CN116064620A - 一种增强向肿瘤部位浸润能力的car-nk细胞制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种转基因细胞及其应用，所述转基因细胞表达嵌合抗原受体以及趋化因子受体，所述趋化因子受体包括CXCR2和CXCR6。所述转基因细胞能够同时表达和分泌嵌合抗原受体和趋化因子受体，使得转基因细胞能够靶向肿瘤抗原，提高CAR‑淋巴细胞向实体瘤内部浸润的能力，同时增强CAR淋巴细胞的抗肿瘤活性，并应用于实体瘤和血液瘤的治疗。

Description

一种增强向肿瘤部位浸润能力的CAR-NK细胞制备及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及一种CAR-NK细胞的制备及其在肿瘤治疗中的用途，更具体地，本发明涉及一种增加CAR-NK细胞向肿瘤部位浸润能力的构建体、表达载体、转基因细胞、药物组合物及其用途。
背景技术
近年来，嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T，CAR-T)细胞在血液恶性肿瘤治疗中取得了令人瞩目的效果。但是CAR-T细胞在临床应用中易产生细胞因子风暴、神经毒性、移植物抗宿主病(GVHD)等不良反应。另外，目前CAR-T细胞对实体瘤的治疗效果尚不理想，使得CAR-T细胞的临床应用仍面临挑战。CAR-NK细胞较CAR-T细胞具有安全性好的优势，一般不会引起细胞因子风暴和GVHD等副作用；NK细胞不需要抗原递呈、不受MHC限制，即可发挥直接的杀伤肿瘤细胞的作用；CAR-NK细胞可以以CAR依赖和NKR依赖等多种识别机制识别和杀伤肿瘤，抗瘤谱广。因此，CAR-NK细胞在抗肿瘤治疗中具有广泛的应用前景，已成为细胞免疫治疗研发领域的热点。然而，CAR-NK细胞治疗实体瘤面临的难题之一是NK细胞难以浸润到实体瘤内部，影响实体瘤患者NK细胞输注临床结果的重要制约因素是未能有足量的NK细胞迁移至肿瘤部位发挥杀瘤作用，将NK细胞有效运输到肿瘤部位是癌症免疫治疗成功的关键。因此，提高NK细胞向实体瘤内部浸润的能力成为基因修饰NK细胞的重要研发策略。
趋化因子和趋化因子受体在T或NK细胞等淋巴细胞向肿瘤迁移过程中起着重要作用。淋巴细胞可以通过细胞表面的趋化因子受体被肿瘤分泌的趋化因子吸引招募而被引导进入肿瘤部位。CXCR2为多种趋化因子(CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL7和CXCL8)的受体。这些趋化因子在肝癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌等多种实体瘤高表达，且与肿瘤增殖、血管生成、侵袭转移及免疫抑制微环境的形成有关。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
发明人发现，CXCR2通常只表达于记忆B细胞和某些髓系细胞(如中性粒细胞和嗜碱性粒细胞)，人T细胞和NK细胞均不表达，因此，T细胞和NK细胞难以浸润至肿瘤部位的原因。因此，如果在淋巴细胞中过表达CXCR2有望有效促进T细胞或NK细胞向肿瘤部位的聚集，有效提高T细胞或NK细胞的抗肿瘤效果。且发明人发现，当在CAR-淋巴细胞共表达CXCR2受体时，相比于共表达CXCR6受体，其向肿瘤的趋化和靶向能力更强，对肿瘤细胞的杀伤能力更强。
为此，本发明提出了一种CAR-淋巴细胞，其表面单链抗体可以识别所有实体瘤和血液瘤的肿瘤抗原并且可以在胞内表达CXCR2受体，增强淋巴细胞向肿瘤部位的迁移能力，有效提高淋巴细胞对于肿瘤的杀伤效果。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包括第一核酸以及第二核酸。其中，第一核酸编码嵌合抗原受体，第二核酸编码趋化因子受体。
根据本发明实施例，所述构建体能够同时编码嵌合抗原受体和趋化因子受体。将本发明实施例的构建体导入淋巴细胞，在淋巴细胞表面表达嵌合抗原受体和趋化因子受体。其中，所述嵌合抗原受体能够使得淋巴细胞靶向肿瘤抗原，定位至表达所述抗原的细胞表面。此外，所述趋化因子受体能够增加淋巴细胞向肿瘤部位的浸润能力，有效提高淋巴细胞的杀伤肿瘤效果。
根据本发明的实施例，上述构建体还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括单链抗体和CD8铰链区，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述胞外区单链抗体可以特异性识别肿瘤抗原，所述单链抗体的C端与所述CD8铰链区的N端相连。
跨膜区，所述跨膜区包括CD8跨膜区，所述CD8跨膜区的N端与所述胞外区的CD8铰链区的C端相连，并且嵌入到所述细胞细胞膜中；
胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连，所述胞内区包括4-1BB共刺激因子结构域和CD3ζ胞内信号段。
根据本发明的实施例，所述肿瘤抗原选自胚胎性蛋白、糖蛋白抗原、鳞状细胞抗原等，包括MSLN(间皮素)、HER2、EGFR、GPC3、MUC1、CEA、CLDN 18.2、EpCAM、PSCA、GD2、IL-13RA2、B7-H3、CD133、ROR1、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、BCMA的至少之一。
根据本发明的实施例，所述趋化因子受体包括选自CXCR2、CXCR6中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述趋化因子为CXCR2。CXCR2的表达使得淋巴细胞向肿瘤内部的浸润能力更强。
