KR20220052992A - 다중 표적 수용체를 위한 음향 친화성 세포 선택 - Google Patents

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KR20220052992A
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루이 토스토에스
바트 립켄스
케더 씨. 치테일
벤자민 로스-존스러드
월터 엠. 주니어 프레즈
잭 살로이오
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프로디자인 소닉스, 인크.
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Abstract

물질의 분리는 친화성 결합 및 음향 영동 기술을 사용하여 달성된다. 분리 및 지지 구조를 위한 물질의 유체 혼합물이 제공된 컬럼은 지지 구조의 유동을 차단하기 위해 음향파와 함께 사용될 수 있다. 지지 구조는 유체 혼합물에서 하나 이상의 물질에 대해 친화성을 가질 수 있다. 지지 구조의 유동을 차단함으로써, 지지 구조에 결합되거나 부착된 물질도 차단된다.

Description

다중 표적 수용체를 위한 음향 친화성 세포 선택
본 출원은 2019년 8월 30일자로 출원된 미국 가특허출원 제63/101,227호의 우선권을 주장하며, 상기 특허 문헌의 내용은 참조를 위해 본 발명에 모두 병합된다.
생체 물질의 분리는 다양한 맥락에서 적용되어 왔다. 예를 들어, 다른 생체 물질에서 단백질을 분리하기 위한 분리 기술들은 여러 분석 프로세스에서 사용된다.
음향 영동은 음향 정상파와 같은 음향을 사용하여 1차 또는 호스트 유체로부터 미립자 및/또는 2차 유체를 분리하는 기술이다. 음향 정상파는 음향 대비 인자로 알려진 밀도 및/또는 압축률의 차이가 있을 때 유체의 미립자에 힘을 가할 수 있다. 정상파의 압력 프로파일은 정상파 노드에서 국부 최소 압력 진폭의 영역과 정상파 안티-노드에서 국부 최대 압력 진폭의 영역을 포함한다. 그러한 밀도 및 압축률에 따라, 미립자들은 정상파의 노드 또는 안티-노드로 드라이브되어 포획될 수 있다. 일반적으로, 정상파의 주파수가 높을수록, 포획될 수 있는 미립자가 작아진다.
본 발명은 물질의 음향 분리를 위한 방법, 시스템 및 장치를 제공하기 위한 것이다.
본 개시는 물질의 음향 분리를 위한 방법, 시스템 및 장치에 관한 기술을 설명한다. 분리되는 물질은 생체 물질일 수 있다. 그러한 분리는 물질 지지 구조를 사용할 수 있다. 상기 지지 구조는 비드일 수 있다. 기능화된 물질은 분리될 하나 이상의 물질에 대한 친화성을 갖는 지지 구조에 적용될 수 있다. 상기 지지 구조는 물질을 포함하는 유체에 혼합될 수 있다. 그러한 유체 혼합물은 유체 컬럼 또는 유동 챔버에 제공될 수 있다. 지지 구조가 통과하는 것을 방지할 수 있는 컬럼의 일단부에 음향 정상파의 제공에 의해 컬럼을 통한 유체 또는 유체 혼합물 유동에 대해 지지 구조가 컬럼에 유지될 수 있다.
일부의 예에 따르면, 폐쇄되고, 자동화되고 및/또는 일회용인 특징을 포함할 수 있는 음향 친화성 시스템이 구현된다. 구성 요소가 야외 환경에서 밀봉될 수 있는 경우 그 시스템은 폐쇄된 것으로 간주될 수 있다. 자동화 시스템은 오퍼레이터 개입이 거의 또는 전혀 없이 자율적으로 동작할 수 있다. 그러한 시스템은 다중 재순환을 포함할 수 있는 친화성 분리 실행에 사용된 구성 요소와 물질이 친화성 분리 실행 후 분리되어 폐기될 경우 일회용이다. 일회용 시스템은 후속 실행을 위해 장비 구성 요소와 물질을 세척하고 멸균하는 추가 단계를 피할 수 있다.
일부의 예에서, 특정 표적 물질을 결합하는 유체 챔버에 분포된 기능화된 물질에 의해 달성되는 생체 물질의 분리를 위한 방법, 시스템, 및 장치가 개시된다. 그러한 특정 표적 물질은 세포, 재조합 단백질 및/또는 단일클론 항체를 포함하는 미립자일 수 있다. 비드 및/또는 마이크로캐리어 구조일 수 있는 기능화된 물질은 코팅되거나 그렇지 않으면 특정 표적 물질을 끌어당기고 결합하기 위한 친화성 물질로 제공된다. 그러한 친화성 물질은 단백질, 리간드(ligand) 또는 표적 물질과 결합을 형성할 수 있는 기타 다른 물질일 수 있다.
일부의 구현 예에서, 친화성 물질 및 표적 물질은 기능화된 물질 상의 결합 부위와 항원-항체 상호 작용을 형성할 수 있다. 일부의 경우, 표적 물질 또는 기능화된 물질의 리간드가 상보적 물질 상의 매트릭스에 결합될 때 표적 물질은 기능화된 물질에 결합된다. 그러한 기능화된 물질은 기능화된 마이크로비드를 포함한다. 상기 기능화된 마이크로비드는 상응하는 항체에 대한 친화성을 갖는 특정 항원 리간드를 포함한다.
일부의 예에서, 기능화된 물질로 지지 구조에 부착된 물질은 컬럼에 남아 있는 반면, 유체의 다른 자유 물질은 물질의 분리를 제공하기 위해 음향 정상파를 통과할 수 있다. 지지 구조는 밀도, 압축률, 크기 또는 지지 구조가 유체 혼합물의 다른 물질보다 음향 정상파에 더 강하게 반응하게 하는 기타 다른 특성에 기초하는 특정 음향 대비 인자를 갖도록 구현될 수 있다.
상기 지지 구조는 친화성 프로세스를 향상시키기 위해 컬럼에서 교반될 수 있다. 다른 모드에서, 음향 정상파를 통과하는 컬럼 유체 혼합물은 컬럼으로 재순환되거나 순환되지 않을 수 있다. 컬럼 내의 유체의 유동을 조절하여 유동되게 하거나 그렇지 않게 할 수 있으며, 그리고 유동될 경우에는, 그 유동 비율을 조절할 수 있다. 유체는 컬럼에 고정되어 있을 수 있으며 온도 조정, 교반, 인큐베이션, 및/또는 기타 다른 유용한 프로세스와 같은 다른 프로세스가 컬럼에 적용될 수 있다. 컬럼의 볼륨은 컬럼에 플런저 또는 피스톤을 제공하는 것과 같이 효과적으로 수정할 수 있다. 가열 또는 냉각은 내부적으로 또는 외부적으로 컬럼 또는 컬럼의 내용물에 적용될 수 있다.
미립자는 비드를 포함할 수 있고, 여기서 상기 비드 중 적어도 하나는 직경이 약 20 내지 300 ㎛인 구를 포함하고 DEAE(N,N-디에틸아미노에틸)-덱스트란, 유리, 폴리스티렌 플라스틱, 아크릴아미드, 콜라겐, 또는 알기네이트 중 적어도 하나를 포함한다. 세포-지지 물질은 세포 성장을 위한 표면 코팅을 갖는 미세 기포를 포함할 수 있다. 세포는, 예를 들어 T-세포, MRC-5 세포 또는 줄기 세포를 포함할 수 있다.
음향 변환기는 1차원 또는 다차원에서 압력을 생성할 수 있는 음향 정상파를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 다차원에서, 음향 정상파의 힘은 크기가 동일할 수 있다. 예를 들어, 파 전파 방향의 힘은 각기 다른 방향으로 생성되는 힘과 크기가 동일할 수 있다. 지지 구조가 통과하는 것을 방지하는 데 기여하는 음향 정상파의 경계 근처에 계면 영역이 생성될 수 있다. 다중 변환기가 사용될 수 있으며, 일부는 하나 이상의 모드에서 음향파를 생성하기 위해, 나머지는 다른 상이한 모드에서 음향파를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 음향파는 1차원 또는 다차원에서 압력을 생성할 수 있는 정상파일 수 있다. 음향파는 특정 물질의 통과를 방지하고 다른 물질의 통과는 허용하는 계면 영역을 형성하는 모드로 생성될 수 있다. 음향파는 클러스터(cluster)의 중력 또는 부력이 유체 또는 음향력과 같은 클러스터의 다른 힘을 능가하여 클러스터가 음향파 밖으로 떨어지거나 상승할 때까지 크기가 증가하는 특정 물질을 포획하고 클러스터링하는 모드로 생성될 수 있다.
세포 수집은 음향 변환기를 끄거나 끄지 않고 수행할 수 있다. 지지 구조의 유동 챔버로의 응집을 향상시키는 첨가제가 적용될 수 있다. 상기 방법은 비드와 같은 지지 구조를 유동 챔버에 결합된 배양 챔버로 재순환시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 대상 환자에 주입하기 위해 수집된 세포를 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 우선적으로 포획한 후에, 상기 방법은 포획된 세포 및/또는 세포-지지 물질이 부력 또는 중력으로 인해 유체로부터 상승하거나 침강하게 하는 단계를 포함할 수 있다. 상승 또는 침강 세포 및/또는 지지 물질이 유동 챔버를 나갈 수 있다. 유체의 상승 또는 침강에 의한 분리를 위해 세포 또는 지지 물질을 포획하는 모드는 세포 및/또는 지지 물질이 유체 경로를 통과하는 것을 방지하거나 허용하는 모드를 수반할 수 있다. 통과를 방지하거나 허용하는 모드는 유체 경로를 가로지르는 계면 영역을 갖는 음향파로 구현될 수 있다.
일부의 구현 예에서, 물질은 재조합 단백질 및 단일 클론 항체, 바이러스, 및/또는 살아있는 세포(예컨대, T-세포)와 같은 표적 화합물을 포함한다. 표면에 기능화된 물질이 있거나 없는 비드 또는 마이크로캐리어는 표적 화합물 또는 구성 요소일 수 있다.
예시적인 장치는 기능화된 물질을 함유하는 유체를 수용하도록 구성된 유동 챔버를 포함할 수 있다. 그러한 유동 챔버는 컬럼 형태일 수 있다. 음향 변환기는 상기 유동 챔버와 연관되어 배열되며, 예를 들어 유동 챔버에 음향적으로 결합되어, 여기될 때 유동 챔버에 음향파 또는 신호를 제공한다. 상기 변환기의 여기는, 음향 압력 진폭이, 예를 들어 음향 변환기가 꺼진 경우와 같이 기본 레벨에서 상승하는 제1 공간 장소, 및 음향 압력 진폭이 기본 레벨에서 거의 또는 전혀 상승하지 않는, 예를 들어 음향 압력 진폭이 음향 변환기가 꺼진 경우와 동일할 수 있는 제2 공간 장소를 포함하는 챔버 내부에 다차원 음향 필드를 생성할 수 있다.
일부의 모드에서, 기능적 물질은 다차원 음향 필드의 제1 또는 제2 장소로 드라이브되어 유지될 수 있다. 다른 모드에서, 계면 영역의 에지 효과에 따라 기능적 물질이 다차원 음향 필드으로 진입하는 것을 방지할 수 있다. 분리를 위한 표적 물질을 포함하는 처리될 물질은 유동 챔버로 유동될 수 있는 데, 여기서 기능화된 물질은 기능화된 물질에 상보적인 특징을 가진 표적 물질의 일부가 기능화된 물질에 결합되는 반면 그 물질의 다른 부분이 상기 유동 챔버를 통과하도록 유지된다. 상기 챔버는 위쪽 또는 아래쪽 방향일 수 있는 수직 유동을 위해 구성될 수 있다. 상기 챔버로의 유체 경로는 그 챔버의 상부 및/또는 하부에 제공될 수 있다. 음향 변환기는 상기 챔버의 상부 및/또는 하부에 결합되어 해당 장소에서 음향 필드를 생성할 수 있다.
기능화된 마이크로캐리어는 또한 버퍼 또는 다른 프로세스 용리(elution)에 의해 표면으로부터 재조합 단백질 또는 단일 클론 항체가 용리된 후에 순환될 수 있다. 이것은, 생물 반응기로부터 발현된 단백질과 기능화된 마이크로캐리어의 더 큰 표면적 및 친화성 상호 작용을 허용하여, 음향 유동화 베드 크로마토그래피 프로세스의 효율성을 증가시킨다.
일부의 구현 예에서, 장치는 팩킹된 컬럼보다 비드 또는 세포와 같은 미립자들 사이에 더 많은 공간을 제공하는 배열로 비드와 같은 기능화된 미립자를 제공한다. 밀도가 낮을수록 비표적 생체 물질이 기능화된 미립자들 사이의 유동 경로를 막을 가능성이 줄어든다. 일부의 구현 예에서, 표적 생체 물질을 함유하는 재순환 매질은 사실상 자유 표적 생체 물질을 기능화된 미립자를 여러 번 통과시킴으로써 장치의 포획 표면적을 증가시킨다. 세포와 같은 비표적 생체 물질의 접촉 감소는 세포의 생존력을 유지하는 데 도움이 될 수 있다. 여기에 설명된 기술은 고밀도 또는 저밀도 세포 배양, 새로운 연구 애플리케이션, 대량 생산 배양 볼륨(예컨대, 1,000리터 이상), 효율적인 모니터링 및 배양 제어, 세포 배양 애플리케이션의 비용 절감 및 오염 감소에 사용될 수 있다.
본 명세서에 기술된 대상의 하나 이상의 구현의 세부사항은 첨부 도면 및 아래의 설명에 설명되어 있다. 그러한 대상의 다른 특징, 관점, 및 이점은 설명, 도면, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
본 발명에 따르면, 물질의 음향 분리를 위한 방법, 시스템 및 장치를 제공할수 있다.
본 개시는 첨부 도면을 참조하여 아래에서 더 상세히 설명되며, 여기서:
도 1은 음향 친화성 프로세스의 단순화된 도면이고;
도 2는 에지 효과 모드에서 동작되는 음향 친화성 시스템의 측면도이고;
도 3은 클러스터 모드에서 동작되는 음향 친화성 시스템의 측면도이고;
도 4는 유동화 베드 셋업의 정면도의 사진이고;
도 5는 음향 친화성 시스템 및 프로세스의 도면이고;
도 6은 음향 친화성 시스템 및 프로세스의 도면이고;
도 7은 음향 친화성 시스템 및 프로세스의 도면이고;
도 8은 음향 친화성 시스템 및 프로세스의 도면이고;
도 9는 음향 친화성 프로세스에서 친화성 포지티브 선택의 도면이고;
도 10은 음향 친화성 프로세스에서 친화성 네거티브 선택의 도면이고;
도 11은 유체 유입 비율에 대한 유지 비율을 나타내는 그래프이고;
도 12는 컬럼 볼륨에 대한 세포 생존력를 나타내는 그래프이고;
도 13은 미립자 크기의 히스토그램을 나타내는 그래프이고;
도 14는 재순환에 따른 음향 친화성 시스템 및 프로세스의 도면이고;
도 15는 재순환 장치에서 순도 및 회수율을 나타내는 막대 그래프이고;
도 16은 CD3 마커를 표적화하기 위한 기능화된 물질을 갖는 비드의 도면이고;
도 17은 상이한 타입의 비드들의 크기 분포를 나타내는 그래프이고;
도 18은 상이한 타입의 비드들에 대한 결합 비율을 나타내는 그래프이고;
도 19는 상이한 친화성 시스템들 사이의 비교 분석을 나타내는 도면이고;
도 20a 및 20b는 항체 적정 비율의 변화에 따른 세포 집단 차이를 예시하는 4개의 그래프를 나타내고;
도 21은 컬럼 볼륨에 대한 밀리리터당 세포 카운트(count)를 나타내는 크로마토그램이고;
도 22는 시간 경과에 따른 컬럼 유출의 세포 카운트를 나타내는 그래프이며;
도 23 및 24는 비드를 유지하고 음향 필드에서 비표적 세포를 통과시키는 것을 포함하는 일련의 세포 선택 동작을 나타내는 도면이다.
