CN104204191B

CN104204191B - 3d体外双相软骨‑骨构建物

Info

Publication number: CN104204191B
Application number: CN201380011832.7A
Authority: CN
Inventors: M·罗索夫斯基; S·法特稀-瓦尔卡尼; R·劳斯特尔; U·马克思
Original assignee: Technische Universitaet Berlin
Current assignee: Technische Universitaet Berlin
Priority date: 2012-02-29
Filing date: 2013-02-28
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2033-02-28
Also published as: EP2834348B1; EP2834348A1; JP2015511482A; EP2634251A1; DK2834348T3; US20150093428A1; RU2014136268A; ES2739201T3; RU2615439C2; CN104204191A; HUE044561T2; SG11201403907VA; TR201911258T4; HK1201072A1; WO2013127921A1; US9856458B2; SG10201607179SA

Abstract

本发明涉及3D体外双相软骨‑骨类器官以及其应用和生产方法，所述3D体外双相软骨‑骨类器官包括：a)人造软骨组织层；和b)人造骨组织层，其中人造骨组织包括结构提供支架和骨髓结构；其中人造软骨组织层接触人造骨组织层的至少一个表面。

Description

3D体外双相软骨-骨构建物

发明背景

多种疾病与关节软骨的退行性变化或骨髓中的误导(misguided)分化过程有关。肌肉-骨骼系统的疾病代表德国疾病治疗中继心血管系统疾病和消化系统疾病之后的第三大高成本集中因素。成功治疗这种疾病的一个先决条件是了解骨髓中造成这些疾病或与其有关的细胞过程。因此，通过置换患者的造血系统来治疗例如白血病是可能的。但是，还有自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎或红斑狼疮，也被长寿命的血浆和居于骨髓特化生态位的记忆T细胞调节。

骨髓是多功能的多细胞组织，其与其他物质位于长骨腔中。在软骨内骨化的背景下——长骨发育，在第4个月左右胚胎发育期间，组织发育。骨髓的特征在于多孔结构，其由松质骨和充满大量薄壁血管的特化结缔组织——骨髓窦状隙——形成。骨髓的主要功能之一是为造血系统中造血细胞分化提供适当的环境。造血干细胞(HSC)代表这些分化过程的起点，其中造血干细胞以未分化的状态居于骨髓松质骨结构的造血干细胞生态位中。造血干细胞生态位被分成两种功能不同的亚型。在成骨细胞-生态位中，造血HSCs通过不同的附着和信号传导分子与特化成骨细胞相互作用，从而使HSCs保持处于圆形非增殖状态。在发动HSCs后，干细胞迁移至位于窦状隙的血管干细胞生态位，在此HSCs呈现增殖增加。根据当今对骨髓中的造血干细胞生态位的理解，干细胞生态位系统的最小单位由成骨细胞生态位和位于松质骨窦状隙血管的血管生态位的组合形成。除干细胞生态位的功能结构外，当前的研究公开了骨髓作为免疫学记忆的来源。间充质基质细胞(MSC)充当血浆和记忆T细胞的存活生态位的细胞构建件。总之，骨髓的生物学功能性取决于多种细胞，如HSC、MSC、内皮细胞和成骨细胞，及其在空间隔室中的适当相互作用。

关节的透明软骨，由于其对于压力高弹性的性质和非常均匀的表面，允许关节弱摩擦运动。该组织的主要部分由多种胞外基质蛋白形成，而细胞组分——软骨细胞——单独或以小组(硫酸软骨素)稀少地嵌入该基质中。神经纤维和血管的缺乏和导致的组织的氧和营养物低供给，为软骨细胞生成独特的微环境。软骨组织可分成多个层，其中，由于基质分子的水平定向，最上层可抵抗摩擦，并且由于垂直定向，下方中层和下层可吸收源自运动的冲击力。虽然软骨细胞在间充质凝聚初始过程的软骨内骨化过程早期出现并且这些细胞显著贡献于骺过程的骨生长，但关节中的透明软骨组织仅在胚胎发生过程的很晚的时间点发育。软骨的完全分化的全功能层仅在出生后通过开始组织的机械刺激才形成。在成年生物体内，软骨组织的稳态高度依赖于嵌入软骨细胞的机械负载和微环境的种类和强度。

已做出大量努力以开发和提供骨和软骨组织的体外模型和测试系统。但是，这些方法涉及单独提供骨或软骨组织。因此，这些模型仅部分地和不充分地代表发生骨、骨髓和软骨组织的发育和稳态的天然环境。

本发明的一个目的是克服现有技术的一个或多个问题。

发明内容

第一方面，本发明涉及三维(3D)体外模型，其考虑软骨和骨组织的紧密相互作用和协作。本发明提供3D体外双相软骨-骨类器官(organoid)，包括：

a)人造软骨组织层；和

b)人造骨组织层，其中人造骨组织包括结构提供支架和骨髓结构；

其中人造软骨组织层接触人造骨组织层的至少一个表面。

人造软骨组织3D体外双相软骨-骨类器官可利用间充质祖细胞制备，优选利用这样的间充质祖细胞：其包括至少50％的下列细胞或由下列细胞组成：CD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+和CD13+，更优选来自分离的原代软骨细胞。具体地，人造软骨组织可通过下文所述的本发明方法制备。

本发明的3D体外双相软骨-骨类器官的人造骨组织的骨髓结构通过在结构提供支架上接种间充质干细胞来制备。人造骨组织的骨髓结构优选通过如下制备：在结构提供支架上接种间充质干细胞，和在结构提供支架上培养间充质干细胞2至10天，优选5至8天，更优选7天后，添加造血干细胞。

本发明的3D体外双相软骨-骨类器官的人造骨组织的结构提供支架优选包括下列或由下列组成：生物学或非生物学材料，更优选3D陶瓷支架。

根据另一方面，本发明涉及生产本发明的3D体外双相软骨-骨类器官的方法。所述方法包括下列步骤或由下列步骤组成：

-在结构提供支架上接种间充质干细胞；

-在所述结构提供支架上培养所述间充质干细胞2至10天，优选5至8天，更优选7天；

-向结构提供支架上培养的间充质干细胞添加造血干细胞，和培养所得混合物至少5天，优选5天至8周，更优选1周至4周，从而制备人造骨组织层，其包括接种有骨髓结构的结构提供支架；

-提供通过权利要求13至15中任一项所述方法制备的人造软骨组织；和

-将所述人造软骨组织层布置于所述人造骨组织层的至少一个表面上。

根据另一方面，本发明涉及移植物，其包括本发明的3D体外双相软骨-骨类器官。

进一步，本发明提供药物组合物，其包括本发明的3D体外双相软骨-骨类器官或本发明的移植物和至少一种药学上可接受的赋形剂。

本发明还涉及体外筛选调节软骨或骨组织的性质的物质的方法，包括下列步骤：

-提供本发明的3D体外双相软骨-骨类器官的样品；

-将各个样品分成多个部分；

-用待筛选物质温育至少一个部分；和

-比较已处理部分与未用待筛选物质温育的另一部分的测量参数。

根据本发明的进一步方面，提供自我包含式3D体外双相软骨-骨类器官在芯片上的装置，其包括至少一个介质供给储器、至少一个器官生长部件，该器官生长部件包括至少一个器官腔，容纳本发明的3D体外双相软骨-骨类器官，其中介质供给储器通过微流体供给通道连接于该至少一个器官生长部件。

本发明还涉及制备软骨形成细胞聚集体的方法，包括步骤：

a)提供间充质祖细胞；和

b)在非附着条件下培养间充质祖细胞，以形成软骨形成细胞聚集体。

本方法使用的间充质祖细胞优选包括至少50％的下列细胞或由下列细胞组成：CD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+和CD13+。更优选地，所述间充质祖细胞包括下列或由下列组成：分离的原代软骨细胞。

本发明基于如下发现：骨组织或软骨组织的发育和稳态受这两种组织的存在和相互作用影响。早已知道，骨组织的形成和分化受施加于发育中的骨的物理力的存在、延伸和方向影响。在天然环境中，这些力通常通过其与软骨组织的接触表面施加于骨组织。软骨组织的一个功能是使来自身体运动的冲击力适当地转移至下方骨组织。这种相互作用不仅对骨组织的定向和强度有影响，而且还影响骨中骨髓和干细胞生态位的限定和组构(organization)。毫无疑问，骨髓和干细胞生态位的组构和分化对个体免疫系统具有显著影响。因此，两种组织——骨组织和软骨组织——应被认为形成一个共同的器官。本发明的3D体外双相软骨-骨类器官表现了这种情况，并且允许模拟这两种组织的存在对骨组织——分别对骨髓和干细胞生态位的组构和分化——和软骨组织的发育和分化的影响。因此，本发明的3D体外双相软骨-骨类器官第一次能够研究这两种组织类型的紧密相互作用的相互影响。具体地，如果将3D体外双相软骨-骨类器官用于测试系统——其中人造软骨组织层可通过机械刺激暴露于限定物理力，则提供这样的模型系统：接近地模拟天然情况，因此能够实现对这些组织生物学的新见解，以及能够实现对与这些组织或过程相互作用的物质的适当筛选系统。

在下文中，更详细地提供本发明的不同方面。如此限定的各方面可与任意其他一个或多个方面组合，除非明确相反陈述。具体地，作为优选或优势显示的任意特征可与作为本发明的部分显示或作为优选或优势显示的任意其他一个或多个特征组合。

本发明涉及3D体外双相软骨-骨类器官。基于本发明的目的，术语“类器官”表示体外不同细胞类型的人造的、从头生成的、功能细胞聚集体，其显示出各器官或组织的至少一个一般功能，优选显示各器官或组织的大部分一般功能。

本发明的3D体外双相软骨-骨类器官包括人造软骨组织层。人造软骨组织是从头和体外制备和组装的软骨组织。通常，人造软骨组织包括完全或至少部分分化的软骨细胞和胞外基质组分——包括胶原蛋白II、IX和XI。

技术人员可利用多种技术制备体外人造软骨组织。由于软骨组织通常不止包括软骨细胞的简单2D层，优选3D培养技术生成的人造软骨组织。适当的技术被总结于Tortelli和Cancedda中(“Three-dimensional cultures of osteogenic and chondrogeniccells:A tissue engineering approach to mimic bone and cartilage in vitro”,European Cells and Materials(2009),17,1-14)。人造软骨组织层可例如得自如下技术：包括通过水凝胶封装、微团(micromass)培养、形成高密度细胞团块和应用生物相容性可降解的或非可降解的支架来培养和/或组构细胞或细胞聚集体。根据本发明的制备人造软骨组织的另一优选方法在下文中被进一步描述为制备软骨形成细胞聚集体的方法。

