伤口的再上皮化增强。与对照组相比，伤口的表面积或疤痕区域明显更小。所有处理过的动物的皮肤均表现出表皮和真皮的几乎正常的组织学结构。

在糖尿病皮肤伤口模型中，结果显示了用细胞/支架3-D构建体治疗的糖尿病小鼠中伤口的加速愈合。组织学评估显示，在处死最后一天时，与对照组相比，治疗组小鼠的伤口再上皮化和皮肤结构恢复增强。相比之下，对照组的伤口仅被角质化的表皮层封闭，而没有皮下组织和肌肉组织。

Claims (60)

1.一种制备细胞群的方法，包括：

（1）从血液样品中移除至少一部分红细胞；

（2）将样品以3,000xg-15,000xg进行离心，并得到沉淀。

（3）将沉淀中的细胞悬浮在溶液中；以及

（4）富集溶液中的CD49f⁺细胞，

其中溶液中至少40％的细胞是表达CD49f且直径小于6 µm的CD49f⁺细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品以大于5,000xg进行离心。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品以大于6,000xg进行离心。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品以大于7,000xg进行离心。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述CD49f⁺细胞的特征还在于为SSEA4阳性。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述CD49f⁺细胞的特征还在于为ABCG2和Lin阴性。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述CD49f⁺细胞的特征还在于为CD73和CD45阳性，并且为CD4和Lin28阴性。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述CD49f⁺细胞进一步表达选自Oct4、Nanog、CD31、CD117和CD105的一种或多种标记物。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述CD49f⁺细胞不表达选自CD3、CD4、CD8、CD11b和CD41的一种或多种标记物。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中溶液中至少50％的细胞是CD49f⁺细胞。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中溶液中至少60％的细胞是CD49f⁺细胞。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中溶液中少于20％的细胞是红细胞。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述CD49f⁺细胞的直径小于5 μm。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述CD49f⁺细胞的直径为约2 μm至约5 μm。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述CD49f⁺细胞的细胞核与细胞质之比（v/v）为至少约9:1、或至少约8:1、或至少约7:1、或至少约6:1、或至少约5:1。

16.一种包含至少1000个细胞的组合物，其中至少40％的细胞是表达CD49f且直径小于6 µm的CD49f⁺细胞。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述CD49f⁺细胞的特征还在于为SSEA4阳性。

18.根据权利要求16或17所述的组合物，其中所述CD49f⁺细胞的特征还在于为ABCG2和Lin阴性。

19.根据权利要求16-18中任一项所述的组合物，其中所述CD49f⁺细胞的特征还在于为CD73和CD45阳性，并且为CD4和Lin28阴性。

20.根据权利要求16-19中任一项所述的组合物，其中所述CD49f⁺细胞进一步表达选自Oct4、Nanog、CD31、CD117和CD105的一种或多种标记物。

21.根据权利要求16-20中任一项所述的组合物，其中所述CD49f⁺细胞不表达选自CD3、CD4、CD8、CD11b和CD41的一种或多种标记物。

22.根据权利要求16-21中任一项所述的组合物，其中至少50％的细胞是CD49f⁺细胞。

23.根据权利要求16-21中任一项所述的组合物，其中至少60％的细胞是CD49f⁺细胞。

24.根据权利要求16-23中任一项所述的组合物，其包含至少10,000个细胞。

25.根据权利要求16-24中任一项所述的组合物，其中少于20％的细胞是红细胞。

26.根据权利要求16-25中任一项所述的组合物，其中所述CD49f⁺细胞的直径小于5 μm。

27.根据权利要求16-25中任一项所述的组合物，其中所述CD49f⁺细胞的直径为约2 μm至约5 μm。

28.根据权利要求16-27中任一项所述的组合物，其中所述CD49f⁺细胞的细胞核与细胞质之比（v/v）为至少约9:1、或至少约8:1、或至少约7:1、或至少约6:1、或至少约5:1。

