JPH07136505A - アフィニティー分離材料 - Google Patents
アフィニティー分離材料Info
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- JPH07136505A JPH07136505A JP5288544A JP28854493A JPH07136505A JP H07136505 A JPH07136505 A JP H07136505A JP 5288544 A JP5288544 A JP 5288544A JP 28854493 A JP28854493 A JP 28854493A JP H07136505 A JPH07136505 A JP H07136505A
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
- A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
- A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
- A61M1/3687—Chemical treatment
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
- G01N30/52—Physical parameters
- G01N30/54—Temperature
Abstract
(57)【要約】
【目的】標的物質に対する高い特異性を有し標的物質を
簡便に回収できる分離材料及び分離システムを提供す
る。 【構成】標的物質に対して特異的親和性を有する物質Ａ
を、物質Ｂと物質Ｃの結合体を介して、刺激応答性高分
子とともに表面に担持させたことを特徴とするアフィニ
ティー分離材料。並びに、該分離材料を用いて標的細胞
を吸着した後、刺激応答性高分子の高次構造を変化させ
ることにより物質Ｂと物質Ｃとの結合を解離させ、標的
物質を該分離材料より脱離する分離方法。
簡便に回収できる分離材料及び分離システムを提供す
る。 【構成】標的物質に対して特異的親和性を有する物質Ａ
を、物質Ｂと物質Ｃの結合体を介して、刺激応答性高分
子とともに表面に担持させたことを特徴とするアフィニ
ティー分離材料。並びに、該分離材料を用いて標的細胞
を吸着した後、刺激応答性高分子の高次構造を変化させ
ることにより物質Ｂと物質Ｃとの結合を解離させ、標的
物質を該分離材料より脱離する分離方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、標的物質に対して特異
的親和性を有する物質と刺激応答性高分子を利用した新
規な物質分離材料及び分離システムに関する。
的親和性を有する物質と刺激応答性高分子を利用した新
規な物質分離材料及び分離システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、細胞工学や遺伝子工学等の発展に
伴い、細胞や遺伝子を利用した細胞治療や遺伝子治療の
研究が盛んとなっており、それらの生体物質を損傷させ
ることなく分離精製する技術が望まれている。また、バ
イオテクノジーの発展により、生物工学的手法によるペ
プチド、蛋白質、糖蛋白質類といった生理活性分子の生
産が行われるようになってきており、細胞やバイオプロ
ダクツの簡便で損傷の少ない分離精製技術が望まれてい
る。
伴い、細胞や遺伝子を利用した細胞治療や遺伝子治療の
研究が盛んとなっており、それらの生体物質を損傷させ
ることなく分離精製する技術が望まれている。また、バ
イオテクノジーの発展により、生物工学的手法によるペ
プチド、蛋白質、糖蛋白質類といった生理活性分子の生
産が行われるようになってきており、細胞やバイオプロ
ダクツの簡便で損傷の少ない分離精製技術が望まれてい
る。
【０００３】従来より化学工業分野で使用されている分
離・精製の単位操作として、吸着・分配・蒸留・析出が
知られているが、これらの方法は、熱や有機溶媒の添加
などにより、被精製物質に対して、大幅な環境変化を強
いるプロセスである。従って、前述の細胞やバイオプロ
ダクツの分離には適していない。
離・精製の単位操作として、吸着・分配・蒸留・析出が
知られているが、これらの方法は、熱や有機溶媒の添加
などにより、被精製物質に対して、大幅な環境変化を強
いるプロセスである。従って、前述の細胞やバイオプロ
ダクツの分離には適していない。
【０００４】細胞やバイオプロダクツの分離方法とし
て、体積（分子量）や密度による方法（沈降速度法、密
度勾配遠心法、ゲル濾過法など）、電場中での移動度の
差による方法（電気泳動など）、等電点による方法（焦
点電気泳動など）、２液相間への分配による方法（２層
分配法、分配クロマトクラフィー）、固相への吸着性の
差による方法（吸着クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー）などが知られている。
