JP2001181205A - 樹状細胞と腫瘍細胞を用いた腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチンの製造方法 - Google Patents
樹状細胞と腫瘍細胞を用いた腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチンの製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトの樹状細胞を用いた、腫瘍特異性の細胞
性ワクチンの製造方法を提供する。 【解決手段】 （ａ）患者から腫瘍特異的抗原を提供す
る腫瘍細胞及び樹状細胞または樹状細胞前駆体を分離す
る段階と、（ｂ）分離された前記腫瘍細胞及び前記樹状
細胞または前記樹状細胞前駆体から分化誘導された樹状
細胞を融合した樹状細胞−癌細胞ハイブリッドを製作す
る段階とを含むことを特徴とする腫瘍特異的抗腫瘍細胞
性ワクチンの製造方法である。
性ワクチンの製造方法を提供する。 【解決手段】 （ａ）患者から腫瘍特異的抗原を提供す
る腫瘍細胞及び樹状細胞または樹状細胞前駆体を分離す
る段階と、（ｂ）分離された前記腫瘍細胞及び前記樹状
細胞または前記樹状細胞前駆体から分化誘導された樹状
細胞を融合した樹状細胞−癌細胞ハイブリッドを製作す
る段階とを含むことを特徴とする腫瘍特異的抗腫瘍細胞
性ワクチンの製造方法である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、樹状細胞を用いた
各種の腫瘍に特異的な細胞性ワクチンの製造方法に関す
るものである。
各種の腫瘍に特異的な細胞性ワクチンの製造方法に関す
るものである。
【０００２】
【従来の技術】樹状細胞（dendritic cell;ＤＣ）は、
骨髄由来であり、現在知らされているもののうち最も強
力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、単球やＢリンパ球
とは異なりＴリンパ球を活性化させる必須細胞である。
これらは、血液、骨髄、リンパ節、皮膚、中枢神経系な
ど、外部物質と頻繁に接触する組織と器官に散在してい
る、多様な発逹段階にある細胞群の通称である（参考文
献１〜３）。この細胞は、接触過敏反応、組織移植拒否
反応、病原性微生物に対する免疫反応でＴリンパ球を活
性化させるなど、一次免疫反応を誘導する免疫反応の開
始細胞と見なされている（参考文献３〜６）。腫瘍部位
で樹状細胞が発見されることがあり（参考文献７）、腫
瘍に浸透した樹状細胞が発見される場合、予後が良好と
の報告がある（参考文献８）。よって、樹状細胞は腫瘍
の抑制や退治において重要であることがわかる。完全に
は解明されていないが、これらは抗原を提示するだけで
はなく、Ｔリンパ球の活性に必要な全ての補助活性因子
を提供する。このように、樹状細胞が免疫反応の調節に
中枢的な役割を担うことを考慮すれば、腫瘍の治療だけ
でなくＴ細胞反応が問題となるアレルギー性疾患、自家
免疫疾患、感染性疾患などの様々な疾患及びワクチンの
開発等で樹状細胞を用いることが可能である。
骨髄由来であり、現在知らされているもののうち最も強
力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、単球やＢリンパ球
とは異なりＴリンパ球を活性化させる必須細胞である。
これらは、血液、骨髄、リンパ節、皮膚、中枢神経系な
ど、外部物質と頻繁に接触する組織と器官に散在してい
る、多様な発逹段階にある細胞群の通称である（参考文
献１〜３）。この細胞は、接触過敏反応、組織移植拒否
反応、病原性微生物に対する免疫反応でＴリンパ球を活
性化させるなど、一次免疫反応を誘導する免疫反応の開
始細胞と見なされている（参考文献３〜６）。腫瘍部位
で樹状細胞が発見されることがあり（参考文献７）、腫
瘍に浸透した樹状細胞が発見される場合、予後が良好と
の報告がある（参考文献８）。よって、樹状細胞は腫瘍
の抑制や退治において重要であることがわかる。完全に
は解明されていないが、これらは抗原を提示するだけで
はなく、Ｔリンパ球の活性に必要な全ての補助活性因子
を提供する。このように、樹状細胞が免疫反応の調節に
中枢的な役割を担うことを考慮すれば、腫瘍の治療だけ
でなくＴ細胞反応が問題となるアレルギー性疾患、自家
免疫疾患、感染性疾患などの様々な疾患及びワクチンの
開発等で樹状細胞を用いることが可能である。
【０００３】現在、世界的に多数の研究所で樹状細胞を
用いた細胞ベースのワクチンの開発が進行しつつある。
その代表的な方法として、（ａ）腫瘍細胞の腫瘍特異的
タンパク質を樹状細胞培養液に添加する方法（参考文献
９、１０）、（ｂ）腫瘍特異的ペプチド抗原を樹状細胞
培養液に添加する方法、（ｃ）腫瘍細胞を破砕した後、
得られた破砕液を樹状細胞培養液に添加する方法、
（ｄ）腫瘍特異的抗原の遺伝子を樹状細胞遺伝子に導入
する等の手法により、腫瘍特異的抗原を樹状細胞のＭＨ
ＣクラスＩまたはクラスII分子に組み込む方法、および
（ｅ）腫瘍細胞を樹状細胞と共に培養して抗原を共有さ
せた後、樹状細胞を利用する方法などがある（参考文献
８）。また、一部の血液腫瘍の場合、（ｆ）腫瘍細胞を
樹状細胞に分化するように誘導して腫瘍細胞自体をワク
チンとして利用しようという試みがある（参考文献１１
〜１５）。
用いた細胞ベースのワクチンの開発が進行しつつある。
その代表的な方法として、（ａ）腫瘍細胞の腫瘍特異的
タンパク質を樹状細胞培養液に添加する方法（参考文献
９、１０）、（ｂ）腫瘍特異的ペプチド抗原を樹状細胞
培養液に添加する方法、（ｃ）腫瘍細胞を破砕した後、
得られた破砕液を樹状細胞培養液に添加する方法、
（ｄ）腫瘍特異的抗原の遺伝子を樹状細胞遺伝子に導入
する等の手法により、腫瘍特異的抗原を樹状細胞のＭＨ
ＣクラスＩまたはクラスII分子に組み込む方法、および
（ｅ）腫瘍細胞を樹状細胞と共に培養して抗原を共有さ
せた後、樹状細胞を利用する方法などがある（参考文献
８）。また、一部の血液腫瘍の場合、（ｆ）腫瘍細胞を
樹状細胞に分化するように誘導して腫瘍細胞自体をワク
チンとして利用しようという試みがある（参考文献１１
〜１５）。
【０００４】このような方法に関して、以下のような問
題がある。まず第１に十分な量の樹状細胞を確保しなけ
ればならない。この問題について、既に多数の研究者に
よってその解決方法が開発されている（参考文献１６〜
１９）。しかしながら、これらの方法は、原料が豊富に
得られない等の点で問題がある。
題がある。まず第１に十分な量の樹状細胞を確保しなけ
ればならない。この問題について、既に多数の研究者に
よってその解決方法が開発されている（参考文献１６〜
１９）。しかしながら、これらの方法は、原料が豊富に
得られない等の点で問題がある。
【０００５】次に、前記（ｃ）の方法を除いて、腫瘍特
異的抗原の分離、同定および遺伝子合成などに適合する
複雑な、場合によると不可能に近い条件を充足させるこ
とが必要である。
異的抗原の分離、同定および遺伝子合成などに適合する
複雑な、場合によると不可能に近い条件を充足させるこ
とが必要である。
【０００６】さらに前記（ａ）〜（ｃ）において、外部
から注入される抗原の大部分は、ＣＤ８、Ｔリンパ球が
媒介する免疫反応を導くＭＨＣクラスＩ分子へ結合する
ことなく、細胞内取り込みを介してＭＨＣクラスIIによ
りＣＤ４、Ｔ細胞に提示される点で問題がある。
から注入される抗原の大部分は、ＣＤ８、Ｔリンパ球が
媒介する免疫反応を導くＭＨＣクラスＩ分子へ結合する
ことなく、細胞内取り込みを介してＭＨＣクラスIIによ
りＣＤ４、Ｔ細胞に提示される点で問題がある。
【０００７】一方で、樹状細胞が分化（または成熟）の
どの段階にあるかに応じて、Ｔリンパ球に接触できる場
所のリンパ節への移動能力が変化し、免疫反応の方向性
も決定されることから、最終的に樹状細胞が抗原提示細
胞として機能するためには非常に複雑な分化過程を経な
ければならない。場合に応じては、抗原の細胞内取り込
みとプロセシングの機能と補助活性因子の発現有無によ
って、免疫システムの活性化の代わりに免疫寛容を誘導
する可能性があるために分化を適切に調節する必要があ
る。これまでに、骨髄（参考文献９、２０〜２３）また
は臍帯血（参考文献２４、２５）から分離したＣＤ３４
陽性造血細胞、末梢血液の単球（参考文献２６〜２
８）、可動化されたＣＤ３４陰性細胞（参考文献２
９）、好中球（参考文献１４）等から樹状細胞への分化
を誘導する方法も開示されている。しかしながら、これ
らの方法は目的通りに分化誘導させることが難しい等の
問題がある。
どの段階にあるかに応じて、Ｔリンパ球に接触できる場
所のリンパ節への移動能力が変化し、免疫反応の方向性
も決定されることから、最終的に樹状細胞が抗原提示細
胞として機能するためには非常に複雑な分化過程を経な
ければならない。場合に応じては、抗原の細胞内取り込
みとプロセシングの機能と補助活性因子の発現有無によ
って、免疫システムの活性化の代わりに免疫寛容を誘導
する可能性があるために分化を適切に調節する必要があ
る。これまでに、骨髄（参考文献９、２０〜２３）また
は臍帯血（参考文献２４、２５）から分離したＣＤ３４
陽性造血細胞、末梢血液の単球（参考文献２６〜２
８）、可動化されたＣＤ３４陰性細胞（参考文献２
９）、好中球（参考文献１４）等から樹状細胞への分化
を誘導する方法も開示されている。しかしながら、これ
らの方法は目的通りに分化誘導させることが難しい等の
問題がある。
【０００８】＜参考文献＞ 1. Steinman,R.M.1991.The dendritic cell system and
its role in immunogenicity.Ann.Rev.Immunol.9:271. 2. Schuler,G.,andR.M.Steinman.1997.Dendritic cells
as adjuvants for immune-mediated resistance to tu
mors.J.Exp.Med.186:1183. 3. Banchereau,J.,andR.M.Steinman.1998.Dendritic ce
lls and the control ofimmunity.Nature392:245. 4. Steinman,R.M.,M.Pack,and K.Inaba.1997.Dendritic
cells in the T-cell areas of lymphoid organs.Immu
nol.Rev.156:25. 5. Bieber,T.1997.FceRI-expressing antigen-presenti
ng cells:new players in the atopic game.Immunol.To
day18:311. 6. Sallusto,F.,andA.Lanzavecchia.1999.Mobilizing d
endritic cells for tolerance,priming,and chronic i
nflammation.J.Exp.Med.189:611. 7. Chaux,P.,A.Hammann,F.Martin,and M.Martin.1993.S
urface phenotype and functions of tumor-infiltrati
ng dendritic cells:CD8 expression by a cellsubpopu
lation.Eur.J.Immunol.23:2517. 8. Celluzzi,C.M.,andJ.L.D.Falo.1998.Physical inter
action between dendritic cells and tumor cells res
ults in an immunogen that induces protectiveand th
erapeutic tumor rejectionb.J.Immunol.160:3081. 9. Porgador,A.,D.Snyder,and E.Gilboa.1996.Inductio
n of antitumor immunity using bone marrow-generate
d dendritic cells.J.Immunol.156: 2918. 10. Young,J.W.,andK.Inaba.1996.Dendritic cells as
adjuvants for class Imajor histocompatibility comp
lex-restricted antitumor immunity.J.Exp. Med.183:
7. 11. Santiago-Schwarz,F.,D.L.Coppock,A.A.Hindenbur
g,andJ.Kern.1994. Identification of a maliganant c
ounterpart of the monocyte-dendritic cell progenit
or in an acute myeloid leukemia.Blood84:3054. 12. Cao,X.,Y.Zhao,Y.Yu,Y.Wang,M.Zhang,W.Zhang,and
J.Wang.1998.Granyl ocyte-macrophage colony-stimula
ting factor induces the differentiati on of murine
erythroleukemia cells into dendritic cells.Immuno
l.95:141. 13. Grouard,G.,M.-C.Rissoan,L.Filgueira,I.Durand,
J.Banchereau,and Y.-J.Liu.1997.The enigmatic plasm
acytoid T cells develop into dendritic cellswith i
nterleukin(IL)-3 and CD40-ligand.J.Exp.Med. 185:11
01. 14. Oehler,L.,O.Majdic,W.F.Pickl,J.Stockl,E.Riedl,
J.Drach,K.Rappers berger,K.Geissler,and W.Knapp.19
98.Neutrophil granulocyte-committed cells can be d
riven to acquire dendritic cell characteristics.J.
