KR20010046515A

KR20010046515A - 대식세포와 종양세포의 융합에 의한 항종양 세포성 치료제

Info

Publication number: KR20010046515A
Application number: KR1019990050310A
Authority: KR
Inventors: 이시우; 김한수; 박기연; 김형직; 김현옥
Original assignee: 이시우
Priority date: 1999-11-12
Filing date: 1999-11-12
Publication date: 2001-06-15
Also published as: JP2001181205A; KR100363587B1

Abstract

본 발명은 강력한 세포성 백신인 인체의 수상돌기세포를 이용한 종양 치료에 관한 것이다. 본 발명은 수상돌기세포가 보유하는 고유한 항원제공 능력을 임상과 치료에 이용 가능한 충분한 수의 수상돌기세포의 제조를 용이하게 하는 방법을 제공하는 바, 본 발명에 따른 수상돌기세포는 종양, 자가면역질환, 알레르기성 질환, 감염성 질환의 치료와 예방 백신의 전달 등에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

대식세포와 종양세포의 융합에 의한 항종양 세포성 치료제{Dendritic cell-cancer fusion hybrid for anti-cancer cellular vaccine}

본 발명은 강력한 세포성 백신인 인체의 수상돌기세포를 이용한 종양 치료에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인체의 면역기전을 활성화 시켜 질병으로부터 인체를 방어할 수 있는 수상돌기세포에 의한 종양의 면역치료방식에 관한 것이다.

