JPS60243097A - 単クローン抗体の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 この発明は、単クローン抗体の分離法に関する。

免疫系は、耐感染因子の小数４１機構を提供している。

免疫系により、外来物質（抗原）に反応して産生された
抗体は、また、病気の治療及び診断用の目的で有効な物
質である。それ故、免疫系により産生された抗体は、異
なった性質を有している。

」−ジーとミルスタインにより最初に開発されたハイブ
リドーマ技術の出現により、現在では、結合部位が単一
の親和性をもつ基本的には均一な組成の単り１］−ン抗
体を産生４゛ることが可能である。この研究者たちによ
るマウスのハイブリドーマの産生は、［ネイチャーＪ、
２５６巻、４９５−４９７ページ（１９７５年）と［ヨ
ー［−：ピアノ・ジャーナル・Ａブ・イミュノ１」ジー
」、６巻、５１１−５１９ページ（１９７６蛋「）に述
べられ−Ｃいる。この方法にＪ：れば、単一の抗体分子
を人間に産生りるハイブリッド細胞を１９るｌこめに、
マウスミエローマ（骨髄腫）細胞に適合した組織培養を
、免疫したマウスの肺臓細胞と融合さぼる。

一般的に融合は、ガルフエ等「ネイチャー」、２６６巻
、５５０−５５２ページ（１９７７年）で述べているに
うにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）存在下でおこな
われ、続いて、リトルフィールド「勺イエンスＪ、１４
５巻、７０９−７１０ページ（１９６４年）で述べてい
るＪ：うに、ＨＡ　Ｔ培地（ヒポキサンチン、アミノプ
テリン、チミジン）にて選択がおこなわれる。免疫化は
、対象の任意外来抗原でもおこなわれる。これは、　□
例えば、ホルモン、タンパク質、細胞表面抗原、腫瘍マ
ーカー、ウィルス、バクテリア、寄生生物の様なもので
ある。臨床的に重要な広範囲の抗原を供給するのにハイ
ブリドーマを利用した例が、多く示されている（例えば
、セヴイア等、［クリニカル・ケミストリー」、２７巻
、１１号、１７９７−１８０６ページ、１９８１年）。

単りＯ−ン抗体は、ヒト細胞からもｌｌ：！Ｊ：される
例えば、ローゼン等、「セル」、１１巻、１３９−１４
７ページ、（１９７７年）；オルソンとカブラン、「ブ
［Ｉシーディンゲス・Ａブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・１ナイエンシズ・オブ・ディ・−１ナイテツ
ド・ステイク・オブ・アメリカ」７７巻、５４２９−５
４．３１ページ、（１９８０年）；クロス等、「ネイチ
ャーＪ　（０ンドン）、２８８巻、４８８−４９１ペー
ジ（１９８０年）：ヨーロッパ特許出願 第４４７２２号、１月２７日（１９８２年）；ヨーロッ
パ特許出願第６２４０９号、１０月１３１１（１９８２
年）。これらの抗体は、ヒ］−の免疫療法において、マ
ウスの抗体よりも高い寛容性を有す必要がある。

目的のハイブリドーマがうまくクローンされると、人聞
に単クローン抗体を産生ケるために、大規模に細胞を培
養Ｊることが望まれる。単クローン抗体産生のための哺
乳類の細胞の有用な大規模培養方法は、フェーダ−とト
ルバートにより、「す”イエンテイフイツク・アメリカ
ン」、２４８巻、１号、２４−３１ページ、（１９８３
年）に述べられている。

一般には、ハイブリドーマ細胞は、通常の細胞培養培地
、例えば、ＲＰ　Ｍ　Ｉ−１６’１０や、ダルベゴの修
正イーグル培地で生育覆る。培地には、通常血清を添加
する。ウシ胎児自活を１５％まで加えるのが普通である
が、ウシ血清、ウマ面消もまた使用される。

単りＯ−ン抗体産生の他の方法は、半透性の膜に入れら
れたハイブリドーマ細胞の生育を含む米国特許第４／１
０９３３１号明細南に述べられ−（いる。ＨＡ　Ｔによ
る選択は、この方法にＪ、り回避りることができる。融
合過程が顕微鏡で観察され、うまくいかなかった融合は
、この肉眼観察に基づいて除去できるからである。

