CN111630146A - 用于细胞疗法和基因疗法的声学加工 - Google Patents

用于细胞疗法和基因疗法的声学加工 Download PDF

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Abstract

由一种或多种声学元件和细胞处理试剂组成的封闭且模块化的流体系统。该系统采用细胞制造方法用于生产细胞和基因疗法治疗剂。

Description

用于细胞疗法和基因疗法的声学加工
相关申请的交叉引用
本申请是于2018年9月6日提交的美国专利申请序列号16/124,184的部分继续申请，所述美国专利申请是于2018年3月30日提交的美国专利申请序列号15/942,427的部分继续申请，并且要求于2017年9月6日提交的临时申请62/554,569的优先权，并且是于2017年5月3日提交的美国专利申请序列号15/586,116的部分继续申请，所述美国专利申请要求于2017年3月30日提交的临时申请美国专利申请序列号62/479,309的优先权，并且要求于2016年8月15日提交的临时申请美国专利申请序列号62/374,910的优先权，并且要求于2016年7月6日提交的临时申请62/359,182的优先权，并且要求于2016年5月3日提交的临时申请62/330,947的优先权。本申请是于2018年6月15日提交的美国专利申请序列号16/010,296的部分继续申请，所述美国专利申请是于2018年3月8日提交的15/916,270的部分继续申请，所述申请是于2017年10月19日提交的15/788,784的部分继续申请，所述申请要求于2017年6月15日提交的临时申请62/520,488优先权，并且是于2017年5月3日提交的15/586,116的部分继续申请，并且要求于2017年3月8日提交的临时申请62/468,895的优先权，并且要求于2016年10月19日提交的临时申请62/410,312的优先权，并且要求于2016年8月15日提交的临时申请62/374,910要求优先权，并且要求于2016年7月6日提交的临时申请62/359,182的优先权，并且要求于2016年5月3日提交的临时申请62/330,947的优先权。本申请是于2018年3月30日提交的美国专利申请序列号15/942,316的部分继续申请，所述美国专利申请是于2017年6月5日提交的15/613,790的部分继续申请，所述申请要求于2017年4月13日提交的临时申请62/485,229的优先权，并且要求于2017年3月30日提交的临时申请62/479,309的优先权，并且是于2016年4月29日提交的15/143,481、现在的专利号9,670,477的分案，并且要求于2016年4月1日提交的临时申请62/316,933的优先权，并且要求于2015年4月29日提交的临时申请62/154,690的优先权。本申请是于2018年5月18日提交的美国专利申请序列号15/983,823的部分继续申请，所述申请是于2018年4月26日提交的15/963,809的部分继续申请，并且要求于2017年5月18日提交的临时申请62/508,385的优先权，并且要求于2017年9月13日提交的临时申请62/558,282的优先权，并且要求于2017年4月26日提交的临时申请62/490,574的优先权，并且是于2016年7月28日提交的15/222,800的部分继续申请，并且要求于2015年7月28日提交的临时申请62/197,801的优先权。本申请是于2017年6月27日提交的美国专利申请序列号15/634,955的部分继续申请，所述申请要求于2017年3月10日提交的临时申请62/469,550的优先权，并且是于2016年8月23日提交的15/245,112的部分继续申请，并且是于2014年7月11日提交的14/329,723的部分继续申请，并且是于2014年2月7日提交的14/175,766、现在的专利号9,416,344的部分继续申请，并且是于2013年9月13日提交的14/026,413、现在的专利号9,458,450的部分继续申请，所述申请要求于2013年7月12日提交的临时申请61/845,531的优先权，并且是于2013年3月15日提交的13/844,754、现在的专利号10,040,011的部分继续申请，所述申请要求于2013年2月7日提交的临时申请61/761,717的优先权，并且要求于2013年1月21日提交的临时申请61/754,792的优先权，并且要求于2012年10月2日提交的临时申请61/708,641的优先权，并且要求于2012年3月15日提交的临时申请61/611,240的优先权，并且要求于2012年3月15日提交的临时申请61/611,159的优先权。本申请要求于2018年1月9日提交的临时申请62/615,420的优先权，并且要求于2018年1月12日提交的临时申请62/617,074的优先权。所有上述申请的整体公开内容在此完全引入本文作为参考。
背景技术
细胞疗法是使用细胞材料用于治疗患者的一类诊断和/或治疗，所述细胞材料可以包括遗传材料。用于实施细胞疗法治疗的当前方法与极高的成本相关，大约为$500,000-$150万。许多技术和方法用于生产治疗产品，其中每种方法趋于独立、开放或非无菌且昂贵的。例如，该方法可能由数名高技能人员在专用设备上实施，增加了总体成本。
基因疗法使用遗传材料来诊断和/或治疗患者。例如，医疗保健专业人员可以通过将基因插入患者的细胞内，代替使用药物或手术，来使用基因疗法治疗病症。研究人员正在测试几种基因治疗方法，其包括：
·用健康的基因拷贝替换引起疾病的突变基因。
·失活或“敲除”功能不正常的突变基因。
·将新基因引入体内，以帮助对抗疾病。
发明内容
本文讨论了可以用于任何类型的细胞或遗传材料，包括昆虫、动物、植物和真菌的细胞和基因工程技术和方法。细胞疗法使用细胞和/或基因工程技术，以提供用于治疗目的的细胞或遗传材料。细胞疗法有时涉及获得患者可能提供或可能不提供的细胞，出于治疗目的修饰细胞，并且将细胞引入患者内。用于获得引入患者的最终产物的生产方法涉及用于处理和/或操纵细胞材料的许多技术和步骤或过程。本说明书讨论了许多此类技术和过程，其使用声学以操纵、分开和/或保留材料来实现。
基因疗法也可以通过将遗传材料引入靶细胞内来利用。技术如声致穿孔和电穿孔可以用于将核酸链引入瞬时打开的细胞膜内，并且因此将外部遗传材料掺入靶细胞内。
细胞治疗技术包括自体细胞加工，其中所利用的细胞来自单个宿主个体并且重新引入单个宿主个体内。同种异体细胞疗法涉及来自一个或多个个体供体的细胞材料。
通过细胞疗法修饰的细胞的培养也是整个细胞疗法过程的重要方面。修饰的细胞在特殊的培养基环境中生长，并且扩展至更大的群体，以使其可用于临床使用。
除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物。
数值应当理解为包括当减少到相同数目的有效数字时相同的数值，以及与所述值相差小于在本说明书中所述类型的测定值的常规测量技术的实验误差的数值。
本说明书中公开的所有范围包括所述端点在内，并且可独立地组合(例如，“2克至10克”的范围包括端点2克和10克以及所有中间值在内)。本说明书中公开的范围的端点和任何值并不限于精确的范围或值；它们足够不精确，以包括接近这些范围和/或值的值。
与数量结合使用的修饰语“约”包括所述值在内，并且具有由上下文所指示的含义。当在RNA的上下文中，例如在人免疫缺陷病毒(HIV-一种HIV)nge的上下文中使用时，修饰语“约”包括病毒RNA的利用，所述病毒RNA在靶细胞中一次转录成细胞DNA。修饰语“约”也应该被视为公开了由两个端点的绝对值定义的范围。例如，“约2至约10”也公开了范围“2至10”。术语“约”可以指所指示数目的正或负10％。例如，“约10％”可以指示9％至11％的范围，并且“约1”可以意指0.9-1.1。
应当注意，本说明书中使用的许多术语是相对术语。例如，术语“上部”和“下部”在位置上相对于彼此，即上部组件定位于在给定的取向上比下部组件更高的海拔处，但如果装置被翻转，则这些术语可以改变。术语“入口”和“出口”相对于关于给定结构流动通过其的流体，例如流体流动通过入口进入结构内，并且流动通过出口离开结构。术语“上游”和“下游”是相对于其中流体流动通过各种部件的方向，即流体在流动通过下游组件之前，流动通过上游组件。应当注意，在环中，第一组件可以被描述为在第二组件的上游和下游。
术语“水平”和“垂直”用于指示相对于绝对参考即地平面的方向。然而，这些术语不应被解释为要求结构彼此绝对平行或绝对垂直。例如，第一垂直结构和第二垂直结构不一定彼此平行。术语“顶部”和“底部”或“基部”用于指其中相对于绝对参考即地球表面，顶部始终高于底部/基部的表面。术语“向上”和“向下”也相对于绝对参考；向上的流动总是逆着地球的重力。
