KR101935989B1 - 하이드로젤 마이크로웰을 이용한 멀티셀룰라 스페로이드의 제조 방법 - Google Patents

하이드로젤 마이크로웰을 이용한 멀티셀룰라 스페로이드의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 멀티셀룰라 스페로이드의 제조 방법 및 이를 이용한 광열 치료 효과의 분석 방법에 관한 것으로서, 2종 이상의 세포를 혼합 배양하여 제조한 균일한 크기의 스페로이드를 제조할 수 있다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 2종 이상의 세포가 퓨전된 일정한 규격의 3차원 스페로이드가 생성되므로, 이를 효과적인 치료 모델로 활용함으로써 광열 치료의 효과 분석, 치료 조건의 최적화 및 다양한 약물 스크리닝이나 신약 개발에 이용할 수 있는 효과가 있다.

Description

하이드로젤 마이크로웰을 이용한 멀티셀룰라 스페로이드의 제조 방법{Method for manufacturing multicellular spheroid using hydrogel microwell}
본 발명은 하이드로젤 마이크로웰을 이용한 멀티셀룰라 스페로이드의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 규격화된 하이드로젤 마이크로웰을 이용함으로써, 서로 다른 종류의 세포를 혼합 배양하여 제조한 균일한 크기의 스페로이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
암에 대한 광열 치료는 광에 기반한 것으로, 외과수술법에 비해 비파괴적이고 간단하며 부작용이 적다. 또한, 전신 마취가 불필요하고 환자의 고통도 거의 없으며, 안정과 회복을 위한 기간이 짧을 뿐만 아니라 여러 차례 반복 치료가 가능하다는 이점도 있다.
한편, 종양 부위에 발열기구를 삽입하여 단순히 가열하는 방식을 갖는 열에 의한 암 치료기술은 이미 오래 전에 시도된 바 있으나, 암세포와 정상세포의 식별이 불가능하여 암세포 주변의 정상세포들도 파괴되는 문제로 인해, 실제 임상에는 널리 적용되지 못하였다. 이에 반해, 광 치료법은 약물 치료법과 방사선 치료법의 단점을 모두 극복한 새로운 암 치료법이라 할 수 있다.
상기의 광열 치료 방법의 적용을 위해서는 암세포를 대상으로 하여 치료 조건의 최적화가 이루어져야 하는데, 기존의 2차원적 세포배양은 주로 한 종류의 동일한 세포를 배양하므로, 서로 다른 종류의 세포 간 상호작용을 고려할 수 없었다. 일부에서 2차원적 공동배양(2D co-culture)을 통해 이러한 문제를 부분적으로 해결하고자 시도되고 있으나, 그럼에도 불구하고 생체 조직에서의 세포 환경과는 많은 차이점이 나타났다.
따라서, 2차원적 세포배양에서 나타나는 문제를 해결하기 위해 세포의 공간적인 구조(spatial organization)를 고려한 3차원적 세포배양 방법에 대한 연구 및 개발은 매우 중요한 의의를 지닌다. 그러므로, 최근에는 생체 내와 동등한 기능을 갖는 3차원 조직인 스페로이드의 배양이 주목을 받고 있다. 그러나 기존의 기술 중 서로 다른 종류의 세포를 퓨전하여 제조한 종양 스페로이드는 공지되어 있지 않다.
스페로이드의 배양 환경을 조성하기 위해 주로 이용하고 있는 방법은 세포를 구멍이 나 있는 생체적합성 지지체(porous biocompatible scaffold)를 이용하여 배양하는 것이다. 생체적합성 지지체의 주된 한 형태인 하이드로젤을 제작하기 위한 재료로서 널리 사용되고 있는 천연고분자는 콜라겐, 젤라틴, 실크 및 피브린 등의 프로테인과 알지네이트, 아가로스 및 키토산 등의 다당류로 나눌 수 있다. 이러한 천연고분자는 천연 물질에서 분리된 소재들이며, 임상용 소재들로 널리 적용되고 있다.
현재까지 이러한 천연고분자의 단독 혹은 복합 소재를 이용하여 다양한 3차원 세포배양용 하이드로젤 지지체를 개발하고자 많은 시도가 이루어지고 있으나, 각 물질이 가지는 특성으로 인해 3차원 세포배양의 효율성이 높지 않다는 문제점이 나타나고 있다. 천연 하이드로젤인 콜라겐(collagen), 폴리사카라이드(polysaccharide), 알지네이트(alginate), 아가로즈(agarose) 등은 자연에서 얻는 물질이기 때문에 안전하고 생체 적합성이 매우 우수하나 기계적 물성이 좋지 않으며 가격이 비싸고 종류도 많지 않기 때문이다.