根据本发明的实施例，所述单链抗体具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述CD8跨膜区具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；所述4-1BB共刺激因子结构域具有如SEQID NO.3所示的氨基酸序列；所述CD3ζ胞内信号段具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述CD8铰链区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述CXCR2具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；所述CXCR6具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
DIQMAQVQLVQSGAEVKRPGASVQVSCRASGYSINTYYMQWVRQAPGAGLEWMGVINPSGVTSYAQKFQGRVTLTNDTSTNTVYMQLNSLTSADTAVYYCARWALWGDFGMDVWGKGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASIGDRVTITCRASEGIYHWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLASGAPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSNYPLTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO.1)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO.2)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO.3)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.4)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO.5)
MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLYLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL(SEQ ID NO.6)
MAEHDYHEDYGFSSFNDSSQEEHQDFLQFSKVFLPCMYLVVFVCGLVGNSLVLVISIFYHKLQSLTDVFLVNLPLADLVFVCTLPFWAYAGIHEWVFGQVMCKSLLGIYTINFYTSMLILTCITVDRFIVVVKATKAYNQQAKRMTWGKVTSLLIWVISLLVSLPQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAISTVVLATQMTLGFFLPLLTMIVCYSVIIKTLLHAGGFQKHRSLKIIFLVMAVFLLTQMPFNLMKFIRSTHWEYYAMTSFHYTIMVTEAIAYLRACLNPVLYAFVSLKFRKNFWKLVKDIGCLPYLGVSHQWKSSEDNSKTFSASHNVEATSMFQ(SEQ ID NO.7)
根据本发明的实施例，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子被设置为转基因细胞中表达所述嵌合抗原受体以及所述趋化因子受体，并且所述嵌合抗原受体以及所述趋化因子受体呈非融合形式。根据本发明的实施例，表达后的所述嵌合抗原受体以及所述趋化因子受体单独存在，可分别独立地发挥各自地靶向和趋化肿瘤细胞的功能。
根据本发明的实施例，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子设置于同一载体上。
根据本发明的实施例，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子设置于不同的载体上。
根据本发明的实施例，所述内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，所述内部核糖体进入位点具有SEQ IDNO：8所示的核苷酸序列。
TGAGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATG(SEQ IDNO：8)
根据本发明的实施例，所述第三核酸分子，设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，并且所述第三核酸分子编码自剪切肽P2A，所述自剪切肽P2A能够在所述转基因细胞中被切割。
根据本发明的实施例，所述自剪切肽P2A具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：9)
根据本发明的实施例，所述第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；同样的，第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。这样与启动子相连的核酸分子可以单独启动转录过程，与其他核酸分子的表达互不干扰。
根据本发明的实施例，所述第一启动子和所述第二启动子分别独立地选自CMV,EF-1,RSV启动子。
需要说明的是，本申请所述的“构建体”既可以是目的基因序列也可以是导入目的基因序列的载体。