て、体積（分子量）や密度による方法（沈降速度法、密
度勾配遠心法、ゲル濾過法など）、電場中での移動度の
差による方法（電気泳動など）、等電点による方法（焦
点電気泳動など）、２液相間への分配による方法（２層
分配法、分配クロマトクラフィー）、固相への吸着性の
差による方法（吸着クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー）などが知られている。
【０００５】これらの分離方法の多くは、物理化学的性
状が大きく異なる細胞成分の分離には適用できるもの
の、物理化学的性状が良く似た成分や細胞、例えばリン
パ球亜集団の分離などには適用が困難であった。この中
で標的物質に対する選択性の高い方法は、アフィニティ
ークロマトグラフィーであり、近年広く利用されるよう
になってきている。細胞を対象とするアフィニティーク
ロマトグラフィーとしては、標的細胞の表層に存在する
膜蛋白等に対するモノクローナル抗体を結合したビーズ
やシャーレを用いた分離方法が報告されており、本方法
による各種リンパ球の亜集団分離も報告されている（例
えば、ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッ
ド、第５４号、２５１ページ、１９８３年に記載されて
いるブラウンらの研究報告）。この抗体を用いた方法
は、特異性が極めて高いことで利点であるが、欠点とし
て、吸着した細胞の脱着が困難なこと、抗体が細胞表層
の抗原に結合するための時間（接触時間）を長くする必
要があること、その結果、非特異的な吸着が増加するこ
となどがあった。
状が大きく異なる細胞成分の分離には適用できるもの
の、物理化学的性状が良く似た成分や細胞、例えばリン
パ球亜集団の分離などには適用が困難であった。この中
で標的物質に対する選択性の高い方法は、アフィニティ
ークロマトグラフィーであり、近年広く利用されるよう
になってきている。細胞を対象とするアフィニティーク
ロマトグラフィーとしては、標的細胞の表層に存在する
膜蛋白等に対するモノクローナル抗体を結合したビーズ
やシャーレを用いた分離方法が報告されており、本方法
による各種リンパ球の亜集団分離も報告されている（例
えば、ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッ
ド、第５４号、２５１ページ、１９８３年に記載されて
いるブラウンらの研究報告）。この抗体を用いた方法
は、特異性が極めて高いことで利点であるが、欠点とし
て、吸着した細胞の脱着が困難なこと、抗体が細胞表層
の抗原に結合するための時間（接触時間）を長くする必
要があること、その結果、非特異的な吸着が増加するこ
となどがあった。
【０００６】前述の欠点を改良した方法としては、アビ
ジン−ビオチンのような親和性の高い結合を利用して、
短時間で分離材料に吸着させる方法が国際出願（ＷＯ９
１／１６１１６）で提案されている。すなわち、ビオチ
ンで標識した抗体を予め時間をかけて標的細胞に結合さ
せた後、アビジンを結合した分離材料に吸着させること
により、短時間で効率良く標的細胞を分離できることと
なる。しかしながら、この方法では、標的細胞の回収
が、物理的振動によりアビジン−ビオチン結合を解離す
ることにより行われているため、ビーズ同士の衝突によ
る細胞の損傷や機能低下が免れない。
ジン−ビオチンのような親和性の高い結合を利用して、
短時間で分離材料に吸着させる方法が国際出願（ＷＯ９
１／１６１１６）で提案されている。すなわち、ビオチ
ンで標識した抗体を予め時間をかけて標的細胞に結合さ
せた後、アビジンを結合した分離材料に吸着させること
により、短時間で効率良く標的細胞を分離できることと
なる。しかしながら、この方法では、標的細胞の回収
が、物理的振動によりアビジン−ビオチン結合を解離す
ることにより行われているため、ビーズ同士の衝突によ
る細胞の損傷や機能低下が免れない。
【０００７】細胞機能を損なわないように回収する方法
としては、特開平２−２１１８６５号に記載された水に
対する上限または下限臨界溶解温度が０〜８０℃にある
ポリマーもしくはコポリマーで表面を被覆した細胞培養
基材が報告されている。この方法は、温度により疎水性
−親水性と相転移する温度応答性高分子を利用したもの
であり、温度応答性高分子が疎水性で収縮した状態の時
に細胞を吸着させた後、温度を変化させ、親水性となっ
て膨潤するときに吸着した細胞を脱着させる方法であ
る。この方法の欠点は、細胞に対する特異性が低いた
め、種々の細胞が存在する液体から特定の細胞を回収す
ることができないことである。特に、マクロファージ、
白血球、リンパ球などの多くは、曲率の小さい表面に吸
着することが知られており、フィルターや不織布形状に
加工した分離材料を用いて、特定のリンパ球などを選択
的に回収することは困難であった。