単クローン抗体の他の生産方法は、−１−）ノラブレシ
等により、「Ｐｒｏｃ、ＡＡＣＲａｎｄ　ＡＳＣＯＪ　
、３０２ページ、（１９８１年）に述べられ（いる中空
ファイバー膜にＪ：るハイブリドーマの培養ぐある。

単りＵ−ン抗体産９−に用いられるハイシリドーマの調
製ぐいくらか異／、Ｔつだ方法は、ツイン−マンとウィ
ーンタン１−ジＡノーノール・Ａブ・メンブラン・パイ
Ａロジー」、６７巻、１６　Ｆ）　−１８２ベージ（１
９８２ｆｆ　）　、メブリンガー出版、二ｌ−３１−り
）、ライマーマン１ビオヒミ力・」−・ヒＡフイジカ・
アクタ」、６９４巻、２２７−２７７ページ（１９８２
年）、ビショツノら （＋’Ｆ１ＢＳレタース１．１４７巻、１号、６４−〔
５８ページ（１９８２年）、王ルゼウイア・バイオメデ
ィカル出版ネ１）の、電気的細胞融合シスフ゛ムにＪ：
るものである。この方法によれば、ハイブリッドする細
胞を、低レベルで、不均一な高周波の゛市場にさらし、
細胞を１−真珠の首飾り１状に配向させる。ついで、直
流パルスをか１ノ、隣接する細胞膜に微細孔をあｔＪる
。これにより、細胞内容を混合し、細胞融合となる。そ
れ故、電気的融合法は、ポリ］ニチレングリ７」−ルに
よる化学的損（ｔｊや、単クローン抗体産生のためのハ
イブリドーマ調製時のウィルス融合における生物学的な
危険を除去してくれる１゜ 細胞培養により単りｌ］−ン抗体を産生さＵｋ後、培地
から抗体を分離精製り−ることが通常望まれる。

各種の既知の分離方法には、硫安沈澱、透析、プロティ
ンＡ−１？ノアロース　によるアノイニテイークロマト
グラフイ、ＤＥＡＥ−セファレル　、ＤＥＡＦ−バイオ
ゲル　、］）に］ＡＥ−アフィゲル・プル−の様なｌ）
　Ｆ　Ａ　ＥカラムにＪ：るイオン交換、又は抗１ｇ−
アガロースによるアフィニティー・クロマトグラフィが
含まれ（いる。

これら及び他の単クローン抗体精製に用いられる通常の
方法は、ゴーディング（１ジ＼７−プール・Ａブ・イミ
ュノ「１ジカル・メソドＪ、３９Ｗ、２８５−３０８ペ
ージ（１９８０年））と、プルツクら（「ジャープル・
オブ・イミコーノ１−１ジカル・メソド」、５３巻、３
１３−３１９ページ（１９８２年））に述べられている
。

ブを明の叢り焦１ 本発明は、細胞培養培地から単り１−１−ン（７１体を
分離する新規方法（・ある。この方法は、単り「、１−
ン抗体産生のためハイブリドーマ細胞をｊｆｌ、養さＵ
た後、細胞培養ｊ８地又は、イの濃縮液ど、水不溶性の
架橋化した高分子電解質の共重合体とを接触さけるもの
である。接触は、高分子電解質の共重合体上でタンパク
質を適当に連続的に吸着、脱着をＪ−るＪ：うなｐＨレ
ベルとイオン塩！！瓜で行なう。

吸着した単り［１−ン抗体が、高分子電解質共重合体に
結合した形態のままで保つことが望まれるならば、脱着
は必要ではない。非結合性の単クローン抗体が望ましい
場合および／又は更に精製を望む場合は、脱着をおこな
うことが望ましい。

これらの高分子電解質の共重合体は、２から約４個の炭
素原子をもつΔレフイン系不飽和単吊体と、４から約６
個の炭素ハλ子をもつα、β　不飽和ポリカルボン酸も
しくはイの無水物との共重合体であり、ジ低級アル４ル
ノ′ミノ低級アル４ルイミド官能側以を有している。