为提供人造软骨组织层，利用间充质干细胞(MCS)——也被称为间充质祖细胞——制备人造软骨组织。优选地，利用分离的间充质祖细胞。术语“分离的”意为间充质祖细胞是已被从天然来源分离，或代表其子代——例如已通过细胞增殖而衍生——的细胞。所用间充质祖细胞优选衍生自供体——个体或患者——的软骨组织。优选地，间充质祖细胞是还未被转化或永生化的原代细胞。具体地，间充质祖细胞可包括成年间充质祖细胞或由成年间充质祖细胞组成。这种成年间充质祖细胞衍生自供体——个体或患者——的非胚胎软骨组织。间充质祖细胞可衍生自已分化以包括软骨组织的任意供体组织的软骨组织。优选地，间充质祖细胞衍生自关节的软骨组织，更优选供体的膝或肘的软骨。间充质祖细胞优选是人细胞。人间充质祖细胞衍生自人源的软骨组织。间充质祖细胞可包括至少50％的如下细胞：CD105⁺、CD106⁺、CD44⁺、CD73⁺、CD90⁺和CD13⁺，或可由如下细胞组成：CD105⁺、CD106⁺、CD44⁺、CD73⁺、CD90⁺和CD13⁺。优选地，间充质祖细胞包括下列或由下列组成：分离的原代软骨细胞，如例如人原代软骨细胞。

本发明的3D体外双相软骨-骨类器官包括人造骨组织层，其中人造骨组织包括结构提供支架和骨髓结构。人造骨组织是已从头和体外制备和组装的骨组织。通常，人造骨组织包括完全或部分分化的成骨细胞、破骨细胞和造血干细胞。

技术人员可利用多种技术制备体外人造骨组织。由于骨组织通常不止包括某细胞类型的简单2D层，优选3D培养技术生成的人造骨组织。适当的技术被总结于Tortelli和Cancedda中(“Three-dimensional cultures of osteogenic and chondrogenic cells:Atissue engineering approach to mimic bone and cartilage in vitro”,EuropeanCells and Materials(2009),17,1-14)。人造骨组织层可例如得自如下技术：包括通过微团培养和应用生物相容性可降解的或非可降解的支架来培养和/或组构细胞或细胞聚集体。适当的培养技术和支架在本领域已知。例如可应用包括生物学或非生物学材料或由生物学或非生物学材料组成的生物可降解的或非可降解的支架。合成型聚合物用作支架以及胶原蛋白型支架、金属型支架如例如钛型支架、或陶瓷型支架的应用已被描述。

用于制备人造骨组织的细胞可包括间充质干细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)。优选地，应用分离的MSCs和/或分离的HSCs。术语“分离的”意为MSCs和/或HSCs是已被从天然来源分离或代表其子代——例如已通过细胞增殖衍生——的细胞。所用的MSCs和/或HSCs优选衍生自供体——个体或患者——的适当组织。优选地，MSCs和/或HSCs是还未转化或未永生化的原代细胞。具体地，MSCs和/或HSCs可包括下列或由下列组成：成年MSCs和/或HSCs。这种成年MSCs和/或HSCs衍生自供体——个体或患者——的非胚胎组织，优选骨或骨髓组织。MSCs和/或HSCs优选是人细胞。人MSCs和/或HSCs优选衍生自人源骨或骨髓组织。

根据本发明的制备人造骨组织的优选方法包括在陶瓷3D支架上接种和培养MSCs。将被栖居的陶瓷3D支架培养预定时间段，随后可添加HSCs。在优选的实施方式中，在陶瓷支架上培养MSCs 2至10天后添加HSCs。然后将被栖居的陶瓷3D支架在静态培养条件下或在连续营养物供应灌注系统中进一步培养。

生成人造骨组织的技术可被进一步改动。例如，可添加生长因子或其他信号传导分子以支持骨髓功能。可应用低氧条件，其类似于骨髓必须面对的天然条件。培养时间以及给予支架不同细胞类型的顺序可能必须被优化。除MSCs和HSCs外，进一步的细胞类型也可用于生成人造骨组织。这些另外的细胞可包括通常存在于骨或骨髓结构中的细胞类型，例如免疫细胞、内皮细胞及类似细胞类型。

本发明的3D体外双相软骨-骨类器官可用作体外和/或体内的研究工具。其可用于研究生物学或其组分的一种或多种。可选地，其可用于体外和/或体内筛选调节软骨或骨组织性质的物质的方法。

本发明还涉及包括本发明的3D体外双相软骨-骨类器官的移植物和包括本发明的3D体外双相软骨-骨类器官或本发明的移植物和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

在进一步方面，本发明涉及体外筛选调节软骨或骨组织性质的物质的方法，包括步骤：

-提供本发明的3D体外双相软骨-骨类器官的样品；

-将各样品分成多个部分；

-用待筛选物质温育至少一个部分；和

在优选的实施方式中，在用待筛选物质温育该部分前，使该部分经过自我包含式器官在芯片上的装置。

简言之，本发明方法，通过本发明的3D体外双相软骨-骨类器官，使对软骨或骨组织产生影响的物质的鉴定和分析成为可能。样品——根据本发明应被理解为包括一定数量的产物对象——被分成多个部分。提供至少两个子组；一组用于筛选，而另一组充当阴性对照。优选地，筛选部分的数量超过对照部分的数量。通常，多个部分进行高通量筛选。在本发明方法中待筛选的物质不以任何方式受限。在本发明的实施方式中，物质选自核酸——包括RNAi、核糖酶、适配子(aptamers)、抗体、肽、糖、聚合物、分子量在50和1.000Da之间的小分子、和蛋白质——优选抗体、细胞因子和脂钙蛋白。这些物质通常可在库中获得。优选在样品的不同部分中温育单种化合物。但是，也可以通过在一个部分中温育至少两种物质来研究物质的协同效应。将另一个子组的对象在不存在物质的情况下同时温育。温育过程取决于多种参数，例如细胞类型和检测灵敏度，其优化按照本领域技术人员已知的常规程序。根据本发明的有效物质鉴定优选间接进行，例如通过确定改变的表达图谱和/或细胞生活力。可在特定时间进行确定，并与实验开始时的信号强度和阴性对照关联。适当的测试本领域技术人员已知或可容易按常规设计。

本发明还公开了自我包含式3D体外双相软骨-骨类器官在芯片上的装置，其包括如WO 2009/146911描述的自我包含式器官在芯片上的装置和本发明的3D体外双相软骨-骨类器官。

形成本发明的自我包含式3D体外双相软骨-骨类器官在芯片上的装置，以允许建立或保持小型化芯片形式的本发明的3D体外双相软骨-骨类器官，小型化芯片形式适于通过活细胞成像和例如双光子显微术在线观察及其如下的应用：例如测试化合物的活性、药效学和药代动力学，或研究器官或类器官和干细胞生态位的自组装、稳态、破坏、再生或相互作用，以及成熟、衰老、死亡和生物钟学现象。因此，本发明的自我包含式3D体外双相软骨-骨类器官在芯片上的装置包括至少一个介质供给储器、至少一个器官生长部件——包括至少一个器官腔，容纳本发明的3D体外双相软骨-骨类器官，其中介质供给储器通过微流体供给通道连接于至少一个器官生长部件。

本发明的主题允许建立包括软骨和骨组织的类器官的小型化体外培养物。所得的本发明的3D体外双相软骨-骨类器官例如在允许连续供应氧和营养物的条件如例如连续灌注条件下培养时适于上至3个月的长时间培养。

本发明的主题允许机械刺激的整合——以模拟例如源自身体运动的物理力，和类器官中血管结构的引入——因此，提供接近于天然情况的环境。基于这些性质，本发明的主题允许产生在组织工程、细胞和组织分化分子生物学以及再生药物领域的多种科学发现。本发明的主题还可导致成本和劳动密集型动物实验被体外测试替代。

当前，还未有尝试提供与长期培养技术如灌注培养相容并且允许引入血管系统的、在一个单独的整合系统中组合功能上相互关联的组织骨、骨髓和软骨的3D体外类器官。通过使系统暴露于机械力或其他刺激，将会在此前从未达到的程度上模拟天然环境。

另一方面，本发明涉及体外制备软骨形成细胞聚集体的方法。该方法包括步骤：

a)提供分离的间充质祖细胞；和

已经惊人地发现，分离的间充质祖细胞能够形成三维细胞聚集体，其呈现软骨形成分化，而不影响胚胎细胞。这种效果通过在非附着条件下培养间充质祖细胞而实现。可显示，在这种非附着培养条件下，间充质祖细胞相互自由排列并凝聚成细胞聚集体，其呈现对软骨形成分化的特异性标记的表达，并且因此指示软骨形成细胞聚集体。

在下文中，更详细地提供本发明的不同方面。如此限定的各方面可与任意其他方面或方面组合，除非明确相反陈述。具体地，作为优选或优势显示的任意特征可与作为本发明的部分显示或作为优选或优势显示的任意其他特征或特征组合。

本发明的方法涉及体外软骨形成细胞聚集体的制备。基于本发明的目的，术语“软骨形成细胞聚集体”指代呈现对软骨细胞或软骨组织特异的至少一个功能的功能细胞聚集体。优选地，本发明的软骨形成细胞聚集体呈现分化软骨细胞或软骨组织的大部分或基本上全部的器官或组织功能。具体地，本发明的软骨形成细胞聚集体可表现如同功能软骨组织和/或能够在体外和/或体内诱导软骨发育或分化。本发明的软骨形成细胞聚集体可特征在于与软骨细胞或软骨组织发育或分化有关的标记基因或蛋白质的表达升高。优选地，本发明的软骨形成细胞聚集体可特征在于，与间充质祖细胞在经历非附着培养条件前即刻的表达相比，胶原蛋白II、IX和XI的上调表达以及胶原蛋白I和XII的下调表达。

本发明的软骨形成细胞聚集体通过本发明的方法形成。软骨形成细胞聚集体可呈现基本上圆形或球形的细胞聚集体。其可具有0,5mm至3mm的平均直径，优选0,5mm至2mm的平均直径。本发明的软骨形成细胞聚集体不具有非源自用于生产软骨形成细胞聚集体的细胞的任何人造生物学或非生物学支架或载体。本发明的软骨形成细胞聚集体优选由本发明方法形成的细胞聚集体组成，其中该方法已在不使用或添加非直接源自用于所述方法的细胞的任意生物学或非生物学支架或载体的情况下进行。