Exp.Med. 187:1019. 15. Choudhury,B.A.,J.C.Liang,E.K.Thomas,L.Flores-R
omo,Q.S.Xie,K.Agu sala,S.Sutaria,I.Sinha,R.E.Champ
lin,and D.F.Claxton.1999.Dendritic cells derived i
n vitro from acute myelogenous leukemia cells stim
ulate autologousantileukemic T-cell responses.Bloo
d 93:780. 16. Santiago-Schwarz,F.,E.Belilos,B.Diamond,andS.
E.Carsons.1992.TNF in combination with GM-CSF enha
nces the differentiation of neonatal cord blood st
em cells into dendritic cells and macrophages.J.Le
uk.Biol. 52:274. 17. Caux,C.,C.Dezutter-Dambuyant,D.Schimitt,andJ.B
anchereau.1992. GM-CSFand TNF-α cooperate in the
generation of dendritic Langerhans cells.Nature 36
0:258. 18. Peters,J.H.,R.Gieseler,B.Thiele,and F.Steinbac
h.1996.Dendritic cells:from ontogenetic orphans to
myelomonocytic descendants.Immunol. Today 17:273. 19. Thurner,B.,C.Roder,D.Dieckmann,M.Heuer,M.Krus
e,A.Glaser,P.Keika voussi,E.Kampgen,A.Bender,and
G.Schuler.1999.Generation of large numbers offully
mature and stable dendritic cells from leukaphere
sis products forclinical application.J.Immunol.Met
hods 223:1. 20. Reid,C.D.L.,P.R.Fryer,C.Clifford,A.Kirk,J.Tike
rpae,and S.C.Knig ht.1990.Identification of hemato
poietic progenitors of macrophages and dendritic L
angerhans cells(DL-CFU) in human bone marrow and p
eripheral blood.Blood 76:1139. 21. Szabolcs,P.,M.A.S.Moore,and J.W.Young.1995.Exp
ansion of immunosti mulatory dendritic cells among
the myeloid progeny of human CD34+bone marrow pre
cursors cultured with c-kit ligand,granulocyte-mac
rophage colony-stimulating factor,and TNF- α.J.Im
munol.154:5851. 22. Siena,S.,M.Di Nicola,M.Bregni,R.Mortarini,A.An
ichini,L.Lombardi, F.Ravagnani,G.Parmiani,and A.M.
Gianni.1995.Massive ex vivo generation of function
al dendritic cells from mobilized CD34+blood proge
nitors for anticancer therapy.Exp.Heamatol.23:146
3. 23. Galy,A.,F.Morel,B.Hill,and B.P.Chen.1998.Hemat
opoietic progenit or cells of lymphocytes and dend
ritic cells. J.Immunother.21:132. 24. Min,Y.H.,S.T.Lee,K.M.Choi,S.Y.Chong,H.O.Kim,J.
S.Hahn,and Y.W.Ko. 1998.Ex vivo generation of func
tional dendritic cells from mobilized CD34+hematop
oietic stem cells.Yonsei Med.J.39:328. 25. Bykovskaja,S.N.,M.J.Buffo,M.Bunker,H.Zhang,A.M
ajors,M.Herbert,A. Lokshin,M.L.Levitt,A.Jaja,D.Sca
lise,D.Kosiban,and C.Evans. 1998.Inte rleukin-2 in
duces development of dendritic cells from cord blo
od CD34+cells.J.Leuk.Biol.63:620. 26. Romani,N.,D.Reider,M.Heuer,S.Ebner,E.Kampgen,
B.Eibl,D.Niederwie ser,and G.chuler.1996.Generatio
n of mature dendritic cells from human blood:An im
proved method with special regard to clinical appl
icability.J.Immunol.Methods 196:137. 27. Chapuis,F.,M.Rosenzwajg,M.Yagello,M.Ekman,P.Bi
berfeld,and J.C.Gl uckman.1997.Differentiation of
human dendritic cells from monocytes in vitro.Eur.
J.Immunol.27:431. 28. Goxe,B.,N.Latour,J.Bartholeyns,J.L.Romet-Lemon
ne,and M.Chokri. 1998.Monocyte-derived dendritic c
ells:Development of a cellular processor forclinic
al applications.Res.Immunol.149:643. 29. Choi,D.,M.Perrin,S.Hoffmann,A.E.Chang,V.Ratana
tharathorn,J.Uber ti,K.T.McDonagh,and J.J.Mule.199
8.Dendritic cell-based vaccines in the setting of
peripheral blood stem cell transplantation: CD34+c
ell-depleted mobilized peripheral blood can serve
as a source of potent dendritic cells.Clin.Cancer
Res.4:2709. 30. Olsson,L.,andH.S.Kaplan.1983.Human-human monoc
lonal antibody- producing hybridomas:Technical asp
ects.Methods Enzymol.92:3.
its role in immunogenicity.Ann.Rev.Immunol.9:271. 2. Schuler,G.,andR.M.Steinman.1997.Dendritic cells
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mors.J.Exp.Med.186:1183. 3. Banchereau,J.,andR.M.Steinman.1998.Dendritic ce
lls and the control ofimmunity.Nature392:245. 4. Steinman,R.M.,M.Pack,and K.Inaba.1997.Dendritic
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nol.Rev.156:25. 5. Bieber,T.1997.FceRI-expressing antigen-presenti
ng cells:new players in the atopic game.Immunol.To
day18:311. 6. Sallusto,F.,andA.Lanzavecchia.1999.Mobilizing d
endritic cells for tolerance,priming,and chronic i
nflammation.J.Exp.Med.189:611. 7. Chaux,P.,A.Hammann,F.Martin,and M.Martin.1993.S
urface phenotype and functions of tumor-infiltrati
ng dendritic cells:CD8 expression by a cellsubpopu
lation.Eur.J.Immunol.23:2517. 8. Celluzzi,C.M.,andJ.L.D.Falo.1998.Physical inter
action between dendritic cells and tumor cells res
ults in an immunogen that induces protectiveand th
erapeutic tumor rejectionb.J.Immunol.160:3081. 9. Porgador,A.,D.Snyder,and E.Gilboa.1996.Inductio
n of antitumor immunity using bone marrow-generate
d dendritic cells.J.Immunol.156: 2918. 10. Young,J.W.,andK.Inaba.1996.Dendritic cells as
adjuvants for class Imajor histocompatibility comp
lex-restricted antitumor immunity.J.Exp. Med.183:
7. 11. Santiago-Schwarz,F.,D.L.Coppock,A.A.Hindenbur
g,andJ.Kern.1994. Identification of a maliganant c
ounterpart of the monocyte-dendritic cell progenit
or in an acute myeloid leukemia.Blood84:3054. 12. Cao,X.,Y.Zhao,Y.Yu,Y.Wang,M.Zhang,W.Zhang,and
J.Wang.1998.Granyl ocyte-macrophage colony-stimula
ting factor induces the differentiati on of murine
erythroleukemia cells into dendritic cells.Immuno
l.95:141. 13. Grouard,G.,M.-C.Rissoan,L.Filgueira,I.Durand,
J.Banchereau,and Y.-J.Liu.1997.The enigmatic plasm
acytoid T cells develop into dendritic cellswith i
nterleukin(IL)-3 and CD40-ligand.J.Exp.Med. 185:11
01. 14. Oehler,L.,O.Majdic,W.F.Pickl,J.Stockl,E.Riedl,
J.Drach,K.Rappers berger,K.Geissler,and W.Knapp.19
98.Neutrophil granulocyte-committed cells can be d
riven to acquire dendritic cell characteristics.J.