根据本发明的实施例，所述构建体是非致病性病毒载体。
根据本发明的实施例，所述非致病性病毒选自反转录病毒、慢病毒和腺病毒等相关病毒。
根据本发明的实施例，所述非致病性病毒为慢病毒。
根据本发明的实施例，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列；
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATCCCCGACATCCAGATGGCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAGGCCTGGGGCCTCAGTGCAGGTATCCTGCAGAGCATCTGGCTATAGTATCAATACTTACTATATGCAGTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGAGCAGGCCTTGAGTGGATGGGCGTTATCAACCCCAGTGGTGTCACAAGTTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACTTTGACCAACGACACGTCCACAAACACAGTCTACATGCAGTTGAACAGTCTGACATCTGCCGACACGGCCGTCTACTACTGTGCGAGATGGGCCTTATGGGGGGACTTCGGTATGGACGTCTGGGGCAAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTATTGGAGACAGAGTCACCATCACCTGCCGGGCCAGTGAGGGTATTTATCACTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATAAGGCCTCTAGTTTAGCCAGTGGGGCCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAATATAGTAATTATCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO：10)
根据本发明的实施例，所述第二核酸分子具有SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。
GCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTGCGATGGAAGATTTTAACATGGAGAGTGACAGCTTTGAAGATTTCTGGAAAGGTGAAGATCTTAGTAATTACAGTTACAGCTCTACCCTGCCCCCTTTTCTACTAGATGCCGCCCCATGTGAACCAGAATCCCTGGAAATCAACAAGTATTTTGTGGTCATTATCTATGCCCTGGTATTCCTGCTGAGCCTGCTGGGAAACTCCCTCGTGATGCTGGTCATCTTATACAGCAGGGTCGGCCGCTCCGTCACTGATGTCTACCTGCTGAACCTAGCCTTGGCCGACCTACTCTTTGCCCTGACCTTGCCCATCTGGGCCGCCTCCAAGGTGAATGGCTGGATTTTTGGCACATTCCTGTGCAAGGTGGTCTCACTCCTGAAGGAAGTCAACTTCTATAGTGGCATCCTGCTACTGGCCTGCATCAGTGTGGACCGTTACCTGGCCATTGTCCATGCCACACGCACACTGACCCAGAAGCGCTACTTGGTCAAATTCATATGTCTCAGCATCTGGGGTCTGTCCTTGCTCCTGGCCCTGCCTGTCTTACTTTTCCGAAGGACCGTCTACTCATCCAATGTTAGCCCAGCCTGCTATGAGGACATGGGCAACAATACAGCAAACTGGCGGATGCTGTTACGGATCCTGCCCCAGTCCTTTGGCTTCATCGTGCCACTGCTGATCATGCTGTTCTGCTACGGATTCACCCTGCGTACGCTGTTTAAGGCCCACATGGGGCAGAAGCACCGGGCCATGCGGGTCATCTTTGCTGTCGTCCTCATCTTCCTGCTCTGCTGGCTGCCCTACAACCTGGTCCTGCTGGCAGACACCCTCATGAGGACCCAGGTGATCCAGGAGACCTGTGAGCGCCGCAATCACATCGACCGGGCTCTGGATGCCACCGAGATTCTGGGCATCCTTCACAGCTGCCTCAACCCCCTCATCTACGCCTTCATTGGCCAGAAGTTTCGCCATGGACTCCTCAAGATTCTAGCTATACATGGCTTGATCAGCAAGGACTCCCTGCCCAAAGACAGCAGGCCTTCCTTTGTTGGCTCTTCTTCAGGGCACACTTCCACTACTCTCTGA(SEQ ID NO：11)在本发明的第二方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体包括上文所述的构建体。根据本发明实施例的表达载体导入受体细胞后，可在受体细胞的膜表面同步表达嵌合抗原受体以及趋化因子受体。
根据本发明的实施例，所述表达载体为慢病毒病毒载体。
