CN1199985C - 蛋白质分子印记聚合物的制备及其生物工程中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，所述一种合成蛋白质印记聚合物和提高蛋白质复性的方法，其特征在于合成以目标蛋白质为印记物的高分子印记聚合物，该蛋白质印记聚合物能够提高蛋白质的复性效率，提高产物的比活和纯度，有利于分离纯化；印记聚合物经处理后，能够作为纳米或纳米类的治疗药物、或分离介质、催化剂、传感器等使用。
Description
一、技术领域：
本发明属生物工程技术领域。
二、背景技术：
大肠杆菌表达体系是基因工程的首选表达体系，具有生长周期短，方法简便，价格低廉，表达水平高等诸多优点。但外源基因在大肠杆菌中表达时，往往以不溶性，无生物活性的包涵体形式存在。尽管包涵体产物形式为分离纯化提供了不少便利，但产物必须经体外变、复性才能获得生物活性。蛋白质体外复性过程复杂，而且得率低。对多硫键的蛋白质(尤其是药用蛋白质)，存在二硫键错配的异构体，从而为下游的分离纯化加大了难度，带来了困难。包涵体问题是目前大肠杆菌表达体系最大的瓶颈难题。由于包涵体产物体外变复性多为经验性、探索性，而且变复性条件因不同蛋白质而异，目前尚无更多规律可循，使得包涵体产物复性得率成为影响大肠杆菌重组产物成本的重要制约因素(对大分子、多二硫键的蛋白质尤其如此)。
迄今为止，提高包涵体产物复性得率的方法主要有三：1，优化变复性液的成份及反应条件，如pH、蛋白质浓度、氧化剂与还原剂的浓度和比例、复性时间等；2，分子伴侣介导的蛋白质体外复性，即在复性体系中使用GroEL/ES，PDI，DnaK，PPI等分子伴侣。尽管分子伴侣的使用显著提高了复性得率，但由于大量使用高纯度的分子伴侣，事实上也增加了复性成本、同时为下一步的分离纯化工艺带来了去除分子伴侣的难度；3，在复性过程中添加溶解状态的或使用固定于层析介质的底物、抑制剂、配基、受体等，用于诱导蛋白质的正确折叠。其缺点是：a.必须能够获得大量高纯度的底物、抑制剂、配基、受体等(不是所有的重组蛋白质都已知底物、抑制剂、配基、受体等；而且即使已知，也并非都能大量高纯度的获得)，从而带来了新的难度并增加了成本；b.由于复性难度大的重组蛋白质多为大分子、多结构域甚至是形成多聚体的蛋白质。这一类的蛋白质在折叠时，其相对独立的结构域的折叠也是相对独立的。因此对这一类的重组蛋白质即使运用了底物、抑制剂、配基、受体等″折叠诱导物″，其作用也只可能是局部的、有限的。如何解决这一难题，至今尚无良策。
分子印记技术是近10年来才发育、成长起来的一个因学科交叉而形成的新的技术方法。分子印记技术是指采用特定印记物来制备高分子聚合物的特异性微型模槽(以反映印记物表面特征)的技术。迄今，其印记物主要为化合物(尤其是具有手性的化合物)，如药物、氨基酸、短肽、核苷酸、辅酶、甾体、糖类等。分子印记术在手性化合物的拆分和纯化上已获得一些令人嘱目的成功，显现出诱人的前景。1993年Mosbach小组在Nature上发表的分子印记技术的论文是分子印记术正式为世人所注目的标志(Nature 361：645-647，1993)。由于该领域是一个交叉的新兴领域，涉足者尚少。
三、发明内容：
本发明的目的是将建立蛋白质分子印记的方法，同时将分子印记技术引入到生物工程重组蛋白质复性研究中，建立一个重组蛋白质体外高效复性的新方法，从而为大分子、多结构域的重组蛋白质的高效复性探索一条新途径。本项发明具有鲜明的学科交叉特色，具有重要的理论探索意义；而且本项发明直接针对重组蛋白质体外复性的难题，因而对重要药用基因工程产品的产业化具有重要的实用意义，类似方法在国内外从未见过报道。
本发明的目的可以通过以下措施来达到：
以纯化的天然蛋白质或者有生物活性的重组蛋白质为印记物，合成高分子印记聚合物(如多聚硅氧烷印记聚合物、聚丙烯酸酯/聚丙烯酰胺印记聚合物或聚苯乙烯印记聚合物等)，然后用高盐溶液或高浓度变性液或蛋白酶将印记物蛋白质分子从高分子印记聚合物中去除，将待复性的重组蛋白质经过变性后，加入到印记聚合物中，进行蛋白质复性，收集复性的蛋白质，从而获得有生物活性的重组蛋白质。