としては、特開平２−２１１８６５号に記載された水に
対する上限または下限臨界溶解温度が０〜８０℃にある
ポリマーもしくはコポリマーで表面を被覆した細胞培養
基材が報告されている。この方法は、温度により疎水性
−親水性と相転移する温度応答性高分子を利用したもの
であり、温度応答性高分子が疎水性で収縮した状態の時
に細胞を吸着させた後、温度を変化させ、親水性となっ
て膨潤するときに吸着した細胞を脱着させる方法であ
る。この方法の欠点は、細胞に対する特異性が低いた
め、種々の細胞が存在する液体から特定の細胞を回収す
ることができないことである。特に、マクロファージ、
白血球、リンパ球などの多くは、曲率の小さい表面に吸
着することが知られており、フィルターや不織布形状に
加工した分離材料を用いて、特定のリンパ球などを選択
的に回収することは困難であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、標
的物質に対する高い特異性を有し標的物質を簡便に回収
できる分離材料及び分離システムを提供することを目的
とする。
的物質に対する高い特異性を有し標的物質を簡便に回収
できる分離材料及び分離システムを提供することを目的
とする。
【０００９】
【問題点を解決するための手段】上記発明の目的は以下
のアフィニティー分離材料並びに分離方法によって達成
される。 （１）標的物質に対して特異的親和性を有する物質Ａ
を、互いに結合能のある少なくとも２種の化合物（物質
Ｂと物質Ｃ）の結合体からなるスペーサーを介して、刺
激応答性高分子とともに表面に担持させたことを特徴と
するアフィニティー分離材料。
のアフィニティー分離材料並びに分離方法によって達成
される。 （１）標的物質に対して特異的親和性を有する物質Ａ
を、互いに結合能のある少なくとも２種の化合物（物質
Ｂと物質Ｃ）の結合体からなるスペーサーを介して、刺
激応答性高分子とともに表面に担持させたことを特徴と
するアフィニティー分離材料。
【００１０】（２）標的物質に対して特異的親和性を有
する物質Ａを、互いに結合能のある少なくとも２種の化
合物（物質Ｂと物質Ｃ）の結合体を介して、刺激応答性
高分子とともに表面に担持させたことを特徴とするアフ
ィニティー分離材料を用いて、標的物質を該分離材料に
結合させた後、刺激応答性高分子の高次構造を変化させ
て、標的物質を該分離材料より脱離させることを特徴と
する分離方法。
する物質Ａを、互いに結合能のある少なくとも２種の化
合物（物質Ｂと物質Ｃ）の結合体を介して、刺激応答性
高分子とともに表面に担持させたことを特徴とするアフ
ィニティー分離材料を用いて、標的物質を該分離材料に
結合させた後、刺激応答性高分子の高次構造を変化させ
て、標的物質を該分離材料より脱離させることを特徴と
する分離方法。
【００１１】（３）互いに結合能を有する物質Ｂと物質
Ｃのいずれか一方が結合した標的物質に対して特異的親
和性を有する物質Ａと、互いに結合能を有する物質Ｂと
物質Ｃの残った方を刺激応答性高分子とともに表面に担
持させた分離材料とからなる分離システムにおいて、物
質Ａと標的物質を接触させると同時もしくは接触させた
後に、さらに該分離材料と接触させて、該分離材料に標
的物質を結合させた後、刺激応答性高分子の高次構造を
変化させて、標的物質を脱離させることを特徴とする分
離方法。
Ｃのいずれか一方が結合した標的物質に対して特異的親
和性を有する物質Ａと、互いに結合能を有する物質Ｂと
物質Ｃの残った方を刺激応答性高分子とともに表面に担
持させた分離材料とからなる分離システムにおいて、物
質Ａと標的物質を接触させると同時もしくは接触させた
後に、さらに該分離材料と接触させて、該分離材料に標
的物質を結合させた後、刺激応答性高分子の高次構造を
変化させて、標的物質を脱離させることを特徴とする分
離方法。
【００１２】本発明において、標的物質は特に限定され
ないが、機能維持が重要であり分離が困難な細胞、例え
ば、上皮系細胞、肝実質細胞、膵ラ島細胞、マクロファ
ージ、単核球、ＮＫ細胞（ＣＤ５６+）、血液幹細胞な
どの未分化細胞（ＣＤ３４+）、Ｂリンパ球、Ｔリンパ
球、及びそのサブセット（ＣＤ４+、ＣＤ８+、ＣＤ１９
+、ＣＤ７１+、ＩＬ２Ｒ+など）、腫瘍細胞などを好適
に例示できる。標的物質に対して特異的親和性を有する
物質とは、抗原−抗体、酵素−基質（阻害剤）、細胞表
層のレセプターとの反応などの生体の制御機構で見られ
る特異的親和性を例示できる。
ないが、機能維持が重要であり分離が困難な細胞、例え
ば、上皮系細胞、肝実質細胞、膵ラ島細胞、マクロファ
ージ、単核球、ＮＫ細胞（ＣＤ５６+）、血液幹細胞な
どの未分化細胞（ＣＤ３４+）、Ｂリンパ球、Ｔリンパ
球、及びそのサブセット（ＣＤ４+、ＣＤ８+、ＣＤ１９
+、ＣＤ７１+、ＩＬ２Ｒ+など）、腫瘍細胞などを好適
に例示できる。標的物質に対して特異的親和性を有する
物質とは、抗原−抗体、酵素−基質（阻害剤）、細胞表