수상돌기 세포(dendritic cell; DC)는 골수에서 유래하며 현재 알려진 중에서도 가장 강력한 항원제공세포(APC)이며, 대식세포나 B 림프구와는 달리 T 림프구를 활성화시키는 필수적인 세포로, 혈액, 골수, 림프절, 피부, 중추 신경계 등 외부물질과 접촉이 빈번한 조직과 기관에 극소량으로 산재한 다양한 발달단계에 있는 세포군의 통칭이다(Steinman, R. M., Ann. Rev. Immunol. 9:271(1991); Schuler, G., and R. M. Steinman., J. Exp. Med. 186:1183(1997); Banchereau, J., and R. M. Steinman., Nature 392:245(1998)). 이 세포는 접촉과민 반응, 조직 이식 거부반응, 병원성 미생물에 대한 면역 반응에서 T 림프구를 활성화 시키는 등 일차 면역반응을 유도하는 면역반응의 시작세포로 여겨지고 있다(Banchereau, J., and R. M. Steinman., Nature 392:245(1998); Steinman, R. M., M. Pack, and K. Inaba., Immunol. Rev .156:25(1997); Bieber, T., Immunol. Today 18:311(1997); Sallusto, F., and A. Lanzavecchia., J. Exp. Med. 189:611(1999)). 종양부위에서 수상돌기 세포들이 발견되기도 하며(Chaux, P., A. Hammann, F. Martin, and M. Martin., Eur. J. Immunol. 23:2517(1993)), 종양에 침투한 수상돌기 세포가 발견되는 경우 예후(prognosis)가 좋다는 보고(Celluzzi, C. M., and J. L. D. Falo., J. Immunol .160:3081(1998))에서와 같이 종양억제나 퇴치에 있어서 수상돌기 세포의 중요성을 알 수 있다. 비록 완전하게 정의되지 않았으나 이들은 항원만을 제공하는 것이 아니라 T 림프구의 활성에 필요한 모든 보조 활성인자를 제공하고 있다. 이와 같이 수상돌기 세포가 면역반응을 조절하는데 중추적인 역할을 한다는 사실을 고려한다면, 종양 치료 뿐만 아니라 T 세포 반응이 문제가 되는 알레르기성 질환, 자가면역질환, 감염성 질환 등의 여러 질환 및 백신개발 등에서 수상돌기 세포를 이용할 수 있다.현재 세계적으로 여러 연구소에서 수상돌기 세포를 이용한 cell-based 백신의 개발이 진행 중에 있으며, 대표적인 방법으로는 (a)종양세포의 종양 특이 단백질을 수상돌기 세포 배양액(culture media)에 투여하거나(Porgador, A., D. Snyder, and E. Gilboa., J. Immunol .156:2918(1996); Young, J. W., and K. Inaba., J. Exp. Med. 183:7(1996)), (b)종양 특이 펩타이드 항원을 수상돌기 세포 배양액에 투여하거나, (c)종양세포를 파괴한 후 이를 수상돌기 세포 배양액에 투여하거나, (d)종양특이항원의 유전자를 수상돌기 세포에 도입하는 등 종양특이 항원이 수상돌기 세포의 MHC 클래스 I 혹은 클래스II에 적재(loading)될 수 있는 여건을 조성하여 수상돌기 세포를 활용하는 방안과, (e)종양세포를 수상돌기 세포와 함께 배양하여 항원의 공유와 교환을 이룬 후 수상돌기 세포를 활용하는 방식 등이 있다(Celluzzi, C. M., and J. L. D. Falo., J. Immunol. 160:3081(1998)). 또한, (f)일부 혈액종양의 경우, 종양세포를 수상돌기 세포로 분화하도록 유도하여 종양세포 자체를 백신으로 이용하려는 시도가 있다(Santiago-Schwarz, F., D. L. Coppock, A. A. Hindenburg, and J. Kern., Blood 84:3054(1994); Cao, X., Y. Zhao, Y. Yu, Y. Wang, M. Zhang, W. Zhang, and J. Wang., Immunol. 95:141(1998); Grouard, G., M.-C. Rissoan, L. Filgueira, I. Durand, J. Banchereau, and Y.-J. Liu., J. Exp. Med. 185:1101(1997); Oehler, L., O. Majdic, W. F. Pickl, J. Stockl, E. Riedl, J. Drach, K. Rappersberger, K. Geissler, and W. Knapp., J. Exp. Med. 187:1019(1998); Choudhury, B. A., et al., Blood 93:780(1999)). 이러한 방식의 성공을 위해서 극복해야 할 과제는 첫째, 충분한 양의 수상돌기 세포를 확보하여야 하며, 둘째 앞서 언급한 (c)항을 제외하고는 종양특이 항원의 분리, 동정 그리고 유전자 합성 등의 까다롭고, 간혹 불가능한 전제 조건들을 충족 시켜야 한다는 것이다. 또한, 외부에서 주입되는 항원들의 대부분은 세포내 소화과정(endocytic pathway)을 거쳐 MHC 클래스 II에 의해 CD4⁺T 세포에게 제공되므로, 세포 내에서 생성되는 종양특이항원과 같은 세포 내부생성 항원이 CTL에게 제공되기 위해 이용하는 MHC 클래스 I 과정을 작동하기란 위에서 언급한 (a-c)항의 경우 이 문제점을 항상 내포하게 된다. 그리고 마지막으로 수상돌기 세포가 항원 제공 세포로서의 기능을 수행하기 위해서는 상당히 복잡한 분화과정을 겪어야 한다. 수상돌기 세포가 분화(또는 성숙)의 어느 단계에 있느냐에 따라 T 림프구를 만날 수 있는 장소인 림프절로의 이동 능력이 달라지고, 면역반응의 방향성도 결정되어 지기 때문이다. 경우에 따라서는 항원의 흡수 (endocytosis)와 처리(processing)의 기능과 보조활성인자의 발현 유무에 따라 면역체계의 활성화 대신 면역관용(tolerance)을 유도할 가능성이 있기 때문에 분화의 적절한 조절이 필요하다.