术语“平行”应该以其两个表面之间保持大致恒定的距离的一般意义，而不是此类表面当延伸到无穷大时永远不相交的严格数学意义来解释。
本说明书涉及“相同数量级”。如果较大数目除以较小数目的商为至少1且小于10的值，则两个数目具有相同的数量级。
在本说明书中讨论的声学装置可以以多模式或平面模式或以多模式和平面模式的组合来操作。多模式指声波在单个来源处在多重方向上的传播。例如，多模式操作可以由声换能器生成，所述声换能器不以平面模式操作，并且在三个维度上产生声力，使得横向力与轴向辐射力具有相同的数量级。可以是超声波的多模式声波由一个或多个声换能器生成，并且在一些实例中，与一个或多个反射器联接，并且在本说明书中有时被称为多维或三维声驻波。平面模式指声波在单个方向上的传播。例如，平面模式操作可以通过激发声换能器，以基本上在一个维度上，例如沿着传播方向产生声力来实现，有时与平面反射器组合。以平面模式生成的可以是超声波的此类声波在本说明书中有时被称为一维声驻波。可以用声换能器实现多模式操作，所述声换能器生成撞击在成形反射器上的平面声波。成形的反射器可以是弯曲的、多面的、阶梯状的或其它成形的特点，使得生成多模式操作。反射器可以是非平面的或在其表面上是多面的，以便在反射来自换能器的入射波时生成差异声波。
多面反射器在反射器的面上创建了微环境，并且修改了声驻波的多模式环境。
声学装置可以用于在流体/颗粒混合物中生成体声波。体声波传播通过一定体积的流体，并且是与表面声波不同的形式，所述表面声波趋于在换能器的表面上操作并且不传播通过一定体积的流体。
声换能器可以由压电材料组成。此类声换能器可以被电激发，以生成平面或多模式声波。由多模式声波生成的三维声力包括与声波传播方向未对齐的径向力或横向力。横向力可以在二维上起作用。横向力是多模式声波中的轴向力的补充，其与声波传播的方向基本上对齐。横向力可以与此类多模式声波的轴向力具有相同的数量级。在多模式操作中激发的声换能器可以显示出在其表面上的驻波，从而生成多模式声波。在换能器的表面上的驻波可能与多模式声波的操作模式有关。当声换能器被电激发以生成平面声波时，换能器的表面可以显示出活塞样动作，从而生成一维声驻波。与平面声波相比，对于相同的输入功率，多模式声波显示出在连续的基础上明显更大的颗粒捕获活性。当反射器的表面为多面、凹面、凸面和其它类型的非平坦表面时，可以利用具有非平坦表面的具有大体上平坦的面的反射器。一个或多个声换能器可以用于生成平面和多维声驻波的组合。在一些操作模式中，多模式和/或平面声波生成界面效应，其可以阻止或保留一定大小的颗粒，而较小的颗粒可以流动通过声波。在一些操作模式下，倾角多模式和/或平面声波可以用于以一定角度偏转颗粒，所述角度是粒度、形状、密度和可压缩性的特征。这种操作模式可用于颗粒的混合群体的分级或产生现有颗粒群体的亚群。
声泳是使用声波的材料分开。本说明书中讨论的实施方式提供了来自流体分散体的颗粒分开的低功率，无压降，无堵塞的方法。声场从颗粒上的散射产生初级声辐射力。多模式操作导致三维声辐射力，其充当三维捕获力场。当颗粒相对于波长较小时，声辐射力与颗粒体积(例如，半径的立方)成比例。声辐射力与频率和声对比因子成比例，其为颗粒与流体密度比以及颗粒与流体可压缩比的函数。声辐射力与声能(例如，声压幅度、流体密度和可压缩性的平方)成比例。对于谐波激发，力的正弦空间变化将颗粒驱动到驻波内的稳定位置。
在一些实例中，具有正对比度、相对于波长较小的颗粒被驱动到压力节点。在一些实例中，具有负对比度的颗粒被驱动至压力波腹。在一些实例中，由于颗粒的不同声学对比因子，颗粒被驱动到压力节点和压力波腹两者。当施加到颗粒上的声辐射力强于流体阻力与浮力/重力的组合效应时，颗粒在声驻波场内捕获。横向声力和轴向声力对被捕获的颗粒的作用导致通过颗粒的浓缩、聚簇、凝集、凝结和/或聚结形成紧密堆积的簇，当达到临界尺寸时，所述簇对于比主体流体重的颗粒通过增强的重力而连续沉降，或对于比主体流体轻的颗粒通过增强的浮力而升起。初级辐射力是单个颗粒与入射(在不存在颗粒的情况下)即初级声场之间的相互作用即散射的结果。当声场中存在两种或更多种颗粒时，一种颗粒上的总入射场包括第二颗粒或另外颗粒的主场和散射场。结果是两种或更多种颗粒之间的相互作用。次级颗粒间力(其在一些实例中可以表示为Bjerknes力)有助于颗粒的聚簇/凝结。
当颗粒大小相对于波长较小时，次级力是两种颗粒的体积和声学对比度、分开距离、连接两种颗粒的中心线相对于声场轴的取向、激发频率以及入射声场的函数。已开发了用于计算初级和次级声辐射力的更准确的模型，并且用于预测关于更一般的条件(例如相对于波长并非较小的粒度)的初级和次级辐射力。
相对于非声学系统，声学系统的使用可以降低构成总体系统的各种方法中使用的试剂量。例如，趋于代表总体方法的显著成本组分的试剂，可以直接引入其中细胞材料或遗传材料保留在声波中的区域内。在这种情况下，试剂可以更高的浓度在细胞材料或遗传材料上操作，使得整个体积无需具有分散在其中的试剂。相应地，与试剂分散在含有细胞材料或遗传材料的体积中时相比，较少的总体试剂可以用于进行相同的功能。
由于在整个过程中细胞的无剪切的声学操作的背景下，转移步骤的减少以及污染风险降到最低，多重单元操作的集成可以增加总体过程效率。
多重单元操作也可以分成单个操作，以与生物加工领域中的其它技术一起利用。例如，声学浓缩和洗涤单元可以与其它当前利用的生物加工设备一起利用。单元可以根据需要集成或根据需要分开。
本说明书中讨论的所有专利申请和文件都整体引入本说明书作为参考。
在附图和下文描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据说明书和附图以及权利要求，本发明的其它特点、目的和优点将变得显而易见。
附图说明
图1是细胞治疗过程的高级方框图。
图2是自体细胞治疗过程的图解。
图3A是声学模块的侧视图。
图3B是声学模块的横截面侧视图。
图4是在密度梯度分离模式下操作的声学模块的横截面侧视图。
图5是用于实施浓缩/洗涤操作的系统的图解。
图6A是在低细胞密度浓缩操作下的声学模块的横截面侧视图。
图6B是在低细胞密度洗涤操作下的声学模块的横截面侧视图。
图6C是在低细胞密度回收操作下的声学模块的横截面侧视图。
图7A是在高细胞密度浓缩操作下的声学模块的横截面侧视图。
图7B是在高细胞密度洗涤操作下的声学模块的横截面侧视图。
图7C是在高细胞密度回收操作下的声学模块的横截面侧视图。
图8是包括用于细胞加工功能的珠的系统的图解。
图9是包括声学亲和模块的横截面侧视图的声学亲和分离系统的图解。
图10是显示了TCR+细胞浓度的两个浓度图。
图11A是在不存在声场的情况下TCR+和TCR-细胞浓度的图。
图11B是在声场的操作下TCR+和TCR-细胞浓度的图。
图12是显示了TCR-细胞浓度的两个浓度图。
图13是在声学加工之前和之后TCR+和TCR-细胞分布的两个图。
图14是使用单个声学模块进行多重不同操作的系统的图解。
图15是显示了在声场的存在和不存在下细胞和试剂共定位的图解。
图16A、16B、16C、16D和16E是显示了在不同声学设置下的分布的图。
图17A和17B是关于声转导/转染的不同试验的结果图表。
图18是显示了在不同条件下的转导效率的分布的图。
图19是倾角波装置的横截面侧视图。
各个附图中相似的参考符号指示相似的元件。
具体实施方式
细胞疗法是使用细胞材料治疗患者的疗法。此类疗法有时涉及获得可以由患者提供的细胞，修饰细胞用于治疗目的，并且将细胞引入患者内。用于获得引入患者的最终产物的生产方法涉及用于处理和/或操纵细胞材料的许多步骤或过程。本说明书讨论了许多此类过程，其使用声学分离和/或分级和/或选择材料和细胞、和/或保留材料或细胞、和/或操纵细胞或材料和/或培养细胞来实现。细胞疗法可能涉及过程如骨髓移植。
基因疗法涉及将遗传材料引入细胞内。使用技术如基于化学相互作用、声致穿孔、电穿孔的那些和/或允许在膜中打开瞬时间隙的其它方法来破坏细胞膜和核膜。膜中的这种破坏允许将遗传材料例如核酸引入细胞内。
图1显示了泛化的细胞治疗方法100。细胞治疗方法100包括分离和/或选择细胞(步骤110)。在自体细胞疗法中，细胞得自待治疗的患者。在同种异体细胞疗法中，细胞得自除待治疗患者外的来源。细胞可以普遍地或专门针对细胞疗法应用进行修饰。