본 개시는 컬럼과 같은 챔버 내의 다른 물질로부터 비드 또는 코팅된 미세 기포와 같은 지지 구조를 분리하기 위해 노드 및 안티노드를 갖는 음향 정상파를 사용하는 방법, 시스템 및 장치를 설명한다. 여기에 설명된 구현 예들은 상이한 모드에서 동작될 수 있다. 예를 들어, 일부의 모드에서, 챔버에 걸쳐 특정 특성이 있는 음향파가 생성된다. 그러한 음향파는 컬럼의 일단부에 위치될 수 있는 음향 변환기에 의해 생성될 수 있다. 상기 음향파는 특정 물질이 음향파에 들어가는 것을 차단하는 반면, 다른 물질은 통과시키는 계면 영역을 생성할 수 있다. 음향파 특성은 압축률, 밀도, 크기, 음향 대비 인자와 같은 파라미터, 및 음향파에 반응하는 임의의 다른 파라미터에 기초하여 물질을 차단하거나 통과하도록 제어될 수 있다. 다른 모드들에서, 음향파는 클러스터의 중력 또는 부력이 음향 또는 유체 항력의 힘을 초과하는 지점까지 크기가 증가하는 클러스터를 형성하기 위해 물질을 포획하는 공간 장소로 생성되어 클러스터가 음향파를 빠져나가게 한다.
여기에서 논의된 모드들은 함께 또는 별도로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 그러한 모드들은 하나 이상의 음향 변환기로 사용되거나 생성될 수 있다. 음향파에 의해 생성된 음향 필드는 특정 물질의 통과를 차단하거나 허용하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 비드, 비드/세포 복합체 또는 미립자의 형태일 수 있는 세포용 지지 구조는 음향 필드를 통과하는 것이 차단될 수 있다. 세포와 같은 물질은 유체 챔버를 통과할 수 있다. 상기 지지 구조는 유체 챔버를 통과한 물질의 적어도 일부와 결합할 수 있는 기능화된 물질을 포함한다. 기능화된 물질을 통해 지지 구조에 결합된 물질은 지지 구조가 음향파와 함께 유체 챔버에 유지됨으로써 유체 챔버에 유지된다. 상기 지지 구조에 결합되지 않은 물질은 음향파를 통해 유체 챔버 밖으로 통과할 수 있다. 친화성 분리를 수행하기 위해 음향파를 사용하는 기술은 여기에 더 상세히 기술된 바와 같이 다수의 이점을 얻는다.
도 1을 참조하면, 도 1은 음향 친화성 프로세스(100)를 예시한다. 기능화된 비드(102)는 표적 및 비표적 물질을 포함하는 챔버(104)에 배치된다. 표적 물질은 비드(102)에 제공된 기능화에 대응한다. 프로세스(100)는 친화성 결합 프로세스에서 표적 물질이 비드(102)에 결합되는 것을 예시한다. 비드(102)는 변환기(106)와 반사기(108) 간 상기 변환기(106)에 의해 생성된 음향 정상파에 의해 수집되거나 영향을 받는다. 챔버(104)의 나머지 물질은 챔버(104)를 통해 유체를 유동시킴으로써 제거될 수 있는 반면, 비드(102)는 음향파에 의해 유지된다. 도 1에 예시된 프로세스(100)는 포지티브 또는 네거티브 선택 프로세스일 수 있으며, 여기서 표적 물질은 그 자체가 수집되거나 다른 물질로부터 각각 제거되는 것이 바람직하다.
일부의 예에 따르면, 폐쇄되고, 자동화되고 및/또는 일회용인 특징을 포함할 수 있는 음향 친화성 시스템이 구현된다. 구성 요소가 야외 환경에서 밀봉될 수 있는 경우 그 시스템은 폐쇄된 것으로 간주될 수 있다. 자동화 시스템은 오퍼레이터 개입이 거의 또는 전혀 없이 자율적으로 동작할 수 있다. 그러한 시스템은 다중 재순환을 포함할 수 있는 친화성 분리 실행에 사용된 구성 요소와 물질이 친화성 분리 실행 후 분리되어 폐기될 경우 일회용이다. 일회용 시스템은 후속 실행을 위해 장비 구성 요소와 물질을 세척하고 멸균하는 추가 단계를 피할 수 있다.
친화성 분리를 위한 이전 시스템은 자기 반응성 비드를 사용했다. 이러한 비드는 용해되지 않거나 생체 내에서 쉽게 소비되지 않고 우선적으로 환자에게 제공되는 모든 치료에서 완전히 제거되기 때문에 제조 프로세스 동안 문제가 발생할 수 있다. 그와 같은 비드가 본 발명의 음향 친화성 분리 시스템에서 사용될 수 있지만, 그러한 음향의 사용은 비드와 같은 지지 구조의 사용 가능성을 제공하며, 이는 특히 음향적으로 반응하도록 맞추어진다. 예를 들어, 비드는 비자기 또는 비자기 반응성일 수 있고, 음향 반응성이 높을 수 있다. 음향 반응성 비드는 다양한 물질로 구성될 수 있으므로, 사용되는 처리 시스템의 유연성이 크게 향상된다. 이러한 음향 친화성 비드는 자기 반응성 비드에 사용되는 공격적인 비드 제거 프로세스를 완화시킬 수 있는 생체 적합성의 용해성 물질로 구성될 수 있다.
음향 친화성 시스템은 현재 시스템과 비교하여 증가된 처리량을 갖도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 시스템을 통한 유체 유동 비율은 기존의 친화성 시스템에서 통상적으로 사용되는 것보다 증가될 수 있다. 시스템은 더 높은 유동 비율과 볼륨를 허용하는 더 큰 채널로 구성될 수 있다. 세포 집단의 확장은 현재 개시된 시스템 내에서 구현될 수 있거나 또는 외부에서 구현되어 음향 친화성 시스템에 제공될 수 있다.
상기 음향 친화성 시스템의 구성은 상이한 범위의 크기 또는 밀도와 같은 상이한 특성을 가질 수 있는 여러 타입의 지지 구조 또는 비드의 사용을 허용한다. 그러한 지지 구조 또는 비드의 상이한 그룹에는 단백질, 항원 또는 항체와 같은 기능화된 물질의 상이한 타입이 제공되어 친화성 분리의 다중화를 가능하게 할 수 있다. 이러한 구성을 통해 복잡한 단일 통과 친화성 선택을 실현할 수 있다.
일부의 구현 예에서, 컬럼에는 특정 타입의 세포에 대한 친화성을 갖는 비드의 볼륨이 제공된다. 컬럼에 도입된 세포들은 비드와 복합체를 형성하며, 이 복합체는 음향 기술을 사용하여 컬럼 볼륨에서 분리될 수 있다. 분리는 관심의 배양된 세포를 수확하기 위해 활용될 수 있으며, 추출된 세포는 환자에게 주입될 수 있다. 관심의 배양된 세포를 분리하기 위해 친화성 결합 시스템에 의한 음향의 사용은 다양한 세포 요법 애플리케이션, 예를 들어 백신 요법, 줄기 세포 요법, 특히 동종 및 자가 요법 또는 재생 요법에 적용할 수 있다.
유체 내의 결합되지 않은 세포 또는 물질로부터 비드 및 비드 복합체를 효과적으로 분리하기 위해 컬럼과 같은 유동 챔버에서 음향파가 생성된다. 그러한 분리는 각각 제외될 원하지 않는 물질이 비드에 결합되거나 또는 분리에서 원하는 물질이 비드에 결합되는 경우 네거티브 또는 포지티브일 수 있다. 네거티브 또는 포지티브 선택에 대한 관심의 물질은 부착 세포를 포함한 상이한 타입의 세포일 수 있다. 부착 세포의 예는 인간 다분화능 줄기 세포(hMSC), 인간 중간엽 줄기 세포(또한 hMSC), 인간 다능성 줄기 세포(hPSC), 인간 진피 섬유아세포(hDF), 인간 연골세포, 및 일부 T 림프구를 포함할 수 있다. 부착 세포는 그것들의 항원 특이성이 다를 수 있다(예컨대, CD8 부착 세포). 세포 요법에 사용되는 라인은 단일클론 또는 다중 클론(예컨대, 다중 클론 CD8 부착 세포주), 및 CAR(키메라 항원 수용체) 부착 세포(일명 인공 부착 세포 수용체, 또는 키메라 부착 세포 수용체, 또는 키메라 면역 수용체)일 수 있다. 이들은 특정 단백질을 인식하도록 변형된 T-세포이다. 음향 친화성 분리 시스템에 사용되는 비드는 네거티브 또는 포지티브 선택을 위해 이들 관심의 세포 또는 물질에 결합하거나 결합하지 않도록 구성될 수 있다.
여기에 설명된 비드 기술은 고밀도 세포 배양, 새로운 연구 애플리케이션, 대량 생산 배양 볼륨(예컨대, 1,000리터 이상), 효율적인 모니터링 및 배양 제어, 세포 배양 애플리케이션의 비용 절감 및 오염 감소에 사용할 수 있다. 사용된 비드는 Promega Corporation에서 공급하는 MAGNE 자기 친화성 비드 또는 폴리스티렌 비드, 또는 밀텐이 바이오텍(Miltenyi Biotec)에서 공급하는 MACS(자기-활성화 세포 분류) 비드와 같이 상업적으로 이용가능할 수 있다. 비드의 크기, 예를 들어 그 직경은 나노미터 또는 마이크로미터 범위일 수 있다. 구형 비드가 사용될 수 있으며, 이는 적어도 2개의 층이 있는 비드이다. 그러한 층들은 상이한 대비 인자, 구조적 강성, 또는 다중 층의 사용을 통해 단일 비드에서 결합되기를 원하는 임의의 다른 특성과 같은 상이한 특성을 가질 수 있다.
일부의 구현은 관심의 물질을 결합하기 위한 지지 구조로 미세 기포를 사용할 수 있다. 그러한 미세 기포는 단백질, 지질 또는 생체 고분자를 포함하여 관심의 세포 또는 물질에 연결할 수 있는 생체 적합성 물질 및 리간드의 쉘(shell)과 충전 가스로 구성될 수 있다. 상대적으로 용이한 제조를 위해 저밀도 유체를 사용할 수 있다. 상기 미세 기포 쉘은 뻣뻣(예컨대, 변성된 알부민)하거나 또는 유연(인지질)할 수 있으며 10 내지 200 nm의 두께를 나타낸다. 상기 충전 가스는 고분자량 및 저 용해도 충전 가스 또는 액체(과불화탄소 또는 육불화황)일 수 있으며, 이는 혈액과 같은 주변 유체에 비해 미세 기포 내부에 증기 농도를 높이고 말초 순환에서 미세 기포 안정성을 증가시킬 수 있다. 상기 미세 기포 쉘은 지질층과 같은 표면 코팅을 가질 수 있다. 그러한 지질층은 세포 또는 생체 분자와 같은 물질 성장을 위한 지지체 또는 기질로 활용될 수 있다. 활성 그룹은 유리 표면에 직접 접합하는 것이 더 쉬울 수 있다. 미세 기포는 2 내지 6 마이크로미터 범위의 직경을 가질 수 있다. 코팅된 미세 기포는 네거티브 대비 인자를 가질 수 있다.
상기 논의된 예들은 지지 구조로서 비드를 제공한다. 코팅된 기포 또는 미세 기포와 같은 다른 지지 구조도 사용될 수 있다. 편의상, 지지 구조는 여기에서 집합적으로 비드로 지칭될 수 있으며, 이러한 용어는 비드, 기포, 마이크로캐리어 및 관심의 표적 물질에 결합되거나 결합될 수 있는 임의의 다른 타입의 친화성 물질/지지 구조를 포함하는 모든 타입의 지지 구조를 포괄하도록 의도된다.
세포는 비드, 예컨대 CD3/CD28 활성화 비드에 결합된다. 하기에서 더 상세히 논의되는 바와 같이, 비드는 관심의 세포 또는 물질이 비드의 표면에 부착되거나 부착될 수 있도록 표면 화학 물질로 기능화될 수 있다. 상기 비드는 생물 반응기 또는 다른 세포 배양 시스템에서 부착 세포의 성장을 허용하는 지지 매트릭스를 포함할 수 있다. 일부의 경우, 부착 세포가 표면에 항원 없이 비드에 결합하고 비드가 기능화되거나 기능화되지 않을 수 있다. 친화성 애플리케이션의 일부의 예에는 성분채집 생성물에 대한 CD3+, CD3+CD4+ 및/또는 CD3+ CD8+ 친화성 선택의 포지티브 또는 네거티브 선택이 포함된다. 친화성 애플리케이션의 다른 예에는 TCR+ 또는 TCR- 세포의 포지티브 또는 네거티브 선택이 포함된다.
구조적으로, 비드는 1 내지 300 ㎛ 범위, 예컨대 125 내지 250 ㎛ 범위의 직경을 갖는 구체를 포함한다. 그러한 구체는 1.02-1.10g/cm³ 범위의 밀도를 가질 수 있다. 일부의 경우, 비드는 막대형 구조를 포함할 수도 있다. 비드는 매끄럽거나 거대 다공성일 수 있다.
비드의 코어는 유리, 폴리스티렌 플라스틱, 아크릴아미드, 콜라겐, 및 알지네이트와 같은 다양한 물질로 만들 수 있다. 다양한 표면 화학 물질과 함께 비드 물질은 형태 및 증식을 포함한 세포 거동에 영향을 미칠 수 있다.
비드를 유리, 콜라겐(예컨대, 중성 또는 하전 젤라틴), 재조합 단백질 또는 화학 처리와 같은 다양한 코팅으로 코팅하여 세포 부착을 향상시킬 수 있으며, 이는 다수의 상이한 세포주에 대해 보다 바람직한 세포 수율을 유도할 수 있다.
비드에 대한 표면 화학 물질은 세포외 기질 단백질, 재조합 단백질, 펩티드, 및 포지티브로 또는 네거티브로 하전된 분자를 포함할 수 있다. 마이크로캐리어의 표면 전하는 DEAE(N,N-디에틸아미노에틸)-덱스트란, 라미닌 또는 비트로넥틴 코팅(세포외 기질 단백질)을 포함한 다수의 상이한 그룹으로부터 도입될 수 있다. DEAE-덱스트란 예에서, 표면에 약한 양전하를 추가할 수 있다.
예를 들어, 생물학적 친화성 프로세스에 사용하기 위한 기능화된 물질을 갖는 비드 코팅의 다른 예는 스트렙타비딘, 단량체성 아비딘, 단백질 A, 항-CD3 뿐만 아니라, 생물학적 물질을 결합하기 위한 다른 공지된 기능화된 물질을 포함한다. 항체, 시약 및/또는 기능화된 물질의 다양한 조합을 비드와 함께 사용하여 관심의 세포에 결합할 수 있다. 관심의 세포는, 예를 들어 CD3과 같은 표적 단백질 또는 마커로 식별될 수 있다.