根据本发明的实施例，所述表达载体为腺病毒载体、非致病性载体或逆转录病毒载体。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种慢病毒载体。根据本发明的实施例，所述慢病毒载体具有SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATCCCCGACATCCAGATGGCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAGGCCTGGGGCCTCAGTGCAGGTATCCTGCAGAGCATCTGGCTATAGTATCAATACTTACTATATGCAGTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGAGCAGGCCTTGAGTGGATGGGCGTTATCAACCCCAGTGGTGTCACAAGTTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACTTTGACCAACGACACGTCCACAAACACAGTCTACATGCAGTTGAACAGTCTGACATCTGCCGACACGGCCGTCTACTACTGTGCGAGATGGGCCTTATGGGGGGACTTCGGTATGGACGTCTGGGGCAAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTATTGGAGACAGAGTCACCATCACCTGCCGGGCCAGTGAGGGTATTTATCACTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATAAGGCCTCTAGTTTAGCCAGTGGGGCCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAATATAGTAATTATCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTGCGATGGAAGATTTTAACATGGAGAGTGACAGCTTTGAAGATTTCTGGAAAGGTGAAGATCTTAGTAATTACAGTTACAGCTCTACCCTGCCCCCTTTTCTACTAGATGCCGCCCCATGTGAACCAGAATCCCTGGAAATCAACAAGTATTTTGTGGTCATTATCTATGCCCTGGTATTCCTGCTGAGCCTGCTGGGAAACTCCCTCGTGATGCTGGTCATCTTATACAGCAGGGTCGGCCGCTCCGTCACTGATGTCTACCTGCTGAACCTAGCCTTGGCCGACCTACTCTTTGCCCTGACCTTGCCCATCTGGGCCGCCTCCAAGGTGAATGGCTGGATTTTTGGCACATTCCTGTGCAAGGTGGTCTCACTCCTGAAGGAAGTCAACTTCTATAGTGGCATCCTGCTACTGGCCTGCATCAGTGTGGACCGTTACCTGGCCATTGTCCATGCCACACGCACACTGACCCAGAAGCGCTACTTGGTCAAATTCATATGTCTCAGCATCTGGGGTCTGTCCTTGCTCCTGGCCCTGCCTGTCTTACTTTTCCGAAGGACCGTCTACTCATCCAATGTTAGCCCAGCCTGCTATGAGGACATGGGCAACAATACAGCAAACTGGCGGATGCTGTTACGGATCCTGCCCCAGTCCTTTGGCTTCATCGTGCCACTGCTGATCATGCTGTTCTGCTACGGATTCACCCTGCGTACGCTGTTTAAGGCCCACATGGGGCAGAAGCACCGGGCCATGCGGGTCATCTTTGCTGTCGTCCTCATCTTCCTGCTCTGCTGGCTGCCCTACAACCTGGTCCTGCTGGCAGACACCCTCATGAGGACCCAGGTGATCCAGGAGACCTGTGAGCGCCGCAATCACATCGACCGGGCTCTGGATGCCACCGAGATTCTGGGCATCCTTCACAGCTGCCTCAACCCCCTCATCTACGCCTTCATTGGCCAGAAGTTTCGCCATGGACTCCTCAAGATTCTAGCTATACATGGCTTGATCAGCAAGGACTCCCTGCCCAAAGACAGCAGGCCTTCCTTTGTTGGCTCTTCTTCAGGGCACACTTCCACTACTCTCTGA(SEQ ID NO:12)
根据本发明实施例的慢病毒载体导入受体细胞后，可在受体细胞的膜表面同步表达嵌合抗原受体以及趋化因子受体。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种转基因细胞。根据本发明的实施例，所述转基因细胞携带上文所述的构建体、表达载体、慢病毒载体或表达嵌合抗原受体以及趋化因子受体，并且所述嵌合抗原受体以及所述趋化因子受体呈非融合形式。
根据本发明的实施例，所述嵌合抗原受体以及所述趋化因子受体如本发明第一方面所限定的。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种CAR-淋巴细胞。根据本发明的实施例，所述CAR-淋巴细胞携带本发明第一方面所述的构建体、本发明第二方面所述的表达载体、本发明第三方面所述的慢病毒载体或表达嵌合抗原受体以及趋化因子受体，并且所述嵌合抗原受体以及所述趋化因子受体呈非融合形式。
根据本发明的实施例，所述嵌合抗原受体以及所述趋化因子受体如本发明第一方面所限定的。
根据本发明的实施例，所述CAR-淋巴细胞包括选自NK-92细胞，外周血NK细胞、脐带血NK细胞、iPSC、CAR-T细胞、CAR-NKT细胞、CAR-γδT细胞、CAR-巨噬细胞中的至少之一。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的构建体、本发明第二方面所述的表达载体、本发明第三方面所述的慢病毒载体、本发明第四方面所述的转基因细胞以及本发明第五方面所述的CAR-淋巴细胞。