수상돌기 세포의 수적인 제한이라는 문제를 해결할 수 있는 방법은 이미 여러 연구자들에 의해 밝혀져 있으며(Santiago-Schwarz, F., E. Belilos, B. Diamond, and S. E. Carsons., J. Leuk. Biol. 52:274(1992); Caux, C., C. Dezutter-Dambuyant, D. Schimitt, and J. Banchereau., Nature 360:258(1992); Peters, J. H., R. Gieseler, B. Thiele, and F. Steinbach., Immunol. Today 17:273(1996); Thurner, B., C. Roder, D. Dieckmann, M. Heuer, M. Kruse, A. Glaser, P. Keikavoussi, E. Kampgen, A. Bender, and G. Schuler., J. Immunol. Methods 223:1(1999)), 골수(Porgador, A., D. Snyder, and E. Gilboa., J. Immunol. 156:2918(1996); Reid, C. D. L., P. R. Fryer, C. Clifford, A. Kirk, J. Tikerpae, and S. C. Knight., Blood 76:1139(1990); Szabolcs, P., M. A. S. Moore, and J. W. Young., J. Immunol .154:5851(1995); Siena, S., M. Di Nicola, M. Bregni, R. Mortarini, A. Anichini, L. Lombardi, F. Ravagnani, G. Parmiani, and A. M. Gianni., Exp. Heamatol. 23:1463(1995); Galy, A., F. Morel, B. Hill, and B. P. Chen., J. Immunother. 21:132(1998)) 또는 제대혈(cord blood)(Min, Y. H., S. T. Lee, K. M. Choi, S. Y. Chong, H. O. Kim, J. S. Hahn, and Y. W. Ko., Yonsei Med. J. 39:328(1998); Bykovskaja, S. N., et al., J. Leuk. Biol. 63:620(1998))에서 분리한 CD34 양성 조혈세포, 말초 혈액의 대식 세포(Romani, N., D. Reider, M. Heuer, S. Ebner, E. Kampgen, B. Eibl, D. Niederwieser, and G. chuler., J. Immunol. Methods 196:137(1996); Chapuis, F., M. Rosenzwajg, M. Yagello, M. Ekman, P. Biberfeld, and J. C. Gluckman., Eur. J. Immunol. 27:431(1997); Goxe, B., N. Latour, J. Bartholeyns, J. L. Romet-Lemonne, and M. Chokri., Res. Immunol. 149:643(1998)), 구동화된(mobilized) CD34음성세포 (Choi, D., M. Perrin, S. Hoffmann, A. E. Chang, V. Ratanatharathorn, J. Uberti, K. T. McDonagh, and J. J. Mule., Clin. Cancer Res. 4:2709.29(1998)) 나 호중구(neutrophil)(Oehler, L., O. Majdic, W. F. Pickl, J. Stockl, E. Riedl, J. Drach, K. Rappersberger, K. Geissler, and W. Knapp., J. Exp. Med. 187:1019(1998)) 등으로부터 수상돌기 세포로의 분화를 유도하고 있다. 본 발명자들은 가장 손쉽게 구할 수 있는 말초 혈액(peripheral blood)의 대식세포(Romani, N., D. Reider, M. Heuer, S. Ebner, E. Kampgen, B. Eibl, D. Niederwieser, and G. chuler., J. Immunol. Methods 196:137(1996))를 이용하였다. 이들 배양된 수상돌기 세포들은 체내에 존재하는 수상돌기 세포와 동일한 혹은 유사한 특성(조직으로의 이동, 항원 제공 능력, 보조활성인자 발현 등)을 보유함으로써, 이들 세포의 임상 적용에 용이할 것으로 본다.

