JPS5928492A - 細胞培養系よりの血しよう蛋白質の分離 - Google Patents
細胞培養系よりの血しよう蛋白質の分離Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、たとえば微生物細胞培養物の発酵プロスおよ
び咄乳動物細胞培養物の消費された培地といった細胞培
養系より血しよう蛋白質を分離する方法に関している。
び咄乳動物細胞培養物の消費された培地といった細胞培
養系より血しよう蛋白質を分離する方法に関している。
ヒト血しようまたは血清中に存在する徨々の種類の蛋白
質を分画して分けることは、多年にわたり、医および薬
学分野の科学者の関心事であった。
質を分画して分けることは、多年にわたり、医および薬
学分野の科学者の関心事であった。
この関心事の重要の部分は、血液の凝固に関与する血し
よう成分、つまり血ｇ、凝固因子の分離である。大きな
医学的興味のある他の血液蛋白質成分は、抗体活性の担
い手であるガンマ−グロブリンおよび血しようのコロイ
ド滲透圧の主要な調節物であるアルブミンである。
よう成分、つまり血ｇ、凝固因子の分離である。大きな
医学的興味のある他の血液蛋白質成分は、抗体活性の担
い手であるガンマ−グロブリンおよび血しようのコロイ
ド滲透圧の主要な調節物であるアルブミンである。
これらの血しよう蛋白質種のもつとも重要な部分は、今
日では、ヒトから得られる血液を天然材料として採取さ
れている。血しよう蛋白質を分離することの重要性のひ
とつの例として、抗血友病性因子（ＡＨＦ：ファクター
■）を商業的に供給することである。止血および血液凝
固におけるファクター■の重要性はよく知られている。
日では、ヒトから得られる血液を天然材料として採取さ
れている。血しよう蛋白質を分離することの重要性のひ
とつの例として、抗血友病性因子（ＡＨＦ：ファクター
■）を商業的に供給することである。止血および血液凝
固におけるファクター■の重要性はよく知られている。
先天性の凝血障害を有する患者の大部分はファクター■
欠乏を有する（血友病Ａ患者）。他方１人数は少ないが
ファクター■欠乏の者もいる（血友病Ｂ患者）。または
、他のマイナーの凝固因子を欠く者もいる。このような
血液凝固の欠陥のある患者には、以前は、全血、または
なるべくは、ファクター■またはファクター■を制レベ
ルに含有するように精製した血しよう投与が行なわれた
。ＪｕｄｉｔｈＰｏｏｌ 、 Ｎｅｗ Ｅｎｇ、 Ｊ、
Ｍｅｄ−２７４，１４４３−４７（１９６５）により
開発されたクリオプレシピテート、あるいはさらに濃厚
な分画たとえば、 Ｕ、Ｓ。
欠乏を有する（血友病Ａ患者）。他方１人数は少ないが
ファクター■欠乏の者もいる（血友病Ｂ患者）。または
、他のマイナーの凝固因子を欠く者もいる。このような
血液凝固の欠陥のある患者には、以前は、全血、または
なるべくは、ファクター■またはファクター■を制レベ
ルに含有するように精製した血しよう投与が行なわれた
。ＪｕｄｉｔｈＰｏｏｌ 、 Ｎｅｗ Ｅｎｇ、 Ｊ、
Ｍｅｄ−２７４，１４４３−４７（１９６５）により
開発されたクリオプレシピテート、あるいはさらに濃厚
な分画たとえば、 Ｕ、Ｓ。
特許３，４１５，８０４．３，６３１，０１８゜４．０
８９．９４４およびＲｅ２９．６９Ｂに記載の方法で製
造される。 Ｈｅｍｏｆｉｌａ３ＡＨＦのようなさらに
濃厚な分画は、高いファクター■含量の市販品として入
手しうる、分画の代表的な例である。しかしこれらの市
販される分画は、材料の入手しやすさつまり提供血液の
供給が限定されるという問題がある。
８９．９４４およびＲｅ２９．６９Ｂに記載の方法で製
造される。 Ｈｅｍｏｆｉｌａ３ＡＨＦのようなさらに
濃厚な分画は、高いファクター■含量の市販品として入
手しうる、分画の代表的な例である。しかしこれらの市
販される分画は、材料の入手しやすさつまり提供血液の
供給が限定されるという問題がある。
伝統的な微生物学的手法に応用される。最近開発された
遺伝子工学および分子生物学の手法を用いて、今や、微
生物種のなかに哺乳動物の血しよう蛋白質を生産するこ
とが可能である。遺伝子スゾライシングの主要な設計者
は、この方法を種々の血しよう蛋白質たとえば抗血灰病
蛋白質、ガンマーグロブリン、アルブミン、フィブリノ
−ダンおよびプロトロンビンの生産に応用しうろことを
示した。 ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙｅｒ Ｕ、Ｓ、特許
４．２ろ７ｅ２２４ 、 ｃｏｌ、 ９をみよ。遺伝子
工学における初期の実際的仕事は、ソマトスタチンおよ
びインスリンのような比較的小型の蛋白質の生産に限定
されていたけれども、細菌および酵母において異物蛋白
質を生産するだめの遺伝子スプライシングの基本原理は
、より大型の蛋白質の製造に適用しうろことが示された
。それで、すで、に生産された比較的大型の蛋白質がり
コンビナンド微生物で製造されている。たとえばＣ）ｏ
ｒ、０ｆｆｏｎ。
遺伝子工学および分子生物学の手法を用いて、今や、微
生物種のなかに哺乳動物の血しよう蛋白質を生産するこ
とが可能である。遺伝子スゾライシングの主要な設計者
は、この方法を種々の血しよう蛋白質たとえば抗血灰病
蛋白質、ガンマーグロブリン、アルブミン、フィブリノ
−ダンおよびプロトロンビンの生産に応用しうろことを
示した。 ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙｅｒ Ｕ、Ｓ、特許
４．２ろ７ｅ２２４ 、 ｃｏｌ、 ９をみよ。遺伝子
工学における初期の実際的仕事は、ソマトスタチンおよ
びインスリンのような比較的小型の蛋白質の生産に限定
されていたけれども、細菌および酵母において異物蛋白
質を生産するだめの遺伝子スプライシングの基本原理は
、より大型の蛋白質の製造に適用しうろことが示された
。それで、すで、に生産された比較的大型の蛋白質がり
コンビナンド微生物で製造されている。たとえばＣ）ｏ
ｒ、０ｆｆｏｎ。
２．９２３，２９７および２，９３３．０００および次
。
。
Ｄｅｍａｖ４ｅ ２．４５８．５８５および２，４７６
，１２６に記載のように分子量約４３，０００の卵アル
ブミンおよびＬａｗｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ −９（２２） ＋６１０３−６１１４（１９
８１’）に記載のような５８５′アミノ酸釦のヒト血清
アルブミンがある。
，１２６に記載のように分子量約４３，０００の卵アル
ブミンおよびＬａｗｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ −９（２２） ＋６１０３−６１１４（１９
８１’）に記載のような５８５′アミノ酸釦のヒト血清
アルブミンがある。
細胞培養系から血しよう蛋白質を分離するための有用な
方法を開発する必要か１本発明者により認められた。他
の蛋白質および細胞成分１代謝物。
方法を開発する必要か１本発明者により認められた。他
の蛋白質および細胞成分１代謝物。
細胞のかでおよび類似の９発酵ブロスおよび消費された
培地中に存在する物質との混合物より、特異的な望む蛋
白質のいずれかを分離することには。
培地中に存在する物質との混合物より、特異的な望む蛋
白質のいずれかを分離することには。
大きな困難をともなう、これまで９発酵ブロスおよび消
費培地より蛋白生成物を採取し単離するのに種々の操作
が用いられた。たとえば細胞または細胞構成成分より、
細胞壁または膜を機械的、物理的または化学的に破壊し
たあと、水および有機溶媒で抽出する。
費培地より蛋白生成物を採取し単離するのに種々の操作
が用いられた。たとえば細胞または細胞構成成分より、
細胞壁または膜を機械的、物理的または化学的に破壊し
たあと、水および有機溶媒で抽出する。
（ＮＨ４）２８０４の塩を用いるか、エタノール、メタ
ノールまたはイソプロパツールのような有機溶媒な用い
るか、ポリエチレングリコールおよびデキストランのよ
うな高分子量重合体を用いるか、または金属イオンおよ
び錯化合物を用いるか、または温度差およびＰＨ条件で
沈殿させる。
ノールまたはイソプロパツールのような有機溶媒な用い
るか、ポリエチレングリコールおよびデキストランのよ
うな高分子量重合体を用いるか、または金属イオンおよ
び錯化合物を用いるか、または温度差およびＰＨ条件で
沈殿させる。
コロイｒ物質たとえばベントナイト、リン酸カルシウム
、硫酸バリウム、ヒドロキシアパタイト活性炭、シリカ
またはＡｌ （ＯＨ）、ゲルに吸着させる。
、硫酸バリウム、ヒドロキシアパタイト活性炭、シリカ
またはＡｌ （ＯＨ）、ゲルに吸着させる。
キーゼルグールおよび他のけいそう土のような濾過助剤
を用いるかまたは用いないで濾過したり。
を用いるかまたは用いないで濾過したり。
遠心したり、または超濾過する。
５ｅｐｈａｄｅｘ■（架橋デキストラン）デル。
Ｓｅ、ｐｈａｒｏｓｅ■ （アガロース）ゲルおよびＤ
ＥＡＥ−８ｅｐｈａｄｅｘまたはＤＦＡＥ−セルロース
イオ７交換ｍ脂のような材料を用い、Ｆ″ル濾過よびイ
オン−交換クロマトグラフィーする。
ＥＡＥ−８ｅｐｈａｄｅｘまたはＤＦＡＥ−セルロース
イオ７交換ｍ脂のような材料を用い、Ｆ″ル濾過よびイ
オン−交換クロマトグラフィーする。
電気泳動および超遠心
脱塩、濃縮および乾燥のような完成操作がある。
蛋白質の採取および分離のためのより最近になって開発
された方法には、イムノアフィニティクロマトグラフイ
ーがある。特定の蛋白質に親和性を有するモノクロナル
抗体多糖類のビードに付着させうる。ビードをクロマト
グラフのカラムに用いる。粗蛋白質溶液なカラムに通す
と、望む蛋白質分子はビードに吸着され、不純物および
不要な物ηはカラムを通過する。適当な洗浄浴液を用い
−を調節して、望む蛋白質をカラムより溶出する。
された方法には、イムノアフィニティクロマトグラフイ
ーがある。特定の蛋白質に親和性を有するモノクロナル
抗体多糖類のビードに付着させうる。ビードをクロマト
グラフのカラムに用いる。粗蛋白質溶液なカラムに通す
と、望む蛋白質分子はビードに吸着され、不純物および
不要な物ηはカラムを通過する。適当な洗浄浴液を用い
−を調節して、望む蛋白質をカラムより溶出する。
本発明の記載
本発明では、水に不溶の架橋されたポリ電解質共重合体
に吸着させて、細胞培養系中の混合物より血しよう蛋白
質を分ける。これらのポリ電解質共重合体は、２から約
４炭素原子数のオレフィン状不飽和の単量体と、４かも
約６炭素原子数のα。
に吸着させて、細胞培養系中の混合物より血しよう蛋白
質を分ける。これらのポリ電解質共重合体は、２から約
４炭素原子数のオレフィン状不飽和の単量体と、４かも
約６炭素原子数のα。
β不飽和ポリカルボン酸または無水物の共重合体で、懸
垂するジ低級アルキルアミノ低級アルキル４ミＩＳ官能
基を有している。
垂するジ低級アルキルアミノ低級アルキル４ミＩＳ官能
基を有している。
水明細書中で使用する。低級アルキル基とは。
約１から約４炭素原子数のアルキル基を意味する。
適当なオレフィン状不飽和単量体の例には、エチレン、
プロピレンおよびイソブチレンがある。
プロピレンおよびイソブチレンがある。
適当なα、β不飽和ポリカルボン酸または無水物の例に
は、マレイン酸、シトラコ／酸、イタコン酸、アコニッ
ト酸または無水物がある。これらの単量体成分のうちで
、エチレンおよび無水マレイン酸が共重合体の形成に有
利である。共重合体は。
は、マレイン酸、シトラコ／酸、イタコン酸、アコニッ
ト酸または無水物がある。これらの単量体成分のうちで
、エチレンおよび無水マレイン酸が共重合体の形成に有
利である。共重合体は。
さらに、２つの単量体成分を実質的に等モル量含有する
のか有利である。
のか有利である。
共重合体を架橋させて水不溶性とするには、たとえば、