本发明的特色在于由于分子印记术中的高分子聚合物组成的微型模槽特异性地反映了印记物表面的整体特征，将其运用在重组蛋白质复性过程中，则可以全面有效地诱导蛋白质的正确折叠，尤其是复性难度大的大分子、多结构域的重组蛋白质的复性，从而避免运用诸如底物、抑制剂、配基、受体等″折叠诱导物″时，其局部的、有限的复性作用，达到提高复性效率的目的。由于分子印记方法以产物为印记物(勿须纯化底物、抑制剂、配基、受体等″折叠诱导物″或分子伴侣等)，而且印记聚合物可上百次重复使用及在常温条件下长时间贮存，并且能够直接进行复性产物的纯化，因而有可能较大幅度地降低复性的成本，从而直接降低基因工程产品的价格。本发明不仅具有重要的理论探索意义，而且具有重要的实用意义和经济价值。以尿激酶为分子印记物合成高分子印记聚合物，该印记聚合物对尿激酶分子有高度的特异性识别能力，能够用于帮助尿激酶的复性、纯化、以及作为纳米类治疗药物。而且以药物蛋白质分子为印记物合成的微米级蛋白质印记聚合物，经研磨、破碎成纳米或接近纳米尺度的小颗粒后，可以作为纳米药物应用、或作为分离介质、催化剂、传感器等使用。
四、具体实施方式：
1.将单体3-氨基丙基三乙氧基硅烷和原硅酸乙酯按一定的比例混合，加入到人尿激酶，或者牛血清白蛋白溶液中(溶于0.1M，pH7.0的磷酸钾缓冲液中)，迅速混匀3分钟后，置于25℃5-6小时，然后放在4℃过夜。所得聚合产物捣碎后，加入一定体积的磷酸钾缓冲液，混匀1分钟，静置20分钟，离心(3500rpm)30分钟，重复洗涤5次。用Coomassie亮兰染色定量法测定多聚硅氧烷印记聚合物上清中的蛋白质含量，用平板测活法和尿激酶荧光底物G2386测活法分别测定上清中尿激酶的酶活性的含量。
2.将存放于磷酸钾缓冲液中的印记聚合物3500rpm离心，去除上清，加入4mL蛋白酶K反应液，及10μL 20mg/mL的蛋白酶K溶液，使酶浓度为50μg/mL，37℃振摇8小时，然后离心去除上清，加入1mL磷酸钾缓冲液，振荡后，3500rpm离心，弃去上清，重复洗涤10次。最后一次离心后，小心吸干上清。加入1mL待结合的蛋白(人尿激酶，牛血清白蛋白，或重组GST-P16)溶液，轻轻振摇，置于冰上10分钟，反复数次。然后3500rpm离心10分钟，取上清Coomassie亮兰测定上清中蛋白质含量。
3.将人尿激酶在变性液(9M Guanidine-HCl，75mM Tris-HCl，15mM DTT，pH 7.5)中变性。将上述变性过的人尿激酶溶液按1比50的比例，缓慢加入剧烈搅拌并冰浴冷却的含有人尿激酶印记聚合物的复性液中，然后放慢搅拌速度，继续冰浴搅拌24小时。用Coomassie亮兰染色定量法测定蛋白含量，用尿激酶显色底物P4080和荧光底物G2386测定尿激酶的活性。
为了便于更好地进行比较，我们同时合成了不含蛋白印记物的聚合物；在蛋白质复性，我们也同时做了通常的在溶液中进行复性的对照实验。用扫描电子显微镜观察尿激酶分子印记聚合物的微观结构发现：不含蛋白质的空白对照聚合物所生成的聚合物颗粒形状不规则，粒径大小差别悬殊，约从0.1μm到5μm不等。而尿激酶印记聚合物颗粒形状较为规则，粒径统一在2μm左右。这说明了HUK作为印记反应的成员参与了反应，并且帮助了聚合物规则形状的形成。单体3-氨基丙基三乙氧基硅烷∶原硅酸乙酯为1∶3时，合成的尿激酶印记聚合物中可含有3.4mg/ml的尿激酶蛋白质。
单体3-氨基丙基三乙氧基硅烷∶原硅酸乙酯为1∶3时，合成的尿激酶印记聚合物经蛋白酶K去除印记物分子后，分别和人尿激酶，牛血清白蛋白，或重组GST-P16进行再结合。人尿激酶和尿激酶印记聚合物的结合率为31.2％，和空白对照聚合物的结合率为2.1％；牛血清白蛋白和尿激酶印记聚合物的结合率为2.5％，和空白对照聚合物的结合率为1.9％；重组GST-P16和尿激酶印记聚合物的结合率为7.9％，和空白对照聚合物的结合率为2.2％。牛血清白蛋白和牛血清白蛋白印记聚合物(单体3-氨基丙基三乙氧基硅烷∶原硅酸乙酯为1∶3)的结合率为32.8％，和空白对照聚合物的结合率为1.9％，人尿激酶和牛血清白蛋白印记聚合物的结合率为3.8％，和空白对照聚合物的结合率为2.1％。
由上述结果可以明显看到：由于印记聚合物表面空出的孔穴保留有其原有印记的蛋白的表面构象信息，所以它能够再次结合人尿激酶。GST-P16融合蛋白的分子量约为44KDa，比人尿激酶(53KDa)略小，而且GST融合蛋白有两个大小不同的结构域组成，它的分子形状与人尿激酶比较相似。但由于它们的分子表面的构象信息不是完全相同，所以人尿激酶印记的聚合物对GST-P16的结合率要远小于其对人尿激酶的再次结合率。而牛血清白蛋白尽管它和人尿激酶一样，也是球形分子，它的分子量为67KDa，大于人尿激酶的分子量，它对人尿激酶印记的聚合物的结合率几乎与空白对照一样。同样，和对空白对照聚合物的结合率相比，牛血清白蛋白对牛血清白蛋白印记聚合物具有明显特异的结合能力，而人尿激酶和牛血清白蛋白印记聚合物的结合能力几乎和它对空白对照聚合物的结合能力相同。这充分说明我们合成的分子印记聚合物的方法及合成获得的印记聚合物是具有印记分子特异性的。