본 발명자들은 종양에 대한 T 림프구 활성을 유도하기 위해 수상돌기 세포를 이용하는 방법을 시험 연구한 결과, 인체로부터 획득한 수상돌기세포의 전구체를 수상돌기세포로 분화 시키고 이들을 종양세포와 융합하여 종양환자에 투여하여 생체 내에서 종양 면역을 유도할 수 있었으며, 또한 수상돌기 세포를 종양세포와 공동 배양하거나, 종양 추출물을 수상돌기 세포 배지에 첨가하여 이들을 환자에게 투여하는 방법을 통하여 종양 면역을 유도할 수 있었고, 수상돌기 세포와 종양 세포 추출물(또는 종양 세포)을 공동 배양한 후, 시험관에서 종양환자의 T 림프구를 활성화한 다음 활성화된 상기 T 림프구를 환자에게 투여하는 어돕티브 트랜스퍼 (Adoptive transfer) 방법을 통하여 종양면역을 유도할 수 있어 본 발명을 완성하게 되었다. 상기 방법들은 공통적으로 수상돌기 세포로 하여금 종양에 선택적인 면역 T 림프구를 활성화시킴으로써 종양의 면역치료를 할 수 있는 장점을 보유한다. 또한 수상돌기세포와 종양세포의 융합체(DCCH) 및 수상돌기세포/종양세포 근접 배양에 의한 백신 개발은 종양의 종류에 관계 없이 적용할 수 있다는 장점을 갖는다. 특히 세포 배양이 어렵거나 불가능 한 경우에도 종양 면역을 증강 시키는 효과를 보유하며, 수상돌기세포가 종양 환자로부터 유래하기 때문에 이들에 대한 GvHD와 같은 부작용이 나타나지 않는 효과가 있으며, 종양 항원의 검색과 치료 약제 구입과 같은 고도의 기술과 비용 부담이라는 단점을 동시에 극복할 수 있기 때문에 가장 안전하고 완벽한 치료 모델로 자리 잡을 수도 있는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 수상돌기세포를 이용하여 인체 면역체계를 자극하여 일차 종양 및 전이성 종양의 치료를 할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기 수상돌기세포를 이용하기 위하여 본 발명은 (a)종양세포와 수상돌기세포의 융합, (b)종양세포와 수상돌기세포의 공동배양 또는 (c)종양세포 추출물과 수상돌기세포와의 혼합배양에 의하여 종양 항원이 수상돌기세포에 의해 면역체계에 제시될 수 있도록 하는 3가지 방식을 개시한다.본 발명의 다른 목적은 환자에게서 분리한 T 림프구를 체외에서 종양 항원을 제시하는 수상돌기세포로 활성화 시킨 다음, 상기 활성화된 T 림프구를 다시 환자의 체내로 투여하는 종양 치료 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 의한 항종양 세포성 백신은 종양의 형태, 크기, 종류에 관계 없이 적용할 수 있는 장점을 갖는다. 따라서, 본 발명의 방법은 간암, 폐암, 피부암, 방광암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 전립선암, 백혈병 및 뇌암 환자 등에 적용가능한 종양특이적 항종양 세포성 백신을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

도1은 말초 혈액의 대식세포로부터 유도한 수상돌기 세포를 단일클론 항체로 염색한 후 유세포 분석기로 측정한 대표적인 결과이고,

도 2는 세포융합의 상대인 림프종 종양 세포주 CA46 (Burkitt s lymphoma)의 표현 형질을 단일클론항체로 염색한 후 유세포 분석기로 분석한 결과이고,

도3는 종양 세포주와 수상돌기 세포를 50% 폴리에틸렌 글리콜 1450를 이용하여 융합한 후 융합이 완료된 세포를 단일클론항체로 염색하고 이를 유세포 분석기로 표현형질의 유지를 확인한 결과이고,

도 4는 수상돌기세포에 의한 T 림프구 증식을 측정한 대표적인 결과이다.

본 발명은 종양면역유도 방법에 있어서 종래의 것보다는 개선된 하기와 같은 특징이 있다.

(1) 수상돌기세포와 종양세포의 체외 융합 :

수상돌기세포와 종양세포의 융합은 종양세포에 의한 항원의 제공과 수상돌기 세포에 의한 강력한 면역체계 활성화라는 두 가지 필수조건을 하나의 세포에 의해 해결하였다.

(2) 수상돌기세포에 의한 종양항원의 제공 :

수상돌기세포에 종양 세포 추출물을 투여하는 방식을 보다 수월하게 하여, 종양 항원의 순수 분리라는 기술적으로 어렵고 경비가 많이 드는 방법을 해결하였다.

(3) 효율성 :

기존의 종양치료방식(외과적 수술, 화학요법, 방사선 요법)에 비해 부작용이 낮고, 재발의 위험성을 제거하였다. 또한 종양의 종류에 관계 없이 적용할 수 있다.

(4) 안전성 :

본 발명은 환자 자신의 면역세포와 종양세포를 이용하는 등 항원의 제공원으로 환자 자신의 면역체계를 동원하기 때문에 안전하게 적용할 수 있다. 또한 현재 개발 중인 유전자 요법에 비해 외부의 핵산(DNA), 바이러스 등을 이용하지 않으므로 이를 사용할 때 나타날 수 있는 부작용의 위험성도 해결하였다.

본 발명자들은 기존의 방식에서 벗어나 보다 저렴하고 효과적인 방식으로 수상돌기세포에 의한 종양항원의 제공 방법을 발명하였다.