일부의 구현에서, 비드는 가교된 덱스트란 매트릭스를 매트릭스 전체에 분포된 포지티브로 하전된 DEAE 기로 대체함으로써 형성된다. 이러한 타입의 비드는 확립된 세포주 및 1차 세포 및 정상 이배체 세포 균주의 배양물로부터 바이러스 또는 세포 생성물의 생산에 사용될 수 있다.
일부의 구현에서, 비드는 변성 콜라겐의 얇은 층을 가교된 덱스트란 매트릭스에 화학적으로 결합함으로써 형성된다. 콜라겐 표면 층은 다양한 단백질 분해 효소에 의해 소화될 수 있기 때문에, 증가 또는 최대 세포 생존력 및 막 무결성을 유지하면서 비드에서 세포를 수확할 수 있는 기회를 제공한다. 여기에서 논의된 음향 친화성 시스템은 다수의 타입의 비드로 동작될 수 있으며, 그 중 3가지 일반적인 그룹이 아래에서 논의된다.
비드는 cGMP(현재 우수 제조 관행) 표준 또는 규정에 따라 구성 및 형성될 수 있다. 음향 친화성 시스템에 사용될 수 있는 비드의 한 가지 예시적인 그룹은 크고 조밀한 비드이다. 이러한 큰 비드는 다음과 같은 특성을 가질 수 있다.
· 비자기
· 약 50 ㎛의 평균 크기
· 더 느린 결합 활동
· 음향 기술을 사용하여 더 쉽게 분리
· 포지티브 음향 대비 인자
· 용해성 및 생체 적합성
· 폴리(락트산-코-글리콜산), PLGA
· 세포에 의해 내면화되지 않음
비드의 또 다른 예시적인 그룹은 여기에서 중간 크기 비드로 지칭되는 그룹이다. 이러한 중간 크기의 비드는 다음과 같은 특성을 가질 수 있다.
· 비자기
· 약 1-10 ㎛ 범위의 평균 크기
· 용해성 및 생체 적합성
· 큰 비드보다 빠른 결합 활동
· 큰 음향 대비 사용
· 네거티브 및 포지티브 대비
· PLGA 또는 독점 지질-기반
비드의 또 다른 예시적인 그룹은 여기에서 작은 비드로 지칭되는 것들이다. 이러한 작은 비드는 다음과 같은 특성을 가질 수 있다.
· 비자기
· 약 200 nm - 2 ㎛ 범위의 평균 크기
· 용해성 및 생체 적합성
· 매우 빠른 결합
· 클러스터링을 통한 분리
· 네거티브 대비 인자, 낮은 음속 및 고밀도
· 독점 지질-기반
상이한 타입의 애플리케이션을 위해 상이한 타입의 비드가 선택될 수 있다. 예를 들어, 세포가 비드와 함께 배양될 때 또는 친화성 결합이 비유동 모드에서 일어날 때 더 큰 비드가 사용될 수 있다.
친화성 결합에 사용되는 비드는 음향 변환기에 의해 생성된 음향파에 의해 억제되거나 통과될 수 있다. 상기 음향 변환기는 증가된 압력 방사력의 장소를 포함하는 음향 필드를 생성하기 위해 유동 챔버에서 다차원 음향 정상파를 생성할 수 있다. 상기 음향 변환기는 여기되어 진동하고 음향파를 생성하는 압전 물질을 포함할 수 있다. 상기 음향 변환기는 고차 진동 모드를 생성하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 음향 변환기의 진동 물질은 그 진동 물질의 표면에서 정상파를 얻기 위해 여기될 수 있다. 진동의 주파수는 여기 신호의 주파수와 직접적인 관련이 있다. 일부의 구현에서, 진동 물질은 유체 층, 예컨대 유체 또는 유동 챔버를 통해 유동되는 유체 내의 배양된 세포와 비드의 혼합물에 직접 노출되는 외부 표면을 갖도록 구성된다. 일부의 구현에서, 상기 음향 변환기는 진동 물질의 외부 표면을 덮는 마모 표면 물질을 포함하고, 그러한 마모 표면 물질은 두께가 반파장 이하이고 및/또는 우레탄, 에폭시 또는 실리콘 코팅, 폴리머, 또는 유사한 얇은 코팅이다. 일부의 구현에서, 상기 음향 변환기는 상단부, 하단부, 및 내부 볼륨을 갖는 하우징을 포함한다. 상기 진동 물질은 하우징의 하단부에 그리고 내부 볼륨 내에 위치될 수 있고 하우징의 상단부를 향하는 내부 표면을 갖는다. 일부의 예에서, 음향 물질의 내부 표면은 상단부 하우징에 직접 노출된다. 일부의 예에서, 상기 음향 변환기는 음향 물질의 내부 표면과 접촉하는 지지 층을 포함하고, 그러한 지지 층은 실질적으로 음향학적으로 투명한 물질로 만들어진다. 하나 이상의 구성이 다차원 음향 정상파의 생성에 사용되는 음향 변환기에서 결합될 수 있다.
상기 생성된 다차원 음향 정상파는 정상파의 축방향 뿐만 아니라 횡방향의 모든 방향에서 음향 필드의 강한 구배를 특징으로 할 수 있다. 일부의 경우, 그와 같은 구배의 강도는 음향 방사력이 mm/s 정도의 선형 속도에서 항력을 극복하기에 충분하도록 하는 것이다. 특히, 음향 방사력은 동일한 크기의 축방향 힘 성분 및 횡방향 힘 성분을 가질 수 있다. 결과적으로, 음향 구배는 횡방향으로 강한 포획력을 발생시킨다.
상기 다차원 음향 정상파는 음향 방사력의 공간 패턴을 발생시킬 수 있다. 상기 다차원 음향 정상파는 변환기에서 압전 물질의 다중 모드 섭동으로 인해 하나의 변환기와 반사기 쌍에서 생성될 수 있다. 상기 음향 방사력은 동일한 크기의 축방향 힘 성분 및 횡방향 힘 성분을 가질 수 있다. 상기 공간 패턴은 방사력의 주기적인 변화로 나타날 수 있다. 보다 구체적으로, 압력 노드 평면 및 압력 안티-노드 평면은 압력 노드 평면과 안티-노드 평면 사이에 최대 및 최소 음향 방사력 평면을 갖는 바닥의 음향 방사력 평면에 각각 대응하는 유체 매체에서 생성될 수 있다. 압력 노드 평면은 또한 음향 변위 안티-노드 평면이며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 공간 패턴은 유체 매체의 빗살형 필터와 매우 유사하게 기능할 수 있다.
아래에서 더 자세히 논의되는 일부의 모드에서, 공간 패턴은 특정 특성을 가진 미립자가 음향파에 들어가거나 가로지르는 것을 차단하는 계면 영역을 생성할 수 있다. 아래에서 더 자세히 논의되는 다른 동작 모드에서, 공간 패턴은, 예를 들어 특정 크기 또는 크기 범위의 미립자를 포획하는 데 사용될 수 있는 반면, 다른 크기 또는 크기 범위의 미립자가 포획되지 않을 수 있다. 그러한 모드들은 동일하거나 별도의 장소에서 장벽 및 포획 기능을 모두 제공하기 위해 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
다차원 음향 정상파에서, 특정 압력 노드 평면 내의 음향 방사력은 미립자가 이러한 평면 내의 여러 개별 지점에서 포획되게 한다. 미립자의 포획은 크기가 지속적으로 증가하는 미립자의 클러스터의 형성으로 이어지며, 임계 크기에 도달하면 강화된 중력 또는 부력 침강으로 인해 1차 유체에서 지속적으로 침강 또는 상승한다. 예를 들어, 공간 패턴은, 예컨대 인소니피케이션(insonification) 주파수 및/또는 위상, 전력, 전압 및/또는 변환기에 공급되는 전류, 또는 유체 속도 또는 유동 비율을 조정함으로써, 배양된 세포가 비드 또는 미세 기포와 같은 지지 구조를 포획하는 동안 자유롭게 유동되게 하도록 구성됨으로써, 유체의 세포 또는 기타 다른 물질로부터 적어도 상기 포획된 지지 구조를 분리한다.
일부의 구현 예에서, 하나 이상의 다차원 음향 정상파가 초음파 변환기와 반사기 사이에 생성된다. 음향파는 음향 변환기에서 지속적으로 발사되고 반사기에 의해 반사되어 그 발사된 음향파와 간섭하여 음향 정상파를 형성한다. 상기 음향 정상파의 형성은 일부의 예를 들면 주파수, 전력, 매체, 변환기와 반사기 사이의 거리를 포함한 여러 인자에 따라 달라질 수 있다. 상기 정상파는 변환기 또는 반사기에서 오프셋되어 국부 최소값 또는 최대값이 변환기 또는 반사기로부터 이격될 수 있다. 반사파(또는 대향의 변환기에 의해 생성된 파)는 변환기 생성 파와 위상이 같거나 다를 수 있다. 상기 정상파의 특성은 구동 신호의 위상, 진폭 또는 주파수를 수정 및/또는 제어하는 것과 같이 변환기에 적용된 구동 신호에 의해 수정 및/또는 제어될 수 있다. 음향적으로 투명하거나 반응하는 물질은 변환기 또는 반사기와 함께 사용되어 정상파를 수정 및/또는 제어할 수도 있다.
유체 혼합물이 초음파 변환기와 반사기, 또는 2개의 마주보는 초음파 변환기 사이에 유동되고 그 사이에 하나 이상의 다차원 음향 정상파가 설정되면 미립자 또는 2차 유체가 클러스터링되거나, 수집되거나, 뭉쳐지거나, 응집되거나, 덩어리지거나, 또는 합체된다. 물질의 클러스터링은 호스트 유체에 대한 미립자 또는 2차 유체의 음향 대비 인자에 따라 다차원 음향 정상파의 노드 또는 안티-노드에서 발생할 수 있다. 미립자는 클러스터가 다차원 음향 정상파의 유지력을 극복할 수 있을 만큼 충분히 큰 크기로 성장할 때 결국 다차원 음향 정상파 노드 또는 안티-노드를 빠져나가는 클러스터를 형성한다. 예를 들어, 클러스터는 중력 또는 부력이 음향 또는 유체 항력보다 우세해지는 지점까지 크기가 증가(즉, 성장)하여 클러스터가 각각 가라앉거나 상승하게 한다. 대부분의 세포의 경우와 같이, 호스트 유체보다 밀도가 높은 유체/미립자의 경우, 클러스터가 가라앉고 그 정화된 호스트 유체로부터 분리되어 수집될 수 있다. 호스트 유체보다 밀도가 낮은 유체/미립자의 경우, 부력의 클러스터는 위로 뜨게되어 수집될 수 있다.
미립자에서 음향 필드의 산란은 미립자 또는 유체 방울을 함께 드라이브시키는 데 기여하는 2차 음향력을 생성한다. 상기 다차원 음향 정상파는 3차원 포획 필드로 작용하는 3차원 음향 방사력을 생성한다. 그러한 음향 방사력은 미립자가 파장에 비해 작을 때 미립자 볼륨(예컨대, 반경의 세제곱)에 비례한다. 그러한 힘은 주파수와 음향 대비 인자에 비례한다. 상기 힘은 음향 에너지(예컨대, 음향 압력 진폭의 제곱)에 따라 조정된다. 미립자에 가해지는 음향 방사력이 유체 항력과 부력 및 중력의 결합된 효과보다 더 강할 때, 미립자는 음향 정상파 내에 포획된다. 다차원 음향 정상파에서 미립자가 포획되면 그 포획된 미립자의 클러스터링, 집중, 응집 및/또는 합체가 발생한다. 따라서, 한 물질의 상대적으로 큰 고체는 강화된 중력/부력 분리를 통해 다른 물질, 동일한 물질, 및/또는 호스트 유체의 더 작은 미립자로부터 분리될 수 있다.
상기 다차원 정상파는 음향파 전파의 방향 및 그 음향파 전파 방향의 횡방향을 포함하는 다수의 방향으로 음향 방사력을 생성한다. 혼합물이 음향 챔버를 통해 유동될 때 현탁의 미립자는 정상파 방향으로 강한 축방향 힘 성분을 경험한다. 이러한 음향력은 유동 방향에 걸쳐 있기 때문에(예컨대, 수직으로) 유체 항력과 정렬되지 않는다. 따라서, 상기 음향력은 미립자의 대비 인자에 따라 미립자를 압력 노드 평면 또는 안티-노드 평면으로 빠르게 드라이브시킬 수 있다. 횡방향 음향 방사력은 집중된 미립자를 각각의 평면 노드의 중심 쪽으로 드라이브시키도록 작용하여 클러스터링, 뭉침 또는 덩어리화를 초래한다. 횡방향 음향 방사력 요소는 그와 같은 미립자 덩어리에 대한 유체 항력을 극복하여 클러스터를 지속적으로 성장시킬 수 있으며, 클러스터는 지배적인 중력 또는 부력으로 인해 혼합물을 빠져나갈 수 있다. 미립자 클러스터의 크기가 증가함에 따른 미립자 당 항력의 감소 뿐만 아니라, 미립자 클러스터의 크기가 증가함에 따른 미립자 당 음향 방사력의 감소는 음향 분리기 유닛의 동작에 개별적으로 또는 집합적으로 영향을 미칠 수 있다. 본 개시에서, 다차원 음향 정상파의 횡방향 힘 성분 및 축방향 힘 성분은 크기가 동일하거나 다르다. 단일 변환기에 의해 생성된 다차원 음향 정상파에서, 축방향 힘은 횡방향 힘과 비슷할 수 있다. 그와 같은 다차원 음향 정상파의 횡방향 힘은 일반적으로 2 정도 이상의 크기로 평면 정상파의 횡방향 힘보다 훨씬 높다.