예를 들어 콜라겐의 경우 낮은 수준의 기계적 특성을 가짐에 따라, 콜라겐 단독으로는 겔화가 어렵다는 문제점이 있다. 또한 아가로스는 단독으로 겔화가 가능하여 고체형 세포배양 배지로 사용되고 있으나, 세포배양 효율이 낮은 문제점을 나타내고 있다. 따라서, 이러한 천연고분자 소재의 하이드로젤 지지체의 문제점을 해결함으로써, 세포의 공간적인 구조(spatial organization)를 고려한 효과적인 3차원적 세포배양 방법에 대한 연구 및 개발이 필요한 실정이다.
한국등록특허 제10-1593049호(2016.02.02) 국제공개특허 WO2016/090361(2016.06.09) 한국등록특허 제10-0363587호(2002.11.21) 한국등록특허 제10-1449906호(2014.10.02) 한국등록특허 제10-1497196호(2015.02.23) 한국등록특허 제10-1362293호(2014.02.06) 한국등록특허 제10-1651265호(2016.08.19) 한국등록특허 제10-1630397호(2016.06.08) 한국등록특허 제10-1635373호(2016.06.27) 한국등록특허 제10-1453796호(2014.10.16) 한국등록특허 제10-1490767호(2015.02.02) 한국등록특허 제10-1660877호(2016.09.22)
본 발명자들은 광열 치료 효과를 분석하기 위한 멀티셀룰라 스페로이드를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 제조된 스페로이드에 치료적으로 유효한 광을 조사함으로써 세포사멸을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 광열 입자에 항암제를 추가로 포함할 경우, 치료 효과를 더욱 극대화함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 마이크로웰에서 세포를 2종 이상 혼합하여 배양하는 스페로이드 제조 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 스페로이드를 규격화된 형태로 제조하기 위하여 목적하는 규격에 해당하는 하이드로젤 마이크로웰의 제조 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 최종적으로 얻고자하는 멀티셀룰라 스페로이드의 부피 및 외형에 상응하는 내부 부피 및 3차원 내부 형상을 갖는 마이크로웰에 적어도 2종 이상의 세포를 혼합 배양(co-culture)하는 단계를 포함하는 멀티셀룰라(multicellular) 스페로이드 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 마이크로웰에 있어서, 동일한 부피 및/또는 형상을 갖는 복수 개의 마이크로웰이 하나의 기판 상에 함께 포함될 수 있으며, 복수 개의 마이크로웰이 포함된 기판을 이용하여 멀티셀룰라 스페로이드를 제조하는 경우에는 동시에 동일한 부피 및 형상의 멀티셀룰라 스페로이드를 제조함으로써, 이를 이용하여 다양한 암세포 치료 조건 및 약물 스크리닝에 용이하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 마이크로웰에 있어서, 상기 멀티셀룰라 스페로이드는 마이크로웰의 3차원 내부 형상과 일치하는 3차원 형상을 갖도록 제조되고, 이에 의해 동일·유사한 부피 및 외형을 갖는 복수개의 멀티셀룰라 스페이드 제조를 가능케 한다.
또한, 본 발명의 마이크로웰에 있어서, 다양한 부피를 갖는 복수 개의 마이크로웰이 하나의 기판 상에 함께 포함될 수 있으며, 다양한 부피를 갖는 마이크로웰이 포함된 기판을 이용하여 멀티셀룰라 스페로이드를 제조하는 경우에는 동시에 다양한 부피의 멀티셀룰라 스페로이드를 제조함으로써, 이를 이용하여 암세포 크기에 따른 약물 활성 또는 최적의 치료 조건 확립 등에 적절하게 이용할 수 있다.
본 발명의 멀티셀룰라 스페로이드 제조 방법은 상술한 바와 같이, 원하는 부피 및 형상의 멀티셀룰라 스페로이드를 용이하게 제조할 수 있는 효과를 발휘하며, 암세포 치료를 위한 약물 스크리닝 시스템 및/또는 암세포 치료 조건 최적화를 위한 테스트 플랫폼을 제공할 수 있다.
