JPS62278982A

JPS62278982A - Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製造法

Info

Publication number: JPS62278982A
Application number: JP12183086A
Authority: JP
Inventors: Takayuki Uejima; 上島　孝之; Kazuo Aisaka; 和夫相阪; Takemitsu Arai; 新井　雄光; Shigeaki Tamura; 田村　繁昭
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1986-05-27
Filing date: 1986-05-27
Publication date: 1987-12-03

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】３、発明の詳細な説明産業上の利用分野本発明はＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼの製造法に
関する。

Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（ＥＣ４，Ｌ。

３．３、以下ＮＡリアーゼと略記する）はＮ−アセチル
ノイラミン酸をＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸
に分解する酵素である。

このＮΔリアーゼは血清などの生体中のシアル酸含有物
質の定量に用いられる。

従来技術ＮＡ’Ｊアーゼは、動物組織およびガス壊療菌（Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ　　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コレ
ラ菌（Ｖｉｂｒｉ。

ｃｈｏｌｅｒａｅ）などの病原性微生物、および各種の
非病原性微生物などに存在することが知られている。

またＮＡリアーゼ産生能を有する微生物を用いたＮＡＩ
Ｊアーゼの製造法において、培地中に高価な試薬である
Ｎ−アセチルノイラミン酸を大量に存在させるときにの
み本酵素の生産量が上昇することが報告されている（特
公昭５６−５４１５３゜特公昭５６−５１７５１）。

また、Ｎ−アセチルノイラミン酸を使用しｔ；いＮＡリ
アーゼの製造法として、Ｎ−アセチルノイラミン酸を必
要としない、エシェリヒア属に属する微生物の変異株を
用いる方法（特開昭６Ｏ−１８４３８４）、Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸リアーゼ産生遺伝情報を担うＤＮＡを組
み込んだベクターを導入したエシェリヒア属に属する微
生物を用いる方法（特開昭６ｌ−１３８４）などが報告
されている。

しかしながら、これらの方法ではいずれもＮＡリアーゼ
の生産量は低い。

発明が解決しようとする問題点Ｎ−アセチルノイラミン酸を用いず、ＮΔリア−ゼを大
量に生産できる方法の開発が望まれている。

問題点を解決するための手段本発明者は、工業的に安価にしかも大量にＮＡリアーゼ
を製造する方法について種々検討した。

その結果、ＮＡリアーゼ産生遺伝情報を担うＤＮＡを組
み込んだベクターを導入した工／エリヒア属に属する微
生物を糖蜜、グリセロール、コーンステイープリカーの
いずれか１種以上を含む培地に培養した場合に、著量の
ＮＡＩＪアーゼが生産されることが見出された。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ産生遺伝
情報を担うＤＮＡを組み込んだベクターを導入した微生
物を、糖蜜、グリセロールおよびコーンステイー少リカ
ーから選ばれる少なくとも１種を含む栄養培地に培養し
、培養物中にＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼを蓄積
させ、これを採取することを特徴とするＮ−アセチルノ
イラミン酸リアーゼの製造法を提供する。

本発明に使用する微生物としては、ＮＡＩＪアーゼ産生
遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだベクターを導入した
微生物であれば、いずれも使用することができる。好適
な例としては、エシェリヒア・コ　　リ　（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　　Ｈ３−４（Ｆ　ＥＲＭ
ＢＰ−５１３）があげられる。

ＮＡリアーゼ産生遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだベ
クターを導入したエンエリヒア属微生物は、特開昭６１
−１３８４号公報に記載の方法に従って得ることができ
る。

本発明において、著量のＮΔリアーゼを生産させるため
に用いられる培地としては、糖蜜、グリセロールおよび
コーンステイープリカーから選ばれる少なくとも１種を
含む栄養培地が用いられる。