在分离和/或选择特定细胞之后，对细胞进行改造和/或活化和/或扩增(步骤112)。例如，在浓缩和洗涤步骤之后，可以通过转导或转染来修饰细胞的遗传材料。可以培养细胞，和/或可以对细胞进行差异活化、遗传修饰和扩增。细胞亚型可以繁殖并且在群体中变得占优势。这种结果可以在细胞类型特异性活化(例如T细胞扩增)中发生，其中T细胞通过人工抗原呈递细胞(例如抗CD3/抗CD28抗体缀合的Dyna Beads)、或通过其它手段例如专门的材料化合物或微珠或纳米珠特异性活化。用于生成嵌合抗原受体T细胞的方法涉及以下步骤：血液白细胞单采术和T细胞分离或从leukopak中分离T细胞，通过物理或材料手段的T细胞活化，利用病毒载体的T细胞转导，在培养基中的T细胞扩增以及冷冻保存或直接施用于患者。与其它外周血单核细胞相比，T细胞在体外培养物中可以分裂多次，或可以通过代谢选择富集，例如在心肌细胞分化过程中，经由乳酸累积消除多能干细胞的过程中发生。
用于增强和修饰细胞用于细胞疗法的其它技术包括使用规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)，DNA序列家族，其与紧靠CRISPR序列定位的CRISPR相关(Cas)基因一起利用。特别地，Cas9(CRISPR相关蛋白9)与CRISPR DNA序列一起利用。增强和修饰细胞用于细胞疗法的其它手段还包括TALEN(转录激活子样效应核酸酶)和睡美人(Sleeping Beauty)转座子系统。一旦细胞产物已得到增强，细胞生产就可以用于生产大量的增强细胞(步骤114)。声学可以用于进行这些过程中的一些或全部。例如，声学细胞培养系统可以掺入声学T细胞活化、声转导/转染和/或声学细胞扩增。在一些系统中，不同的步骤在串联布置的不同装置中进行。在一些系统中，不同的步骤在单个装置中串联进行。应理解，这些过程在流体环境中发生，并且因此也可以称为声流体过程。
图2示意性地示出了用于治疗患者122的T细胞治疗方法120，其中对患者的T细胞进行改造，因此它们将攻击癌细胞。图2示出了自体方法，其中患者122是待增强细胞的来源、以及由该方法产生的增强细胞的接受者。类似的方法可以用于同种异体细胞疗法。例如，可以使用来自其它供体的leukopak而不是直接来自患者的血液作为待增强细胞的来源，来进行T细胞治疗方法。
声学装置(例如无标记的密度梯度分离装置、倾角波分离装置或倾角流动分离装置)可以用于进行白细胞单采术，从患者的血液样品中分离白血细胞，并且增强淋巴细胞群体。在继续进行细胞治疗方法之前，还可能需要将来自患者的细胞解冻，并且与低温材料例如DMSO(二甲基亚砜)分开。在分离白血细胞后，可以将患者血样的剩余部分返回给患者或丢弃。白细胞单采术减少了待加工流体中存在的红血细胞(RBC)和血小板，主要留下了外周血单核细胞(PBMC)，例如淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)、粒细胞和单核细胞。在图4的讨论中描述了声学密度梯度分离的实例。在图13的讨论中描述了倾角波和倾角流动分离系统的实例。这些系统使用基于大小、密度、可压缩性和/或声学对比因子来区分颗粒的声学方法，以分离组分。
在步骤之间，可以使用浓缩/洗涤系统来加工细胞或靶生物材料，以增加待加工流体中的细胞浓度，以去除不需要的材料(例如，非靶细胞、细胞片段、血小板和碎片)，并且改变携带细胞的流体。T细胞可以以不同次序洗涤和/或浓缩和/或洗涤，或产生对于浓缩/洗涤操作所需的结果。一些系统使用一个或多个声学装置实现浓缩/洗涤操作，所述声学装置可以保留T细胞并将其浓缩成减少的体积。示例浓缩/洗涤系统在图5-8的讨论中描述。一些方法和系统在声学密度梯度分离之后掺入了浓缩/洗涤步骤。例如，当由亲水多糖如Ficoll-PaqueTM组成的密度梯度介质用于分离特定细胞，例如RBC时，可能必需在后续过程步骤中洗掉剩余的密度梯度流体。
加工分离的PBMC以选择且活化特定类型的T细胞。T细胞，也称为CD4+或CD8+T淋巴细胞，是一类淋巴细胞，其在细胞介导的免疫中起关键作用，并且可以通过在细胞表面上T细胞受体的存在而与其它免疫细胞区分开。T细胞包括靶T细胞124和非靶细胞126两者。
例如，声学装置128可以用于维持对于流场中的特定细胞具有亲和力的微粒、纳米颗粒或微载体(例如，颗粒、珠或气泡)。例如，亲和选择方法可以实现基于标记物例如CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+的选择。选择还可以用于T细胞受体选择或TCR，其是在T细胞的表面上发现的分子，其负责将抗原片段识别为与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的肽。声学亲和选择可以是其中微载体对于靶T细胞具有亲和力的正选择，或其中微载体对于非靶细胞具有亲和力的负选择。T细胞治疗方法120使用负选择，其中仅靶T细胞穿过声学装置128。某些系统使用正选择以靶向CD3+T细胞或CD3+T细胞的子集，例如CD3CD4和CD3CD8 T细胞，或使用负选择以去除单核细胞和/或B细胞。一些方法和系统在选择特定细胞之后掺入浓缩/洗涤步骤，以从细胞悬浮液中去除抗体和其它亲和选择试剂和/或浓缩细胞群体用于下游应用。一些系统提供了来自单采血液成分术产物的单核细胞(MNC)的无标记选择。示例亲和选择系统在图9的讨论中进行描述。
在分离后，将靶T细胞暴露于活化试剂，例如Dynabeads(Thermo)或TransAct(Miltenyi)。这些活化试剂通常含有对T细胞受体及其共刺激分子CD28特异性的抗体。取决于用于活化的刺激，在使T细胞与这些试剂一起离体温育数小时或数天后，T细胞分裂多次，并且其数目显著扩展用于以后的生产过程。
在T细胞治疗方法120的一种配置中，通过使用病毒载体将遗传材料130转移到靶T细胞124内来增强活化的T细胞，其使得T细胞能够在其外表面上表达嵌合抗原受体(CAR)131，其结合在患者的癌细胞上呈现的特异性蛋白质。尽管T细胞疗法方法120使用转导(即，取决于病毒类型，通过病毒载体将外源DNA或RNA引入细胞内的过程)，但某些方法使用转染、电穿孔或声致穿孔，其不需要病毒载体将外来遗传材料引入细胞内、或增强细胞的其它方法。在一些系统中，基因转移步骤用声学方法实现，所述声学方法捕获和/或共定位和/或浓缩T细胞以及例如慢病毒或腺病毒。
在T细胞治疗方法120中，修饰的T细胞132的群体在增强后进行扩增。扩增过程可以包括灌注介质更换。一些系统通过使用声学装置培养细胞群体来实现扩增过程，所述声学装置将T细胞维持在培养物中，其中在培养期自始至终可以更换培养基，以添加营养素和细胞因子(如葡萄糖和白介素2)，并且去除代谢废物如乳酸盐。在扩增后，将修饰的T细胞132浓缩并洗涤，然后例如通过输注施用于患者122。
实施T细胞治疗方法120的一些系统是封闭且模块化的声流体系统，具有声学元件和细胞加工试剂，用于规模为300至1500亿个细胞和750mL至5L的细胞制造过程。
实施T细胞治疗方法120的一些系统和方法包括来自单采血液成分术产物的单核细胞(MNC)分离，来自单采血液成分术产物的T细胞(例如CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+)分离，在细胞改造和扩增后去除T细胞受体阳性细胞(TCR+细胞)，以及几个洗涤和体积改变步骤。
实施T细胞治疗方法120的一些系统和方法包括规模依赖性和/或规模非依赖性应用，或其组合。此类实施方式可以控制细胞制造方法起始和最终的细胞群体和/或使这些过程步骤自动化。
实施T细胞治疗方法120的一些系统和方法包括关于图5至图14描述的一个或多个装置。这些装置可以是独立的或集成的或者以各种组合或顺序组合。尽管一般就T细胞应用而言进行描述，但其它类型的细胞材料可以用这些声学细胞加工系统和方法进行加工。
声学模块
图3A和图3B分别是声学模块140的照片和示意图，所述声学模块140可用于用于进行一个或多个步骤，例如，声学密度梯度分离、细胞活化、浓缩/洗涤、基因转移和/或细胞治疗方法的细胞扩增步骤，例如参考图2所述的那些。
声学模块140限定具有入口144、出口146和排放口148的流动腔室142。换能器152(例如，超声换能器)和反射器154彼此隔着流动腔室142放置。在一些实施方式中，反射器154替换为第二换能器152。在操作中，换能器152在流动腔室142中的流体中产生声波。声波与反射器154相互作用以产生声驻波。换能器152可以进行操作，以提供产生边缘效应的声驻波，所述边缘效应限制特定颗粒进入声驻波内，或者提供产生声节点和波腹的场的声驻波，所述场捕获在声驻波内的特定颗粒。构造了声学模块140的原型。
声学密度梯度分离
图4示出了用于白血细胞与血液的其它组分的声学密度梯度分离的声学模块140。血液或稀释的血液通过声学模块140从入口144泵送到出口146，在流动腔室142中诱导由箭头指示的流动模式。