본 발명에서 사용하는 대식세포는 말초혈액에서 추출하였고, 이를 피콜-하이패크(Ficoll-Hypaque, Pharmacia, Uppsala, Sweden) 및 퍼콜(Percoll, Pharmacia)로 연속 분리한 후 부착성 형질을 이용하여 분리하였다. 그러나, 본원에서 이용하는 방식은 골수, 림프절 등의 다른 조직에서 획득한 대식세포 또는 골수, 제대혈, 말초혈액과 같은 다른 조직에서 획득한 조혈 모세포에도 적용할 수 있다.사용한 배양용기는 조직 배양용 플레이트(culture dish, TPP, Switzerland)를 이용하였으나, 페트리디시, 플라스크, 또는 roller bottles 등의 다른 세포 배양 용기를 이용할 수도 있다. 배양용기에 분주한 세포의 수는 ml 당 5 x 10exp5개로 하였다. 각 배양단계에 이용하는 배양액은 수상돌기세포의 생존과 증식을 유지할 수 있어야 하며, 이를 위해 성장인자의 첨가가 필수적인 과정이다. 일반적으로 사용하는 배양액은 10% 우혈청(Life Technologies, Grand Island, NY)을 첨가한 RPMI-1640(Ivrine Scientific, Santa Ana, CA) 이나 사람을 포함하는 다른 종의 혈청을 이용할 수 있으며, 필수 아미노산, 비타민을 함유하는 다른 합성 배양액을 사용할 수도 있다. 배양 중 세균에 의한 오염을 최소화 하기 위해 페니실린, 스트렙토마이신 또는 젠타마이신 사용이 바람직하다. 배양액에 의해 제공되는 양분의 지속적인 공급을 위해 주기적으로 성장인자를 첨가한 배양액의 교환이 바람직하다.

본 발명은 또한 치료대상이 되는 환자로부터 직접 대식세포 또는 수상돌기 세포를 분리하는 방법을 사용하는데 특징이 있다. 이들 세포를 이용하여 체내 또는 체외에서 환자의 T 림프구를 활성화시켜 종양의 면역치료에 이용한다. 또한, 정상인으로 부터 수집하거나 획득한 수상돌기세포세포의 HLA 항원(클래스 I 과 II; HLA-A, B, C 와 DP, DQ, DR)이 환자의 그것과 동일한 경우 이들을 이용할 수도 있다. 특히, 방사선 및 화학요법으로 치료를 받는 말기 종양환자로부터 수상돌기세포의 수집이나 말초혈액의 수집이 용이하지 않는 경우 또는 HLA 항원이 일치하는 친족이 존재하는 경우 이를 활용할 수도 있다.이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일뿐 본 발명은 이에 제한적인 것은 아니다. 또한, 본 발명의 기술적 요지 및 권리범위내에서 얼마든지 당업자간에 변형실시 또는 균등적 실시가 가능하다는 것은 당업자간에 명백히 이해될 것이고, 그 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

실시예 1 : 종양조직의 수집

조직학으로 확인된 종양 조직과 말초혈액 50 ml을 환자의 동의하에 수집하였으며, 임상적인 소견, 혈액의 상태 및 다른 구체적인 치료 방식들을 구체적으로 기록하였다. 전립선 암, 위암, 간암, 난소암, 흑색종, 백혈병 등과 같은 다양한 종양에서 유래한 세포주를 구축하고, 이들의 표현 형질을 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Diego, CA)를 통해 분석하였다.