본 발명의 명세서상의 용어 "혼합 배양"은 2종 이상의 세포를 함께 배양하는 것으로서 공배양 또는 공생배양이라고도 칭한다. 세포의 종류에 따라 단독배양에 비해 높은 성장률을 목적으로 혼합배양을 수행하는 경우도 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 혼합 배양은, 적어도 1종 이상의 종양 세포; 및 정상 세포로 수행된다. 상기 2종 이상의 세포 혼합 배양은 정상 세포와 종양 세포를 이용하여 수행함으로써 멀티셀룰라 스페로이드를 제조하여 실제 종양을 모방할 수 있고, 종양의 전이를 모사하거나 또는 광열치료 및 약물치료를 포함하는 통상적인 치료방법에 대한 내성을 확인하는 데 이용할 수도 있다. 상기와 같이 실제 종양을 모방함으로써, 광열치료, 화학요법 또는 방사선치료를 포함하는 치료방법을 적용하여 정상 세포의 손상을 최소화하고 종양 세포만을 효과적으로 치료할 수 있는 처리량 및 처리시간 조건을 확립하는 근거자료로 활용할 수 있다. 또한 종양을 모방함으로써 치료 목적으로 적용하기 위한 약물 스크리닝에도 활용할 수 있다.
본 명세서상의 용어 "종양 세포"는 종양을 구성하고 있는 세포를 의미하고, 종양은 양성 종양과 악성 종양으로 구분된다.
본 발명의 일 구현예에서, 종양 세포는 악성 종양을 구성하는 종양 세포이다. 악성 종양은 일반적으로 암(특히 고형암)으로 지칭되고, 대부분 유해하며 접촉시에도 세포분열이 억제되지 않는다. 이는 구조화되지 않고 여러 층을 생성하여 증식하며, 비정상적인 핵을 지니는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 종양 세포는 난소암(ovarian cancer)세포, 자궁암(uterine cancer)세포, 교아종(glioblastoma)세포, 유방암(breast cancer)세포, 흑색종(melanoma)세포, 폐암(lung cancer)세포, 간암종(hepatocarcinoma)세포, 치은암(ulocarcinoma)세포, 설암(tongue cancer)세포, 췌장암(pancreatic cancer)세포, 전립선암(prostate cancer)세포, 신장암(renal cell carcinoma)세포, 골암(cancer of a bone)세포, 고환암(testis cancer)세포, 중피종(mesothelioma)세포, 위장암(gastric adenocarcinoma)세포, 림프종(lymphoma)세포, 뇌종양(encephaloma)세포, 결장암(colon cancer)세포 및 방광암(bladder cancer)세포이다.
본 명세서상의 용어 "정상 세포"는 어떤 조직을 구성하거나 또는 어떤 기능을 하는 세포로 분화될 것이 예상되거나, 또는 분화된 세포를 의미하나 이에 한정되지 않는다. 암세포와는 대비적으로, 접촉시 세포분열이 억제되고 구조화된 단일층을 형성하며 정상적인 핵을 지닌다. 본 명세서상에서 정상 세포는 종양 세포에 대비되는 개념으로 제시하기 위한 것으로서, 특정 조직에 존재하거나 또는 특정 기능을 하는 세포로 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 멀티셀룰라(multicellular) 스페로이드 제조 방법을 제공한다: (a) 감광액(Photoresist)이 패턴화된 기판 위에 고분자 수지를 열경화시켜 몰드를 제조하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 몰드 위에 고분자 섬유 및 프리 폴리머를 코팅하여 마이크로웰을 광경화시키는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 몰드로부터 광경화된 마이크로웰을 분리하는 단계.
본 발명의 방법을 단계별로 이하 자세히 설명한다:
단계 (a): 감광액(Photoresist)이 패턴화된 기판 위에 고분자 수지를 열경화시켜 몰드를 제조하는 단계
본 발명의 단계 (a)에 있어서, 감광액이 패턴화된 기판은 일반적으로 실리콘 웨이퍼에 포토리소그라피 공정을 이용하여 형성된 패턴을 포함하는 기판을 의미한다. 그 위에 액상의 고분자 수지를 채우고 열경화시킴으로써 기판상에 마이크로웰의 챔버(chamber) 부분이 양각으로 전사된 몰드를 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 고분자 수지는 PDMS(polydimethylsiloxane), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리이미드(polyimides), PMMA(polymethylmeta acrylate) 및 PC(polycarbonate) 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 마이크로웰은 50 내지 500 ㎛의 직경을 가질 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 마이크로웰은 75 내지 300 ㎛의 직경을 가질 수 있다.