ジビニルベンゼンおよびエチレンジアミンのような従来
から使用の架橋剤を用いる。有利な架橋剤は、上記定義
のような低級アルキル基を有すル低級アルキルイミノビ
ス（低級フルキルアミン）であるつ 本発明で使用するポリ電解質共重合体は、Ｕ、Ｓ。
ジビニルベンゼンおよびエチレンジアミンのような従来
から使用の架橋剤を用いる。有利な架橋剤は、上記定義
のような低級アルキル基を有すル低級アルキルイミノビ
ス（低級フルキルアミン）であるつ 本発明で使用するポリ電解質共重合体は、Ｕ、Ｓ。
特許３，５５４．９８５ ；３，５５５．ＤＯ１；４．
０８１，４３２ ；４，０９７，４７３ ；４．１１８
．５５４；および４，１５７．４６１に記載の方法で製
造しりる既知の化合物である。たとえば、エチレンと無
水マレイン酸 （ＥＭＡ ）との有利な共重合体は、百
機溶媒媒体の適当なもののなかで過酸化物触媒の存在で
エチレンと無水マレイン酸とを反応させ製造シラる。生
ずるベースとしてのｇＭＡ共重合体は、２個の１級アミ
ノ基を有し、架橋されたＥＭＡ共重合体を与える。低級
アルキルイミノビス（低級アルキルアミン）のような架
橋剤と反応させうルイミド官能基は、ついで、ジ低級ア
ルキルアミノ低級アルキルアミンと、ＥＭＡ共重合体の
残存する遊離無水物基の１部またはすべてと反応さすこ
とにより架橋された共重合体中に導入し５る。
０８１，４３２ ；４，０９７，４７３ ；４．１１８
．５５４；および４，１５７．４６１に記載の方法で製
造しりる既知の化合物である。たとえば、エチレンと無
水マレイン酸 （ＥＭＡ ）との有利な共重合体は、百
機溶媒媒体の適当なもののなかで過酸化物触媒の存在で
エチレンと無水マレイン酸とを反応させ製造シラる。生
ずるベースとしてのｇＭＡ共重合体は、２個の１級アミ
ノ基を有し、架橋されたＥＭＡ共重合体を与える。低級
アルキルイミノビス（低級アルキルアミン）のような架
橋剤と反応させうルイミド官能基は、ついで、ジ低級ア
ルキルアミノ低級アルキルアミンと、ＥＭＡ共重合体の
残存する遊離無水物基の１部またはすべてと反応さすこ
とにより架橋された共重合体中に導入し５る。
本発明において使用するポリ電解質共重合体吸着剤を調
製するには約３モル係から約１００モル係までのジ低級
アルキルアミノ低級アルキルアミンを用いる。
製するには約３モル係から約１００モル係までのジ低級
アルキルアミノ低級アルキルアミンを用いる。
有利なジ低級アルキルアミノ低級アルキルアミンはジメ
チルアミノプロピルアミンで有利な架橋ポリ電解質共重
合体はまた。凝集段階にＵ、Ｓ。
チルアミノプロピルアミンで有利な架橋ポリ電解質共重
合体はまた。凝集段階にＵ、Ｓ。
特許４，１１８，５５４に記載の方法を用い、そして。
残存する遊離カルボキシルまたは無水物のサイトがあれ
ば、Ｕ、 Ｓ、特許４，１５７，４３１に記載のように
アルコキシアルキルアミンでブロックする方法で製造し
うる。ここでのアルコキシおよびアルキルは、なるべく
は１から４炭素原子数で、もつとも有利なブロック剤は
メトキシプロピルアミンである。
ば、Ｕ、 Ｓ、特許４，１５７，４３１に記載のように
アルコキシアルキルアミンでブロックする方法で製造し
うる。ここでのアルコキシおよびアルキルは、なるべく
は１から４炭素原子数で、もつとも有利なブロック剤は
メトキシプロピルアミンである。
了解されると思うが、ポリ電解質共重合体吸着剤製造の
上記方法の記載は説明のためのみであって０本発明によ
り細胞培養系より血しよう蛋白質を分ける方法が、特定
の方法で製造されたものに限定されてしまうわけでない
。
上記方法の記載は説明のためのみであって０本発明によ
り細胞培養系より血しよう蛋白質を分ける方法が、特定
の方法で製造されたものに限定されてしまうわけでない
。
血清および血しようを分画するのにポリ電解質共重合体
が有用なことはすでに知られていたが。
が有用なことはすでに知られていたが。
種々の蛋白質、ペプチド、核酸および類似の細胞培養成
分と血しよう蛋白質が混合している。微生物細胞培養物
の発酵プロス、哺乳動物細胞培養の消費された培地およ
び他のそのような複雑な細胞培養系より血しよう蛋白質
を分離でる能力をポリ電解質共重合体が亘することは知
られてもいなかったし、示唆されてもいなかった。本明
細書に使用する細胞培養系は、たとえば、細胞の融解物
または抽ｉｔ５？Ｉ］のような培養細胞より遊離される
材料。
分と血しよう蛋白質が混合している。微生物細胞培養物
の発酵プロス、哺乳動物細胞培養の消費された培地およ
び他のそのような複雑な細胞培養系より血しよう蛋白質
を分離でる能力をポリ電解質共重合体が亘することは知
られてもいなかったし、示唆されてもいなかった。本明
細書に使用する細胞培養系は、たとえば、細胞の融解物
または抽ｉｔ５？Ｉ］のような培養細胞より遊離される
材料。
または発酵プロス中に生産されるか導入される材料、ま
たは消費された培地、または、それらの１部分で、望む
血しよう蛋白質を含有しているものとでる。
たは消費された培地、または、それらの１部分で、望む
血しよう蛋白質を含有しているものとでる。
本発明方法は、細胞培養系より、血しよう中にふつうに
見出だされる蛋白質のいずれをも分離するのに用いうる
。このことは以降の詳細な例で説明するが、ここで、細
菌、酵母および肝臓の細胞培養系よりの血液凝固蛋白質
つまりヒト血しようのファクター■の分離、細菌および
酵母細胞培養系よりの別の血しよう蛋白質、つまりヒト
血清アルブミンの分離の例を示す。別の血しよう蛋白質
たとえばａｌ−アンチトリデシン。α２−マクログロブ
リン、フィブロネクチン、セルロゾラスミン。
見出だされる蛋白質のいずれをも分離するのに用いうる
。このことは以降の詳細な例で説明するが、ここで、細
菌、酵母および肝臓の細胞培養系よりの血液凝固蛋白質
つまりヒト血しようのファクター■の分離、細菌および
酵母細胞培養系よりの別の血しよう蛋白質、つまりヒト
血清アルブミンの分離の例を示す。別の血しよう蛋白質
たとえばａｌ−アンチトリデシン。α２−マクログロブ
リン、フィブロネクチン、セルロゾラスミン。
Ｃ−反応性蛋白質、トランスフェリン、フイゾリノーデ
ン、プロトロン♂ン、血しようトロンボシラスチン成分
およびガンマ−グロブリンもまた。
ン、プロトロン♂ン、血しようトロンボシラスチン成分
およびガンマ−グロブリンもまた。
本発明方法により細胞培養系より分けうる。細胞培養系
におけるこれら血しよう蛋白質の由来は。
におけるこれら血しよう蛋白質の由来は。
培地中に外部より加えたもの、たとえば血しよう蛋白質
生長因子、馬、牛または羊の血清または牛胎児血清のよ
うな全血清、または栄養成分や類似のもの、または遺伝
子工学的に細胞培養による血しよう蛋白質の特異的生産
によるものでありうる。
生長因子、馬、牛または羊の血清または牛胎児血清のよ
うな全血清、または栄養成分や類似のもの、または遺伝
子工学的に細胞培養による血しよう蛋白質の特異的生産
によるものでありうる。
細胞工学による微生物では、最初の遺伝子工学は、つぎ
０４つの代表的リコンビナントＤＮＡ要素を用いうる。
０４つの代表的リコンビナントＤＮＡ要素を用いうる。
ｌ）種々の由来のＤＮＡ分子を切断しそして連結するた
めの手段。
めの手段。
２）自身のＤＮＡおよびそれに連結させたよそ者のＤＮ
Ａフラグメントの双方を複製させうる適当な遺伝子担体
。
Ａフラグメントの双方を複製させうる適当な遺伝子担体
。
３）複合ＤＮＡ分子を機能する細菌または酵母細胞に導
入するｔこめの手段、および ４）リコンビナントＤＮＡ分子を獲得した受容細胞のク
ロンを、多数の細胞から選び出す手段。
入するｔこめの手段、および ４）リコンビナントＤＮＡ分子を獲得した受容細胞のク
ロンを、多数の細胞から選び出す手段。
たとえば、 ｐｓｃ １０１の細菌性プラスミドをよそ
者または外部からの遺伝子を宿主細菌中に導入するのに
用いうる。宿主細菌の例としては、たとえば、 ｔｈ
ｅ ＡＩＴｌｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔ、ｕｒ
ｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。
者または外部からの遺伝子を宿主細菌中に導入するのに
用いうる。宿主細菌の例としては、たとえば、 ｔｈ
ｅ ＡＩＴｌｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔ、ｕｒ
ｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。
Ｒｏｃｋｖ、１ｌｌｅ 、 Ｍａｒｙｌａｎｄより受入
番号ＡＴＣＣ３１２４４として入手しうるＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ −１２α１７７６がありう
る。シラスミドは制限エンドニュクレアーゼまたは他の
ＤＮＡ切断酵素たとえばＥｃｏＲｌで切断して、インタ
クトのレゾリコンおよび接着末端を有する直鎖状のＤＮ
Ａフラグメントとなしうる。望むよそ者遺伝子または外
部遺伝子を有し、所定のフェノタイプ的性質および相補
的で連結させうる末端を有する第２のＤＮＡフラグメン
トを、よそ者細胞より採取しうるかまたは会成しうる。
番号ＡＴＣＣ３１２４４として入手しうるＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ −１２α１７７６がありう
る。シラスミドは制限エンドニュクレアーゼまたは他の
ＤＮＡ切断酵素たとえばＥｃｏＲｌで切断して、インタ
クトのレゾリコンおよび接着末端を有する直鎖状のＤＮ
Ａフラグメントとなしうる。望むよそ者遺伝子または外
部遺伝子を有し、所定のフェノタイプ的性質および相補
的で連結させうる末端を有する第２のＤＮＡフラグメン
トを、よそ者細胞より採取しうるかまたは会成しうる。
この第２のＤＮＡフラグメントと第１のＤＮＡフラグメ
ントとを、ＤＮＡリガーゼまたは他のＤＮＡ連結剤たと
えばＴ、ＤＮＡリガーゼでスプライシングし、相補的な
閉じた。再環状化されたプラスミドとする。上側のシラ
スミドのＦＣＯＲｌサイトに第２のＤＮＡフラグメント
な導入すると、シラスミドの調節要素であるｌａｃオペ
ロンの調節下に遺伝子情報が発現する。生ずる組換プラ
スミドを用いて細菌細胞を形質転換し適当な培地中に細
菌を培養して複製させる。フェノタイゾの性状による分
別で望む転換細胞を分離する。たとえば、特定の発育阻
止物質たとえば抗生物質に対する抵抗性または種々の形
態上の差を利用する。
ントとを、ＤＮＡリガーゼまたは他のＤＮＡ連結剤たと
えばＴ、ＤＮＡリガーゼでスプライシングし、相補的な
閉じた。再環状化されたプラスミドとする。上側のシラ
スミドのＦＣＯＲｌサイトに第２のＤＮＡフラグメント
な導入すると、シラスミドの調節要素であるｌａｃオペ
ロンの調節下に遺伝子情報が発現する。生ずる組換プラ
スミドを用いて細菌細胞を形質転換し適当な培地中に細
菌を培養して複製させる。フェノタイゾの性状による分
別で望む転換細胞を分離する。たとえば、特定の発育阻
止物質たとえば抗生物質に対する抵抗性または種々の形
態上の差を利用する。
微生物に哺乳動物の血しよう蛋白質を発現さすのに上記
の一般的原則を応用しうろことは、実際に、Ｌａｗｎ等
が、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ９ （
２２）。
の一般的原則を応用しうろことは、実際に、Ｌａｗｎ等
が、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ９ （
２２）。
６１０３−６１１４（１９８１）に記載したような、リ
コンビナント細菌を用いるヒト血清アルブミン（Ｈ８Ａ
）の生産により説明される。この記載の方法によると、
Ｈ８Ａ遺伝子の完成蛋白質コード領域を含有するように