Exp.Med. 187:1019. 15. Choudhury,B.A.,J.C.Liang,E.K.Thomas,L.Flores-R
omo,Q.S.Xie,K.Agu sala,S.Sutaria,I.Sinha,R.E.Champ
lin,and D.F.Claxton.1999.Dendritic cells derived i
n vitro from acute myelogenous leukemia cells stim
ulate autologousantileukemic T-cell responses.Bloo
d 93:780. 16. Santiago-Schwarz,F.,E.Belilos,B.Diamond,andS.
E.Carsons.1992.TNF in combination with GM-CSF enha
nces the differentiation of neonatal cord blood st
em cells into dendritic cells and macrophages.J.Le
uk.Biol. 52:274. 17. Caux,C.,C.Dezutter-Dambuyant,D.Schimitt,andJ.B
anchereau.1992. GM-CSFand TNF-α cooperate in the
generation of dendritic Langerhans cells.Nature 36
0:258. 18. Peters,J.H.,R.Gieseler,B.Thiele,and F.Steinbac
h.1996.Dendritic cells:from ontogenetic orphans to
myelomonocytic descendants.Immunol. Today 17:273. 19. Thurner,B.,C.Roder,D.Dieckmann,M.Heuer,M.Krus
e,A.Glaser,P.Keika voussi,E.Kampgen,A.Bender,and
G.Schuler.1999.Generation of large numbers offully
mature and stable dendritic cells from leukaphere
sis products forclinical application.J.Immunol.Met
hods 223:1. 20. Reid,C.D.L.,P.R.Fryer,C.Clifford,A.Kirk,J.Tike
rpae,and S.C.Knig ht.1990.Identification of hemato
poietic progenitors of macrophages and dendritic L
angerhans cells(DL-CFU) in human bone marrow and p
eripheral blood.Blood 76:1139. 21. Szabolcs,P.,M.A.S.Moore,and J.W.Young.1995.Exp
ansion of immunosti mulatory dendritic cells among
the myeloid progeny of human CD34+bone marrow pre
cursors cultured with c-kit ligand,granulocyte-mac
rophage colony-stimulating factor,and TNF- α.J.Im
munol.154:5851. 22. Siena,S.,M.Di Nicola,M.Bregni,R.Mortarini,A.An
ichini,L.Lombardi, F.Ravagnani,G.Parmiani,and A.M.
Gianni.1995.Massive ex vivo generation of function
al dendritic cells from mobilized CD34+blood proge
nitors for anticancer therapy.Exp.Heamatol.23:146
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opoietic progenit or cells of lymphocytes and dend
ritic cells. J.Immunother.21:132. 24. Min,Y.H.,S.T.Lee,K.M.Choi,S.Y.Chong,H.O.Kim,J.
S.Hahn,and Y.W.Ko. 1998.Ex vivo generation of func
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oietic stem cells.Yonsei Med.J.39:328. 25. Bykovskaja,S.N.,M.J.Buffo,M.Bunker,H.Zhang,A.M
ajors,M.Herbert,A. Lokshin,M.L.Levitt,A.Jaja,D.Sca
lise,D.Kosiban,and C.Evans. 1998.Inte rleukin-2 in
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od CD34+cells.J.Leuk.Biol.63:620. 26. Romani,N.,D.Reider,M.Heuer,S.Ebner,E.Kampgen,
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n of mature dendritic cells from human blood:An im
proved method with special regard to clinical appl
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human dendritic cells from monocytes in vitro.Eur.
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ells:Development of a cellular processor forclinic
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8.Dendritic cell-based vaccines in the setting of
peripheral blood stem cell transplantation: CD34+c
ell-depleted mobilized peripheral blood can serve
as a source of potent dendritic cells.Clin.Cancer
Res.4:2709. 30. Olsson,L.,andH.S.Kaplan.1983.Human-human monoc
lonal antibody- producing hybridomas:Technical asp
ects.Methods Enzymol.92:3.
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
に鑑みなされたものであり、その目的は、樹状細胞を用
いて免疫システムを刺激して腫瘍及び転移性腫瘍の治療
を可能にする腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチンの製造方
法を提供することである。そこで、本発明において、
（ａ）腫瘍細胞と樹状細胞との融合、（ｂ）腫瘍細胞と
樹状細胞との近接（共同）培養、または（ｃ）腫瘍細胞
抽出物を添加された樹状細胞の培養によって、腫瘍抗原
が樹状細胞により免疫システムに提示されるようにする
３種の方法を開示する。
に鑑みなされたものであり、その目的は、樹状細胞を用
いて免疫システムを刺激して腫瘍及び転移性腫瘍の治療
を可能にする腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチンの製造方
法を提供することである。そこで、本発明において、
（ａ）腫瘍細胞と樹状細胞との融合、（ｂ）腫瘍細胞と
樹状細胞との近接（共同）培養、または（ｃ）腫瘍細胞
抽出物を添加された樹状細胞の培養によって、腫瘍抗原
が樹状細胞により免疫システムに提示されるようにする
３種の方法を開示する。
【００１０】また、本発明の他の目的は、患者から分離
したＴリンパ球を体外から腫瘍抗原を提示する樹状細胞
で活性化させた後、前記活性化されたＴリンパ球を再び
患者の体内に投与するための、腫瘍特異的抗腫瘍細胞性
ワクチンを提供することである。
したＴリンパ球を体外から腫瘍抗原を提示する樹状細胞
で活性化させた後、前記活性化されたＴリンパ球を再び
患者の体内に投与するための、腫瘍特異的抗腫瘍細胞性
ワクチンを提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、腫瘍に対
するＴリンパ球の活性を誘導するために樹状細胞を用い
る方法を研究した結果、（１）患者から獲得した樹状細
胞の前駆体を樹状細胞に分化させ、これらを腫瘍細胞と
融合する、もしくは（２）腫瘍細胞と近接（共同）培養
する、または、（３）腫瘍抽出物を樹状細胞培地に添加
し、これらを該患者に投与すると腫瘍免疫が誘導できる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
するＴリンパ球の活性を誘導するために樹状細胞を用い
る方法を研究した結果、（１）患者から獲得した樹状細
胞の前駆体を樹状細胞に分化させ、これらを腫瘍細胞と
融合する、もしくは（２）腫瘍細胞と近接（共同）培養
する、または、（３）腫瘍抽出物を樹状細胞培地に添加
し、これらを該患者に投与すると腫瘍免疫が誘導できる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】さらに、前記（１）〜（３）で得られた、
腫瘍特異的な抗原を提示し得る融合細胞または樹状細胞
を用いて、インビトロで腫瘍患者のＴリンパ球を活性化
した後、活性化された前記Ｔリンパ球を該患者に投与す
る養子免疫細胞移入（Adoptive transfer）方法で腫瘍
免疫を誘導することも可能である。
腫瘍特異的な抗原を提示し得る融合細胞または樹状細胞
を用いて、インビトロで腫瘍患者のＴリンパ球を活性化
した後、活性化された前記Ｔリンパ球を該患者に投与す
る養子免疫細胞移入（Adoptive transfer）方法で腫瘍
免疫を誘導することも可能である。