단계 (b): 상기 단계 (a)의 몰드 위에 고분자 섬유 및 프리 폴리머를 코팅하여 마이크로웰을 광경화시키는 단계
본 발명의 단계 (b)에 있어서, 단계 (a)에서 제조된 몰드 위에 고분자 섬유를 올리고, TMSPMA(3-(Trimetoxysily) propylmethacrylate)로 코팅한 뒤, 광경화시킴으로써 챔버 부분이 음각으로 형성된 마이크로웰을 제조할 수 있다. 광경화는 합성 유기 재료가 자외선(Ultraviolet, UV), 전자선(Electron Beam, EB) 등 빛에너지를 받아 가교 또는 경화하는 현상을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 고분자 섬유는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산)](PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐 및 셀룰로오스 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 프리 폴리머는 TMSPMA(3-(Trimetoxysily) propylmethacrylate), HEA(Hydroxyethyl acrylate), GMA(Glycidyl methacrylate), EGDMA(diethyleneglycol dimethacrylate), THFA(Tetrahydrofurfuryl acrylate), HMAA(Hydroxymethul acrylamide), PEA(Phenyl epoxyacrylate), HOFHA(6-Hydroxy-2, 2,3,3,4,4,5,5-octafluoro), EOPT(Polyethoxylated(4)pentaerythritoltetraacrylate), HPA(Hydroxypropyl acrylate), BMA(Buthylmethacrlate), PETIA(Pentaerythritol triacrylate), HDDA(Hexan diol diacrylate), EGPEA(Ethyleneglycol phenyletheracrylate), BM(Benzylmethacrylate), HPPA(Hydroxyphenoxypropyl acrylate), BHPEA(2-(4-Benzoyl-3-hydroxyphenoxy)ethylacrylate), HEMA, HPMA, DGDMA 중에서 선택될 수 있다.
단계 (c): 상기 단계 (b)의 몰드로부터 광경화된 마이크로웰을 분리하는 단계
본 발명의 단계 (c)에 있어서, 광경화된 마이크로웰을 분리함으로써 특정 직경의 챔버를 구비하는 마이크로웰을 준비할 수 있다. 상기 마이크로웰은, 특정한 규격에 해당하는 스페로이드를 제조함에 있어 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명에서 제시하는 방법에 따라 제조된 스페로이드는 다음과 같은 방법에 따라 광열 치료 효과를 분석하기 위해 유용하게 사용될 수 있다: a) 적어도 2종 이상의 종양세포를 혼합 배양하여 스페로이드를 제조하는 단계; b) 상기 단계 a)의 스페로이드에 광열 입자를 흡수시키는 단계; c) 상기 단계 b)의 스페로이드에 600 내지 1100 nm 파장 영역의 광을 조사하는 단계; 및 d) 상기 단계 c)의 스페로이드의 사멸 또는 괴사 여부를 확인하는 단계.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 광열 입자는 실리카-금 나노입자(silica-gold nanoparticles), 금-황화 금 나노입자(Gold/gold sulfide nanoparticles), 전도성 고분자(PCPDTBT)와 인지질(DOPC, DOPE)이 결합된 나노입자, 및 단백질-금 복합 나노입자(Proteinticle/Gold Core/Shell nanoparticles)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 광열 입자는 항암 또는 항종양 활성을 나타내는 약제학적 활성 성분을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 약제학적 활성 성분은 독소루비신(doxorubicin), 에토포시드(etoposide), 미톡산트론(mitoxantrone), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 테니포시드(teniposide), 암사크린(amsacrine), 에피루비신(epirubicin), 메르바론(merbarone) 및 피로잔트론하이드로클로라이드(piroxantrone hydrochloride) 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 c)는 700 내지 900 nm 파장 영역의 광을 100 mW 이상 1 W 이하의 전력으로 3분 이상 30분 이하로 조사하는 단계이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
본 발명은 마이크로웰에서 세포를 2종 이상 혼합하여 배양하는 스페로이드 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 조성물을 이용하면 2종 이상의 종양 세포가 퓨전된 일정한 규격의 3차원 스페로이드가 생성되므로, 이를 효과적인 치료 모델로 활용함으로써 광열 치료의 효과 분석, 치료 조건의 최적화 및 다양한 약물 스크리닝이나 신약 개발에 이용할 수 있다.
또한 본 발명에서의 하이드로젤 마이크로웰은 간단한 공정으로 생산이 가능하므로 이를 이용하여 쉽고 빠르게 다양한 크기로 퓨전 종양 스페로이드를 형성할 수 있다.