실시예 2 : 대식세포의 분리 및 배양

(1) 대식세포의 분리

본 발명에서 사용하는 대식세포는 말초혈액에서 추출하였고, 이를 파이콜-하이패크(Ficoll-Hypaque) 및 퍼콜(Percoll)로 연속 분리한 후 부착성 형질을 이용하여 분리하였다. 말초혈액에서 단핵구를 파이콜-하이패크 농도 그래디언트에 의해 원심분리하고, 상기 원심분리에 의해 분리된 단핵구를 다시 퍼콜을 사용해 농축하였다. 구체적으로는, 1.061 g/ml 및 1.050 g/ml의 밀도를 갖는 퍼콜 그래디언트를 제작한 후 이들을 15 ml 원심분리 튜브(conical tube)에 10.061, 1.015의 순서로 아래에서부터 비연속적인 그래디언트를 형성하도록 주입하였다. 배지에 부유되어 있는 단핵구(1X10exp8)를 상층에 주입한 후 10분간 2000 x g, 20℃에서 원심분리한 다음 1.050과 1.061의 중간층에서 대식세포를 수집하였다. 이 때, 항 CD14 항체 (Becton Dickinson)로 염색한 후 유세포 분석기로 분석한 결과 전체의 70% 이상이 대식세포임을 알 수 있었다.

대식세포의 순도를 높이기 위해 별도로 대식세포가 플라스틱표면에 부착하는 성질을 이용하여 순도 90-95%로 대식세포를 분리하였다. 필요에 따라서는 대식세포를 CD14-MACS(Miltenyi Biotec, Germany)를 이용하여 분리하였다. 이 경우 말초혈액 단핵구를 사람의 항체로 항체수용체를 블록킹(blocking)한 다음 초미세금속파편이 접속된 항사람 CD14 항체(CD14-microbeads)와 30 분간 4℃에서 염색한다. 염색 후 세포를 원심 분리하여 세척하고 이를 자기장이 적용되는 컬럼(column)에 적용하여 항 CD14 항체가 부착된 세포들이 자기장에 의해 컬럼에 부착시키고 여타세포는 방출하도록 한다. 부착된 세포는 자기장으로부터 격리하여 모아 1회 세척한 후 세포 수를 결정한다.

대식세포는 10% 우혈청, 10 mM 글루타민, 및 페니실린/스트렙토마이신(Life Technologies, Grand Island, NY)을 함유하는 RPMI 1640 배지에 부유 시킨 다음 6 웰 또는 100 mm 조직배양 플레이트에 5 x 10exp5 cells/ml의 농도로 배양을 시작하였다.

(2) 대식세포에서 수상돌기세포로 분화 유도

상기 과정에 의해 분리된 대식세포를 6일간 GM-CSF (600 U/ml, Pharmingen, San Diego, CA) 및 IL-4(100 U/ml, Pharmingen) 을 함유하는 배지에서 배양하였다. 배양 3일째 50%의 배지를 이들 성장인자를 함유하는 신선한 배지로 교체하여 주었다. 6일째에 비부착성 세포를 수집하여 원심 분리한 후 이들을 GM-CSF(600 U/ml), IL-4(100 U/ml) 및 CD40리간드(CD154,CD40 ligand, 연세대학교 이태호 교수) 또는 GM-CSF(600 U/ml), IL-4(100 U/ml) 및 20% 대식세포 배양상층액(monocyte-conditioned medium, MCM)으로 3일간 추가 배양하여 성숙(maturation)을 완료하였다.

상기 성숙시킨 세포들이 체내의 수상돌기 세포와 유사한 형질과 능력을 가졌는지를 유세포 분석기(flow cytometry, Becton Dickinson)와 다양한 시험관내 검사(in vitro assay)를 통해 확인하였다. 형질확인을 위해서 형광색소가 부착된 백서에서 제작된 항사람 단일클론항체들, CD1a (Pharmingen), CD11c (Pharmingen), CD14(Becton Dickinson), CD15(Becton Dickinson), CD40 (Pharmingen), CD54, CD80(Serotec, Oxford, England), CD83(Pharmingen), CD86 (serotec) 및 HLA-DR(Becton Dickinson)로 염색한 후 유세포 분석기를 통해서 표현형질을 확인하고 그 결과를 도 1에 나타내었다.

기능성 확인을 위해서 첫째, 배양된 수상돌기 세포를 자극원(stimulator)으로 하고 동종(allogeneic)의 말초 혈액 단핵구(mononuclear cells; MNC)를 반응체 (responder)로 하여 반응체의 분열능을 방사선 동위원소로 표지한 티미딘 (thymidine, NEN, Boston, MA)의 염색체 통합(integration) 정도로 확인 하였고, 둘째, 수상돌기 세포를 테타누스 독소(tetanus toxoid) 등과 같은 항원과 배양을 한 후 동일인으로부터 추출한 단핵구(autologous MNC) 또는 순수분리한 T 림프구에 항원 제공 능력을 분석하였다. 상기 과정에서 다양한 방법과 성장인자 배합에 의해 배양된 수상돌기 세포들의 기능 차이를 분석하여 최적의 항원 제공능력을 가진 수상 돌기 세포를 선발하였다.