その使用量は５〜３０ｇ／ｌ程度が好ましい。さらに、
炭素源としての糖蜜、グリセロール、窒素源としてのコ
ーンステイープリカー、ペプトン。

酵母エキスを適当に組み合わせて用いれば、より優れた
結果を得ることができる。

培養は振とう培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条
件下に行われる。培養温度は２５〜３５℃が好適であり
、培養期間は通常１６〜４８時間程度で完了する。

培養物中からのＮＡＩＪアーゼの採取は次のように行う
。

培ｔｍ了後、培養液から遠心分離などの方法で菌体を集
め、得られた菌体を超音波処理、ガラスピーズを用いる
摩砕処理、フレンチプレス処理などによって破砕し、酵
素を抽出する。この抽出液を通常酵素ｉ製に用いられる
方法、例えば塩析。

有機溶媒沈殿、透析、イオン交換カラムクロマトグラフ
ィー、ゲル濾過、凍結乾燥などの方法にて処理する。こ
のようにして、精製ＮＡ’Ｊアーゼを採取することがで
きる。

ＮＡリアーゼの活性の測定は、メソッヅ・イン・エンザ
イモロジイ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
、）５、３９１〜３９４．　　（１９６２）に記載の方
法に従って測定する。

以下、実施例をあげて本発明を具体的に説明する。

実施例１゜Ｎ　Ａ　ＩＪアーゼ産生遺伝情報を担うＤＮＡを組み込
んだベクターを導入したエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）　　Ｈ３−４（ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−５１３）（以下Ｈ３−４株と略記する）を第１表
に示す各種培地、各々１０ｍ１（ｐＨ７，０）に接種し
、２８℃で１８時間振とう培養した。培養終了後、遠心
分離（１０，０００ｒｐｍ、　２０分）により菌体を集
め、０．８５％生理食塩水で洗浄後、菌体を超音波処理
により破砕し、遠心分離（１０，０Ｏｒｐｍ、　２０分
）し、上清液２ｍｌを菌体抽出液として調製した。その
抽出液中のＮＡＩＪアーゼ活性を測定した。その結果は
第１表の通りであり、糖蜜。

グリセロール、コーンステイープリカーなどを添加した
培地ではＮＡＩＪアーゼの生産看が５〜１０倍に増加し
た。

第　　　　１　　　　表ブイヨン（２＞”　　　　　　　　　　　　　　　０．
２５０ブイヨン（２）十　糖蜜（１）　　　　　　　　
　１．９５ブイヨン（２）＋　グリセロール（０，５＞
　　　　１．４１ブイ　ヨ　ン（２）　　＋　　コーン
ステイープリカー　（１）　　　　　　　　　２．　３
　２ブイヨン（２）半　ペプトン（１）　　　　　　　
０．５４５ブイヨン（２）十　酵母エキス（１）　　　
　　　０．８１０実施例２゜Ｈ３−４株を第２表に示す種々の濃度の糖蜜とコーンス
テイープリカーより成る培地各々ｌ　Ｑｍｌ（ｐＨ７，
０）に接種し、２３℃で１８時間振とう０　　培養した
。培養終了後、実施例１と同様に菌体抽出液を調製し、
その抽出液中のＮＡＩＪアーゼ活性を測定した。その結
果は第２表に示す通りであり、適当な濃度の糖蜜とコー
ンステイープリカーより成る培地でＮＡＩＪアーゼの生
産量が約２４倍増加した。

