WO2018037742A1 - 吸着材 - Google Patents

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WO2018037742A1
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polymer material
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target substance
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優史 丸山
七重 山下
譲 島崎
博史 吉田
啓介 渋谷
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日立化成株式会社
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    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86

Definitions

  • the present invention relates to an adsorbent and a purification method using the adsorbent.
  • Affinity purification using a biomolecule such as protein as a target substance consists of adsorption of the target substance onto the affinity adsorbent, washing of non-adsorbed components, and desorption of the target substance from the adsorbent with an eluent.
  • a severe pH solution such as a strong acid or a strong base is often used as the eluent. This is because it is necessary to change the ionization state of the affinity ligand and the target substance and weaken the interaction between the affinity ligand and the target substance by charge repulsion.
  • biomolecules are often unstable and there is a risk that the purified target substance will deteriorate.
  • a temperature-responsive affinity adsorbent capable of purifying a target substance without changing the pH in a mild pH environment has been developed.
  • a method using a protein whose thermal stability is reduced by gene recombination as a ligand (Patent Documents 1 and 2), or poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) is used.
  • Methods have been reported (Patent Documents 3 and 4) that use phenomena such as phase transition caused by a change in solubility in water accompanying a temperature change, using a polymer exhibiting a representative lower critical solution temperature (LCST). .
  • the former is difficult to be a practical adsorbent because the recombinant protein is expensive and not highly durable.
  • an object of the present invention is to provide an adsorbent having high dispersibility and reversibility.
  • the adsorbent of the present invention includes a polymer material having a plurality of functional groups that can be ionized in water, not exhibiting a lower critical solution temperature, an adsorption site capable of interacting with a target substance, and a carrier.
  • the ionization rate of the polymer material changes due to changes in the external environment.
  • the adsorbent of the present invention uses a change in the ionization rate of the polymer material due to a change in the external environment for adsorption / desorption of the target substance without using a phenomenon such as phase transition caused by a change in solubility in water.
  • the adsorbent of the present invention does not use genetically modified protein, it can be manufactured at low cost.
  • the adsorbent of the present invention is easy to handle because of its low temperature dependence of dispersibility in water, and has little hysteresis because it does not utilize changes in polymer solubility.
  • deterioration during purification of the target substance can be suppressed, and the neutralization step after purification can be omitted.
  • FIG. 1 is a schematic view of an adsorbent in which a polymer material and an adsorption site are bonded.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of an adsorbent in which a polymer material and an adsorption site are not bonded and are separately immobilized on a carrier at different positions.
  • FIG. 3 is a graph showing measurement results of changes in the ionization rate of the adsorbent when the temperature is raised from 4 ° C. to 37 ° C. in the examples.
  • FIG. 4 is a diagram showing measurement results of changes in the ionization rate of the adsorbent when the temperature is lowered from 37 ° C. to 4 ° C. in the examples.
  • FIG. 5 is a schematic view of a problem when a conventional adsorbent that uses the change in solubility of a polymer is used.
  • the adsorbent of the present invention comprises a polymer material having a plurality of functional groups that can be ionized in water (hereinafter also simply referred to as polymer material), an adsorption site capable of interacting with a target substance, and a carrier. Since the adsorbent of the present invention includes these components, the ionization rate of the polymer material changes due to a change in the external environment, and the target substance is adsorbed or desorbed due to the change in the ionization rate.
  • FIGS. 1 and 2 are schematic views of the adsorbent. As shown in FIGS. 1 and 2, the adsorbent 10 or the adsorbent 20 interacts with the target material 5 and the polymer material 1 having a plurality of functional groups 2 that can be ionized in water on the polymer main chain 3. A possible adsorption site 4 and a carrier 6 are provided.
  • the polymer material and the adsorption site may be bonded, or they may be separately immobilized on the carrier without bonding.
  • FIG. 1 is a schematic view of an adsorbent in which a polymer material and an adsorption site are bonded.
  • the adsorption site 4 that adsorbs the target substance 5 is bonded to the polymer material 1 having a plurality of functional groups 2 that can be ionized in water.
  • the polymer material 1 to which the adsorption site 4 is bonded is fixed to the carrier 6.
  • FIG. 2 is a schematic view of an adsorbent in which the polymer material and the adsorption site are not bonded and are separately immobilized on the carrier at different positions.
  • the adsorption site 4 that adsorbs the target substance 5 is not bonded to the polymer material 1 having a plurality of functional groups 2 that can be ionized in water.
  • the adsorption site 4 is separately immobilized on the carrier 6 at different positions.
  • the adsorbent of the present invention includes the above-described components, and in particular, the polymer material has a plurality of functional groups that can be ionized in water, so that the ionization rate of the polymer material changes due to a change in the external environment.
  • the ionization rate of the polymer material changes, the surrounding environment of the adsorption site that interacts with the target substance changes, and as a result, the strength of the interaction between the target substance and the adsorption site changes, Adsorb or desorb.
  • the polymer material has a plurality of functional groups that can be ionized in water and does not exhibit a lower critical solution temperature (LCST). Therefore, the polymer material is hydrophilic in both a high and low ionization rate, but has a high ionization rate. It is more hydrophilic in the state and more hydrophobic in the low ionization state.
  • the ionization rate of the polymer material is high, the functional groups that can be ionized in water are more ionized, and the polymer main chain becomes relatively elongated due to the charge repulsion between the ionized sites.
  • the ionization rate is low, charge repulsion is small, so that the polymer main chain is likely to be relatively contracted.
  • the presumed adsorption / desorption mechanism of the adsorbent in which the polymer material and the adsorption site are bonded will be described below.
  • the ionization rate of the polymer material is higher, functional groups that can be ionized in water are more ionized, and the polymer main chain of the polymer material is relatively less due to the charge repulsion between the ionized sites. It is in a stretched state.
  • the adsorption site is hydrophobic, the interaction between the hydrophilic polymer material and the hydrophobic adsorption site is relatively weak, so that the target substance is adsorbed on the adsorption site (the left figure in FIG. 1). .
  • the ionization rate of the polymer material decreases due to changes in the external environment, the hydrophobicity of the polymer material increases. Therefore, when the adsorption site is hydrophobic, the interaction between the polymer material and the adsorption site becomes stronger. As a result, the adsorption of the adsorption site and the target substance is weakened, and the target substance is desorbed from the adsorption site (right diagram in FIG. 1). When the ionization rate of the polymer material is lowered, the polymer main chain of the polymer material is in a relatively contracted state due to a small charge repulsion.
  • the presumed adsorption / desorption mechanism of the adsorbent in which the polymer material is not bonded to the adsorption site and is separately immobilized on the carrier at different positions will be described below.
  • the ionization rate of the polymer material is higher, the polymer main chain of the polymer material is in a relatively elongated state due to charge repulsion between ionized sites.
  • the target substance is desorbed from the adsorption site (the right figure in FIG. 2).
  • the adsorbent of the present invention maintains its dispersibility in water because the polymer material does not become hydrophobic even when the ionization rate of the polymer material decreases due to a change in the external environment. Hysteresis is small because no change in solubility is used. Therefore, the adsorbent of the present invention is superior in dispersibility and reversibility compared to conventional adsorbents that utilize changes in solubility accompanying temperature changes, and is also handled during manufacture, transportation, and filling of adsorbents. Is also easy.
  • the change in the external environment is not particularly limited as long as the ionization rate of the polymer material can be changed.
  • ⁇ H is also affected by the polarity of the solvent molecules, the degree of ionization, and the like, as the change in the external environment, in addition to the temperature change, for example, the salt concentration, dielectric constant, and pH of the solution in contact with the adsorbent And the like.
  • the salt concentration is changed, the electrostatic shielding effect is changed, the dielectric constant is changed by the change of the kind of the solvent or the solute, and when the pH is changed, the ionization equilibrium shift occurs, thereby changing the ionization rate.
  • the change in the external environment is preferably a change in the temperature, salt concentration, dielectric constant and pH of the solution in contact with the adsorbent, and a change in temperature is more preferable.
  • the adsorbent of the present invention is an adsorbent that is responsive to a change in the external environment. If the change is a temperature change, the adsorbent becomes a temperature-responsive adsorbent, and if the change in the external environment is a change in salt concentration, dielectric constant, or pH, the salt concentration responsiveness, dielectric constant response, respectively. Or pH responsive adsorbent.
  • the ionization rate of the polymer material can be monitored by, for example, monitoring the characteristics (eg, pH) of the solution eluted from the column when the external environment is changed while the buffer solution is passed through the column filled with the adsorbent. Can be obtained.