【００１３】すなわち、本発明は、（ａ）患者から腫瘍
特異的抗原を提示する腫瘍細胞及び樹状細胞または樹状
細胞前駆体を分離する段階と、（ｂ）分離された前記腫
瘍細胞及び前記樹状細胞または前記樹状細胞前駆体から
分化誘導された樹状細胞を融合した樹状細胞−腫瘍細胞
ハイブリッドを製作する段階とを含むことを特徴とする
腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチンの製造方法である。
特異的抗原を提示する腫瘍細胞及び樹状細胞または樹状
細胞前駆体を分離する段階と、（ｂ）分離された前記腫
瘍細胞及び前記樹状細胞または前記樹状細胞前駆体から
分化誘導された樹状細胞を融合した樹状細胞−腫瘍細胞
ハイブリッドを製作する段階とを含むことを特徴とする
腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチンの製造方法である。
【００１４】さらに本発明は、（ａ）癌患者から腫瘍特
異的抗原を提示する腫瘍細胞及び樹状細胞または樹状細
胞前駆体を分離する段階と、（ｂ）分離された前記腫瘍
細胞及び前記樹状細胞または前記樹状細胞前駆体から分
化誘導された樹状細胞を近接させて培養する段階とを含
むことを特徴とする腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチンの
製造方法である。
異的抗原を提示する腫瘍細胞及び樹状細胞または樹状細
胞前駆体を分離する段階と、（ｂ）分離された前記腫瘍
細胞及び前記樹状細胞または前記樹状細胞前駆体から分
化誘導された樹状細胞を近接させて培養する段階とを含
むことを特徴とする腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチンの
製造方法である。
【００１５】さらに本発明は、（ａ）癌患者から腫瘍特
異的抗原を提示する腫瘍特異的腫瘍細胞及び樹状細胞ま
たは樹状細胞前駆体を分離／培養する段階と、（ｂ）前
記腫瘍細胞の抽出物を、前記樹状細胞または前記樹状細
胞前駆体から誘導された樹状細胞の培養培地に添加する
段階とを含むことを特徴とする腫瘍特異的抗腫瘍細胞性
ワクチンの製造方法である。
異的抗原を提示する腫瘍特異的腫瘍細胞及び樹状細胞ま
たは樹状細胞前駆体を分離／培養する段階と、（ｂ）前
記腫瘍細胞の抽出物を、前記樹状細胞または前記樹状細
胞前駆体から誘導された樹状細胞の培養培地に添加する
段階とを含むことを特徴とする腫瘍特異的抗腫瘍細胞性
ワクチンの製造方法である。
【００１６】さらに本発明は、前記腫瘍細胞は、胃癌、
肝臓癌、大腸癌、肺癌、皮膚癌、膀胱癌、子宮頚部癌、
卵巣癌、乳癌、前立腺癌、白血病及び脳腫瘍患者から分
離した腫瘍細胞よりなる群から選択された何れか１つで
あるであることを特徴とする、前記製造方法である。
肝臓癌、大腸癌、肺癌、皮膚癌、膀胱癌、子宮頚部癌、
卵巣癌、乳癌、前立腺癌、白血病及び脳腫瘍患者から分
離した腫瘍細胞よりなる群から選択された何れか１つで
あるであることを特徴とする、前記製造方法である。
【００１７】さらに本発明は、前記樹状細胞または前記
樹状細胞前駆体は、患者または該患者とＨＬＡ抗原が一
致する供与者の末梢血液または骨髄から分離したことを
特徴とする前記製造方法である。
樹状細胞前駆体は、患者または該患者とＨＬＡ抗原が一
致する供与者の末梢血液または骨髄から分離したことを
特徴とする前記製造方法である。
【００１８】さらに本発明は、前記製造方法によって製
造された腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチンである。
造された腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチンである。
【００１９】さらに本発明は、対象腫瘍が、胃癌、肝臓
癌、大腸癌、肺癌、皮膚癌、膀胱癌、子宮頚部癌、卵巣
癌、乳癌、前立腺癌、白血病または脳腫瘍である、前記
腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチンである。
癌、大腸癌、肺癌、皮膚癌、膀胱癌、子宮頚部癌、卵巣
癌、乳癌、前立腺癌、白血病または脳腫瘍である、前記
腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチンである。
【００２０】さらに本発明は、Ｔリンパ球を癌患者から
分離し、該Ｔリンパ球を前記腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワ
クチンで活性化させることからなる、Ｔリンパ球の活性
化方法である。
分離し、該Ｔリンパ球を前記腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワ
クチンで活性化させることからなる、Ｔリンパ球の活性
化方法である。
【００２１】本発明による抗腫瘍細胞性ワクチンは腫瘍
の形態、大きさ、種類を問わず適用できる。従って、本
発明の方法は、肝臓癌、肺癌、皮膚癌、膀胱癌、子宮頚
部癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、白血病及び脳腫瘍患者
らに適用可能な腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチンを提供
しうる。
の形態、大きさ、種類を問わず適用できる。従って、本
発明の方法は、肝臓癌、肺癌、皮膚癌、膀胱癌、子宮頚
部癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、白血病及び脳腫瘍患者
らに適用可能な腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチンを提供
しうる。
【００２２】
【発明の実施の形態】以下、本発明をさらに詳しく説明
する。
する。
【００２３】本発明は腫瘍免疫誘導方法において、従来
の方法に比べて下記の点で改善された。
の方法に比べて下記の点で改善された。
【００２４】（１）樹状細胞と腫瘍細胞との体外融合：
樹状細胞と腫瘍細胞とを融合することによって、腫瘍細
胞による抗原の提示と、樹状細胞による強力な免疫シス
テムの活性化という２つの必須条件をこのような融合細
胞により解決した。
樹状細胞と腫瘍細胞とを融合することによって、腫瘍細
胞による抗原の提示と、樹状細胞による強力な免疫シス
テムの活性化という２つの必須条件をこのような融合細
胞により解決した。
【００２５】（２）樹状細胞による腫瘍抗原の提示：樹
状細胞に腫瘍細胞抽出物を投与する方法を用いているこ
とから、技術的に難しく且つ高コストである腫瘍抗原の
純粋分離工程を必要としない。
状細胞に腫瘍細胞抽出物を投与する方法を用いているこ
とから、技術的に難しく且つ高コストである腫瘍抗原の
純粋分離工程を必要としない。
【００２６】（３）効率性：既存の腫瘍治療方法（例え
ば外科的手術、化学療法、放射線療法）に比べて副作
用、再発の危険性が低い。また腫瘍の種類を問わず適用
しうる。
ば外科的手術、化学療法、放射線療法）に比べて副作
用、再発の危険性が低い。また腫瘍の種類を問わず適用
しうる。
【００２７】（４）安全性：本発明は、患者自身の免疫
細胞と腫瘍細胞とを用いるために、深刻な副作用等の問
題がなく、安全に適用しうる。また、現在開発中の遺伝
子療法に比べて、外来の核酸（ＤＮＡ）、ウイルスなど
を利用しないことからも副作用の恐れがない。
細胞と腫瘍細胞とを用いるために、深刻な副作用等の問
題がなく、安全に適用しうる。また、現在開発中の遺伝
子療法に比べて、外来の核酸（ＤＮＡ）、ウイルスなど
を利用しないことからも副作用の恐れがない。
【００２８】本発明の腫瘍細胞性ワクチンの製造方法
は、最も容易に入手できる末梢血液の単球（参考文献２
６）を用いて樹状細胞を得た。なぜなら、このように培
養された樹状細胞は、体内に存在する樹状細胞と同一ま
たは類似した特性（例えば、組織への移動、提示能力、
補助活性因子発現など）を保持するすることによって、
これら細胞の臨床適用が容易であると考えられるためで
ある。
は、最も容易に入手できる末梢血液の単球（参考文献２
６）を用いて樹状細胞を得た。なぜなら、このように培
養された樹状細胞は、体内に存在する樹状細胞と同一ま
たは類似した特性（例えば、組織への移動、提示能力、
補助活性因子発現など）を保持するすることによって、
これら細胞の臨床適用が容易であると考えられるためで
ある。
【００２９】本発明の製造方法において、樹状細胞（好
ましくは、ヒト）は、好ましくは、ヒトの、皮膚の表皮
（ランゲルハンス細胞）等の非リンパ組織および脾臓、
骨髄、リンパ節や胸腺等のリンパ組織、ならびに血液(b
lood DC's)やリンパ（veiledcells）などの循環システ
ムの組織から得られる。
ましくは、ヒト）は、好ましくは、ヒトの、皮膚の表皮
（ランゲルハンス細胞）等の非リンパ組織および脾臓、
骨髄、リンパ節や胸腺等のリンパ組織、ならびに血液(b
lood DC's)やリンパ（veiledcells）などの循環システ
ムの組織から得られる。
【００３０】樹状細胞は抹消血等の組織中には少数で存
在するため、高密度であるいは単離された形態であるこ
とが好ましい。高密度であるいは単離された形態の樹状
細胞を得る方法としては、一若しくは複数回の密度勾配
分離、ポジティブ選択、ネガティブ選択またはこれらの
組み合わせが使用できる。
在するため、高密度であるいは単離された形態であるこ
とが好ましい。高密度であるいは単離された形態の樹状
細胞を得る方法としては、一若しくは複数回の密度勾配
分離、ポジティブ選択、ネガティブ選択またはこれらの
組み合わせが使用できる。
【００３１】樹状細胞が得られたら、細胞を適当な培地
で培養して、最適な抗原の取り込み、プロセッシング及
び提示の状態で細胞集団を拡張するおよび／または細胞
を維持する。顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子
(granulocyte/macrophage colony stimulating factor)
（ＧＭ−ＣＳＦ）及びインターロイキン４（ＩＬ−４）
の双方の存在がインビトロ培養で樹状細胞の成熟の適当
な状態を維持するのに特に好ましい。この際、約６００
Ｕ／ｍｌの濃度のＧＭ−ＣＳＦ及び約２００Ｕ／ｍｌの
濃度のＩＬ−４の組み合わせが好ましい。
で培養して、最適な抗原の取り込み、プロセッシング及
び提示の状態で細胞集団を拡張するおよび／または細胞
を維持する。顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子
(granulocyte/macrophage colony stimulating factor)