将人尿激酶分别在溶液中、空白对照聚合物和人尿激酶印记聚合物进行复性，其活性回收率分别为29％，29％，37％。在人尿激酶印记聚合物中的复性得率明显高于通常的溶液复性和在空白对照聚合物中的复性。而且进一步分析我们发现人尿激酶分别在溶液中、空白对照聚合物和人尿激酶印记聚合物复性后，复性上清液中入尿激酶的比活分别为：13.92IU/μg、14.01IU/μg、26.35IU/μg。在印记聚合物复性的人尿激酶比活是常用方法获得产物比活的1.9倍，这将大大有利于后续的分离纯化，有利于获得高纯度的精品，同时降低分离纯化的成本和工作量。这充分说明印记聚合物确实具有提高复性得率，并且具有帮助蛋白质纯化的功能。
除此之外，我们还发现：将参与复性的印记聚合物与尿激酶底物保温10分钟后离心，取上清测定，对于荧光底物G2386，其460nm处的荧光值为98.6，对于显色底物P4080，其在405nm处的吸光度值达到1.0以上。这定性地说明在复性过程中，还有一部分已经被复性的、具有生物活性的尿激酶被滞留在其印记聚合物内或其表面；而用同样的方法测定参与尿激酶复性的空白对照聚合物，结果显示空白对照聚合物不能水解尿激酶底物，表明空白对照聚合物内或其表面没有吸附任何有生物活性的尿激酶蛋白质。这充分说明仅仅计算复性溶液上清中获得的尿激酶复性得率不能准确地反映尿激酶在其印记聚合物中的真正的复性效率，尿激酶在其印记聚合物中的复性效率大大高于常用的溶液方法。
Claims (2)
1.一种利用蛋白质印记聚合物提高重组蛋白质复性的方法，其特征在于合成以尿激酶为印记物的多聚硅氧烷高分子印记聚合物，用高盐溶液或高浓度变性液或蛋白酶将印记物尿激酶蛋白质分子从高分子印记聚合物中去除，将变性过的重组蛋白质加入到印记聚合物中，进行蛋白质复性，从而获得有生物活性的重组蛋白质。
2.根据权利要求1所述的利用蛋白质印记聚合物提高重组蛋白质复性方法在提高重组蛋白质复性率研究中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: NANJING UNIVERSITY CAPITAL MANAGEMENT CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: NANJING UNIVERSITY Effective date: 20131107 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 210093 NANJING, JIANGSU PROVINCE TO: 210000 NANJING, JIANGSU PROVINCE |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20131107 Address after: 210000, 05 high tech Development Zone, Pukou District, Jiangsu City, Nanjing Province, 4 stories Patentee after: Nanjing University Asset Management Co., Ltd. Address before: 210093 Hankou Road, Jiangsu, China, No. 22, No. Patentee before: Nanjing University |
|
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: NANJING UNIVERSITY SCIENCE PARK DEVELOPMENT CO., L Free format text: FORMER OWNER: NANJING UNIVERSITY CAPITAL MANAGEMENT CO., LTD. Effective date: 20140627 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 210000 NANJING, JIANGSU PROVINCE