  • a change in the external environment is a temperature change (that is, the ionization rate of the polymer material is temperature-dependent), and functional groups such as amino groups that ionize by capturing protons from the neutral state
  • the ionization rate is reduced due to temperature change in the polymer material having ionizable functional groups, the amount of protons captured by the polymer material is reduced by changing the column temperature.
  • the proton concentration in the buffer increases.
  • the change in the ionization rate of the polymer material due to the change in the external environment may be a change that can change the adsorption property by changing the strength of the interaction between the target substance and the adsorption site. This is because, for example, in the ionization rate measurement method using a column packed with an adsorbent, it is sufficient if there is a region where the pH of the solution eluted from the column changes by 0.7 or more with respect to changes in the external environment. It is.
  • the target substance is not particularly limited as long as it is a substance that can be adsorbed to the adsorption site, and examples thereof include proteins, biomolecules, cells, viruses, and nanoparticles.
  • the target substance may be an antibody. From the viewpoint of utilizing the characteristics of the adsorbent of the present invention, those that are unstable under severe pH conditions are preferred.
  • the adsorption site can be selected according to the target substance adsorbed on the adsorption site.
  • the adsorption site is preferably susceptible to a change in physical properties due to the change in the ionization rate of the polymer material, Hydrophobic adsorption sites are preferred for hydrophilic polymer materials.
  • part is a magnitude
  • the adsorption site is hydrophobic and has a size approximately equal to or smaller than the molecular size of the polymer material.
  • the adsorption site may have a functional group that can be ionized in water.
  • the functional group that can be ionized in the water that the adsorption site has It does not become a functional group that can be ionized in water of the polymer material. That is, the polymer material has a functional group that can be ionized in water separately from the functional group that can be ionized in water that the adsorption site has.
  • the adsorption site is not particularly limited, and examples thereof include peptides, proteins, sulfide group-containing (heterocyclic) aromatic compounds, vitamins, dyes, saccharides, sugar chain-binding molecules, thiophilic ligands, boronic acids, antigens, and the like. Examples include antigen partial structures, enzyme substrates, antibodies, and antibody partial structures.
  • the adsorption site may have a portion derived from these substances. Examples of peptides and proteins include those having a histidine tag, glutathione, lectin, and RGD sequence. Peptides and proteins may be these partial structures or mimetic molecules.
  • Examples of the peptide or protein partial structure or mimetic molecule include a protein A partial structure or mimetic molecule, a protein G partial structure or mimetic molecule, a protein L partial structure or mimetic molecule, and the like. , Protein A mimetic molecule ApA, protein A mimetic molecule 22/8, protein G mimetic molecule A2C7I1, and the like.
  • Examples of the sulfide group-containing (heterocyclic) aromatic compound include mercaptopyridine, mercaptoethylpyridine, and (3-thia-5-pyridylpentyl) vinylsulfone.
  • vitamins include biotin.
  • the dye examples include rhodamine, cibacron blue, and mimetic blue.
  • Preferred adsorption sites are a protein A partial structure or mimetic molecule, a protein G partial structure or mimetic molecule, a protein L partial structure or mimetic molecule, a sugar chain binding molecule, a thiophilic ligand and an antigen or antigen partial structure.
  • Preferred combinations of the target substance and the adsorption site include, for example, a combination of an antibody and a protein A partial structure or mimetic molecule, or a sulfide group-containing (heterocyclic) aromatic compound, or a protein and a dye or vitamin. Combinations are listed.
  • the adsorption of the target substance to the adsorption site may be either a chemical bond or a physical bond, or a multipoint bond.
  • a chemical bond for example, hydrogen bond, hydrophobic interaction, ⁇ - ⁇ interaction, dipole-dipole interaction, charge-dipole interaction, charge-charge interaction, charge transfer interaction, van der Waals bond, anchor effect, etc.
  • a reversible bond is formed by an appropriate interaction or a combination thereof.
  • the functional group that can be ionized in water is not particularly limited as long as the functional group can be ionized in water. However, it is preferably 17.7 or less higher than 15.7 which is the pKa of water and less than oxo in water.
  • This is a functional group that produces a conjugate acid or conjugate base of pKa that is -3.7 or lower, which is 2 lower than the pKa of -1.7.
  • the functional group that can be ionized in water preferably includes a functional group having a pKa of ⁇ 3.7 to 17.7, or a pKa of a conjugate acid or conjugate base thereof of ⁇ 3.7 to 17. Contains functional groups that are 7 or less.
  • the functional group that can be ionized in water is sufficient if at least a part of the functional group or its conjugate acid or conjugate base has the pKa.
  • the actual pKa when a functional group that can be ionized in water is present in the polymer material may be different from the pKa when the functional group that can be ionized in water is present alone in water. This is because the presence of a plurality of functional groups that can be ionized in water in the polymer material may cause an interaction between them.
  • the appropriate range of the pKa of a functional group that can be ionized in water or its conjugate acid or base varies depending on the pH when the adsorbent is used.
  • the pH range in which the adsorbent of the present invention can be used is sufficiently wide.
  • the functional group that can be ionized in water is not particularly limited.
  • an amino group primary amino group, secondary amino group, tertiary amino group
  • imino group various nitrogen-containing aromatic groups (pyrrole group, Imidazolyl group, pyridyl group, pyrimidyl group, oxazolyl group, thiazolyl group and triazolyl group), guanidyl group, phenolic hydroxyl group, carboxyl group, boronic acid group, phosphoryl group, phosphinyl group, silicate group and their derivatives
  • An amino group, an imino group, a nitrogen-containing aromatic group, a guanidyl group, a phenolic hydroxyl group, a carboxyl group, a boronic acid group and a phosphoryl group are preferred, and an amino group and an imino group are particularly preferred.
  • pKa may change greatly due to their interaction and may be outside the appropriate pKa range. Is preferred.
  • the polymer material having a plurality of functional groups that can be ionized in water is not particularly limited as long as it has a plurality of functional groups that can be ionized.
  • the polymeric material may be a dendrimer.
  • the polymer material include polylysine ( ⁇ -polylysine, ⁇ -polylysine), linear polyethyleneimine, branched polyethyleneimine, polyvinylamine, chitosan, polyamidoamine dendrimer, polypropyleneimine dendrimer, polylysine dendrimer, polyglutamic acid, polyaspartic acid , Polyacrylic acid, polymethacrylic acid, carboxymethylcellulose, alginic acid, polyphosphoric acid, polyphosphoric acid ester, polysilicic acid, polysiloxane and derivatives thereof, and derivatives and copolymers having these as a partial structure.
  • the polymer material is preferably polylysine, a dendrimer having a plurality of amino groups, a dendrimer having a plurality of imino groups, polyethyleneimine, polyallylamine, or a material containing them as a partial structure.
  • Polylysine and polyallylamine have an amino group as a functional group that can be ionized in water
  • polyethyleneimine has an imino group as a functional group that can be ionized in water.
  • a polymer material having a plurality of functional groups that can be ionized in water does not exhibit a lower critical solution temperature (LCST). Therefore, the polymer material of the present invention does not change phase with temperature change.
  • the polymer material is preferably hydrophilic.
  • the adsorbent of the present invention does not utilize the change in solubility of the polymer material because the polymer material does not exhibit LCST, and therefore does not adsorb or desorb the target substance by phase change.
  • the adsorbent of the present invention is superior in terms of dispersibility and reversibility of response compared to a conventional adsorbent using a temperature-responsive polymer exhibiting LCST.
  • the carrier may be either porous or non-porous.
  • Examples of the shape of the carrier include plate shapes, bead shapes, fiber shapes such as nonwoven fabrics and woven fabrics, membrane shapes, monolith shapes, and hollow fiber shapes.
  • the carrier has materials including, for example, polysaccharides, synthetic resins, inorganic compounds, and composite materials thereof.
  • the polysaccharide may be a cross-linked polysaccharide.
  • the carrier may have these materials at least on the surface of the carrier.
  • polysaccharides or cross-linked polysaccharides include agarose, cross-linked agarose, hydrophobized agarose, and cellulose.
  • the synthetic resin include polystyrene, polyalkyl methacrylate, polyglycidyl methacrylate, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylamide, polysiloxane, and polyfluorinated ethylene.
  • inorganic compounds include silica, metal oxides (for example, alumina, titania, zirconia, iron oxide, etc.), ferrite, hydroxyapatite, and silicate.
  • the carrier or its surface preferably has polysaccharides, cross-linked polysaccharides, polystyrene, silica or metal oxides, particularly preferably polysaccharides or cross-linked polysaccharides.
  • the carrier surface may be modified with a reactive group such as a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, an epoxy group, or an ester group. Further, the carrier surface may be modified with a compound other than the adsorption site and the polymer material. For example, the carrier surface can be blocked to prevent nonspecific adsorption of the target substance, surface modification to control the orientation of the adsorption site or polymer material, or modification to improve the dispersibility or adsorption of the carrier. It may be done.