第　　　　２　　　　表ブイヨン（２＞　　　　　　　　　　　　　　　　　０
．２５０糖蜜（１）　　＋　　コーンステイープリカー
（１）　　　　　　　　　　　　　　３．２　７糖蜜（
１）＋　ペプトン（１）　　　　　　　　　２．３０糖
蜜（１）　　十　酵母エキス（１）　　　　　　　　２
．５６グリセロール（０，５）　　＋　　コーンステイ
ープリカー（１）　　　　　　　　　　２．　７　３グ
リセロール（０，５）　　＋　　ペブ　ト　ン（１）　
　　　　　　　　　　　１．　９　０グリセロール（０
，５）　　十　　酵母エキス（１）　　　　　　　　　
　２．　０　２糖蜜（１）　　　＋　　コーンステイー
プリカー（３）　　　　　　　　　　　　　　４．　４
　５糖蜜（２）　　＋　　コーンステイープリカー（２
）　　　　　　　　　　　　　　６．０　０糖蜜（３）
　　＋　　コーンステイープリカー（１）　　　　　　
　　　　　　　　１．３　０（注）各培地はすべて０．
００２％アンピシリンを含有する。

実施例３゜Ｈ３−４株を糖蜜２０　ｇ／Ｒ、コーンステイープ＋）
ｈ−２０ｇ／Ｃアンピシリン２０ｍｇ／ｎよりなる培地
（ｐＨ７，０）　３０　Ｑｍｌを含む２１ｘルレンマイ
ヤーフラスコに植菌し、２８℃で１８時間振とう培養し
た。

この培養１６００ｍ１を上記培地と同じ組成の培地１８
１を含む３０１ジγ−ファーメンタ−に入れ、通気攪拌
（１νｖｍ、　３００　ｒｐｍ）　しつつ、２８℃で１
８時間培養を行った。

この培養物１８βから遠心分離（８，００Ｏｒｐｍ。

２０分）にて、菌体を集めた。得られた菌体を０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０＞　１００　Ｏｎ＋ｌに懸
濁して、Ｄ　ｙ　ｎ　ｏ　−Ｍ　ｉ　ｌ　ｌ　（Ｗ、Ａ
、Ｂａｃｈｏｆｅｎ社製、スイス）にて細胞を破砕し、
菌体内の酵素を抽出した。

このときのＮＡリアーゼ活性を測定したところ、Ｎ　Ａ
　ＩＪアーゼ生産量は、８．２単位／ｍｌ−培養液であ
った。

この抽出液に硫酸アンモニウムを加え、硫酸アンモニウ
ム５０〜９０％飽和で沈澱する部分を採取した。

この沈殿を、約２０　Ｑｍｌの０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）に溶解し、同緩衝液５βで２４時間透
析した。透析液を同緩衝液で平衡化した０２人εセファ
デックス（１１１ロ径６ｃＩｌｌ）に通塔した。

この操作で、ＮＡリアーゼはＤＥＡε−セファデックス
に吸着された。さらに、同緩衝液約１βで不純蛋白質を
洗い流した。

次に、０゜０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）から１．
０Ｍ塩化す）　ＩＪウムを含む同緩衝液までの塩化す）
　ＩＪウムの濃度匂配液で、流速約１　ｍｌ　／ｍｉｎ
になるようにして溶出を行った。約２０１１１１ずつ分
画し、溶出してくる活性画分約３０　Ｑｍｌをあわせた
。

これに硫酸アンモニウムを加えて、硫酸アンモニウム９
０％飽和で沈澱する部分を遠心分離（１２，０００Ｘｇ
、２０分）で集め、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）　３　Ｑｍｌに溶解した。

この溶液を同緩衝液２！で２４時間透析した。

透析液を凍結乾燥し、ＮＡＩＪアーゼの粉末精製酵素標
品約１００．０００単位（比活性２０単位／ｍｇ）を得
た。

精製酵素は、細胞抽出液に比べて比活性は約１０倍に上
昇し、活性の収率は約７０％であった。

発明の効果本発明によれば、工業的に安価に大量にＮ　Ａ　’Ｊア
ーゼを製造することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ産生遺伝情報を担う
ＤＮＡを組み込んだベクターを導入した微生物を糖蜜、
グリセロールおよびコーンスティープリカーから選ばれ
る少なくとも１種を含む栄養培地に培養し、培養物中に
Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼを蓄積させ、これを
採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸リ
アーゼの製造法。