장벽 형성 또는 클러스터링을 포함하여 다양한 모드에 대해 생성된 다차원 음향 정상파는 변환기의 기본 3D 진동 모드를 여기시키는 주파수에서 압전 물질을 여기하여 얻는다. 상기 변환기는 섭동되어 초음파를 생성할 수 있는 다양한 물질로 구성될 수 있다. 예를 들어, 상기 변환기는 압전 결정 또는 다결정을 포함하는 압전 물질로 구성될 수 있다. 다중 모드 응답을 달성하기 위해 초음파 변환기에서 압전 결정 또는 다결정일 수 있는 압전 물질의 섭동은 다차원 음향 정상파의 생성을 허용한다. 압전 물질은 디자인된 주파수에서 다중 모드 응답으로 변형되도록 특별히 디자인되어 다차원 음향 정상파를 생성할 수 있게 한다. 상기 다차원 음향 정상파는 9개의 개별적인 다차원 음향 정상파를 생성하는 3×3 모드와 같은 압전 물질의 고유한 모드로 생성될 수 있다. 압전 물질이 각기 다른 모드 형상을 통해 진동하도록 함으로써 다수의 다차원 음향 정상파가 생성될 수도 있다. 따라서, 물질은 0×0 모드(즉, 피스톤 모드), 1×1, 2×2, 1×3, 3×1, 3×3 및 기타 다른 고차 모드와 같은 여러 모드에서 동작하도록 선택적으로 여기될 수 있다. 물질은 하나 이상의 모드를 건너뛰거나 순서대로 다양한 모드를 순환하도록 동작할 수 있으며, 각 사이클에서 반드시 동일한 순서일 필요는 없다. 모드들 간 물질의 이러한 스위칭 또는 디더링(dithering)은 지정된 시간 동안 생성되는 단일 피스톤 모드 형상과 함께 다양한 다차원 파형을 허용한다. 상기 변환기는 PZT-8(lead zirconate titanate)로 만들어질 수 있는 압전 결정 또는 다결정과 같은 압전 물질로 구성될 수 있다. 그와 같은 결정은 대략 1인치 이상의 주요 치수를 가질 수 있다. 압전 물질의 공진 주파수는 명목상 약 2 MHz일 수 있고 하나 이상의 주파수에서 동작될 수 있다. 각각의 초음파 변환기 모듈은 단일 또는 다중 결정을 포함할 수 있다. 다중 결정은 각각 별도의 초음파 변환기로 동작할 수 있으며 하나 또는 다수의 제어기에 의해 제어될 수 있으며, 상기 제어기에는 신호 증폭기가 포함될 수 있다. 상기 변환기의 제어는 변환기의 드라이버에 제어 신호를 제공하도록 프로그래밍될 수 있는 컴퓨터 제어에 의해 제공될 수 있다. 그러한 컴퓨터 제어에 의해 제공되는 제어 신호는 주파수, 전력, 전압, 전류, 위상, 또는 압전 물질을 여기시키는 데 사용되는 임의의 다른 타입의 파라미터와 같은 드라이버 파라미터를 제어할 수 있다. 압전 물질은 정사각형, 직사각형, 불규칙한 다각형, 또는 일반적으로 임의의 형상일 수 있다. 상기 변환기(들)는 횡방향 및 축방향으로 동일한 크기의 힘을 생성하는 압력 필드를 생성하는 데 사용된다.
일부의 예에서, 압전 물질의 크기, 형상, 및 두께는 다른 여기 주파수에서 변환기 변위를 결정할 수 있다. 다양한 주파수의 변환기 변위를 사용하여 음향화된 유체의 특정 물질을 표적으로 할 수 있다. 예를 들어, 더 짧은 파장의 더 높은 주파수는 더 작은 크기의 물질을 표적으로 할 수 있다. 더 긴 파장의 더 낮은 주파수는 더 작은 크기의 물질을 표적으로 할 수 있다. 이러한 고주파 및 저주파의 경우, 음향파의 영향을 받지 않는 물질은 큰 변화 없이 통과할 수 있다. 더 고차 모드 변위는 모든 방향으로 음향 필드에서 강한 구배를 갖는 3차원 음향 정상파를 생성할 수 있으므로, 모든 방향에서 강한 음향 방사력을 생성하고, 어떤 힘은 예를 들어 크기가 같을 수 있고, 여러 포획 라인으로 이어질 수 있으며, 여기서 포획 라인의 수는 변환기의 특정 모드 형상과 상관된다.
여기에 설명된 변환기들의 압전 결정은 그러한 결정을 여기시키기 위해 주파수를 포함하는 구동 파라미터를 변경함으로써 다양한 응답 모드에서 동작될 수 있다. 각각의 동작 지점에는 이론적으로 무한한 수의 진동 모드가 중첩되어 있으며, 여기서 하나 이상의 모드가 지배적이다. 실제로, 변환기의 임의의 동작 지점에 여러 진동 모드가 존재하며, 일부 모드는 주어진 동작 지점에서 지배적이다.
도 2를 참조하면, 계면 장벽 모드에서 동작하는 시스템(200)이 예시되어 있다. 음향 계면 영역(202)은 비드(204)가 음향파(206)를 통과하는 것을 차단하기 위해 사용된다. 음향파(206)는 국부적 최소(노드) 및 최대(안티-노드)를 갖는 정상파를 생성하기 위해 반사기(210)에 의해 반사되는 음향파를 지속적으로 발사하는 음향 변환기(208)에 의해 생성된다. 압력 상승은 계면 영역(202)에서 음향파(206)의 상류 측에서 생성될 수 있으며, 유입되는 현탁된 미립자에 작용하는 음향 방사력과 함께 발생할 수 있다. 에지, 경계 또는 장벽 효과를 제공하는 것으로도 지칭되는 계면 영역(202)은 특정 물질 또는 미립자에 대한 장벽으로서 작용할 수 있다. 시스템(200)에서, 비드(204)의 대부분 또는 실질적으로 전부가 음향파(206)에 들어가는 것이 방지된다. 다른 물질들은 계면 영역(202)을 통과할 수 있다. 음향파(206)는 비드(204)에 영향을 미치도록 구성되는 반면, 다른 물질은 음향파(206)를 통과할 수 있도록 더 낮은 영향을 경험한다.
계면 영역(202)은 음향 변환기(208)에 의해 음향화된 유체 볼륨의 상류 경계 표면 또는 영역에 위치된다. 예를 들어, 유체는 계면 영역(202)을 가로질러 유동될 수 있어 유체의 음향화된 볼륨에 들어가고 하류 방향으로 계속될 수 있다. 음향 정상파(206)의 주파수는 원하는 특성을 갖도록 제어될 수 있어, 예를 들어 상이한 대비 인자 물질들이 음향 정상파(206)에 의해 억제되거나 음향 정상파를 통과할 수 있다. 계면 영역(202)은, 예를 들어 유지될 제1 크기 범위의 미립자에 영향을 미치도록 생성 및 제어될 수 있다. 음향 정상파(206)는, 예를 들어 제1 크기 범위와 다른 제2 크기 범위의 미립자가 통과할 수 있도록 생성 및 제어될 수 있다. 계면 영역(202)을 형성하는 음향 정상파(206)는 선택적 물질들을 차단하거나 통과시키도록 변조될 수 있다. 그러한 변조는 유체가 음향 정상파(206)에 의해 생성된 음향 필드를 통해 유동되는 동안 다른 시간에 선택적 물질들을 차단하거나 통과시키는 데 사용될 수 있다.
일부의 구현 예에서, 음향 정상파(206)는 3차원 음향 필드를 생성하며, 이는 직사각형 변환기로 구현된 변환기(208)에 의한 여기의 경우 유체 유동의 방향에 걸쳐 대략 직사각형 프리즘 볼륨의 유체를 점유하는 것으로 설명될 수 있다. 음향파(206)는 정상파로서 생성될 수 있다. 그러한 음향파(206)의 생성은 유체 유동을 가로질러 서로 마주 대하는 2개의 변환기로 달성될 수 있다. 단일 변환기, 예를 들어 변환기(208)는 챔버 벽 또는 반사기(210)로 구현될 수 있는 것과 같이 음향 특성의 변화를 제공하는 계면 경계 영역 쪽으로 유체를 통해 음향파(206)를 발사하는 데 사용될 수 있다. 계면 경계로부터 반사된 음향파는 변환기(208)로부터 발사된 음향파와 함께 정상 음향파를 형성하는 데 기여할 수 있다. 상이한 또는 변화되는 유동 비율에서의 동작 동안, 계면 영역(202)의 위치는 상류 또는 하류로 이동할 수 있다.
음향 정상파(206)에 의해 생성된 음향 필드는 계면 영역(202)에서 유체 및 물질에 음향 방사 압력(예컨대, 압력 상승) 및 음향 방사력을 가한다. 그러한 방사 압력은 유체의 물질에 영향을 주어 특정 특성을 가진 상류 물질이 음향 필드에 들어가는 것을 차단한다. 그러한 차단된 물질과 상이한 특성을 가진 다른 물질들은 유체 유동과 함께 음향 필드를 통과할 수 있다. 물질 또는 미립자가 음향 필드에 의해 차단되거나 통과되는지의 여부에 영향을 미치는 특성에는 물질 압축률, 밀도, 크기 및 음향 대비 인자가 포함된다. 음향파의 생성 또는 변조에 영향을 미칠 수 있는 파라미터는 주파수, 전력, 전류, 전압, 위상 또는 변환기(208)를 동작시키기 위한 임의의 다른 구동 파라미터를 포함한다. 음향파(206)에 영향을 미치는 다른 파라미터는 변환기 크기, 형상, 두께뿐만 아니라, 챔버 크기 및 밀도, 점도 및 유동 비율과 같은 유체 파라미터를 포함한다.
도 3을 참조하면, 클러스터링 모드에서 동작하는 시스템(300)이 예시되어 있다. 초음파 변환기(308)와 반사기(310) 사이에 하나 이상의 다차원 음향 정상파(306)가 생성된다. 음향파는 음향 변환기(308)로부터 지속적으로 발사되고 발사된 파와 간섭하기 위해 반사기(310)에 의해 반사되어, 각각 국부 최소값 및 최대값, 또는 노드 및 안티-노드를 갖는 정상파(306)를 형성한다. 반사파(또는 대향의 변환기에 의해 생성된 파)는 변환기 생성 파와 위상이 같거나 다를 수 있다. 그러한 정상파의 특성은 구동 신호의 위상, 진폭 또는 주파수를 수정 및/또는 제어하는 것과 같이 변환기(308)에 인가된 구동 신호에 의해 수정 및/또는 제어될 수 있다. 음향적으로 투명하거나 반응하는 물질들은 또한 변환기(308) 또는 반사기(310)와 함께 사용되어 정상파(306)를 수정 및/또는 제어할 수 있다.
클러스터링 모드에서, 비드(304), 비드 복합체(314) 및/또는 세포와 같은 미립자는 다차원 정상파(306) 내에서 클러스터링되거나, 수집되거나, 뭉쳐지거나, 응집되거나, 덩어리지거나, 또는 합체된다. 상기 클러스터링은 비드(304)의 음향 대비 인자 또는 호스트 유체에 대한 미립자에 따라 다차원 음향 정상파(306)의 노드 또는 안티-노드에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 비드(304), 비드 복합체(314) 또는 포지티브 음향 대비 인자를 갖는 미립자들은 다차원 음향 정상파(306)의 노드로 드라이브되는 반면, 비드(304), 비드 복합체(314) 또는 네거티브 음향 대비 인자를 갖는 미립자들은 안티-노드로 드라이브된다. 클러스터링된 비드(304), 비드 복합체(314) 또는 미립자들은 클러스터(312)가 다차원 음향 정상파(306)의 유지력을 극복할 수 있을 만큼 충분히 큰 크기로 성장할 때 결국 다차원 음향 정상파(306)의 노드 또는 안티-노드를 빠져나가는 클러스터(312)를 형성한다. 예를 들어, 클러스터(312)가 다차원 음향 정상파(306)에서 크기가 증가함에 따라 중력 또는 부력이 음향 및/또는 유체 항력보다 지배적이기 시작한다. 클러스터(312)의 크기가 클러스터(312) 상의 중력 또는 부력이 음향 및/또는 유체 항력을 초과하도록 하기에 충분히 크면, 클러스터(312)는 다차원 음향 정상파(306)를 빠져나간다.
비드(304), 비드 복합체(314) 또는 예를 들어 포지티브 음향 대비 인자를 갖는 미립자의 경우, 클러스터(312)는 통상적으로 중력으로 가라앉는다. 비드(304), 비드 복합체(314) 또는 예를 들어 네거티브 음향 대비 인자를 갖는 미립자의 경우, 클러스터(312)는 통상적으로 부력으로 상승한다. 중력은 도 3에 도시되어 있지 않으며, 시스템(300)의 배향은 중력이 유체 유동 방향과 일치하거나 반대 방향으로 정렬될 수 있다. 유체 유동의 방향에 대한 중력으로, 클러스터(312)는 중력으로 인해 가라앉는 것으로 도시된다. 중력이 유체 유동의 방향과 일치되면, 클러스터(312)는 부력으로 인해 상승하는 것으로 도시된다.
이러한 동작 모드에서, 비드(304) 및 비드 복합체(314)들은 음향파로부터 가라앉거나 상승함으로써 챔버에 유지된다. 비드는 이러한 모드에서 가볍게 클러스터링되는 경향이 있으며 표적 물질 또는 세포와의 추가 상호 작용을 허용하기 위해 챔버에 재분포되는 경향이 있다. 또한, 교반기는 클러스터링된 비드들의 이동 및 재분포를 촉진하기 위해 챔버에 제공될 수 있다.
세포 타입 A와 같은 미립자는 다차원 음향 정상파(306)에서 포획되지 않는다. 타입 A 세포 및 다차원 음향 정상파(306)의 특성은 타입 A 세포가 포획 및/또는 클러스터링 없이 통과할 수 있게 한다. 타입 B 세포는 비드(304)에 결합되어 비드 복합체(314)를 형성한다. 따라서, 타입 B 세포는 자체적으로 다차원 음향 정상파(306)를 통과할 수 있지만 비드(304)에 결합된 경우 클러스터(312)로 드라이브될 수 있다.
도 4를 참조하면, 유동화 베드 시스템(400)에 대한 셋업이 예시되어 있다. 유동화 베드는 약 10% 내재 약 30% 팩킹 범위를 갖는 구형 비드로 구성된다. 음향 변환기는 유동화 베드를 수용하는 컬럼의 상부에 부착된다. 비드, 세포 또는 기타 다른 물질들을 동반할 수 있는 유체를 도입하거나 제거하기 위해 컬럼의 베이스에 연결부가 제공된다. 시스템(400)의 구성 및 동작은 펌프, 밸브 또는 스위치와 같은 유체 제어 장치 뿐만 아니라, 변환기에 대한 드라이버를 동작시키기 위한 신호를 제공하는 제어기로 제어될 수 있다. 상기 제어기는 탁도 센서, 유체 유동 센서 및/또는 밸브 센서를 포함할 수 있는 센서들로부터 피드백을 수신한다. 상기 제어기는 또한 음향 변환기로부터 피드백을 수신하여 폐쇄 루프 변환기 제어를 제공하는 데 기여한다. 변환기의 각기 다른 동작 모드는 제어기에 의해 구현될 수 있다. 상기 제어기는 여기에 논의된 예들에 따라 시스템(400)에 대한 자동화 동작을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 제어기에는 오퍼레이터가 자동화된 음향 친화성 세포 선택 프로세스를 구현하기 위해 선택할 수 있는 다수의 자동화 프로파일이 제공될 수 있다. 도 4에 예시된 바와 같이, 상기 음향 변환기는 위에서 논의된 것처럼 에지 효과 또는 계면 영역을 생성하는 모드에서 사용된다. 이러한 모드에서 동작하는 변환기로 컬럼의 처리량에 대한 테스트는 음향 정상파 및 에지 효과에 의해 비드가 컬럼에서 유지되는 동안 컬럼에서 사용할 수 있는 유동 속도 또는 유동 비율에 대한 몇 가지 가이드라인을 설정했다.