도 1은 멀티셀룰라 스페로이드 형성을 위한 하이드로젤 마이크로웰 어레이 제작 공정을 나타낸다.
도 2는 나노 입자의 모양을 분석한 결과이다. (A) 실리카와 골드가 결합되어있는 고분자를 이용하여 할로우 메조포러스 실리카를 합성한 모식도; 및 (B) 주사전자현미경을 이용하여 나노 입자의 모양을 분석한 결과.
도 3은 나노 입자의 특성을 분석한 결과이다. (A) 원소 분석기를 통한 나노 입자의 구성 원소 분석; (B) 시간 경과에 따른 약물 방출 그래프; 및 (C) 나노 입자의 농도를 달리한 시간 경과에 따른 광열 효과에 의한 온도 그래프.
도 4는 자궁관련 암세포 멀티셀룰라 스페로이드의 광열치료 결과를 나타낸다. (A) 자궁암세포, 난소암세포 및 멀티셀룰라 스페로이드의 직경 150 μm 마이크로웰 상의 세포 사진; (B) 리플레이트된 광열 치료 전의 세포 사진; 및 (C) 광열 치료 후의 세포 사진.
도 5는 서로 다른 종류의 암세포 멀티셀룰라 스페로이드 광열치료 결과를 나타낸다. (A) 교아종세포, 유방암세포 및 멀티셀룰라 스페로이드의 직경 150 μm 마이크로웰 상의 세포 사진; B) 리플레이트된 광열 치료 전의 세포 사진; 및 (C) 광열 치료 후의 세포 사진.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 마이크로웰의 제조
스페로이드의 크기를 지름 75, 150 및 300 μm로 설정하기 위해서 반도체 제조 공정인 포토리소그래피(photolithography) 기술을 이용하였다. 감광제(Photoresist)가 패턴된 실리콘 웨이퍼를 제조한 후, PDMS(polydimethylsiloxane)로 마이크로 몰드를 제조하였다. 제조된 PDMS 마이크로 몰드 위에 PEG(polyethylene glycol)를 올리고, 한 시간 동안 TMSPMA(3-(trimethoxysilyl)-propyl methacrylate)로 코팅한 후, 3-DW로 세척한 유리 기판을 그 위에 올리고 UV 광을 조사하여 경화시킴으로써 PEG 하이드로젤 마이크로웰을 제작하였다.
실시예 2. 마이크로웰을 이용한 스페로이드의 형성
상기 실시예 1에서 제조한 지름 75, 150 및 300 μm의 하이드로젤 마이크로웰에서 자궁암세포(HeLa)와 난소암세포(Ovarian), 교아종세포(U87MG)와 유방암세포(MCF)를 각각 3일 동안 배양하였다. 이에 따라 자궁암세포와 난소암세포, 교아종세포와 유방암세포의 멀티셀룰라 스페로이드를 각각 제작하였다.
퓨전을 위하여 한 웰당 각 세포들을 1×106씩 투입하였다. 자궁암세포(HeLa)의 경우에는 FBS 10%, PS 1%가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 배양액으로 사용하였으며, 난소암세포(Ovarian)는 FBS(Fetal bovine serum) 10%, PS(Peak serum) 1%가 포함된 F-12(Ham's F-12 Nutrient Mixture)를 사용하였고, 멀티셀룰라 스페로이드에는 이들을 1:1로 섞어서 자궁암세포(HeLa)와 난소암세포(Ovarian)를 배양하였다.
또한 FBS 10%, PS 1%가 포함된 DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)에 교아종세포(U87MG)와 유방암세포(MCF)를 배양하였다. 하이드로젤 마이크로웰에서 자궁암세포(HeLa)와 난소암세포(Ovarian), 교아종세포(U87MG)와 유방암세포(MCF)를 온도 37℃와 CO2 5%로 유지되는 인큐베이터(incubator) 안에서 각각 3일 동안 배양하였다.
실시예 3. 광열 치료 효과의 확인 및 조건 최적화
상기 실시예 2에 따라 마이크로웰에서 배양된 지름 75, 150 및 300 μm의 퓨전 종양 스페로이드를 4웰 플레이트에 각각 배치하여 하루 동안 배양한 뒤 실리카-금-독소루비신 나노입자를 통하여 광열 치료를 실시하였다.