  • a reactive group such as a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, an epoxy group, or an ester group.
  • the carrier surface may be modified with a compound other than the adsorption site and the polymer material.
  • the carrier surface can be blocked to prevent nonspecific adsorption of the target substance, surface modification to control the orientation of the adsorption site or polymer material, or modification to improve the dispersibility or adsorption of the carrier. It may be done.
  • the adsorbent of the present invention can be produced by chemically bonding a polymer material or a polymer material and an adsorption site to a carrier.
  • the chemical bond between the polymer material and the carrier may be formed using, for example, an ionizable functional group in the polymer material.
  • combinations of functional groups on the surface of the carrier that form chemical bonds and functional groups that can be ionized include, for example, epoxy groups and amino groups, ester groups (for example, NHS esters of carboxylic acids), amino groups, amino groups, and the like. Examples include a combination of a group and a carboxyl group.
  • the chemical bond can be formed by bringing a polymer material solution into contact with the carrier. When a chemical bond is formed by a condensation reaction (for example, when an amino group and a carboxyl group are used), the reaction is preferably performed in the presence of a condensing agent (for example, DMT-MM).
  • a condensing agent for example, DMT-MM
  • the bond between the polymer material and the adsorption site may be formed either before or after the polymer material is immobilized on the carrier.
  • the polymer material and the adsorption site may be combined, and then the polymer material to which the adsorption site is bonded may be immobilized on the carrier, or after the polymer material having no adsorption site is immobilized on the carrier.
  • the solidified polymer material and the adsorption site may be combined.
  • the adsorbent in which the polymer material and the adsorption site are not bonded and is separately immobilized on the carrier at different positions is obtained by immobilizing the polymer material and the adsorption site separately on the carrier.
  • the polymer material can be immobilized on the carrier in the same manner as described above.
  • the adsorption site can be immobilized on the carrier by, for example, bonding the adsorption site and the carrier by chemical bonding.
  • the order of immobilization of the polymer material and the carrier is not particularly limited, but it is preferable to immobilize the adsorption site on the carrier first.
  • the present invention also relates to a method for purifying a target substance using the adsorbent.
  • the method for purifying a target substance includes a step of bringing a solution containing the target substance into contact with the adsorbent, and then a step of applying a change in the external environment.
  • the target substance can be purified by adsorbing the target substance to the adsorbent, or the target substance can be purified by adsorbing the unnecessary substance as the target substance to the adsorbent.
  • the cells can be purified using the target substance as an unnecessary molecule on the cell membrane, and the virus or nanoparticle can be purified using the target substance as an unnecessary molecule on the surface of the virus or nanoparticle.
  • the target substance in the solution is adsorbed on the adsorbent.
  • Adsorption of the target substance to the adsorbent can be achieved by appropriately setting the ionization rate of the polymer material so that the adsorption site and the target substance are adsorbed.
  • the target substance in an adsorbent in which a polymer material and an adsorption site are bonded, the target substance can be preferably adsorbed on the adsorption site by increasing the ionization rate.
  • the target substance is preferably adsorbed by lowering the ionization rate. Can be absorbed.
  • the temperature of the solution containing the target substance can be appropriately selected so that the target substance is adsorbed on the adsorbent, but the target substance is preferably within a stable range, and more preferably lower within that range.
  • the temperature of the solution is preferably lower for adsorption within a range where the target substance is stable, for example, 4 ° C.
  • the higher the solution temperature is within the stable range of the target substance For example, it is set to 37 ° C.
  • the solution containing the target substance is preferably a buffer solution using water as a solvent.
  • the pH at which the solution containing the target substance is brought into contact with the adsorbent can be selected depending on the physical properties of the target substance, the adsorption site, and the polymer material, but a pH that is advantageous for the adsorption of the target substance can be selected. desirable.
  • the polymer material has a plurality of functional groups that can be ionized in water.
  • the ionization rate of the polymer material changes, and the target is changed from the adsorbent to the target. Material desorbs.
  • the change of the external environment the above change can be used, for example, the change of the temperature, salt concentration, dielectric constant (type of solute and solvent) or pH of the solution in contact with the adsorbent.
  • the target substance purification method is performed using a column packed with an adsorbent.
  • adsorbent In conventional temperature-responsive adsorbents using changes in solubility, hydrophobicity increases and dispersibility decreases due to temperature changes, the affinity with water changes greatly, the column flow path changes, Although there is a risk that cracks and gaps with the wall surface will occur, the adsorbent of the present invention does not use the change in solubility accompanying temperature change for adsorption or desorption of the target substance, so such risk is Few.
  • the purification method using a column packed with the adsorbent of the present invention is preferably applied to an object in which decomposition or aggregate formation occurs at a low pH from the viewpoint of utilizing the characteristics. Further, since the eluted target substance is obtained in a state of being dissolved in a buffer solution in a pH range close to neutrality, it can be applied to the next purification process without requiring a neutralization step.
  • the method for purifying a target substance is performed using the adsorbent in a suspension state.
  • adsorbent in conventional temperature-responsive adsorbents using changes in solubility, hydrophobicity increases and dispersibility decreases due to temperature changes, and suspended adsorbents aggregate, adhere to wall surfaces, and localize at interfaces.
  • the adsorbent of the present invention does not utilize the change in solubility accompanying the change in temperature for the adsorption or desorption of the target substance, there is almost no such risk.
  • Polyamine was used as a polymer material having a plurality of functional groups that can be ionized in water.
  • the target substance was a human IgG antibody
  • ⁇ -polylysine (EPL) was used as the polymer material
  • the adsorption site was (4-hydroxyphenylethylamino) (phenylamino) triazine (ApA).
  • ApA is a protein A mimetic molecule having antibody adsorption ability.
  • Example 1 A 0.1% by weight solution of the obtained polymer 1 is prepared, this is added to a cross-linked agarose carrier having NHS ester groups on the surface, and the resulting suspension is shaken at room temperature overnight. Thus, an adsorbent of Example 1 in which was immobilized on a carrier was obtained.
  • the target substance is a human IgG antibody
  • EPL is used as the polymer material
  • the adsorption site is (3-thia-5-pyridylpentyl) sulfonyl derived from (3-thia-5-pyridylpentyl) vinylsulfone (MEP-DVS).
  • MEP-DVS (3-thia-5-pyridylpentyl) vinylsulfone
  • MEP-DVS (3-thia-5-pyridylpentyl) vinylsulfone
  • a solution of MEP-DVS (0.7 equivalent) in THF was added to a water / THF solution of EPL, and the mixture was stirred at room temperature for 12 hours, whereby (3-thia-5-pyridylpentyl) sulfonylethyl derived from MEP-DVS was added to EPL. Part was introduced. Hydrochloric acid was added to the resulting reaction solution to make it acidic, dialyzed with water, and the resulting precipitate was filtered off and lyophilized to obtain polymer 2 as a solid.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, an adsorbent of Example 2 in which polymer 2 was immobilized on a carrier was obtained.
  • Example 3-6 The adsorbent of Example 3-6 was obtained using a combination of various polymer materials and adsorption sites. Specifically, the polymer material shown in Table 1 and a compound for forming an adsorption site (1 to 20 equivalents) are mixed and reacted under predetermined conditions to synthesize polymer 3-6. Each polymer obtained was immobilized on a carrier in the same manner as in Example 1 to obtain an adsorbent of Example 3-6.
  • Example 7 EPL was used as the polymer material, and the adsorption site was ApA. Similar to the immobilization of polymer 1 on the carrier in Example 1, ApA was immobilized on a cross-linked agarose carrier having an NHS ester group on the surface, and then EPL was immobilized on the carrier, so that APA and EPL were separated separately. The adsorbent of Example 7 immobilized on a carrier was obtained.
  • Comparative Example 2 in which protein A mimetic molecule 22/8 was introduced into a carrier by allowing a DMF solution of a chlorotriazine derivative, which is a raw material of protein A mimetic molecule 22/8, to act on a crosslinked agarose carrier having an amino group on the surface An adsorbent was obtained.
  • ⁇ Comparative example 4> A 0.1% by weight solution of polyamidoamine dendrimer was added to a cross-linked agarose carrier having NHS ester groups on the surface, and the resulting suspension was shaken overnight at room temperature to immobilize the polyamidoamine dendrimer on the carrier. The adsorbent of Comparative Example 4 was obtained.
  • Table 1 shows polymer materials, adsorption sites and preferred target substances for the adsorbents of Example 1-7 and Comparative Example 1-5.
  • the introduced adsorption site or the raw material compound used for introduction of the adsorption site is described.
  • Example 1 For the adsorbents of Example 1-7 and Comparative Example 1-5, the change in ionization rate with temperature change was measured.