根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括：药学上可接受的辅料。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种药物组合物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述本发明第一方面所述的构建体、本发明第二方面所述的表达载体、本发明第三方面所述的慢病毒载体、本发明第四方面所述的转基因细胞、本发明第五方面所述的CAR-淋巴细胞以及本发明第六方面所述的药物组合物可用于实体瘤或血液瘤的免疫治疗。
根据本发明的实施例，所述实体瘤包括选自发生在脏器中的有形瘤，包括胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤、肝癌、胆管癌、胃癌、结直肠癌、食管癌、肺癌、头颈癌、宫颈癌、脑胶质瘤、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤的至少之一。
根据本发明的实施例，所述血液瘤包括选自血细胞和造血系统内的急性髓系白血病、急性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤的至少之一。
附图说明
图1是根据本发明实施例1的靶向MSLN的CAR的结构模式图以及连接P2A及CXCR2或CXCR6受体的CAR的结构模式图，其中，SP表示编码信号肽的核苷酸序列，α-MSLN-scFv表示编码抗MSLN单链抗体的核苷酸序列，CD8 hinge+TM表示编码CD8铰链区和跨膜区的核苷酸序列，4-1BB表示编码4-1BB共刺激因子结构域的核苷酸序列，CD3ζ表示编码CD3Z胞内区的核苷酸序列，P2A表示编码P2A自剪切肽的核苷酸序列，CXCR2表示编码CXCR2全长的核苷酸序列，CXCR6表示编码CXCR6全长的核苷酸序列；
图2是根据本发明实施例2的定量PCR检测胰腺癌细胞趋化因子表达的结果图；
图3是根据本发明实施例2的ELISA检测胰腺癌肿瘤细胞中趋化因子CXCL8分泌水平的结果图；
图4是根据本发明实施例2的ELISA检测胰腺癌肿瘤细胞中趋化因子CXCL16分泌水平的结果图；
图5是根据本发明实施例2的NK-92、anti-MSLNCAR-NK-92和anti-MSLNCAR-CXCR2-NK-92细胞CXCR2的表达水平检测结果图；
图6是根据本发明实施例2的NK-92、anti-MSLN CAR-NK-92和anti-MSLN CAR-CXCR6-NK-92细胞CXCR6的表达水平检测结果图；
图7是根据本发明实施例2的NK-92、anti-MSLNCAR-NK-92、anti-MSLNCAR-CXCR2-NK-92与anti-MSLN CAR-CXCR6-NK-92细胞趋化能力检测结果图；
图8是根据本发明实施例2的NK-92、anti-MSLNCAR-NK-92和anti-MSLNCAR-CXCR2-NK-92细胞体外杀伤能力检测结果图；
图9是根据本发明实施例3的NK-92、anti-MSLNCAR-NK-92和anti-MSLNCAR-CXCR2-NK-92细胞抗肿瘤能力检测结果图；
图10是根据本发明实施例3的NK-92、anti-MSLNCAR-NK-92和anti-MSLNCAR-CXCR2-NK-92细胞向肿瘤内部浸润检测结果图；
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在对本发明描述的过程中，对于本文中有关的术语进行了解释和说明，这些解释和说明仅仅是为了方便对于方案的理解，并不能看做是对本发明保护方案的限制。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为病毒载体、质粒、噬菌体等等。根据本发明的一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的分离的核酸的表达，进而实现所述分离的核酸编码的蛋白质的体外大量获得。
本申请构建了一种同时表达嵌合抗原受体和免疫刺激分子的转基因细胞，其中，所述嵌合抗原受体靶向的抗原包括胚胎性蛋白、糖蛋白抗原、鳞状细胞抗原等，包括MSLN、HER2、EGFR、GPC3、MUC1、CEA、CLDN 18.2、EpCAM、PSCA、GD2、IL-13RA2、B7-H3、CD133、ROR1、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、BCMA中的至少之一，定位至表达所述抗原的细胞表面，所述构建体能够表达CXCR2、CXCR6受体至少之一，提高CAR-淋巴细胞向实体瘤内部浸润的能力，同时增强CAR淋巴细胞的抗肿瘤活性，并应用于实体瘤和血液瘤的治疗。
下面将更详细地描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，以下实施中所述的“质粒”与“载体”具有相同的意义，可互换使用。
实施例1：Anti-MSLN-CAR-CXCR2-NK细胞的制备
1.CAR表达质粒的构建
本发明设计的靶向间皮素的CAR载体(anti-MSLN-CAR)序列，包含靶向识别MSLN的胞外段(anti-MSLN scFv)、CD8铰链(Hinge)区与跨膜段、4-1BB胞内共刺激因子结构域与胞内信号转导分子CD3ζ及由P2A自剪切肽连接的CXCR2基因片段。基因元件结构示意图见图1。