换能器进行操作，以在换能器152和反射器154之间的区域中生成声驻波156。对于特定类型的操作，系统通常以特定频率(例如1或2MHz)调谐到每单位流速(ml/分钟)的电功率(以瓦特计)比的特定值。在一定范围内，只要每单位流速的功率比保持恒定，就可以在装置内调整流速。通过改变换能器和反射器之间的路径长度，并且通过使换能器和反射器更宽，装置可以按比例放大或缩小。按比例放大或缩小的装置以相同的线速度操作。然后，通过按比例缩小的装置的横截面积的改变来给出流速中的增加或减少。驻波的频率是可调整的，取决于待在驻波中捕获的目的粒度。对于细胞，通常的操作频率在500kHz至5MHz之间。对于较小的颗粒，例如病毒或外来体，操作频率可以增加到12MHz、24MHz、或36MHz或更高。对于较大的亲和珠，操作频率可以较低，例如100kHz，但也可以是1或2MHz或更高。声驻波捕获具有一定大小和声学对比因子的细胞，例如RBC 160和WBC，但对于给定的一组操作条件可能不捕获血小板。以多模式方式操作确保捕获的细胞聚簇，并且当簇达到临界大小时连续沉降出来，所述临界大小取决于流体和细胞的特性。收集器用密度梯度介质164进行预填充，所述密度梯度介质164调谐至低于RBC 160和粒细胞162，但高于PBMC 166的密度，使得RBC 160和粒细胞162通过密度梯度介质164沉降并掉落到收集器的底部。另一方面，PBMC166从声场中沉降出来，并且沉降到密度梯度介质164的顶部，因为它们的密度小于密度梯度介质的密度。然后，这种分层效应将允许收获富集的PBMC166。在初始体积的血液已循环通过装置之后，可以通过将流出物146循环回到入口，反复循环回到入口144来进一步增加分离性能，使得在一段时间内，分层效应和密度梯度分离得到进一步增强。(Kedar，我们具有应该尝试在此处包括的关于增强浓缩的数据)
声驻波156产生边缘效应，其产生边界158，所述边界158限制或阻止了颗粒的通过。这种效应将RBC 160、粒细胞162、ficoll 164、PBMC 166和血浆168保留在流动腔室142的下部部分内。在流动腔室142的这个区域中的流体流速可忽略不计，并且由于其相对密度，保留的组分沉降为离散的层。
分离可以进行目视观察。在分离完成后，不同的级分通过排放口排掉。在分离PBMC细胞后，可以将患者血样的剩余部分返回给患者或丢弃。
与技术如逆流离心相比，这种方法对待分离的细胞施加低得多的力。
浓缩/洗涤系统
浓缩和洗涤的物理手段，例如高速离心机，对免疫细胞(例如T细胞)产生大量应力和应变，其可能降低细胞免疫功能的功效。关于图3A和3B描述的声学模块140可以使用声波包括声行波和/或声驻波，以浓缩和/或洗涤免疫细胞。与通过物理手段相比，这种方法提供了更温和的浓缩和洗涤免疫细胞的过程。这种方法已显示维持高水平的细胞健康和/或生存力。
从在初始培养基中具有例如小于1×106个细胞/mL的低细胞密度的初始混合物开始，声泳可以用于将初始混合物的体积减少例如至少10x，包括20x且直到200x或更多。细胞浓度可以增加至少10x，包括20x且直到200x或更多。体积减小因子是进料细胞密度的函数。随着进料细胞密度增加，可获得的体积减小因子将降低。例如，进料细胞密度在20至4000万个细胞/ml的范围内，体积减少可以是10x，包括20x且更多。这个初始减少过程是第一个体积减少步骤。接下来，可以通过入口144和排放口148引入第二介质(例如，生物相容性洗涤液或缓冲溶液)，以至少部分地置换第一介质并进行洗涤步骤。洗涤效率可以为80％、90％、99％且更多，取决于所使用的第二介质的量。接下来，可以使细胞和第二介质的新混合物经受声泳体积减少步骤。这一系列操作称为“渗滤”过程。声学浓缩洗涤装置可以处理的细胞浓度和进料体积的范围非常广；进料体积可以小至200ml且大至1000ml、3000ml、5000ml且更多；细胞密度可以低至150,000个细胞/ml，可以是100-500万个细胞/ml、500-1000万个细胞/ml、1000-2000万个细胞/ml、以及2000-5000万个细胞/ml。为了在收集器中获得更高的细胞浓度，可以添加另外的排放端口，使得可以去除声学装置内的上清液。(需要增加这种可能性)
图5显示了示例浓缩和洗涤系统200，其包括声学装置222，有时被称为声学浓缩洗涤波(ACW)元件。系统200使用声学模块140(参见图3A和3B)作为声学装置222。一些系统使用其它声学模块用于其声学装置222。尽管关于细胞的浓缩和洗涤进行描述，但系统200可以用于浓缩和/或洗涤其它材料。
声学装置222被掺入流体控制模块211内，所述流体控制模块211还包括多个开关阀V1、V2、V3、V4，多个气泡传感器B1、B2、B3，以及多个温度传感器T1和T2。泵220被布置在声学装置222的上游，并且被配置或控制为泵送流体以流动通过声学装置222。在系统200中，泵是蠕动泵，但一些系统使用其它类型的泵，例如注射泵。
系统200还包括声学控制中心214。在系统200中，声学控制中心是被配置为一起控制声学装置222和流体控制模块211的集成声学加工系统。声学控制中心214向用户呈现图形用户界面(GUI)，用于控制声学装置222和流体控制模块211。一些声学控制中心使用其它用户界面来实现。声学控制中心214可以通过控制流体控制模块211中的元件来提供自动流体流动，操作各种阀。声学控制中心还通过自动地改变激发频率以及对换能器的电压信号，根据需要对于驻波维持特定的操作点。它通过连续测量跨越换能器的电压信号和流经换能器的电流来进行该功能。根据这些测量，控制中心可以计算所有换能器特性，例如电阻抗、电阻、电抗、实际功率和表观功率。相同控制中心可以用于控制所公开的任何装置或方法。
在示出的实例中，含有目的细胞的进料流体210和洗涤流体流211均通过阀V1进入系统200内。在其中通道和流动腔室由无菌一次性使用盒提供的系统200中，在使用之前无需(例如，用洗涤流体)清洁系统。在使用中，洗涤流体袋212和进料流体袋214置于流体控制模块211的上方。当操作阀V1，以提供在洗涤流体袋212或进料流体袋214和泵220之间的流体连接时，这种相对位置允许重力流启动泵220。
在泵220被启动之后，流体控制模块211被配置用于浓缩进料流体中包含的细胞。控制声学装置222，以在声学装置222的流动腔室142中生成声波。操作阀V1，以提供在进料袋210和泵220之间的流体连接。操作阀V3，以隔离排放出口148，并且提供在废物出口146和阀V4之间的流体连接。T2是废物出口的温度，并且提供跨越声场的任何可能的温度升高的了解，其可以提供关于系统的成功操作的有用指示，并且确保细胞不经历任何明显的温度升高。阀V2允许废物出口和上清液排放端口之间的切换。操作阀V4，以提供阀V3与废物袋218之间的流体连接、或提供用于将废液出口流体再循环回到进料袋210的选项。存在至少两种操作模式。在第一模式下，进料流体通常对于固定的持续时间再循环，以在声场中建立细胞簇，其趋于增加系统的捕获效率。在所述点时切换阀V4，并且进料流体现在被排空到废物袋218内。这个步骤继续直到气泡传感器B1检测到空气，在所述点时这个过程步骤被停止。在第二模式下，再循环可以对于这个过程步骤的整个持续时间发生。在这种模式下，类似于渗滤，细胞在声场中被连续捕获，并且含有越来越少的细胞的废物出口被送回进料流，使得逃逸的细胞多次穿过声场，增强了在声场中捕获的可能性。泵220以稳定的流速或变化的流速泵送流体以流动通过声学装置222。流速在这个过程步骤过程中通常是固定的。在固定的持续时间后，停止再循环。此时，通过切换阀V1开始洗涤过程。洗涤流体流可以采用多个流体路径。通常，洗涤流体通过入口144和收集器排放口148流入，并且在一些实施方案中，添加了另外的洗涤端口。这通过进一步的阀安装(未显示，也许我们应该显示)来实现。洗涤过程在固定的持续时间内用预定量的洗涤流体发生，以通过置换进料流体来达到所需的洗涤效率，例如80％或90％或99％或更高。洗涤流体也被丢弃到废物袋218内。当洗涤过程已结束时，泵停止流动。此时，流动已停止。然后关闭声场，并且允许仍未沉降出来进入收集器142内的捕获细胞随后沉降到收集器142内。沉降过程步骤也具有通过控制中心控制的固定的持续时间。在沉降过程结束时，切换阀V2，并且上清液从声学元件中去除并流入废物袋内。(我们不需要第二个泵吗？)(或泵的位置正确吗？)上清液是声学元件中在收集器容积上方的流体体积142的一部分，其现在含有已沉降到收集器内的所有细胞。一旦去除了上清液体积(其通过气泡传感器B3感测到)，就切换阀V3，并且通过控制中心以某一固定的流速开始通过排放口148从收集器体积中去除浓缩且洗涤的细胞。浓缩且洗涤的细胞流入浓缩袋216内。气泡传感器B2用作确定这个过程步骤何时已完成的传感器。