상기 제조되는 수상돌기세포의 수적 증가를 위해 GM-CSF, IL-4과 MCM 또는 CD40 리간드를 이용하였으며, 이외에도 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor), M-CSF(monocyte-macrophage colony-stimulating factor), 인터루킨 1, 인터루킨 3, 인터루킨 6, TNF(tumor necrosis factor)와 같은 다른 성장인자를 사용할 수 있었는데, 이들 인자는 세포 성장과 분화에 최적 농도를 결정한 후 첨가되었다. 혈액으로부터 수상돌기세포의 제조을 시작할 때 생존률을 증가 시키기 위해 다음의 방식을 적용하였다; 혈액을 헤파린(100 U/ml) 또는 다른 항 응고제를 함유하는 용액(주로 RPMI-1640)에 1:1로 희석한 후 파이콜-하이패크(Ficoll-Hypaque) 위에 얹은 다음 이들을 2000 RPM(약 900g force)으로 상온에서 20분간 원심분리하였다. 상기 방식에 의해 단핵구는 파이콜-하이패크와 혈액희석액의 중간층에서 획득되었으며 적혈구, 다핵구 및 혈소판의 오염을 최소화할 수 있었다. 사용되는 성장인자의 양은 공급자의 활성 정의에 따라 다르지만 GM-CSF(100-100 U/ml), IL-4 (10-500 U/ml)을 사용하는 것이 바람직하였다. 세포 수를 검사한 후 필요에 따라 일부는 동결배지로 처리한 후 바이얼(cryovial)에 넣어 인식 표시한 후 질소탱크에서 장기보존하였다.

실시예 3 : 수상돌기세포와 종양세포의 융합

수상돌기세포(5 x 10exp6)와 종양세포(2.5 x 10exp6)을 15 ml 원심분리튜브에 혼합한 후 이들을 잔류단백질을 제거하기 위해 PBS를 첨가하고 원심분리를 2회 실시하였다. 상기 원심 분리 후, 부유액을 완벽하게 제거하고 침전 세포에 PEG 1500 (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 세포 융합을 수행하였다. 세포융합은 60초간 1 ml의 50% PEG을 함유하는 RPMI-1640을 침전된 세포에 한 방울씩 주입하면서 침전을 용해시킬 정도로 흔들어 주면서 시작 하였고, 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배지 1ml을 1 분간 첨가한 다음 9ml을 1 분간 첨가 함으로서 종결하였다. 융합 직후 세포를 한차례 배지로 희석한 다음 원심 분리하여 잔류 PEG을 제거하였다. 융합의 정도는 수상돌기 세포에 대한 단일클론항체와 종양세포에 대한 단일클론항체로 염색하고 이를 유세포 분석기로 분석함으로써 결정하였다. 본 발명에서는 실험상의 편리를 위해 예비단계로 종양세포의 세포질을 5 M CSFE(5-(and-6)-carboxy-fluorescein diacetate, succinimidyl ester, molecular Probes, Eugene, OR, USA)로 15분간 염색하여 융합의 효율을 측정하였다. 상기 염색 형광물질은 녹색 발광으로 세포를 표지하므로 전체세포 중 녹색 형광을 발하는 세포 중에서 수상돌기 세포의 표지 인자인 CD1a, CD11c 또는 CD83을 발현하는 세포는 성공적으로 융합 되었음을 의미하는데, 측정 결과 대부분의 경우 3-6%의 수상돌기세포가 융합되는 것을 확인할 수 있었다. 이 경우 단일클론 항체 생성을 위해 myeloma(종양의 일종) 세포를 비장의 정상세포(B 림프구)와 융합한 결과(hybridoma)가 종양세포의 특성인 영구성(비사멸성)과 B 림프구의 특성인 항체의 합성/분비라는 양면성을 모두 만족하는 예에서 본 바와 같이(Olsson, L., and H. S. Kaplan. Methods Enzymol. 92:3(1983)), 종양세포(종양특이항원의 제공자: signal 1과 APC(보조활성인자의 제공자: signal 2의 양쪽 특성을 모두 충족 시킬 수 있는 융합세포(hybrid cell)가 형성된다.