ここで用いる、低級アルキルは１から４個のｖ２索Ｄ；
ミ子を右りるフルキルを愚昧Ｊる。

適当なＡレノイン系不飽和１１１量体の例は、土ブレン
、ブ１１ピレン、イソブチレンである。α、β−不飽和
ポリカル小ン酸もしくはその無水物の例は、マレイン酸
、シトラコン酸、イタコン酸、アコニット酸、ｂｔ、＜
はその無水物である。これらの単量体成分のうち、ブチ
レンとマレイン酸無水物は、共重合体形成に望ましい。

Ｊｔ重合体はＪ：だ、実際−）、　２ｆ！の単量体が等
モル聞合まれることが望ましい。

水不溶性とするための共重合体の架橋化は、例えば、ジ
ビニルベンゼンや、１チレンジアミンのような通常の架
橋剤で行なうことができる。望ましい架橋剤は、上記定
義の低級アルキルを含む低級アルキルイミノビス（低級
アルキルアミン）である。

本発明に使用される高分子電解質共重合体は公知物質で
あり、米国特許第３，５５４，９８５号、第３．５５５
．００１号、第４．０８１．４３２号、第４，０９７，
４７３号、 第４，１１８．５５／Ｉ号、第４，１５７．４３１号各
明細書に）ホベられた方法にＪ、り製造りることができ
る。例えば、ブチレンどンレーｆン酸無水物（ＥＭＡ）
の望ましい共重合体は、適当な有機溶媒中（・′、過酸
化触媒の存在下、エチレンと無水マレイン酸を反応させ
ることにより！Ｅ＋　１でさる。生成しＩＣＥ　Ｍ　Ａ
共重合体は、２つの第１級アミン基をわら、架橋化しＩ
ＣＥＭＡ共重合体をつくる低級アルキルイミノビス（低
級アルキルアミン）のＪ：うな架橋剤と反応させること
ができる。ＥＭＡは、約３モル％から約７モル％の架橋
剤と反応させるのが望ましい。ＦＥ　ＭＡ共重合体の遊
頗状無水基の一部ｂｂ＜は全でと、ジ低級アルキルアミ
ノ低級アルキルアミンを反応さｔ！で、望みのジ低級ア
ルキルアミノ低級アルキルイミド官能側基を、架橋化共
重合体に付加することができる１、約３モル％から約１
０〇七ル％のジ低級アル−１−ルアミノ低級アルキルア
ミンを、本発明に用いる高分子電解質共重合体の調製に
使用される。

好Ｊ、しいジ低級アルキルアミノ低級アルキルアミンは
、ジメｆ−ルアミノゾ１１ピルアミンであり、望ましい
架橋剤は、メブルイミノビス（ゾＩＩピルノノミン）で
ある。

高分子電解質共重合体は、米国１、“Ｉ　’　；＋Ｑ第
４．１１８．５５／Ｉ号明細出に述べられ−（いる凝集
］二稈を用いる方法により調製でき、遊に１のカルボキ
シルあるいは無水物の部位は、米国４’ｌ　ａＱ第４．
１５７゜／１３１号明細書に開示されているアルコキシ
アル４ルアミンでブ１−１ツクリ゛ることができる。上
記アルコキシ及びアルキルは、１から４個の炭素原子を
もつことが望ましく、最適なブ１−１ツク剤は、メトギ
シブｌコビルアミン（゛ある３゜高分子電解質共重合体
の上記ｔＪ産方法の開示は、単に例証を目的とし、本発
明により細胞培養培地から単クローン抗体を分離Ｊる方
法は、これらの特定の製造方法に限定されるものＣ゛は
ない。