、従来法によりリコンビナントシラスミドｐＨ８Ａ ｌ
が構成された。このリコンビナントプラスミドベクター
を含有する細Ｍハ、Ｅ、 ｃｏｌｉ染色体のトリシトフ
ァン合成ニ関与する酵素をコードする領域である。 Ｅ
、 ｃｏｌｉｔｒｐプロモーター−オペレーターの調節
下にＨ８Ａ蛋白質を合成する。
コンビナント細菌を用いるヒト血清アルブミン（Ｈ８Ａ
）の生産により説明される。この記載の方法によると、
Ｈ８Ａ遺伝子の完成蛋白質コード領域を含有するように
、従来法によりリコンビナントシラスミドｐＨ８Ａ ｌ
が構成された。このリコンビナントプラスミドベクター
を含有する細Ｍハ、Ｅ、 ｃｏｌｉ染色体のトリシトフ
ァン合成ニ関与する酵素をコードする領域である。 Ｅ
、 ｃｏｌｉｔｒｐプロモーター−オペレーターの調節
下にＨ８Ａ蛋白質を合成する。
ｐＨ８Ａ ｌプラスミド構成のためには、 Ｈ８Ａ ｍ
ＲＮＡの蛋白質をコードする全配列および６′の非翻訳
部分にわたるｃＤＮＡを分離する。最初のｃＤＮＡクロ
ーンは、適当なオリビデオキシチミジレート、っまりオ
リゴ（ｄＴ ）１２−ＩＢ （Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉ
ｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ ）を用いヒト肝臓ＲＮＡをゾラ
イミングして得られ、た。これらのｃＤＮＡを用いて、
プラスミドｐＥＩＦ＋ ３２２配列およびＥ、 ｃｏｌ
ｉ ｔｒｐプロモーター−オペレーターおよびプラスミ
ドｐＬｅＩＦ Ａ ２５に由来でる９人為的平滑末端を
有するＸｂａ ｌ切断サイトに終る− ｔｒｐリーダ
ーペゾチドのりボゾーム結合サイトの３００ ｂｐフラ
グメントを含有するベクターフラグメントよりリコンビ
ナントプラスミドを構成した。ｐＬｅＩＦ Ａ ２５シ
ラスミドはヒト白血球インターフェロンＡ （ＩＦＮα
２）の発現４１６（１９８０）に記載した。Ｅ、 ｃｏ
ｌｉ ｔｒｐプロモーター−オペレーター領域もまた。
ＲＮＡの蛋白質をコードする全配列および６′の非翻訳
部分にわたるｃＤＮＡを分離する。最初のｃＤＮＡクロ
ーンは、適当なオリビデオキシチミジレート、っまりオ
リゴ（ｄＴ ）１２−ＩＢ （Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉ
ｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ ）を用いヒト肝臓ＲＮＡをゾラ
イミングして得られ、た。これらのｃＤＮＡを用いて、
プラスミドｐＥＩＦ＋ ３２２配列およびＥ、 ｃｏｌ
ｉ ｔｒｐプロモーター−オペレーターおよびプラスミ
ドｐＬｅＩＦ Ａ ２５に由来でる９人為的平滑末端を
有するＸｂａ ｌ切断サイトに終る− ｔｒｐリーダ
ーペゾチドのりボゾーム結合サイトの３００ ｂｐフラ
グメントを含有するベクターフラグメントよりリコンビ
ナントプラスミドを構成した。ｐＬｅＩＦ Ａ ２５シ
ラスミドはヒト白血球インターフェロンＡ （ＩＦＮα
２）の発現４１６（１９８０）に記載した。Ｅ、 ｃｏ
ｌｉ ｔｒｐプロモーター−オペレーター領域もまた。
（）ｅｒ、 ０ｆｆｅｎ。
３．０２０．５２８．日本公開特許公報８，０６１，７
９８ 。
９８ 。
Ｆｉｕｒ、 Ｐａｔ、 Ａｐｐｌ’ｎ ５６＋７７６お
よびＲｕ５ｓｅｌおよびＢｅｎｎｅｔ、Ｇｅｎｅ １７
（１）、 ９−１８ （１９８２）に記載されている
。シラスミドｐＢＲ３２２は、性質の明確な、市販され
ているプラスミドで１分子量は２．６ Ｘ １０６であ
る。１０個以上の独特の制限サイトを有し、それは、ア
ンピシリン抵抗性（Ａｐ ）遺伝子内にただひとつのＰ
ｓｔｌ制限サイトおよびテトラサイクリン抵抗性（Ｔｃ
）遺伝子内に位置する。制限エンドニュクレアーゼＥ
ｃｏＲｌ 、 Ｈｉｎｄ ｌ 。
よびＲｕ５ｓｅｌおよびＢｅｎｎｅｔ、Ｇｅｎｅ １７
（１）、 ９−１８ （１９８２）に記載されている
。シラスミドｐＢＲ３２２は、性質の明確な、市販され
ているプラスミドで１分子量は２．６ Ｘ １０６であ
る。１０個以上の独特の制限サイトを有し、それは、ア
ンピシリン抵抗性（Ａｐ ）遺伝子内にただひとつのＰ
ｓｔｌ制限サイトおよびテトラサイクリン抵抗性（Ｔｃ
）遺伝子内に位置する。制限エンドニュクレアーゼＥ
ｃｏＲｌ 、 Ｈｉｎｄ ｌ 。
ＢａｍＨｌ 、およびＳａｌ ｌに対する単一サイトを
含πする。これらの単一制限サイトの重要性は、配列５
’ ＣＴ（）ＣＡ↓Ｇ７．Ｊの５番目と６番目の塩基の
あいだを切る制限エンドニュクレアーゼＰｓＴ ｌによ
り認識されるただひとつのサイトであるということから
も分るであろう。ｐＢＲ３２２中にはひとつだけのＰｓ
ｔサイトがあるので、短かい一重鎚の６′末端を有する
直線状プラスミドを与える。このゾラスミドはさらにＢ
ｏｌｉｖａｒ等がＧｅｎｅ ２ 、９５（１９７７）に
記載ルており、その制限エンドニュクレアーゼマップは
５ｕｔｃｌｉｆｆ 、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲ
ｅｓ、５．２７２１−２７２８（１９７Ｂ）に記載され
ている。これはＥ、 ｃｏｌｉ ＲＲＩ 、 ＮＲＲＬ
Ｂ −１２０１４よりうろことができるが、その培養
物のひとつは、 ｔｈｅ Ｎｏｒｔｂｅｒ Ｒｅｇｉ
ｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ 、
Ｕ−８，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒｅ。
含πする。これらの単一制限サイトの重要性は、配列５
’ ＣＴ（）ＣＡ↓Ｇ７．Ｊの５番目と６番目の塩基の
あいだを切る制限エンドニュクレアーゼＰｓＴ ｌによ
り認識されるただひとつのサイトであるということから
も分るであろう。ｐＢＲ３２２中にはひとつだけのＰｓ
ｔサイトがあるので、短かい一重鎚の６′末端を有する
直線状プラスミドを与える。このゾラスミドはさらにＢ
ｏｌｉｖａｒ等がＧｅｎｅ ２ 、９５（１９７７）に
記載ルており、その制限エンドニュクレアーゼマップは
５ｕｔｃｌｉｆｆ 、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲ
ｅｓ、５．２７２１−２７２８（１９７Ｂ）に記載され
ている。これはＥ、 ｃｏｌｉ ＲＲＩ 、 ＮＲＲＬ
Ｂ −１２０１４よりうろことができるが、その培養
物のひとつは、 ｔｈｅ Ｎｏｒｔｂｅｒ Ｒｅｇｉ
ｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ 、
Ｕ−８，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒｅ。
Ｐｅｏｒｉａ 、 ｌ１１１ｎｏｉｓ Ｕ、Ｓ、Ａ、の
永久的コレクションに寄託されている。
永久的コレクションに寄託されている。
Ｆ−Ａ７．Ｆ−６１，およびＢ−４４と称でるいくつか
の重複しているオリゴニュクレオチドＩノコンビナント
フラグメントが、上記の研究者によるｃ ＤＮＡクロン
より選択され、上記σ） ｐＢＲろ２２変型ベクターフ
ラグメント中に挿入するためσ）適切なりＮＡ鎖となっ
た。フラグメントブロックｆ）相補的な接着末端により
、望む構造遺伝子のメツセージ配列全体を６つの部分よ
り構成することが可能となった。得られる完成されたり
コンビナントゾ５ スミｆ ｐＨ８Ａ ｌ ＆’！−、
プラスミド＋７） １）ＢＲ３２２部分にＴｃおよびＡ
ｐ遺伝子およびＥ、 ｃｏｌｉ ｔｒｐ ７’ロモータ
ーーオペレーター領域を含有するのみならず、 ’ Ｃ
ＤＮＡクロンＦ−４７，Ｆ−６１およびＢ−４４に由来
する）ＩＳＡコード領域を含有した。リコンビナントプ
ラスミドｐＨ８Ａ ｌ中の他の選択された制限エンドニ
ュクレアーゼサイトは、単一のＥＣＯＲｌおよびＢｇｌ
１１制限サイトおよび２個のＸｂａｌおよびＰｓｔ
ｌ制限サイトであった。
の重複しているオリゴニュクレオチドＩノコンビナント
フラグメントが、上記の研究者によるｃ ＤＮＡクロン
より選択され、上記σ） ｐＢＲろ２２変型ベクターフ
ラグメント中に挿入するためσ）適切なりＮＡ鎖となっ
た。フラグメントブロックｆ）相補的な接着末端により
、望む構造遺伝子のメツセージ配列全体を６つの部分よ
り構成することが可能となった。得られる完成されたり
コンビナントゾ５ スミｆ ｐＨ８Ａ ｌ ＆’！−、
プラスミド＋７） １）ＢＲ３２２部分にＴｃおよびＡ
ｐ遺伝子およびＥ、 ｃｏｌｉ ｔｒｐ ７’ロモータ
ーーオペレーター領域を含有するのみならず、 ’ Ｃ
ＤＮＡクロンＦ−４７，Ｆ−６１およびＢ−４４に由来
する）ＩＳＡコード領域を含有した。リコンビナントプ
ラスミドｐＨ８Ａ ｌ中の他の選択された制限エンドニ
ュクレアーゼサイトは、単一のＥＣＯＲｌおよびＢｇｌ
１１制限サイトおよび２個のＸｂａｌおよびＰｓｔ
ｌ制限サイトであった。
この変型されたプラスミドｐＨ８Ａ ｌを用いてに、ｃ
ｏｌｉ Ｋ −１２菌株２９４を変型した。ｐＨ８Ａ
Ｉを含有するＥ、 ｃｏｌｉをトリプトファンを欠く最
小培地に発育させろと、 ）ｔｓＡ抗体と特異的に反応
し、５Ｄ８ｙｌｅリアクリルアミド電気泳動でＩＳＡと
共に移動でる蛋白質を生産すると報告された。
ｏｌｉ Ｋ −１２菌株２９４を変型した。ｐＨ８Ａ
Ｉを含有するＥ、 ｃｏｌｉをトリプトファンを欠く最
小培地に発育させろと、 ）ｔｓＡ抗体と特異的に反応
し、５Ｄ８ｙｌｅリアクリルアミド電気泳動でＩＳＡと
共に移動でる蛋白質を生産すると報告された。
リコンビナントプラスミド中に適当な遺伝子情報を導入
することにより、微述物細胞培養系中に種々の血しよう
蛋白質を同様に発現さすために。
することにより、微述物細胞培養系中に種々の血しよう
蛋白質を同様に発現さすために。
他のプラスミドベクターを同様に構成しうる。それで、
望む蛋白質のポリペプチドアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡを、遺伝コードによりコドンを選択することにより
調製しうるう組立てられた遺伝子はついで発現プラスミ
ド中に挿入し、上記のＩＳＡの例と同じ方法で微生物宿
主中で複製させ５る。
望む蛋白質のポリペプチドアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡを、遺伝コードによりコドンを選択することにより
調製しうるう組立てられた遺伝子はついで発現プラスミ
ド中に挿入し、上記のＩＳＡの例と同じ方法で微生物宿
主中で複製させ５る。
哺乳動物蛋白質を遺伝子工学的に生産するのに応用しう
る微生物宿主ベクター系の代表的な例には、ＩＳＡの生
産のための上記したＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ −１２宿主ベ
クター系以外につぎのものがある。
る微生物宿主ベクター系の代表的な例には、ＩＳＡの生
産のための上記したＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ −１２宿主ベ
クター系以外につぎのものがある。
他のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ株および他のＥｎｔｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉａ−ｃｅａｅたとえばＳａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ：Ｂ、ｇｌｏｂｉｇｉｉ ； ｇｒｌｓｅｕｓ 、 Ｓ、ａｌｂｕｓ 、およびＳ、
ｐｂａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓＳｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｉｊｉ＋たとえばＳ＋ａｕｒｅｕｓ ：お
８ｃｈｉｚｏａａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂ
ｅ今や、宿主の染色体中に組込まるべきすがソーム性ま
たは任意の他の遺伝子に、見かげ上いかなるＤＮＡ断片
を連結されうろことは明らかである。
ｂａｃｔｅｒｉａ−ｃｅａｅたとえばＳａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ：Ｂ、ｇｌｏｂｉｇｉｉ ； ｇｒｌｓｅｕｓ 、 Ｓ、ａｌｂｕｓ 、およびＳ、
ｐｂａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓＳｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｉｊｉ＋たとえばＳ＋ａｕｒｅｕｓ ：お
８ｃｈｉｚｏａａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂ
ｅ今や、宿主の染色体中に組込まるべきすがソーム性ま
たは任意の他の遺伝子に、見かげ上いかなるＤＮＡ断片
を連結されうろことは明らかである。
Ａｙ：ｅｌおよび協同研究者は培養哺乳動物細胞中に。
よそ者ＤＮＡが取り込まれ発現されうろことを示した。
５ｃｉｅｎｃｅ ２０９ 、１４１４−１４２２ （１
９８０）。
９８０）。
このような技術は、 Ｅ、 ｃｏｌｉまたは他の微生物
宿主中には発現されないが、＠乳動物または他のを椎動
物細声において顕著なフェノタイプを有する遺伝子を分
離するのに有用である。このようにして、転換されたＤ
ＮＡは染色体ＤＮＡ中に組込まれる。転換ＤＮＡはまた
シミアンウィルス４０ （５ｖ４０）ベクターを経由し
て培養細胞中に導入されうる。それで、５ｖ４０ウイル
スは、多くの原核細胞遺伝子を哺乳動物細胞にクロニン
グするためのベクターとして用いられた。 Ｍｕｌｌｉ
ｇａｎおよびＢｅｒｇ 、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２０９
＋ １４２２−１４２７（１９８０）。実際、リコンビ
ナン）ＤＮＡの方法論が初めて証明されたのは、ＳＶ４
０へのＬｃｏｌｉがラクトースオペロンの導入であった
。Ｊａｃｋａｏｎ等、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａ
ｄ、ｓｅｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ ６９ ｍ２９０４−２９
０９（１９７２）。ヒト染色体の規定された領域よりク
ロン化ＤＮＡを分離する他の方法は、 Ｇｕｓｅｌｌａ
等によりＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃｏｄ。
宿主中には発現されないが、＠乳動物または他のを椎動
物細声において顕著なフェノタイプを有する遺伝子を分
離するのに有用である。このようにして、転換されたＤ
ＮＡは染色体ＤＮＡ中に組込まれる。転換ＤＮＡはまた
シミアンウィルス４０ （５ｖ４０）ベクターを経由し
て培養細胞中に導入されうる。それで、５ｖ４０ウイル
スは、多くの原核細胞遺伝子を哺乳動物細胞にクロニン
グするためのベクターとして用いられた。 Ｍｕｌｌｉ
ｇａｎおよびＢｅｒｇ 、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２０９
＋ １４２２−１４２７（１９８０）。実際、リコンビ
ナン）ＤＮＡの方法論が初めて証明されたのは、ＳＶ４
０へのＬｃｏｌｉがラクトースオペロンの導入であった
。Ｊａｃｋａｏｎ等、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａ
ｄ、ｓｅｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ ６９ ｍ２９０４−２９
０９（１９７２）。ヒト染色体の規定された領域よりク
ロン化ＤＮＡを分離する他の方法は、 Ｇｕｓｅｌｌａ
等によりＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃｏｄ。
Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ ７７ （５） 、 ２８２９
−２８５３（１９８０）に記載されている。
−２８５３（１９８０）に記載されている。
理解されうるように１本発明は、遺伝子工学により血し
よう蛋白質を提供するために特定の宿主ベクター系に限
定されない。その理由は、血しよう蛋白質を培養系に導
入する方法のいかんにかかわらず、Ｊ当な細胞培養培地
中に細胞を発育させたあとの細胞培養系より血しよう蛋
白質を分離することに本発明は関与しているからである
。
よう蛋白質を提供するために特定の宿主ベクター系に限
定されない。その理由は、血しよう蛋白質を培養系に導
入する方法のいかんにかかわらず、Ｊ当な細胞培養培地
中に細胞を発育させたあとの細胞培養系より血しよう蛋
白質を分離することに本発明は関与しているからである
。
細胞培養培地の元素的組成は、細胞塊および細胞生成物
を構成するための基本的必要条件をみたしそして合成お
よび維持に適当なエネルギーを供給するものとする。た
とえば、微生物細胞のだめの代表的元素組成はつぎのよ
うでありうる。
を構成するための基本的必要条件をみたしそして合成お
よび維持に適当なエネルギーを供給するものとする。た
とえば、微生物細胞のだめの代表的元素組成はつぎのよ
うでありうる。
Ｃ５Ｏ
Ｎ ７−１２Ｐ
１−６８
０．５−１Ｍｇ
０．５それで、適当な培地とは、特定
の細胞の発育のための上記した元素上の必要条件をみた
しうるものとなる。小規模微生物細胞培養のための従来
から用いられている培地は、ふつう、肉または魚の酵素
氷解の可溶性生成物である自消化物（トリノシン消化物
、ペゾトン、ニュトリエントプロス）を基礎としている
。ビタミンおよび補酵素（ふつす２／リツトヤ量）を提
供するために、培地にはしばしばさらに、肉エキス（ミ
ートインフュージョン）または酵母エキスを加える。Ｎ
ａｃｌ 、 Ｋ２ＨＰＯ。
１−６８
０．５−１Ｍｇ
０．５それで、適当な培地とは、特定
の細胞の発育のための上記した元素上の必要条件をみた
しうるものとなる。小規模微生物細胞培養のための従来
から用いられている培地は、ふつう、肉または魚の酵素
氷解の可溶性生成物である自消化物（トリノシン消化物
、ペゾトン、ニュトリエントプロス）を基礎としている
。ビタミンおよび補酵素（ふつす２／リツトヤ量）を提
供するために、培地にはしばしばさらに、肉エキス（ミ
ートインフュージョン）または酵母エキスを加える。Ｎ
ａｃｌ 、 Ｋ２ＨＰＯ。
およびＭｇＳＯ４の無機塩および種々のアミノ酸も必要
に応じて加えうる。血液寒天培地では、血液がさらに追
加の養分を提供する。血清もまた用いうる。ここでアル
ブミン成分は、保護的な非栄養分性の発育因子となる。
に応じて加えうる。血液寒天培地では、血液がさらに追
加の養分を提供する。血清もまた用いうる。ここでアル
ブミン成分は、保護的な非栄養分性の発育因子となる。
グルコース、ラクトース。
およびマルトースのような炭素化合物は１元素炭素への
細胞の要求および必要なエネルギーを提供する。
細胞の要求および必要なエネルギーを提供する。
さらに例として、Ｅ、ｃｏｌｉに対する代表的最小培地
はつぎのよ５である。
はつぎのよ５である。
物質 ｇｔｎ ／ Ｉ
Ｋ２ＨＰ０． ７．０ＫＨ２ｐｏ４３
．０ ＮａｐミルサイトレートＨ２００，５ Ｍｇ８０．・７Ｈ２００，Ｉ Ｆ ｅ Ｓ Ｏ４０−０１ （ＮＨ４） ２８０４ １．０グルコース
２．０ 大規模の発酵においては、ホス４１分解コンスターチ、
コーンシュゴー。糖蜜、 Ｃ５ｒｅｌｏｓｅ■。
．０ ＮａｐミルサイトレートＨ２００，５ Ｍｇ８０．・７Ｈ２００，Ｉ Ｆ ｅ Ｓ Ｏ４０−０１ （ＮＨ４） ２８０４ １．０グルコース
２．０ 大規模の発酵においては、ホス４１分解コンスターチ、
コーンシュゴー。糖蜜、 Ｃ５ｒｅｌｏｓｅ■。
小麦ふすまといった炭水化物材料および他の利用しうる
炭素原、醸造酵母、大豆蛋白質、カゼイン。
炭素原、醸造酵母、大豆蛋白質、カゼイン。
尿素、アンモニウム塩、硝酸塩、他の利用しうる窒累原
といった窒素性材料より適当な発酵培地を調製しうる。
といった窒素性材料より適当な発酵培地を調製しうる。
これらの発酵培地成分の原料は、組物質でもより精製し
た物質でもよい。Ｎ−Ｚ−Ａｍ １ ｎ Ｉｌｌ■蛋白
質氷解物、コーンステイーシリカ−およびデイステイラ
ースソルゾルは、微生物細胞培養系に有用な栄養−成分
を提供する。市販品として入手しうる複合材料である。
た物質でもよい。Ｎ−Ｚ−Ａｍ １ ｎ Ｉｌｌ■蛋白
質氷解物、コーンステイーシリカ−およびデイステイラ
ースソルゾルは、微生物細胞培養系に有用な栄養−成分
を提供する。市販品として入手しうる複合材料である。
Ｎ−Ｚ−Ａｍｉｎｅは。
らく農産業の副産物である。カゼインの酵素消化物であ
る。コーンステイープリカーは、コーンスターチ製造の
副産物で、 ａｉ々の蛋白水解物、Ｂ−信金ビタミン、
アミン、および他の有機物および無機物質を含めた複合
物質を含有する。デイステイラースソルプルは、アルコ
ール飲料製造の副産物である。
る。コーンステイープリカーは、コーンスターチ製造の
副産物で、 ａｉ々の蛋白水解物、Ｂ−信金ビタミン、
アミン、および他の有機物および無機物質を含めた複合
物質を含有する。デイステイラースソルプルは、アルコ
ール飲料製造の副産物である。
微生物の必要としうる微量栄養成分は、ふつう主要な発
酵培地成分中に存在するので、微量成分を別に添加する
必要はふつうない。たとえば、金属の塩化物、硫酸塩、
リン酸塩および硝酸塩は。
酵培地成分中に存在するので、微量成分を別に添加する
必要はふつうない。たとえば、金属の塩化物、硫酸塩、
リン酸塩および硝酸塩は。
主要な炭素および窒素成分とあわせて発酵培地中に存在
するのがふつうである。
するのがふつうである。
同様に、哺乳動物および他のを推動物の細胞の発育のた
めの適当な培地は、同化しうる。窒素原。
めの適当な培地は、同化しうる。窒素原。
炭素原および無機塩を含有する。これらは、よく知られ
ている組織培養の培地たとえば、 ＢａｓａｌＭｅｄｉ
ｕｍ Ｅａｇｌｅ’ｓ （ＢＭｇ ） ＋Ｅａｇｌｅ’
ｓ ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ
（ＭＥＭ ） 、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉ
ｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉａ 、Ｍｅｄｉｕｍ １９
９ 、そしてバランスド サルト ツルージョン（ＢＳ
Ｓ）タトえば１種々の栄養成分で強化されたｇａ ｇ
ｌ ｅおよび）（ａｎｋｓ培地がある。これらは市販品
として入手しうる培地で、Ｈ，ＪｌＭｏｒｔｏｎ ｒ
Ｉｎ Ｖｌｔｒｏ ６．８９−１０８（１９７０）に詳
記されている。これらの従来法による培地は、既知の不
可欠アミノ酸、無機塩、ビタミンおよび炭水化物を含有
する。それらはしばしば、牛胎児血清のような哺乳動物
血清で強化される。
ている組織培養の培地たとえば、 ＢａｓａｌＭｅｄｉ
ｕｍ Ｅａｇｌｅ’ｓ （ＢＭｇ ） ＋Ｅａｇｌｅ’
ｓ ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ
（ＭＥＭ ） 、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉ
ｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉａ 、Ｍｅｄｉｕｍ １９
９ 、そしてバランスド サルト ツルージョン（ＢＳ
Ｓ）タトえば１種々の栄養成分で強化されたｇａ ｇ
ｌ ｅおよび）（ａｎｋｓ培地がある。これらは市販品
として入手しうる培地で、Ｈ，ＪｌＭｏｒｔｏｎ ｒ
Ｉｎ Ｖｌｔｒｏ ６．８９−１０８（１９７０）に詳
記されている。これらの従来法による培地は、既知の不
可欠アミノ酸、無機塩、ビタミンおよび炭水化物を含有
する。それらはしばしば、牛胎児血清のような哺乳動物
血清で強化される。
血しよう蛋白質の生合成における肝臓の支配的役割から
、肝臓細胞は１本発明のひとつの特徴に従い、培養し血
しよう蛋白質成分を分離するための遊離な哺乳動物細胞
である。血液の凝固に関与する血しよう成分の場合に、
腫瘍細胞の培養物は本発明で特に有用である。つまり、
腫瘍患者には。
、肝臓細胞は１本発明のひとつの特徴に従い、培養し血
しよう蛋白質成分を分離するための遊離な哺乳動物細胞
である。血液の凝固に関与する血しよう成分の場合に、
腫瘍細胞の培養物は本発明で特に有用である。つまり、
腫瘍患者には。
凝固異常がふつうに観察され、ヒトお」：び動物中での
多くの１次的および移植腫瘍のまわりにフィブリンが沈
着することが報告された。たとえばＤｖｏｒａｋ等、
５ｃｉｅｎｃｅ 、 ２１２ 、９２３−９２４（１９
８１）をみよ、また、培養肝癌細胞からアルブミンをう
ろこともできることが知られている。
多くの１次的および移植腫瘍のまわりにフィブリンが沈
着することが報告された。たとえばＤｖｏｒａｋ等、
５ｃｉｅｎｃｅ 、 ２１２ 、９２３−９２４（１９
８１）をみよ、また、培養肝癌細胞からアルブミンをう
ろこともできることが知られている。
哺乳動ｗＪ細胞培養系より血しよう成分を分けることを
、ヒト肝臓アデノカルシノーマセルライン５Ｋ−ＨＥＰ
−１の細胞培養系よりヒトファクター■を分けることを
例として説明する。確立されたセルラインＳＫ −ＨＥ
Ｐ −１は、１９７１年にＳｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉ
ｎｇ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｑｓｅａｒｃｈのＧ＋・ｒｒｅｍｐｅにより肝アデノカ
ルシノーマより得られこのセルラインの培養物はこの研
究所より入手しうる。
、ヒト肝臓アデノカルシノーマセルライン５Ｋ−ＨＥＰ
−１の細胞培養系よりヒトファクター■を分けることを
例として説明する。確立されたセルラインＳＫ −ＨＥ
Ｐ −１は、１９７１年にＳｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉ
ｎｇ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｑｓｅａｒｃｈのＧ＋・ｒｒｅｍｐｅにより肝アデノカ
ルシノーマより得られこのセルラインの培養物はこの研
究所より入手しうる。
セルラインＳＫ −ＨＥＰ −１の確立および特徴につ
いてはつぎのような文献がある。
いてはつぎのような文献がある。
１１ｉ’ｏｇｈおよびＴｒｅｍｐ’ｅ 、 ” Ｎｅｗ
Ｈｕｍａｎ ＴｕｍｏｒＣｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ
″ 、Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅ１ｌａ Ｉｎ
Ｖｉｔｒ。
Ｈｕｍａｎ ＴｕｍｏｒＣｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ
″ 、Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅ１ｌａ Ｉｎ
Ｖｉｔｒ。
（Ｆｏｇｈ ｌ ｅｄ、） ＊ Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｕｂｌ、Ｃｏｒｐ＋、 ＮｅｗＹｏｒｋ 、
１９７ ５ ｒ ｐｐ、 １ １５−５４ ；Ｆ
ｏｇｈ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、Ｎａｔ’ｌ、Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｉｎ５ｔ、 ５ ’ｆ３ 。
Ｐｕｂｌ、Ｃｏｒｐ＋、 ＮｅｗＹｏｒｋ 、
１９７ ５ ｒ ｐｐ、 １ １５−５４ ；Ｆ
ｏｇｈ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、Ｎａｔ’ｌ、Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｉｎ５ｔ、 ５ ’ｆ３ 。
２０９−１４（１９７７）；
Ｆｏｇｈ ａｔ ａｌ＋、 Ｊ＋Ｎａｔ、’ｌ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｉｎ５ｔ、 ５９ ＋２２１−２５（１９７
７）。
ｃｅｒ Ｉｎ５ｔ、 ５９ ＋２２１−２５（１９７
７）。
細胞培養系よりファクターＶｌ１１を分けるための本発
明のひとつの具体例として、ポリ電解質は、約６モル係
から約７モル係の懸垂するジ低級アルキルアミノ低級ア
ルキルイミド官能基を含有する。
明のひとつの具体例として、ポリ電解質は、約６モル係
から約７モル係の懸垂するジ低級アルキルアミノ低級ア
ルキルイミド官能基を含有する。
約３モル係から約１０モル係までの低級アルキルイミノ
ビス（低級アルキルアミン）で架橋された。
ビス（低級アルキルアミン）で架橋された。
エチレンと無水マレイン酸との共重合体がある。
そして、これは、残存する遊離カルボキシルまたは無水
物サイトの実質的にすべてかアルコキシアルキルアミン
でふさがれていることを特徴とする。
物サイトの実質的にすべてかアルコキシアルキルアミン
でふさがれていることを特徴とする。
有利なのは、共重合体はメチルイミノビスゾロビルアミ
ンで架橋させ、懸垂する基がジメチルアミノゾロビルイ
ミドの場合である。この具体例の分離プロセスで用いる
ポリ電解質の濃度は、１部には、処理する細胞培養系中
のファクター■の量に依存するが、一般的に、約１から
約１０重量係。
ンで架橋させ、懸垂する基がジメチルアミノゾロビルイ
ミドの場合である。この具体例の分離プロセスで用いる
ポリ電解質の濃度は、１部には、処理する細胞培養系中
のファクター■の量に依存するが、一般的に、約１から
約１０重量係。
そしてなるべくは約５から約６重量係の濃度にポリ電解
質を用いてすぐれた結果を得られた。細胞培養系の−」
はなるべくは、ファクター■１の吸着の段階で約５．５
から約６．５に調整する。
質を用いてすぐれた結果を得られた。細胞培養系の−」
はなるべくは、ファクター■１の吸着の段階で約５．５
から約６．５に調整する。
吸着されたファクター■の上清よりの分離は。
濾過、遠心、および類似の分離操作で実施しうる。
ファクター■蛋白質の溶出は、約１から約６七ルのＮａ
Ｃ１なるべくは約１．５から約１．８モルのＮａＣ１゜
および他の生理的に許容されうる浴出液を用いて行なう
。
Ｃ１なるべくは約１．５から約１．８モルのＮａＣ１゜
および他の生理的に許容されうる浴出液を用いて行なう
。
細胞培養系よりアルブミンを分離する１本発明の別の具
体例として、ポリ電解質はなるべくは。
体例として、ポリ電解質はなるべくは。
ファクター■について上記したのと同様とするが。
懸垂する官能基の含量は約９０モル係から約１００モル
係までとし、残存する遊離カルざキシルまたは無水物の
サイトは、ふさがれていても、そのままでもよい。この
具体例での分離プロセスに用いるポリ電解質の濃度は９
部分的には、処理される細胞培養系中のアルブミンの量
によって変化するが、一般的に、約０．０１から約２０
重量係の濃度に用いてよい結果を与える。細胞培養系の
ＰＨは。
係までとし、残存する遊離カルざキシルまたは無水物の
サイトは、ふさがれていても、そのままでもよい。この
具体例での分離プロセスに用いるポリ電解質の濃度は９
部分的には、処理される細胞培養系中のアルブミンの量
によって変化するが、一般的に、約０．０１から約２０
重量係の濃度に用いてよい結果を与える。細胞培養系の
ＰＨは。
アルブミン吸着段階のあいだ約６．５から７．５に調整
する。上清よりの吸着されたアルブミンの分離および、
吸着剤よりのアルブミンの溶出はファクター■について
上記したような様式で実施しうる。
する。上清よりの吸着されたアルブミンの分離および、
吸着剤よりのアルブミンの溶出はファクター■について
上記したような様式で実施しうる。
溶出段階でＰＨを約６．５から約４．５に調整し、約０
．０１から約０．１モルのＮａＣ１で浴出するのが有利
である。
．０１から約０．１モルのＮａＣ１で浴出するのが有利
である。
つぎに実施例を示して本発明を説明するが９本発明がこ
れらにより限定されるわけでない。
れらにより限定されるわけでない。
例１
この例は、ポリ電解質共重合体に吸着させ、細菌および
酵母培養物よりヒト血しょう■ファクターを分離するこ
とな説明する。
酵母培養物よりヒト血しょう■ファクターを分離するこ
とな説明する。
Ｅ８ｃｈｅｒｔｃｂｉａ ｃｏｌｉ細菌およびＳａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母の細胞を
つぎの条件で培養し処理した。
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母の細胞を
つぎの条件で培養し処理した。
ｇ、ｃｏｌｉの培地： Ｌｕｒｌａ Ｂｒｏｔｈ１７．
５．ｌｉ’ ＮａＣ１ １７，５，！ｉｉ’酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ）３５＋Ｑ
／７ ’Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｒｃｏ）
４．２ ｍｌ ２Ｎ ＮａＯＨ ３５０ｏ ｍ脱イオン蒸留水 上記の材料をかくはん浴解し、溶液は３０分オートクレ
ーブしたＯ Ｅ、ｃｏｌｉ菌株：に１２ 培養：上記培地中に６７°Ｃで４８時間出発時の濃度＝
５縦の寒天斜面より３５０ＯＮの上記培地に懸濁 最終濃度： ５ Ｘ １０９細胞／縦 細胞は、 Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ ２−２１冷凍遠心機で
６５００ｒｐｍで１０分遠心 採取された細胞不含上清：３０００ＩｒＬｔ採取された
細胞：１４．４４．！ｉ’ 細胞の破壊＝８ｇの細胞を、 ８２ｒ７４０ Ｋ１１ｏ
ｐａｓｃａｌ／回で４回、１フレンチプレス中で破壊 酵母用培地： ｙＥｐＤ 溶液ｆｉｌ ： ２５ ｇ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ ）
７ Ｑ ｇＢａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ （Ｄｉｒｃｏ
）３１５０Ｍの脱イオン蒸留水 溶ｇ＋２１ニア０ｇデキストロース ３５Ｃ１／の脱イオン蒸留水 溶液１３１ ： ３．５ 、！ｉ’の（ＮＨ，） ２Ｓ
Ｏａ１７．５紋の脱イオン蒸留水 溶液＋１１および（２）は別々にオートクレーブした。
５．ｌｉ’ ＮａＣ１ １７，５，！ｉｉ’酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ）３５＋Ｑ
／７ ’Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｒｃｏ）
４．２ ｍｌ ２Ｎ ＮａＯＨ ３５０ｏ ｍ脱イオン蒸留水 上記の材料をかくはん浴解し、溶液は３０分オートクレ