도 5를 참조하면, 유동화 베드 시스템(500)이 예시되어 있다. 이러한 구현 예에서, 컬럼(502)은 약 10% 내지 약 30% 팩킹 범위일 수 있는 친화성 비드(504)로 팩킹되며, 여기서 % 팩킹은 전체 컬럼의 볼륨 대 비드 볼륨의 백분율을 나타낸다. 비드(504)에는 표적 세포(506)에 결합하기 위한 친화성 구조가 제공된다. 음향 필드를 생성할 수 있는 음향 변환기(512)는 컬럼(502)의 상부에 결합된다. 동작 시, 표적 세포(506)와 비표적 세포(508)의 혼합이 유입구(510)를 통해 컬럼(502)에 입력된다. 세포의 혼합물이 컬럼(502)을 통해 유동될 때, 표적 세포(506)는 비드(504)와 결합한다. 비표적 세포(508)는 상보적 친화성 구조가 없기 때문에 비드(504)와 결합하지 않는 경향이 있다. 혼합물이 컬럼(502)을 통해 변환기(512) 쪽으로 유동될 때, 비드(504)는 컬럼(502)의 유동화 베드 내에서 자유롭게 이동할 수 있다. 비드(504)가 변환기(512)에 의해 생성된 음향 필드에 접근함에 따라, 비드(504)는 음향 에지 효과에 의해 차단되고 및/또는 음향 필드에 포획되게 된다. 어떠한 경우에도, 비드(504)는 컬럼(502)의 출력으로 통과되는 것이 방지된다. 표적 세포(506)들이 비드(504)에 결합함에 따라, 표적 세포(506)는 그것들이 결합된 비드(504)와 함께 컬럼(502)을 빠져나가는 것이 방지된다. 비표적 세포(508)는 비드(504) 만큼 음향 필드의 영향을 크게 받지 않고 음향 필드를 통과하여 컬럼(502)을 빠져나갈 수 있다.
유동화 베드 시스템(500)과 함께 사용되는 이러한 친화성 기술은 단일 통과 기반으로 구현될 수 있다. 시스템(500)은 컬럼(502)을 통과하고 빠져나가는 물질을 선택하거나 비드에 결합되어 컬럼(502)에 유지되는 물질을 선택하기 위해 비드를 선택하도록 구성될 수 있다. 통과 또는 유지된 물질은 포지티브로 또는 네거티브로 선택될 수 있다.
도 6을 참조하면, 친화성 분리 프로세스(600)가 예시되어 있다. 프로세스(600)는 친화성 비드와 세포가 함께 결합되어 비드 복합체를 얻는 외부 인큐베이션 단계를 포함한다. 유체에서 결합되지 않은 물질과 비드 복합체의 혼합물은 컬럼(602)으로 공급된다. 유체 혼합물이 컬럼(602)을 따라 이동함에 따라, 비드 복합체는 변환기(604)에 의해 생성된 음향 필드에 의해 컬럼(602)으로 지향된다. 결합되지 않은 물질은 음향 필드를 통과함으로써 컬럼(602)을 빠져나간다. 이러한 분리 단계는 결합되지 않은 물질의 대부분을 제거하면서 비드 복합체를 유지한다. 상기 비드 복합체가 컬럼(602)에 로딩되면, 컬럼(602)의 베이스에 버퍼 유체를 도입하여 플러시(flush) 프로세스를 실행할 수 있다. 나머지 결합되지 않은 물질은 변환기(604)에 의해 생성된 음향 필드를 통해 버퍼 유체와 함께 이동한다. 비드 복합체는 또한 컬럼(602)을 따라 버퍼 유체와 함께 이동하지만 음향 필드에 의해 빠져나가는 것이 차단된다.
프로세스(600)는 물질의 친화성 분리에 유리한 다수의 특징을 제공한다. 예를 들어, 비드에 대한 표적 물질의 결합은 외부에서 발생할 수 있으며, 이는 또한 유연한 인큐베이션 단계를 허용한다. 음향 분리는 비드 복합체와 혼합된 결합되지 않은 물질의 양을 빠르게 줄이는 점진적이고 높은 처리량 분리 프로세스를 제공한다. 예를 들어, 그러한 분리 프로세스는 1시간 이내에 완료될 수 있다. 프로세스(600)는 또한 유연하게 확장할 수 있으며 약 10 mL 내지 약 1 L 범위의 처리 용량을 처리할 수 있다. 또한, 모든 타입의 비드가 프로세스(600)에서 사용될 수 있어 고유한 또는 맞춤형 친화성 분리 프로세스에 상당한 유연성을 제공한다.
도 7을 참조하면, 유동화 베드 시스템(700)이 예시되어 있다. 컬럼(702)이 제공되며, 이는 도 4 내지 6에 예시된 컬럼들 중 임의의 컬럼으로서 구현될 수 있다. 첫 번째 세척 프로세스에서, 컬럼(702)은 친화성 비드로 로딩된다. 컬럼(702)의 상부 근처에 음향 필드를 생성하기 위해 음향 변환기(704)가 온(ON)되어 있는 동안 세척 용액이 컬럼(702)을 통과한다. 음향 필드는 세척 용액이 친화성 비드를 세척하기 위해 통과하는 동안 컬럼(702)에 친화성 비드를 유지한다. 세포 물질이 컬럼(702)에 도입되는 포획 프로세스가 구현된다. 표적 세포 물질은 친화성 비드에 결합하여 비드 복합체를 형성하고 음향 변환기(704)에 의해 생성된 음향 필드에 의해 컬럼(702)을 빠져나가는 것이 차단된다. 비표적 물질은 음향 필드를 통과할 수 있고 컬럼(702)을 빠져나갈 수 있다. 상기 포획 프로세스 후, 유체가 컬럼(702)으로 도입되어 비표적 물질이 컬럼(702) 밖으로 유동되는 플러시 프로세스가 제공된다. 상기 비드 복합체는 음향 변환기(704)에 의해 생성된 음향 필드에 의한 유체 유동에 대해 컬럼(702)에 유지된다.
시스템(700)은 내부 비드 결합 및 컬럼(702)의 물질에 가해지는 낮은 전단력을 포함하는 친화성 분리 프로세스를 위한 다수의 유리한 특징을 제공한다. 더 큰 비드와 연관된 잠재적으로 더 큰 결합 에너지로 인해 더 큰 비드가 사용될 때 낮은 전단력의 내부 비드 결합이 중요할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포 물질이 더 큰 비드에 의해 포획되는 데 더 오래 걸리거나 더 많은 양의 에너지가 필요할 수 있다. 따라서, 더 낮은 전단력은 더 큰 비드와의 결합을 방해하는 것을 방지하는 데 도움이 될 수 있다. 시스템(700)은 음향 변환기(704)를 사용하여 음향 에지 효과를 생성할 수 있으며, 이는 처리량을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 결합 및 분리 프로세스를 2시간 이내에 완료할 수 있다. 시스템(700)은 확장 가능하며 약 10 mL 내지 약 1 L 범위의 처리 용량을 처리할 수 있다. 시스템(700)에 사용된 유동화 베드는 친화성 분리 및/또는 단독 분리의 목적을 위해 비드 또는 세포와 함께 사용될 수 있다.
도 8을 참조하면, 세포 선택 시스템(800)이 예시된다. 시스템(800)은 교반 메커니즘(804)이 제공된 컬럼(802)을 포함한다. 교반 메커니즘(804)은 컬럼(802)의 베이스 근처에서 교반 바로서 구현될 수 있다. 친화성 분리 프로세스는 컬럼(802)을 유동화 베드로 사용하여 시스템(800)에서 구현될 수 있다. 컬럼(802)은, 예를 들어 약 10% 내지 약 30% 팩킹 범위의 친화성 비드로 로딩된다. 음향 변환기(806)에 의해 음향 필드가 생성되는 동안 컬럼(802)으로 유체의 도입으로 친화성 비드가 세척된다. 유체는 컬럼(802)을 빠져나가는 반면 친화성 비드는 음향 필드에 의해 빠져나가는 것이 차단된다. 음향 변환기(806)가 컬럼(802)의 상부 근처에 음향 필드를 생성하는 동안 세포 물질의 혼합물이 컬럼(802)에 도입된다. 모든 세포 물질은 음향 필드의 구현으로 친화성 비드와 함께 컬럼(802)에 유지된다. 과잉 유체는 음향 필드를 통과하고 컬럼(802)을 빠져나갈 수 있는 반면 세포 및 친화성 비드는 빠져나가는 것이 차단된다.
세척 프로세스와 세포 물질의 도입 프로세스에서, 변환기(806)는 한 경우에는 세척 프로세스 동안 친화성 비드가 빠져나가는 것을 차단하고, 다른 경우에는 친화성 비드와 세포 물질 모두가 빠져나가는 것을 차단하기 위해 각기 다른 모드 또는 상이한 특성으로 동작될 수 있다. 예를 들어, 변환기(806)를 구동하는 데 사용되는 주파수는 세포와 친화성 비드 모두가 유지될 때의 주파수와 친화성 비드를 유지하기 위해 다를 수 있다.
컬럼(802)에 친화성 비드 및 세포 물질이 로딩되면, 교반 메커니즘(804)을 사용하여 컬럼(802)을 교반할 수 있다. 그러한 교반은 컬럼(802) 내에서 친화성 비드 및 세포 물질을 이동시키는 데 기여한다. 친화성 비드 및 세포 물질이 컬럼(802) 내에서 이동함에 따라, 표적 물질에 대한 친화성 결합 프로세스가 향상될 수 있다. 이러한 인큐베이션 단계는 유체 유동이 없고 변환기(806)가 활성화되지 않은 상태에서 구현될 수 있다.
인큐베이션/결합 프로세스가 완료되면, 친화성 비드/표적 물질 복합체를 세척할 수 있고, 비표적 물질을 컬럼(802)에서 제거할 수 있다. 상기 표적 물질은 친화성 비드로부터 표적 물질의 분리를 촉진하는 컬럼(802)에 제공된 용액으로 친화성 비드로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 그러한 용액은 버퍼에 효소(예컨대, 트립신)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 그 다음, 표적 물질은 컬럼(802)에서 제거될 수 있고, 반면 친화성 비드는 음향 변환기(806)에 의해 생성된 음향 필드와 함께 유지된다.
도 9를 참조하면, 단일 통과로 직선 컬럼에서 포지티브 선택을 위한 친화성 선택 프로세스(900)가 예시되어 있다. 프로세스(900)는 친화성 비드가 있는 컬럼(902)의 로딩 및 비드 세척으로 시작된다. 음향 변환기(904)는 로딩 및 세척 프로세스 동안 컬럼(902)의 상부 근처에 음향 필드를 생성한다. 그 다음, 세포 물질의 혼합물이 컬럼(902)으로 공급된다. 표적 물질은 친화성 비드에 결합되어 비드 복합체를 형성한다. 비표적 물질은 음향 필드를 통해 컬럼(902)을 빠져나간다. 표적 물질은 컬럼(902)에서 친화성 비드와 함께 유지되는 반면, 비표적 물질은 컬럼(902)에서 빠져나간다. 버퍼를 컬럼(902)에 도입하여 비드 복합체가 세척된다. 분리 버퍼가 컬럼(902)에 도입되어 표적 물질이 친화성 비드로부터 분리되게 한다. 음향 필드가 제자리에 있으면, 그 분리된 표적 물질은 컬럼(902)을 빠져나와 수집되는 반면, 친화성 비드는 유지된다.
도 10을 참조하면, 단일 통과로 직선 컬럼에서 네거티브 세포 선택을 위한 친화성 선택 프로세스(1000)가 예시되어 있다. 프로세스(1000)는 친화성 비드가 있는 컬럼(1002)을 원하는 공극 분률로 로딩하는 것으로 시작한다. 그러한 로딩 프로세스는 음향 변환기(1004)가 컬럼(1002)에서 제거되는 동안 구현될 수 있다. 컬럼(1002)의 상부에 연결된 음향 변환기(1004)에 의해, 버퍼의 도입으로 친화성 비드가 세척된다. 이러한 세척 프로세스는 유동화 베드를 형성하기 위해 비드 볼륨를 확장하는 역할도 한다. 음향 필드를 생성하는 음향 변환기(1004)에 의해, 세포 물질의 혼합물이 컬럼(1002)으로 공급된다. 표적 물질은 친화성 비드에 결합되어 비드 복합체를 형성한다. 비표적 물질은 음향 필드를 통해 컬럼(1002)을 빠져나간다. 상기 표적 물질은 컬럼(1002)의 친화성 비드와 함께 유지되는 반면, 상기 비표적 물질은 컬럼(1002)을 빠져나가 원하는 생성물로 수집된다. 이러한 네거티브 세포 선택은 단일 통과에서 세포 물질의 혼합물로부터 표적 물질을 제거한다. 친화성 비드는 다중화되거나 단일 통과에서 다중화된 네거티브 선택을 허용하는 하나 이상의 타입의 표적 물질과 결합하도록 구성될 수 있다.
도 11을 참조하면, 그래프(1100)는 음향 유동화 베드 컬럼에 대한 유체 유입 비율에 대한 음향 필드를 갖는 비드 유지 비율을 예시한다. 그래프(1100)에 나타낸 바와 같이, 유체 유입 비율이 분당 0 내지 약 10 mL로 증가함에 따라 비드의 100%가 컬럼에 유지된다. 유체 유입 비율이 분당 10 mL 이상으로 증가함에 따라, 점점 더 많은 비드가 음향 필드를 통과한다. 그래프(1100)에 제시된 데이터는 비드가 음향 필드를 통과하게 하는 획기적인 유체 유입 비율을 이해하는 데 유용하다. 이러한 테스트는 평균 직경이 90 ㎛이고 평균 밀도가 1.033 g/cc인 SP 세파로스(Sepharose) "고속 유동(Fast Flow)" 비드를 사용했다. 종단 속도는 52.2 cm/hr이었다. 컬럼 파라미터는 볼륨 - 40 ml; 높이 - 20 cm; 직경 - 1.6 cm이다. 확장된 공극 분률은 7.86E+05 cells/ml의 시작 비드 농도로 70%였다. 동작 파라미터는 주파수 - 1 MHz 및 전력 - 3 W이다.
도 12를 참조하면, 그래프(1200)는 음향 친화성 시스템에서 회수된 총 생존 세포 대 컬럼 볼륨를 예시하며, 여기서 컬럼 볼륨은 컬럼의 볼륨에 의해 정규화된 시스템에 대한 입력의 양을 나타낸다. 그래프(1200)에 나타낸 바와 같이, 밀리리터당 수백만 개의 세포로 나타낸 총 생존 세포는 컬럼 볼륨의 약 1/2 후에 상당히 증가한다. 이러한 데이터는 음향 친화성 시스템에서 결합의 효율성을 나타낸다. 예를 들어, 유동화 베드 컬럼에 세포 물질 공급물을 공급하는 컬럼 볼륨의 초기 절반 동안에는 결합되지 않은 세포가 거의 관찰되지 않는다.
도 13을 참조하면, 그래프(1300)는 미립자 직경에 따라 유동화 베드 컬럼을 빠져나가는 비드의 히스토그램을 예시한다. 그래프(1300)는 더 낮은 유동 비율에서 작은 미립자가 컬럼을 빠져나가는 반면 더 큰 미립자는 유지된다는 것을 나타낸다. 또한, 빠져나가는 미립자의 평균 크기는 유동 비율에 따라 증가한다.
도 14를 참조하면, 재순환에 따른 음향 친화성 세포 선택을 구현하기 위한 유동화 베드 시스템(1400)이 예시되어 있다. 시스템(1400)은 컬럼(1402) 및 음향 변환기(1404)를 포함한다. 컬럼(1402)은 유체의 유동을 방해하고 컬럼(1402)의 중심 쪽으로 유체 유동을 강제할 수 있는 환형 리브(1406)들을 포함한다. 리브(1406)들은 컬럼(1402) 내 채널링(channeling)과 같은 바람직하지 않은 효과를 방지하는 데 도움이 될 수 있다.