層のレセプターとの反応などの生体の制御機構で見られ
る特異的親和性を例示できる。
【００１３】互いに結合能のある少なくとも２種の化合
物（物質Ｂと物質Ｃ）の結合体とは、物質Ｂと物質Ｃと
が結合能を有していればよく生体由来物質であっても合
成化合物であっても、また、第３成分が結合していても
かまわないが、生理的条件で高い親和性を有するビオチ
ン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、リボフ
ラビン−リボフラビン結合蛋白などの組み合わせを好適
に例示できる。ビオチン−アビジンの組み合わせは、ビ
オチン標識抗体などが市販されており容易に入手できる
ため、応用性が高く好ましい。
物（物質Ｂと物質Ｃ）の結合体とは、物質Ｂと物質Ｃと
が結合能を有していればよく生体由来物質であっても合
成化合物であっても、また、第３成分が結合していても
かまわないが、生理的条件で高い親和性を有するビオチ
ン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、リボフ
ラビン−リボフラビン結合蛋白などの組み合わせを好適
に例示できる。ビオチン−アビジンの組み合わせは、ビ
オチン標識抗体などが市販されており容易に入手できる
ため、応用性が高く好ましい。
【００１４】刺激応答性高分子とは、熱、ｐＨ、電位、
光などにより高次構造が変化して、水溶液中で膨潤した
り収縮する高分子であればよい。例えば、水に対する上
限臨界温度または下限臨界温度を有し、温度変化に応答
して、膨潤−収縮する高分子を好適に例示できる。その
ような高分子としては、Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ドやＮ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピ
ルメタアクリルアミドなどのアクリルアミドやメタアク
リルアミドの誘導体類をはじめ、ビニルメチルエーテル
などのビニルエーテル類などのポリマーやコポリマーが
知られている。
光などにより高次構造が変化して、水溶液中で膨潤した
り収縮する高分子であればよい。例えば、水に対する上
限臨界温度または下限臨界温度を有し、温度変化に応答
して、膨潤−収縮する高分子を好適に例示できる。その
ような高分子としては、Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ドやＮ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピ
ルメタアクリルアミドなどのアクリルアミドやメタアク
リルアミドの誘導体類をはじめ、ビニルメチルエーテル
などのビニルエーテル類などのポリマーやコポリマーが
知られている。
【００１５】光応答性の場合は、例えば、アゾベンゼン
基を有する吸水性高分子のように光異性化をおこす高分
子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニ
ル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体のよう
に光イオン解離する感応基を有する吸水性高分子、スピ
ロベンゾピランを含むＮ−イソプロピルアクリルアミド
ゲルのように疎水性相互作用が光変化する高分子などを
用いることができる。
基を有する吸水性高分子のように光異性化をおこす高分
子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニ
ル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体のよう
に光イオン解離する感応基を有する吸水性高分子、スピ
ロベンゾピランを含むＮ−イソプロピルアクリルアミド
ゲルのように疎水性相互作用が光変化する高分子などを
用いることができる。
【００１６】物質Ａ、Ｂ、Ｃを材料表面に担持させる方
法は特に限定されず、公知の方法を組み合わせることに
よって目的の分離材料を作製することができる。例え
ば、官能基を有する単量体を共重合した刺激応答性高分
子を合成した後、該官能基を利用して物質Ｂの結合と基
材表面への結合を行なったり、電子線、オゾン、γ線、
プラズマなどを利用したグラフト法により官能基を有す
る単量体を共重合した刺激応答性グラフト鎖を形成させ
た後、物質Ｂを結合させたりすることができる。
法は特に限定されず、公知の方法を組み合わせることに
よって目的の分離材料を作製することができる。例え
ば、官能基を有する単量体を共重合した刺激応答性高分
子を合成した後、該官能基を利用して物質Ｂの結合と基
材表面への結合を行なったり、電子線、オゾン、γ線、
プラズマなどを利用したグラフト法により官能基を有す
る単量体を共重合した刺激応答性グラフト鎖を形成させ
た後、物質Ｂを結合させたりすることができる。
【００１７】一方、標的物質への特異的親和性を有する