高分子電解質共重合体は、血漿と面清の分画、および米
国性お第４，３８２．０２８号明細古に見られる細胞培
養系から血漿タンパク質の分子ａｌｌに有用であること
が知られＣいｌこが、使１１０（の細胞培養培地から単
クローン抗体を分離Ｃきることはこれまで知られ（もい
イに（ノれば、示峻１〕（＼れ（いない。単り１１−ン
抗体は、免疫グ１１Ｊリン画分（ガンマ・グに１プリン
＞　＋Ｊ存イ＋”＋Ｊるボリク１１−ン抗体とは異なり
、コニークＣ・、高い特ＩＣ性をも゛っだ物質（゛ある
。このＪ：うな十分に定義された個々の成分が本発明に
おいて、用いる高分子電解質共重合体を用いて分離され
ることは予想されなかっｌ（。米国性的第４，０９７，
４７３月明細書に述べられている、この高分子電解質共
重合体樹脂を用いた従来技術の血液の分画において、ガ
ンマ・グロブリン画分は樹脂に吸＠されず、溶液中に残
存した。

本発明の方法は、細胞培養培地での相当するハイブリド
ーマの培養により産生きれる各種型の単クローン抗体を
分離するのに適合可能である。この方法により分離され
うるハイブリドーマ抗体の例１．ｔ１小ルｔン、タンパ
ク質、細胞表面抗原、蝕瘍マーカー、ウィルス、細菌、
寄生体のような既知の臨床的に重要な抗原に対して調製
され〕ｃものである。ホルモンでは、ヒ１−・コリオゴ
ナド１−ロピン、ヒト・ソマト１−〇ピン、ツマ１〜ス
タブン、ソマトメジン、プロラクチン、黄体形成ホルモ
ン、卵胞刺激ホルモン、チｃ＋　１〜１」ピン、コルブ
コトロピン、エンドルフィン、」ニンクノアリン、黒色
水胞刺激ホルモン、エストロゲン、プロゲスチン、アン
ドロゲンで示されている。タンパク費では、免疫グロブ
リン０、Ｍ、Ａ及び「、インターノ」Ｏン、ノイブロネ
クチン、抗血友病性因ｒ■、プロトロンビン、プラスミ
ノーゲンアクチベーターおよびアルカリフＡスファター
ｔｒ示されている。

細胞表面抗原では、免反関連抗涼ど、組織適合性抗原に
より示されている。叶瘍マーカーは癌胎児性抗原、α−
フエ１〜タンパク質および、前Ｓ’／腺酸性ノオスファ
ターゼにより示される。ウィルスは、肝炎、庖疹Ｊ３よ
び狂犬病のウィルスである。伯の典型的な臨床的に重要
な抗原は、！Ｊ！り１１−ン抗体に関する数多くの総説
の１゛っ、例えば、［ヴイアらの報告、「クリニカル・
ケミストリー」、２７巻、（１１号）、１７９７から１
８０６ページ、（１９８１年）どイの中に引用され”Ｃ
いる文献を参照することにＪ：す、当梨にには明らかで
ある４゜本発明はまた、十等！に物的様、他の咄乳動物
、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジに対しＣ調製され
る単クローン抗体の分ｌ１１１１にも利用できる。

特定の例示ハイブリドーマとそこから由来ηる単クロー
ン抗体により本発明を史に説明りるために、３種の異な
る型のハイブリドーマの大規模培養と、イこからｐγ牛
される単り１コ一ン抗体の分＃１が以トの例１から３ま
【゛に詳述され−Ｃいる１、この例は、ウシ・ツマ１へ
１〜ロビン抗ｒ＋！、ヒ１〜色系細胞肝関連抗ＩＩλ、
おにび１重要組織適合性複合体（ＭＨＣ）のネスミｌ−
１−２細胞表面抗原に対Ｊる単り１１−ン抗体を示して
いる。。

これらの例にａ３いて、ウシ・ツマｌ〜１・１］ピン・
ハイシリトーマは、に１１−Δ１−Ｂ６−Ｂ３、ヒト色
水細胞腫ハイブリドーマは９．２．２７、ネスミ抗１１
−２ハイシリドーマは１６−１−２　Ｎと表記りる。