图6A示出了在低细胞浓度下的进料体积浓缩期间的声学装置222，所述细胞浓度可以是0.2至1百万个细胞/ml、或1-2百万个细胞/ml。由于与进料体积相比，ACW低得多的流体体积，可以借助于捕获或保留来实现浓缩。例如，与200ml直到5000ml的进料体积相比，通常的ACW滞留体积可以为15ml、30ml、或80ml或更多。伴随流体控制模块处于所述浓缩配置，含有细胞的进料流体通过入口114泵送进入声学装置222内，逆着重力从底部到顶部流动通过流动腔室142，并且通过废物出口146流出。声波可以产生压力场，其生成作用于细胞和细胞簇上的初级和次级声辐射力。流体中的细胞可以通过声辐射力的效应被保持(或被捕获)。离开声学装置222的流体流动通过阀V2、阀V3和阀V4到废物袋218。
当主体流体和夹带在主体流体中的材料通过声驻波向上流动时，声驻波捕获(保留或保持)材料(例如二次相材料，包括流体和/或颗粒)。声场从材料上的散射导致三维声辐射力，其充当三维捕获场。
与超声驻波结合生成的三维声辐射力在本说明书中被称为三维或多维驻波。当颗粒相对于波长较小时，声辐射力与材料的颗粒体积(例如，半径的立方)成比例。声辐射力与频率和声对比因子成比例。声辐射力与声能(例如，声压幅度的平方)成比例。对于谐波激发，力的正弦空间变化将颗粒驱动到驻波内的稳定位置。当施加到颗粒上的声辐射力强于流体阻力与浮力和重力的组合效应时，颗粒可以在声驻波场内捕获。
期望地，超声换能器在流体中生成三维或多维声驻波，所述声驻波对悬浮颗粒施加横向力，以伴随轴向力，以便增加驻波的颗粒捕获能力。平面或一维声驻波可以在轴向或波传播方向上提供声力。平面或一维声波产生中的横向力可以比轴向力小两个数量级。多维声驻波可以提供明显大于平面声驻波的横向力。例如，横向力可以与多维声驻波中的轴向力具有相同数量级。多面反射器或其它成形的反射器可以用于生成更大的声辐射力，以进一步增强声场的捕获强度。图6A中示意性地显示了与换能器相对定位的多面反射器。在较高的细胞密度下，可以使用平面或多面反射器。在图7A中显示了与换能器相对的平面反射器。
在细胞在声驻波156中捕获之后，流体控制模块211可以被配置用于洗涤捕获的细胞。继续控制声学装置222，以在声学装置222的流动腔室142中生成声波。切换阀V1，以提供在洗涤袋212和泵220之间的流体连接。阀V3继续隔离排放出口148，并且提供在废物出口146和阀V4之间的流体连接。阀V4继续提供在阀V3与废物袋218之间的流体连接。
图6B示出了在洗涤捕获细胞期间的声学装置222。伴随流体控制模块处于所述洗涤配置，洗涤流体通过入口114泵送进入声学装置222内，逆着重力从底部到顶部流动通过流动腔室142，并且通过废物出口146流出。离开声学装置222的流体流动通过阀V2、阀V3和阀V4到废物袋218。洗涤流体可以是最初容纳细胞的相同类型的缓冲流体，或者可以是不同类型的缓冲流体。尽管描述为已浓缩的洗涤细胞，但洗涤过程可以无需先前的浓缩过程而进行。(如上所述，浓缩由于ACW较小的滞留体积而发生。它可以通过更大的单元来完成)。例如，洗涤过程可以用于更换含有细胞群体的缓冲流体，而不减少缓冲流体的体积。
在浓缩和/或洗涤之后，流体控制模块211被配置用于回收捕获的细胞。停止泵220并且关闭阀V3，以将废物出口146与系统200的下游部分隔离。在密封流动腔室142之后，停用声学装置222。在流动腔室142中不存在流体的流动，并且先前在声驻波156中捕获的细胞沉降到流动腔室142的底部。细胞和小体积的相关流体从流动腔室142的排放出口148倾析。操作阀V3，以提供在排放出口148和浓缩袋216之间的流体连接。
在一些实施方式中，系统200被配置为加工具有低细胞密度的流体，其可以用于细胞工程的缓冲液更换。低密度系统可以配置为对于具有1–3百万(M)个细胞/mL进料浓度的流体，提供数毫升(mL)/分钟(分)的流通量流速。
构建了原型低密度系统。原型系统证实了在维持高细胞生存力的同时浓缩细胞的能力。在一个实例中，原型低密度系统用于浓缩和洗涤T细胞。在约51分钟内加工了大约1L具有约2M个细胞/mL的进料流体。表1显示了浓缩数据。浓缩流体具有极低的最终回收体积6.9mL，伴随250.7M个细胞/mL的高最终密度。活细胞回收率为约84％，伴随160倍的体积减少。
表1：关于低细胞密度的主要T细胞浓缩数据
过程参数 输入 输出
体积(mL) 1105.8 6.9
活细胞密度(M个细胞/mL) 1.86 250.7
总活细胞(十亿) 2.06 1.73
细胞生存力(％) 99.1 97.9
在一些实施方式中，系统200被配置为加工具有高细胞密度的流体，其可以用于细胞工程的缓冲液更换。
图7A-7C分别示出了具有高细胞密度的流体的浓缩、洗涤和回收过程。相同的系统222以不同的操作参数使用。它可以用平面或多面反射器进行操作。这些过程与用于低密度系统222的过程基本上相同。然而，细胞的捕获可以导致捕获细胞的凝集和/或聚簇。另外，次级颗粒间力例如Bjerkness力有助于细胞聚簇。随着颗粒继续凝集和/或聚簇，颗粒可以生长到一定尺寸，在其下颗粒簇上的重力克服了声辐射力和流体阻力。在此类尺寸下，颗粒簇从声驻波中掉出来。
在浓缩步骤期间，在声驻波156中捕获的细胞通过所有横向力和轴向力的作用形成细胞簇。细胞簇变得足够大，以致于重力克服了流动通过流动腔室142的流体的向上力和声驻波156的捕获效应，并且细胞簇沉降到流动腔室142的底部，如图7A中所示。簇掉落的频率由流速和细胞浓度控制。
在洗涤期间，如图7B中所示，关闭进料入口144，并且将洗涤流体通过排放出口148引入流动腔室142内。选择低流速以避免使细胞簇重新悬浮。预料某些流速适合于细胞簇。例如，在原型系统222中，使用了流速，而没有观察到明显的细胞簇的重新悬浮。继续控制声波装置222，以在声波装置222的流动腔室142中生成声波。驻声波156限制或防止通过洗涤流体的流动重新悬浮的细胞或细胞簇被携带通过废物出口146离开流动腔室142。
在回收期间，废物出口146被关闭并且声学装置222被停用。如图7C中所示，细胞和小体积的相关流体从流动腔室142的排放出口148倾析。
在一些实施方式中，系统200被配置为加工具有高细胞密度的流体。高密度系统可以被配置为对于具有10–40M个细胞/mL进料浓度的流体提供流通量流速。
构建了原型高密度系统。原型高密度系统证实了在维持高细胞生存力的同时浓缩细胞的能力。在一个实例中，原型高密度系统用于浓缩和洗涤T细胞。在约33分钟内加工了大约1L具有约35M个细胞/mL的进料流体，而无需执行洗涤步骤。表2显示了浓缩数据。浓缩流体具有低最终回收体积48.9mL，伴随587M个细胞/mL的高最终细胞浓度。活细胞回收率为约86％，伴随19倍的体积减少。
表2：关于高细胞密度的主要T细胞浓缩数据
过程参数 输入 输出
体积(mL) 949.9 48.9
活细胞密度(M个细胞/mL) 35.3 587
总活细胞(十亿) 33.5 28.7
细胞生存力(％) 98.8 98.0
用声学装置222加工免疫细胞可以包括单阶段过程/装置和/或多阶段过程/装置，其可以用于细胞群体的加工。过程/阶段可以是单一目的的，或者可以将几个步骤集成到总体免疫细胞加工系统中。关于步骤集成的灵活性和潜力可以允许浓缩且洗涤细胞的改善的回收率。
在一些实施方式中，系统200包括串联联接的两个或更多个低密度声学单元，用于具有低细胞密度的流体的多阶段浓缩和洗涤过程。在一些实施方式中，系统200包括串联联接的两个或更多个高密度声学单元，用于具有高细胞密度的流体的多阶段浓缩和洗涤过程。
例如，使用串联的两个高密度声学装置对两阶段高密度声学单元系统进行建模，而无需其它外围设备以提供两阶段流体控制模块原型。在阶段1中，通过第一高密度声学单元加工具有28.6B个细胞(约31.5M个细胞/mL)的体积为908.6mL的第一流体。加工时间为约33分钟。由第一高密度声学单元产生的浓缩流体具有48.9mL的最终体积，具有23.6B个细胞(约482.6M个细胞/mL)。活细胞回收率为约83％。由第一高密度声学单元产生的废流体具有847mL的体积，伴随5.0？？B个细胞(约8M个细胞/mL)。在阶段2中，来自阶段1的废流体由第二高密度声学单元进行加工。加工时间为约33分钟。由第二高密度声学单元产生的第二浓缩流体具有50.8mL的最终体积，具有3.3B个细胞(约65M个细胞/mL)。从第二高密度声学单元流出的第二废流体具有790mL的体积，具有3B个细胞(约3.8M个细胞/mL)。活细胞回收率为约48％。将第一浓缩流体和第二浓缩流体合并为最终浓缩流体，具有99.7mL的体积和26.9B个细胞(约270M个细胞/mL)，并且活细胞回收率为约94％。因此，与一阶段过程相比，两阶段串联过程实现了更高的活细胞回收率(与83％相比，约94％)和更多的活细胞(与23.6B个细胞相比，26.9B个细胞)。
在一些实施方式中，系统200包括用于低细胞密度和低最终体积的一个或多个低密度声学单元、以及用于高细胞密度和高容量的一个或多个高密度声学单元的组合。低密度声学单元可以是串联联接的，高密度声学单元可以是串联联接的，并且高密度声学单元可以布置在低密度声学单元的下游。