在本发明的方法中，使用分离的间充质祖细胞。术语“分离的”意为间充质祖细胞是已从天然来源分离的细胞或其子代——其例如已通过细胞增殖衍生——分离的细胞。所用的间充质祖细胞优选衍生自供体——个体或患者——的软骨组织。优选地，间充质祖细胞是还未转化或未永生化的原代细胞。具体地，间充质祖细胞可包括成年间充质祖细胞或由成年间充质祖细胞组成。这种成年间充质祖细胞衍生自供体——个体或患者——的非胚胎软骨组织。间充质祖细胞可衍生自已分化以包括软骨组织的任意供体组织的软骨组织。优选地，间充质祖细胞衍生自供体的关节的软骨组织，更优选膝或肘的软骨。用于本发明方法的间充质祖细胞优选是人细胞。人间充质祖细胞衍生自人源软骨组织。间充质祖细胞可包括至少50％的如下细胞：CD105⁺、CD106⁺、CD44⁺、CD73⁺、CD90⁺和CD13⁺，或可由如下细胞组成：CD105⁺、CD106⁺、CD44⁺、CD73⁺、CD90⁺和CD13⁺。优选地，间充质祖细胞包括下列或由下列组成：分离的原代软骨细胞，如例如人原代软骨细胞。

在本发明的方法中，间充质祖细胞可经历在分离后的任意阶段、在非附着条件下的培养。但是，如果间充质祖细胞已在附着2D单层条件下进行至少一些培养，则会进一步增强细胞聚集体的形成。优选地，间充质祖细胞在进行在非附着条件下培养前已在2D单层培养中被培养至少5代。为确保去分化表型，需要在2D单层附着条件中培养间充质祖细胞至少10代。细胞聚集体形成的高效力保持在很多代中。但是，已发现，如果间充质祖细胞已在2D单层培养中被培养至少5代和不多于20代，则实现最佳结果。优选地，间充质祖细胞在分离后在2D单层中培养至少5代和不多于15代后进行非附着培养。

在本发明的方法中，在提供分离的间充质祖细胞后，使间充质祖细胞经历非附着培养条件，以形成软骨形成细胞聚集体。

如果间充质祖细胞在特定浓度下经历非附着培养条件，则细胞聚集体的形成尤其有效。如果浓度过低，则细胞相互仅极少接触，向细胞聚集体的凝聚有效性较小。另一方面，如果间充质祖细胞的浓度过高，细胞灵活性或移动性较小，因此，细胞聚集体的形成有效性较小。优选地，间充质祖细胞在5×10⁴至5×10⁷/ml的浓度下经历非附着培养条件。如果间充质祖细胞在1×10⁵至1×10⁷/ml，优选5×10⁵至5×10⁶/ml，和最优选9×10⁵至1,1×10⁶/ml的浓度下经历非附着培养条件，会实现更好的结果。

在本发明的方法中，在非附着培养条件下培养分离的间充质祖细胞。这意为在如下条件下培养间充质祖细胞：其中细胞不采取显示强依附和附着于培养表面的扁平、散开的形状。优选地，间充质祖细胞在接种后保持圆形，如果这样的话，仅弱关联于培养表面。适当的非附着细胞培养手段在本领域公知。非附着培养条件可包括在具有不支持间充质祖细胞附着的培养表面的培养容器中培养间充质祖细胞。例如，可使用具有呈现超低细胞依附的培养表面的培养容器。因此，可使用具有中性或带正电的培养表面的培养容器。优选地，培养表面可被进一步减少间充质祖细胞和培养表面相互作用的材料层涂布。培养表面可覆有亲水水凝胶。

显示在非附着培养条件下间充质祖细胞相当迅速地缔合并凝聚成细胞聚集体。在非附着细胞培养24小时后，间充质祖细胞聚集成一个大复合体。但是，为制备代表具有进展的发育、分化和/或功能的软骨形成细胞聚集体的细胞聚集体，进行非附着培养超过24小时的一段时间是有益的。在本发明的方法中，可在非附着条件下培养间充质祖细胞至少48小时，优选至少72小时，更优选至少1周，还更优选至少2周，最优选至少4周。因此，可在非附着条件下培养间充质祖细胞48小时至8周，优选60小时至6周，更优选72小时至5周。在普通培养皿中培养后，聚集体附着皿表面，并且细胞开始迁移和增殖，导致聚集体结构瓦解。因此，聚集体优选在整个培养期间保持在非附着条件下。

在本发明的方法中，优选在非附着条件下培养间充质祖细胞，至少直到呈现圆形的细胞聚集体形成，其具有0,5mm至3mm的平均直径，更优选0,5mm至2mm的平均直径。

通过本发明方法生成的软骨形成细胞聚集体的适应性取决于其诱导或提供分化软骨细胞或软骨组织的能力。因此，优选在非附着条件下培养分离的间充质祖细胞，直到所得细胞聚集体开始呈现部分或完全分化的软骨细胞或软骨组织的性质和/或功能。可通过各标记基因、蛋白质或结构的相对表达监测分化进程。优选地，在非附着条件下培养分离的间充质祖细胞，至少直到形成的细胞聚集体，与经历非附着培养条件前即刻的间充质祖细胞表达相比，呈现胶原蛋白II、IX和XI上调表达以及胶原蛋白I和XII下调表达。由于阶段特异标记分子的表达分析揭示保持的N-钙粘蛋白表达和胶原蛋白II型的升高水平而非胶原蛋白X型的表达，因此表明在软骨形成前体和柱形软骨细胞之间的分化表型而非至肥大前阶段的进一步分化。这种表型反映出在关节软骨组织中捕获的软骨细胞表型。基因的相对表达水平通过公知方法可容易确定，如例如定量或半定量RT-PCR或RNA印迹法。蛋白质的相对表达水平也可通过公知方法确定，如例如蛋白质印迹法和ELISA技术。除关于mRNA和蛋白质水平的表达模式分析外，进一步通过免疫组织化学染色以及抗压性测定进行的聚集体结构的详细表征也被包括，以指定聚集体的质量(quality)。

现有技术中大多数方法遭遇的缺点之一是，在这些方法中，需要存在人造生物学或非生物学支架或载体，在其上或其中培养细胞以形成软骨组织。生物学或非生物学支架或载体被认为是人造的或添加的——如果所述支架或载体是从外部提供的和不是直接由在细胞聚集体形成期间用于本发明方法的细胞形成。在本发明的方法中，无需这种人造生物学或非生物学支架或载体的使用或存在。本发明的方法在不使用任何这种非源自所用细胞的人造生物学或非生物学支架或载体的情况下生成根据本发明所述的软骨形成细胞聚集体。在优选的实施方式中，实施本发明的方法，使得在软骨形成细胞聚集体形成过程中不添加生物学或非生物学支架。

在本发明的方法中，利用标准培养基，在附着或非附着条件下培养间充质祖细胞。无需特殊培养基以在非附着条件下诱导适当细胞聚集。技术人员公知适当的培养基。一般，使用标准DMEM并带有一定含量的胎牛血清(FCS)，优选FCS存在的浓度为5％至15％，更优选浓度为10％的FCS。

尽管事实上适当的软骨形成分化在聚集体形成后被诱导而无需额外的处理，但进一步优化可以是有益的。因此，在本发明的方法中，一旦聚集过程完成，关于生长因子给予或低氧条件下培养的进一步优化步骤将进一步改善发育和分化。

本发明还涉及移植物，其包括下列或由下列组成：本发明的人造软骨形成细胞聚集体或由其衍生的组织或结构。

在本发明另一方面，提供药物组合物，其包括本发明的人造软骨形成细胞聚集体、由其衍生的组织或结构或本发明的移植物和至少一种药学上可接受的赋形剂。

本发明的人造软骨形成细胞聚集体、本发明的移植物或本发明的药物组合物可用于治疗软骨损伤和/或破坏或软骨损失。

由于本发明的方法利用衍生自非胚胎来源的分离的间充质祖细胞发挥作用，该方法允许从得自具体供体或患者的细胞开始产生人造软骨形成细胞聚集体。因此，可以提供已经从将要用本发明的人造软骨形成细胞聚集体、药物组合物或移植物治疗的人的细胞衍生的人造软骨形成细胞聚集体。因此，显示可以提供这样的移植物：其主要、基本上或完全衍生自移植物受体本身的细胞，使得排斥反应将减少至最小或完全不存在。

本发明的人造软骨形成细胞聚集体可用于体外或体内生成分化的软骨细胞或软骨组织。

本发明的人造软骨形成细胞聚集体、本发明的移植物或本发明的药物组合物可用作可体外和体内使用的研究工具。

本发明的人造软骨形成细胞聚集体、本发明的移植物或本发明的药物组合物可用于体外或体内筛选调节软骨细胞或软骨组织性质的物质的方法。

本发明另外教导了体外筛选调节软骨细胞或软骨组织性质的物质的方法，包括步骤：

-提供本发明的人造软骨形成细胞聚集体或通过本发明方法制备的细胞聚集体或由其衍生的组织的样品；

-将各样品分成多个部分；

-用待筛选物质温育至少一个部分；和

简言之，本发明方法，通过本发明的人造软骨形成细胞聚集体，使对软骨细胞或软骨组织具有影响的物质的鉴定和分析成为可能。样品——根据本发明应被理解为包括一定数量的产物对象——被分成多个部分。提供至少两个子组；一组用于筛选，而另一组充当阴性对照。优选地，筛选部分的数量超过对照部分的数量。通常，多个部分进行高通量筛选。在本发明方法中待筛选的物质不以任何方式受限。在本发明的实施方式中，物质选自核酸——包括RNAi、核糖酶、适配子、抗体、肽、糖、聚合物、分子量在50和1.000Da之间的小分子和蛋白质——优选抗体、细胞因子和脂钙蛋白。这些物质通常可在库中获得。优选在样品的不同部分中温育单种化合物。但是，也可以通过在一个部分中温育至少两种物质来研究物质的协同效应。将另一个子组的对象在不存在物质的情况下同时温育。温育过程取决于多种参数，例如细胞类型和检测灵敏度，其优化按照本领域技术人员已知的常规程序。根据本发明的有效物质鉴定优选间接进行，例如通过确定改变的表达图谱和/或细胞生活力。可在特定时间进行确定，并与实验开始时的信号强度和阴性对照关联。适当的测试本领域技术人员已知或可容易按常规设计。