  • Each adsorbent is packed in a column (inner diameter 5 mm, length 50 mm), placed in a constant temperature bath at 4 ° C., and PBS buffer (5 mM) is passed at a flow rate of 0.5 mL / min to 4 ° C. To stabilize the column. Thereafter, the column was placed in a constant temperature bath at 37 ° C. while maintaining this flow rate (0.5 mL / min), and the pH of the solution eluted from the column was monitored.
  • FIG. 3 shows the measurement results of the change in the ionization rate of the adsorbent when the temperature is raised from 4 ° C. to 37 ° C. for the adsorbents of Examples 1 and 2 and Comparative Examples 3 and 5.
  • FIG. 4 shows the measurement results of changes in the ionization rate of the adsorbent when the temperature is lowered from 37 ° C. to 4 ° C. for the adsorbents of Examples 1 and 2 and Comparative Examples 3 and 5.
  • the adsorbent of Comparative Example 3 shows a small change in pH of the solution eluted from the column with temperature change
  • the adsorbent of Comparative Example 5 shows no change in pH of the solution eluted from the column. I could't.
  • the pH change of the solution eluted from the column with the temperature change is large, and the ionization rate is large with the temperature change. It was shown to change.
  • the adsorbent of Example 3-7 is also similar to the adsorbents of Examples 1 and 2, compared to the adsorbent of Comparative Example, the pH of the solution eluted from the column with temperature change. The change was large, and the ionization rate changed greatly with the temperature change. Therefore, it was shown that by using a polymer material having a plurality of functional groups that can be ionized in water, the ionization rate of the polymer material changes greatly with temperature change.
  • Example 2 From Table 2, in Test Example 1, the adsorbents of Examples 1, 2, 4, 6 and 7 in which a large change in the ionization rate of the polymer material with changes in temperature was observed were those in Comparative Examples 2, 3 and 5. Compared with the adsorbent, the desorption rate was high, showing excellent adsorption characteristics, and the temperature dependence of the adsorption characteristics was observed. In the adsorbents of Examples 1, 2, 4 and 6 in which the polymer material and the adsorption site are bonded, the target substance is desorbed when the temperature is raised, whereas the polymer material and the adsorption site are separately attached to the carrier. The immobilized adsorbent of Example 7 showed that the target substance was desorbed when the temperature was lowered.
  • a PBS buffer solution pH 5 or 30 mM, sodium chloride 37.5 mM
  • 1 wt% of a predetermined target substance at 4 ° C. or 37 ° C. is added twice the volume of the beads.
  • the supernatant solution was analyzed by GPC to quantify the decrease in concentration, thereby calculating the adsorption capacity of the adsorbent.
  • the results of Examples 1 and 2 and Comparative Examples 2, 3, and 5 are shown in Table 3.
  • Adsorbent 20 Adsorbent 1 Polymer material 2 Functional group that can be ionized in water 3 Polymer main chain 4 Adsorption site 5 Target substance 6 Carrier All publications, patents, and patent applications cited in this specification are incorporated herein by reference. It is incorporated herein.

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Abstract

本発明は、高い分散性および可逆性を有する吸着材を提供することを目的とする。　水中でイオン化し得る官能基を複数有する、下限臨界溶解温度を示さない高分子材料と、標的物質と相互作用可能な吸着部位と、担体とを備えることを特徴とする吸着材。

Description

吸着材
　本発明は、吸着材およびそれを用いた精製方法に関する。
　タンパクのような生体分子を標的物質としたアフィニティ精製は、アフィニティ吸着材への標的物質の吸着、非吸着成分の洗浄、溶離液による標的物質の吸着材からの脱離の工程からなる。このとき、溶離液としては、しばしば強酸や強塩基のような過酷なｐＨの溶液を用いる。これは、アフィニティリガンドや標的物質のイオン化状態を変え、電荷反発によりアフィニティリガンドと標的物質の間の相互作用を弱める必要があるためである。しかし、強酸や強塩基のような過酷なｐＨ環境では、しばしば生体分子は不安定であり、精製された標的物質が劣化するリスクがある。このようなリスクを回避するため、温和なｐＨ環境にてｐＨを変化させることなく標的物質を精製可能な温度応答性アフィニティ吸着材が開発されている。
　このような温度応答性アフィニティ吸着材としては、リガンドとして、遺伝子組換えによって熱安定性を低下させたタンパクを用いる手法（特許文献１、２）や、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）に代表される下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を示すポリマーを用いて、温度変化に伴う水に対する溶解性の変化により起こる相転移等の現象を利用する手法（特許文献３、４）が報告されている。
　しかし、前者は、遺伝子組換えタンパクが高価であることや耐久性が高くないことから実用的な吸着材とはなりにくい。