［１ｌ−Ａ１−１３６−８３単り１」−ンハイブリドー
マは、脳十重体抽出物から精製したウシ・ラン１〜１−
１１ピン（純瓜９０％）で戯の１３Δ１．、、　Ｆ３　
／　Ｃマウスを免疫し、マウス骨髄腫細胞とマウス骨髄
腫細胞Ｓ　［＞　２　／　Ｏ〜Δ０１４とをハイブリッ
ドして調製した。これは、シュルマン等により、「ネイ
チャー」、２７６巻、２６９から２７０ページ（１９７
８年）の中で記述されｃいる１３　Ａ　ｌ−Ｂ　／Ｃ起
源の広く利用されている公知細胞系であり、この記述を
本明細書で参照Ｊる。１ｇ鎖を合成しないこれらの細胞
は、スイス・バーゼルのバーゼル免疫研究所及び、メリ
ーランド州ロツクヴイルのアメリカンタイプ・カルチ−
７−・−ルクシＥ１ン（寄託番号ＡＴＣＣＣＲ＋−１５
８１）から入手したものである。

免疫は、フロイントの完全アジ１パン１−存在下、１０
０から２００μ７のウシ・ツマＩ・トロピンを腹腔内注
射し−Ｃおこなわれた。また何四かのマウスには標準ト
１１Ｓ１／＜（酵素免疫吸着測定法）により測定した血
清の抗体価を完全にするために補助注射をおこなった（
エングヴアルとパールマン、「イミコノクミス１へり−
」、８巻、８７１から８７４ページ（１９７１年）参照
）。

温和な条ｆ１で機械的に破砕り゛ることにＪ、り解−１
させた後、肺臓細胞を取り出し、ダルベコの修ｉｆイー
グル培地、低１１１度グル］−ス、５０ＩｌｌＨトＩＥ
ＰＥｓＩ衝液（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ’　−２−，１：タンスルホンＭ）ｐＨ７，４に５０
％ＰＥＧ１５００とした中で、１０：１の割合で骨髄腫
細胞と室温（２０から２２℃）で、５分間混合すること
ににす、ハイブリダイゼーションを行なった。ＰＥＧを
除去し、細胞をダルベコの修正イーグル培地、高８１瓜
グルコースに１０％ウマ面清、５％ウシ面清、ＩＸ非必
須アミノ酸、ＩＸ　Ｌ−グルタミン、１００ｕ／ｍｌペ
ニシリン、おＪ：び１００　ＩＩ　’ｊ　／　ｍ乏スト
レゾ１〜マイシンを添加したものに懸濁し、組織培養プ
レートに分散さＶた。加湿した７％ＣＯ２雰囲気下、３
７℃で一晩培養した後、培地を１．２４ｍＨヒポ４ニザ
ンヂン、０．０／１８１ＭアーミノプｊリンおＪ：び、
２．０６ｍＨブミジンを含むトＩ　Ａ　’Ｉ選択培地に
交換した。１」Δ丁培地中で２週間の選択培養後、ウシ
・ツマ１〜１〜１１ビンに対りる抗体のＥＩＩＳＡによ
る測定Ｃ陽性のハイブリドーマ細胞を選択し、ＢΔＬ　
［３３１３マウス細胞の供給細胞層上、軟寒天にり日−
ニングした。

単クローン抗体産生に用いるウシ・ソマト１〜［１ピン
ホルエン抗隙はまた、例えば、１９８３年３月３０日付
、ヨーロッパ特許出願用７５．４／１４号や、１９８１
年１０月１４日付、英国特ｒ１出願第２．０７３，２４
５号に配達されているように大腸菌の還伝子組換えＤＮ
ＡにＪｚり産生されたウシ成長ホルモンでも可能である
。そのようなウシ成長ホルモンを産生ずる大腸菌の菌株
は、メリーランド州日ツクヴイルのアメリカン・タイプ
・カルチャー・フレクシ」ンから寄託番号、Ａ　ｒ　Ｃ
Ｃ３１８２６，３１８４０，３１８／１１．３１８４２
．３１８４３として入手可能である。