由于本发明的人造软骨形成细胞聚集体可被认为是器官、类器官或器官或其部分的前体，其可尤其有益于使用测试系统——其中可在模拟天然灌注的条件下长时间制备和/或培养人造软骨形成细胞聚集体。其显示出尤其适于将本发明的方法和/或本发明的人造软骨形成细胞聚集体结合在分析系统中，该分析系统基于申请号EP 10 008 244的欧洲专利申请或公开号WO2009/146911的PCT申请中描述的自我包含式器官在芯片上的装置系统。

本发明还公开了自我包含式人造软骨形成细胞聚集体类器官在芯片上的装置，其包括WO 2009/146911描述的自我包含式器官在芯片上的装置和本发明的人造软骨形成细胞聚集体。

形成本发明的自我包含式人造软骨形成细胞聚集体类器官在芯片上的装置以允许建立或保持小型化芯片形式的本发明的人造软骨形成细胞聚集体，小型化芯片形式适于通过活细胞成像和例如双光子显微术在线观察及其如下的应用：例如测试化合物的活性、药效学和药代动力学，或研究器官或类器官和干细胞生态位的自组装、稳态、破坏、再生或相互作用，以及成熟、衰老、死亡和生物钟学现象。因此，本发明的自我包含式人造软骨形成细胞聚集体类器官在芯片上的装置包括至少一个培养基供给储器、至少一个器官生长部件——包括至少一个器官腔，容纳本发明的人造软骨形成细胞聚集体，其中培养基供给储器通过微流体供给通道连接于至少一个器官生长部件。

本发明首次提供人造软骨形成细胞聚集体及其生产方法，其特征在于非强制细胞组装，无需任何人造生物学或非生物学支架或载体，和由成年细胞生产，从而无需胚胎细胞或组织。

本发明的人造软骨形成细胞聚集体代表功能诱导性聚集体，其能够诱导或引发体外和体内软骨组织发育。所得软骨组织的特征在于以生理顺序排列、一般形成软骨组织部分的结构的可验证存在。

附图说明

图1显示去分化的软骨细胞呈现间充质干细胞特征。[A]将去分化的软骨细胞染色，用于间充质表面标记组(panel)。细胞为CD105、CD106、CD44、CD73、CD90和CD13阳性，和造血标记CD34和CD45阴性(显示一个代表性实验，n＝6)。脂肪形成性分化。[B-D]用脂肪形成性培养基处理去分化的软骨细胞28天。通过光学显微镜术和油红O染色评价脂肪细胞分化。B)单层细胞的阴性对照，未染色；C)单层细胞的阴性对照，油红O染色；D)通过细胞质中脂质填充液滴的形成证明28天后的脂肪细胞分化；分化脂肪细胞中脂质填充液滴的油红O染色；(显示一个代表性实验，n＝6)；成骨细胞分化。[F-G]用成骨培养基处理去分化的软骨细胞28天。通过von Kossa染色评价成功的分化。E)染色阴性对照；F)通过von Kossa染色证明钙化基质的积累；(显示一个代表性实验，n＝6)；线＝50μm。

图2显示低依附板中的凝聚动力学。特殊处理的培养皿表面用于该3D培养系统，在此细胞无法依附。在低依附板中供应细胞悬浮液(106个细胞/ml)。在3D培养诱导后细胞立即开始相互作用；(显示一个代表性实验，n＝6)。

图3显示凝聚阶段期间软骨形成相关基因的基因表达动力学。与单层表达比较，在3D培养诱导后的前90或72小时内的基因表达的实时PCR分析。管家基因比以对数标度显示，(n＝6)通过Mann-Whitney U_-测试进行统计学分析。

图4显示在低依附培养28天后软骨形成相关基因的基因表达。与单层表达比较，在3D培养诱导后28天的基因表达的实时PCR分析。管家基因比以对数标度显示，(n＝6)通过Mann-Whitney U_-测试进行统计学分析。

图5显示差异表达基因的分类。[A]凝聚阶段(24h)和[B]分化阶段(28天)的两个独立微阵列实验分别的评价。根据Panther基因本体数据库显示所选基因本体组中上调和下调基因的数量。

图6显示PTX处理细胞的细胞凝聚。在凝聚过程中将百日咳毒素(PertussisToxine)以三种不同的浓度给予去分化的软骨细胞。在PTX处理后，未观察到凝聚表现方面的显著变化(显示一个代表性实验，n＝3)。

图7显示凝聚过程中的细胞相互作用和亚聚集体连接。通过3D低依附培养诱导的凝聚；网状连接在培养诱导后12小时可见；(显示一个代表性实验，n＝6)。

图8显示本发明的自我包含式3D体外双相软骨-骨类器官在芯片上的装置的示意图。

图9显示3D陶瓷培养系统中MSCs的表现。(A)生态位ECM组分的免疫组织化学和2-光子显微术，(i)胶原蛋白-I，(ii)纤连蛋白和(iii)整联蛋白4a在培养的(a)第1天和(b)第7天之间高度表达。(标度线：100μm)。(B)SEM成像示例(i，iii)3D培养2周后的MSCs与(ii，iv)骨松质(标度线：10μm)之间的结构相似性。(C)3D培养1周后MSCs的自发成骨分化，通过阳性Von Kossa(i)染色和Alizarin红(iii)染色可见——与未接种的陶瓷(ii，iv)相比。(D)与单层相比在1和4周后共培养系统中的已知生态位分子的实时PCR分析。(n＝3，误差线：平均值的SD，***p<0.001)。

图10显示HSPC存活和表型。(A)HSPCs在接种后在3D共培养系统中存活(i)1周，(ii)2周，(iii)4周和(iv)8周，通过荧光显微术可见。MSC核用DAPI复染成蓝色。(标度线：100μm)。(B)代表性FACS图和(C，D)定量——3D和传统共培养系统中原始的(CD34+CD38-)和分化的(CD34+CD38+)HSPCs。(n＝8，误差线-平均值的SD，**p<0.01，***p<0.001)。

图11显示HSPC增殖。(A)显示不同培养系统中HSPCs的差异增殖的CFSE-FACS分析的代表性柱状图。虚线描述慢(右侧)和快(左侧)增殖细胞部分。(B)四个培养系统中慢增殖细胞的定量。(C，D，E)在培养1、2和4周后各培养系统中慢和快增殖细胞部分的原始(CD34+CD38-)HSPCs的定量。(n＝6，误差线-平均值的SD，*p<0.05，***p<0.001)。

图12显示HSPC生活力和功能性。(A)代表性FACS图和(B，C)定量——3D和传统共培养系统中的坏死(PI阳性)和凋亡(膜联蛋白V阳性)HSPCs。(n＝8，误差线-平均值的SD，*p<0.05**p<0.01，***p<0.001)。(D,E)来自3D共培养系统的HSPCs的多系分化潜能。代表性(i)GEMM，(ii)BFU-E，(iii)GM集落和(E)CFU-GEMM分析后的集落评分(n＝3)。

图13显示3D共培养系统中组分的相互作用。(A)在培养2周后3D共培养系统的免疫组织化学和2-光子显微术。显示当与未染色的对照(i)(标度线：100μm)比较时，绿色追踪的HSCs和红色追踪的MSCs与Alexa 350(蓝色)染色的ECM组分(ii)胶原蛋白I和(iii)纤连蛋白，以及与信号传导分子(iv)C-Kit(v)整联蛋白4a(vi)N钙粘蛋白共同定位。(B)SEM成像示例在3D培养2周后较小圆形HSPCs和较大扁平附着MSCs之间的物理相互作用(标度线：10μm)。

实施例：

实施例A：

I.人造骨组织的形成：

细胞

通过标准程序分离间充质干细胞(MSC)。简言之，将骨髓吸出物用PBS仔细漂洗，并通过Ficoll密度梯度离心分离PBMC(周围血液单核细胞)。通过塑料附着然后上至4代的扩增期分离间充质先祖。利用MACS技术(Miltenyi Biotec)通过CD34表达从脐血样品分离人造血干细胞。在补充培养基(的TPO,FLT3,IL6和SCF)中培养HSC。

平台

通过3D陶瓷支架(Zellwerk)提供人造骨髓的平台。为诱导协调的增殖、分化和根据胞外基质沉积的微环境和信号传导分子表达的再调节，在添加造血干细胞前一周将间充质干细胞接种在该陶瓷上。然后将陶瓷在静态培养中或在连续营养物供应的灌注系统中进一步培养。通过基因表达分析、通过FACS技术的不同细胞群组成和一般生物学功能(HSC保持和增殖、个体干细胞生态位发育、免疫学问题)的确定，评价骨髓的功能。

II.软骨形成细胞聚集体或人造软骨组织的形成：

骨关节炎和类风湿性关节炎是影响软骨结构的退行性疾病。由不同因素(例如，机械过载、年龄、损伤和炎症)引起，组织结构被不可逆地损失，因为软骨内的细胞仅具有非常低的固有自我修复能力。因此，为找到诱导软骨再生过程的替代性策略，近几十年已做出多种尝试。近些年，自体细胞在再生药物中的应用是深入研究的主题。但是，仍要建立间充质祖细胞的理想来源和体外分化的最佳培养条件。间充质基质/干细胞由于其分化成所有间充质组织的能力脱颖而出，虽然可得自骨髓或其他组织来源的细胞数量是受限的。因此，自健康组织分离然后扩增的自体细胞的应用是解决这种困难的一项有希望的策略。

不幸地，细胞在撤销其正常组织微环境后失去其分化表型。因此，通过酶消化和随后的二维单层培养使软骨细胞自其正常三维关节软骨基质分离导致细胞改变，在此过程中细胞重新进入细胞周期，失去其圆形表型，并将其基质分子生产从胶原蛋白II、IX和XI型切换成I、III和V型。另外，已证明，2D-培养的软骨细胞表达间充质干细胞表面标记并且具有多系分化潜能。该过程被称为去分化，并突出了完整3D环境对于保持软骨细胞表型的重要性。因此，近年来，显现发育过程不仅由可溶性因子控制，而且另外还由附着分子提供的空间排列控制，其不仅介导细胞-细胞和细胞-基质相互作用，还有助于通过附着信号传导进行的基因表达调节。因此，在3D结构中培养祖细胞呈现为体外软骨形成性再分化过程中的关键刺激因素之一。因此，多种3D培养系统已因此被建立。常用四种在3D系统中培养间充质细胞或祖细胞的技术：1)水凝胶封装、2)微团培养、3)高密度细胞团块和4)生物相容性支架。

