KR101960410B1

KR101960410B1 - 염화코발트로 유도된 저산소 환경을 이용한 융합효율이 높은 전이암 하이브리드 세포의 제조방법

Info

Publication number: KR101960410B1
Application number: KR1020170086838A
Authority: KR
Inventors: 허갑용
Original assignee: 허갑용
Priority date: 2017-07-08
Filing date: 2017-07-08
Publication date: 2019-03-20
Also published as: KR20190005684A

Abstract

본 발명은 염화코발트(CoCl₂)로 유도된 저산소 환경을 이용한 융합효율이 높은 전이암 하이브리드 세포의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 전이암 하이브리드 세포의 제조 방법은 암세포와 대식세포가 융합되는 배양 배지를 염화코발트(CoCl₂)를 이용하여 종양조직의 미세 환경의 특징 중 하나인 저산소 환경으로 조성하여 암세포와 대식세포를 융합한다. 본 발명에 의하면, 염화코발트(CoCl₂)를 이용한 저산소 환경의 조성만으로 높은 융합 효율과 높은 세포 생존율 및 전이 능력을 얻을 수 있다.

Description

염화코발트로 유도된 저산소 환경을 이용한 융합효율이 높은 전이암 하이브리드 세포의 제조방법{METHOD FOR PREPARING METASTATIC HYBRID CELLS WITH HIGH FUSION EFFICIENCY USING HYPOXIC ENVIRONMENT INDUCED BY COBALT CHLORIDE}

본 발명은 저산소 환경을 이용한 전이암 하이브리드 세포의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로 암세포와 대식세포를 융합하는 단계에서 암세포의 생체 내 미세 환경의 특징 중 하나인 저산소환경을 조성하여 암세포와 대식세포를 융합하여 두 세포 간 융합효율을 획기적으로 높이고, 융합된 하이브리드 세포의 전이성을 모니터링하여 전이암의 특성을 관찰할 수 있는 저산소 환경을 이용한 전이암 하이브리드 세포의 제조방법에 관한 것이다.

현재 밝혀진 암에 의한 사망 중 약 90 %의 원인으로 지목되는 것은 암의 전이이다(Nature Reviews Cancer, 2006, 6:449-458). 전이암은 암세포가 처음 발생한 부위에서 떨어져 나와 주위의 혈관이나 림프관으로 침투해 그곳을 통해 이동하여 체내의 다른 부위에 새로운 종양을 형성하는 것이다(Science, 2013, 13;341, (6151):1186-1188). 이렇게 이동성을 얻어 전이되는 암세포의 생성 이유나 메커니즘은 아직 완전히 밝혀지지 않았으며, 그 원인에 대한 다양한 이론들이 존재한다.

가장 활발히 연구되고 있는 이론 중 하나는 EMT(epithelial to mesenchymal transition), MET(mesenchymal to epithelial transition) 이론이다. 종양 상피세포(epithelial cell)가 유전자 돌연변이에 의해 간엽세포(mesenchymal cell)의 형질을 획득한 세포로 변한다(EMT)는 이론이다(Nat Rev. 2002, 2:442-544, J Clin Invest. 2009, 119:1417-1419). 간엽세포의 형질을 갖게 된 상피세포는 세포 간 결합이 약화되어 본래 있던 위치에서 떨어져 나와 혈관으로 이동하게 된다. 그 후 혈관을 통해 이동하던 세포가 다시 자신의 상피적 특성을 획득하여(MET) 원발 부위에서 멀리 떨어진 2차 부위에 정착하여 종양을 증식시키게 되는 것이 전이의 과정이라고 주장하는 것이다. 그러나 EMT 과정과 MET 과정에 대한 유전자 돌연변이대한 설명 및 이를 증명하는 연구결과는 매우 부족한 현실이다. 또한 실제 종양조직에서는 이런 EMT 세포를 확인하기 어렵다(J Pathol. 2009, 219:275-276).

또 다른 이론은 암 줄기세포(CSCs : Cancer stem cells)이다. 본 이론의 특징은 종양 조직 내에 종양의 생성, 성장 및 이동 등에서 줄기세포의 기능을 하는 암줄기세포가 존재한다는 이론으로 다양한 약물치료에도 종양이 다시 재발하는 현상을 설명하기 위해 제시된 이론으로, 종양 조직 내에 줄기세포가 돌연변이에 의해 종양세포로 변형된 것으로 일반적인 줄기세포의 특징, 즉 빠른 증식력과 분화력 및 이동성 등을 가지며 이를 통해 성장, 전이 등의 핵심적인 기능을 담당하는 세포군이 따로 존재한다는 이론이다. 그러나 전이하는 능력과 연관된 다양한 연구에서 암줄기세포의 존재가 확인되는 연구보고가 있음에도 불구하고, 실제 연구에서 암줄기세포를 이용한 전신 전이의 유발은 잘 이루어지지 않는 것을 볼 수 있다(Int J Cancer. 2008;123:73-84).

위의 두 가지 이론 이외에 최근 주목받고 있는 이론으로 종양세포에 대한 대식세포의 작용에 관련된 것이 있다. 대식세포는 암세포에서도 일반적으로 항암 면역 반응을 담당하지만, 암이 있는 환경에서 오히려 종양의 성장을 촉진하는 대식세포도 존재한다. 이렇게 종양 주변에 있는 대식세포를 종양관련 대식세포(Tumor-Associated Macrophage, TAM)이라고 부르는데, 종양의 성장을 촉진하거나, 신생혈관 생성을 증진시켜 암세포가 전이를 쉽게 할 수 있는 환경을 형성하기도 하며 직접 주변의 암세포에 융합하여 혈관 침투와 이동을 도와 암세포의 전이를 유도하기도 한다(Cell, 2010, 141(1):39-51, Curr Opin Immunol. 2010, 22(2):231-237, Nature Reviews Immunol. 2015, 15:7386). 즉 이러한 종양 주변에 침윤된 대식세포와의 상호작용에 의해 주변 종양조직이 변형되어 전이성을 획득한다는 이론이다. 이와 관련된 다양한 연구보고에서는 주로 대식세포와 종양세포간의 상호작용에 의해 종양조직의 유전적 변형이 유도되는 과정에 초점이 맞추어져 연구되고 있다.