TO: 210093 NANJING, JIANGSU PROVINCE |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20140627 Address after: 210093 Hankou Road, Jiangsu, China, No. 22, No. Patentee after: NANJING UNIVERSITY TECHNOLOGY PARK DEVELOPMENT CO., LTD. Address before: 210000, 05 high tech Development Zone, Pukou District, Jiangsu City, Nanjing Province, 4 stories Patentee before: Nanjing University Asset Management Co., Ltd. |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: NANJING JIRUIKANG BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: NANJING UNIVERSITY SCIENCE PARK DEVELOPMENT CO., LTD. Effective date: 20141105 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 210093 NANJING, JIANGSU PROVINCE TO: 210019 NANJING, JIANGSU PROVINCE |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20141105 Address after: 210019, 6, 3, 18 Jiangdong Street, Jialing Road, Jianye District, Jiangsu, Nanjing Patentee after: NANJING JIRUIKANG BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Address before: 210093 Hankou Road, Jiangsu, China, No. 22, No. Patentee before: NANJING UNIVERSITY TECHNOLOGY PARK DEVELOPMENT CO., LTD. |
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| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Wang Yao Document name: Notification of Passing Examination on Formalities |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20190116 Address after: 210046 Innovation Building of Nanda Science Park, No. 8 Yuanhua Road, Qixia District, Nanjing City, Jiangsu Province Patentee after: NANJING UNIVERSITY TECHNOLOGY PARK DEVELOPMENT CO., LTD. Address before: 210019 No. 18 East Street, Jialing River, Jianye District, Nanjing City, Jiangsu Province, 3 buildings and 6 floors Patentee before: NANJING JIRUIKANG BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CX01 | Expiry of patent term | ||
| CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20050504 |