anti-MSLN-CAR-CXCR2载体的构建：以pSBbi-MSLN CAR-GP质粒为模板扩增anti-MSLN-CAR基因片段，从pENTER-CXCR2或pENTER-CXCR6载体(维真生物)扩增CXCR2或CXCR6基因片段，酶切后获得的CXCR2或CXCR6基因片段连接到pSBbi-MSLN CAR-GP质粒上，连接成anti-MSLNCAR-CXCR2或anti-MSLNCAR-CXCR6片段，经转化、鉴定、测序正确后，扩增anti-MSLNCAR-CXCR2或anti-MSLNCAR-CXCR6片段并将之插入至慢病毒载体pLent-EF1a-P2A-GFP的AsiSI和MIuI酶切位点之间，构建pLent-EF1a-anti-MSLNCAR-P2A-CXCR2-GFP或pLent-EF1a-anti-MSLNCAR-P2A-CXCR6-GFP载体，测序验证序列正确。
1.2慢病毒的包装及病毒液浓缩
取处于对数生长期的293T细胞5×106接种于10cm的培养皿中，加入10mL DMEM培养基，37℃、5％ CO2培养箱中培养过夜。待细胞密度达到80％时，更换10mL新鲜的DMEM培养基，继续置于培养箱中培养。配制慢病毒包装体系：将6μg psPAX2质粒，3μgpMD2.G质粒与6μg目的基因载体质粒加入至体积为250μL无血清DMEM培养基中，混合均匀，配制DNA混合液；将15mL
Figure BDA0003984090910000111
加到体积为235μL的无血清DMEM培养基中，混合均匀。将
Figure BDA0003984090910000112
混合液一次性加入到DNA混合液中，静置混匀，室温孵育15min。将混合液加入293T细胞培养皿中。24h后进行换液，同时观察荧光阳性率。将培养皿放回37℃，5％ CO2培养箱中，48h后收取细胞上清，400×g离心5min，去除细胞碎片，将上清用0.45mm的滤头过滤至新的50ml离心管中。加入5×PEG8000溶液，上下颠倒离心管混合均匀，放于4℃冰箱中过夜。将离心管置于4℃，4000×g离心机中离心20min，弃上清，加适量无血清DMEM培养基重悬病毒沉淀，分装至EP管中，放于-80℃冰箱中保存。
1.3慢病毒滴度检测
取对数生长期的293T细胞，调整浓度为1×105/mL。取24孔板，每孔加1mL细胞悬液(1×105/孔)，设置3个加入病毒体积梯度。置于37℃、5％ CO2培养箱过夜培养。先将浓缩病毒液进行10倍稀释：取1.5mL EP管，吸取60μL病毒浓缩液到EP管中，用540μL DMEM培养基进行稀释，混合均匀。对293T细胞用新鲜DMEM培养基进行换液，分别吸取5μL、50μL与500μL稀释后病毒液加到相应的孔中，做好标记，然后将培养板放回37℃、5％ CO2培养箱中。24h后，吸弃孔板中病毒液，再加入1mL新鲜DMEM培养基。72h后，用胰酶消化收获细胞，使用流式仪检测293T细胞GFP表达率，根据下列公式换算病毒滴度：
滴度(TU/mL)＝(C×N×D×1000)/V
其中：C＝流式检测的GFP阳性率
N＝感染时细胞的数目(约为1×105)
D＝病毒载体的稀释倍数
V＝加入的稀释病毒的体积数
1.4慢病毒感染人NK细胞
取处于生长对数期的NK-92细胞(购自ATCC)，于100×g离心5min收获细胞，加入适量α-MEM培养基重悬细胞，调整细胞密度为5×105个/mL。在24孔板中分别接入5×105个NK-92细胞，病毒浓缩液1mL与鱼精蛋白(购自索莱宝，终浓度8μg/mL)，混合均匀，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。24h后，观察细胞状态，换液，将感染的细胞转移入EP管中，100×g离心5min，加入少量新鲜α-MEM培养基重悬细胞，将细胞转入细胞培养瓶中，加入10mL新鲜α-MEM培养基和IL-2(终浓度为200IU/mL)继续培养48h。将细胞转移入流式管中，加入3mL 1×PBS溶液，100×g离心5min，弃上清，弹起细胞沉淀，使用1×PBS溶液再次洗涤一遍。使用流式仪检测GFP的表达率。继续扩大培养，调整感染后NK-92细胞的状态进行扩增。将感染后的NK-92细胞通过流式仪分选GFP阳性的CAR-NK-92细胞，用于后期实验。
实施例2：Anti-MSLN CAR-NK细胞CXCR2或CXCR6的表达、趋化能力测定以及Anti-MSLN CAR-CXCR2-NK细胞杀伤功能测定
2.1胰腺癌肿瘤细胞中高表达趋化因子检测
取胰腺癌肿瘤细胞系Capan-2细胞(购自ATCC)提取cDNA，通过定量PCR检测趋化因子CXCL8(IL-8)、CXCL10、CXCL12、CXCL16与CCL18的表达，结果显示Capan-2细胞高表达CXCL8与CXCL16(图2)。进一步，通过ELISA实验检测胰腺癌肿瘤细胞系AsPC-1细胞(购自ATCC)与Capan-2细胞分泌CXCL8与CXCL16的含量。结果显示AsPC-1与Capan-2细胞均分泌CXCL8与CXCL16，且Capan-2细胞分泌CXCL8与CXCL16的含量明显高于AsPC-1细胞(图3与图4)。因此，选择CXCL8与CXCL16对应的趋化因子受体CXCR2与CXCR6作为靶点以增强NK细胞向高表达CXCL8和CXCL16趋化因子的胰腺癌等肿瘤的趋化能力。
2.2CAR-NK-92细胞CXCR2或CXCR6的表达
流式细胞术分别检测anti-MSLN CAR-CXCR2-NK-92与anti-MSLN CAR-CXCR6-NK-92细胞CXCR2或CXCR6的表达，结果显示，CXCR2在anti-MSLN CAR-CXCR2-NK-92细胞上表达率为99.0％(图5)，CXCR6在anti-MSLN CAR-CXCR6NK-92细胞上表达率为90.5％(图6)，而未修饰的NK-92细胞(不表达CXCR2、CXCR6和CAR的细胞)和anti-MSLN CAR-NK-92细胞基本无CXCR2与CXCR6表达(图5与图6)。说明CXCR2或CXCR6成功表达于NK细胞表面。