物質Ａに対しては、縮合剤や架橋剤を用いて物質Ｃ結合
させることができる。さらに、これらを混和することに
より物質Ｂと物質Ｃとを結合させて、物質Ａが、物質Ｂ
と物質Ｃの結合体を介して、刺激応答性高分子とともに
表面に担持された分離材料を作製することができる。
物質Ａに対しては、縮合剤や架橋剤を用いて物質Ｃ結合
させることができる。さらに、これらを混和することに
より物質Ｂと物質Ｃとを結合させて、物質Ａが、物質Ｂ
と物質Ｃの結合体を介して、刺激応答性高分子とともに
表面に担持された分離材料を作製することができる。
【００１８】分離材料の形態は、特に限定されず、プレ
ート状、シャーレ状、繊維状、不織布状、多孔質膜、フ
ィルター状、ビーズ状などを例示でき、それぞれの形態
にあったカラムなりモジュ−ルに収納されて使用されて
もかまわない。また、その基材となる材質についても水
に対して非溶解性であれば特に限定されず、ポリオレフ
ィン、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリウレタン、ポリ
アミド、ポリエステル、綿、ポリスチレン、及びそれら
の変性物や共重合体など、既存の材料を例示することが
できる。
ート状、シャーレ状、繊維状、不織布状、多孔質膜、フ
ィルター状、ビーズ状などを例示でき、それぞれの形態
にあったカラムなりモジュ−ルに収納されて使用されて
もかまわない。また、その基材となる材質についても水
に対して非溶解性であれば特に限定されず、ポリオレフ
ィン、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリウレタン、ポリ
アミド、ポリエステル、綿、ポリスチレン、及びそれら
の変性物や共重合体など、既存の材料を例示することが
できる。
【００１９】標的物質の分離方法は、前記の分離材料に
標的物質を接触させてもかまわないし、予め物質Ｂと物
質Ｃのいずれかを結合した物質Ａを標的物質と接触させ
た後、物質Ｂと物質Ｃの残った方を結合させた分離材料
と接触させることにより、分離材料に吸着する方法でも
よい。
標的物質を接触させてもかまわないし、予め物質Ｂと物
質Ｃのいずれかを結合した物質Ａを標的物質と接触させ
た後、物質Ｂと物質Ｃの残った方を結合させた分離材料
と接触させることにより、分離材料に吸着する方法でも
よい。
【００２０】標的物質の回収は、温度等の刺激により刺
激応答性高分子の高次構造を急速に変化せしめることに
より、物質Ｂと物質Ｃの結合を弱めることにより行う
が、回収率の向上などを目的として、必要に応じて物理
的な方法や化学的な方法を併用してもかまわない。細胞
やタンパク質などの非特異的吸着を抑制するため、刺激
応答性高分子が緩衝液、培養液、血液、血漿などで膨潤
した状態で標的物質を特異的に吸着させた後、温度等を
変化させて収縮させるこにより、物質Ｂと物質Ｃの結合
を解離させることが好ましい。また、このとき物質Ａと
標的物質との特異的結合が解離することによって、標的
物質が脱離してもかまわない。
激応答性高分子の高次構造を急速に変化せしめることに
より、物質Ｂと物質Ｃの結合を弱めることにより行う
が、回収率の向上などを目的として、必要に応じて物理
的な方法や化学的な方法を併用してもかまわない。細胞
やタンパク質などの非特異的吸着を抑制するため、刺激
応答性高分子が緩衝液、培養液、血液、血漿などで膨潤
した状態で標的物質を特異的に吸着させた後、温度等を
変化させて収縮させるこにより、物質Ｂと物質Ｃの結合
を解離させることが好ましい。また、このとき物質Ａと
標的物質との特異的結合が解離することによって、標的
物質が脱離してもかまわない。
【００２１】本発明の分離材料は、標的物質に対する特
異的親和性を有するリガンドと刺激応答性高分子とを有
しているため、標的物質を選択的に吸着し、刺激応答性
高分子の高次構造変化により、該標的物質を簡便に脱離
できる分離材料や分離システムとなる。
異的親和性を有するリガンドと刺激応答性高分子とを有
しているため、標的物質を選択的に吸着し、刺激応答性
高分子の高次構造変化により、該標的物質を簡便に脱離
できる分離材料や分離システムとなる。
【００２２】
（実施例１）標的物質としてＣＤ４+細胞を設定し、標
的物質に対して特異的親和性を有する物質としてＣＤ４
に対する抗体、物質Ｂと物質Ｃの結合体としてアビジン
−ビオチン結合、刺激応答性高分子としてポリ（Ｎ−イ
ソプロピルアクリルアミド）を選定して、アフィニティ
分離材料を作製し、ＣＤ４+細胞の分離を行った。
的物質に対して特異的親和性を有する物質としてＣＤ４
に対する抗体、物質Ｂと物質Ｃの結合体としてアビジン
−ビオチン結合、刺激応答性高分子としてポリ（Ｎ−イ
ソプロピルアクリルアミド）を選定して、アフィニティ
分離材料を作製し、ＣＤ４+細胞の分離を行った。
【００２３】分子内に複数のパ−オキサイド基を有する