在3D微环境中培养和防止单层形成是所有所述培养系统的原理。尽管事实上所有培养模型均能够诱导软骨形成分化——通过胶原蛋白II型和蛋白多糖的上调证明，但仍存在显著缺陷。细胞由于离心(团块培养)或通过重力(微团)被强制形成细胞3D聚集体。另一方面，在生物相容性支架上水凝胶封装或培养后，细胞相互作用的能力受限，或成不可能。但是，体外模拟软骨细胞分化的完整体内过程，以获得再生应用的最佳先决条件，以及提供模型培养系统，以扩展该多步过程的充分了解，似乎是合理的。

间充质凝聚代表骨骼成分发育的第一步，其中先祖迁移至未来骨骼形成的位点，并开始积累和凝聚，生成高密度细胞聚集体。在体外再分化的过程中，主要目标是整合该第一步——聚集体形成。不幸地，没有常用3D培养系统适于这种目的，因为其全部缺乏在凝聚过程前独立单细胞移动性的先决条件。

发明人已建立了无支架培养系统，其包括分离的去分化软骨细胞的初始细胞凝聚和随后软骨形成再分化。凝聚过程以及再分化细胞的集中特征在于综合基因表达分析。由于软骨形成分化通过胶原蛋白II型表达的剧烈上调和蛋白多糖的大量分泌和积累来证明，这种新的3D培养系统首次提供研究体外间充质凝聚刺激过程的机会。细胞聚集期间趋化因子信号传导的抑制证明，凝聚过程与细胞迁移无关，但由附着分子和增强的细胞-细胞接触介导。

材料和方法

原代软骨细胞的分离和培养

来自志愿者供体的关节膝软骨得自Musculoskeletal Research Center Berlin，Charité(Berlin，德国)以及得自Institute of ExperimantalPathology Charité，Campus Virchow。研究经当地伦理委员会(CharitéCampus Mitte，University Hospital Berlin)批准。将软骨组织切成小块，并通过利用DMEM中的胶原蛋白酶(1mg/ml，Sigma-Aldrich)在37℃下酶消化过夜释放软骨细胞。通过70μm尼龙细胞染色器(BD FalconTM，Belgium)过滤，将细胞从消化的组织分离，用PBS洗涤，并在包含10％FCS的DMEM中培养。将原代软骨细胞在带有加湿气氛(5％CO₂/空气)的水套式培育箱中、在37℃下、在补充10％FCS和青霉素/链霉素(Gibco)的DMEM培养基(Gibco)中培养。将细胞传代至少10次，以生成完全的去分化表型。

去分化软骨细胞的表征

通过FACS的表面表达分析。通过直接免疫荧光染色分析去分化软骨细胞的不同间充质干细胞(MSC)表面标记分子的表达。通过胰蛋白酶消化和离心收集细胞，并将细胞团块重悬浮于PBS/BSA(0.5％)中。用荧光标记的抗体在RT下培育细胞15min。作为同种型对照，将细胞用与MSC抗体相同的同种型的T-细胞标记分子染色。然后将染色分析用PBS/BSA洗涤，并离心去除未结合的抗体。将细胞团块重悬浮于400μl PBS/BSA中，并在FACSCaliburTM(BD Biosciences)上进行分析。对于死亡细胞的检测，在流式细胞术分析前即刻添加碘化丙啶(propidium jodid)。获得并利用CellQuestTM软件分析30,000个事件。

分化潜能。利用已知培养基补充(DMEM，带有10％FCS、10μg/ml胰岛素、0,2mM吲哚美辛(Indomethacin)、1μM地塞米松(Dexamethasone)、0,5mM 3-异丁基-甲基-黄嘌呤(Sigma))，在2D培养中诱导脂肪形成性分化。将去分化的软骨细胞接种在6孔板(Corning-100.000个细胞每孔)中，并在DMEM+10％FCS中培养到细胞汇合。刺激细胞28天，其中每4天更换培养基。脂类油红O染色：在28d后将细胞在4％多聚甲醛中固定10min，用PBS洗涤，随后用新过滤的油红O染色溶液(0,7％在丙烯甘油中)(Sigma)培育1h。在用蒸馏水漂洗细胞两次后，通过光学显微镜术评价染色。

利用适当的分化培养基(DMEM+10％FCS、10mMβ-磷酸甘油(Sigma)、10nM地塞米松(Sigma)、0,1mM L抗坏血酸2-磷酸酯(Sigma)，在单层培养中诱导成骨分化。简言之，将细胞接种在6孔板(Corning-100.000个细胞每孔)中，并在DMEM+10％FCS中培养到细胞达到汇合。每4天更换培养基，并在成骨刺激21天后，通过分泌的Ca2+基矿物化基质的von Kossa染色作为成骨细胞分化的标记，将细胞染色。用4％多聚甲醛(Sigma)固定细胞。将硝酸银溶液(5％，Sigma)给予固定的细胞，并将培养板置于UV光中20min。最终，将细胞用水漂洗，并通过光学显微镜术进行评价。

3D培养系统

对于3D低依附培养，收集去分化的软骨细胞，并将其重悬浮于DMEM+10％FCS中，以在单个细胞悬浮液中生成106个细胞/ml。将细胞悬浮液(1ml每孔)给予24孔低依附板(Ultra Low Cluster Plate，Corning，德国)。与标准组织培养皿的带负电亲水性表面相反，超低依附板具有中性的、亲水水凝胶涂布的表面，其很大程度上最小化依附蛋白质的结合。通过利用这种特殊培养皿，细胞不会如同微团培养通过细胞附着在低聚层构建物中沉降。防止2D单层培养物的形成，并且细胞在此悬浮培养保持条件下保持圆形。此外，与其中细胞通过离心被强制沉降的团块培养系统相反，低依附培养系统提供在初始凝聚过程中自由细胞运动和细胞细胞相互作用的机会。为确保恒定培养条件，每3天定期更换培养基。

为干扰低依附培养中G-蛋白结合受体引起的趋化信号传导，将百日咳毒素(Sigma，德国)以不同的浓度(10、100和1000ng/ml)给予在低依附凝聚实验中的培养基。

组织学

将收集的聚集体的部分在低温恒温器中切成5-μm厚，并安置于Superfrost Plus玻片(Menzel)上。将玻片干燥和固定。

苏木精染色。将切片在苏木精染色溶液(Sigma)中温育3min，随后在自来水中漂洗。将切片脱水和安置。通过光学显微镜术分析染色切片。

阿尔新蓝染色。将玻片在3％酸性酸中预温育3min，然后在室温下用阿尔新蓝(Sigma)(3％，在3％乙酸中)溶液处理30min。将切片用水洗涤，脱水和安置。通过光学显微镜术分析染色切片。

II型胶原蛋白染色。将玻片用蛋白质阻断剂(block)(Dako Cytomation)在RT下处理10min，然后用抗2A型胶原蛋白的一级单克隆抗体(BD Biosciences)在4℃下温育过夜。第二天，将切片用Cy3结合的二级抗体(Dako Cytomation)温育1h，并将核通过DAPI复染。通过荧光显微术分析染色切片。

实时PCR。在所示时间点溶解细胞，利用RNA II试剂盒(Machery和Nagel)提取RNA。通过逆转录400ng总RNA(Taqman，Roche)合成cDNA。利用下列条件进行实时PCR实验：1μl cDNA，各0.5μM引物，6mM MgCl2，200mM dNTP，50mM Tris(pH 8.8)，500ng/mlBSA，Immolase 0.05U/ml(Bioline)，1×Sybrgreen(Molecular Probes)。表达相对水平以与GAPDH表达的比给出。

DNA微阵列分析。根据生产协议利用人基因组CGH微阵列44K(Agilent)。微阵列实验基于双色比杂交和低RNA输入荧光线性扩增试剂盒(Agilent)进行RNA标记。简言之，将500ng总RNA用低聚(dT)-T7启动子引物和Moloney鼠白血病病毒-逆转录酶(MMLV-RT)逆转录，以合成cDNA的第一链和第二链。用同时包括花青3-胞苷5'-三磷酸酯(3-CTP)或花青5-CTP的T7RNA聚合酶合成荧光反义cRNA。通过花青3-CTP的A552nm的吸光度和花青5-CTP的A650nm的吸光度定量纯化产物，并用Nanodrop光度计(Kisker)验证标记效力。在杂交前，将2μg各标记的cRNA产物片段化，并根据供应商协议(Agilent)与对照靶标和杂交缓冲液混合。杂交在60℃下进行过夜。然后洗涤玻片，并利用DNA微阵列激光扫描仪(Agilent)以5-μm分辨率进行微阵列扫描。利用采用默认设置的图像分析工具A6.1.1版(Agilent)提取特征。在Rosetta Informatics Platform Resolver Built 4.0上进行数据分析。通过严格的数据评价和2-倍表达截断结合仅选择低p值(p<0.05)数据点的要求，鉴定表达图谱的变化。通过应用此策略，数据评价独立于Rosetta Resolver系统(Agilent)中实施的误差模型。

结果

为实现完全表型去分化，将分离的软骨细胞以单层培养至少10代。如前所述，细胞采用明确的先祖表型，该先祖表型由如下标记：MSC表面标记(CD105、CD106、CD44、CD73、CD90和CD13)和多分化潜能(脂肪细胞和骨细胞)(图1)(Rosowski等，2006)的表达。根据表面表达，观察到均一的去分化软骨细胞群。

低依附培养后的细胞凝聚

这种培养技术的基本思路是避免细胞依附于培养皿表面和保持细胞移动性。为防止依附单层形成，将培养细胞接种于具有特殊处理的表面的低依附板的孔中。在数小时内，细胞开始相互附着，生成网状结构。在接下来的72小时过程中，带孔结构凝聚，并最终在每孔生成一个高密度细胞聚集体，其平均直径为1-2毫米(图2)。将细胞聚集体再培养4周，而尺寸或形状无任何明显变化。将培养过程细分为早期和晚期阶段，并分别评价。

体外间充质凝聚–早期事件

在第一步中，分析软骨形成分化的基因特征的表达(图3)。转录因子SOX-5的mRNA水平在培养12小时后略微上调。在较晚时间点时，表达回落至单层水平。惊人地发现，转录调节因子SOX-9与单层培养相比下调3倍。这种减少的mRNA水平在凝聚形成的前三天内保持。然而，两种转录因子在单层和低依附培养中均高度表达，其由GAPDH比指示。去分化的软骨细胞显示不同的TGF-β1表达；但是，这种生长因子在细胞凝聚中保持不变。如预期的，低依附凝聚中的N-钙粘蛋白表达在凝聚前几个小时内显著上调。在较晚时间点，当凝聚物已形成时，检测到附着分子的基因表达减少4倍。惊人地，甚至在3D培养的初始阶段也测量到所选基质分子的mRNA水平的显著变化。发现单层培养中1A1型胶原蛋白大量表达，但该分子在3D培养诱导后4小时下调10倍，并显示在接下来的90小时内进一步逐步减少。相反，发现软骨基质分子2A1型胶原蛋白在低依附培养90小时后被诱导12倍。但是，蛋白多糖组分聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的mRNA水平在很早期时间点(4小时)显著降低10倍，并在3D培养接下来的4天内进一步降低(图3)。