（ＧＭ−ＣＳＦ）及びインターロイキン４（ＩＬ−４）
の双方の存在がインビトロ培養で樹状細胞の成熟の適当
な状態を維持するのに特に好ましい。この際、約６００
Ｕ／ｍｌの濃度のＧＭ−ＣＳＦ及び約２００Ｕ／ｍｌの
濃度のＩＬ−４の組み合わせが好ましい。
【００３２】また、本発明の製造方法において、樹状細
胞は、末梢血液、特に末梢血液からの単球を樹状細胞前
駆体として使用して、この樹状細胞前駆体を成熟するこ
とによって得ることが好ましい。このような単球は、患
者の末梢血液から抽出され、これをフィコール−ハイパ
ック（ファルマシア、Uppsala, Sweden）及びパーコー
ル（ファルマシア）を用いて連続的に分離した後、さら
に単球の純度を高めるために、単球がプラスチック表面
に付着する性質を用いて分離される。または、臍帯血を
樹状細胞前駆体の源として使用してもよく、男性が前立
腺癌の危険性が高いことが知られている家系で生まれる
場合には、必要であれば後に使用できるように凍結保存
可能である、臍帯血を樹状細胞前駆体の源として使用で
きる。
胞は、末梢血液、特に末梢血液からの単球を樹状細胞前
駆体として使用して、この樹状細胞前駆体を成熟するこ
とによって得ることが好ましい。このような単球は、患
者の末梢血液から抽出され、これをフィコール−ハイパ
ック（ファルマシア、Uppsala, Sweden）及びパーコー
ル（ファルマシア）を用いて連続的に分離した後、さら
に単球の純度を高めるために、単球がプラスチック表面
に付着する性質を用いて分離される。または、臍帯血を
樹状細胞前駆体の源として使用してもよく、男性が前立
腺癌の危険性が高いことが知られている家系で生まれる
場合には、必要であれば後に使用できるように凍結保存
可能である、臍帯血を樹状細胞前駆体の源として使用で
きる。
【００３３】このようにして得られた単球を培養し、樹
状細胞にまで成熟させる。培養容器は組織培養用プレー
ト（TPP, Switzerland）を用いるが、ペトリ皿、フラス
コまたはローラーボトルなどの他の細胞培養容器も使用
可能である。培養容器に播いた細胞の数は１ｍｌ当り５
×１０5程度が好ましい。各培養段階で用いる培養液
は、樹状細胞の生存と増殖を好適に保つために、成長因
子の添加が必須である。一般に使用する培養液は、これ
に限定されないが、１０％牛血清（ライフ テクノロジ
ーズ、GrandIsland, NY）を添加したＲＰＭＩ−１６４
０（Ivrine Scientific, SantaAna, CA）が好適に用い
られる。これに加えて、ヒトを含む他の種から得られた
血清、必須アミノ酸、ビタミン等を含有する培養液も使
用可能である。また、培養中細菌による汚染を最小化す
るために、ペニシリン、ストレプトマイシンまたはゲン
タマイシン等の抗生物質を使用することが望ましい。培
養中、栄養分を持続的に供給するために、成長因子を添
加した新鮮培養液で定期的に交換することが望ましい。
状細胞にまで成熟させる。培養容器は組織培養用プレー
ト（TPP, Switzerland）を用いるが、ペトリ皿、フラス
コまたはローラーボトルなどの他の細胞培養容器も使用
可能である。培養容器に播いた細胞の数は１ｍｌ当り５
×１０5程度が好ましい。各培養段階で用いる培養液
は、樹状細胞の生存と増殖を好適に保つために、成長因
子の添加が必須である。一般に使用する培養液は、これ
に限定されないが、１０％牛血清（ライフ テクノロジ
ーズ、GrandIsland, NY）を添加したＲＰＭＩ−１６４
０（Ivrine Scientific, SantaAna, CA）が好適に用い
られる。これに加えて、ヒトを含む他の種から得られた
血清、必須アミノ酸、ビタミン等を含有する培養液も使
用可能である。また、培養中細菌による汚染を最小化す
るために、ペニシリン、ストレプトマイシンまたはゲン
タマイシン等の抗生物質を使用することが望ましい。培
養中、栄養分を持続的に供給するために、成長因子を添
加した新鮮培養液で定期的に交換することが望ましい。
【００３４】このようにして培養された単球は、遠心分
離によって回収され、さらにこれらは、例えばＧＭ−Ｃ
ＳＦ(６００Ｕ／ｍｌ)、ＩＬ−４(１００Ｕ／ｍｌ)、Ｃ
Ｄ４０リガンド(ＣＤ１５４、ＣＤ４０リガンド）、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ（６００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−４(１００Ｕ／
ｍｌ)等の成長因子、および、２０％単球培養液（monoc
yte-conditioned medium、MCM）でさらに適当な期間培
養して成熟させ、樹状細胞を得る。
離によって回収され、さらにこれらは、例えばＧＭ−Ｃ
ＳＦ(６００Ｕ／ｍｌ)、ＩＬ−４(１００Ｕ／ｍｌ)、Ｃ
Ｄ４０リガンド(ＣＤ１５４、ＣＤ４０リガンド）、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ（６００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−４(１００Ｕ／
ｍｌ)等の成長因子、および、２０％単球培養液（monoc
yte-conditioned medium、MCM）でさらに適当な期間培
養して成熟させ、樹状細胞を得る。
【００３５】得られた樹状細胞について、フローサイト
メトリーや様々なインビトロ分析を用いて、その形質と
樹状細胞としての能力を確認する。このような分析によ
り、目的に応じた最適の提示能力を有する樹状細胞を選
択する。
メトリーや様々なインビトロ分析を用いて、その形質と
樹状細胞としての能力を確認する。このような分析によ
り、目的に応じた最適の提示能力を有する樹状細胞を選
択する。
【００３６】このようにして選択された樹状細胞を大量
に得るために、成長因子等を用いて樹状細胞を培養す
る。
に得るために、成長因子等を用いて樹状細胞を培養す
る。
【００３７】または、本発明の方法によると、樹状細胞
を、癌にかかっていないことが既知の健常人から得ても
よい。各人の抹消血単球(peripheral blood mononuclea
r cells)（ＰＢＭＣ）で、個々の関連するＨＬＡ抗原
（クラスＩとIIの双方、例えば、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ及
びＤＲ）を同定し、ＨＬＡ抗原の点で癌患者と一致する
樹状細胞を単離し、上記と同様にして拡張する。例え
ば、放射線および／または化学療法剤で処置された後期
癌患者は、しばしば十分なまたは有効な樹状細胞を提供
することができない。したがって、子孫などの、ＨＬＡ
が一致する健常人由来の樹状細胞は、上記いずれかの方
法を用いて得、拡張でき、さらに癌抗原と共にインビト
ロでインキュベートすることによって、ＨＬＡが一致す
る癌患者の免疫療法および／または腫瘍成長阻害を目的
とする活性化Ｔ細胞を誘発できる。
を、癌にかかっていないことが既知の健常人から得ても
よい。各人の抹消血単球(peripheral blood mononuclea
r cells)（ＰＢＭＣ）で、個々の関連するＨＬＡ抗原
（クラスＩとIIの双方、例えば、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ及
びＤＲ）を同定し、ＨＬＡ抗原の点で癌患者と一致する
樹状細胞を単離し、上記と同様にして拡張する。例え
ば、放射線および／または化学療法剤で処置された後期
癌患者は、しばしば十分なまたは有効な樹状細胞を提供
することができない。したがって、子孫などの、ＨＬＡ
が一致する健常人由来の樹状細胞は、上記いずれかの方
法を用いて得、拡張でき、さらに癌抗原と共にインビト
ロでインキュベートすることによって、ＨＬＡが一致す
る癌患者の免疫療法および／または腫瘍成長阻害を目的
とする活性化Ｔ細胞を誘発できる。
【００３８】次に、得られた樹状細胞は、ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）または電気融合(electrofusion)
によって融合され、その後、樹状細胞及び腫瘍細胞の表
現型を発現する細胞をＦＡＣＳ（例えば、ＦＡＣＳ Ｓ
ＣＡＮフローサイトメーター(FACS SCAN flow cytomete
; Becton Dickinson, San Jose, California, USA)）
によって選択される。前者の場合、より詳しくは、この
ようにして得られた樹状細胞を、同じ患者から得られた
腫瘍細胞と共に混合し、不純物除去のために遠心分離に
より洗浄し、得られた沈殿にＰＥＧ １５００(シグ
マ、St.Louis、MO、USA)を加えて細胞融合を行う。融合
の程度は、樹状細胞および腫瘍細胞それぞれに対するモ
ノクローナル抗体で染色し、これをフローサイトメトリ
ーによって分析できる。このようにして、腫瘍細胞と抗
原提示細胞両方の特性を全て満たす樹状細胞−腫瘍細胞
ハイブリッドが形成され、腫瘍特異性抗腫瘍細胞性ワク
チンとして用いることができる。
グリコール（ＰＥＧ）または電気融合(electrofusion)
によって融合され、その後、樹状細胞及び腫瘍細胞の表
現型を発現する細胞をＦＡＣＳ（例えば、ＦＡＣＳ Ｓ
ＣＡＮフローサイトメーター(FACS SCAN flow cytomete
; Becton Dickinson, San Jose, California, USA)）
によって選択される。前者の場合、より詳しくは、この
ようにして得られた樹状細胞を、同じ患者から得られた
腫瘍細胞と共に混合し、不純物除去のために遠心分離に
より洗浄し、得られた沈殿にＰＥＧ １５００(シグ
マ、St.Louis、MO、USA)を加えて細胞融合を行う。融合
の程度は、樹状細胞および腫瘍細胞それぞれに対するモ
ノクローナル抗体で染色し、これをフローサイトメトリ
ーによって分析できる。このようにして、腫瘍細胞と抗
原提示細胞両方の特性を全て満たす樹状細胞−腫瘍細胞
ハイブリッドが形成され、腫瘍特異性抗腫瘍細胞性ワク
チンとして用いることができる。
【００３９】上述の細胞融合方法の代わりに、腫瘍細胞
と、得られた樹状細胞とを近接させた状態で培養する方
法も用いられる。この場合、上述のように得られた樹状
細胞と、同患者より得られた腫瘍細胞とを、上述の培養
方法と同様に共に培養することによって、樹状細胞に該
腫瘍細胞に特異的な抗原を提示させることができる。こ
のようにして得られた樹状細胞は、腫瘍特異性抗腫瘍細
胞性ワクチンとして用いることができる。
と、得られた樹状細胞とを近接させた状態で培養する方
法も用いられる。この場合、上述のように得られた樹状
細胞と、同患者より得られた腫瘍細胞とを、上述の培養