대식세포와 종양간의 관련된 연구로 또 하나 주목할 만한 것은 대식세포와 종양세포간의 융합을 통해 전이성을 획득하며 이를 통해 새로운 형질의 암이 생성된다는 연구가 보고되고 있다. 실제로 흑색 종 세포를 주입한 쥐 동물모델의 체내에서 골수유래 대식세포와 흑색 종 세포가 자연적으로 융합하여 전신 전이가 발생한 연구 결과가 존재한다(Nat Rev Cancer, 2008, 8(5):377-386). 주로 이런 TAM 세포의 활동이 활발하게 일어나는 암세포 주변의 미세 환경은 1) pH가 정상 세포 주위보다 낮고, 2) 저산소 상태이며 3) 암세포와 대식세포들에서 분비되는 CSF-1, IL-3, IL-6 등 다양한 성장인자들과, CCL-2, IFN-γ 등의 사이토카인들이 존재하고 있다(Trends Cell Biol. 2014, 24(8):472-478, Cell, 2010, 2;141(1):39-51. Adv Drug Deliv Rev. 2016, pii: S0169-409X(16) 30232-0.).

하지만 위와 같은 대식세포-종양 세포 간 융합 방법의 개발에 관한 다양한 시도들의 경우 실험적인 in vitro 방법의 경우 세포에 물리적, 화학적 충격 등으로 인해 세포 생존율이 매우 낮고 또한 그 성공확률이 5% 미만으로 매우 낮은 경우이거나 in vivo 실험의 경우 외부에서 주입한 암세포가 체내에서 자연적으로 대식세포와의 융합이 이루어진 것으로, 그 과정으로 실험적으로 재현하는 것이 불가능하며 이를 연구에 활용하는 것 역시 불가능 하다. 이러한 예시로는 다음과 같은 것이 있다. 인공적으로 동물 세포를 융합하여 하이브리드 세포를 만드는 방법은 여러 가지가 있다. 센다이 바이러스를 이용하는 방법(J Virol. 1973 Oct; 12(4): 937-939, ANTICANCER RESEARCH. 2016; 36:3827-3832)은 바이러스가 세포 표면에 융합하여 자신의 유전물질을 숙주 세포에 주입하는 성질에서 착안하여, 자외선 조사 등을 통해 증식 능력을 없애고 불활성화 시킨 센다이 바이러스를 통해 세포막 융합 기능만 이용하는 방법으로, 세포 융합에 관한 연구 초반에 많이 사용되었던 방법이다. 이 방법은 다른 방법들에 비해 실험 방법이 복잡하고 그에 비해 융합 성공률은 10% 이하로 낮다는 문제점이 있다(Methods in enzymology, 1993, vol. 221, pp 26-28).

폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 방법(Somatic Cell Genetics, 1976, 2( 3):271-280, Sci Rep. 2017, 7:46544)은 자세한 작용 기전이 아직 밝혀지지 않았지만, 세포와 세포 사이의 접촉을 증가시키는 기능을 갖고 있는 폴리에틸렌 글리콜의 사용 방법이 간단하여, 현재 세포 융합 실험에서 가장 널리 사용되고 있다. 그러나 이 방법은 세포 독성이 높고, 세포 융합 성공률은 25% 이하로 낮다는 문제점이 있다(Methods in Molecular Biology, 2006, 325:59-66, Stem Cell Rev. 2006, 2(4): 341-349, European Journal of Clinical Investigation, 2002, 32:207-217, Stem Cell Research, 2017, 19:76-81).

또 전기 융합 방법은 세포에 전기 자극을 주어 세포막을 약화시켜 두 세포를 융합시키는 방법으로, 작업 시간이 짧고 융합 성공률이 약 60 ~ 70 % 정도로 비교적 높지만, 비교적 높은 비용이 발생하고, 실험 절차가 복잡하며, 아직까지 융합에 최적화된 실험 방법이 정립되지 않았다는 단점이 있다(Bioelectrochemistry. 2013. 89: 34-41). 이를 개선하기 위한 노력이 지속되고 있지만(한국 공개특허공보 제10-2013-0037469호, 제10-2016-0045287호), 실제 세포 실험에 사용되기까지는 시간이 더 필요할 것으로 보인다.

위와 같은 방법들을 사용하지 않고 단순히 두 종류의 세포를 함께 배양하여 자연적으로 융합이 되도록 하는 실험법 또한 많이 이용되고 있지만 이 역시 융합성공률은 현저히 낮다(Int. J. Mol. Sci. 2016, 17(6):826).

또한 이렇게 여러 가지 방법들이 존재하지만 대부분 낮은 효율의 문제뿐만 아니라, 자연적인 융합법 외에는 세포에 자극을 주는 방법들이기 때문에 세포의 생장에 영향을 준다는 문제점도 존재한다.

이런 문제점들을 극복하고 높은 효율로 암세포와 대식세포를 인공적으로 융합할 수 있다면, 이 융합세포를 이용하여 체외(in vitro) 실험이 가능해지기 때문에 전이암의 메커니즘에 관한 다양한 연구에 도움이 될 것이다. 뿐만 아니라 현재의 전이암 동물 모델은 일반 암세포를 동물 혈관을 통해 주입하거나, 암 조직을 직접 동물에 이식하는 방법을 사용하기 때문에 성공률에 한계가 있으나, 융합을 통해 전이성을 획득한 세포를 주입한다면 전이암 동물 모델의 제작 성공률의 증가도 기대해볼 수 있을 것이다. 임상 실험에 들어가기 전 꼭 필요한 동물 실험을 위한 전이암 동물 모델이 부족한 현실이기 때문에(Nat Rev. 2011; 11:135-41) 아직 그 메커니즘이 완전히 밝혀지지 않은 전이암의 보다 전문적이고 다양한 연구를 위해서도 적절한 동물 모델의 개발이 절실하다.