软骨形成分化–晚期事件

为分析低依附3D培养系统的软骨形成潜能，限定具体胞外基质组分的积累(图4)。此外，通过实时PCR定量软骨形成相关基因的表达(图4)。在28天后，将聚集体切片，用于组织学分析。聚集体切片的苏木精染色证实高细胞密度。此外，通过阿尔新蓝染色可观察胞外基质蛋白多糖的大量积累。在3D培养4周后2A1型胶原蛋白表达增加3个数量级，是确定的基质分子的最突出结果。2A1型胶原蛋白表达的动力学免疫组织学分析证实2A1型胶原蛋白的积累，甚至在3D培养初始阶段期间。在培养诱导后的前两天内，未检测到2A1胶原蛋白信号。但是，在细胞凝聚诱导后8天证实了显著信号，和在培养4周后，证实了甚至更广泛的2A1型胶原蛋白沉积。此外，与单层培养相比，证实1A1型胶原蛋白表达减少——mRNA水平减少25倍。意外地，聚集蛋白聚糖mRNA水平与增殖2D培养相比减少5倍(图4)。惊人地，转录因子Sox-9呈现在增殖单层细胞中异常高水平的基因表达——通过GAPDH比指示。在聚集体形成期间表达暂时减少后，mRNA水平返回单层基础值。另一方面，可检测到Sox-5表达进一步增加14倍。因此，Sox-5相对表达在低依附培养4周后超过相对Sox-9表达。此外，可确定在3D培养中TGFβ1和附着分子N-钙粘蛋白的mRNA水平的进一步增加(图4)。

综合分析凝聚和分化过程

为应用无支架分化系统，利用基因组范围的微阵列分析进一步研究细胞分化以及表征凝聚过程中表达图谱的变化。进行两个独立实验——利用各自的原代细胞培养。将荧光标记的探针杂交在Agilent 44K DNA芯片上。将两芯片的所得数据合并以进行评价。如果两阵列证明基因表达至少2倍变化，则基因被命名为被调控基因。p值截断被预先指定为p<0.05。为获得该具体研究的生物学过程的总体思路，根据Panther GO分类将被调控基因分组(表1-5)。在早期和晚期阶段均具有最高数量的被调控基因的组是细胞-细胞通信，发育过程和信号转导(图5)，表明诱导分化过程所需的功能组的基因表达被大幅调节。但是，3D培养系统的目的是去分化软骨细胞的再分化。因此，更详细地探寻Panther分类”骨骼系统发育。

凝聚阶段。

如表1和2显示，生长因子TGF-β3和GDF-15以及转录因子Fos是此分组中的最高上调基因。显著地，Hox-A簇的数个成员表达被定义为在凝聚阶段中升高。TGF-β组成员Inhibin-_B代表最强下调基因，并且在培养28天后抑制也很明显和。

28天后的聚集体(表3和4)。

在28天后最突出的上调基因是软骨相关基质分子胶原蛋白II、IX和XI。基质Gla-蛋白和软骨酸性蛋白也显示mRNA水平增加，而意外但与实时PCR数据一致的是，聚集蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖合成酶HAS呈现被下调。在此分组中的最高上调基因是转录因子Fos和Runx2以及生长因子GDF-15，而非软骨基质分子胶原蛋白I和XII急剧减少。

凝聚过程由细胞-细胞附着介导

间充质凝聚过程的特征在于松散间充质的聚集。然而，关于如何介导这种祖细胞密度增加所知甚少。由于Panther分类中的几个蛋白质家族的多功能性，根据KEGG数据库将附着分子和趋化分子以较窄意义细分。由于DNA微阵列数据证明了差异表达的趋化因子和相应的受体(表5)，应用这种3D培养系统的第一个尝试，应分析凝聚过程中趋化因子和迁移性细胞活性的潜在参与。大部分趋化因子受体是七种跨膜受体家族的部分。这类蛋白质通过G-蛋白关联的信号转导发出其信号传导。百日咳毒素(PTX，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis))通过G亚单元——异三聚G蛋白复合体——的ADP-核糖基化扰乱该途径。为在凝聚期间消除趋化因子活性，通过添加不同浓度的PTX进行低依附培养实验。意外地，在前72小时内，PTX处理的培养的细胞凝聚呈现出与对照实验无差别，而与施加的浓度无关(图6)。在培养诱导后即刻，细胞形成小细胞簇，通过网状过渡阶段进一步变稠，直到最终形成一个高密度细胞聚集体，而与PTX给予无关，并且具有相似动力学。该观察结果显示，细胞聚集过程不涉及趋化因子介导的细胞迁移。有意思的是，微阵列评价结果证明，75％的差异表达的附着分子呈现被上调，这表明凝聚步骤期间细胞间相互作用增加(表5)。该假设通过更详细的显微术观察被确认。在多个亚聚集体出现的不同过渡阶段，长枝状细胞产物变得可见。连接直接从一个至下一个细胞亚中心形成(图7A-C)或通过具有相反方向的两个延伸的单个细胞建立(图7D)。在晚期阶段，利用这些细串将全部亚聚集体连接成最终聚集体。因此，凝聚过程通过附着分子表达增加被驱动，导致相对于趋化因子介导的细胞迁移，细胞相互作用增加。

总结

自体祖细胞的应用代表恢复骨关节炎中破坏的软骨组织的有希望的策略。这些细胞可被触发进行分化，成为功能活性软骨细胞，生成新合成的软骨。到目前为止，为此已建立数种培养系统。由于软骨形成分化起始于体内间充质凝聚步骤，对于完全表征体外第一谱系特异性步骤具有极大意义。因此，研发无支架低依附3D培养系统，模拟包括初始凝聚阶段的整个软骨形成过程。培养系统能够诱导软骨形成分化，该软骨形成分化由关键转录因子Sox-5和II和IX型胶原蛋白的基因表达增加来指示。与其他已建立的3D培养系统相比，低依附板培养的应用提供了如下优势：分析从此前分离和扩张的间充质源的人原代细胞的单独细胞悬浮液开始的细胞聚集的不同阶段。早期阶段的分析证明，凝聚过程由增加的细胞-细胞附着介导，而非由趋化因子信号传导介导。因此，低依附3D培养系统可最终有助于鉴定对于体内软骨形成分化诱导或用于临床应用的体外生成移植物至关重要的关键因子。

III.自我包含式3D体外双相软骨-骨类器官在芯片上的装置：

在图8中，描述本发明的自我包含式3D体外双相软骨-骨类器官在芯片上的装置。

自我包含式3D体外双相软骨-骨类器官在芯片上的装置1包括基底2，其中形成两个培养基供给储器5，其通过培养基供给通道6相互连接。自我包含式3D体外双相软骨-骨类器官在芯片上的装置1进一步包括器官腔7，其中容纳3D体外双相软骨-骨类器官，该3D体外双相软骨-骨类器官包括人造软骨组织层4和人造骨组织层3，其中人造软骨组织4直接接触人造骨组织3的表面。为允许在3D体外双相软骨-骨类器官上施加机械力，可存在致动器8。

实施例B：

材料和方法

1.MSCs的分离和扩张

在具有按照Ethics board of the Charite-Universitatsmedizin Berlin指南的书面同意的情况下，人MSCs分离自在关节置换手术后获得的股骨头骨髓，如前所述。然后细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中扩张，该培养基具有4.5g/l葡萄糖(PAALaboratories，Austria)，包含10％FBS(PAA Laboratories，Austria)和青霉素-链霉素(PAA laboratories)。4和7代之间的MSCs用于共培养实验。

2.HSPCs的分离

在具有按照Ethics board of the Charite-Universitatsmedizin Berlin指南的书面同意的情况下，人HSPCs分离自脐带血。脐带血被收集在PBS-BSA-EDTA溶液中，并且单核细胞通过密度梯度离心被分离。然后利用MACS CD34+分离试剂盒(Miltenyi Biotec，德国)并按照生产商的指示，通过免疫磁性分离来分离HSPCs。然后新分离的细胞以2×10⁴细胞/培养的密度被导入不同培养系统。

3.陶瓷

1mm厚并且1cm直径的基于氧化锆的、羟磷灰石涂布的Sponceram陶瓷盘购自Zellwerk gmbh，德国。该盘在使用前经热压处理。

4.细胞培养系统

在接种HSCs前7天，将陶瓷盘接种约106个细胞/盘密度的MSCs。陶瓷盘浸入超低依附24孔板(Corning inc.，USA)中的DMEM-高葡萄糖(PAA Laboratories，Austria)，其包含10％FBS(PAA Laboratories，Austria)和青霉素-链霉素。板保持在37℃，5％CO₂下。每48小时更换培养基。同时，将6孔板也接种MSCs，使得其在24小时内实现汇合。将这些板中的一组用与陶瓷相同的培养基培养，而另一组用包含地塞米松、抗坏血酸和β-磷酸甘油(Sigma，USA)的骨诱导培养基处理。在接种MSCs后7天，将新分离的HSPCs导入4种培养条件中：1.3D共培养，其中MSCs接种在陶瓷中；2.2D共培养，其中MSC单层接种在6孔板中；3.2D共培养，其中骨诱导MSC单层接种在6孔板中；和4.在补充有100ng/ml IL-6、SCF、TPO和FLT-3L(Peprotech，UK)的Stemspan培养基(Stemcell Technologies inc.，Canada)中悬浮培养。9个独立的MSC和HSC样品用于此研究。在培养开始后1、2和4周通过流式细胞术和免疫组织化学分析来自各培养系统的细胞。分析另外的时间点——8周——的3D培养，以确定长时间培养潜能。

5.RNA分离、cDNA制备和qPCR

按照提供的指示，利用RNA II试剂盒(Macherey-Nagel，德国)进行RNA分离。将在陶瓷中培养的细胞直接在陶瓷上溶解。按照生产商的指示，通过利用逆转录试剂cDNA试剂盒(Applied Biosystems，USA)进行mRNA逆转录。在96-孔PCR板(Biozym Scientific，德国)中利用1μl cDNA与1μl引物混合物和SensiFAST^TMSybrNo-ROX试剂盒(Bioline，德国)进行实时PCR，并利用Stratagene MX 3005P^TMMultiplexQuantitative PCR系统(Agilent Technologies，USA)读取。引物购自TIBMolBiol(德国)。