组合可以设计为对于不同的过程结束特异性的。在一些情况下，可以按比例缩小组合，以使流通量、容量、进料和/或最终体积例如降低至1/20L单位。在一些情况下，可以扩展组合，以使流通量、容量、进料和/或最终体积例如增加至5L单位或20L单位。
在测试过程中，还发现超声换能器的主动冷却导致更大的流通量和效率，并且允许对换能器更高的功率递送。像这样，开发了用于主动冷却换能器的冷却单元。冷却单元包括独立的流动路径，其与通过含有流体的装置的流动路径分开，所述流体待暴露于多维声驻波。冷却剂入口适于允许冷却流体进入冷却单元内。冷却剂出口充当冷却剂和废热通过其离开冷却单元的出口。此处，冷却剂入口位于冷却剂出口下方，尽管该路径可以根据需要而改变。流动通过冷却单元的冷却剂可以是任何适当的流体。例如，冷却剂可以是水、空气、酒精、乙醇、氨水或其某种组合。在某些实施方案中，冷却剂可以是液体、气体或凝胶。冷却剂可以是不导电的流体，以防止电短路。冷却单元可以用于冷却超声换能器，当该装置待伴随重复加工和再循环连续运行延长的时间段(例如，灌注)时，这可以是特别有利的。需要时，冷却单元也可以用于冷却运行通过该装置的主体流体。
图8示出了用于来自细胞的浓缩、洗涤和分开微载体或其它亲和珠、颗粒或液滴的四步方法(伴随任选的第五步)。该方法的第一步250涉及在声泳装置256中，浓缩具有附着细胞254的微载体252。通过从生物反应器258接收具有附着细胞254的微载体252，可以将微载体252和附着细胞254引入到声泳装置256中。在生物反应器258中，将微载体252和细胞254悬浮于第一培养基260(例如，用于使细胞在生物反应器中保持活力的生长血清或防腐材料)中。被第一培养基包围的具有附着细胞254的微载体252通过在声泳装置中生成的声驻波262而浓缩。在第二步264中，然后用第二培养基266洗涤具有附着细胞254的浓缩微载体252，以去除第一培养基260(例如，生物反应器生长血清或防腐材料)。第三步268是将含有酶的第三培养基270引入到声泳装置内，以通过第二培养基的酶促作用，使细胞254从微载体252中脱离。在特定的实施方案中，胰蛋白酶是用于使细胞254从微载体252中酶促脱离的酶。然后可以使用多维声驻波262将细胞254与微载体252分开。通常，这通过在多维声驻波262中捕获微载体252来完成，而脱离的细胞254用第三培养基通过。然而，需要时，可以相反地捕获细胞。最后，需要时，可以将分开的细胞任选地浓缩并再次洗涤。
在浓缩且捕获/保持在多维声驻波中之后，微载体可以聚结、凝集、聚集、凝结和/或聚簇至临界尺寸，在这个点时，由于增强的重力沉降，微载体从声驻波中掉出来。微载体可以落入位于声驻波下方的声泳装置的收集器中，以从流动腔室中去除。
在测试期间，使用红色和蓝色食用染料制备有色流体，分别进行浓缩和洗涤的步骤一和步骤二。浓缩混合物包括红色流体中的SoloHill微载体。洗涤混合物包括蓝色流体，并且通过该装置三遍。在显微镜下观察浓缩。浓缩步骤显示为具有99％的效率。经过一系列洗涤通过，第一培养基(染成红色)被第二培养基(染成蓝色)逐渐洗出。光吸收数据显示于表3中。
表3：光吸收
Figure BDA0002577042700000191
红光吸收中的降低和蓝光吸收中的增加证明了洗涤步骤的可行性。声泳浓缩、洗涤和分开方法的测试显示，该方法适合于细胞疗法和微载体应用。浓缩和洗涤步骤以所得到的大于99％的效率进行，并且分开步骤，例如使细胞与微载体分开，以大于98％的效率进行。细胞具有多于98％的生存力。
声学亲和分离系统
图9呈现了声学亲和分离系统300的实例。如关于图2所讨论的，可以使用声学亲和分离系统，使用正选择或负选择来分离靶细胞(例如，CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞)与非靶细胞和其它材料。
在一些实例中，通过使用与靶生物分子相互作用的配体，来完成生物材料例如蛋白质或细胞的亲和分离。然后可以将这种配体共价或非共价附着至表面，使得捕获靶生物分子。如果生物分子是细胞中的跨膜蛋白，则整个细胞将被亲和系统捕获。
配体是识别生物分子并与之形成复合物的物质。对于蛋白质-配体结合，配体通常是与靶蛋白上特异性位点结合的分子，所述靶蛋白可以是细胞内、细胞外或跨膜的；这种结合可以导致靶蛋白构象的改变，其依次又可以产生信号。配体可以是与蛋白质材料结合的小分子、离子或蛋白质。配体和结合配偶体之间的关系是电荷、疏水性和分子结构的函数。结合通过分子间力例如离子键、氢键和范德华力而发生。对接结合实际上可通过解离来逆转。配体和靶分子之间可测量的不可逆共价键在生物系统中是典型的。
可以与受体结合，改变受体的功能，并触发受体的生理应答的配体被称为受体激动剂；阻断受体的生理应答的配体是拮抗剂。激动剂与受体的结合既可以根据可以触发多少生理应答来表征，也可以根据产生生理应答所需的激动剂浓度来表征。高亲和力的配体结合暗示相对低的配体浓度足以最大程度地占据配体-结合位点，并且触发生理应答。Ki水平越低，越可能存在未决(pending)抗原和接受抗原之间的化学反应。低–亲和力结合(高Ki水平)暗示在最大程度地占据结合位点并实现对配体的最大生理应答之前，需要相对高的配体浓度。二价配体由作为配体的两个连接分子组成，并且在科学研究中用于检测受体二聚体并研究特性。
T细胞受体或TCR是在T细胞或T淋巴细胞表面上发现的分子，其负责将抗原的片段识别为结合至主要组织相容性复合物(MHC)分子的肽。TCR和抗原肽之间的结合具有相对低的亲和力，并且是变性的。
声学亲和分离系统300包括声学装置310，其可以通过操作声边缘效应模式，也称为声界面效应模式中的声场进行操作，以维持(或保持)对于声流场下方的特异性细胞具有亲和力的微载体(例如，颗粒、珠、液滴或气泡)，使得大多数树脂被声场阻挡并防止流入声场内。声场的前缘或界面对微载体施加足够强的向下力，以防止其进入声场。微载体可以在声场中捕获，例如多维声驻波或关于图4讨论的边缘效应，可以防止微载体离开流动腔室，同时可能无法保留自由的、未结合的细胞。
声学装置310具有含有入口314和出口316的流动腔室312。声学装置是可操作的，以生成具有边缘效应的声场318，所述边缘效应限制了树脂从声学装置310中的流出。在这个实例中，微载体是用配体功能化的微珠320，所述配体优先结合靶细胞322。重力的向下力与流动通过的流体的向上力之间的相互作用产生了微载体的流化床。珠携带用于以高特异性亲和结合各种靶的分子。可以使用的一些亲和分子尤其包括抗体、适体、寡核苷酸和受体。关于亲和力结合的靶可以包括生物分子、细胞、外泌体、蛋白质、病毒、药物等。
尽管顺磁珠(例如，以名称Dynabeads或Miltenyi's…(找到的名称)出售的铁或铁磁珠)已用于实现亲和提取，但声学装置310和类似装置使亲和分离成为可能，而无需顺磁性的其它微载体的珠。
已证实了具有高声学对比度和亲和化学的非磁性珠。这些声学珠可以具有用于亲和结合的功能化的材料涂层或组合物，并且被设计为用声场从复杂混合物或流体中提取。声学珠可以直接用于使用磁珠的细胞制造、生物化学、诊断、传感器等开发的应用中。声学珠可以使用与由磁珠使用相同的表面和亲和化学。用声学珠代替磁珠的这种容易性具有许多优点，包括简化关于应用的批准以及简化应用。亲和珠的一个实施方案是全氟化碳液体例如全氟己烷或全氟溴辛烷的液滴。由于其高密度(1.6至1.9g/ml)和大约400至600m/s的极低声速，此类液滴是有吸引力的亲和珠。
声学珠可以制备为生物相容的。此类珠可以以不同的大小生产，其允许在大小区分声场中基于大小的连续分开，例如可以由倾角向场分级技术提供。声学珠可以与封闭的基于声学的系统组合使用，导致用于治疗细胞制造的连续的衔接循环。这个功能性为磁珠提取提供了替代方案，同时保存了以可直接转移到声学珠的当前现有亲和化学的使用。在分离操作中，声学珠可以是消耗品。
在一个实例中，使用公开的Memorial Sloan Kettering Cancer Center(MSKCC)方案进行了概念验证试验，所述方案用于从患者的血液中提取CD3+T细胞。在试验中，使用了顺磁珠，并且将磁场替换为声场。从患者的血液中提取CD3+T细胞的方法是制造CAR(嵌合抗原受体)T细胞的集成部分。当前的方法基于商购可得的CD3 Dynabeads。在试验中，已努力使方案差异降到最低，包括在培养肉汤中而不是血液中执行实验。由于来自肉汤的CAR T细胞制造中的几个步骤，差异被视为降低的。将溶剂密度增加为使得T细胞“在声学中不可见”，或对声场不那么敏感。Dynabeads的小尺寸可以提供类似于细胞的声学对比度，因此使得分离公差更小。该试验采用了Jurkat CD3+和CD3-T细胞系作为模型。CD3-细胞被用作非特异性捕获的对照。