최근 실험적으로, 저산소 챔버를 이용하여 저산소 환경을 조성한 후 유방암 세포와 대식세포를 융합시킨 연구가 보고 되었으나, 저산소 챔버를 이용하여 저산소 환경을 조성하면 일반적인 공동배양(Co-culture)보다 뛰어난 융합 성공률을 보여준다는 내용으로, 실제 챔버를 이용한 연구결과는 '융합 효율이 기존의 공동배양보다 약 두 배 정도 높다' 라고 언급하고 있지만, 최종 융합 성공률은 전체 실험에 활용한 세포 중, 1%가 되지 않는다. (FASEB J, 2015, 29(9):4036-4045). 1% 미만의 성공률로 융합이 되었다는 것은 자연 환경에서 관찰되는 융합 비율과 비교해서 저산소 챔버에 의해 융합이 효율적으로 증가 혹은 개선되었다고 보기 어렵다. 따라서 이러한 대식세포-종양세포 간 융합 방법을 활용한 전이암 연구에 있어서의 가장 큰 장애물은 융합 성공률이라고 말할 수 있다(Nat Rev Cancer, 2008, 8(5):377-386).

한국 등록특허공보 제10-0363587호(공고일 2002년 12월 06일) 한국 공개특허공보 제10-2014-0135101호(공개일 2014년 11월 25일) 한국 공개특허공보 제10-2013-0093091호(공개일 2016년 04월 26일) 한국 공개특허공보 제10-2014-0084043호(공개일 2014년 07월 04일)

J. M. Pawelek & A. K. Chakraborty, "Opinion : Fusion of tumour cells with bone marrow-derived cells : a unifying explanation for metastasis" Nature Reviews Cancer, 2008, 8, 377-386)

본 발명의 목적은 암세포와 대식세포를 융합하는 과정에서 암세포의 생체 내 미세 환경의 특징 중 하나인 저산소환경을 조성하여 암세포와 대식세포를 융합함으로써 세포 사멸률이 낮고, 융합 효율이 높은 저산소 환경을 이용한 전이암 하이브리드 세포의 제조방법을 제공하는데 목적이 있다.

상기 목적들을 달성하기 위한, 본 발명의 전이암 하이브리드 세포의 제조 방법은, 암세포와 대식세포를 융합하여 전이성을 갖는 전이암 하이브리드 세포의 제조 방법에 있어서, 상기 암세포와 상기 대식세포가 융합되는 배양 배지를 상기 암세포의 생체 내 미세 환경의 특징 중 하나인 저산소 환경으로 조성하여 상기 암세포와 상기 대식세포를 융합하되, 상기 저산소 환경은, 상기 배양 배지에 염화코발트(CoCl₂)를 처리하는 것을 특징으로 한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 전이암 하이브리드 세포의 제조 방법은 염화코발트(CoCl₂)를 이용하여 암세포의 생장 환경 중 하나인 저산소 환경을 조성하고 암세포와 대식세포를 융합하여 전이성을 가진 하이브리드 세포를 제작함으로써, 별도의 물리적인 외부 자극을 가하지 않고 제조가 가능하며 기존의 세포 융합에 사용된 다양한 방법들의 한계점에 해당하는 융합 효율이 극히 낮은 것과 비교하여 그 융합 효율이 90%에 달하여 그 효과가 현저하다.

또 본 발명의 전이암 하이브리드 세포의 제조 방법은 세포 사멸 율이 낮아서 융합세포의 수득 율이 매우 높으며, 세포의 종에 제한 없이 적용이 가능하기 때문에 인간 세포를 포함하여 다양한 세포에서 전이암의 메커니즘 규명에 필요한 다양한 실험이 가능하며, 다양한 동물에서 전이암 모델을 만드는 것과 같은 산업적 활용성이 매우 크다.

또한 본 발명을 통해 만들어진 세포를 동물 모델에 적용하면 암의 전이에 관한 연구는 물론이고 하나의 동물 모델에서 다양한 부위의 암 연구도 가능한 다목적 동물 암 모델의 개발이 가능하다.