ーブしたＯ Ｅ、ｃｏｌｉ菌株：に１２ 培養：上記培地中に６７°Ｃで４８時間出発時の濃度＝
５縦の寒天斜面より３５０ＯＮの上記培地に懸濁 最終濃度： ５ Ｘ １０９細胞／縦 細胞は、 Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ ２−２１冷凍遠心機で
６５００ｒｐｍで１０分遠心 採取された細胞不含上清：３０００ＩｒＬｔ採取された
細胞：１４．４４．！ｉ’ 細胞の破壊＝８ｇの細胞を、 ８２ｒ７４０ Ｋ１１ｏ
ｐａｓｃａｌ／回で４回、１フレンチプレス中で破壊 酵母用培地： ｙＥｐＤ 溶液ｆｉｌ ： ２５ ｇ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ ）
７ Ｑ ｇＢａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ （Ｄｉｒｃｏ
）３１５０Ｍの脱イオン蒸留水 溶ｇ＋２１ニア０ｇデキストロース ３５Ｃ１／の脱イオン蒸留水 溶液１３１ ： ３．５ 、！ｉ’の（ＮＨ，） ２Ｓ
Ｏａ１７．５紋の脱イオン蒸留水 溶液＋１１および（２）は別々にオートクレーブした。
浴液ｆｉ＋および（２）は温かいうちに減圧で、溶液（
３）とつぎの割合に合併した。
３）とつぎの割合に合併した。
酵母菌株：Ｍ２Ｓ
培養：上記培地中でかくはんしなから３０°Ｃで４５時
間 最初の′Ｉ＃度：１，５ｒｎｔの寒天斜面培養物を上記
培地の３５００＃＋７に懸濁 最終濃度： ５ ｘ ｉ Ｃ９細胞／縦細胞は冷凍Ｂｅ
ｃｋｍａｎ Ｊ ２−２１遠心機中で１０分間３５００
ｒｐｍで遠心 採取された細胞不含上清：２５００ｒｆＬｔ採取された
細胞：２８．Ｏｇ 細胞の破壊：１０３．Ａ２５キロパス力ル／回で４回フ
レンチプレス中で８ｇの細胞を 破壊 市販の、島度に精製された。ヒト血しようファクター■
濃厚液（Ｈｅｍｏｆｉｌ■ＡＨＦ Ｕ−８，特許社）を
１０ｍ／の蒸留水で再構成し、上記の細胞不含上清およ
び上記の破壊細胞の生理食塩水中懸濁液（３０−１９０
ｍｌの割合）中でインキュベートした。それぞれの懸濁
液より、つぎの水不溶架橋ポリ電解質重合体樹脂（樹脂
Ａ）で吸着分離した。
間 最初の′Ｉ＃度：１，５ｒｎｔの寒天斜面培養物を上記
培地の３５００＃＋７に懸濁 最終濃度： ５ ｘ ｉ Ｃ９細胞／縦細胞は冷凍Ｂｅ
ｃｋｍａｎ Ｊ ２−２１遠心機中で１０分間３５００
ｒｐｍで遠心 採取された細胞不含上清：２５００ｒｆＬｔ採取された
細胞：２８．Ｏｇ 細胞の破壊：１０３．Ａ２５キロパス力ル／回で４回フ
レンチプレス中で８ｇの細胞を 破壊 市販の、島度に精製された。ヒト血しようファクター■
濃厚液（Ｈｅｍｏｆｉｌ■ＡＨＦ Ｕ−８，特許社）を
１０ｍ／の蒸留水で再構成し、上記の細胞不含上清およ
び上記の破壊細胞の生理食塩水中懸濁液（３０−１９０
ｍｌの割合）中でインキュベートした。それぞれの懸濁
液より、つぎの水不溶架橋ポリ電解質重合体樹脂（樹脂
Ａ）で吸着分離した。
樹脂Ａは５モル係のメチルイミノビス（プロピルアミン
）で架橋された。５モル係の懸垂ジメチルアミノプロピ
ルイミド基を含有する。エチレンと無水マレイン酸との
実質的等モルの量の共重合体である。遊離カルボキシル
基または無水物の基のすべては、さらに、メトキシプロ
ピルアミンでふさがれている。このポリ電解質共重合体
は。
）で架橋された。５モル係の懸垂ジメチルアミノプロピ
ルイミド基を含有する。エチレンと無水マレイン酸との
実質的等モルの量の共重合体である。遊離カルボキシル
基または無水物の基のすべては、さらに、メトキシプロ
ピルアミンでふさがれている。このポリ電解質共重合体
は。
Ｕ、 Ｓ、特許４，１５７，４３１の例１記載のような
反応剤を示したモル割合で用いて製造した。
反応剤を示したモル割合で用いて製造した。
使用前、樹脂Ａは、つぎのように予備的に条件づけした
。
。
０．１％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ ）を安定剤とし
て含有する２００ｍｔの０．１５４’ＭのＮａＣ１中で
１２グラムの樹脂Ａをスラリーとした。、（ヒト血清ア
ルブミンも、 ＢＡＡに代えて用いうる。）１Ｍくえん
酸でＰＨを４．０に調整したスラリーは、シラスチック
メツフナ−濾斗上で、 Ｗｈａｔｍａｎ Ａ ５４濾紙
を通して濾過した。４−ｇはすて、ポリ電解質重合体ケ
ーキを、０，１％のＢＳＡを含有する２００ＷＬｔの０
．１５４ＭのＮａＣ１中にスラリーとした。ついで１Ｎ
のＮａＯＨで−を５．８に調整し、ｐｉ−１５，８で１
０分かくはんした。スラリーはふたたびプラスチツクゾ
ツフナー濾斗上ワットマンＡ５４濾紙を通して濾過した
。濾液をすてポリ電解質共重合体ケーキを採取し、下記
のように用いた。
て含有する２００ｍｔの０．１５４’ＭのＮａＣ１中で
１２グラムの樹脂Ａをスラリーとした。、（ヒト血清ア
ルブミンも、 ＢＡＡに代えて用いうる。）１Ｍくえん
酸でＰＨを４．０に調整したスラリーは、シラスチック
メツフナ−濾斗上で、 Ｗｈａｔｍａｎ Ａ ５４濾紙
を通して濾過した。４−ｇはすて、ポリ電解質重合体ケ
ーキを、０，１％のＢＳＡを含有する２００ＷＬｔの０
．１５４ＭのＮａＣ１中にスラリーとした。ついで１Ｎ
のＮａＯＨで−を５．８に調整し、ｐｉ−１５，８で１
０分かくはんした。スラリーはふたたびプラスチツクゾ
ツフナー濾斗上ワットマンＡ５４濾紙を通して濾過した
。濾液をすてポリ電解質共重合体ケーキを採取し、下記
のように用いた。
分離プロセスはつぎのように実施した。
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ１社よりのアプロチニンプ
ロテアーゼ阻害剤（１ｍｉ、つまり、１Ｏ−２０）リゾ
シン阻害剤単位）を安定剤として、プラスチックビーカ
ーに入れた。上記調製のＥ、 ｃｏｌｉ培養物上清の１
９０縦に加えた＋）６から５分かくはんしたあとで、再
構成）（ｅｍｏｆｉｌ ＡＨＦ （ファクター■の２６
４単位）の１［ＩＭを加え、混合物はかくはんし、試料
（ａｔと同様に分析して、最初のベースラインレベルな
設定した。この混合物を、上記に採取したポリ電解質重
合体ケーキに添加し、１Ｍくえん酸でＰＨを５．８に調
整し、 Ｐｌ−１５，８で２０分かくはんした。スラリ
ーはプラスチックプツフナー濾斗上、ワットマンＡ５４
濾紙を通した。ポリエチレンケーキを乾燥し破壊する前
に、濾液容量を測定し、試１（ｂｌを採取した。ついで
０．１％のＢＳＡを含有する２ ００ ｍｌ （Ｄ Ｏ
，００２Ｍ ＮａＣ１をポリエチレンケーキにゆっく
り加えた。濾液をすて、ケーキは、 ０，１ ｔｌｂＢ
ＳＡを含有する０、３ ＭのＮａ Ｃ１の２００ｍ１に
分散させた。ｐＨ５，８で５分かくはんした。スラリー
は、プラスチックプッフナー濾斗上。
ロテアーゼ阻害剤（１ｍｉ、つまり、１Ｏ−２０）リゾ
シン阻害剤単位）を安定剤として、プラスチックビーカ
ーに入れた。上記調製のＥ、 ｃｏｌｉ培養物上清の１
９０縦に加えた＋）６から５分かくはんしたあとで、再
構成）（ｅｍｏｆｉｌ ＡＨＦ （ファクター■の２６
４単位）の１［ＩＭを加え、混合物はかくはんし、試料
（ａｔと同様に分析して、最初のベースラインレベルな
設定した。この混合物を、上記に採取したポリ電解質重
合体ケーキに添加し、１Ｍくえん酸でＰＨを５．８に調
整し、 Ｐｌ−１５，８で２０分かくはんした。スラリ
ーはプラスチックプツフナー濾斗上、ワットマンＡ５４
濾紙を通した。ポリエチレンケーキを乾燥し破壊する前
に、濾液容量を測定し、試１（ｂｌを採取した。ついで
０．１％のＢＳＡを含有する２ ００ ｍｌ （Ｄ Ｏ
，００２Ｍ ＮａＣ１をポリエチレンケーキにゆっく
り加えた。濾液をすて、ケーキは、 ０，１ ｔｌｂＢ
ＳＡを含有する０、３ ＭのＮａ Ｃ１の２００ｍ１に
分散させた。ｐＨ５，８で５分かくはんした。スラリー
は、プラスチックプッフナー濾斗上。
ワットマン屋５４濾紙を通して醐過した。ポリ電解質重
合体ケーキを乾燥粉砕するより前に、濾液容量を測定し
、試料（ｃｌを採取した。０．１ ％ Ｂ ８ Ａ含有
２０ＯＮの０．３ＭのＮａＣ１を用いてポリ電解質ケー
キを洗い、濾液なすてた。ポリ電解質ケーキは、安定剤
として０．１Ｍのリジンおよび０．１％のＢＳＡ安定剤
を含有する。２００ｍ／の１．５ＭのＮａＣ１中に分散
させた。１ＭのＮａＯＨ″′ｃ″−を６．０に調整し、
スラリーなＰＨ６，０で２０分かくはんした。
合体ケーキを乾燥粉砕するより前に、濾液容量を測定し
、試料（ｃｌを採取した。０．１ ％ Ｂ ８ Ａ含有
２０ＯＮの０．３ＭのＮａＣ１を用いてポリ電解質ケー
キを洗い、濾液なすてた。ポリ電解質ケーキは、安定剤
として０．１Ｍのリジンおよび０．１％のＢＳＡ安定剤
を含有する。２００ｍ／の１．５ＭのＮａＣ１中に分散
させた。１ＭのＮａＯＨ″′ｃ″−を６．０に調整し、
スラリーなＰＨ６，０で２０分かくはんした。
スラリーは、プラスチックプツフナー濾斗上ワットマン
Ａ５４濾紙で濾過したうポリ電解質重合体ケーキにすて
、＃Ｉ液は、プツフナー濾斗上ワットマン１６１濾紙を
通してｆＩＩ過した。生ずる濾液の容量を測定し、試料
（ｄｌを分析のために採取した。
Ａ５４濾紙で濾過したうポリ電解質重合体ケーキにすて
、＃Ｉ液は、プツフナー濾斗上ワットマン１６１濾紙を
通してｆＩＩ過した。生ずる濾液の容量を測定し、試料
（ｄｌを分析のために採取した。
上記の酵母培養物の細胞不含上清および上記のＥ、ｃａ
ｄｉおよび酵母の破壊された細胞懸濁液を用いて、上記
のポリ電解質吸着操作を反復した。
ｄｉおよび酵母の破壊された細胞懸濁液を用いて、上記
のポリ電解質吸着操作を反復した。
Ｍ Ｌ Ａ Ｅｌｅｃｔｒａ ７
５ Ｑ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅｒ（
Ｍｅｄｌｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｍａ
ｔｉｏｎ社）上、従来法による１段階活性化ＰＴＴ （
部分的トロンボプラスチン時間）アッセイシステムによ
り、上記採取の試料のファクターＶｌ１１を分析した。
５ Ｑ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅｒ（
Ｍｅｄｌｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｍａ
ｔｉｏｎ社）上、従来法による１段階活性化ＰＴＴ （
部分的トロンボプラスチン時間）アッセイシステムによ
り、上記採取の試料のファクターＶｌ１１を分析した。
なお、１段階ＰＴＴアッセイシステムのさらに背景とな
る情報については、 Ｑｕｉｃｋ、 ” Ｈｅｍｏｒｒ
ｈａｇｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ”。
る情報については、 Ｑｕｉｃｋ、 ” Ｈｅｍｏｒｒ
ｈａｇｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ”。
Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ 、 Ｐｂ１ｌａｄｅｌｐ
ｈｉａ 、 Ｐａ、 １１９５７；Ｌａｎｇｄｅｌｌ等
、 Ｊ、］＝ａｂ＋Ｃｌ１ｎ＋Ｍｅｄ＋Ａ Ｉ 、 ６
３７（１９５３）；およびＨａｒｄｉ８ｔｙ等、Ｔｈｒ
ｏｍｂ。
ｈｉａ 、 Ｐａ、 １１９５７；Ｌａｎｇｄｅｌｌ等
、 Ｊ、］＝ａｂ＋Ｃｌ１ｎ＋Ｍｅｄ＋Ａ Ｉ 、 ６
３７（１９５３）；およびＨａｒｄｉ８ｔｙ等、Ｔｈｒ
ｏｍｂ。
Ｄｉａｔｈ、 Ｈａｅｍｏｒｒｈ 、 ７ 、２１５
（１９６２）を診照されたい。
（１９６２）を診照されたい。
この装置は、凝集プロセスの開始を示すのに光学センシ
ングを用いる。これは、２仄微分の凝固速度を用いる。