6.细胞追踪

为通过荧光显微术长期追踪HSPCs和MSCs，在培养前按照生产商的指示分别用525细胞标记试剂盒和细胞Tracker^TMRed CMTPX(Invitrogen，USA)标记细胞。为追踪细胞分裂，在分离后即刻按照生产商的指示用2.5μΜ浓度的羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE，Invitrogen，USA)标记HSPCs。然后门控出(gated out)绿色标记的细胞，并利用流式细胞术在1、2和4周后追踪细胞分裂。

7.免疫组织化学

为可视化陶瓷支架中的ECM和信号传导分子，在接种被追踪的HSPCs后2周，将具有细胞的陶瓷固定在-20℃的丙酮(Sigma，USA)中。然后用手术刀将盘切割，并以150μΙ总体积在96孔板中用胶原蛋白I(鼠抗人，Sigma，USA)，C-Kit(鼠抗人，Santa Cruz BiotechnologyInc，USA)，纤连蛋白(鼠抗人，Millipore，USA)，整联蛋白4a(鼠抗人，Abeam，UK)和N-钙粘蛋白(鼠抗人，Santa Cruz Biotechnology Inc，USA)的一级抗体染色。然后将样品用结合Alexa 350或Alexa594(Invitrogen，USA)的山羊抗鼠二级抗体染色，洗涤，并通过显微镜检查可视化。

8.荧光和2-光子显微术

1、2、4和8周后共培养系统中绿色追踪的HSPCs的存在通过在用DAPI(Sigma，US)复染核后，将其在数字荧光显微镜(BZ 9000，Keyence，德国)下可视化而确定。ECM和信号传导分子利用2光子显微镜(Trimscope II，LaVision BioTec，德国)被可视化为3D堆叠，并利用Imaris 7.5版(Bitplane Scientific Software，Switzerland)渲染。

9.扫描电子显微镜(SEM)

SEM用于可视化细胞接种的陶瓷培养系统和骨髓之间的结构相似性以及对HSPCs和MSCs的物理相互作用。将在共培养2周后带有MSCs和HSPCs的陶瓷盘和从股骨头切除的1cm²骨髓片固定，用丙酮脱水，并通过临界点干燥而制备。然后将这些样品涂布以金和银，并利用Hitachi S-520SEM(Hitachi，Japan)可视化。

10.流式细胞术

通过流式细胞术分析，在表面标记表达的基础上，比较来自全部培养系统的HSPCs的表型。通过在温育箱中在37℃下用1×胰蛋白酶-EDTA(PAA Laboratories，Austria)温育30分钟，收集来自全部附着培养系统的细胞。将悬浮液细胞简单移送到收集管中。然后按照生产商的指示将细胞用下列抗体染色：CD34-APC(Miltenyi Biotec，德国)、CD38-PE(USA)、膜联蛋白V-Pacific Blue(BioLegend，USA)、碘化丙啶(Sigma，USA)。利用Analyzer(Miltenyi，德国)流式细胞仪进行流式细胞术分析，并利用FlowJo Software，7.6.5版(Tree Star inc.，USA)分析数据。

11.CFU-GEMM分析

利用集落形成单元——粒细胞、红细胞、巨噬细胞、巨核细胞分析，测试得自在接种后1、2、4和8周的陶瓷共培养系统的HSPCs的髓样分化潜能。将1000个细胞接种在CFU-GEMM培养基(Miltenyi Biotec，德国)中，并可视化集落和在2周后评分。

12。统计学分析

利用GraphPad软件5.0版(GraphPad Software Inc.，USA)，对数据组进行2因素ANOVA分析，然后Bonferroni校准。大于或等于0.05的P值被认为显著。数据表示为平均值+/-标准偏差。

结果

1.在陶瓷中培养7天内，MSCs产生具有与骨髓接近的结构相似性的微环境。

3D培养条件对骨髓MSCs的分化和ECM产生的影响已被广泛记载。刚性支架，如本研究使用的陶瓷，已显示出使MSCs易于成骨分化。因此确定在导入HSPCs前陶瓷支架中的3D培养对MSCs的影响。

免疫组织化学分析显示，在接种7天后MSCs产生由胶原蛋白I和纤连蛋白组成的ECM的网状网络(图9A(i，ii))，其中存在MSCs。还产生整联蛋白4a(图9A(iii))。胶原蛋白I和纤连蛋白已知涉及HSC生态位在骨髓中的保持，并且被认为介导HSPCs与骨髓的固定。整联蛋白4a已知在生态位中的MSC-HSC相互作用中起作用。扫描电子显微镜(图9B)揭示MSC接种的陶瓷结构(图9B(i、iii)与人骨髓基质结构(图9B(ii、iv))的惊人相似性。

阳性茜素红(Alizarin Red)(图9C(i、ii))、Von Kossa染色(图9C(iii、iv))显示，接种在陶瓷中的MSCs在培养7天后进行自发的成骨分化。

与MSCs单层培养相比，早期成骨标记——骨桥蛋白——的表达的Q-PCR分析(图9D)确认，MSCs至少部分自发成骨分化。在骨内生态位具有推定性影响的其他分子，即Jagged 1、N-钙粘蛋白、BMPR1a、ICAM1和CXCR4，与单层相比，也在3D培养中被上调，表明MSCs在陶瓷支架中培养时自发地产生微环境，这有助于HSC保持。确定7天是将造血干细胞和祖细胞导入系统的适当时间点。

2.原始CD34+CD38-HSPCs保持在3D共培养系统中长至8周。

验证3D共培养系统作为支持HSPCs的手段的第一考虑因素是接种到陶瓷中的HSPCs是否进入其中，并且长时间段保持在其中。利用荧光显微术，在接种后1、2、4和8周(图10A)于共培养系统中检测到细胞追踪剂-绿色标记的HSPCs，表明HSPCs渗入MSC接种的陶瓷，并稳定保持长至8周。未测试进一步的时间点。

为确定HSPCs是否保持其原始(CD34+CD38-)表型和探索3D共培养系统相对于已应用的HSPC培养策略的优势，通过CD34和CD38表达细胞(图10B、C、D)的流式细胞术检测比较了保持在陶瓷共培养系统中与保持在传统悬浮培养和与骨诱导和非诱导MSC单层的共培养上至4周中原始HSPCs的百分比。

发现保持在陶瓷共培养系统中的CD34+、CD38-细胞百分比在接种后长至8周在50％左右保持稳定。然而，在所有其他培养条件下，CD34+、CD38-细胞的比例稳定减少(图10C)，直到存在小于5％的原始HSPCs。发现单层共培养中大百分比的HSPCs(约50％)为分化(CD34+CD38+)细胞，其在2周后检测不到。在3D系统中也始终观察到小百分比(<5％)的这些细胞(图10D)。

3.在陶瓷型共培养系统中保持的HSPCs缓慢分裂并且为静态。

接着，通过在第1、2和4周流式细胞术分析CFSE标记的HPSCs，将3D共培养系统中HSPCs的增殖与之前述及的常规培养方法进行比较。已经历1次或更少分裂(CFSE柱状图中从右开始前2个峰)的细胞被认为是慢增殖，而所有其他细胞被认为是快增殖。

流式细胞术分析和随后柱状图生成(图11A)显示，3D共培养系统中的细胞是所有培养系统中的最慢增殖。

发现3D共培养中大比例(>70％)的HSPCs是慢增殖细胞。发现该百分比在第2和4周之间略微(<10％)减少(图11B)。发现所有常规培养中慢增殖细胞的比例与3D共培养系统相比相对较低，并且到培养4周时减少至小于10％(图11B)。

在通过CD34和CD38的流式细胞术分析研究培养1、2和4周后慢和快增殖HSPCs的表型时，发现来自3D共培养系统的HSPCs在培养1、2和4周后保持最大比例的具有原始CD34+CD38-表型的细胞(图11C、D、E)。3D共培养的超过50％的慢和快增殖HSPCs保持原始表型长至4周。

如预期的，快增殖细胞中CD34+CD38-细胞的比例小于慢增殖细胞中CD34+CD38-细胞的比例。传统共培养的慢和快增殖部分中原始细胞的百分比随时间稳定减小(图11C、D、E)。

4.在陶瓷型共培养系统中保持的HSPCs是活的和非凋亡的。

在已经确认在3D培养中最佳保持原始HSPC表型的情况下，通过测量膜联蛋白V——广泛使用的早期凋亡指示剂——和碘化丙啶(PI)——被晚期凋亡和坏死细胞获取——的表达，确定所有培养系统中的细胞生活力。

在上至第2周，3D共培养系统中很小比例(<0.2％)的HSPCs表达膜联蛋白V(图12C)，和获取PI(图12B)，然后这些细胞不再存在。

在常规系统中，特别是在悬浮培养和与骨诱导MSCs的共培养中，发现略大比例的HSPCs(0.5-1.5％)凋亡或坏死(图12B,C)。由此数据，得出如下结论：在所有培养条件中大部分HSPCs保持存活和非凋亡长至8周。

5.来自陶瓷共培养的HSPCs具有功能性并且能够多系分化。

在确认在3D共培养系统中保持的HSPCs保留其原始表型和存活后，利用CFU-GEMM分析，测试这些细胞是否保留HSPCs的多系分化潜能特征。

在接种后1、2和4周分离自3D共培养系统的CD34+细胞生成CFU-GEMM、BFU-E和CFU-GM集落(图12D)。在计数这些集落的基础上，在不同时间点未发现显著差异(图12E)。因此，在3D共培养系统中保持的CD34+细胞不仅存活，而且保留其特征性多系分化潜能。

6.3D共培养系统中的HSPCs与其微环境的ECM和细胞组分相互作用。

最后，为示例在陶瓷共培养系统中较大程度地模拟骨髓HSPC生态位中的相互作用，研究陶瓷系统中HSPCs和MSCs的物理相互作用。虽然此前观察到HSPCs和MSCs的共同定位(图10A)，但未获得物理接触的证据或相互作用机制的任何标志。

扫描电子显微镜(SEM)揭示，始终发现在陶瓷共培养系统中具有约10μm直径的小圆形HSPCs紧密接触一个或多个扁平的大MSCs(图13B)。为进一步阐明这些相互作用所涉及的因素，进行免疫组织学分析。