뿐만 아니라, 본 발명에 의해 제작된 전이성 하이브리드 세포는 전이암의 다양한 체외 실험이 가능하며, 전이성을 가진 하이브리드 세포를 직접 동물에 주입하는 방식을 사용하면 보다 높은 성공률의 전이암 동물 모델 제작도 기대할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 암세포와 대식세포의 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포를 제조하는 수순을 도시한 흐름도;
도 2는 본 발명에 따른 세포 융합 시, 육안으로 모니터링이 용이하도록 형광 염색 공정이 추가된 암세포와 대식세포의 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포의 제조하는 수순을 도시한 흐름도;
도 3은 본 발명의 실시 (예)에 따른 암세포와 대식세포의 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포를 제조 및 모니터링 수순을 도시한 흐름도;
도 4는 본 발명의 실시 (예)에 따른 CoCl₂를 사용하였을 때 Hepa1c1c7 세포의 생존율을 MTT assay를 이용하여 측정한 결과를 나타내는 도표;
도 5a는 도 3의 실시 (예)에 따른 배양 배지에서 아무것도 처리하지 않고 쥐의 간암세포(Hepa1c1c7)와 대식세포(RAW264.7)를 함께 배양한 플레이트를 나타내는 사진;
도 5b는 저산소 챔버를 이용하여 저산소 환경을 조성한 배지에서 동일 세포를 함께 배양한 상태를 나타내는 플레이트의 사진;
도 5c는 염화코발트(CoCl₂)를 이용하여 저산소 환경을 조성한 배지에서 동일 세포를 함께 배양한 상태를 나타내는 플레이트의 사진;
도 5d는 도 5a 내지 5c의 융합 성공률을 정량적으로 나타낸 그래프;
도 6은 도 3의 실시 (예)에 따른 세포 융합 방법을 다양한 종류의 암세포-인간 폐암세포(A-549), 쥐 폐암세포(LA-4), 쥐 신장세포(RAG), 쥐 간세포(Hepa1c1c7)-에 적용하여 대식세포와 융합한 전이성 하이브리드 세포의 형광 사진;
도 7a 내지 도 7c는 도 3의 실시 (예)에 따른 세포 융합 방법을 사용하여 암세포(Hepa1c1c7)와 대식세포(RAW264.7)가 융합되는 초기 단계의 전이성 하이브리드 세포를 주사 전자 현미경(Scanning Electrone Microscope, SEM)으로 본 사진들;
도 8a 내지 도 8c는 도 3의 실시 (예)에 따른 세포 융합 방법을 사용하여 만들어진 암세포, 대식세포 및 하이브리드 세포 각각의 Epithelial 단백질 표지자인 EpCam을 형광염색(red)을 통해 보여주는 사진들;
도 9a 내지 도 9c는 도 3의 실시 (예)에 따른 세포 융합 방법을 사용하여 만들어진 암세포, 대식세포 및 하이브리드 세포 각각의 Mesenchymal 단백질 표지자인 Fibronectin을 형광염색(red)을 통해 보여주는 사진들;
도 10a 및 도 10b는 도 8a 및 도 9a에 나타나는 암세포의 이동을 보여주는 광학 사진들;
도 11a 및 도 11b는 도 8c 및 도 9c에 나타나는 하이브리드 세포의 이동성을 보여주는 광학 사진들;
도 12는 도 10a 내지 도 11b에 나타나는 세포의 이동성을 정량적으로 나타낸 그래프; 그리고
도 13은 본 발명의 방법을 사용하여 다양한 종류의 암세포와 대식세포를 융합하였을 때 융합 효율을 자연적으로 융합하였을 때의 효율과 비교하여 정량적으로 나타낸 그래프이다.

이하, 상기 목적 외에 본 발명의 다른 목적 및 특징들은 첨부 도면을 참조한 실시예에 대한 설명을 통하여 명백히 드러나게 될 것이다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가진 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

이하 첨부된 도 1 내지 도 13을 참조하여 본 발명의 실시 (예)를 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명에 따른 암세포와 대식세포의 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포를 제조하는 수순을 도시한 흐름도이고, 도 4는 본 발명의 실시 (예)에 따른 CoCl₂를 사용하였을 때 Hepa1c1c7 세포(쥐의 간암세포)의 생존율을 MTT assay를 이용하여 측정한 결과를 나타내는 도표이다.

도 1을 참조하면, 본 발명의 전이암 하이브리드 세포 제조 수순은 먼저, 단계 S100에서 전이암 하이브리드 세포를 제조하기 전에 암세포를 이용하여 전이암 하이브리드 세포의 생장 환경을 결정한다.

즉, 전이암 하이브리드 세포의 생장 환경을 생체 내 암의 미세 환경의 특징 중 하나인 저산소 환경으로 조성하기 위하여, 암세포를 이용하여 저산소 환경 조건을 결정한다.

이 실시 (예)에서는 사전 실험 예를 들어, 도 4에 도시된 바와 같이, MTT assay(세포 독성도 조사)을 통해 세포 배양 중 암세포의 생장에 영향을 받지 않도록 염화코발트(CoCl₂)의 농도를 조절하여 암세포 예를 들어, Hepa1c1c7 세포의 생존율을 측정한 후, 특정 농도를 결정하여 전이암 하이브리드 세포의 생장 환경을 결정한다. 예컨대, Hepa1c1c7 세포의 생존율을 80 % 이상을 조건으로 하는 경우, 염화코발트(CoCl₂)의 농도는 약 125 μM 이하의 범위에서 결정된다.

이 후, 단계 S120에서 염화코발트(CoCl₂)를 이용하여 저산소 환경이 조성된 배양 배지에서 대식세포가 충분히 분화하여 암세포에 작용할 수 있도록 일정 기간 예컨대, 2일 동안 배양한다. 그 결과, 단계 S130에서 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포가 생장된다.

이러한 본 발명에서는 상술한 단계(S100 ~ S130)들의 과정 이외에 물리적인 외부 자극을 가하지 않고, 융합 세포를 제조함으로써, 높은 융합 효율과 높은 세포 생존율을 보이는 융합 방법을 제공할 수 있다.

염화코발트(CoCl₂)는 Hypoxia-inducible factor(HIF)-1α를 안정화시키는 물질로 잘 알려져 있다. 이 HIF-1α는 암세포의 신생혈관 생성에 관여하는 VEGF의 발현을 촉진시키는 역할을 하는데, 암세포의 미세 환경에서 신생혈관의 생성은 암세포가 원발 부위를 벗어나 체내의 다른 부위로 이동이 가능하게 하는 가장 중요한 활동이라고 할 수 있다.

따라서 이와 같은 본 발명의 전이암 하이브리드 세포의 제조 방법은 별도의 물리적인 외부 자극을 가하지 않고, TAM 대식세포의 활동과 암세포의 HIF-1α의 활동이 보다 활발할 수 있는 저산소 환경을 조성하여 하이브리드 세포를 제작함으로써, 높은 융합효율과 높은 세포 생존율 및 전이 능력을 얻을 수 있으며, 세포의 종에 제한 없이 적용이 가능하기 때문에 다양한 세포에서 전이암의 메커니즘 규명에 필요한 체외 실험이 가능하다. 또한 이제까지 세포의 융합 방법으로 사용되어온 여러 가지 방법들에 비해 뛰어난 효율을 바탕으로 산업적인 활용을 가능하게 할 수 있다.