ングを用いる。これは、２仄微分の凝固速度を用いる。
つまり、＃同速度の変化速度である。このアッセイは、
ＡＰＴＴ （活性化された部分的トロンボシラスチン
タイム）試薬キットＡｃｔｉｎ■を用いる。これは、
Ｄａｄｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社より市販され、Ｕ
、 Ｓ、％許３，４８６，９８１記載のような。
ＡＰＴＴ （活性化された部分的トロンボシラスチン
タイム）試薬キットＡｃｔｉｎ■を用いる。これは、
Ｄａｄｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社より市販され、Ｕ
、 Ｓ、％許３，４８６，９８１記載のような。
ファクター■欠如血しようおよびエラジン（ｅｌｌａｇ
ｉｃ ） 酸活性化剤を包含している。凝固時間を、試
料の希釈液について測定し、結果は２回収されたファク
ター■単位および最初の未処理試１（ａｌ中の活性に対
する回収された ファクター■活性のパーセントで表わ
す。結果は次表１に示す。
ｉｃ ） 酸活性化剤を包含している。凝固時間を、試
料の希釈液について測定し、結果は２回収されたファク
ター■単位および最初の未処理試１（ａｌ中の活性に対
する回収された ファクター■活性のパーセントで表わ
す。結果は次表１に示す。
以上の結果は、増加した純度および実質的な収量で、細
菌および酵母のブロスおよび破壊細胞懸濁液よりファク
ター■活性を回収しうろことを示す。
菌および酵母のブロスおよび破壊細胞懸濁液よりファク
ター■活性を回収しうろことを示す。
例２
ポリ電解質共重合体を用いる吸着で、細菌および酵母培
％物よりヒト皿清アルブミンを分離する例を示す。
％物よりヒト皿清アルブミンを分離する例を示す。
Ｅ、 ｃｏｌｉおよびＳ、ｃｅｒｅｕｉｓｉａｅ酵母細
胞を上記例１のように培養し処理した。ヒト皿清アルブ
ミン（Ｃｏｈｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｖ ： Ｊ、Ａ、Ｃ，
８，６８＋ ４５９５（１９４（Ｓ）を、細胞不言上ｉ
および破壊細胞の液相の生理食塩水中希釈液（３Ｌｌ−
１９０ｍＪ希釈）中でインキュベートした。つぎに示す
、水不溶ノ。
胞を上記例１のように培養し処理した。ヒト皿清アルブ
ミン（Ｃｏｈｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｖ ： Ｊ、Ａ、Ｃ，
８，６８＋ ４５９５（１９４（Ｓ）を、細胞不言上ｉ
および破壊細胞の液相の生理食塩水中希釈液（３Ｌｌ−
１９０ｍＪ希釈）中でインキュベートした。つぎに示す
、水不溶ノ。
架ｌｉ＆Ｉｉされたポリ竜哨賀本８体位（脂（樹脂Ｂ）
に吸着させてアルブミン乞分離した。
に吸着させてアルブミン乞分離した。
樹脂Ｂは、５モルチリメチルイミノビス（ｆロビルアミ
ン）で架橋されそして９０モル係の懸垂１−るジメチル
アミンゾロビルアミド基を含有する。
ン）で架橋されそして９０モル係の懸垂１−るジメチル
アミンゾロビルアミド基を含有する。
実質的ＱＣ等モル量のエチレンと無水マレイン酸との共
重合体である。このポリ電解質共重合体は。
重合体である。このポリ電解質共重合体は。
Ｕ、Ｓ、特許４，０９７．４７３および４，１１８，５
５４の例１およびＵ、Ｓ、特許４，１５７，４３１の例
１２記載の反応剤およびモル比を用いる方法に実質的に
準じて製造した。
５４の例１およびＵ、Ｓ、特許４，１５７，４３１の例
１２記載の反応剤およびモル比を用いる方法に実質的に
準じて製造した。
この例によると、上記細胞不含の上清および破壊細胞懸
濁希釈液のそれぞれの２０ｍと、アルブミンの２００呼
／縦浴液の２．４ｒｎｔとを混合した。
濁希釈液のそれぞれの２０ｍと、アルブミンの２００呼
／縦浴液の２．４ｒｎｔとを混合した。
これらの試料は、ベースラインおよび最初のアルブミン
レベルを設定するために、アルブミン添加前後の全蛋白
質含量を分析した。全蛋白質含量はＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、 Ｒｌｃりｈｍｏｎｄ 、
Ｃａ１ｉｆより市販されているＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ａｓ５ａｙ Ｋｉｄを用いて測定した。こ
のキットは、Ｂｒａｄｆｏｒｄ 、 Ａｎａｌ。
レベルを設定するために、アルブミン添加前後の全蛋白
質含量を分析した。全蛋白質含量はＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、 Ｒｌｃりｈｍｏｎｄ 、
Ｃａ１ｉｆより市販されているＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ａｓ５ａｙ Ｋｉｄを用いて測定した。こ
のキットは、Ｂｒａｄｆｏｒｄ 、 Ａｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ７２ 、２４８ （１９７６）の方
法にもとづき、鴇々の蛋白質濃度に応する染料の色の変
化の差を測定する。
法にもとづき、鴇々の蛋白質濃度に応する染料の色の変
化の差を測定する。
アルブミン添加混合物のそれぞれの２０１Ｍを２００ｗ
Ｉｙの樹脂Ｂと混合した。樹脂の懸濁液はＰＨ７，０に
調整し−５０分かくはんし、濾過し、ｍ脂は、それぞれ
約５Ｑｍの脱イオン水で６度洗った６洗液を合併し、前
記のように全蛋白質含量を分析した。それぞれの試料に
ついて、ｍ脂ケーキを２０ｍ１の０．０４ ＭのＮａＣ
１に懸濁させ、ＰＨを４．ＯＫ調整し、溶出アルブミン
を含有する水相を濾別した。溶出試料は、上記のように
全蛋白質含量を測定した。 ” Ａｌｂｕｍｉｎ ５
ｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅ−
ｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ ｗｉｔ
ｈ Ｂｒｏｍｃｒｅｓｏｌ Ｃ）ｒｅｅｎ、”Ｃ１１ｎ
、 Ｃｈｅｍ、 Ａｃｔ、ａ ３１ 、８７ （１９７
１）に記載の特異的アッセイによっても測定した。全蛋
白質含量およびアルブミンの採取についての上記の分析
結果は、次表２に、示す。
Ｉｙの樹脂Ｂと混合した。樹脂の懸濁液はＰＨ７，０に
調整し−５０分かくはんし、濾過し、ｍ脂は、それぞれ
約５Ｑｍの脱イオン水で６度洗った６洗液を合併し、前
記のように全蛋白質含量を分析した。それぞれの試料に
ついて、ｍ脂ケーキを２０ｍ１の０．０４ ＭのＮａＣ
１に懸濁させ、ＰＨを４．ＯＫ調整し、溶出アルブミン
を含有する水相を濾別した。溶出試料は、上記のように
全蛋白質含量を測定した。 ” Ａｌｂｕｍｉｎ ５
ｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅ−
ｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ ｗｉｔ
ｈ Ｂｒｏｍｃｒｅｓｏｌ Ｃ）ｒｅｅｎ、”Ｃ１１ｎ
、 Ｃｈｅｍ、 Ａｃｔ、ａ ３１ 、８７ （１９７
１）に記載の特異的アッセイによっても測定した。全蛋
白質含量およびアルブミンの採取についての上記の分析
結果は、次表２に、示す。
上記の試料はまた。５ＤＳ−ポリアクリルアミドデル電
気泳動に処した。ＳＤ８電気泳動において。
気泳動に処した。ＳＤ８電気泳動において。
試料はナトリウムＰデシルスルフェート（Ｓｎ２）と短
時間加熱し、２０２０−４Ｏ／’ｌ’″ルで７チポリア
クリルアミドデル電気泳動に処し、デルの分子ふるい効
果により大きさに従って分けた。移動率は分子量に関係
する。デルはＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌ ｕｅＲ−２５
０で染め、デンシティ スキャンユング法で評価した。
時間加熱し、２０２０−４Ｏ／’ｌ’″ルで７チポリア
クリルアミドデル電気泳動に処し、デルの分子ふるい効
果により大きさに従って分けた。移動率は分子量に関係
する。デルはＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌ ｕｅＲ−２５
０で染め、デンシティ スキャンユング法で評価した。
電気泳動からは、微生物および酵母のブロスの他の成分
との複合混合物よりアルブミンのすぐれた分離か確かめ
られた。
との複合混合物よりアルブミンのすぐれた分離か確かめ
られた。
例ろ
この例は、ポリ電解質共重合体吸着によりヒト肝臓細胞
培養物よりヒト血しようファクター■を分けることを説
明する。
培養物よりヒト血しようファクター■を分けることを説
明する。
８に−ＨＥＰ＝ｌ肝臓細胞を、４．５ダ／酎のグルコー
スを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ変型ミニマム エツセン
シャル培地（ＭＥＭ）中に３７°Ｃで発育させた。
スを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ変型ミニマム エツセン
シャル培地（ＭＥＭ）中に３７°Ｃで発育させた。
培地には５容量チの牛血清を加えた。細胞はまず。
７５ｃｍ２のＴ−フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ Ｐｌａｓｔ
ｉｃｓ ）中の付着培養でコンフルエンシイ−状態まで
発育させた。細胞の１部は、 Ｕ、Ｓ、特許４，０５９
，４８５記載の操作に実質的に従いスピンナーフラスコ
中でかくはん液体懸濁培養に移し、そこで保持した。
ｉｃｓ ）中の付着培養でコンフルエンシイ−状態まで
発育させた。細胞の１部は、 Ｕ、Ｓ、特許４，０５９
，４８５記載の操作に実質的に従いスピンナーフラスコ
中でかくはん液体懸濁培養に移し、そこで保持した。
Ｔ−フラスコの細胞培養系およびスピンナーフラスコよ
り細胞および細胞不含上清を採取した。
り細胞および細胞不含上清を採取した。
上清まり遠心により細胞を分け、凍結−融解を４回反復
して破壊した。
して破壊した。
細胞不含の上清および生理食塩水（０，９％ＮａＣ１）
中破壊細胞懸１＠液の試料中で、市販され、高度精製さ
れたヒト血しようファクターＷの濃厚赦（ＡＨＦ 、
Ｃｕｔｔｅｒ Ｌａｂ Ｏｒａ ｔ、ｏｒｉｅｓ 獲）
をインキュベートした。 ＡＨＦは、 ＨｅｒＳｈｇｏ
ｌｄ寺、Ｊ、 Ｌａｂ。
中破壊細胞懸１＠液の試料中で、市販され、高度精製さ
れたヒト血しようファクターＷの濃厚赦（ＡＨＦ 、
Ｃｕｔｔｅｒ Ｌａｂ Ｏｒａ ｔ、ｏｒｉｅｓ 獲）
をインキュベートした。 ＡＨＦは、 ＨｅｒＳｈｇｏ
ｌｄ寺、Ｊ、 Ｌａｂ。
の方法の変型および改良により、プールされた新鮮凍結
面しようの冷不浴分画より精製された。このインキュベ
ーションの前に、乾燥状のファクター■は無菌水中で再
構成し、２４０単ｕ／１０ｒｎｔ浴液とした。ファクタ
ー■を外部から加えないで。
面しようの冷不浴分画より精製された。このインキュベ
ーションの前に、乾燥状のファクター■は無菌水中で再
構成し、２４０単ｕ／１０ｒｎｔ浴液とした。ファクタ
ー■を外部から加えないで。
スピンナー培養物よりの破壊細胞について類似の試験を
した（試行ｚ）にの例の５つの試行はっぎのよ５である
。
した（試行ｚ）にの例の５つの試行はっぎのよ５である
。
試行ＶＴ−フラスコ培養物よりの破壊細胞試行ＷＴ−フ
ラスコ培養物よりの細胞不含上清 試行Ｘ スピンナー培養物よりの破壊細胞試行Ｙ スピ
ンナー培養物よりの細胞不含上清試行Ｚ スピンナー培
養物よりの破壊細胞再構成ファクター■はつぎのような
割合でインキュペ・−トした。
ラスコ培養物よりの細胞不含上清 試行Ｘ スピンナー培養物よりの破壊細胞試行Ｙ スピ
ンナー培養物よりの細胞不含上清試行Ｚ スピンナー培