실리카-금-독소루비신 나노입자의 제조 방법은 다음과 같다. 유리 바이알에 증류수 2 ㎖, 암모니아 용액(ammonium hydroxide solution, NH4OH) 0.2 ㎖, 테트라에틸 올쏘실리케이트(Tetraethyl orthosilicate, TEOS) 0.8 ㎖ 및 에탄올 8 ㎖을 우유빛 색깔이 될 때까지 반응시킨 후, 원심분리를 통해 분리하여 실리카를 얻을 수 있었다.
이후 실리카, 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine, PEI) 과 금의 혼합용액(1:5)을 섞고 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 그 다음, 0.3몰의 수산화나트륨(NaOH) 용액을 떨어뜨리고 3 내지 24시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 에탄올로 워싱하여 원심분리를 통해 할로우 메조포러스 실리카 나노입자를 얻었다.
독소루비신 용액에 이 입자를 첨가하여 반응한 후 증류수로 워싱하고 원심분리를 통해 완성된 입자를 상온에 건조하여 얻었다. NH4OH, NaOH, TEOS, PEI 및 에탄올은 Sigma Aldrich Korea에서 구입하였다.
또한 대조군으로서 난소암세포, 자궁암세포, 교아종세포 및 유방암세포를 각각 3일 동안 배양하여 NIR(near infrared) 파장 808 nm, 전류 3 A, 전력 4.265 W 조건으로 광열 치료하고 멀티셀룰라 스페로이드에서도 마찬가지 조건에서 치료되는 것을 확인하였다. 이에 따라 서로 다른 종류의 퓨전 종양 스페로이드에 대한 치료 조건을 각각 최적화할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서는 실리카-금-독소루비신 나노입자를 세포 미디엄과 섞어 세포 내로 흡수(uptake)시키고, 광열 치료를 위한 농도를 최적화하였다. 광열 치료를 위한 온도를 각 실리카-금-독소루비신 나노입자 농도(0, 0.25, 0.50 및 0.75 mg / 50 μl) 및 시간 변화에 따른 온도 그래프로 나타내어 확인하였다. 결과적으로 500 μl의 세포 미디엄에 0.50 mg / 50 μl 농도로 실리카-금-독소루비신 나노입자를 포함하는 조건에서 광열 치료 조건을 최적화하였다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (4)

  1. 다음의 단계를 포함하는 종양에 대한 광열 치료 효과 분석 방법:
    (a) 최종적으로 얻고자하는 멀티셀룰라 스페로이드의 부피 및 외형에 상응하는 내부 부피 및 3차원 내부 형상을 갖는 마이크로웰에 적어도 2종 이상의 종양세포를 혼합 배양(co-culture)하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 스페로이드에 광열 입자를 흡수시키는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)의 스페로이드에 600 내지 1100 nm 파장 영역의 광을 조사하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c)의 스페로이드의 사멸 또는 괴사 여부를 확인하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 광열 입자는 독소루비신(doxorubicin), 에토포시드(etoposide), 미톡산트론(mitoxantrone), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 테니포시드(teniposide), 암사크린(amsacrine), 에피루비신(epirubicin), 메르바론(merbarone) 및 피로잔트론하이드로클로라이드(piroxantrone hydrochloride) 중에서 선택되는 약제학적 활성 성분을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 광열 치료 효과 분석 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 종양 세포는 난소암(ovarian cancer)세포, 자궁암(uterine cancer)세포, 교아종(glioblastoma)세포, 유방암(breast cancer)세포, 흑색종(melanoma)세포, 폐암(lung cancer)세포, 간암종(hepatocarcinoma)세포, 치은암(ulocarcinoma)세포, 설암(tongue cancer)세포, 췌장암(pancreatic cancer)세포, 전립선암(prostate cancer)세포, 신장암(renal cell carcinoma)세포, 골암(cancer of a bone)세포, 고환암(testis cancer)세포, 중피종(mesothelioma)세포, 위장암(gastric adenocarcinoma)세포, 림프종(lymphoma)세포, 뇌종양(encephaloma)세포, 결장암(colon cancer)세포 및 방광암(bladder cancer)세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 광열 치료 효과 분석 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 마이크로웰은 다음 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 광열 치료 효과 분석 방법:
    (a) 감광액(Photoresist)이 패턴화된 기판 위에 고분자 수지를 열경화시켜 몰드를 제조하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 몰드 위에 고분자 섬유 및 프리 폴리머를 코팅하여 마이크로웰을 광경화시키는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 몰드로부터 광경화된 마이크로웰을 분리하는 단계.
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