도 2는 본 발명에 따른 세포 융합 시, 육안으로 모니터링이 용이하도록 형광 염색 공정이 추가된 암세포와 대식세포의 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포의 제조하는 수순을 도시한 흐름도이다.

도 2를 참조하면, 이 제조 수순은 세포 융합 시, 육안으로 모니터링이 용이하도록 하기 위하여, 도 1의 제조 방법에 암세포와 대식세포 각각에 서로 다른 색상의 형광 물질을 주입 처리하는 형광 염색 단계(S160)가 추가되며, 다른 단계들은 도 1의 것과 동일하게 처리된다.

즉, 이 제조 수순은 단계 S150에서 전이암 하이브리드 세포를 제조하기 전에 도 4에 도시된 바와 같이, MTT assay을 통해 세포 배양 중 암세포의 생장에 영향을 받지 않도록 염화코발트(CoCl₂)의 농도를 조절하여 전이암 하이브리드 세포의 생장 환경을 결정한다.

단계 S160에서 암세포와 대식세포 각각에 서로 다른 형광색을 띄는 나노 입자를 주입 처리한다. 이를 위해 세포 융합에 들어가기 전에, 암세포는 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate : FITC) 형광의 나노 입자를 주입하고, 대식세포는 로다민 이소티오시아네이트(rhodamine isothiocyanate : RITC) 형광의 나노 입자를 주입한다. 이 실시 (예)에서 FITC 나노 입자는 주식회사 바이테리얼즈 사(Biterials Co., Ltd)의 제품명 NEO-STEM TMSF50를 주입하고, RITC 나노 입자는 바이테리얼즈 사(Biterials Co., Ltd)의 제품명 NEO-STEM TMSR50를 주입한다. 따라서 융합에 성공한 세포는 암세포의 녹색 형광과 대식세포의 빨간색 형광이 합쳐져 주황색 빛을 띠므로 형광 현미경을 통하여 세포 융합을 바로 확인할 수 있다.

단계 S180에서 염화코발트(CoCl)를 이용하여 저산소 환경이 조성된 배양 배지에서 대식세포가 충분히 분화하여 암세포에 작용할 수 있도록 일정 기간 예컨대, 2일 동안 배양한다. 그 결과, 단계 S190에서 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포가 생장된다.

이러한 본 발명에서는 상술한 단계(S150 ~ S190)들의 과정이외에 물리적인 외부 자극을 가하지 않고, 융합 세포를 제조함으로써, 높은 융합 효율과 높은 세포 생존율을 보이는 융합 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 대식세포는 동물종의 혈관에서 추출한 단구세포를 분화시킨 세포이거나 동물 종 유래의 대식세포 세포 주이다. 대식세포 세포 주는 예를 들어, RAW264.7, MV-4-11, 3D4/2, J774A.1, KG-1, NR8383[AgC11x3A, NR8383.1], DH82, IC-21, 3D4/31, MH-S, C8-B4, AMJ2-C11, Fcwf-4[Fcwf], MD, 23 ScCr[10ScNCr/23], SC, 3D4/21, I-13.35, H36.12j[Pixie 12j], RAW 309 Cr.1, P388D1[P388 D1], AMJ2-C8, H36.12e[Pixie 12e], H36.12a[Pixie 12a], PMJ2-PC, PMJ2-R, H36.12b[Pixie 12b], H36.12d[Pixie 12d], I-11.15, 42TA, KG-1a, C8-S, C8-D30 등의 세포주들로 구성되는 군에서 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에서 사용되는 암세포는 위암(Gastric cancer), 간암(Liver cancer), 폐암(Lung cancer), 유방암(Breast cancer), 난소암(Ovarian cancer), 기관지암(bronchial cancer), 구강암(Oral cavity cancer), 후두암(Larynx cancer), 췌장암(Pancreatic cancer), 대장암(Colorectal cancer), 방광암(Bladder cancer), 결장암(Colon cancer), 자궁경부암(Uterine cervical cancer), 전립선암(Prostate cancer), 신장암(Kidney cancer), 피부암(Skin cancer), 갑상선암(Thyroid cancer), 뇌암(Brain cancer) 세포 등으로 이루어지는 군에서 선택된 암세포이거나 이들 세포에서 유래된 세포주 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

위암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, KATOIII, NCI-N87, SNU-16, SNU-5, AGS, SNU-1 세포 주들로 구성되는 군에서 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

간암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, SNU-475, C3A, SNU-449, PLC/PRF/5, SNU-387, SK-HEP-1, SNU-423, H-4-II-E, H4-II-E-C3, McA-RH8994, MH1C1, N1-S1, Hepa-1c1c7, Hepa 1-6 세포 주들로 구성되는 군에서 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

폐암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, NCI-H2126, NCI-H1299, NCI-H1437, NCI-H1563, NCI-H1573, NCI-H1975, NCI-H661, KLN 205, LL/2, DMS 114, NCI-H460[H460], SW 1271, LA4 세포 주들로 구성되는 군에서 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

유방암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, BT-549, Hs 578T, MDA-MB-134-VI, MDA-MB-175-VII, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436, MDA-MB-157, MDA-MB-415, MDA-MB-453, MDA-MB-468, HCC1569, HCC1599, HCC38, HCC70, HCC1806, HCC1187, HCC1395, HCC202, HCC1419, HCC1428, HCC1937, HCC1143, HCC1500, HCC1954, HCC2157, HCC2218, MCF7, SK-BR-3, T-47D, ZR-75-1, ZR-75-30, DU4475, UACC-812, UACC-893, UACC-3199, UACC-3133, UACC-1179, UACC-732, UACC-2087, BT-20, AU565, BT-474, BT-549, CAMA-1, Eph4 1424.2, EpH4 1424.1, EMT6, EpH4 1424, Eph4 1424.2, C127I, JC 세포 주들로 구성되는 군에서 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