　また、後者は、価格や耐久性の課題は解決されているものの、ＬＣＳＴ以上の温度ではポリマーの水に対する親和性が大幅に低下するため、吸着材の水中での分散性が極端に低下し取り扱いにくいこと、吸着材を充填したカラム中で、溶液が通過する流路が大きく変化し得、また、クラックや壁面との隙間が発生するリスクがあることや、しばしば温度変化に対してヒステリシスが大きいこと等により、分散性および応答の可逆性に問題があり、実用的な吸着材とはなりにくい（図５参照）。
国際公開第２００８／１４３１９９号 国際公開第２０１４／００３１７６号 特開平７－１３６５０５号公報 特表２００３－５２４６８０号公報
　前記の通り、ＬＣＳＴを示すポリマーを用いた従来の吸着材は、遺伝子組換えタンパクを用いた吸着材で問題となる価格および耐久性の面では優れるものの、分散性および応答の可逆性に問題がある。よって、本発明は、高い分散性および可逆性を有する吸着材を提供することを目的とする。
　前記課題を解決するために、本発明の吸着材は、水中でイオン化し得る官能基を複数有する、下限臨界溶解温度を示さない高分子材料と、標的物質と相互作用可能な吸着部位と、担体とを備えることを特徴とし、これらの成分を備えることによって、外部環境の変化によって高分子材料のイオン化率が変化する。本発明の吸着材は、水への溶解性の変化により起こる相転移等の現象を用いず、外部環境の変化による高分子材料のイオン化率の変化を標的物質の吸着・脱着に利用する。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-162834号の開示内容を包含する。
　本発明の吸着材は、遺伝子組換えタンパクを用いないため、安価に製造可能である。本発明の吸着材は、水中での分散性の温度依存性が小さいため、取り扱いが容易であり、また、ポリマーの溶解性の変化を利用していないため、ヒステリシスが小さい。本発明の標的物質の精製方法は、標的物質の精製中の劣化を抑制可能であり、精製後の中和工程を省略することも可能である。
　前記した以外の課題、構成および効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
図１は、高分子材料と吸着部位が結合している吸着材の模式図である。 図２は、高分子材料と吸着部位が結合しておらず、異なる位置で別々に担体に固定化されている吸着材の模式図である。 図３は、実施例における、４℃から３７℃に昇温した際の吸着材のイオン化率の変化の測定結果を示す図である。 図４は、実施例における、３７℃から４℃に降温した際の吸着材のイオン化率の変化の測定結果を示す図である。 図５は、ポリマーの溶解性の変化を利用する従来の吸着材を用いた際の課題の模式図である。
　以下、図面等を用いて、本発明の実施形態について説明する。以下の説明は本発明の内容の具体例を示すものであり、本発明がこれらの説明に限定されるものではなく、本明細書に開示される技術的思想の範囲内において当業者による様々な変更および修正が可能である。また、本発明を説明するための全図において、同一の機能を有するものは、同一の符号を付け、その繰り返しの説明は省略する場合がある。
　本発明の吸着材は、水中でイオン化し得る官能基を複数有する高分子材料（以下、単に高分子材料とも記載する）と、標的物質と相互作用可能な吸着部位と、担体とを備える。本発明の吸着材は、これらの成分を備えることによって、外部環境の変化によって高分子材料のイオン化率が変化し、このイオン化率の変化により標的物質を吸着または脱着する。
　図１および図２に吸着材の模式図を示す。図１および図２に示すように、吸着材１０または吸着材２０は、高分子主鎖３上に、水中でイオン化し得る官能基２を複数有する高分子材料１と、標的物質５と相互作用可能な吸着部位４と、担体６とを備える。
　高分子材料と吸着部位は結合していてもよく、または、これらは結合せずに別々に担体に固定化されていてもよい。
　一実施形態において、高分子材料と吸着部位は結合している。図１は、高分子材料と吸着部位が結合している吸着材の模式図を示す。図１に示すように、吸着材１０において、標的物質５を吸着する吸着部位４は、水中でイオン化し得る官能基２を複数有する高分子材料１に結合している。吸着部位４が結合した高分子材料１は担体６に固定化されている。
　別の実施形態において、高分子材料と吸着部位は結合しておらず、異なる位置で別々に担体に固定化されている。図２は、高分子材料と吸着部位が結合しておらず、異なる位置で別々に担体に固定化されている吸着材の模式図を示す。図２に示すように、吸着材２０において、標的物質５を吸着する吸着部位４は、水中でイオン化し得る官能基２を複数有する高分子材料１と結合しておらず、高分子材料１および吸着部位４は、異なる位置で別々に担体６に固定化されている。
　本発明の吸着材は、前記の成分を備えることにより、特に、高分子材料が水中でイオン化し得る官能基を複数有することにより、外部環境の変化によって高分子材料のイオン化率が変化する。そして、高分子材料のイオン化率が変化することで、標的物質と相互作用する吸着部位の周辺環境が変化し、その結果、標的物質と吸着部位の相互作用の強さが変化し、標的物質が吸着または脱着する。
　より詳細には、高分子材料のイオン化率が変化すると、高分子材料全体の親水性やコンフォメーションが変化すると考えられる。高分子材料は、水中でイオン化し得る官能基を複数有しており、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を示さないため、イオン化率が高い状態でも低い状態でも親水性であるが、イオン化率が高い状態ではより親水性であり、イオン化率が低い状態ではより疎水性である。高分子材料のイオン化率が高い状態では、水中でイオン化し得る官能基はよりイオン化された状態であり、このイオン化された部位どうしの電荷反発により、高分子主鎖は比較的伸長した状態になりやすく、一方、イオン化率が低い状態では、電荷反発が小さいため、高分子主鎖は比較的収縮した状態になりやすい。
　高分子材料と吸着部位が結合している吸着材（図１参照）の推定される吸着・脱着メカニズムを以下に説明する。高分子材料のイオン化率がより高い状態では、水中でイオン化し得る官能基はよりイオン化された状態であり、このイオン化された部位どうしの電荷反発により、高分子材料の高分子主鎖は比較的伸長した状態になっている。このとき、吸着部位が疎水性の場合、親水性の高分子材料と疎水性の吸着部位との相互作用は比較的弱いため、標的物質は吸着部位に吸着している（図１の左図）。そして、外部環境の変化によって、高分子材料のイオン化率が低下すると、高分子材料の疎水性が増大するため、吸着部位が疎水性の場合、高分子材料と吸着部位の相互作用が強くなる方向に平衡が移動し、結果として吸着部位と標的物質の吸着が弱くなり、標的物質が吸着部位から脱着する（図１の右図）。高分子材料のイオン化率が低下した状態では、高分子材料の高分子主鎖は、電荷反発が小さいため比較的収縮した状態になっている。
　高分子材料と吸着部位が結合しておらず、異なる位置で別々に担体に固定化されている吸着材（図２参照）の推定される吸着・脱着メカニズムを以下に説明する。高分子材料のイオン化率がより高い状態では、イオン化された部位どうしの電荷反発により、高分子材料の高分子主鎖は比較的伸長した状態になっている。このとき、高分子材料が担体表面において占める排除体積がより大きいため、標的物質は吸着部位から脱着している（図２の右図）。そして、外部環境の変化によって、高分子材料のイオン化率が低下すると、高分子材料の周辺の水和水の量が減少し、高分子材料が担体表面において占める排除体積が小さくなり、担体表面に存在する吸着部位への溶質のアクセスがしやすくなる方向に平衡が移動し、結果として吸着部位と標的物質が吸着する（図２の左図）。
　本発明の吸着材は、外部環境の変化によって高分子材料のイオン化率が低下しても、高分子材料が疎水性にはならないため、水中での分散性が保たれ、また、高分子材料の溶解性の変化を利用していないため、ヒステリシスが小さい。よって、本発明の吸着材は、温度変化に伴う溶解性の変化を利用する従来の吸着材と比較して分散性および可逆性に優れ、また、吸着材の製造・輸送・充填の際の取り扱いも容易である。
　外部環境の変化は、高分子材料のイオン化率を変化させることができるものであれば特に限定されない。ここで、水中でイオン化し得る官能基のイオン化率は、イオン化に関わる自由エネルギー（ΔＧ＝ΔＨ－ＴΔＳ）の温度依存性、すなわちイオン化に際するエントロピー変化（ΔＳ）の度合いに依存するところ、一般にΔＳ≠０であるため、イオン化率は温度によって変化する。すなわち、外部環境の変化は、例えば温度変化である。前記の式より、イオン化率は、通常、昇温に伴いイオン化率が低くなり、降温に伴いイオン化率が高くなる。また、ΔＨは溶媒分子の極性や電離度等からも影響されるため、外部環境の変化としては、温度変化以外にも、例えば、吸着材が接触している溶液の塩濃度、誘電率およびｐＨ等の変化が挙げられる。例えば、塩濃度が変化すると静電遮蔽効果が変化し、溶媒や溶質の種類の変化により誘電率が変化し、また、ｐＨが変化するとイオン化の平衡移動が起こり、これらによってイオン化率が変化する。外部環境の変化は、好ましくは、吸着材が接触している溶液の温度、塩濃度、誘電率およびｐＨの変化であり、温度変化がより好ましい。これらの外部環境の変化を組み合わせてもよい。外部環境の変化により高分子材料のイオン化率が変化して標的物質が吸着または脱着することから、本発明の吸着材は、外部環境の変化に応答性の吸着材であり、例えば、外部環境の変化が温度変化である場合には、吸着材は温度応答性吸着材となり、外部環境の変化が塩濃度、誘電率またはｐＨの変化である場合には、それぞれ、塩濃度応答性、誘電率応答性またはｐＨ応答性吸着材となる。