方法と同様に共に培養することによって、樹状細胞に該
腫瘍細胞に特異的な抗原を提示させることができる。こ
のようにして得られた樹状細胞は、腫瘍特異性抗腫瘍細
胞性ワクチンとして用いることができる。
【００４０】さらに、上述の細胞融合方法、近接させて
培養することによる方法とは別に、腫瘍細胞の抽出液を
得られた樹状細胞の培養系に加える方法も用いられる。
該抽出液は、超音波破砕やホモジナイズ等の当業界に周
知の方法で調整される。これを樹状細胞の培養系に添加
することによって樹状細胞に該腫瘍細胞に特異的な抗原
を提示させることができる。このようにして得られた樹
状細胞は、腫瘍特異性抗腫瘍細胞性ワクチンとして用い
ることができる。
培養することによる方法とは別に、腫瘍細胞の抽出液を
得られた樹状細胞の培養系に加える方法も用いられる。
該抽出液は、超音波破砕やホモジナイズ等の当業界に周
知の方法で調整される。これを樹状細胞の培養系に添加
することによって樹状細胞に該腫瘍細胞に特異的な抗原
を提示させることができる。このようにして得られた樹
状細胞は、腫瘍特異性抗腫瘍細胞性ワクチンとして用い
ることができる。
【００４１】本発明による製造方法は、上述の末梢血液
より得られた単球だけでなく、骨髄、リンパ節などの他
の組織から得た単球、または骨髄、臍帯血、末梢血液な
どの他の組織から得た造血母細胞にも適用しうる。
より得られた単球だけでなく、骨髄、リンパ節などの他
の組織から得た単球、または骨髄、臍帯血、末梢血液な
どの他の組織から得た造血母細胞にも適用しうる。
【００４２】本発明による方法は、治療対象となる患者
から直接単球または樹状細胞を分離することにその特徴
がある。このような細胞を用いて体内または体外で患者
のＴリンパ球を活性化して腫瘍の免疫治療に用いる。ま
た、正常なヒトから収集／獲得した樹状細胞のＨＬＡ抗
原（クラスＩとII；ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、とＤＰ、Ｄ
Ｑ、ＤＲ）患者のそれと同一な場合にこれらを用いるこ
ともできる。特に、放射線及び化学療法を受けている末
期腫瘍患者において、樹状細胞の収集や末梢血液の収集
が容易でない場合、または該患者とＨＬＡ抗原が一致す
る親族が存在する場合、これを活用することもできる。
から直接単球または樹状細胞を分離することにその特徴
がある。このような細胞を用いて体内または体外で患者
のＴリンパ球を活性化して腫瘍の免疫治療に用いる。ま
た、正常なヒトから収集／獲得した樹状細胞のＨＬＡ抗
原（クラスＩとII；ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、とＤＰ、Ｄ
Ｑ、ＤＲ）患者のそれと同一な場合にこれらを用いるこ
ともできる。特に、放射線及び化学療法を受けている末
期腫瘍患者において、樹状細胞の収集や末梢血液の収集
が容易でない場合、または該患者とＨＬＡ抗原が一致す
る親族が存在する場合、これを活用することもできる。
【００４３】得られた腫瘍特異性抗腫瘍細胞性ワクチン
は、同患者より分離／培養されたＴリンパ球の活性化に
用いられる。さらに、活性化されたＴリンパ球をさらに
培養して用いることもできる。このようにして得られた
Ｔリンパ球を同患者に投与することで、特異的な腫瘍の
治療を行うことができる。
は、同患者より分離／培養されたＴリンパ球の活性化に
用いられる。さらに、活性化されたＴリンパ球をさらに
培養して用いることもできる。このようにして得られた
Ｔリンパ球を同患者に投与することで、特異的な腫瘍の
治療を行うことができる。
【００４４】以下、実施例を通じて本発明をさらに詳し
く説明する。但し、下記実施例によって本発明が限定さ
れることはない。
く説明する。但し、下記実施例によって本発明が限定さ
れることはない。
【００４５】
【実施例】実施例１:腫瘍組織の収集 組織学で確認された腫瘍組織と末梢血液５０ｍｌを患者
の同意の下に採取し、臨床的な所見、血液の状態及び他
の具体的な治療方式を記録した。前立腺癌、胃癌、肝臓
癌、卵巣癌、黒色種、白血病のような多様な腫瘍から由
来した細胞株を構築し、これらの表現形質をフローサイ
トメトリー(ベクトン・ディッキンソン、SanDiego、CA)
を用いて分析した。
の同意の下に採取し、臨床的な所見、血液の状態及び他
の具体的な治療方式を記録した。前立腺癌、胃癌、肝臓
癌、卵巣癌、黒色種、白血病のような多様な腫瘍から由
来した細胞株を構築し、これらの表現形質をフローサイ
トメトリー(ベクトン・ディッキンソン、SanDiego、CA)
を用いて分析した。
【００４６】実施例２:単球の分離及び培養 (１)単球の分離 本発明で使用する単球は末梢血液から抽出され、これを
フィコール−ハイパック(Ficoll-Hypaque)及びパーコー
ル(Percoll)で連続的に分離した後、付着性形質を用い
て分離した。末梢血液から単核球をフィコール−ハイパ
ック濃度勾配により遠心分離し、前記遠心分離により分
離された単核球を再びフィコールを使用して濃縮した。
具体的には、１.０６１ｇ／ｍｌ及び１.０５０ｇ／ｍｌ
濃度のフィコール溶液を製作した後、これらを１５ｍｌ
遠心分離用チューブに１０.０６１ｇ／ｍｌ、１.０１５
ｇ／ｍｌの順に注入し、下から非連続的な濃度勾配を形
成した。培地に浮遊している単核球（約１×１０8)を該
チューブの上層に注入した後、１０分間２０００×ｇ、
２０℃で遠心分離した。フィコール濃度１.０５０ｇ／
ｍｌと１.０６１ｇ／ｍｌとの中間にあたる層から単球
を回収した。この際、抗ＣＤ１４抗体(ベクトン・ディ
ッキンソン)で染色した後、フローサイトメトリーで分
析した結果、単球の純度は７０％以上であった。
フィコール−ハイパック(Ficoll-Hypaque)及びパーコー
ル(Percoll)で連続的に分離した後、付着性形質を用い
て分離した。末梢血液から単核球をフィコール−ハイパ
ック濃度勾配により遠心分離し、前記遠心分離により分
離された単核球を再びフィコールを使用して濃縮した。
具体的には、１.０６１ｇ／ｍｌ及び１.０５０ｇ／ｍｌ
濃度のフィコール溶液を製作した後、これらを１５ｍｌ
遠心分離用チューブに１０.０６１ｇ／ｍｌ、１.０１５
ｇ／ｍｌの順に注入し、下から非連続的な濃度勾配を形
成した。培地に浮遊している単核球（約１×１０8)を該
チューブの上層に注入した後、１０分間２０００×ｇ、
２０℃で遠心分離した。フィコール濃度１.０５０ｇ／
ｍｌと１.０６１ｇ／ｍｌとの中間にあたる層から単球
を回収した。この際、抗ＣＤ１４抗体(ベクトン・ディ
ッキンソン)で染色した後、フローサイトメトリーで分
析した結果、単球の純度は７０％以上であった。
【００４７】また、単球の純度を高めるために、単球が
プラスチック表面に付着する性質を用いて純度９０〜９
５％で単球を分離した。必要に応じて、単球をＣＤ１４
−ＭＡＣＳ（Miltenyi Biotec、Germany）を用いて分離
した。この場合、末梢血液単核球は、ヒト抗体で抗体受
容体をブロックキングされた後、超微細金属破片の接続
された抗ヒトＣＤ１４抗体(ＣＤ１４−マイクロビーズ)
で３０分間、４℃で染色された。染色後、細胞を遠心分
離して洗浄し、これを磁場が適用されるカラムに適用し
て抗ＣＤ１４抗体の結合した細胞を磁場によりカラムに
付着させ、その他の細胞は放出させた。付着した細胞
は、磁場から隔離することで溶出させ、１回洗浄してか
ら細胞数を測定した。
プラスチック表面に付着する性質を用いて純度９０〜９
５％で単球を分離した。必要に応じて、単球をＣＤ１４
−ＭＡＣＳ（Miltenyi Biotec、Germany）を用いて分離
した。この場合、末梢血液単核球は、ヒト抗体で抗体受
容体をブロックキングされた後、超微細金属破片の接続
された抗ヒトＣＤ１４抗体(ＣＤ１４−マイクロビーズ)
で３０分間、４℃で染色された。染色後、細胞を遠心分
離して洗浄し、これを磁場が適用されるカラムに適用し
て抗ＣＤ１４抗体の結合した細胞を磁場によりカラムに
付着させ、その他の細胞は放出させた。付着した細胞
は、磁場から隔離することで溶出させ、１回洗浄してか
ら細胞数を測定した。
【００４８】得られた単球を、１０％牛血青、１０ｍＭ
グルタミン及びペニシリン/ストレプトマイシン（ライ
フ テクノロジーズ、GrandIsland、NY）を含有するＲ
ＰＭＩ１６４０培地に浮遊させた後、６ウェルまたは１
００ｍｍ組織培養プレートを用いて５x１０5細胞／ｍｌ
の濃度で培養を開始した。
グルタミン及びペニシリン/ストレプトマイシン（ライ
フ テクノロジーズ、GrandIsland、NY）を含有するＲ
ＰＭＩ１６４０培地に浮遊させた後、６ウェルまたは１
００ｍｍ組織培養プレートを用いて５x１０5細胞／ｍｌ
の濃度で培養を開始した。
【００４９】(２）単球から樹状細胞への分化誘導 前記過程により分離された単球を、６日間ＧＭ−ＣＳＦ
(６００Ｕ／ｍｌ）（Pharmingen、SanDiego、CA)及びＩ
Ｌ−４(１００Ｕ／ｍｌ、Pharmingen)を含む培地で培養
した。培養３日目に培地の５０％をこれらの成長因子を
含む新鮮な培地で交換した。培養６日目に非付着性細胞
を収集して遠心分離した後、これらをＧＭ−ＣＳＦ(６
００Ｕ／ｍｌ)、ＩＬ−４(１００Ｕ／ｍｌ)及びＣＤ４
０リガンド(ＣＤ１５４、ＣＤ４０リガンド、延世大学
校 李テホ教授より）またはＧＭ−ＣＳＦ（６００Ｕ／
ｍｌ）、ＩＬ−４(１００Ｕ／ｍｌ)及び２０％単球培養
上層液（monocyte-conditioned medium、MCM）で３日間
さらに培養して成熟を完了した。
(６００Ｕ／ｍｌ）（Pharmingen、SanDiego、CA)及びＩ
Ｌ−４(１００Ｕ／ｍｌ、Pharmingen)を含む培地で培養
した。培養３日目に培地の５０％をこれらの成長因子を
含む新鮮な培地で交換した。培養６日目に非付着性細胞
を収集して遠心分離した後、これらをＧＭ−ＣＳＦ(６
００Ｕ／ｍｌ)、ＩＬ−４(１００Ｕ／ｍｌ)及びＣＤ４
０リガンド(ＣＤ１５４、ＣＤ４０リガンド、延世大学
校 李テホ教授より）またはＧＭ−ＣＳＦ（６００Ｕ／
ｍｌ）、ＩＬ−４(１００Ｕ／ｍｌ)及び２０％単球培養
上層液（monocyte-conditioned medium、MCM）で３日間
さらに培養して成熟を完了した。
【００５０】このようにして成熟させた細胞が体内の樹
状細胞と類似した形質と能力とを有するかを、フローサ
イトメトリー（ベクトン・ディッキンソン)と多様なイ
ンビトロ分析を行い確認した。形質確認のために白ネズ
ミで製作された、蛍光色素が付着した抗ヒトモノクロー
ナル抗体、ＣＤ１ａ(Pharmingen)、ＣＤ１１ｃ(Pharmin
gen)、ＣＤ１４(ベクトン・ディッキンソン)、ＣＤ１５
(ベクトン・ディッキンソン)、ＣＤ４０(Pharmingen)、