単クローン抗体９．２．２７の生産と特徴付【）は、ラ
イスフニ［ルド等、［ハイブリトーン・イン・キャンザ
ー・ダイアグツシス・アンド・トリートメン１−」（ミ
ツヂエル、■ツ１〜ゲン編、ラベンプレス、ニュー１−
り、１９８２年）１８３から１８６ページに、又、ブｔ
ルとライスノ［ルド、［プロシーディンゲス・ＡＩ・Ｊ
−シＥ：ｌナル・アカデミ−・オブ・ナイ■ンシズ・オ
ブ・ユナイテッド・スティン・オブ・アメリカＪ、７９
巻、１２４５から１２４９ページ（１９８２年）に述べ
られている。この公表論文は本明細占Ｃ参照する。これ
らの単クローン抗体は、カリフォルニア州う・ジヨウの
スクリブス・クリニック・アンド・す］」゛−ヂ・ファ
ウンデーション、分子免疫部門のＲ，Ａ、ライスノエル
ドと、メリーランド州フレデリックの国立癌研究所（Ｎ
ＣＩ）フレデリック癌研究センターから入手した。

９．２．２７単クロ一ン抗体の産生の報告されている中
で、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｏ８マウス骨髄腫細胞の非分泌〈
非Ｉｇ分泌）変異型６５３は、以前に、ゲッター等、「
ツマディック・セル・ジエネテイクス」、３巻、２３１
から２３４ページ（１９７７年）の中で、又、モルガン
等、「ハイブリドーマ」、１巻、２７か６３８ページ（
１９８１年）で述べられたＪ、うに、３０％ＰＥＧ１０
００存イ１下、感受性と＜７つだ（免疫された＞ＢＡＩ
Ｂ／Ｃの肺臓細胞どの融合に使用された。Ｐ３−Ｘ６３
−ＡＣ＋８細胞系は、コーラ−とミルスタインにより、
「ネイチャー」、２５６巻、４９５から４９７ページ（
１９７５年）に述べられているように、ハイブリドーマ
産生に通常用いられている既知のマウス骨髄腫の細胞系
である。

これらの単り１コ一ン抗体を産住Ｊるのに用いた免疫原
は、Ｍ１４あるいはＭ２１ヒ１へ色索細胞肚細胞系から
得た４Ｍ尿素抽出物であった。単層Ｍ１４ヒ１〜色索細
胞腫細胞抽出物は、ギＡ７　Ｄつ■イ等、「ジＡ７−ナ
ル・第１・イミコノロジー」、１２６巻、６２から６６
ページ（１９８１年）に述べられでいる。Ｍ２１２１ヒ
８細胞肝１胞系は、ギラノ等、［プロシーディンゲス・
オブ・アメリカン・アッシー■−−ジョン・ＡＩ・−ｔ
’　ｔｌン勺−・リサーチ」、１９巻、１３３ページ（
１９７Ｆ３年）に述べられているＪ：うに転移性色素細
胞腫障害由来のものであった。これは、５％Ｃ０２／　
９　ｂ％空気中、３７℃で、１０％ウシ胎児血清（Ｇ　
Ｌ、　Ｂ　ＣＯ）　、２１１１８Ｌ−グルタミン、ｉＪ
３　Ｊ、び５０μｇ／−硫酸ゲンタマイシンを添加した
ＲＰＭＩ−１６４０培地で長期細胞培養して保持した。

単り【−１−ン抗体１６．１．２Ｎの産生と特徴付【ノ
は、Ａザｌ−′８、ｒジャーフル・Ａブ・イミュノロジ
ーＪ、１２４巻、（２号＞、５２３から５４０ページ（
１９８０年）に述べられている。

上記発表は本明細書中参照しである。これらの単クロー
ン抗体は、マウスの免疫リンパ細胞をマウスの骨髄腫細
胞と融合することにより調製されたハイブリドーマ細胞
系により産生きれる。ハイブリドーマ細胞系は、国立ア
レルギー感染症研究所にあるハイブリドーマ細胞銀行か
ら入手し、Ａ　Ｔ　ＣＣＦＩＢ１４の寄託番号でメリー
ランド州ロックヴイルのアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションで保持されでいる。この細胞系は、Ｎ
５−１骨髄種細胞を以前にＣ３Ｈ細胞で免疫したＣ３１
−１．ｓＷマウスの絢臓細胞と融合することにより産生
された。Ｎ　Ｓ−１は、コーラ−、ホーウ■、ミルスタ
イン、［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノ１
１１ジー１６巻２９２ページ（１９７６年）に述べられ
ている非分泌型のに一鎖合成細胞系である。、１６．１
．２Ｎハイシリドーマが産生する単クローン抗体は、Ｋ
Ｋ、１〕“抗ａ、ｐ、ｒ。