2-光子显微术揭示，发现荧光标记的MSCs(红)和HSPCs(绿)嵌入主要由纤连蛋白和胶原蛋白I组成的ECM网络(图13A ii，iii)。信号传导分子C-kit、整联蛋白4a和N-钙粘蛋白的免疫染色显示，这些分子位于HSPCs与MSCs接触的区域(图13A iv、v、vi)，表明3D共培养系统中的HSPCs和MSCs通过这些分子相互作用，十分类似于认为在骨髓的骨内造血生态位中存在的相互作用。

讨论

已知骨内造血生态位——其中造血干细胞和祖细胞(HSPCs)作为慢增殖原始细胞保持——是高度复杂的系统。几种不同的细胞类型，包括成骨细胞、成骨先祖和间充质干细胞，已被发现有助于生态位调控——通过多种机制，如生成ECM分子，直接细胞与细胞接触和生成信号传导分子。虽然各自的细胞类型、信号传导途径和物理标准被隐含在生态位保持的不同方面中，但仍然不清楚这些因素之间的相互作用和其在生态位中的确切作用。因此，有效模拟骨内生态位的体外模型的开发将会对研究生态位相互作用具有很大用处。

最近的研究已经显示，为成功模拟骨内生态位内的相互作用，需要存在基质支持细胞和3D结构。若干独立研究已经揭示，骨髓间充质干细胞(MSCs)在原始、静态HSCs的体外保持和增殖中尤其有效。MSCs被认为通过生成信号传导分子如整联蛋白、包括胶原蛋白I和纤连蛋白的ECM组分以及通过细胞相互作用来介导生态位保持。已知胶原蛋白I和纤连蛋白通过结合表面受体和截获分泌因子来介导HSC寻靶(homing)。还已知MSCs是成骨细胞的前体，成骨细胞是在生态位中HSPCs的已知伙伴。已显示，贡献于骨髓HSPC生态位的成骨细胞是混合群，其包括处于不同分化程度的细胞。

为尽可能接近地模拟所有这些因子，利用羟磷灰石涂布的接种骨髓MSCs的3D陶瓷支架作为脐带血衍生的HSPCs的培养系统。陶瓷支架被优化用于细胞附着，并已被报道诱导MSCs的自发成骨分化。

然而，显示分化程度小于用BMPs或其他因子诱导的培养，表明在单独陶瓷支架上培养MSCs，如在骨髓生态位中那样，会生成处于不同成骨分化程度的细胞群。

在对接种MSCs的陶瓷进行免疫组织化学分析时，观察到ECM分子——胶原蛋白I和纤连蛋白——的表达，其构成贯穿陶瓷观察到的密集网络状结构的主要组分。

还检测到整联蛋白4a的水平增加。MSC接种的陶瓷和股骨头骨松质的扫描电子显微镜分析揭示，二者之间高度的结构相似性。该培养系统的实时PCR分析显示，早期成骨标记——骨桥蛋白——以及在骨内生态位中具有已知作用的分子——Jagged-1、C-X-C趋化因子受体4型(CXCL12)、BMP受体1A(BMPR1A)、N-钙粘蛋白和细胞间附着分子-1(ICAM-1)——的表达在3D培养中上调。已知骨桥蛋白通过限制HSPC增殖和移动来促进生态位保持和HSPCs静止。Jagged-1被认为通过Notch-信号传导来介导HSPC自更新。CXCL12、BMPR1A和N-钙粘蛋白均已被隐含在HSC寻靶中，并且ICAM-1是细胞间结合的已知介导物。因此，在将MSCs接种到陶瓷支架中1周内，观察到具有与骨髓生态位结构和分子相似性的微环境形成。为完成该假定人造生态位，然后将CD 34+HSPCs导入该系统。

利用荧光显微术，能够检测到在3D共培养系统中荧光标记的HSPCs上至8周——在将其导入陶瓷后，表明HSPCs不仅进入陶瓷，而且长时间保留于此。通过流式细胞术分析，证明陶瓷共培养中大比例(超过50％)的HSPCs从培养1周上至8周稳定地保留原始CD34+CD38-表型。相反，发现常规单层共培养中或作为限定的细胞因子补充培养基中的悬浮培养而培养的HSPCs始终失去其原始表型。还确认所有培养系统中的细胞均未凋亡或坏死。

由于骨内生态位中的原始HSPCs特征还在于其慢速增殖，因此利用CFSE稀释研究来研究各培养系统中的HSPC增殖。证明3D共培养系统中的HSPCs，与常规培养的HSPCs相比，在4周内经历极少分裂(<2)。悬浮培养中的细胞尤其高度增殖。还发现3D共培养的较大百分比的慢增殖细胞保留CD34+CD38-表型。

在已经由此确认3D共培养系统能够在体外长时间保持存活的慢增殖的CD34+CD38-HSPCs后；利用CFUGEMM分析证明这些细胞具有功能性，并且能够形成红系和髓样集落。来自陶瓷的HSPCs的集落形成能力不随培养时间变化，表明功能性HSPCs被稳定保持。

在检测共培养系统中的分子相互作用时，发现MSCs和HSPCs在前述纤连蛋白和胶原蛋白I构成的网络中位置紧密接近。还看到生态位介导分子：干细胞生长因子受体(C-kit)、N-钙粘蛋白和整联蛋白4a与HSPCs和MSCs共同定位，表明这两种细胞类型可通过这些分子相互作用。C-kit是干细胞生长因子的受体，并且被认为通过介导对生态位基质的附着来促进HSC在生态位中的保持。N-钙粘蛋白和整联蛋白4a也被认为具有相似作用。进一步SEM成像揭示了附着MSCs和HSPCs之间的物理相互作用，清楚表明3D共培养系统中的生态位样细胞相互作用。

近来的研究成功在与MSCs的共培养中、在分别由胶原蛋白I和纤维蛋白构成的3D凝胶基质中保持HSPCs。这些研究有效证明，成功体外保持HSPCs需要3D支架、适当ECM和伙伴细胞的组合。其他工作已证明，成骨分化的细胞是在3D中HSPCs的有效支持细胞。单层共培养和移植研究已显示，MSCs使HSPC保持在体外和体内均高度改善。3D共培养系统组合明确限定的刚性支架、自发地生成适当ECM组分和进行自发分化的骨髓MSCs以及原始HSPCs，以产生人造系统，其在细胞、分子和结构组成方面接近地模拟骨髓HSPC生态位。这种系统能够比之前描述的系统使原始HSPCs维持更长时间。

结论

陶瓷型3D共培养系统接近地模拟骨内HSPC生态位的最重要方面，并且将提供有用的体外模型，以研究健康和患病状态的生态位的相互作用。其作为物质测试平台，用于靶向生态位任意部分的药物也具有很大的潜能。这种系统还可形成移植的有效HSPC扩张策略的基础。

表1分分类骨骼发育[上调基因；24h]

[FD：倍数变化；AV：平均值]

表2分类骨骼发育[下调基因；24h]

[FD：倍数变化；AV：平均值]

表3分类骨骼发育[上调基因；28天]

[FD：倍数变化；AV：平均值]

表4分类骨骼发育[下调基因；28天]

[FD：倍数变化；AV：平均值]。

Claims

1.3D体外双相软骨-骨类器官，包括：

a)人造软骨组织层；和

b)人造骨组织层，其中所述人造骨组织包括结构提供支架和骨髓结构；

其中通过在所述结构提供支架上接种间充质干细胞制备所述人造骨组织的骨髓结构，并且

其中所述人造软骨组织层接触所述人造骨组织层的至少一个表面。

2.权利要求1所述的3D体外双相软骨-骨类器官，其中所述人造软骨组织的制备利用间充质祖细胞。

3.权利要求1所述的3D体外双相软骨-骨类器官，其中所述人造软骨组织的制备利用包括至少50％的下列细胞或由下列细胞组成的间充质祖细胞：CD105⁺、CD106⁺、CD44⁺、CD73⁺、CD90⁺和CD13⁺。

4.权利要求1所述的3D体外双相软骨-骨类器官，其中所述人造软骨组织由分离的原代软骨细胞制备。

5.权利要求1所述的3D体外双相软骨-骨类器官，其中通过在所述结构提供支架上接种间充质干细胞和通过在培养所述结构提供支架上的间充质干细胞2至10天后添加造血干细胞，制备所述人造骨组织的骨髓结构。

6.权利要求1所述的3D体外双相软骨-骨类器官，其中所述人造骨组织的所述结构提供支架包括生物学或非生物学材料或由生物学或非生物学材料组成。

7.权利要求1所述的3D体外双相软骨-骨类器官，其中所述人造骨组织的所述结构提供支架包括3D陶瓷支架或由3D陶瓷支架组成。

8.权利要求1-7中任一项所述的3D体外双相软骨-骨类器官，其中通过制备软骨形成细胞聚集体的方法制备所述人造软骨组织，所述方法包括步骤：

a)提供间充质祖细胞；和

b)在非附着条件下培养所述间充质祖细胞，以形成软骨形成细胞聚集体。

9.利用权利要求8所述的3D体外双相软骨-骨类器官，体外和/或体内筛选调节软骨或骨组织性质的物质的方法，其中通过下列步骤制备软骨形成细胞聚集体：

a)提供间充质祖细胞；和

10.权利要求9所述的方法，其中所述间充质祖细胞包括至少50％的下列细胞或由下列细胞组成：CD105⁺、CD106⁺、CD44⁺、CD73⁺、CD90⁺和CD13⁺。

11.权利要求9或10中任一项所述的方法，其中所述间充质祖细胞包括分离的原代软骨细胞或由分离的原代软骨细胞组成。

12.移植物，包括权利要求1至8中任一项所述的3D体外双相软骨-骨类器官。

13.药物组合物，包括权利要求1至8中任一项所述的3D体外双相软骨-骨类器官或权利要求12所述的移植物和至少一种药学上可接受的赋形剂。

14.体外筛选调节软骨或骨组织性质的物质的方法，包括步骤：

-提供权利要求1至8中任一项所述的3D体外双相软骨-骨类器官的样品；

-将各个样品分成多个部分；

-用待筛选物质温育至少一个部分；和

-比较已处理部分与未用所述待筛选物质温育的另一部分的测量参数。

15.自我包含式3D体外双相软骨-骨类器官在芯片上的装置，包括至少一个培养基供给储器、至少一个器官生长部件，所述至少一个器官生长部件包括至少一个器官腔，权利要求1至8中任一项所述的3D体外双相软骨-骨类器官被包含和容纳在所述至少一个器官腔中，其中所述培养基供给储器通过微流体供给通道连接于所述至少一个器官生长部件。