ＣＤ５４、ＣＤ８０(Serotec、Oxford、England)、ＣＤ
８３(Pharmingen)、ＣＤ８６(serotec)及びＨＬＡ−Ｄ
Ｒ(ベクトン・ディッキンソン)で染色してからフローサ
イトメトリーを用いて表現形質を確認した。その結果を
図１に示した。
状細胞と類似した形質と能力とを有するかを、フローサ
イトメトリー（ベクトン・ディッキンソン)と多様なイ
ンビトロ分析を行い確認した。形質確認のために白ネズ
ミで製作された、蛍光色素が付着した抗ヒトモノクロー
ナル抗体、ＣＤ１ａ(Pharmingen)、ＣＤ１１ｃ(Pharmin
gen)、ＣＤ１４(ベクトン・ディッキンソン)、ＣＤ１５
(ベクトン・ディッキンソン)、ＣＤ４０(Pharmingen)、
ＣＤ５４、ＣＤ８０(Serotec、Oxford、England)、ＣＤ
８３(Pharmingen)、ＣＤ８６(serotec)及びＨＬＡ−Ｄ
Ｒ(ベクトン・ディッキンソン)で染色してからフローサ
イトメトリーを用いて表現形質を確認した。その結果を
図１に示した。
【００５１】機能性の確認のため、第１に、培養された
樹状細胞を刺激因子（stimulator）とし、同種（alloge
neic）の末梢血液単核球（mononuclearcells;MNC）を反
応体(responder)として、反応体の分裂能を放射線同位
元素で標識したチミジン（NEN、Boston、MA）の染色体
統合(integration)程度で確認し、第２に、樹状細胞を
破傷風トキソイドのような抗原と培養した後、同一のヒ
トから抽出した自己由来単核球（autologous MNC）また
は純粋分離したＴリンパ球への提示能力を分析した。前
記過程で多様な方法および成長因子配合により培養され
た樹状細胞の機能の差を分析して最適の提示能力を有す
る樹状細胞を選択した。
樹状細胞を刺激因子（stimulator）とし、同種（alloge
neic）の末梢血液単核球（mononuclearcells;MNC）を反
応体(responder)として、反応体の分裂能を放射線同位
元素で標識したチミジン（NEN、Boston、MA）の染色体
統合(integration)程度で確認し、第２に、樹状細胞を
破傷風トキソイドのような抗原と培養した後、同一のヒ
トから抽出した自己由来単核球（autologous MNC）また
は純粋分離したＴリンパ球への提示能力を分析した。前
記過程で多様な方法および成長因子配合により培養され
た樹状細胞の機能の差を分析して最適の提示能力を有す
る樹状細胞を選択した。
【００５２】このように製造された樹状細胞を大量に得
るために、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４とＭＣＭまたはＣＤ
４０リガンドを利用し、以外にも顆粒球コロニー形成刺
激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、単球−マクロファージ コロニ
ー形成刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン、イ
ンターロイキン７３、インターロイキン６、腫瘍壊死因
子（ＴＮＦ）等の他の成長因子を使用できる、これらの
因子は細胞の成長と分化に最適の濃度を決定した後添加
された。
るために、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４とＭＣＭまたはＣＤ
４０リガンドを利用し、以外にも顆粒球コロニー形成刺
激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、単球−マクロファージ コロニ
ー形成刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン、イ
ンターロイキン７３、インターロイキン６、腫瘍壊死因
子（ＴＮＦ）等の他の成長因子を使用できる、これらの
因子は細胞の成長と分化に最適の濃度を決定した後添加
された。
【００５３】血液から樹状細胞を製造し始める時、生存
率を増加させるために次の方法を用いた。血液をヘパリ
ン(１００Ｕ／ｍｌ)または他の抗凝固剤を含有する溶液
(主にＲＰＭＩ−１６４０)と１:１で希釈した後、フィ
コール−ハイパック上に置いてからこれらを２０００ｒ
ｐｍ（約９００ｇ）、常温、２０分間で遠心分離した。
前記方法により単核球はフィコール−ハイパックと血液
希釈液との中間層に分離され、赤血球、多核球及び血小
板の汚染が最小化することができた。用いられた成長因
子およびその量は、供給者の活性定義に応じて異なる
が、ＧＭ−ＣＳＦを１００〜１２００Ｕ／ｍｌ、ＩＬ−
４を１０〜５００Ｕ／ｍｌで使用することが望ましい。
細胞数を測定した後、必要に応じて一部は凍結培地で処
理した、バイアルに入れて認識表示した後窒素タンクで
長期保存した。
率を増加させるために次の方法を用いた。血液をヘパリ
ン(１００Ｕ／ｍｌ)または他の抗凝固剤を含有する溶液
(主にＲＰＭＩ−１６４０)と１:１で希釈した後、フィ
コール−ハイパック上に置いてからこれらを２０００ｒ
ｐｍ（約９００ｇ）、常温、２０分間で遠心分離した。
前記方法により単核球はフィコール−ハイパックと血液
希釈液との中間層に分離され、赤血球、多核球及び血小
板の汚染が最小化することができた。用いられた成長因
子およびその量は、供給者の活性定義に応じて異なる
が、ＧＭ−ＣＳＦを１００〜１２００Ｕ／ｍｌ、ＩＬ−
４を１０〜５００Ｕ／ｍｌで使用することが望ましい。
細胞数を測定した後、必要に応じて一部は凍結培地で処
理した、バイアルに入れて認識表示した後窒素タンクで
長期保存した。
【００５４】実施例３:樹状細胞と腫瘍細胞との融合 樹状細胞（約５×１０6個）と腫瘍細胞（約２.５×１０
6個）を１５ｍｌ遠心分離チューブに混合した後、これ
らを残留タンパク質の除去のためにＰＢＳを添加して２
回遠心分離した。遠心分離の後、上清を完壁に除去し、
沈殿細胞にＰＥＧ １５００(シグマ、St.Louis、MO、U
SA)を添加して細胞融合を行った。５０％ＰＥＧを含む
ＲＰＭＩ−１６４０の１ｍｌを、６０秒間、沈殿した細
胞に一滴ずつ注入し、その都度揺すりながら、細胞を溶
解させた。次に血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍ
ｌを１分間添加した後、さらに９ｍｌを１分間で添加
し、細胞融合を完了させた。融合の直後に細胞を１回培
地で希釈した後、遠心分離して残留ＰＥＧを除去した。
融合の程度は樹状細胞に対するモノクローナル抗体と腫
瘍細胞に対するモノクローナル抗体で染色し、これをフ
ローサイトメトリーで分析することによって測定した。
図３において、腫瘍細胞株と樹状細胞を、上述したよう
にフローサイトメトリーで表現型質の維持を確認した結
果を示す。
6個）を１５ｍｌ遠心分離チューブに混合した後、これ
らを残留タンパク質の除去のためにＰＢＳを添加して２
回遠心分離した。遠心分離の後、上清を完壁に除去し、
沈殿細胞にＰＥＧ １５００(シグマ、St.Louis、MO、U
SA)を添加して細胞融合を行った。５０％ＰＥＧを含む
ＲＰＭＩ−１６４０の１ｍｌを、６０秒間、沈殿した細
胞に一滴ずつ注入し、その都度揺すりながら、細胞を溶
解させた。次に血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍ
ｌを１分間添加した後、さらに９ｍｌを１分間で添加
し、細胞融合を完了させた。融合の直後に細胞を１回培
地で希釈した後、遠心分離して残留ＰＥＧを除去した。
融合の程度は樹状細胞に対するモノクローナル抗体と腫
瘍細胞に対するモノクローナル抗体で染色し、これをフ
ローサイトメトリーで分析することによって測定した。
図３において、腫瘍細胞株と樹状細胞を、上述したよう
にフローサイトメトリーで表現型質の維持を確認した結
果を示す。
【００５５】本発明では実験の便利上、予備段階で腫瘍
細胞の細胞質を蛍光物質である５ＭＣＳＦＥ（5（また
は6）−carbo×y−fluorescein diacetate、succinimid
ylester）（モレキュラー プローブス、Eugene、OR、U
SA)で１５分間染色して融合の効率を測定した。このよ
うな染色蛍光物質は、緑色の発光で細胞を表示する。従
って緑色蛍光を発する細胞で、樹状細胞の標識因子のＣ
Ｄ１ａ、ＣＤ１１ｃまたはＣＤ８３を発現する細胞は成
功的に融合されたことを意味する。ここでは、測定結果
の大部分の場合３〜６％の樹状細胞が融合されることが
確認できた。この場合、モノクローナル抗体の生産のた
めに腫瘍の一種であるミエローマ細胞を脾臓の正常細胞
(Ｂリンパ球)と融合した結果、腫瘍細胞の特性である永
久性（非死滅性）とＢリンパ球の特性の抗体の合成/分
泌という特性を全て満たすことができた。すなわち、例
えば参考文献３０のように、腫瘍細胞(腫瘍特異的抗原
の提供者：シグナル１）とＡＰＣ（抗原提示細胞:シグ
ナル２）の両側特性を全て満たす融合細胞が形成され
る。
細胞の細胞質を蛍光物質である５ＭＣＳＦＥ（5（また
は6）−carbo×y−fluorescein diacetate、succinimid
ylester）（モレキュラー プローブス、Eugene、OR、U
SA)で１５分間染色して融合の効率を測定した。このよ
うな染色蛍光物質は、緑色の発光で細胞を表示する。従
って緑色蛍光を発する細胞で、樹状細胞の標識因子のＣ
Ｄ１ａ、ＣＤ１１ｃまたはＣＤ８３を発現する細胞は成
功的に融合されたことを意味する。ここでは、測定結果
の大部分の場合３〜６％の樹状細胞が融合されることが
確認できた。この場合、モノクローナル抗体の生産のた
めに腫瘍の一種であるミエローマ細胞を脾臓の正常細胞
(Ｂリンパ球)と融合した結果、腫瘍細胞の特性である永
久性（非死滅性）とＢリンパ球の特性の抗体の合成/分
泌という特性を全て満たすことができた。すなわち、例
えば参考文献３０のように、腫瘍細胞(腫瘍特異的抗原
の提供者：シグナル１）とＡＰＣ（抗原提示細胞:シグ
ナル２）の両側特性を全て満たす融合細胞が形成され
る。
【００５６】実施例４:樹状細胞によるＴリンパ球の増
殖分析 腫瘍患者から採取した末梢血液の単核球（約１×１０6
細胞）をＨＥＰＥＳ、２-メルカプトエタノール、Ｌ−
グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン及び１０
％の人のＡＢ血清を含有するＲＰＭＩ １６４０に浮遊
させてから１Ｕ／ｍｌの再組合ＩＬ−２を添加した後、
９６-ウェルマイクロタイタープレートに分周した。樹
状細胞(細胞融合後または腫瘍抗原の転移後、約１×１
０5個）を３０ｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで処理した