난소암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, PA-1, Caov-3, SW 626, SK-OV-3, SK-LMS-1, HT-3, ME-180, MES-SA, SK-UT-1, KLE, AN3 CA, UACC-1598, MES-OV, UWB1.289, TOV-112D, OV-90, TOV-21G, HEY-T30 세포 주들로 구성되는 군에서 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

구강암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, SCC-15, SCC-25, SCC-9, UPCI:SCC090, UPCI:SCC152, A-253 세포 주들로 구성되는 군에서 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

자궁경부암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, Ca-Ski, DoTc2 4510, SiHa, C-33 A, MES-SA, SK-UT-1, AN3 CA, RL95-2 세포 주들로 구성되는 군에서 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

전립선암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, PNEC30, TRAMP-C1, VCaP, MyC-CaP 세포 주들로 구성되는 군에서 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

신장암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, RAG, Renca, Caki-1, Caki-2, A-498 세포 주들로 구성되는 군에서 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

피부암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, Lo Ren, DU4475, A-375, RPMI-7951, WM-115, SK-MEL-1, SK-MEL-3, SK-MEL-24, G-361 세포 주들로 구성되는 군에서 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

갑상선암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, TT 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.

뇌암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, A172, SW1088, H4, U118-MG, U87-MG, PFSK-1, Daoy, NB41A3 세포 주들로 구성되는 군에서 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

후두암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, FaDu, Detroit 562 세포 주들로 구성되는 군에서 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

췌장암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, Capan-2, Panc 10.05, CFPAC-1, HPAF-II, SW 1990, BxPC-3, AsPC-1, UACC-462, PANC-1, MIA PaCa-2, SU.86.86, AR42J, Panc 03.27, LTPA, Hs 766T, Panc 08.13, Panc 02.03, Panc 04.03, Panc 05.04, Panc 02.13 세포 주들로 구성되는 군에서 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

대장암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, SNU-C1, SK-CO-1, SW1116, SW948, T84, LS123, LoVo, SW837, SW48, RKO, COLO 205, SW1417, LS411N, NCI-H508, HT-29, CT26.WT, Hs 675.T, LS 174T, LS123, COLO 320DM, SW620, SW480, DLD-1, HCT116, HCT-15 세포 주들로 구성되는 군에서 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

방광암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, 5637, HT-1197, HT-1376, RT4, SW 780, T-24, TCCSUP, UM-UC-3, NBT-II, J82, SCaBER 세포 주들로 구성되는 군에서 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

그리고 결장암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, SNU-C1, SK-CO-1, SW1116, SW948, T84, LS123, LoVo, SW837, SW48, RKO, COLO 205, SW1417, LS411N, NCI-H508, HT-29, CT26.WT, CMT-93 세포 주들로 구성되는 군에서 어느 하나로 제작되는 것을 특징으로 한다.

계속해서 본 발명의 실시 (예)에 따른 전이암 하이브리드 세포를 제조 및 모니터링 방법을 도 3 내지 도 13을 이용하여 상세히 설명한다.

도 3은 본 발명의 실시 (예)에 따른 암세포와 대식세포의 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포를 제조 및 모니터링 수순을 도시한 흐름도이고, 도 5a는 도 3의 실시 (예)에 따른 배양 배지에서 아무것도 처리하지 않고 쥐의 간암세포(Hepa1c1c7)와 대식세포(RAW264.7)를 함께 배양한 플레이트를 나타내는 사진이고, 도 5b는 저산소 챔버를 이용하여 저산소 환경을 조성한 배지에서 동일 세포를 함께 배양한 상태를 나타내는 플레이트의 사진이며, 도 5c는 염화코발트(CoCl₂)를 이용하여 저산소 환경을 조성한 배지에서 동일 세포를 함께 배양한 상태를 나타내는 플레이트의 사진이고, 도 5d는 도 5a 내지 5c에서의 세포들의 융합성공률을 정량적으로 나타낸 그래프이다. 또한 도 6 내지 도 12는 본 발명의 실시 (예)에 따른 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포를 모니터링한 결과를 나타내는 도면들이며, 그리고 도 13은 본 발명의 방법을 사용하여 다양한 종류의 암세포와 대식세포를 융합하였을 때 융합 효율을 정량적으로 나타낸 그래프이다.

먼저 도 3을 참조하면, 본 발명의 전이암 하이브리드 세포는 단계 S200에서 암세포를 이용하여 융합 세포를 제조하기 전에 MTT assay을 통해 세포 배양 중 암세포의 생장에 영향을 받지 않도록 저산소 환경 조건을 결정하기 위하여 염화코발트(CoCl₂)의 농도를 조절하여 전이암 하이브리드 세포의 생장 환경을 결정한다.

융합 실험이 들어가기 전, 세포의 생장에 큰 영향을 주지 않는 CoCl₂의 농도를 찾기 위한 MTT assay를 진행한다. 이 실시 (예)에서는 다양한 농도의 CoCl₂를 처리한 Hepa1c1c7 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트(96-well microtitre plates)에 1 X 10⁴의 양으로 37 ℃, 5% CO₂의 항온 배양기에서 24시간 동안 배양시킨 후 MTT assay를 진행한다. 이 때, MTT assay의 결과가 도 4에 도시되어있다. 이 실험 결과를 바탕으로 융합 실험에서는 세포의 생존율이 80 % 이상인 농도(100 mM 이하)를 사용하였다.

이 후 제조 방법은 융합 세포의 전이 능력과 이동성을 모니터링하거나, 융합 세포의 융합 효율을 모니터링하기 위하여 제조 과정이 나누어진다. 즉, 융합 세포의 전이 능력과 이동성을 모니터링하기 위하여, 단계 S210에서는 세포 융합에 이용하는 배양 배지를 단계 S200에서 결정된 조건에 맞추어 염화코발트(COCl₂)를 처리하여 배양 배지를 저산소 상태로 조성한 후 세포를 일정 기간 예컨대, 2일 동안 배양한다. 이 실시 (예)에서는 암세포로 쥐의 간에서 유래한 Hepa-1c1c7 세포 주를 사용하고, 대식세포로 Raw264.7 세포 주를 사용한다. 각 세포는 1% 페니실린/스트렙토마이신과 10% 우태혈청을 함유하고 있는 MEM, DMEM 배지에서 배양시킨다.