시스템(1400)은 위에서 논의된 것들과 유사하게 동작된다. 예를 들어, 시스템(1400)은 포지티브 또는 네거티브 선택을 위해 사용될 수 있고 음향 변환기(1404)와 함께 각기 다른 동작 모드를 사용할 수 있다. 시스템(1400)은 표적 세포가 컬럼(1402)에서 비드와 결합할 더 많은 기회를 제공함으로써 표적 세포 회수율을 개선하기 위한 재순환의 사용을 예시한다. 비드가 컬럼(1402)에 로딩되고 세척된 후, 통과 1 공급물이 컬럼(1402)에 공급된다. 통과 1 공급물로부터 발생하는 컬럼(1402)의 유출물은 통과 2 공급물로서 사용하기 위해 수집된다. 통과 2 공급물은 후속의 재순환 통과에서 공급물 공급을 위한 입력으로 사용된다. 나타내지는 않았지만, 통과 2 공급물은 다른 후속의 재순환 통과를 위해 수집될 수 있는 유출물을 생성할 수 있다. 임의의 수의 재순환을 사용할 수 있다. 여기에서 논의된 예시적인 시스템 및 유동화 베드 각각은 다중 재순환 통과를 갖도록 구성될 수 있다.
도 15를 참조하면, 그래프(1500)는 다수의 재순환 공급물 통과의 유동화 베드 시스템에서 순도(P) 및 회수율(R)을 예시한다. 그래프(1500)는 순도가 높은 레벨로 유지됨을 나타내며, 재순환 통과 1 및 2의 경우 90% 이상, 재순환 통과 3의 경우 80% 이상이다. 세포의 회수율은 각각의 재순환 통과에서 증가하는 데, 세 번째 재순환에서 100%에 가깝다.
도 16을 참조하면, 기능화된 물질을 갖는 비드의 구현 예가 예시되어 있다. 그러한 비드는 세포 상의 CD3 수용체에 대한 친화성을 갖도록 구성된다. 상기 비드는 스트렙타비딘, 단량체성 아비딘, 단백질 A, 및/또는 항-CD3으로 코팅될 수 있다. 비오틴-항-CD3 복합체는 세포 상의 CD3 수용체에 대한 친화성 표적을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 상기 항-CD3-비오틴 항체는 항-TCR-비오틴 항체로 치환 또는 대체될 수 있다. 상기 스트렙타비딘 코팅된 비드는 다른 타입의 코팅보다 더 큰 결합 표면적을 제공할 수 있다. 예를 들어, 상기 스트렙타비딘 코팅된 비드는 다른 코팅보다 더 큰 세포 결합/cm² 비율을 가질 수 있다. 상기 코팅이라는 용어는 비드 표면의 기능화된 물질을 지칭하는 데 사용되며, 비드 표면의 일부 또는 전체를 덮을 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 비드의 일부는 스트렙타비딘으로 코팅될 수 있고, 다른 부분은 다중화된 친화성 프로세스를 구현하기 위해 다른 기능화된 물질로 코팅될 수 있다.
도 17을 참조하면, 상이한 타입의 비드의 크기 분포를 나타내는 그래프가 도시되어 있다. y축은 백분율(%)로 표시되고 x축은 마이크로미터 단위의 크기로 표시된다. 그래프는 GE 세파로스(Sepharose) 비드와 ABT 비드의 다양한 크기 분포를 예시한다. 비드는 세포의 크기보다 큰 크기로 분포되어 있다. 세포 상의 비드들 간의 크기 차이는 비드와 세포 간 구별하고 비드와 세포를 분리하기 위한 음향 대비 인자로 사용될 수 있다.
도 18을 참조하면, 그래프는 상이한 타입의 비드에 대한 결합 비율을 예시한다. 그러한 결합 비율은 100,000개 세포의 초기 세포 집단에 대한 것이다. y축은 cell/cm²를 나타내고, x축은 다양한 타입의 비드를 나타낸다. 예시된 바와 같이, 평균 직경이 34 ㎛인 세파로스(Sepharose) 비드는 30,000 cells/cm² 이상의 결합 비율을 달성했다. 평균 직경이 65 ㎛인 프로메가(Promega) 비드는 약 65,000 cells/cm²의 결합 비율을 달성했다. 평균 직경이 70 ㎛인 플러리비드(Pluribeads)는 세파로스 비드보다 더 크고 40,000 cells/cm² 미만의 결합 비율을 달성했다.
도 19를 참조하면, 상이한 친화성 시스템들 간의 비교 분석을 예시하는 도면이 도시된다. 한 시스템은 APC 및 항-CD3를 사용하고 다른 시스템은 APC, 항-비오틴, 비오틴 및 항-CD3를 사용한다. 도면에 나타낸 바와 같이, 비오틴을 포함하는 시스템은 약 65%의 결합을 나타낸 반면, 비오틴이 없는 시스템은 약 55%의 결합을 나타냈다. 비교 구현에는 antiCD3-fluorophore vs. antiCD3-biotin+antibiotin-fluorophore이 포함된다.
도 20을 참조하면, 상이한 항체 적정 비율에 대한 세포 카운트(count)를 나타내는 여러 그래프가 예시되어 있다. 그래프에 예시된 바와 같이, 세포 집단은 적정 비율이 증가함에 따라 더 크게 분리된다.
도 21을 참조하면, 밀리리터당 세포 카운트 대 컬럼 볼륨를 예시하는 크로마토그램이 도시되어 있다. 컬럼 볼륨은 유동화 베드에 제공되거나 유동화 베드에서 재순환되는 물질과 함께 동반된 유체의 양을 나타낸다. 플러그 유동을 달성하려면 컬럼을 통한 유체 유동이 바람직하다.
도 22를 참조하면, 시간 경과에 따른 컬럼 유출의 세포 카운트를 예시하는 그래프가 도시되어 있다. 컬럼 유출의 탁도는 세포 농도와 상관관계가 좋다.
음향 친화성 세포 분리에 대한 여러 실험 테스트를 수행했다. 테스트 결과는 아래 예와 같이 표로 작성된다.
예 1
4가지 유동화 베드 플랫폼 테스트는 테스트 1일차에 서로 다른 세포 농도(100 e6/mL 및 10 e6/mL)와 서로 다른 포획 항체 조합(항-TCR a/b 단독 vs 항-TCR a/b 및 항-CD52)으로 수행되었다. 초기 공급 농도(100 e6/mL 및 TCR a/b-집단은 74 - 78%였다).
모든 샘플을 IKA 롤러(30 rpm) 상에서 20분 동안 PBS 중에 2% BSA로 표 1에 리스트된 대응하는 포획 항체 조합과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 PBS 중 2% BSA로 2회 세척하고 최종적으로 PBS 중에 10 mL의 2% BSA로 재현탁시켰다. 유동 세포 분석을 위해 샘플을 제거하고 테스트 A부터 D까지의 초기 집단으로 사용했다. 다음에, 50% 고체 Promega 비드 슬러리 4 ml를 유동화 베드 컬럼에 로딩하고 PBS 용액 중에 30 ml의 2% BSA로 세척하여 잔류 에탄올 및 미립자를 제거하였다. 이러한 초기 세척 단계는 1 ml/min 및 0.75 W의 유동 비율 및 전력에서 수행되었다.
다음 조건에서 동작하는 아비딘-결합 메타크릴레이트 비드(Promega)로 팩킹된 유동화 베드 유닛을 사용하여 공급 세포 집단을 분리했다; 유동 비율 - 1 mL/min 및 전력 - 0.75 W. 유출로 표시된 첫 번째 프랙션(fraction)은 전체 샘플이 유동화 베드에 로딩된 후 수집되었다. 플러시로 표시된 두 번째 프랙션은 1 ml/min 및 0.75 W의 PBS 용액 중에 30 ml의 2% BSA로 유동화 베드를 플러싱한 후 수집되었다. 이러한 플러싱 단계는 포획되지 않은 모든 세포가 회수되도록 구현된다. 이러한 프로세스가 완료되면, 컬럼의 나머지 내용물이 검색되어 정체(holdup)로 표시된 세 번째 프랙션으로 수집된다. 세 가지 프랙션 모두로부터의 샘플이 유동 세포 분석을 위해 수집되었다. 질량 균형을 수행하기 위해, 각각의 프랙션에 대한 질량 및 세포 카운트를 기록했다.
표 1. 유동화 베드(FB) 플랫폼 테스트 파라미터
Figure pct00001
유동화 베드 유닛에 의한 분리 후 모든 샘플에 대해 순도가 대략 15% 증가하였으며, 여기서 초기 세포 집단이 76% TCR 녹아웃 세포로 구성되었다. 더 높은 세포 농도(100E6 cells/mL)에서 수행된 테스트에 있어서, 샘플 A 및 B는 유출에서 각각 13% 및 10%와 플러시에서 11% 및 8%의 순도의 산출을 보여 두 번째 프랙션에서 순도가 약간 감소했다. 그러한 정체 프랙션의 순도는 샘플 A 및 B에 대해 73.2% 및 68.1%로 100% 순도가 달성되지 않았음을 나타낸다. 더 낮은 세포 농도(10E6 cells/mL)에서 수행된 테스트는, 샘플 C 및 3D에서, 각각 유출 프랙션에서 90.5% 및 92.4%의 높은 순도를 산출하고 플러시 프랙션에서 94.8% 및 93.2%의 훨씬 더 높은 순도를 산출했다. 이러한 결과는 유동화 베드 유닛와 함께 사용된 현재 조건에서 낮은 세포 농도가 더 우수함을 보여주었다. 포획 항체로서 항-TCR 및 항-CD52의 조합을 전체적으로 사용하는 것은 항-TCR을 단독 포획 항체로 사용하는 것과 비교하여 상당히 상이한 순도를 산출하지 않았다.
표 2. 유동화 베드 테스트로부터의 TCR a/b-순도 및 회수율
Figure pct00002
각각의 테스트에 대한 총 TCR-회수율은 유동-통과 및 플러시 프랙션의 TCR-세포의 합을 시작 TCR-세포 카운트로 나눈 것과 같다(부록의 식 6 참조). TCR-세포가 유동화 베드 시스템에 유지될 수 있는 두 가지 메커니즘이 있다: 음향 유지 및 비효율적인 플러싱. 음향 유지는 자유 세포가 유체 유동에 의해 가해지는 항력과 비교하여 음향 필드에서 더 큰 힘을 경험할 때 발생한다. 이것은 높은 전력 대 유량 비율에서 발생하며 동작 조건을 최적화하여 방지할 수 있다. 세포는 또한 시스템의 볼륨으로 분산되는 경향이 있어 회수율을 향상시키는 데 필요한 플러시 단계를 만든다. 그러한 플러싱(즉, 플러시) 단계는 균일한 속도 분포를 가져야 하며, 그렇지 않으면 유입되는 세척 버퍼가 유동화 베드와 혼합될 때 TCR-세포를 회수하기 위해 많은 양의 버퍼가 필요하다. 이러한 타입의 세포 유지는 플러시 속도와 볼륨를 증가시키고 유동화 베드 유입구 디자인을 개선함으로써 감소될 수 있다.
각각의 유동화 베드 테스트에 대해, 총 TCR-세포 회수율을 표 2에서 볼 수 있다.
높은 세포 밀도(100 e6/ml)를 테스트하는 동안 가장 낮은 회수율이 나타났다. 테스트 A와 B는 각각 7%와 5%의 TCR-회수율을 가졌다. 비드와 세포가 매우 큰 덩어리로 함께 뭉치는 이러한 테스트 중에 컬럼의 "막힘" 효과가 관찰되었다. 이러한 고체 덩어리는 유체 역할을 하기보다는 컬럼에 채널링을 일으키고 세포가 빠져나가는 것을 방지했다. 컬럼이 오염되어 비특정 결합이 발생했을 수도 있다.
테스트 C 및 D는 유사한 회수율(34% 및 33%)을 가졌다. 10 e6/ml를 사용한 두 가지 테스트는 예상대로 동작했지만 여전히 상대적으로 낮은 TCR-세포 회수율을 가졌다. 이는 앞서 설명한 낮은 유체 속도와 비효율적인 플러시 단계 때문이며 동작 조건을 최적화하고 유동화 베드 유입구 디자인을 개선하여 향상시킬 수 있다. 항체를 변경하는 것은 세포 회수율에 최소한의 영향을 미쳤다.
예 2
서로 다른 친화성 비드 타입(Promega, Dynabead, PolyStyrene 6 ㎛ 및 14 ㎛)으로 4개의 음향 분리기 유닛 테스트를 수행했다. 2일차에, 고정 항체 조합(항-TCR 및 항-CD52) 및 항체 볼륨 0.15 mL 및 0.052 mL를 각각 사용했다. 초기 TCR a/b-집단은 77%였다.
모든 샘플을 IKA 롤러(30rpm) 상에서 20분 동안 PBS 중에 2% BSA로 항-TCR 및 항-CD52와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 PBS 중에 2% BSA로 2회 세척하였다. 유동 세포 분석을 위해 샘플을 제거하고 테스트 L부터 Q까지의 초기 집단으로 사용했다. 샘플을 표 3에 리스트된 대응하는 비드 후보와 함께 PBS 중에 10 mL의 2% BSA로 IKA 롤러(30rpm)에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 다음 조건에서 동작되는 음향 분리기 유닛를 사용하여 분리했다; 유동 비율 - 1 mL/min 및 전력 - 0.75 W. 유출로 표시된 첫 번째 프랙션은 전체 샘플이 음향 필드를 통과한 후 수집되었다. 유동화 베드를 PBS 용액 중에 30 ml의 2% BSA로 플러싱한 후 플러시로 표시된 두 번째 프랙션을 수집했다. 이러한 프로세스가 완료되면, 컬럼의 나머지 내용물이 검색되어 정체으로 표시된 세 번째 프랙션으로 수집된다. 세 가지 프랙션 모두로부터의 샘플이 유동 세포 분석을 위해 수집되엇다. 질량 균형을 수행하기 위해, 각각의 프랙션에 대한 질량 및 세포 카운트를 기록했다.
표 3. 음향 분리기(AS) 플랫폼 테스트 파라미터
Figure pct00003
음향 분리기 유닛으로 분리한 후 모든 샘플에 대해 순도가 대략 13% 증가했으며, 여기서 초기 세포 집단이 77% TCR 녹아웃 세포로 구성었다. Dyna 비드와 함께 배양된 샘플은 유출 프랙션에서 89.4%의 가장 높은 순도를 보였고, 반면 폴리스티렌(10 - 14 ㎛) 비드와 함께 배양된 샘플은 84.3%의 가장 낮은 순도를 보였다. 이러한 경향은 Dyna 비드와 함께 배양된 샘플이 91.1% 순도를 산출하고 폴리스티렌 비드가 84.5% 순도를 산출하는 플러시 프랙션에서도 관찰되었다. 모든 샘플의 순도는 유출(84.3% - 89.8%)에서 플러시 프랙션(84.6% - 91.1%)으로 약간 증가했다.
표 4. 유동화 베드 테스트로부터의 TCR a/b-순도 및 회수율
Figure pct00004
각각의 음향 분리기 시스템 테스트에 대한 총 TCR-세포 회수율은 표 4에서 볼 수 있다. 이러한 도면에서, 50 ㎛ Promega 비드는 TCR-세포 회수율이 80%이고 4.5 ㎛ Dyna-비드는 회수율이 17%에 불과한 비드 타입에 영향을 받는 것으로 나타났다. 폴리스티렌 미립자 모두 6 ㎛ 및 14 ㎛ 비드에 대해 각각 26% 및 27%로 유사한 회수율을 가졌다. 모든 테스트가 동일한 동작 조건에서 수행되었기 때문에, 유사한 회수율이 예상되어 이러한 관계는 향후 작업에서 확인해야 한다. 유동화 베드와 마찬가지로, 음향 분리기 시스템의 TCR 회수율은 유동 속도를 높이고 유입구 및 수집기 디자인을 개선함으로써 증가될 수 있다.