使细胞悬浮液与结合CD3+细胞的CD3 Dynabeads一起温育。使混合物通过声学系统，其捕获了磁珠(含有或不含细胞)。收集的细胞成功地在培养中生长。用明场图像与荧光图像的重叠检查培养的细胞。珠为黑色的，具有略带红色的自发荧光。活细胞为荧光红色。珠直径为4.5微米。观察到具有珠的CD3+T细胞复合物，其证实了该技术的效率。在这个实例中没有提取到CD3-T细胞，其证实了特异性。
在一个实例中，进行了用声学珠的试验。在这个试验中，琼脂糖珠用作声学珠。这些珠从几个制造商处现货可得，并且不是顺磁性的，或者具有很少至没有铁或铁磁性含量。一些琼脂糖珠具有简化抗体附着的表面修饰。它们也由生物相容性材料组成，其对于治疗溶液可能是重要的。例如，可以使用ABT Bead，其为相对廉价、异质(20-150μm)、现成的珠，可与链霉抗生物素蛋白素和生物素缀合物一起获得。趋于相对昂贵、均质(20-40μm)的CellMosaic琼脂糖珠可以按需以任何修改进行配置。
声学珠可以被捕获在声场如多维声驻波中。在声学系统中使用声学亲和珠已显示了概念验证和性能证实。所公开的方法和系统允许使用现成的试剂和当前可用的声学系统。亲和力可以靶向任何类型的所需T细胞或标记物，包括TCR+、CD3+、CD4+、CD8+。声学珠可以具有高、中或低对比因子，其可以影响珠如何响应声场，例如被迫朝向声节点或波腹、或者通过场。
珠可以由各种材料和组合组成，其允许开发具有声学性能和生物相容性的最佳化学。珠可以进行加工，用于分离、分选或分开过程中有用的任何其它功能。当与调谐声学系统一起使用时，专门设计的声学珠的性能可以匹配或超过顺磁珠。
现有化学可以与声学珠一起使用，并且与尺寸和结构均质性的规格结合，以实现对于声学和分离性能所需的结果。珠可以由复合构造组成，以促进声学效率。声学系统提供了用热管理来管理小尺寸的灵活性，并且使用射流技术来获得用单独的顺磁珠不可能的结果。声学珠的生物相容性和/或生物可降解性以及简化的加工，允许与用于CAR T细胞制造的现有硬件集成。亲和声学珠可以用于多种环境中，包括模型环境，例如掺料有靶细胞和鼠脾提取物的动物血液。声学珠因此可以与现有系统合作使用，并且可以被设计且制造用于靶应用。珠可以提供有声学活性或中性的芯，并且珠自身可以对于高、中或低声学对比度进行配置。珠的大小可以被配置用于组合的分离和亲和力，例如，某种尺寸的珠可以包括功能化的材料以靶向某种生物材料，而另一种尺寸的珠可以被功能化以靶向另一种生物材料，其各自可以在封闭或流动的系统中同时且连续地分开。珠可以设计为在窄或相对宽的范围内具有均匀的尺寸分布。可以使用各种亲和化学，包括链霉抗生物素蛋白-生物素复合物和免疫球蛋白或适体。珠可以设计为易于制造和/或贮存期限。珠可以与批准的化学一起使用，使得它们可以容易地集成到使用批准的化学的已知系统内。
在示例试验中证实了TCR+细胞的亲和力负选择，其中指定了1L的体积和300亿个细胞。在平行试验中，证实了体积为5L和1500亿个细胞的TCR+细胞的亲和力负选择。表4概括了试验结果。
表4
Figure BDA0002577042700000231
在示例试验中证实了来自单采血液成分术产物的CD3+细胞的亲和选择。表5概括了试验结果。
表5
项目 基线 优选的
初始体积 300mL
最终体积 待对于活化进行调整
总活细胞 15B MNC(如果是T细胞，则是正确的)
活CD3<sup>+</sup>细胞回收率 80％ >80％
纯度 95％CD3<sup>+</sup> >95％
在示例试验中指定了来自单采血液成分术产物的CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞的亲和选择。表6概括了试验结果。
表6
Figure BDA0002577042700000232
在示例试验中证实了来自单采血液成分术产物的单核细胞(MNC)的无标记选择。表7概括了试验结果。
表7
Figure BDA0002577042700000233
通过关于图3A-9描述的方法分离的靶T细胞是幼稚T细胞。在分离后，将靶T细胞暴露于活化试剂，例如白介素2(IL-2)，莫罗单抗-CD3，从Miltenyi Biotec商购可得的TRANSACT T Cell Reagent。幼稚T细胞的活化增加T细胞的分裂和增殖速率，并且还触发T细胞的分化(例如，细胞因子(辅助细胞)的分泌、杀伤功能(细胞毒性细胞)的活化、效应子功能的获得)。
声学活化系统
例如，T细胞的活化可以通过T细胞受体和经由肽在T细胞上的共刺激分子和抗原呈递细胞上的共刺激分子的同时接合而发生。两者均为有效免疫应答的产生所需的。第一信号通过T细胞受体与其在抗原呈递细胞(例如树突状细胞、B细胞和巨噬细胞)上呈递的同源肽的结合而提供。第二信号来自共刺激例如CD28，其中抗原呈递细胞上的表面配体通过刺激(例如病原体的产物或细胞的分解产物，例如坏死体或热休克蛋白)诱导。第二信号允许T细胞完全响应抗原呈递。如果没有第二信号，则T细胞变得无反应性，并且将来变得更难以活化T细胞。
图10示出了具有生物反应器340和声学模块140的系统330。系统330可以用于T细胞的转导、转染、活化、扩增/培养、浓缩或洗涤。声学模块140与生物反应器340流体连接。泵342将流体从生物反应器340的出口344泵送到声学模块140的入口144。一些系统将泵定位在系统的其它部分中。生物反应器340的入口344接收从声学模块140的出口146流出的流体。生物反应器340具有端口，它通过所述端口接收例如来自储库348的培养基、试剂(珠、抗体)、来自气体来源350的气体(例如氧、氮、二氧化碳)，以维持pH和溶解氧。生物反应器340包括温度控制模块346和搅拌器348。与需要加热以维持～36–37℃的所需温度用于细胞生存力和生长的生物反应器相比，生物反应器340包括可以加热或冷却生物反应器中的流体的温度控制模块346。由换能器152施加于流体的声能趋于加热系统中的流体，其减少了加热所需的能量并增加了对于温度监测和控制的需要。
在操作中，泵343将培养基从生物反应器340泵送到声学模块140内。操作换能器152，以提供声波，所述声波将活化珠或试剂和细胞共定位在压力节点中。
图11A和11B示意性地示出了假设与细胞的高分子量反应受到扩散限制，这种共定位预料提供的效率增加。基于这一假设，活化的关键因素包括扩散速率和结合速率。扩散速率是流体的流体扩散系数的因子；颗粒、细胞和试剂的分子量和直径；流体温度；以及雷诺数。结合速率是试剂和细胞固有的。
图11A示出了在不存在声场的情况下细胞和试剂的间隔，而图11B示出了在声场的存在下细胞和试剂的间隔。高分子量试剂花费比低分子量试剂更长的时间到达细胞表面。因此，高分子量试剂的使用需要更长的温育时间和/或更高的浓度，用于试剂到达细胞表面。然而，声场的声压节点将捕获细胞并吸引更高分子量的试剂。来自细胞聚簇的次级力将增强高分子量试剂的捕获，并且还在限制试剂洗出的节点处增加流体粘度。
对于1英寸的流动腔室，每小时1升(L/h)的流速在换能器152和反射器154之间产生2-4厘米/分钟(cm/分)的线速度。这些条件提供了较低且可控制的剪切，并且刺激先于并支持活化的细胞聚集。试剂以例如3-4个活化珠/细胞、10uL TRANSACT/百万细胞或0.5μg抗CD3/百万细胞的水平供应。对于大多数细胞群体，流体的pH维持在6至8之间。用声学模块140操作生物反应器340共48至72小时预料活化T细胞，同时将输入细胞群体从0.1-1B总细胞进入扩增，以达到0.25–10B总细胞离开。关于图2描述的方法包括在活化之前的T细胞选择。然而，预料即使起始群体是PBMC，而不是纯化的T细胞，在活化后T细胞仍应该是占优势的。
用从ThermoFischer Scientific商购可得的Human T-Activator CD3/CD28DYNABEADS测试了系统300的原型。使用声学来控制活化珠使得能够使用可降解的非磁性珠或其它活化颗粒，例如正声学对比度、由含有IL-2和/或其它活化剂的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)制成的可降解珠。这些生物学相容的珠避免了与下述可能性相关的危险：含金属的磁珠可以与通过这些方法制造的治疗剂一起引入患者内。一些系统具有容积为0.1至1升的生物反应器。在活化后，系统330还可以用于在活化细胞的转导或转染和增强细胞的扩增之前和/或之间洗涤活化的细胞。
声学细胞工程
如关于图2所述的，系统330可以用于对活化的细胞进行转导或转染。在活化后，可以如关于图6B所述的洗涤细胞。转导和转染一般使用与活化相同的操作参数进行。
在转导中，将1至10个病毒载体/细胞加入系统，并且循环维持24至48小时。在使用原型系统330的转导证实中，在BSA非特异性封闭后，还以4-20μg/cm2的浓度加入RETRONECTIN。与活化试剂一样，预料声场优先地将病毒载体和细胞共定位在压力节点中。预料用含有病毒载量的正对比度的可降解珠替换游离病毒载体，允许使用的病毒载体的量中的十倍减少，因为它们在释放前在节点中浓缩。