2.3Anti-MSLN CAR-CXCR2 NK-92与Anti-MSLN CAR-CXCR6 NK-92细胞的趋化能力比较
通过transwell实验检测NK细胞的趋化能力。在transwell小室上室接入3×105个NK-92细胞，下室加入600μL胰腺癌Capan-2细胞培养上清，37℃培养4h后收集下室中的细胞进行计数。结果显示，anti-MSLN CAR-CXCR2-NK-92细胞的迁移率为23.38％±2.30％，明显高于anti-MSLN CAR-NK-92、anti-MSLN CAR-CXCR6-NK-92和NK-92细胞(图7)。
2.4Anti-MSLN CAR-CXCR2 NK-92细胞的体外杀伤功能
以NK-92、anti-MSLN CAR-NK-92和anti-MSLN CAR-CXCR2-NK-92细胞为效应细胞，以胰腺癌细胞系Capan-2作为靶细胞，设置效靶比为5:1、2.5:1和1.25:1，将效应细胞与靶细胞共孵育5h，LDH释放法检测效应细胞对靶细胞的杀伤效率。结果表明，anti-MSLN CAR-CXCR2-NK-92细胞和anti-MSLN CAR-NK-92细胞对胰腺癌细胞Capan-2的杀伤效率均明显高于未修饰的NK-92细胞(图8)。说明CXCR2的表达不影响CAR-NK92细胞的杀伤效应。
实施例3：Anti-MSLN CAR-CXCR2 NK-92细胞体内抗肿瘤能力和向肿瘤内部浸润的能力
以胰腺癌Capan-2细胞皮下荷瘤建立胰腺癌异种移植模型，观察anti-MSLN CAR-CXCR2 NK92细胞对胰腺癌的治疗作用。选择6周龄雌性裸鼠，腋下皮下荷瘤，荷瘤剂量为每只小鼠5×106个Capan-2细胞。两周后，待肿瘤体积达到100mm3左右时开始治疗。首先将小鼠随机分为对照组、NK-92细胞治疗组、anti-MSLN CAR-NK-92细胞治疗组和anti-MSLN CAR-CXCR2-NK-92细胞治疗组。治疗组小鼠采用尾静脉注射效应细胞5×106/100μL/只，对照组注射等体积的1×PBS溶液，每隔一周注射一次，每隔3天腹腔注射IL-2(5×104IU/只)。每三天测量小鼠肿瘤体积，共观察治疗至56天，取肿瘤组织拍照，并测量肿瘤体积(图9)。结果可见，anti-MSLN CAR-CXCR2-NK-92细胞治疗组的肿瘤体积明显小于其他三组，说明表达CXCR2的CAR-NK细胞具有更强的体内抗肿瘤能力。
为进一步明确NK细胞的浸润情况，我们用免疫荧光的方法检测了肿瘤组织中NK细胞浸润情况。如图10所示，结果显示，未治疗组肿瘤组织中几乎没有NK细胞，NK-92治疗组肿瘤组织中有少量NK细胞，anti-MSLN CAR-NK-92细胞治疗组肿瘤组织中相对未治疗和NK92治疗组浸润的NK细胞数量增多，而anti-MSLN CAR-CXCR2-NK-92细胞治疗组肿瘤组织中浸润的NK细胞数量明显高于anti-MSLN CAR-NK-92细胞治疗组。说明表达CXCR2的CAR-NK细胞具有明显增强的向实体肿瘤内部浸润的能力。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (23)

1.一种构建体，其特征在于，包括：
第一核酸，所述第一核酸编码嵌合抗原受体；以及
第二核酸，所述第二核酸编码趋化因子受体。
2.根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：
胞外区，所述胞外区包括单链抗体和CD8铰链区，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述胞外区单链抗体可以特异性识别肿瘤抗原，所述单链抗体的C端与所述CD8铰链区的N端相连；
跨膜区，所述跨膜区包括CD8跨膜区，所述CD8跨膜区的N端与所述胞外区的CD8铰链区的C端相连；
胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连，所述胞内区包括4-1BB共刺激因子结构域和CD3ζ胞内信号段。
3.根据权利要求2所述的构建体，其特征在于，所述肿瘤抗原选自：胚胎性蛋白、糖蛋白抗原、鳞状细胞抗原等，包括MSLN、HER2、EGFR、GPC3、MUC1、CEA、CLDN 18.2、EpCAM、PSCA、GD2、IL-13RA2、B7-H3、CD133、ROR1、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、BCMA中的至少之一。
4.根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述趋化因子受体包括选自CXCR2、CXCR6中的至少之一，优选地，所述趋化因子为CXCR2。
5.根据权利要求2或权利要求4任一项所述的构建体，其特征在于，所述单链抗体具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
所述CD8跨膜区具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
所述4-1BB共刺激因子结构域具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
所述CD3ζ胞内信号段具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
所述CD8铰链区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