原に特異的であるが、Ｋ　ども交叉反応する。

１６．１．２Ｎハイブリドーマ産生のための細胞融合は
、基本的には、］−ラーとミルスタイン［ネイチｒ−Ｊ
、２５６巻、４９５−、−　／Ｉ　９７ページ（１９７
５年）の方法と、グー７ター等、「ソノテイツク・セル
・ジエネテイクス」３巻、２３１−２３４ページ（１９
７７年）の方法により実施した。ハイブリッドの選択は
、基本的にはり１〜ルフイールド、ｒＥｘｐ、ｃｅｌｌ
　Ｒｅ５Ｊ　、　４１巻、１９０ページ、（１９６６年
）の方法に従い、１１Ａ１−培地で行なった。

細胞培養により成育し、本発明の方法により分離されつ
る他の例示的な単りローン抗体には、例えば、以下のＪ
：うなものがある１゜ １）米国特許第＝１，４３０，４３７号明細占に述べら
れている、Ａ　Ｔ　ＣＣｌ−Ｉ　Ｂ　Ｂ　Ｏ６７と）−
ＩＢ８０６８からそれぞれ得られるハイブリドーマ細胞
３Ｅ１とＩＤ４から産生される単純性庖疹ウィルス１型
及び２型（Ｈ３ＶＩ型及び２型）に対りる単り［１−ン
抗体と、１９８４年２７１２２１”ＩＩ・１、」−［１
ツバ特訂出願第１００，９５５号にブを表されたＩＩ　
Ｓ　Ｖに対する単り［１−ンＩＱＭ抗体。

２）　ノアス等、１ｊフツド」、５９巻（ご３号）５９
４−６００ページ（１９８２年）で述べているブタの第
■囚子凝集タンパク賀、及び、ミュラー客、「ブラッド
−１５８巻（５号＞１０００−１００６ベージ（１９Ｂ
　’１年）で述べているヒト第■因イ：Ｃに対づる単り
１」−ン抗体。

３）ソノ等、１プ［１シーデインゲス・オブ・ナシ士１
）−ル・アカダミー・Ａ゛ブ・（ナイ■ンシズ・オブ・
コナイテツドスフイツ・Ａブ・アメリカ」、７９巻、１
８３−１８７ページ（１９８２年）に述べられ−（いる
ように、マウス骨ｒｔＩＪＭ＋、細胞系Ｐ３・−Ｘ６３
−Δｇ８とＳ　ｐ２１０−△ｇ１４から調製されたハイ
ブリドーマを用いたヒト第■囚子とフォノ・ウィーブラ
ン１〜タンパク質の複合体に対する単クローン抗体。

４）米国特許第４，４２３，１４７号明細出に述べられ
ているα−インターフエ［１ン（白血球インターフＩ　
Ｉ−Ｉン）に対Ｊ−る単クローン抗体。

５）　り一等、（Ｐｒｏｔｉｄｅｓ　Ｂｉｏｌ、　Ｆｌ
ｕｉｄｓ　ｌ　。

３０巻、３９５−３９８ページ（１９８２年）で述べて
いるように、Ｎ５−１マウス骨髄腫細胞と融合した免疫
マウスの肺臓細胞のハイブリドーマが産生ずるプロ］ヘ
ロンビンに対する単りＤ−ン抗体。

６）　米国時ｎ第４．３８１，２９２号明細書に述べら
れたヒト−］−リンパ球に対りる単り１１−ン抗体。

７）二−ルゼン等、［エンボ・ジＡノープル１２巻（１
号）１１５−１１９ページ（１９８３年）に述べでいる
プラスミノーゲンｊ′クヂベーターに対する単り［１−
ン抗体。

８）米国特ム１第４，３６１，５５０号明細書のバイブ
リドーマＡ　’ｒ　ＣＣＣＲＬ　−８０１’ｌが産生ず
るヒ１−・クープレツリー１細胞に対Ｊるｆｉり口−ン
抗体。