이 상태로 단계 S220에서 배지의 교환 없이 37 ℃, 5% CO₂의 항온 배양기에서 2일 동안 세포 융합을 진행한다. 그 결과, 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포가 만들어진다. 이 때, 융합된 하이브리드 세포를 투과 전자 현미경을 통해 확인한 결과가 도 7a 내지 도 7c에 도시되어 있다.

이어서 단계 S230에서 융합 세포의 전이 능력 및 이동성을 확인한다. 이 실시 (예)에서는 융합 세포의 전이 능력을 모니터링하기 위하여, 융합이 완료된 세포들을 12-웰 플레이트에 1.5 X 10⁵의 양으로 37℃, 5% CO₂의 항온 배양기에서 24시간 동안 배양시킨 후, 면역 세포 화학(Immunocytochemistry : ICC)법을 이용하여 전이능력을 확인한다. 이 때, 사용한 항체는 Epithelial 단백질 표지자로 알려진 EpCaM(Abcam, Cambridge, UK)과, Mesenchymal 단백질 표지자로 알려진 Fibronectin(Abcam, Cambridge, UK)이다. 도 8a 내지 도 9c는 이의 결과를 나타낸 사진들이다.

그리고 융합 세포의 이동성을 모니터링하기 위하여, 융합이 완료된 세포들을 12-웰 플레이트에 1.5 X 10⁵의 양으로 37℃, 5% CO₂의 항온 배양기에서 24시간 동안 배양시킨 후, 도 10a 내지 도 11b에 도시된 바와 같이, 세포가 가득 찬 플레이트의 가운데 부분을 10μl의 피펫 팁(pipet tip)으로 선(점선으로 표시됨)을 그어 빈 공간을 만들어준 후, 다시 24시간 동안 배양시키는 Wound healing assay를 수행하여 세포의 이동성을 확인한다.

다시 도3에서 융합 세포의 융합 효율을 모니터링하기 위하여, 단계 S240에서 세포 융합에 이용하는 배양 배지를 단계 S210과 동일한 조건으로 조성한 후, 세포를 일정 기간 예컨대, 2일 동안 배양하고, 암세포와 대식세포 각각에 서로 다른 형광색의 나노 입자를 주입하여 형광 염색을 처리한다. 이 실시 (예)에서는 암세포로 쥐의 간에서 유래한 Hepa-1c1c7 세포주를 사용하고, 대식세포로 Raw264.7 세포 주를 사용한다. 각 세포는 1% 페니실린/스트렙토마이신과 10% 우태혈청을 함유하고 있는 MEM, DMEM 배지에서 배양시킨다. 이때, 이후 세포 융합을 확인하기 위하여 형광염색을 함께 진행한다. 암세포인 Hepa-1c1c7는 FITC 나노 입자를, Raw264.7은 RITC 나노 입자를 각각 배양 배지에 넣어준 후, 100 mm 조직 배양 플레이트에 1 X 10⁶개의 양으로 37℃, 5% CO₂의 항온 배양기에서 하루 동안 배양시킨다.

이 실시 (예)에서는 FITC로 형광 표지한 암세포와 RITC로 형광 표지한 대식세포를 하나의 플레이트에 배양시킨다. 이 때, 배양 배지는 저산소 상태를 만들어주기 위해 염화코발트(CoCl₂)를 처리한다. 이 상태로 단계 S250에서 배지의 교환 없이 37 ℃, 5% CO₂의 항온 배양기에서 2일 동안 세포 융합을 진행한다.

단계 S260에서 융합 세포의 융합 효율을 확인한다. 이 실시 (예)에서는 2일 동안 동일한 배양 배지에서 세포 융합이 진행된 세포들을 Trypsin-EDTA를 이용하여 플레이트 바닥에서 떼어낸 후, 6-웰 플레이트(6-well plates)에 3 X 10⁵의 양으로 37℃, 5% CO₂의 항온 배양기에서 24시간 동안 배양시킨 후 세포 융합을 확인한다. 이 때, 형광 현미경을 통해 확인해본 결과, 융합이 되지 않은 암세포는 도 5a 및 도 5b, 도 5c에 도시된 바와 같이, 초록색으로 나타나고, 대식세포는 빨간색으로, 그리고 융합에 성공한 세포는 두 형광 물질이 합쳐져 주황색으로 나타난다.

즉, 도 5a를 참조하면, 이 실시 (예)에서 쥐의 간암세포는 Hepa1c1c7 세포 주를 사용하고, 대식세포는 RAW264.7 세포 주를 사용한다. 이 때, 간암세포와 대식세포를 함께 배양하기 위해 아무런 처리도 하지 않는다. 또 세포 융합을 확인하기 위하여 간암세포와 대식세포 각각에 서로 다른 색상의 형광을 갖는 나노 입자 즉, 간암세포에는 FITC 나노 입자를, 대식세포에는 RITC 나노 입자를 주입하여 염색을 진행한다. 그 결과, 간암세포는 초록색으로 나타나고, 대식세포는 빨간색으로 나타난다.

도 5b를 참조하면, 이 실시 (예)에서 배양 배지를 암세포의 생장 환경의 특징 중 하나인 저산소 환경으로 조성하기 위하여 저산소 챔버(2% O₂, 5% CO₂, and 93% N₂)를 사용한다. 또한 도 5c를 참조하면, 염화코발트(CoCl₂)를 처리하여 저산소 환경을 조성한다. 이러한 환경 조건에서 간암세포와 대식세포를 일정 기간 동안 배양한 결과, 융합에 성공한 세포는 두 형광 물질이 합쳐져서 주황색으로 나타난다.