ポリブチルメタクリレートを重合開始剤として、Ｎ−イ
ソプロピルアクリルアミドとメタクリル酸とを重合さ
せ、ブチルメタクリレートを疎水性ドメインとしＮ−イ
ソプロピルアクリルアミドとメタクリル酸との共重合体
（モル比２２：１）を温度応答性ドメインとするブロッ
ク共重合体を合成した。本ブロック共重合体を、クロロ
ホルム−エタノール（９：１）の混合溶媒に溶解し、プ
ラズマ放電処理した厚さ１００μのポリエステル不織布
にコーティングした。
ポリブチルメタクリレートを重合開始剤として、Ｎ−イ
ソプロピルアクリルアミドとメタクリル酸とを重合さ
せ、ブチルメタクリレートを疎水性ドメインとしＮ−イ
ソプロピルアクリルアミドとメタクリル酸との共重合体
（モル比２２：１）を温度応答性ドメインとするブロッ
ク共重合体を合成した。本ブロック共重合体を、クロロ
ホルム−エタノール（９：１）の混合溶媒に溶解し、プ
ラズマ放電処理した厚さ１００μのポリエステル不織布
にコーティングした。
【００２４】本不織布をφ２５に打ち抜いて容器に入
れ、５ｍｇ／ｍｌの１−エチル−３−（ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド（シグマ社製）溶液を２０ｍ
ｌ（ｐＨ５．５）シャーレに注入し、５分間室温で放置
した。続いて、アビジンの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を１ｍｌ
添加し、室温で１時間時々撹拌しながら放置した。さら
に、グリシンを最終濃度で０．２モルとなるように添加
して１時間放置した後、リン酸バッファー（ＰＢＳ）で
リンスした。このアビジン固定化不織布は、ＰＢＳ中で
４℃で保存した。
れ、５ｍｇ／ｍｌの１−エチル−３−（ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド（シグマ社製）溶液を２０ｍ
ｌ（ｐＨ５．５）シャーレに注入し、５分間室温で放置
した。続いて、アビジンの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を１ｍｌ
添加し、室温で１時間時々撹拌しながら放置した。さら
に、グリシンを最終濃度で０．２モルとなるように添加
して１時間放置した後、リン酸バッファー（ＰＢＳ）で
リンスした。このアビジン固定化不織布は、ＰＢＳ中で
４℃で保存した。
【００２５】ＣＤ４+細胞とアビジンに特異的に吸着す
る物質として、ビオチン標識したＣＤ４抗体を購入（イ
ムノテック）し、アビジン固定化不織布にＰＢＳ中でイ
ンキュベートすることにより結合させて分離材料を得
た。この分離用不織布を５枚積層してφ２５ｍｍのフィ
ルターホルダーにセットして、人新鮮血のバフィーコー
トより採取し１％アルブミンを添加したＰＢＳで洗浄し
て調整した白血球液（１×１０5 ／ｍｌ）を２５℃でゆ
っくりと１０ｍｌ流すことにより分離用不織布に吸着さ
せた。吸着した細胞の溶出は、温度を３５℃に上昇させ
て、１％アルブミンを添加したＰＢＳを流すことで行っ
た。その結果、純度９４％、回収率５３％でＣＤ４+細
胞を回収することができた。
る物質として、ビオチン標識したＣＤ４抗体を購入（イ
ムノテック）し、アビジン固定化不織布にＰＢＳ中でイ
ンキュベートすることにより結合させて分離材料を得
た。この分離用不織布を５枚積層してφ２５ｍｍのフィ
ルターホルダーにセットして、人新鮮血のバフィーコー
トより採取し１％アルブミンを添加したＰＢＳで洗浄し
て調整した白血球液（１×１０5 ／ｍｌ）を２５℃でゆ
っくりと１０ｍｌ流すことにより分離用不織布に吸着さ
せた。吸着した細胞の溶出は、温度を３５℃に上昇させ
て、１％アルブミンを添加したＰＢＳを流すことで行っ
た。その結果、純度９４％、回収率５３％でＣＤ４+細
胞を回収することができた。
【００２６】（実施例２）実施例１と同様の方法で作製
したアビジン固定化不織布を、φ２５ｍｍのフィルター
ホルダーに５枚積層することにより分離モジュ−ルを作
製した。骨髄から得たバフィーコートより１％アルブミ
ンを添加したＰＢＳで洗浄して調整した白血球液（１×
１０6 ／ｍｌ）に、ビオチン標識したＣＤ３４抗体を添
加した後、前述の分離モジュールに定量ポンプで０．５
ｍｌ／ｍｉｎで流した。吸着した細胞の溶出は、温度を
３５℃に上昇させて１％アルブミンを添加したＰＢＳを
流すことで行った。その結果、純度９５％、回収率４８
％でＣＤ３４+細胞を回収することができた。
したアビジン固定化不織布を、φ２５ｍｍのフィルター
ホルダーに５枚積層することにより分離モジュ−ルを作
製した。骨髄から得たバフィーコートより１％アルブミ
ンを添加したＰＢＳで洗浄して調整した白血球液（１×
１０6 ／ｍｌ）に、ビオチン標識したＣＤ３４抗体を添
加した後、前述の分離モジュールに定量ポンプで０．５
ｍｌ／ｍｉｎで流した。吸着した細胞の溶出は、温度を
３５℃に上昇させて１％アルブミンを添加したＰＢＳを