後、マイクロタイタープレートに添加した。対照群とし
て破傷風トキソイド(５００nｇ／ｍｌ)と無処理群を用
いた。
殖分析 腫瘍患者から採取した末梢血液の単核球（約１×１０6
細胞）をＨＥＰＥＳ、２-メルカプトエタノール、Ｌ−
グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン及び１０
％の人のＡＢ血清を含有するＲＰＭＩ １６４０に浮遊
させてから１Ｕ／ｍｌの再組合ＩＬ−２を添加した後、
９６-ウェルマイクロタイタープレートに分周した。樹
状細胞(細胞融合後または腫瘍抗原の転移後、約１×１
０5個）を３０ｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで処理した
後、マイクロタイタープレートに添加した。対照群とし
て破傷風トキソイド(５００nｇ／ｍｌ)と無処理群を用
いた。
【００５７】マイクロタイタープレートは５％ＣＯ2、
３７℃の条件で５日間培養した後、ウェル当り１ｍＣｉ
の放射線標識チミジン(３Ｈ−チミジン)を添加する。２
４時間追加培養した後、セミオート細胞収集器(semi-au
tomatic cell harvester)と放射線検査器とを用いて放
射線残留量を測定し、これを通じて抗原の提示能力を検
証した。また図４では、本発明の樹状細胞によるＴリン
パ球の増殖を測定した代表的な結果を示す。
３７℃の条件で５日間培養した後、ウェル当り１ｍＣｉ
の放射線標識チミジン(３Ｈ−チミジン)を添加する。２
４時間追加培養した後、セミオート細胞収集器(semi-au
tomatic cell harvester)と放射線検査器とを用いて放
射線残留量を測定し、これを通じて抗原の提示能力を検
証した。また図４では、本発明の樹状細胞によるＴリン
パ球の増殖を測定した代表的な結果を示す。
【００５８】実施例５:ＮＯＤ／ＳＣＩＤ白ネズミを用
いた人の末梢血液免疫細胞とＤＣＣＨの抗腫瘍免疫能力
動物実験 ＮＯＤ／ＳＣＩＤ白ネズミは免疫システムを欠乏した実
験動物であって、人の腫瘍と免疫システムを移植する場
合人体の免疫システムを点検できる価値のある実験動物
モデルの役割ができる。子宮頚部癌から由来したＭＥ−
１８０と他人の単球から由来した樹状細胞とを融合して
ＤＣＣＨ（Dendriticcell- cancer cellhybrid;DCCH）
（約１×１０6個）を製作した後、これを末梢血液免疫
細胞（約５×１０6個）とＭＥ−１８０細胞株（約４×
１０6個）と混合して白ネズミ１匹当り０.２ｍｌずつ皮
下注射した（ｈｕ−ＰＢＬ＋ＤＣＣＨ）。対照群として
は、腫瘍細胞のみを注入した群（コントロール）、腫瘍
細胞と末梢血液細胞のみを注入した群（ｈｕ−ＰＢ
Ｌ）、腫瘍細胞とＤＣＣＨを注入した群（ＤＣＣＨ）と
し、各群当り５匹とした。腫瘍の形成と成長は毎週単位
で６週間観察し、腫瘍の大きさはキャリパで最長径
（ａ）と高さ（ｂ）を測定した後、次の式で体積（ｖ）
を決定した。
いた人の末梢血液免疫細胞とＤＣＣＨの抗腫瘍免疫能力
動物実験 ＮＯＤ／ＳＣＩＤ白ネズミは免疫システムを欠乏した実
験動物であって、人の腫瘍と免疫システムを移植する場
合人体の免疫システムを点検できる価値のある実験動物
モデルの役割ができる。子宮頚部癌から由来したＭＥ−
１８０と他人の単球から由来した樹状細胞とを融合して
ＤＣＣＨ（Dendriticcell- cancer cellhybrid;DCCH）
（約１×１０6個）を製作した後、これを末梢血液免疫
細胞（約５×１０6個）とＭＥ−１８０細胞株（約４×
１０6個）と混合して白ネズミ１匹当り０.２ｍｌずつ皮
下注射した（ｈｕ−ＰＢＬ＋ＤＣＣＨ）。対照群として
は、腫瘍細胞のみを注入した群（コントロール）、腫瘍
細胞と末梢血液細胞のみを注入した群（ｈｕ−ＰＢ
Ｌ）、腫瘍細胞とＤＣＣＨを注入した群（ＤＣＣＨ）と
し、各群当り５匹とした。腫瘍の形成と成長は毎週単位
で６週間観察し、腫瘍の大きさはキャリパで最長径
（ａ）と高さ（ｂ）を測定した後、次の式で体積（ｖ）
を決定した。
【００５９】
【数１】
【００６０】また、腫瘍の平均直径が３ｍｍ以上測定さ
れた場合腫瘍が形成されたと見なした。このようにして
腫瘍の形成及び死亡率を週単位に測定された結果を図５
に示す。
れた場合腫瘍が形成されたと見なした。このようにして
腫瘍の形成及び死亡率を週単位に測定された結果を図５
に示す。
【００６１】図５より明らかなように、本発明のＤＣＣ
Ｈで活性化された末梢血液免疫細胞を注入された白ネズ
ミは、コントロール群に比べて、顕著に腫瘍の成長およ
び死亡率を抑えることができた。
Ｈで活性化された末梢血液免疫細胞を注入された白ネズ
ミは、コントロール群に比べて、顕著に腫瘍の成長およ
び死亡率を抑えることができた。
【００６２】
【発明の効果】本発明の腫瘍特異的腫瘍細胞性ワクチン
の製造方法は、樹状細胞が有する固有の抗原提示能力を
利用するものであって、複雑な実験的手法や制御等を必
要としない、臨床および治療に用いるのに十分な数の樹
状細胞の製造を容易にする方法を提供し、本発明に係る
樹状細胞は腫瘍、自家免疫疾患、アレルギー性疾患、感
染性疾患の治療と予防ワクチンの伝達等に好適に利用で
きる。
の製造方法は、樹状細胞が有する固有の抗原提示能力を
利用するものであって、複雑な実験的手法や制御等を必
要としない、臨床および治療に用いるのに十分な数の樹
状細胞の製造を容易にする方法を提供し、本発明に係る
樹状細胞は腫瘍、自家免疫疾患、アレルギー性疾患、感
染性疾患の治療と予防ワクチンの伝達等に好適に利用で
きる。
【００６３】また、本発明による抗腫瘍細胞性ワクチン
は腫瘍の形態、大きさ、種類を問わず適用できるため、
肝臓癌、肺癌、皮膚癌、膀胱癌、子宮頚部癌、卵巣癌、
乳癌、前立腺癌、白血病及び脳腫瘍患者らに適用可能で
ある。
は腫瘍の形態、大きさ、種類を問わず適用できるため、
肝臓癌、肺癌、皮膚癌、膀胱癌、子宮頚部癌、卵巣癌、
乳癌、前立腺癌、白血病及び脳腫瘍患者らに適用可能で
ある。
【図１】本発明により末梢血液の単球から誘導した樹状
細胞を、モノクローナル抗体で染色した後、フローサイ
トメトリーで測定した代表的な結果を示す。
細胞を、モノクローナル抗体で染色した後、フローサイ
トメトリーで測定した代表的な結果を示す。
【図２】本発明において細胞融合に用いられたリンパ腫
瘍細胞株ＣＡ４６（バーキットリンパ腫）の表現形質
を、モノクローナル抗体で染色した後、フローサイトメ
トリーで分析した結果を示す。
瘍細胞株ＣＡ４６（バーキットリンパ腫）の表現形質
を、モノクローナル抗体で染色した後、フローサイトメ
トリーで分析した結果を示す。
【図３】本発明において腫瘍細胞株と樹状細胞を５０％
ポリエチレングリコール１４５０を用いて融合した後、
得られた融合細胞をモノクローナル抗体で染色し、これ
をフローサイトメトリーで表現型質の維持を確認した結
果を示す。
ポリエチレングリコール１４５０を用いて融合した後、
得られた融合細胞をモノクローナル抗体で染色し、これ
をフローサイトメトリーで表現型質の維持を確認した結
果を示す。
【図４】本発明の樹状細胞によるＴリンパ球の増殖を測
定した代表的な結果を示す。
定した代表的な結果を示す。
【図５】ＮＯＤ／ＳＣＩＤ白ネズミに人の子宮頚部癌の
細胞株を注入した後、本発明によるＤＣＣＨと末梢血液
細胞とを同時に皮下注射して腫瘍の形成及び死亡率を週
単位に測定した結果を示す。
細胞株を注入した後、本発明によるＤＣＣＨと末梢血液
細胞とを同時に皮下注射して腫瘍の形成及び死亡率を週
単位に測定した結果を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 15/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 金 亨 稙 大韓民国京畿道城南市盆唐区二梅洞143番 地 アルムマウル703棟801号 (72)発明者 金 賢 玉 大韓民国京畿道城南市盆唐区二梅洞143番 地 アルムマウル703棟801号
Claims (8)
- 【請求項１】 （ａ）患者から腫瘍特異的抗原を提示す
る腫瘍細胞及び樹状細胞または樹状細胞前駆体を分離す
る段階と、 （ｂ）分離された前記腫瘍細胞及び前記樹状細胞または
前記樹状細胞前駆体から分化誘導された樹状細胞を融合
した樹状細胞−腫瘍細胞ハイブリッドを製作する段階と
を含むことを特徴とする腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチ
ンの製造方法。 - 【請求項２】 （ａ）癌患者から腫瘍特異的抗原を提示
する腫瘍細胞及び樹状細胞または樹状細胞前駆体を分離
する段階と、 （ｂ）分離された前記腫瘍細胞及び前記樹状細胞または
前記樹状細胞前駆体から分化誘導された樹状細胞を近接
させて培養する段階とを含むことを特徴とする腫瘍特異
的抗腫瘍細胞性ワクチンの製造方法。 - 【請求項３】 （ａ）癌患者から腫瘍特異的抗原を提示
する腫瘍特異的腫瘍細胞及び樹状細胞または樹状細胞前
駆体を分離／培養する段階と、 （ｂ）前記腫瘍細胞の抽出物を、前記樹状細胞または前
記樹状細胞前駆体から誘導された樹状細胞の培養培地に
添加する段階とを含むことを特徴とする腫瘍特異的抗腫
瘍細胞性ワクチンの製造方法。 - 【請求項４】 前記腫瘍細胞は、胃癌、肝臓癌、大腸
癌、肺癌、皮膚癌、膀胱癌、子宮頚部癌、卵巣癌、乳
癌、前立腺癌、白血病及び脳腫瘍患者から分離した腫瘍
細胞よりなる群から選択された何れか１つであるである
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載
の製造方法。 - 【請求項５】 前記樹状細胞または前記樹状細胞前駆体
は、患者または該患者とＨＬＡ抗原が一致する供与者の
末梢血液または骨髄から分離したことを特徴とする請求
項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の製
造方法によって製造された腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワク
チン。 - 【請求項７】 対象腫瘍が、胃癌、肝臓癌、大腸癌、肺
癌、皮膚癌、膀胱癌、子宮頚部癌、卵巣癌、乳癌、前立
腺癌、白血病または脳腫瘍である、請求項６に記載の腫
瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチン。 - 【請求項８】 Ｔリンパ球を癌患者から分離し、該Ｔリ
ンパ球を請求項６または７に記載の腫瘍特異的抗腫瘍細
胞性ワクチンで活性化させることからなる、Ｔリンパ球
の活性化方法。
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