　高分子材料のイオン化率は、例えば、吸着材を充填したカラムに緩衝液を通液した状態で外部環境を変化させたときに、カラムから溶出される溶液の特性（例えばｐＨ）をモニタリングすることで求めることができる。例えば、外部環境の変化が温度変化であって（すなわち、高分子材料のイオン化率が温度依存性である）、中性状態からプロトンを捕捉することでイオン化するアミノ基のような官能基を水中でイオン化し得る官能基として有する高分子材料において、温度変化によってイオン化率が低下する場合には、カラムの温度を変化させることで高分子材料が捕捉しているプロトンの量が減り、それに伴って緩衝液中のプロトン濃度が上昇する。そのため、カラムから溶出する溶液のｐＨをモニタリングすれば、高分子材料が放出したプロトンの分だけｐＨが低下する領域が見られる。逆に、イオン化率が高くなる場合には、高分子材料が緩衝液からプロトンを奪うため、カラムから溶出する溶液のｐＨは上昇する領域が見られる。このような変化が見られる吸着材では、イオン化率の変化が温度依存性であることがわかる。なお、滴定、表面分析、元素分析等によって吸着材中の高分子材料の分子数が定量されれば、イオン化率の変化幅も定量可能となる。
　外部環境の変化による高分子材料のイオン化率の変化は、標的物質と吸着部位の相互作用の強さを変化させて、吸着特性を変化させることができる程度の変化であればよい。これは、例えば、吸着材を充填したカラムを用いる前記のイオン化率の測定方法において、外部環境の変化に対し、カラムから溶出される溶液のｐＨが０．７以上変化する領域が存在すれば十分である。
　標的物質は、吸着部位に吸着し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、タンパク、生体分子、細胞、ウイルスおよびナノ粒子等が挙げられる。標的物質は、抗体であってもよい。また、本発明の吸着材の特性を活かす観点からは、過酷なｐＨ条件で不安定なものが好適である。
　吸着部位は、吸着部位に吸着する標的物質に応じて選ぶことができる。本発明では、高分子材料のイオン化率の変化を利用して標的物質の吸着・脱着を制御するため、吸着部位は、高分子材料のイオン化率の変化による物性の変化を受けやすいことが好ましく、親水性の高分子材料に対して疎水性の吸着部位が好ましい。また、吸着部位は高分子材料の分子サイズに対して同等以下程度のサイズであることが好ましい。好ましくは、吸着部位は、疎水性であり、かつ高分子材料の分子サイズに対して同等以下程度のサイズのものである。なお、吸着部位は、水中でイオン化し得る官能基を有し得るが、この場合、高分子材料と吸着部位が結合している吸着材において、吸着部位が有する水中でイオン化し得る官能基は、高分子材料が有する水中でイオン化し得る官能基とはならない。すなわち、高分子材料は、吸着部位が有する水中でイオン化し得る官能基とは別に、水中でイオン化し得る官能基を有する。
　吸着部位としては、特に限定されずに、例えば、ペプチド、タンパク、スルフィド基含有（複素環式）芳香族化合物、ビタミン類、色素、糖類、糖鎖結合分子、チオフィリックリガンド、ボロン酸、抗原および抗原部分構造、酵素の基質、抗体および抗体部分構造等が挙げられる。吸着部位は、これらの物質に由来する部分を有していればよい。ペプチドおよびタンパクとしては、例えば、ヒスチジンタグ、グルタチオン、レクチンおよびＲＧＤ配列を有するもの等が挙げられる。ペプチドおよびタンパクは、これらの部分構造または模倣分子であってもよい。ペプチドまたはタンパクの部分構造または模倣分子としては、例えば、プロテインＡ部分構造または模倣分子、プロテインＧ部分構造または模倣分子、プロテインＬ部分構造または模倣分子等が挙げられ、これらの模倣分子としては、例えば、プロテインＡ模倣分子ＡｐＡ、プロテインＡ模倣分子２２／８およびプロテインＧ模倣分子Ａ２Ｃ７Ｉ１等が挙げられる。スルフィド基含有（複素環式）芳香族化合物としては、例えば、メルカプトピリジン、メルカプトエチルピリジンおよび（３－チア－５－ピリジルペンチル）ビニルスルホン等が挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビオチンが挙げられる。色素としては、例えば、ローダミン、シバクロンブルーおよびミメティックブルー等が挙げられる。好ましい吸着部位は、プロテインＡ部分構造または模倣分子、プロテインＧ部分構造または模倣分子、プロテインＬ部分構造または模倣分子、糖鎖結合分子、チオフィリックリガンドおよび抗原または抗原部分構造である。
　標的物質と吸着部位の好ましい組み合わせとしては、例えば、抗体と、プロテインＡ部分構造もしくは模倣分子、またはスルフィド基含有（複素環式）芳香族化合物との組み合わせや、タンパクと、色素またはビタミン類との組み合わせが挙げられる。
　吸着部位への標的物質の吸着は、化学的結合および物理的結合のいずれであってもよく、多点結合であってもよい。例えば、水素結合、疎水性相互作用、π－π相互作用、双極子－双極子相互作用、電荷－双極子相互作用、電荷－電荷相互作用、電荷移動相互作用、ファンデルワールス結合、アンカー効果等の適宜の相互作用や、これらの組み合わせによって可逆的な結合が形成される。
　高分子材料が有する水中でイオン化し得る官能基は、水中でイオン化し得るものであれば特に限定されないが、好ましくは、水のｐＫａである１５．７より２高い１７．７以下かつ水中におけるオキソニウムイオンのｐＫａである－１．７より２低い－３．７以上のｐＫａの官能基であるか、または、水のｐＫａである１５．７より２高い１７．７以下かつ水中におけるオキソニウムイオンのｐＫａである－１．７より２低い－３．７以上のｐＫａの共役酸もしくは共役塩基を生じる官能基である。すなわち、水中でイオン化し得る官能基は、好ましくは、ｐＫａが－３．７以上１７．７以下である官能基を含むか、またはその共役酸もしくは共役塩基のｐＫａが－３．７以上１７．７以下である官能基を含む。水中でイオン化し得る官能基は、該官能基またはその共役酸もしくは共役塩基の少なくとも一部が前記のｐＫａを有していればよい。なお、水中でイオン化し得る官能基が高分子材料中に存在するときの実際のｐＫａは、水中でイオン化し得る官能基が単独で水中に存在する際のｐＫａと異なる場合がある。これは、高分子材料中に水中でイオン化し得る官能基が複数存在することでそれらの間で相互作用が生じることがあるためである。
　水中でイオン化し得る官能基またはその共役酸もしくは共役塩基のｐＫａの適正な範囲は、吸着材を使用する際のｐＨによって異なる。ただし、高分子材料中の水中でイオン化し得る官能基の数を増やすことで、前記の相互作用によってｐＫａが変化する官能基が増え、広範なｐＫａ範囲の官能基を高分子材料中に含ませることができるため、本発明の吸着材を使用可能なｐＨ範囲は十分に広い。
　水中でイオン化し得る官能基としては、特に限定されずに、例えば、アミノ基（１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基）、イミノ基、各種含窒素芳香族基（ピロール基、イミダゾリル基、ピリジル基、ピリミジル基、オキサゾリル基、チアゾリル基およびトリアゾリル基等）、グアニジル基、フェノール性水酸基、カルボキシル基、ボロン酸基、ホスホリル基、ホスフィニル基、シリケート基およびそれらの誘導体の基等を用いることができ、アミノ基、イミノ基、含窒素芳香族基、グアニジル基、フェノール性水酸基、カルボキシル基、ボロン酸基およびホスホリル基が好ましく、アミノ基およびイミノ基が特に好ましい。水中でイオン化し得る官能基は、１種類のみを用いてもよいし、複数種類を用いてもよい。水中でイオン化し得る官能基として複数種類のものを用いる際には、それらの相互作用によってｐＫａが大きく変化し、適正なｐＫａ範囲から外れる可能性があるため、適宜前記のｐＫａ範囲に設定することが好ましい。
　水中でイオン化し得る官能基を複数有する高分子材料は、前記のイオン化し得る官能基を複数有するものであれば特に限定されない。高分子材料は、デンドリマーであってもよい。高分子材料としては、例えば、ポリリジン（α－ポリリジン、ε－ポリリジン）、直鎖ポリエチレンイミン、分岐ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、キトサン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリプロピレンイミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ポリリン酸、ポリリン酸エステル、ポリケイ酸、ポリシロキサンおよびそれらの誘導体、ならびにそれらを部分構造として有する誘導体および共重合体等が挙げられる。高分子材料としては、ポリリジン、アミノ基を複数有するデンドリマー、イミノ基を複数有するデンドリマー、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミンまたはそれらを部分構造として含むものが好ましい。なお、ポリリジンおよびポリアリルアミンは、水中でイオン化し得る官能基としてアミノ基を有し、また、ポリエチレンイミンは、水中でイオン化し得る官能基としてイミノ基を有する。
　水中でイオン化し得る官能基を複数有する高分子材料は、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を示さない。よって、本発明の高分子材料は、温度変化に伴って相変化するものではない。また、高分子材料は、好ましくは親水性である。本発明の吸着材は、高分子材料がＬＣＳＴを示さないため、高分子材料の溶解性の変化を利用するものではなく、よって、相変化によって標的物質を吸着または脱着させるものではない。本発明の吸着材は、ＬＣＳＴを示す温度応答性高分子を用いる従来の吸着材と比べて、分散性および応答の可逆性の面で優れる。
　担体は、多孔質および非多孔質のいずれの形状であってもよい。担体の形状としては、例えば、板状、ビーズ状、不織布や織物等の繊維状、膜状、モノリス状および中空糸状等が挙げられる。