29.根据权利要求16-28中任一项所述的组合物，其中所述CD49f⁺细胞被包含一种或多种因子的培养基激活，其中激活的细胞表达ABCG2。

30.一种培养人类细胞的方法，包括

在培养基中培养多个人类细胞，所述培养基与选自原代肝细胞和肝细胞系的至少一个接触或已被用其进行了培养。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述细胞（a）直径小于6 μm，并且（b）是CD49f⁺细胞。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞的特征还在于为SSEA4阳性。

33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述CD49f⁺细胞的特征还在于为ABCG2和Lin阴性。

34.根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述细胞在培养后表达ABCG2。

35.根据权利要求30-34中任一项所述的方法，其中所述培养至少持续一小时。

36.根据权利要求30-35中任一项所述的方法，其进一步包括在培养之前和/或期间促进细胞融合。

37.根据权利要求30-36中任一项所述的方法，其中所述人类细胞包括选自以下的至少一种：胚胎干（ES）细胞，造血干细胞（HSC），间充质干细胞（MSC），内皮干细胞（ESC），乳腺干细胞（MaSC），肠干细胞（ISC），神经干细胞（NSC），成体嗅觉干细胞（OSC），神经嵴干细胞（NCSC），睾丸干细胞（TSC）以及诱导多能干细胞（iPSC）。

38.根据权利要求30-37中任一项所述的方法，其中所述肝细胞系包括衍生自肝癌的细胞系、永生化肝细胞、从转基因动物分离的永生肝细胞、肝细胞/肝癌杂交细胞、基因工程肝细胞、肝祖细胞、或其组合。

39.根据权利要求30-38中任一项所述的方法，其中所述培养基与至少原代肝细胞和一种或多种选自肝细胞系的接触或已被用其进行了培养。

40.根据权利要求30-38中任一项所述的方法，其中所述培养基与至少原代肝细胞接触或已被用其进行了培养。

41.根据权利要求30-38中任一项所述的方法，其中所述培养基与至少一种或多种选自肝细胞系的接触或已被用其进行了培养。

42.根据权利要求30-38中任一项所述的方法，其中所述培养基同时或依次与选自原代肝细胞和肝细胞系的至少两种接触或已被用其进行了培养。

43.一种分离的人类细胞，其表达CD49f，并且不表达Lin。

44.根据权利要求43所述的分离的人类细胞，其特征还在于为ABCG2阳性。

45.根据权利要求43或44所述的分离的人类细胞，其特征还在于为SSEA4阳性。

46.根据权利要求43-45中任一项所述的分离的人类细胞，其还表达选自Oct4、Nanog、Lin28、CD73和CD105的一种或多种标记。

47.根据权利要求43-46中任一项所述的分离的人类细胞，其为CD45、CD14和/或CD19阴性。

48.根据权利要求43-47中任一项所述的分离的人类细胞，其中所述细胞在包含一种或多种因子的培养基中培养一段时间后，发展成集落。

49.权利要求43-48中任一项所述的细胞的群体。

50.一种组合物，其包含权利要求43-48中任一项所述的细胞。

51.一种衍生自人类细胞的干细胞群，所述人类细胞（a）直径小于6 µm，（b）表达CD49f，并且（c）不表达ABCG2，其中所述干细胞群表达ABCG2 ，并且是异质细胞群。

52.一种组合物，其包含权利要求51所述的干细胞群和药学上可接受的载体或赋形剂。

53.一种细胞群，其分化自权利要求51所述的干细胞群。

54.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或赋形剂中的权利要求53的分化细胞。

55.一种在有需要的人类对象中治疗疾病或病症的方法，包括向所述人类对象施用有效量的权利要求52或54所述的组合物。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述疾病或病症选自退行性疾病、增生性疾病、遗传性疾病、损伤、以及器官衰竭。

57.一种包含至少1000个细胞的组合物，其中至少40％的细胞表达CD49f和ABCG2，并且不表达Lin。

58.根据权利要求57所述的组合物，其中所述至少40％的细胞的特征还在于为CD73和/或SSEA4阳性。

59.根据权利要求57或58所述的组合物，其中所述至少40％的细胞的特征还在于为Oct4、Nanog和/或CD105阳性。

60.根据权利要求57-59中任一项所述的组合物，其包含至少10,000个细胞。

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