養物よりの破壊細胞再構成ファクター■はつぎのような
割合でインキュペ・−トした。
９０ｍ１の生理食塩水および１〃ばのＡｐｒｏｔｉｎｉ
ｎゾロテアーゼインビビター中、試行Ｖよりの破壊細胞
の１００縦の懸〆蜀液と、１０ｍ１（２４０フアクタ一
■単位）を混合した口 １９０１の細胞不含の試行Ｗの上清および１ＭのＡｐｒ
ｏｔｉｎｉｎ ７°ロチアーゼインヒビターに、１０ｍ
１ （２４ＱファクターＶ■単位）を加えた。
ｎゾロテアーゼインビビター中、試行Ｖよりの破壊細胞
の１００縦の懸〆蜀液と、１０ｍ１（２４０フアクタ一
■単位）を混合した口 １９０１の細胞不含の試行Ｗの上清および１ＭのＡｐｒ
ｏｔｉｎｉｎ ７°ロチアーゼインヒビターに、１０ｍ
１ （２４ＱファクターＶ■単位）を加えた。
試行Ｘよりの破壊細胞１５酎を１７５ｒｎｔの生理食塩
水に含有する懸濁液にＩＯＭ（２４０フアクタ一■単位
）を加えた。
水に含有する懸濁液にＩＯＭ（２４０フアクタ一■単位
）を加えた。
試行Ｙよりの細胞不含上清の１９１ ｒｎｌに９．５σ
（２２８フアクタ一■１単位）を加えた。そして。
（２２８フアクタ一■１単位）を加えた。そして。
ファクター■１１を外部添加しない生理食塩水の１８５
ｍｔに試行Ｚよりの破壊細胞の１５ｉｒを加えた。
ｍｔに試行Ｚよりの破壊細胞の１５ｉｒを加えた。
分離プロセスはつぎのようである。
試行Ｘおよび２の場合には、試料を、まず７０．０■の
樹脂Ｂ（上記例２記載）と混合し、ＰＨを８．０に調整
し、このＰＨでスラリーを２０分かくはんした。混合物
はプツフナー濾斗上ワットマン轟５４濾紙で隠退した。
樹脂Ｂ（上記例２記載）と混合し、ＰＨを８．０に調整
し、このＰＨでスラリーを２０分かくはんした。混合物
はプツフナー濾斗上ワットマン轟５４濾紙で隠退した。
樹脂は蒸留水で濾紙よりはぎ取りビーカーに入れ５分か
くはんした。このＣ昆合物はゾッフナー濾斗上ワットマ
ンＡ Ｉ ａＷ紙で濾過した。樹脂をすて、２度のｇ液
を合併した。濾液の容量を計り、樹脂Ｂに吸着されない
分として試料をアッセイした。
くはんした。このＣ昆合物はゾッフナー濾斗上ワットマ
ンＡ Ｉ ａＷ紙で濾過した。樹脂をすて、２度のｇ液
を合併した。濾液の容量を計り、樹脂Ｂに吸着されない
分として試料をアッセイした。
試行Ｖ、ＷおよびＹよりの試料（樹脂Ｂで処理してない
）および試行ＸおよびＺの上記処理試料（樹脂Ｂ処理よ
りの濾ｇ）を、あらかじめ榮件付けした樹脂Ａ（上記例
１記載）でつぎのように処理した。
）および試行ＸおよびＺの上記処理試料（樹脂Ｂ処理よ
りの濾ｇ）を、あらかじめ榮件付けした樹脂Ａ（上記例
１記載）でつぎのように処理した。
試料および樹脂を混合し、 ＰＨな５．８に調整し。
生ずるスラリーをこの−で２０分かくはんした。
スラリーはプツフナー濾斗上ワットマン扁５４濾紙で濾
過した。ケーキを乾燥し砕くより前に、ａ液の容量を記
録した。試料は、ケ脂Ａに吸着されぬ分動としてアッセ
イした。ついで、０．１％ＢＳＡを加えた２０ＯＮの０
．００２ ＭのＮａ Ｃ１（６液をケーキに注加し、濾
液はすてた。ケーキは０．１％ＢＳＡを加えた２ ００
Ｉｌｌの０．３ｔＡのＮａｃｌ （ｆｆ４ Ｗ中に懸
濁させた。ＰＨ５，８で５分かくはんした。スラリーは
ブツフナー濾斗上、ワットマンノｆｆｉ ５４１１４１
紙を濾過した。ケーキを乾燥し、砕＜ ｍＪに、濾液の
容量を記録した。濾液をアッセイしたか、これは洗液の
活性である。ついで、０．１ ％のＢＳＡを加えた２０
ＯＮの０．３ ＭのＮａＣ１浴Ｑをケーキに注加し。
過した。ケーキを乾燥し砕くより前に、ａ液の容量を記
録した。試料は、ケ脂Ａに吸着されぬ分動としてアッセ
イした。ついで、０．１％ＢＳＡを加えた２０ＯＮの０
．００２ ＭのＮａ Ｃ１（６液をケーキに注加し、濾
液はすてた。ケーキは０．１％ＢＳＡを加えた２ ００
Ｉｌｌの０．３ｔＡのＮａｃｌ （ｆｆ４ Ｗ中に懸
濁させた。ＰＨ５，８で５分かくはんした。スラリーは
ブツフナー濾斗上、ワットマンノｆｆｉ ５４１１４１
紙を濾過した。ケーキを乾燥し、砕＜ ｍＪに、濾液の
容量を記録した。濾液をアッセイしたか、これは洗液の
活性である。ついで、０．１ ％のＢＳＡを加えた２０
ＯＮの０．３ ＭのＮａＣ１浴Ｑをケーキに注加し。
濾液はすてた。樹脂のケーキは−１，５ＭのＮａＣ１。
０．１ Ｍのリジン、 ０．０１ ）ｔのくえん酸ナト
リウムの、０，１％ＢＳＡ添加水性溶ｉ２０ ＯＮ中に
懸濁させた。ＰＨ６で２０分かくはんした。スラリーは
ゾツフナー濾斗上でワットマンＡ５４濾紙を濾過した。
リウムの、０，１％ＢＳＡ添加水性溶ｉ２０ ＯＮ中に
懸濁させた。ＰＨ６で２０分かくはんした。スラリーは
ゾツフナー濾斗上でワットマンＡ５４濾紙を濾過した。
樹脂ケーキをすて、濾液をプッフナー濾斗上ワットマン
屋１濾紙を濾過した。濾液の容量を記録し、試料は、最
終溶出ファクター■分画としてアッセイした。
屋１濾紙を濾過した。濾液の容量を記録し、試料は、最
終溶出ファクター■分画としてアッセイした。
汐１］１のように処理した試料についてファクター■１
をアッセイした。結果は１回収されたファクター一単位
として示した。結果を次表６に示す。
をアッセイした。結果は１回収されたファクター一単位
として示した。結果を次表６に示す。
イン１４
エチレンに代えてそれと当量のプロピレンまたはインブ
チレンを用い、そして（または）無水マレイン酸に代え
てそれと当量のシトラコン酸、イタコン酸またはアコニ
ット酸の無水物を用い、そして（または）ジメチルアミ
ノプロピルアミンに代えてそれと当量のジエチルアミノ
エチルアミンを用いて１例１から３を実施しても実質的
に同様な結果を与える。
チレンを用い、そして（または）無水マレイン酸に代え
てそれと当量のシトラコン酸、イタコン酸またはアコニ
ット酸の無水物を用い、そして（または）ジメチルアミ
ノプロピルアミンに代えてそれと当量のジエチルアミノ
エチルアミンを用いて１例１から３を実施しても実質的
に同様な結果を与える。
本発明の趣旨および範囲を逸脱しないで種々の他の例に
専門家は気付かれるであろうが、それらもすべて特許請
求の範囲に含まれるはずである。
専門家は気付かれるであろうが、それらもすべて特許請
求の範囲に含まれるはずである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）懸垂されているジ低級アルキルアミノ低級アルキ
ルイミド官能基を含有する。２から約６炭素原子数のオ
レフィン状に不飽和の単量体と、４から約６炭素原子数
の、α、β不飽和ポリカルボン酸または無水物との、水
に不溶の、架橋されたポリ電解質共重合体に接触さすこ
とにより、細胞培養系中に混合している血しよう蛋白質
成分を、該系より、該共重合体に吸着さすことからなる
。細胞培養系中に混合している血しよう蛋白質成分を分
離する方法。 （２（細胞培養系が微生物細胞培養系である。上記（１
）項記載の方法。 （３） 細胞培養系が哺乳動物細胞培養系である。上
記（１１項記載の方法。 （４） 微生物細胞培養系が発酵ブロスである上記（
２）項記載の方法。 （５１哺乳動物細胞培養系が消費された細胞培養培地で
ある。上記（３）項記載の方法。 （６）微生物細胞培養系が、破壊微生物細胞の分離物で
ある。上記（２）項記載の方法。 （７） 哺乳動物細胞培養系が、破壊微生物細胞の分
離物である。上記（３）項記載の方法。 （８）微生物細胞が細菌細胞である。上記（２１項記載
の方法。 （９）細菌細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
′細胞である上記（８）項記載の方法。 ｕｏｌ 微生物細胞が酵母細胞である上記（２）項記
載の方法。 αυ 酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｕｉｓｉａｅ細胞である上記１０１項記載の方法。 α渇 哨乳動物細胞かヒト肝臓細胞である。上記（３）
項記載の方法。 （１３） ヒト肝臓細胞が５Ｋ−ＨＥＰ−１細胞であ
る上記ｕり項記載の方法。 ■ オレフィン状不飽和単量体がエチレンでα。 β不飽和ポリカルボン酸または無水物がマレイン酸また
は無水物である上記（１）項記載の方法。 ０９ ジ低級アルキルアミノ低級アルキルイミドがジ
メチルアミノゾロビルイミドである上記圓項記載の方法
。 αω 血しよう蛋白質がヒト血しようファクター■であ
る上記（１）項記載の方法。 α７） 血しよう蛋白質がヒト血清アルブミンである。 上記（１）項記載の方法。 α＆ オレフィン状不飽和単量体がエチレンで、α。 β不飽和ポリカルボン酸または無水物がマレイン酸また
は無水物で、懸垂するジ低級アルキルアミノ低級アルキ
ルイミドがジメチルアミノプロピルイミドで、ポリ電解
質共重合体が約６モル係から約７モル係の該懸垂ジメチ
ルアミノゾロピルイミドを含有し、そして残りの遊離カ
ルざキシルまたは無水物サイトは、アルキル基およびア
ルコキシ基が約１から４炭素原子数であるアルコキシア
ルキルアミンでふさがれている。上記αω項記載の方法
。 （１！Ｊ オレフィン状不飽和単量体がエチレンで、
α。 β不飽和ポリカルボン酸または無水物がマレイン酸また
は無水物で、懸垂するジ低級アルキルアミノ低級アルキ
ルイミドがジメチルアミノプロピルイミドで、ポリ電解
質共重合体は、約９０モル係から約１００モル係までの
該懸垂ジメチルアミノゾロピルイミドを含有する。上記
（１９項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US399604 | 1982-07-19 | ||
| US06/399,604 US4382028A (en) | 1982-07-19 | 1982-07-19 | Separation of plasma proteins from cell culture systems |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5928492A true JPS5928492A (ja) | 1984-02-15 |
| JPH0443638B2 JPH0443638B2 (ja) | 1992-07-17 |
Family
ID=23580190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58130730A Granted JPS5928492A (ja) | 1982-07-19 | 1983-07-18 | 細胞培養系よりの血しよう蛋白質の分離 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4382028A (ja) |
| EP (1) | EP0099871B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5928492A (ja) |
| AT (1) | ATE24934T1 (ja) |
| AU (1) | AU552859B2 (ja) |
| CA (1) | CA1202566A (ja) |
| DE (1) | DE3369159D1 (ja) |
| ES (1) | ES524150A0 (ja) |
| HU (1) | HU196832B (ja) |
| IL (1) | IL69272A (ja) |
| ZA (1) | ZA835181B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US4632981A (en) * | 1982-07-30 | 1986-12-30 | Genentech, Inc. | Human antithrombin III |
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