在转染中，每10万个细胞添加0.1μg DNA/RNA，并且循环维持24至48小时。与活化试剂一样，预料声场优先地将DNA/RNA和细胞共定位在压力节点中。预料用含有DNA/RNA负载的正对比度的可降解珠替换游离DNA/RNA，允许使用的DNA/RNA的量中的十倍产生。
较高频率的驻波场导致较陡的压力梯度，其依次又更适合于捕获较小的颗粒如病毒和DNA/RNA。可替代材料(例如，铌酸锂)、制造方法(基于MEM的厚膜)和专门的表面处理(泛音抛光)，用于产生可操作以产生频率为0.01至100MHz的驻波场的换能器。与目前的换能器相比，这些换能器更易于按比例放大，所述目前的换能器在较高的频率下是受限制的，并且由于所需的极薄厚度(例如20MHz传感器需要100μm PZT元件)而难以按比例放大至更高频率。
原型声学模块140用于证实由声场提供的转导效率中的增加。声学模块140对用于修饰Jurkat T细胞的杆状病毒的转导效率的作用。杆状病毒是直径为30-60nm且长度为250-300nm的杆状、有包膜病毒。
图11A-11E和表8呈现了测试结果。
表8
对照 方法对照1 方法对照2 以3MHz的声学 以10MHz的声学
- MOI:50 MOI:50 MOI:10 MOI:10
- GFP+:28.4％ GFP+:48.8％ GFP+:21.8％ GFP+:48.4％
声学细胞扩增
图10中所示的系统330也可以用于扩增洗涤的增强的细胞。扩增过程可以包括灌注培养基更换。一些系统通过使用声学装置培养细胞群体来实现扩增过程，所述声学装置在其中更换培养基的培养物中维持或再循环T细胞。
增强的细胞可以保持在相同系统330中或转移到另一个系统330(例如，更大的系统)。已生产了容量为1L和5L的原型系统。系统已设计为具有0.5L至10L的容量。用声学模块140将生物反应器340操作8至12天，伴随0至2体积的新鲜培养基/反应器的工作体积/天(vvd)的灌注速率，预料将T细胞群体从通过在活化期间产生的0.25–10B总细胞扩增到10B–100B总细胞离开。
倾角波/倾角流声学细胞选择
其它声学和非声学模块可以用于关于图2描述的一些步骤。例如，倾角波或倾角流声学模块可以用于代替或补充声学模块140，用于RBC耗尽和其它分级过程。关于图14讨论了使用倾角波装置的RBC、粒细胞、血小板和MNC的分级。
图13示出了声换能器，其在具有平均方向流的流体流内生成体声波，所述平均方向流相对于声波倾角。倾角声波可以引起流体内的颗粒以不同角度偏转，所述角度取决于颗粒的各种特征。因此，相对于通过装置的流动方向成角度的体声驻波可以用于使颗粒或细胞与流动通过该装置的流体偏转、收集、区分或分级。图13示出了由于声波被声反射器反射而生成的成角度的声驻波。应当理解，可以使用任何类型的声波，包括行波，其可以无需声反射器而实现，或者可以用声吸收器来实现。所示出的声驻波可以用于通过例如大小、密度、声速和/或形状，来分离或分级流体中的颗粒。成角度的声驻波可以是三维声驻波。声驻波也可以是平面波，其中声换能器的压电材料以活塞方式被激发，或者声驻波可以是平面声驻波和多维声驻波的组合。还可以通过声场的强度、声场的角度、流体的特性、驻波的维数或模式、驻波的频率、声腔室形状和混合物流动速度，来控制或放大颗粒通过驻波的偏转。
当声驻波在液体中传播时，快速振荡可能对悬浮在液体中的颗粒或液体之间的界面生成非振荡力。这种力被称为声辐射力。该力源于传播波的非线性。作为非线性的结果，波在传播时失真，并且时间平均值为非零。通过级数展开(根据扰动理论)，第一个非零项将是二阶项，其说明了声辐射力。对流体悬浮液中的颗粒或细胞的声辐射力是在颗粒或细胞的任一侧上的辐射压力差的函数。辐射力的物理描述是入射波和散射波的叠加，加上与周围培养基相比，以不同速度振荡的非刚性颗粒的效应，从而辐射出波。
如图13中所示，将单采血液成分术产物分级成淋巴细胞、单核细胞和RBC、粒细胞和其它颗粒。这种方法可以用于分离单采血液成分术产物中的T细胞。
细胞治疗系统–实施例1
图14–实施例-一个单元用于多重操作
14A–处于用于基于密度的分离的边缘效应的ACW–抽取出RBC 160、粒细胞162、ficoll 164，留下PBMC 166和血浆168
14B–将ACW连接到洗涤组件
无选择–加工所有PBMC
14C–连接到生物反应器并且活化、洗涤、转染、扩增
-
图15-实施例-串联的多重单元
15A–抽取出并丢弃非PBMC，抽取出并收集PBMC
15B–转移至浓缩和洗涤单元
15C–转移至扩增床用于T细胞的亲和选择
15D–转移至生物反应器单元用于活化和增强
15E–转移至更大的生物反应器单元用于扩增
-
上文讨论的方法、系统和装置是示例。适当时，各种配置可以省略、取代或添加各种程序或组件。例如，在替代配置中，可以以与所述不同的次序来进行方法，并且可以添加、省略或组合各种步骤。另外，关于某些配置描述的特点可以在各种其它配置中组合。可以以类似方式组合配置的不同方面和元件。另外，技术在发展，并且因此，许多元件是示例，并不限制本公开内容或权利要求的范围。
在说明书中给出了具体细节，以提供示例配置(包括实施方式)的透彻理解。然而，配置可以无需这些具体细节进行实践。例如，已显示众所周知知的方法、结构和技术，而没有不必要的细节以避免混淆配置。该说明书仅提供了示例配置，并不限制权利要求的范围、适用性或配置。相反，配置的先前描述提供了用于实现所述技术的描述。可以对元件的功能和布置作出各种改变，而不脱离本公开内容的精神或范围。
另外，可以将配置描述为被描绘为流程图或方框图的方法。尽管各自可以将操作描述为序贯过程，但许多操作可以平行或同时进行。另外，可以重新排列操作的次序。方法可以具有附图中未包括的另外阶段或功能。
已描述了几种示例配置，可以使用各种修改、替代构造和等价物，而不脱离本公开内容的精神。例如，上文元件可以是较大系统的组件，其中其它结构或过程可以优先于或以其它方式修改本发明的应用。另外，可以在考虑上文元件之前、之中或之后采取许多操作。相应地，上文描述并不限制权利要求的范围。
值超过(或多于)第一阈值的陈述等价于该值达到或超过稍微大于第一阈值的第二阈值的陈述，例如，第二阈值为在相关系统的分辨率中高于第一阈值的一个值。值小于(或在其内)第一阈值的陈述等价于该值小于或等于稍微低于第一阈值的第二阈值的陈述，例如，第二阈值为在相关系统的分辨率中低于第一阈值的一个值。

Claims (18)

1.一种用于通过实施一系列过程生产治疗剂的方法，所述方法包括：
获得适于引起(invoking)治疗应答的细胞材料；
其中所述过程包括浓缩所述细胞材料的过程、洗涤所述细胞材料的过程、或亲和选择所述细胞材料的一部分的过程中的一种或多种；和
所述过程中的至少一种采用声学装置以保留所述细胞材料或所述细胞材料与之结合的结构。
2.权利要求1的方法，其进一步包括：
用声学倾角波装置分级所述细胞材料或修饰的细胞材料。
3.权利要求2的方法，其中所述细胞材料包括在单采血液成分术产物中。
4.权利要求1的方法，其进一步包含将所述过程中的一种或多种集成到单个装置内。
5.权利要求1的方法，其中所述细胞材料容纳在袋中。
6.权利要求1的方法，其中所述一系列过程形成封闭系统。
7.权利要求1的方法，其中用于亲和选择的过程包括对于TCR+细胞的阴性选择。
8.权利要求1的方法，其中所述一系列过程形成衔接的CAR T生产过程。
9.一种用于通过实施一系列过程生产治疗剂的系统，所述系统包括：
声学装置，其包括超声换能器，所述超声换能器被配置为生成声波以保留细胞材料或细胞材料与之结合的结构；
所述声学装置中的腔室，用于接收细胞材料或细胞材料与之结合的结构，所述超声换能器连接至所述腔室；
所述声学装置被配置为实施浓缩过程、洗涤过程或亲和选择过程中的一种或多种。
10.权利要求9的系统，其进一步包括用于分级所述细胞材料的倾角波声学装置。
11.权利要求10的系统，其中所述细胞材料包括在单采血液成分术产物中。
12.权利要求9的系统，其中所述声学装置被配置为集成所述浓缩过程、洗涤过程或亲和选择过程中的一种或多种。
13.权利要求9的系统，其中所述细胞材料容纳在袋中。
14.权利要求9的系统，其进一步包括封闭系统。
15.权利要求9的系统，其中所述亲和选择过程包括对于TCR+细胞的阴性选择。
16.权利要求9的系统，其进一步包括衔接的CAR T生产过程。
17.一种细胞疗法生产系统，其包括：
形成闭合系统的多个互连装置，所述装置中的至少一个是被配置为保留细胞或保留用于支撑细胞的结构的声学装置。
18.权利要求17的系统，其中所述装置形成衔接的细胞疗法生产系统。
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