流すことで行った。その結果、純度９５％、回収率４８
％でＣＤ３４+細胞を回収することができた。
【００２７】
【発明の効果】本発明の分離材料や分離方法は、標的物
質を選択的に吸着する物質Ａを使用して標的物質を吸着
し、刺激応答性高分子の高次構造変化により解離する物
質Ｂと物質Ｃの結合により分離材料に保持させているた
め、標的物質への高い選択性が得られ、かつ標的物質の
変性や機能変化が少ない状態で、外部刺激（環境変化）
により簡便に脱離させて回収することが可能となる。ま
た、従来困難であった血球系細胞や機能細胞の詳細な分
離が容易にできるため、特殊な細胞を分離して、必要に
より増殖・機能変換させて再び生体内に戻す細胞治療や
遺伝子治療に有効な分離技術等として効果を発揮するこ
ととなる。また、本分離材料や分離方法は、標的物質を
各種のバイオプロダクツ、生体関連物質や化学物質とす
ることで、バイオ産業、医薬品産業、化学工業から診断
・治療などの医療分野に至るまで、広範に利用できる技
術となる。
質を選択的に吸着する物質Ａを使用して標的物質を吸着
し、刺激応答性高分子の高次構造変化により解離する物
質Ｂと物質Ｃの結合により分離材料に保持させているた
め、標的物質への高い選択性が得られ、かつ標的物質の
変性や機能変化が少ない状態で、外部刺激（環境変化）
により簡便に脱離させて回収することが可能となる。ま
た、従来困難であった血球系細胞や機能細胞の詳細な分
離が容易にできるため、特殊な細胞を分離して、必要に
より増殖・機能変換させて再び生体内に戻す細胞治療や
遺伝子治療に有効な分離技術等として効果を発揮するこ
ととなる。また、本分離材料や分離方法は、標的物質を
各種のバイオプロダクツ、生体関連物質や化学物質とす
ることで、バイオ産業、医薬品産業、化学工業から診断
・治療などの医療分野に至るまで、広範に利用できる技
術となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/02 7236−4Ｂ
Claims (1)
- 【請求項１】標的物質に対して特異的親和性を有する物
質を、互いに結合能のある少なくとも２種の化合物の結
合体からなるスペーサーを介して、刺激応答性高分子と
ともに表面に担持させたことを特徴とするアフィニティ
分離材料。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28854493A JP3441496B2 (ja) | 1993-11-17 | 1993-11-17 | アフィニティー分離材料 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28854493A JP3441496B2 (ja) | 1993-11-17 | 1993-11-17 | アフィニティー分離材料 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07136505A true JPH07136505A (ja) | 1995-05-30 |
| JP3441496B2 JP3441496B2 (ja) | 2003-09-02 |
Family
ID=17731621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28854493A Expired - Fee Related JP3441496B2 (ja) | 1993-11-17 | 1993-11-17 | アフィニティー分離材料 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3441496B2 (ja) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996028198A1 (en) * | 1995-03-13 | 1996-09-19 | Ao Forschungsinstitut Davos | An extracorporeal blood treatment apparatus and method for removal of free circulating infectious agents |
| WO1999012975A1 (en) * | 1997-09-08 | 1999-03-18 | Fleximer, Llc | Smart polymer-coupled bioactive entities and uses thereof |
| WO2000067901A1 (en) * | 1999-05-11 | 2000-11-16 | Japan Chemical Innovation Institute | Affinity-controlling material with the use of stimulus-responsive polymer and separation/purification method with the use of the material |