　担体は、例えば、多糖類、合成樹脂、無機化合物およびそれらの複合材料を含む材料を有する。多糖類は、架橋された多糖類であってもよい。担体は、これらの材料を少なくとも担体表面に有していればよい。多糖類または架橋された多糖類としては、例えば、アガロース、架橋アガロース、疎水化アガロースおよびセルロース等が挙げられる。合成樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリアルキルメタクリレート、ポリグリシジルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリシロキサンおよびポリフッ化エチレン等が挙げられる。無機化合物としては、シリカ、金属酸化物（例えば、アルミナ、チタニア、ジルコニア、酸化鉄等）、フェライト、ハイドロキシアパタイトおよびシリケート等が挙げられる。担体またはその表面は、多糖類、架橋された多糖類、ポリスチレン、シリカまたは金属酸化物を有することが好ましく、多糖類または架橋された多糖類を有することが特に好ましい。
　担体表面は、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、エポキシ基、エステル基等の反応性基によって修飾されていてもよい。また、担体表面は、吸着部位および高分子材料以外の化合物によって修飾されていてもよい。例えば、担体表面は、標的物質の非特異的な吸着を防止するブロッキングや、吸着部位または高分子材料の配向性を制御する表面修飾や、担体の分散性または吸着性を改質する修飾等が行われていてもよい。
　本発明の吸着材は、高分子材料、または高分子材料および吸着部位を担体に化学結合することで製造できる。
　高分子材料と担体の化学結合は、例えば、高分子材料中のイオン化し得る官能基を用いて形成してもよい。この場合、化学結合を形成する担体の表面の官能基と、イオン化し得る官能基との組み合わせとして、例えば、エポキシ基とアミノ基、エステル基（例えば、カルボン酸のＮＨＳエステル）とアミノ基、アミノ基とカルボキシル基との組み合わせ等が挙げられる。化学結合の形成は、担体に高分子材料の溶液を接触させることで行うことができる。縮合反応により化学結合を形成する場合（例えば、アミノ基とカルボキシル基を用いる場合等）、縮合剤（例えば、ＤＭＴ－ＭＭ等）の存在下で反応を行うことが好ましい。
　一実施形態において、高分子材料と吸着部位が結合している吸着材では、高分子材料と吸着部位との結合は、高分子材料を担体に固定化する前および後のいずれに形成してもよい。すなわち、高分子材料と吸着部位とを結合させ、その後、吸着部位が結合した高分子材料を担体に固定化してもよく、あるいは、吸着部位を有さない高分子材料を担体に固定化した後に、固体化した高分子材料と吸着部位とを結合させてもよい。
　別の一実施形態において、高分子材料と吸着部位とが結合しておらず、異なる位置で別々に担体に固定化されている吸着材は、高分子材料と吸着部位を別々に担体に固定化して製造できる。高分子材料の担体への固定化は、前記と同様にして行うことができる。吸着部位の担体への固定化は、例えば、吸着部位と担体を化学結合により結合させることで行うことができる。高分子材料と担体の固定化の順序には特に制限はないが、吸着部位を先に担体に固定化することが好ましい。
　本発明は、前記の吸着材を用いる標的物質の精製方法にも関する。標的物質の精製方法は、前記の吸着材に、標的物質を含む溶液を接触させる工程と、その後、前記の外部環境の変化を印加する工程とを含む。本発明は、標的物質を吸着材に吸着して、該標的物質を精製することもできるし、不要物質を標的物質として吸着材に吸着して、目的物質を精製することもできる。後者の場合、例えば、標的物質を細胞膜上の不要分子として細胞を精製することができ、また、標的物質をウイルスやナノ粒子の表面の不要分子として該ウイルスやナノ粒子を精製することができる。
　標的物質を含む溶液を吸着材に接触させる工程では、溶液中の標的物質が吸着材に吸着する。標的物質の吸着材への吸着は、高分子材料のイオン化率を、吸着部位と標的物質が吸着するように適宜設定することで達成できる。例えば、高分子材料と吸着部位が結合している吸着材では、好ましくは、イオン化率をより高くすることで標的物質を吸着部位に吸着させることができる。また、例えば、高分子材料と吸着部位が結合しておらず、異なる位置で別々に担体に固定化されている吸着材では、好ましくは、イオン化率をより低くすることで、標的物質を吸着部位に吸着させることができる。
　標的物質を含む溶液の温度は、標的物質が吸着材に吸着するように適宜選択できるが、標的物質が安定な範囲内であることが好ましく、その範囲内において低い方がより好ましい。例えば、高分子材料と吸着部位が結合している吸着材では、溶液の温度は、標的物質が安定な範囲内において低い方が吸着には好ましく、例えば４℃とする。また、例えば、高分子材料と吸着部位が結合しておらず、異なる位置で別々に担体に固定化されている吸着材では、溶液の温度は、標的物質が安定な範囲内において高い方が吸着には好ましく、例えば３７℃とする。
　標的物質を含む溶液は、水を溶媒とした緩衝液とすることが好ましい。
　標的物質を含む溶液を吸着材に接触させる際のｐＨは、標的物質、吸着部位および高分子材料の各物性に依存して選ぶことができるが、標的物質の吸着に有利なｐＨを選ぶことが望ましい。
　外部環境の変化を印加する工程では、高分子材料は水中でイオン化し得る官能基を複数有するため、外部環境の変化を印加することで、高分子材料のイオン化率が変化し、吸着材から標的物質が脱着する。外部環境の変化としては、前記の変化を用いることができ、例えば、吸着材が接触している溶液の温度、塩濃度、誘電率（溶質および溶媒の種類）またはｐＨの変化等が用いられる。
　一実施形態において、標的物質の精製方法は、吸着材が充填されたカラムを用いて実施される。従来の溶解度の変化を利用する温度応答性の吸着材では、温度変化によって、疎水性が増大して分散性が低下し、水との親和性が大きく変化し、カラムの流路が変わったり、クラックや壁面との隙間が発生したりするリスクがあるが、本発明の吸着材は、温度変化に伴う溶解性の変化を標的物質の吸着または脱着に利用していないため、そのようなリスクは少ない。
　本発明の吸着材を充填したカラムを用いる精製方法は、その特性を活かす観点から、低いｐＨで分解や凝集体生成が発生する対象に適用することが好ましい。また、溶出された標的物質が中性に近いｐＨ領域の緩衝液に溶解した状態で得られるため、中和工程を必要とせず次の精製プロセスに適用できる。
　別の実施形態において、標的物質の精製方法は、吸着材を懸濁液の状態で用いて実施される。従来の溶解度の変化を利用する温度応答性の吸着材では、温度変化によって、疎水性が増大して分散性が低下し、懸濁状態の吸着材が凝集、壁面に付着、界面に局在化等するリスクが高いが、本発明の吸着材は、温度変化に伴う溶解性の変化を標的物質の吸着または脱着に利用していないため、そのようなリスクはほぼない。
　以下、実施例を示して本発明について具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞
　水中でイオン化し得る官能基を複数有する高分子材料としてポリアミンを用いた。具体的には、標的物質をヒトＩｇＧ抗体とし、該高分子材料としてε－ポリリジン（ＥＰＬ）を用い、吸着部位を（４－ヒドロキシフェニルエチルアミノ）（フェニルアミノ）トリアジン（ＡｐＡ）とした。なお、ＡｐＡは、抗体吸着能を有するプロテインＡ模倣分子である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　ＥＰＬの水／ＤＭＦ溶液にクロロ（４－ヒドロキシフェニルエチルアミノ）（フェニルアミノ）トリアジン（ＡｐＡ－Ｃｌ）（０．２当量）およびトリエチルアミン（０．０２当量）を加え、８０℃で６時間加熱することで、ＥＰＬにＡｐＡを導入した。得られた反応液に塩酸を加えて酸性とし、水により透析し、生じた沈殿を濾別した後に凍結乾燥することでポリマー１を固体として得た。
　得られたポリマー１の０．１重量％溶液を調製し、これを、ＮＨＳエステル基を表面に有する架橋アガロース担体に加え、得られた懸濁液を室温で一晩振盪することで、ポリマー１が担体に固定化された実施例１の吸着材を得た。
＜実施例２＞
　標的物質をヒトＩｇＧ抗体とし、高分子材料としてＥＰＬを用い、吸着部位を、（３－チア－５－ピリジルペンチル）ビニルスルホン（ＭＥＰ－ＤＶＳ）由来の（３－チア－５－ピリジルペンチル）スルホニルエチル部分とした。
　ジビニルスルホンと２－ピリジルエタンチオール塩酸塩とを塩基存在下で反応させることによって（３－チア－５－ピリジルペンチル）ビニルスルホン（ＭＥＰ－ＤＶＳ）を調製した。ＥＰＬの水／ＴＨＦ溶液にＭＥＰ－ＤＶＳ（０．７当量）のＴＨＦ溶液を加え、室温で１２時間撹拌することで、ＥＰＬにＭＥＰ－ＤＶＳ由来の（３－チア－５－ピリジルペンチル）スルホニルエチル部分を導入した。得られた反応液に塩酸を加えて酸性とし、水により透析し、生じた沈殿を濾別した後に凍結乾燥することでポリマー２を固体として得た。
　実施例１と同様にして、ポリマー２が担体に固定化された実施例２の吸着材を得た。
＜実施例３－６＞
　種々の高分子材料と吸着部位の組み合わせを用いて実施例３－６の吸着材を得た。具体的には、表１に示す高分子材料と、吸着部位を形成するための化合物（１～２０当量）とを混合し、所定の条件にて反応させてポリマー３－６を合成し、得られた各ポリマーを実施例１と同様にして担体に固定化して、実施例３－６の吸着材を得た。
＜実施例７＞
　高分子材料としてＥＰＬを用い、吸着部位をＡｐＡとした。実施例１におけるポリマー１の担体への固定化と同様にして、ＡｐＡを、ＮＨＳエステル基を表面に有する架橋アガロース担体に固定化し、その後、ＥＰＬを担体に固定化して、ＡＰＡおよびＥＰＬが別々に担体に固定化された実施例７の吸着材を得た。
＜比較例１＞