실시예 4 : 수상돌기 세포에 의한 T 림프구 증식 분석

종양 환자로부터 수집한 말초혈액의 단핵구(1 x 10⁶cell)를 HEPES, 2-머캡토에탄올, L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 및 10% 사람 AB 혈청을 함유하는 RPMI 1640에 부유 시킨 다음 1 U/ml의 재조합 IL-2를 첨가 한 후 96-웰 마이크로타이터 플레이트(well microtiter plate)에 분주하였다. 수상돌기 세포(세포 융합 후 또는 종양 항원의 전이 후1 x 10exp5 cells)를 30g/ml의 마이토마이신-C(Mitomycin-C)으로 처리 한 다음 마이크로타이터 플레이트에 첨가하였다. 대조군으로 테타누스 독소(500 ng/ml)와 무처리군을 이용하였다. 마이크로타이터는 플레이트는 5% CO2, 37℃의 조건에서 5일간 배양한 다음 웰당 1 mCi의 방사선 표지 티미딘(3H-Thymidine)을 첨가한다. 24시간 추가 배양 후, 반자동 세포 수집기(semi-automatic cell harvester)와 방사선 검사기를 이용하여 방사선 잔류량을 측정하고 이를 통해 항원의 제공능력을 검증하였다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 수상돌기세포가 보유하는 고유한 항원제공 능력을 임상과 치료에 이용 가능한 충분한 수의 수상돌기세포의 제조를 용이하게 하는 방법을 제공하는 바, 본 발명에 따른 수상돌기세포는 종양, 자가면역질환, 알레르기성 질환, 감염성 질환의 치료와 예방 백신의 전달 등에 유용하게 이용할 수 있어 본 발명은 의학 및 생물산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

(a)암 환자로부터 종양특이적 항원을 제공하는 종양세포 및 수상돌기세포 (dendritic cell) 또는 수상돌기세포 전구체를 분리하는 단계; 및

(b)상기 분리된 종양세포 및 상기 분리된 수상돌기세포 또는 수상돌기세포 전구체로부터 분화 유도된 수상돌기세포를 근접 배양하는 단계를 포함하여 종양항원을 수상돌기세포에 제공함으로써 제작하는 것을 특징으로 하는 종양특이적 항종양 세포성 백신의 제작 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양된 종양세포 및 수상돌기세포를 세포융합시키는 단계를 추가하여 종양세포 및 수상돌기세포(dendritic cell)를 융합하여 DCCH (Dendritic cell-cancer cell hybrid: DCCH)를 제작하는 것을 특징으로 하는 종양특이적 항종양 세포성 백신의 제작 방법.
(a)암 환자로부터 종양 특이적 종양세포 및 수상돌기세포 또는 수상돌기세포 전구체를 분리하고 배양하는 단계; 및

(b)상기 종양세포의 추출물을 제작하여 수상돌기세포 또는 수상돌기세포 전구체로부터 유도된 수상돌기세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 포함하는 종양특이적 항원을 수상돌기세포에 제공함으로써 제작하는 것을 특징으로 하는 종양특이적 항종양 세포성 백신의 제작 방법.
제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 종양세포는 위암, 간암, 대장암, 폐암, 피부암, 방광암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 전립선암, 백혈병 및 뇌암 환자로부터 분리한 종양세포로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 종양세포임을 특징으로 하는 종양특이적 항종양 세포성 백신의 제작 방법.
제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 수상돌기세포 또는 수상돌기세포 전구체는 환자 또는 HLA 항원이 일치하는 공여자의 말초 혈액 또는 골수로부터 분리한 것임을 특징으로 하는 종양특이적 항종양 세포성 백신의 제작 방법.
상기 제1항 내지 제3항의 어느 한 항의 방법에 의해 제작된 종양특이적 항종양 세포성 백신.