所述CXCR2具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；
所述CXCR6具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子被设置为转基因细胞中表达所述嵌合抗原受体以及所述趋化因子受体，并且所述嵌合抗原受体以及所述趋化因子受体呈非融合形式。
7.根据权利要求6所述的构建体，其特征在于，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子设置于同一载体上。
8.根据权利要求6所述构建体，其特征在于，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子设置于不同的载体上。
9.根据权利要求7所述的构建体，其特征在于，所述构建体进一步包括：
内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，所述内部核糖体进入位点具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
10.根据权利要求7所述的构建体，其特征在于，所述构建体进一步包括：
第三核酸分子，设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，并且所述第三核酸分子编码自剪切肽P2A，所述自剪切肽P2A能够在所述转基因细胞中被切割。
11.根据权利要求10所述的构建体，其特征在于，所述自剪切肽P2A具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求7或8所述的构建体，其特征在于，进一步包括：
第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；以及
第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。
13.根据权利要求12所述的构建体，其特征在于，所述第一启动子和所述第二启动子分别独立地选自CMV,EF-1,RSV启动子。
14.根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述构建体是非致病性病毒载体。
15.根据权利要求14所述的构建体，其特征在于，所述非致病性病毒选自反转录病毒、慢病毒和腺病毒相关病毒，优选地，所述非致病性病毒为慢病毒。
16.根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列；
第二核酸分子具有SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。
17.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求1～16任一项所述的构建体；
任选地，所述表达载体为慢病毒病毒载体；
任选地，所述表达载体为腺病毒载体、非致病性载体或逆转录病毒载体。
18.一种慢病毒载体，其特征在于，具有SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。
19.一种转基因细胞，其特征在于，携带权利要求1～16任一项所述的构建体、权利要求17所述的表达载体或权利要求18所述的慢病毒载体；或
表达嵌合抗原受体以及趋化因子受体，并且所述嵌合抗原受体以及所述趋化因子受体呈非融合形式，
其中，所述嵌合抗原受体以及所述趋化因子受体如权利要求2～5任一项所限定的。
20.一种CAR-淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞携带权利要求1～16任一项所述的构建体、权利要求17所述的表达载体或权利要求18所述的慢病毒载体；或
表达嵌合抗原受体以及趋化因子受体，并且所述嵌合抗原受体以及所述趋化因子受体呈非融合形式，
其中，所述嵌合抗原受体以及所述趋化因子受体如权利要求2～5任一项所限定的；
任选地，所述CAR-淋巴细胞包括选自NK-92细胞，外周血NK细胞、脐带血NK细胞、iPSC、CAR-T细胞、CAR-NKT细胞、CAR-γδT细胞、CAR-巨噬细胞中的至少之一。
21.一种药物组合物，其特征在于，包括：
权利要求1～16任一项所述的构建体、权利要求17所述的表达载体、权利要求18所述的慢病毒载体、权利要求19所述的转基因细胞或权利要求20所述的CAR-淋巴细胞；
任选地，进一步包括：药学上可接受的辅料。
22.权利要求1～16任一项所述的构建体、权利要求17所述的慢病毒载体、权利要求18所述的表达载体、权利要求19所述的转基因细胞、权利要求20所述的CAR-淋巴细胞或权利要求21所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于实体瘤或血液瘤的免疫治疗。
23.根据权利要求22所述的用途，其特征在于，所述实体瘤包括选自发生在脏器中的有形瘤，包括胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤、肝癌、胆管癌、胃癌、结直肠癌、食管癌、肺癌、头颈癌、宫颈癌、脑胶质瘤、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤中的至少之一；
任选地，所述血液瘤包括选自血细胞和造血系统内的急性髓系白血病、急性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤中的至少之一。
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