| JP2001096104A (ja) * | 1999-07-29 | 2001-04-10 | Univ Kansai | 液中の有機物の除去方法及び除去装置 |
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| JP2006158305A (ja) * | 2004-12-08 | 2006-06-22 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 細胞分離用吸着材、細胞分離用吸着材モジュール及び細胞分離方法 |
| WO2007055178A1 (ja) * | 2005-11-08 | 2007-05-18 | Japan Health Sciences Foundation | 細胞の分取方法、及び当該方法に用いる基材 |
| WO2016143215A1 (ja) * | 2015-03-09 | 2016-09-15 | 株式会社日立製作所 | 吸着材、それを用いた分離精製装置及び分離精製方法 |
| WO2018037742A1 (ja) | 2016-08-23 | 2018-03-01 | 日立化成株式会社 | 吸着材 |
| WO2023276937A1 (ja) * | 2021-06-30 | 2023-01-05 | 日油株式会社 | 細胞剥離剤および細胞分離方法 |
-
1993
- 1993-11-17 JP JP28854493A patent/JP3441496B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US7012136B2 (en) | 2000-10-13 | 2006-03-14 | Amersham Biosciences Kk | Stimulus responsive affinity chromatographic material and separation/purification method |
| US7355020B2 (en) | 2000-10-13 | 2008-04-08 | Ge Healthcare Bio-Sciences Kk | Stimulus responsive affinity chromatographic material and separation/purification method |
| JP2002119854A (ja) * | 2000-10-13 | 2002-04-23 | Amersham Bioscience Kk Kk | 刺激応答型アフィニティクロマトグラフィー材料等の分離材料および分離精製方法 |
| JP2006158305A (ja) * | 2004-12-08 | 2006-06-22 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 細胞分離用吸着材、細胞分離用吸着材モジュール及び細胞分離方法 |
| WO2007055178A1 (ja) * | 2005-11-08 | 2007-05-18 | Japan Health Sciences Foundation | 細胞の分取方法、及び当該方法に用いる基材 |
| JPWO2007055178A1 (ja) * | 2005-11-08 | 2009-04-30 | 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | 細胞の分取方法、及び当該方法に用いる基材 |
| WO2016143215A1 (ja) * | 2015-03-09 | 2016-09-15 | 株式会社日立製作所 | 吸着材、それを用いた分離精製装置及び分離精製方法 |
| JP2016165677A (ja) * | 2015-03-09 | 2016-09-15 | 株式会社日立製作所 | 吸着材、それを用いた分離精製装置及び分離精製方法 |
| WO2018037742A1 (ja) | 2016-08-23 | 2018-03-01 | 日立化成株式会社 | 吸着材 |
| US10898878B2 (en) | 2016-08-23 | 2021-01-26 | Showa Denko Materials Co., Ltd. | Adsorbent material |
| WO2023276937A1 (ja) * | 2021-06-30 | 2023-01-05 | 日油株式会社 | 細胞剥離剤および細胞分離方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3441496B2 (ja) | 2003-09-02 |
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