예 3
2개의 유동화 베드(FB) 프로세스 및 2개의 음향 분리기(AS) 프로세스를 수행하였다. 각기 다른 펌프 시스템(주사기 펌프 및 연동 펌프)은 유동화 베드 유닛에서 테스트되었으며 2개의 새로운 비드 후보는 테스트 1일차 음향 분리기 유닛에서 테스트되었다. 초기 공급 농도는 107 cells/mL이었고 TCR a/b-집단은 약 80%였다.
샘플 준비 및 음향 유닛 동작 절차는 이전 예와 동일하다. 간단히 말해서, 유동화 베드에 대한 공급 샘플을 IKA 롤러(30 rpm) 상에서 20분 동안 PBS 중에 2% BSA로 비오틴화된 항-TCR a/b 항체(표 5)와 함께 인큐베이션했다. 세포를 PBS 중에 2% BSA로 2회 세척하고 최종적으로 PBS 중에 10mL의 2% BSA로 재현탁시켰다. 음향 분리기 유닛을 위한 공급 샘플의 경우, 비드 인큐베이션 후 항체-세포 인큐베이션이 이어졌다. 각각의 공급 샘플에서 1 × 106 세포를 유동 세포 분석을 위해 별도로 수집하고 각 테스트의 초기 집단으로 사용했다.
유동화 베드 컬럼에 2ml Promega 비드 슬러리(아비딘-결합 메타크릴레이트 비드)를 로딩한 다음 PBS 용액 중에 30 ml의 2% BSA로 세척하여 잔류 에탄올 및 미립자를 제거하였다. 이러한 초기 세척 단계는 3 mL/min 및 2.25 W 에서 수행되었다. 2개의 다른 펌프(주사기 펌프 - FB_A 및 연동 펌프 - FB_B)가 1일차에 평가되었다. 그 다음, 공급 세포 집단은 3 mL/min 및 4 mL 컬럼 볼륨에서 동작하는 Promega 비드로 팩킹된 유동화 베드 유닛을 사용하여 분리되었다. 음향 분리기 유닛 동작을 위해, 다음 조건에서 비드 라벨된 공급물을 분리했다: 유동 비율 - 1 mL/min 및 전력 - 0.75 W.
성능 평가를 위해, 두 장치에서 처리된 샘플을 수집하고, 유출, 플러시 및 정체의 3개의 다른 프랙션에서 분석했다(표 6). 유출로 표시된 처리된 샘플의 첫 번째 프랙션은 전체 샘플이 유동화 베드에 로딩된 후 수집되었다. 플러시로 표시된 두 번째 프랙션은 유동화 베드를 PBS 용액 중에 30 ml의 2% BSA로 플러싱한 후 수집되었다. 이러한 플러싱 단계는 포획되지 않은 모든 세포가 회수되게 하는 데 필요하다. 이러한 프로세스가 완료되면, 컬럼의 나머지 내용물이 검색되어 정체로 표시된 세 번째 프랙션으로 수집되었다. 세 가지 프랙션 모두에서 샘플을 유동 세포 분석을 위해 수집했다. 각각의 프랙션에 대한 질량 및 세포 농도 카운트는 세포 회수율 평가를 위해 기록되었다.
표 5. 유동화 베드(FB) 및 음향 분리기(AS) 유닛 테스트 파라미터(비드 볼륨 = 1cc, 슬러리 볼륨 = 4 ml.
Figure pct00005
순도는 유동화 베드 유닛에 의한 분리 후 모든 샘플에 대해 대략 11~12% 증가했고 음향 분리기 유닛에 의한 분리 후에는 거의 변화가 없었으며, 여기서 초기 세포 집단은 80% TCR 녹아웃 세포로 구성되었다(표 6). 유동화 베드 테스트의 경우, 연동 펌프(FB_A)와 주사기 펌프(FB_B) 모두 유동 통과 및 플러시 프랙션에서 유사한 레벨의 순도(90~92%)를 나타냈다. 유동화 베드 테스트 외에, 2개의 다른 마이크론 크기의 생분해성 미립자 후보(AS_A - PLGA 및 AS_B - Wax)가 음향 분리기 유닛에서 테스트되었다.
표 6은 또한 회수율 결과를 나타낸다. 연동 펌프(FB_A) 및 주사기 펌프(FB_B)가 있는 유동화 베드는 각각 78% 및 61%의 TCR-회수율을 나타냈다. 결과에 따라, FDS는 향후 플랫폼 검증에 연동 펌프를 사용하기로 결정했다. 연동 펌프는 추가적인 프로세스 최적화 및 폐쇄형 시스템 개발의 유연성을 가능하게 한다. PLGA 및 Wax를 위한 음향 분리기는 회수율이 낮았다(각각 50% 및 38%).
표 6. 유동화 베드(FB) 및 음향 분리기(AS) 유닛 테스트 파라미터
Figure pct00006
예 4
4가지 유동화 베드 유닛 테스트가 각기 다른 동작 절차로 수행되었다. 컬럼에서 공급 세포의 체류 시간은 처리된 샘플을 재순환하거나 또는 더 긴 기간 동안 컬럼에 샘플을 유지함으로써 증가되었다. 초기 공급 농도는 107 cells/mL이었고 TCR a/b-집단은 약 80%였다.
유동화 베드 유닛의 공급 및 초기 비드 로딩에 대해 1일차에서와 동일한 절차를 수행하였다. 표 7은 재순환 없음(FB_E, 재순환 없음), 1회 재순환(FB_F, 1회 재순환), 4회 재순환(FB_G, 4회 재순환), 정지 및 유동(FB_H, 정지 및 유동)의 4가지 다른 동작 절차를 나타낸다. 구체적으로, 정지 및 유동 조건에서, 2.5 mL의 공급 샘플에 (3 mL/min)로 로딩하고 3분 20초 동안 유동을 정지시켰다. 모든 공급 볼륨이 컬럼에 로딩될 때까지 이 절차를 반복했다. 모든 공급 세포는 총 13분 20초 동안 더 높은 전력 조건(4.5 W)으로 컬럼에 유지되었다. 재순환 단계와 정지 및 유동 단계가 완료되면, 컬럼을 30 mL의 2% BSA 용액으로 플러싱했다. 처리된 샘플은 1일차에서와 같이 수집 및 분석되었다.
표 7. 유동화 베드(FB) 플랫폼 및 음향 분리기(AS) 유닛 테스트 파라미터(비드 볼륨 = 1 ml)
Figure pct00007
분리 후 모든 샘플에 대해 순도가 대략 9-18% 증가했으며, 여기서 초기 세포 집단이 80% TCR 녹아웃 세포로 구성되었다(표 8). 한 번의 재순환(FB_F)으로 유동 통과 및 플러시 부분에서 순도가 각각 95.6% 및 97.7%였다. 특히, 4회 재순환(FB_G)은 순도가 낮았고 4회 재순환으로 인해 약간의 온도 상승이 관찰되었다. 온도 상승은 정지 및 유동 조건(FB_H)에서도 발생했다.
표 8. TCR a/b- 유동화 베드 및 음향 분리기 테스트에서 순도 및 회수율
Figure pct00008
TCR a/b-회수율에 대해, 재순환 및 정지 및 유동 조건은 양호한 결과를 나타냈다. 더 많은 재순환 단계를 추가하면 더 양호한 회수율(1회 재순환 - 82.64% 및 4회 재순환 - 98.89%)을 나타냈고 정지 및 유동 조건에서도 높은 회수율(85.75%)을 보였다.
본 개시에 따르면, 다수의 유리한 특징을 제공하는 음향 친화성 시스템이 논의된다. 예를 들어, 여기에서 논의된 시스템 및 방법들은 표적 세포 물질에 대해 증가된 회수율 및 순도를 제공할 수 있다. 상기 시스템 및 방법들은 확장 가능하며, 상대적으로 광범위한 물질 볼륨을 처리할 수 있다. 포지티브 및 네거티브 선택은 본 개시에 따라 구현될 수 있다. 포지티브 선택에는 성분채집 생성물에 따른 구현이 포함될 수 있다. 네거티브 및 포지티브 선택은 다중화 기반으로 구현될 수 있으며, 여기서 다수 타입의 세포 물질이 한 번에 선택될 수 있다. 여기에 설명된 시스템 및 프로세스들은 완전히 자동화될 수 있으며 소모품 요소들과 함께 사용되는 것으로 생각할 수 있다. 음향 친화성 세포 선택 시스템은 세포 집중-세척 장치 및/또는 다운스트림 적용을 위한 시스템과 통합될 수 있다.
유전자 및 세포 요법은 암 및 자가면역과 같은 생명을 위협하는 질병을 치료하는 데 있어 큰 가능성을 나타낸다. 혈액암에 대한 줄기 세포 이식 또는 키메라 항원 수용체 T-세포(CAR-T) 요법과 같은 치료법 개발은 혈액 또는 성분채집 생성물의 초기 집단에서 세포 선택을 사용할 수 있다.
CAR-T 치료제 개발을 위해, T-세포, B-세포, 단핵구, NK 세포 및 호염기구, 호중구, 호산구, 수지상 세포와 같은 기타 다른 세포를 포함하는 말초혈액 단핵 세포(PBMC)는 혈액 또는 성분채집 생성물로부터 분리된다. 이전의 분리 기술에는 밀도 구배 원심분리(물리적, 무표지 선택) 및 표면 마커 발현 기반 선택(친화성, 표지 선택)이 포함된다. 이들 기술은 CD3+ T-세포 또는 CD3+ T-세포의 CD4+/CD8+ 서브세트를 분리하는 데 사용할 수 있다. 약 5억 내지 약 10억의 포괄적 범위에서의 수를 가질 수 있는 T-세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 표적으로 하는 암세포를 발현하기 위해 활성화되고, 바이러스로 형질도입될 수 있으며, 환자에게 투여량의 최종 제형화 전에 추가로 확장될 수 있다. 제형화된 세포 생성물은 자가 치료를 위해 세포를 수집한 동일한 환자에게 주입하거나 동종 치료를 위해 여러 환자에게 주입한다.
그와 같은 세포-기반 요법에 대한 상술한 기술은 정교하고, 길고, 비용이 많이 드는 제조 프로세스를 수반하는 경향이 있다. 더욱이, 그와 같은 CAR-T 제조의 최종 생성물에 대한 품질 관리 프로세스는 전체 시간에 추가되어 누적 시간이 2주이고 환자당 ~$400,000의 비용이 들 수 있다. 세포 서브타입으로의 미세한 분리가 구현됨에 따라 프로세스가 더 길고 비용이 많이 든다. 예를 들어, 동물 연구에 따르면, CD4+ 및 CD8+ 집단 내에서 정의된 T-세포 서브세트를 사용하면 CAR-T 요법에서 생체 내 지속성과 같은 치료 이점이 있을 수 있고, 반면 이펙터(effector) 및 메모리 표현형을 포함하는 T-세포 서브세트의 다른 조합은 T-세포 요법 단기 효율성 및 장기 지속성에 영향을 미칠 수 있다. 상업적인 예에서, Juno Therapeutics는 정의된 CD4/CD8 T-세포 서브세트를 사용하여 비호지킨 림프종을 치료하기 위해 CD19+ B 세포를 표적으로 삼고 있다.
현재 가장 널리 사용되는 세포 분리 기술 중 하나인 밀도 구배 원심분리는 수동, 저해상도 및 확장 불가능한 프로세스이다. 잠재적으로 세포독성 자기 나노미립자를 통한 라벨링을 사용하는 자기-활성화 세포 분류(MACS)를 사용한 세포 선택은 처리량이 제한적이다. 실제로, 여러 MACS 셀 선택은 순차적으로 수행되며(예컨대, 먼저 CD4+ 및 나중에 CD8+) 모든 표적 세포를 수집하는 경향이 있다. 이러한 조건은 MACS 프로세스에서 얻은 각각의 세포 타입을 카운팅한 다음 원하는 시작 비율을 얻기 위해 적절한 양의 세포를 함께 혼합함으로서 CAR-T 제조를 위한 원하는 시작 비율을 수동으로 준비하는 것을 의미한다. 이러한 프로세스는 환자마다 PBMC 조성의 가변성을 고려할 때 더 문제가 된다.
여기에서 논의된 음향-지향 세포 선택 프로세스는 이전의 세포 선택 기술에 비해 많은 이점을 제공한다. 여기에서 논의된 세포 선택에 적용된 음향 기술들은 보다 빠르고 안전며, 예컨대 독성이 적고, 폐쇄적이고, 비용 효율적이고, 견고하며, 보다 세밀한 하위-분리를 양호하게 수행할 수 있는 프로세스를 생성하는 경향이 있으며, 향상된 CAR-T-세포 치료법을 포함한 보다 접근하기 쉬운 세포 및 유전자 치료법을 얻기 위해 더 좋은 품질을 가질 수 있다.
한 세포 선택 기술은 성분채집 생성물로부터 면역 세포 포획 및 용리를 위한 각진 음향파-기반 기술의 사용을 포함한다. 이러한 기술은 세포 및 유전자 치료를 위한 세포 분리 및 생산에서 비용과 프로세스 시간을 크게 줄일 수 있는 잠재력이 있다. 그러한 기술은 밀도, 크기, 압축률 및 기타 다른 인자와 같은 물리적 특성을 기반으로 무표지 분리를 가능하게 하고, 높은 처리량 및 낮은 전단 비율에서 정의된 세포 서브세트의 다중화 선택을 허용한다.
이전에 논의된 유동화 베드 시스템은 음향 친화성 세포 선택(AACS) 세포 분류를 구현할 수 있다. 여기에서 논의된 AACS는 프로세스 규모, 예를 들어 초당 백만개 이상의 세포에서 친화성 표지된 세포 선택을 위해 세포에 가해지는 음향 방사력을 사용한다. 세포 조작에 대한 이러한 접근 방식은 확장 가능하고 명목상 전단이 없다. AACS 유동화 베드는 하부 유입구 유동 항력과 음향 정상파에 의해 생성된 압력 사이의 균형으로 인해 컬럼에 현탁된 친화성 비드를 포함하는 컬럼으로 구성된다. 유동화 베드는 컬럼의 비드가 컬럼 볼륨 전체에 걸쳐 확장되는 확장된 베드 시스템으로 동작할 수 있다. MACS와 같은 팩킹된 베드 시스템은 비드들 사이의 좁은 채널로 인해 항상 높은 전단 또는 낮은 유동 비율을 생성한다. AACS 유동화 베드가 확장 베드로 동작될 수 있기 때문에, 전단력이 현저히 낮고 훨씬 높은 유동 비율을 얻을 수 있다. 이러한 시스템의 더 높은 유동 비율과 확장성은 CAR-T 제조에서 친화성 세포 선택과 관련된 시간 제약을 줄이는 데 기여한다. 예를 들어, 이전의 세포 선택 기술은 8시간의 프로세스 시간을 가질 수 있으며, 이는 세포 생성물 품질을 손상시킬 수 있다. AACS 시스템은 2시간 이내에 이러한 세포 분리를 수행할 수 있다.