　架橋アガロース担体に、ＮａＯＨ存在下でジビニルスルホン（ＤＶＳ）を作用させた後に２－ピリジルエタンチオール（ＭＥＰ）塩酸塩を作用させることで、ＭＥＰ－ＤＶＳに由来する（３－チア－５－ピリジルペンチル）スルホニルエチル部分が担体に導入された比較例１の吸着材を得た。
＜比較例２＞
　表面にアミノ基を有する架橋アガロース担体に、プロテインＡ模倣分子２２／８の原料であるクロロトリアジン誘導体のＤＭＦ溶液を作用させることで、プロテインＡ模倣分子２２／８が担体に導入された比較例２の吸着材を得た。
＜比較例３＞
　架橋アガロース担体にヒトＩｇＧ抗体を固定化して、ヒトＩｇＧ抗体が担体に導入された比較例３の吸着材を得た。
＜比較例４＞
　ＮＨＳエステル基を表面に有する架橋アガロース担体にポリアミドアミンデンドリマーの０．１重量％溶液を加え、得られた懸濁液を室温で一晩振盪することで、担体にポリアミドアミンデンドリマーが固定化された比較例４の吸着材を得た。
＜比較例５＞
　架橋アガロース担体を比較例５の吸着材とした。
　実施例１－７および比較例１－５の吸着材について、高分子材料、吸着部位および好ましい標的物質を表１に示す。ここで、吸着部位については、導入された吸着部位または吸着部位の導入に用いた原料化合物を記載している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜試験例１＞
　実施例１－７および比較例１－５の吸着材について、温度変化に伴うイオン化率の変化を測定した。
　各吸着材をそれぞれカラム（内径５ｍｍ、長さ５０ｍｍ）に充填し、４℃の恒温槽内に設置し、ＰＢＳ緩衝液（５ｍＭ）を流量０．５ｍＬ／分にて通液することで４℃にてカラムを安定化させた。その後、この流量（０．５ｍＬ／分）を維持した状態でカラムを３７℃の恒温槽内に設置し、カラムから溶出される溶液のｐＨをモニタリングした。代表例として、実施例１、２および比較例３、５の吸着材についての結果を図３に示す。図３は、実施例１、２および比較例３、５の吸着材について、４℃から３７℃に昇温した際の吸着材のイオン化率の変化の測定結果を示す。
　引き続き、カラムが３７℃にて安定化した後に、前記流量（０．５ｍＬ／分）を維持した状態でカラムを４℃の恒温槽内に再度設置し、カラムから溶出される溶液のｐＨをモニタリングした。代表例として、実施例１、２および比較例３、５の吸着材についての結果を図４に示す。図４は、実施例１、２および比較例３、５の吸着材について、３７℃から４℃に降温した際の吸着材のイオン化率の変化の測定結果を示す。
　図３および図４より、比較例３の吸着材では、温度変化に伴いカラムから溶出される溶液のｐＨ変化は小さく、比較例５の吸着材では、カラムから溶出される溶液のｐＨ変化は見られなかった。これに対し、実施例１および２の吸着材では、比較例３および５の吸着材と比べて、温度変化に伴いカラムから溶出される溶液のｐＨ変化が大きく、温度変化に伴いイオン化率が大きく変化することが示された。なお、図示していないが、実施例３－７の吸着材も実施例１および２の吸着材と同様に、比較例の吸着材と比べて、温度変化に伴いカラムから溶出される溶液のｐＨ変化が大きく、温度変化に伴いイオン化率が大きく変化していた。よって、水中でイオン化し得る官能基を複数有する高分子材料を用いることで、温度変化に伴い高分子材料のイオン化率が大きく変化することが示された。
＜試験例２＞
　実施例１－７の吸着材および比較例１－５の吸着材の温度変化に伴う標的物質に対する吸着特性の変化をカラム中で測定した。
　カラムに、４℃または３７℃で、１重量％の所定の標的物質を含むｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液（リン酸５ｍＭまたは３０ｍＭ、塩化ナトリウム３７．５ｍＭ）を１０ｍＬ通液し、カラムから溶出される溶液内の標的物質濃度をモニタリングし、溶液中の濃度減少分から吸着材の吸着容量を算出した。代表例として、実施例１、２、４、６、７および比較例２、３、５の結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表２より、試験例１において、温度変化に伴う高分子材料のイオン化率の大きな変化が見られた実施例１、２、４、６および７の吸着材は、比較例２、３および５の吸着材と比較して脱着率が高く、優れた吸着特性を示し、また、吸着特性の温度依存性が見られた。なお、高分子材料と吸着部位が結合している実施例１、２、４および６の吸着材では、昇温時に標的物質が脱着するのに対し、高分子材料と吸着部位が別々に担体に固定化されている実施例７の吸着材では、降温時に標的物質が脱着することが示された。一方、比較例１－４の吸着材では、試験例１において温度変化に伴う高分子材料のイオン化率の小さな変化が見られたものの、脱着率は低く、また、吸着特性の温度依存性はほぼ見られなかった。なお、実施例３および５の吸着材も同様に、比較例の吸着材に対して優れた吸着特性を示し、また、吸着特性の温度依存性が見られた。
＜試験例３＞
　実施例１－７の吸着材および比較例１－５の吸着材の温度変化に伴う標的物質に対する吸着特性の変化を、吸着材を懸濁液の状態で用いるビーズ分散系で測定した。
　各吸着材に、４℃または３７℃で、１重量％の所定の標的物質を含むｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液（リン酸５ｍＭまたは３０ｍＭ、塩化ナトリウム３７．５ｍＭ）をビーズ体積の２倍量加え、３時間振盪させた後に、上澄み溶液をＧＰＣで分析して濃度の減少分を定量することで、吸着材の吸着容量を算出した。代表例として、実施例１、２および比較例２、３、５の結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表３より、試験例１において、温度変化に伴う高分子材料のイオン化率の大きな変化が見られた実施例１および２の吸着材は、比較例２、３および５の吸着材と比較して脱着率が高く、優れた吸着特性を示し、また、吸着特性の温度依存性が見られた。一方、比較例１－４の吸着材では、試験例１において温度変化に伴うイオン化率の小さな変化が見られるものの、脱着率は低く、また、吸着特性の温度依存性はほぼ見られなかった。なお、実施例３－７の吸着材も同様に、比較例の吸着材に対して優れた吸着特性を示し、また、吸着特性の温度依存性が見られた。
１０　吸着材
２０　吸着材
１　高分子材料
２　水中でイオン化し得る官能基
３　高分子主鎖
４　吸着部位
５　標的物質
６　担体
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (16)

  1. 　水中でイオン化し得る官能基を複数有する、下限臨界溶解温度を示さない高分子材料と、
    　標的物質と相互作用可能な吸着部位と、
    　担体と
    を備えることを特徴とする吸着材。
  2. 　外部環境の変化によって高分子材料のイオン化率が変化することを特徴とする、請求項１に記載の吸着材。
  3. 　外部環境の変化が、吸着材が接触している溶液の温度、塩濃度、誘電率またはｐＨの変化であることを特徴とする、請求項２に記載の吸着材。
  4. 　水中でイオン化し得る官能基が、ｐＫａが－３．７以上１７．７以下である官能基を含むか、またはその共役酸もしくは共役塩基のｐＫａが－３．７以上１７．７以下である官能基を含むことを特徴とする、請求項１に記載の吸着材。
  5. 　水中でイオン化し得る官能基が、アミノ基、イミノ基、含窒素芳香族基、グアニジル基、フェノール性水酸基、カルボキシル基、ボロン酸基およびホスホリル基から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、請求項４に記載の吸着材。
  6. 　高分子材料が、ポリリジン、アミノ基を複数有するデンドリマー、イミノ基を複数有するデンドリマー、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、またはそれらを部分構造として含む高分子材料であることを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載の吸着材。
  7. 　標的物質が、タンパク、生体分子、細胞、ウイルスまたはナノ粒子であることを特徴とする、請求項１に記載の吸着材。
  8. 　標的物質が抗体であることを特徴とする、請求項７に記載の吸着材。
  9. 　吸着部位が、プロテインＡ部分構造または模倣分子、プロテインＧ部分構造または模倣分子、プロテインＬ部分構造または模倣分子、糖鎖結合分子、チオフィリックリガンドおよび抗原または抗原部分構造から選ばれる少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１に記載の吸着材。
  10. 　担体またはその表面が、多糖類、架橋された多糖類、ポリスチレン、シリカまたは金属酸化物を有することを特徴とする、請求項１に記載の吸着材。
  11. 　担体またはその表面が、多糖類または架橋された多糖類を有することを特徴とする、請求項１０に記載の吸着材。
  12. 　高分子材料と吸着部位が結合していることを特徴とする、請求項１に記載の吸着材。
  13. 　高分子材料と吸着部位が結合しておらず、異なる位置で担体に固定化されていることを特徴とする、請求項１に記載の吸着材。
  14. 　請求項１に記載の吸着材に標的物質を含む溶液を接触させる工程と、
    　その後請求項３に記載の外部環境の変化を印加する工程と
    を含む標的物質の精製方法。
  15. 　請求項１に記載の吸着材が充填されたカラムを用いる、請求項１４に記載の精製方法。
  16. 　請求項１に記載の吸着材を懸濁液の状態で用いる、請求項１４に記載の精製方法。
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