도 5d는 도 5a 내지 5c의 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 융합되지 않은 암세포를 포함한 전체 암세포 수(녹색, 주황색 형광)에 대비하여 융합이 성공하여 주황색으로 보이는 세포들의 수의 비율을 보여준다.

도 6은 도 3의 실시 (예)에 따른 세포 융합 방법을 다양한 세포에 적용하여 인간 폐암세포(A-549)및 쥐 폐암세포(LA-4), 쥐 신장세포(RAG)와 대식세포를 융합한 전이성 하이브리드 세포의 형광 사진이다.

도 13을 참조하면, 도 5 내지 6의 실시 (예)에서 볼 수 있는 다양한 세포에서의 융합 효율을 정량적으로 측정하였다. 실험에 사용된 세포는 간암(Hepa-1c1c7), 폐암(LA4, A549), 신장암(RAG)의 세포주이다. 각각의 세포를 도 5와 동일한 조건으로 대식세포와 융합한 후, 융합되지 않은 암세포를 포함한 전체 암세포(녹색, 주황색) 대비, 융합에 성공한 암세포(주황색)의 비율을 보여준다.

계속해서 도 8a 내지 도 8c는 도 3의 실시 (예)에 따른 세포 융합 방법을 사용하여 만들어진 암세포, 대식세포 및 하이브리드 세포 각각을 Epithelial 단백질 표지자인 EpCam을 형광염색(red)을 통해 보여주는 사진들이고, 도 9a 내지 도 9c는 도 3의 실시 (예)에 따른 세포 융합 방법을 사용하여 만들어진 암세포, 대식세포 및 하이브리드 세포 각각을 Mesenchymal 단백질 표지자인 Fibronectin을 형광염색(red)을 통해 보여주는 사진들이다.

도 8a 내지 도 9c를 참조하면, 이 사진들은 본 발명의 융합 방법에 의해 제조된 하이브리드 세포의 Fibronectin과 EpCam을 형광염색(red)을 통해 보여줌으로써 융합 세포의 전이성을 보여준다.

전이성을 갖는 세포는 epithelial 성질은 약하고 mesenchymal 성질이 강하다. 따라서 전이성을 가진 융합세포는 Epithelial 단백질 표지자인 EpCam은 발현이 적고 Mecenchymal 단백질 표지자인 Fibronectin의 발현양은 많다.

도 10a 및 도 10b는 도 8a 및 도 9a에 나타나는 암세포(Hepa1c1c7)의 이동을 보여주는 광학 사진들이고, 도 11a 및 도 11b는 도 8c 및 도 9c에 나타나는 하이브리드 세포의 이동성을 보여주는 광학 사진들이며, 그리고 도 12는 도 10a 내지 도 11b에 나타나는 세포의 이동 정도를 그래프로 정량한 도면이다.

도 10a 내지 도 11b를 참조하면, 이 사진들은 암세포, 대식세포 및 하이브리드 세포들 각각의 이동성을 비교하기 위한 것으로, 도 3의 단계 S230에서와 같이, 암세포, 대식세포 및 하이브리드 세포들 각각이 가득 찬 플레이트의 가운데 부분을 10μl의 피펫 팁(pipet tip)으로 선(점선으로 표시됨)을 그어 빈 공간을 만들어준 후, 다시 24시간 동안 배양시키는 Wound healing assay를 수행하여 세포의 이동성을 확인한다.

그 결과, 도 12에 도시된 바와 같이, 본 발명의 하이브리드 세포는 암세포와 비교했을 때, 플레이트의 빈 공간으로 더 많이 이동한 것을 확인할 수 있다.

이상에서, 본 발명에 따른 저산소 환경을 이용한 전이암 하이브리드 세포의 제조방법에 대한 구성 및 작용을 상세한 설명과 도면에 따라 도시하였지만, 이는 실시 (예)를 들어 설명한 것에 불과하며, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변화 및 변경이 가능하다.

따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims

암세포와 대식세포를 융합하여 전이성을 갖는 전이암 하이브리드 세포의 제조 방법에 있어서:
상기 암세포와 상기 대식세포가 융합되는 배양 배지를 상기 암세포의 생체 내 미세 환경의 특징 중 하나인 저산소 환경으로 조성하여 상기 암세포와 상기 대식세포를 융합하되;
상기 저산소 환경은,
상기 배양 배지에 염화코발트(CoCl₂)를 처리하되, Hepa1c1c7 세포의 생존율을 80 % 이상의 조건으로 하는 경우, 염화코발트(CoCl₂)의 125 μM 이하의 농도로 48시간 동안 처리되는 것을 특징으로 하는 저산소 환경을 이용한 전이암 하이브리드 세포의 제조방법.
제 1항에 있어서,
대식세포는 동물종의 혈관에서 추출한 단구세포를 분화시킨 세포이거나 동물종 유래의 대식세포 세포주인 것을 특징으로 하는 세포이고;
암세포는 위암 (Gastric cancer), 간암 (Liver cancer), 폐암 (Lung cancer), 유방암 (Breast cancer), 난소암 (Ovarian cancer), 기관지암 (bronchial cancer), 구강암 (Oral cavity cancer), 후두암 (Larynx cancer), 췌장암 (Pancreatic cancer), 대장암 (Colorectal cancer), 방광암 (Bladder cancer), 결장암 (Colon cancer), 자궁경부암 (Uterine cervical cancer), 전립선암 (Prostate cancer), 신장암 (Kidney cancer), 피부암 (Skin cancer), 갑상선암 (Thyroid cancer), 뇌암 (Brain cancer) 세포로 이루어지는 군에서 선택된 암세포이거나 이들 세포에서 유래된 세포주인 것을 특징으로 하는 저산소 환경을 이용한 전이암 하이브리드 세포의 제조방법.
삭제