AACS 시스템은 CAR-T 제조에 사용될 수 있으며, 다중화된 세포 선택의 유리한 이점을 갖는다. 상기 시스템은 정의된 비율로 T-세포 서브세트를 선택하도록 구성할 수 있다. 이전의 세포 선택 시스템은 그와 같은 다중화된 세포 선택을 달성할 수 없다. 예를 들어, MACS 시스템에는 친화성 표적 세포에 부착된 상자성 나노미립자를 끌어들이기 위해 자화되는 큰 비드로 구성된 팩킹된 베드가 있다. 이러한 팩킹된 컬럼은, 선택되는 실제 항체-항원 쌍에 관계없이, 모든 나노미립자를 끌어당기는 데, 즉 하나 이상의 표적 세포 타입이 분리되는 경우 순차적 라벨링 단계가 사용될 수 있다는 것을 의미한다. AACS 시스템은 다양한 표적에 대한 항체로 기능화된 비드를 가질 수 있다. 유동화 베드는 세포와 비드의 자유로운 움직임과 혼합을 허용하는 한편, 음향을 사용하여 컬럼에 비드를 유지한다. 상이한 항체로 기능화된 비드의 비율을 컬럼에 사용할 수 있으며, 이는 분리되는 대응하는 상이한 항원을 갖는 세포의 비율을 획득함으로써, 예를 들어 정의된 비율에서 CD4/CD8 세포의 동시 다중화 선택을 가능하게 한다.
AACS를 기반으로 하는 다중화된 포지티브 세포 선택 시스템이 여기에서 논의된다. 다중화된 AACS는 T-세포의 총 수와 CD4 대 CD8 T-세포의 비율로 정의되는 원하는 시작 세포 집단에서 다시 동작한다. 1:1 비율로 프로세스를 시작하기 위해 총 2억 개의 T-세포가 사용된다고 가정하면, 1억 개의 CD4+ 및 CD8+ T-세포 모두가 성분채집 생성물에서 분리된다. 이러한 수의 3배, 예를 들어 각 T-세포 서브타입의 3억 개를 갖는 것이 바람직할 수 있어, 제조 실패의 경우에 나머지 세포로 제조 프로세스를 다시 시작할 수 있는 옵션이 항상 존재한다. 실제로, 성분채집 생성물에서 얻어진 환자의 PBMC 양과 CD4/CD8 세포의 비율에는 상당한 변동이 있다. 그러한 서브타입은 환자로부터 성분채집 백(bag)에서 얻은 전체 PBMC의 5%일 수 있으며, 바람직하게는 그 전체의 최소 5%이다. 환자의 혈액에서 가장 적은 수의 PBMC가 100억 개라고 가정하면, 모든 성분채집 백에는 최소 5억 개의 CD4+ 및 5억 개의 CD8+ T-세포가 있을 것으로 예상된다. 그와 같이, 총 CD4+ 및 CD8+ 원하는 세포 회수율은 AACS 다중화 세포 선택 시스템에서 최소 60%(최종 순도 포함)이다.
상이한 세포 표면 마커 세포 타입의 미리 결정된 비율을 얻기 위해 2개의 상이한 방법이 사용될 수 있다. 첫 번째 방법은 세포를 동일하게 결합하고 용리하는 비드의 비율을 다르게 하는 것이다("비드 비율 방법"). 두 번째 방법은, 첫 번째 및 두 번째 용리와 함께, 두 가지 다른 비드 타입에 대한 차등 릴리스(differential release) 메커니즘 또는 동작을 갖는 것으로 구성된다. 첫 번째 용리 버퍼 1은 비드 1에서 세포 타입 1, 예컨대 CD4를 용리하는 데 사용되며, 용리 버퍼 2는 비드 타입 2에서 세포 타입 2, 예컨대 CD8을 용리하며, 여기서 1과 2는 표적 세포 표면 마커(이 경우, CD4 및 CD8)로 정의된다. 이 두 번째 방법을 차등 릴리스 방법이라고 한다.
두 방법 모두, 항체가 세포가 아닌 비드에 부착되는 것이 바람직하지만, 어느 부착을 사용해도 된다. 일부의 상황에서, 예를 들어 비오틴-비오틴화된 항체 배열이 사용될 때, 세포에 대한 항체의 부착은 두 표적 세포 타입의 포획을 야기할 수 있다. 사용된 결합은 i) 단량체성 아비딘 비드 결합 시스템이 뒤따르는 세포-비오틴화된 항체 결합("세포 우선") 또는 ii) 유동화 베드 컬럼에서 친화성 세포 포획이 뒤따르는 단량체성 아비딘 비드-비오틴화된 항체 결합("비드 우선")일 수 있다. 비드 우선 기술은 각기 다른 항체로 기능화된 비드를 기반으로 다중화된 세포 선택을 가능하게 하는 것이 바람직하다. 일부의 구현에서, 다중 컬럼(예컨대, CD4에 대한 컬럼 및 CD8에 대한 컬럼)이 사용될 수 있다. 다른 구현에서는 단일 컬럼(예컨대, CD4/CD8 단일 컬럼 혼합물)을 사용할 수 있다. 구현에 따라 상이한 릴리스 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 다중 컬럼의 경우 직렬 컬럼 릴리스가 사용될 수 있지만, 단일 컬럼의 경우 차등 릴리스 방법이 사용될 수 있다. 일부의 구현에서, 절단될 수 있는 비드-항체 링커가 사용될 수 있다. 다중화된 세포 선택 AACS 프로세스는 CD4+ 및 CD8+ 세포인 1차 세포와 함께 성분채집 생성물 T-세포(또는 PBMC)를 사용하여 수행할 수 있거나 원하는 세포 타입을 선택하기 위해 혼합 세포주(예컨대, 2개의 다른 마커 포함)를 사용할 수 있다.
도 23 및 도 24를 참조하면, 다중화된 세포 선택을 위한 프로세스가 예시되어 있다. 도 23에서, 음향 정상파일 수 있는 음향 필드는 비드가 컬럼을 빠져나가는 것을 차단하는 데 사용되는 반면, 다른 세포 타입을 포함하는 샘플은 컬럼에 적용된다. 도 24에서, 비드 기능화에 의해 표적화된 타입의 세포, 이 경우에는 스트렙타비딘-비오틴 결합이 비드와 결합하여 컬럼에 남는다. 비표적 세포는 음향 필드를 통과하여 컬럼을 빠져나간다. 이들 비표적 세포는 도 23 및 도 24에 예시된 컬럼으로 표적화된 것과 다른 특정 세포 타입을 포획하도록 기능화된 비드를 포함하는 순차적 컬럼에 입력될 수 있다. 비드의 표적이 되는 세포는 포지티브로 선택되고, 비드의 비표적 세포는 네거티브로 선택된다(음향 필드를 통과하여 컬럼 외부에 수집됨).
위에서 논의된 방법, 시스템, 및 장치들은 예이다. 다양한 구성은 적절한 경우 다양한 절차 또는 요소를 생략, 대체, 또는 추가할 수 있다. 예를 들어, 대안적인 구성에서, 상기 방법들은 설명된 것과 다른 순서로 수행될 수 있고, 다양한 단계가 추가, 생략, 또는 결합될 수 있다. 또한, 특정 구성과 관련하여 설명된 특징들은 다양한 다른 구성으로 결합될 수 있다. 그러한 구성의 상이한 관점 및 요소들은 유사한 방식으로 결합될 수 있다. 또한, 기술이 발전하므로, 많은 요소는 예시이며, 본 개시 또는 청구범위를 제한하지 않는다.
예시의 구성(구현 포함)에 대한 완전한 이해를 제공하기 위해 설명에 특정 세부사항이 제공된다. 그러나, 이러한 특정 세부사항 없이 구성을 실행할 수 있다. 예를 들어, 잘 알려진 프로세스, 구조, 및 기술은 구성을 모호하게 하는 것을 피하기 위해 불필요한 세부사항 없이 표시되었다. 이러한 설명은 예시적인 구성만을 제공하며, 청구항의 범의, 적용 가능성, 또는 구성을 제한하지 않는다. 오히려, 구성에 대한 이전 설명은 설명된 기술들을 구현하기 위한 설명을 제공한다. 본 개시의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 구성 요소의 기능 및 배열에 다양한 변경이 이루어질 수 있다.
또한, 구성은 흐름도 또는 블록도로 도시되는 프로세스로 설명될 수 있다. 각각은 동작을 순차적 프로세스로 설명할 수 있지만, 많은 동작을 병렬로 또는 동시에 수행할 수 있다. 또한, 동작 순서가 재배열될 수 있다. 프로세스에는 도면에 포함되지 않은 추가 단계나 기능들이 있을 수 있다.
여러 예시적인 구성을 설명했지만, 다양한 수정, 대안적인 구성 및 등가물이 본 개시의 사상을 벗어남이 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 위의 요소들은 더 큰 시스템의 구성 요소일 수 있으며, 여기서 다른 구조 또는 프로세스가 본 발명의 애플리케이션보다 우선하거나 다르게 수정하게 할 수 있다. 또한, 위의 요소들을 고려하기 전, 도중, 또는 후에 다수의 동작이 수행될 수 있다. 따라서, 위의 설명은 청구항의 범위를 제한하지 않는다.
값이 제1 임계값을 초과한다(또는 보다 많다)는 진술은 그 값이 제1 임계값보다 약간 더 큰 제2 임계값을 충족하거나 초과한다는 진술과 동일하다. 예를 들어, 제2 임계값은 관련 시스템의 해상도에서 제1 임계값보다 하나 높은 값이 된다. 값이 제1 임계값보다 작다(또는 그 안에 있다)는 진술은 그 값이 제1 임계값보다 약간 낮은 제2 임계값보다 작거나 같다는 진술과 동일하다. 예를 들어, 제2 임계값은 관련 시스템의 해상도에서 제1 임계값보다 하나 낮은 값이 된다.

Claims (20)

  1. 유체 유동을 허용하도록 각각의 단부에 개구를 가짐과 더불어, 적어도 2개의 상이한 타입의 세포 물질을 표적으로 하는 복수의 지지 구조의 도입 및 봉쇄를 허용하도록 유동화 베드로 구성되는 컬럼; 및
    상기 컬럼에서 음향 정상파를 생성하기 위한 상기 컬럼의 일단부 상의 음향 변환기를 포함하며,
    상기 음향 변환기는 상기 유체 유동에 대해 상기 컬럼의 지지 구조를 차단 및 유지하기 위해 음향 정상파를 생성하도록 구성되는, 분리 시스템.
  2. 청구항 1에 있어서,
    유체를 교반하기 위해 컬럼에 결합된 교반기를 더 포함하는, 분리 시스템.
  3. 청구항 1에 있어서,
    음향 변환기는 복수의 모드에서 동작하도록 구성되는, 분리 시스템.
  4. 청구항 3에 있어서,
    복수의 모드는 클러스터링 모드 및 에지 효과 모드를 포함하는, 분리 시스템.
  5. 청구항 1에 있어서,
    음향 변환기는 컬럼에서 다차원 음향 정상파를 생성하도록 구성되는, 분리 시스템.
  6. 청구항 1에 있어서,
    미리 결정된 비율로 2개의 상이한 타입의 세포 물질을 얻기 위해 적어도 2개의 상이한 타입의 세포 물질을 표적으로 하는 지지 구조의 비율을 더 포함하는, 분리 시스템.
  7. 청구항 6에 있어서,
    지지 구조가 표적 세포 타입에 특정된 항체로 구성된 친화성 비드를 포함하는, 분리 시스템.
  8. 청구항 7에 있어서,
    친화성 비드가 컬럼 볼륨의 약 10% 내지 약 30% 범위의 컬럼 팩킹을 포함하는, 분리 시스템.
  9. 청구항 7에 있어서,
    친화성 비드는 CD4 또는 CD8 포획 항체 중 하나 이상으로 구성되는, 분리 시스템.
  10. 청구항 7에 있어서,
    친화성 비드가 아비딘-결합 메타크릴레이트 비드로 구성되는, 분리 시스템.
  11. 물질을 분리하는 방법으로서, 상기 방법은:
    적어도 2개의 상이한 타입의 세포 물질과 결합하기 위한 유동화 베드로서 구성된 컬럼에 지지 구조를 제공하는 단계;
    상기 적어도 2개의 상이한 타입의 세포 물질을 포함하는 유체 혼합물을 컬럼 내로 유동시키는 단계; 및
    상기 지지 구조가 유체 유동에 의해 컬럼을 떠나는 것을 차단하기 위해 컬럼의 단부 근처에 음향 변환기로 음향 정상파를 생성하는 단계를 포함하는, 물질 분리 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    컬럼에서 유체 혼합물을 교반하는 단계를 더 포함하는, 물질 분리 방법.
  13. 청구항 11에 있어서,
    컬럼의 제1 지지 구조와 제1 타입의 세포 물질을 결합하는 단계; 및
    상기 제1 타입의 세포 물질과 구별되는 제2 타입의 세포 물질을 컬럼의 제2 지지 구조와 결합하는 단계를 더 포함하는, 물질 분리 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    정상파로 컬럼에 지지 구조를 유지하면서 컬럼으로부터 제1 타입의 세포 물질 또는 제2 타입의 세포 물질 중 적어도 하나를 용리하는 단계를 더 포함하는, 물질 분리 방법.
  15. 청구항 11에 있어서,
    컬럼에서 다차원 음향 정상파를 생성하는 단계를 더 포함하는, 물질 분리 방법.
  16. 청구항 11에 있어서,
    지지 구조가 친화성 비드를 포함하는, 물질 분리 방법.
  17. 청구항 16에 있어서,
    친화성 비드로 컬럼 볼륨의 약 10% 내지 약 30% 범위로 컬럼을 팩킹하는 단계를 더 포함하는, 물질 분리 방법.
  18. 청구항 16에 있어서,
    친화성 비드는 CD4 또는 CD8 포획 항체 중 하나 이상으로 구성되는, 물질 분리 방법.
  19. 청구항 16에 있어서,
    친화성 비드가 아비딘-결합 메타크릴레이트 비드로 구성되는, 물질 분리 방법.
  20. 음향 친화성 분리 방법으로서, 상기 방법은:
    유체 내의 제1 세포 물질을 표적으로 하는 제1 친화성 비드를 제1 컬럼에 제공하는 단계;
    유체 내의 제2 세포 물질을 표적으로 하는 제2 친화성 비드를 제2 컬럼에 제공하는 단계;
    각각의 제1 컬럼 및 제2 컬럼의 단부 근처에 음향 변환기로 음향 정상파를 생성하는 단계;
    제1 컬럼에서 그리고 음향 정상파를 통해 세포 물질 유체 혼합물을 유동시키는 단계;
    제1 친화성 비드가 음향 정상파를 통과하는 것을 방지하기 위해 제1 컬럼에 음향 정상파를 구성하는 단계;
    상기 제1 컬럼의 음향 정상파를 통과한 상기 세포 물질 유체 혼합물을 상기 제2 컬럼으로 그리고 상기 제2 컬럼의 음향 정상파를 통해 유동시키는 단계; 및
    상기 제2 친화성 비드가 제2 컬럼의 음향 정상파를 통과하는 것을 방지하기 위해 제2 컬럼에 음향 정상파를 구성하는 단계를 포함하는, 음향 친화성 분리 방법.
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