９）米国特許第４，３６３，７９９号明細書のハイプリ
ドーマへ丁ＣＣＣＲＬ−８０００が産生するヒ１〜表面
Ｔｍ胞に対する単クローン抗体。

１０）米国特Ｊ１第４，３４９，５２８号明細書のバイ
ブリド−？　Ａ　Ｔ　ＣＣＣＲＬ−８０１９が産生り−
る癌胎児性抗原（ＣＦΔ）に対づる単クローン抗体。

１１）　１９８１汗１０月２８［１付、ヨーロッパ特ｎ
出賄第３８，６４２号の１３型ＩＩＩ炎ウイルス及び１
９８２年４１１１日イ；ｔ、ｐｃｒ出願ｗ。

８２　０１０７２号の［３型肝炎表面抗原に３＝ｆ　Ｕ
る単クローン抗体。

１２）　アイヴアニ−とディライス、１ｔレ−１−１シ
ー、イミーｌノ１１ジー１．１７巻、２８７　２９０ペ
ージ（，１９８０Ｚｌ’　）に述べられＣいるヒト成艮
ホル七ンに対り′る単クローン抗体。

１３）米１１特ｉ／ｌ第１１，４４３．４２７号明細書
の［細胞の表面抗原【ご対りる単り［二１−ン抗体。

１４）米国４ｊｊ　ｉ；’Ｉ第４．４／１３．５４９号
明細出に公表されたバイプリドーマＡ　”Ｉ　ＣＣＨＢ
８１７８が産生ずる細菌抗ＤＩに対りる単クローン抗体
。

１５）　１９８２年３月５日角フランス特ｒ「第２．４
８９，１５２号明細書に公表されたヒ１〜卵胞刺激ホル
モンに対する単クローン抗体３゜１６）　１９８２４３
月５ＥＩイＳｔ　−／　５　ンス特ｎ第２，４８９．１
５１号明細書に公表されたヒ１〜黄体形成ホルモンに対
する単クローン抗体。

１１）　カスズボウスキ等、「キャンサーリリーーブ」
４４巻（３号）　１１９４−１１９９ページ（１９８／
１年）に公表ｔ−ｉ　しＣＣＯＬ　１　ト表ワサレるヒ
ト結腸癌に対する単り１」−ン抗体。

１８）スミス等、ｉＴｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、　Ｊ　３３
巻（２号）２１１−２２４ページ（１９８４年）に述べ
られているヒ１〜第１ｘ囚子に対する単り［ｊ−ン抗体
。

上記の、又、他の単クローン抗体を産生り−るハイブリ
ドーマ細胞を生育するだめの一般的な方法と大規模装置
は、）１ダーと１〜ルバー１〜の報告、［サイエンディ
フィック・）′メリカンＪ２／１８巻（１号＞２４−３
１ページ（１９８３年）と］・ルバートとフェダーによ
り［アニュアル・レボーツ・オン・ファーメンテ−ジョ
ン・テクノロジー」、第３章、３５−７４ページ、アカ
デミツク・プレス（１９８３年）に述べられている。上
記報告は参照されている。モルトン、「イン・ビトロ」
、６Ｗ（２号）８９−１０８ページ（１９７０年）に述
べられているにうな、例えば、ＲＰＭ１１６４０、ダル
ベ」の修正イーグル培地等の通常の細胞培養培地が、ハ
イシリドーマ細胞の培養に使用できる。

ハイ１リドーマ細胞は、ヨー１コツパ特許出願第１１３
，３２８号（１９８４年７月１１日公開）の固定式維持
リアクター（５ｔａｔｉｃ　１Ｉｌａｉｎｔｅｎａｎｃ
ｅｒｅａｃｔｏｒ（ＳＨＲ）　）システム中で、単クロ
ーン抗体を連続的に分泌しながら、事実上は、増殖が停
止した状態で、長期間にわたって保持覆る。

細胞培養培地でのハイ１リドーマの生育おＪ、び／又は
保持に続いて、吸着のために、単クローン抗体を含む培
養後の細胞培養培地もしくはその淵−縮液を高分子電解
質樹脂と接触させる操作をｐＨ約６．５から約７．５で
、イオン塩ｍ瓜約ｏ、ｏｉから約０．１５Ｍ（望ましく
は、約０．０１がら約０．０４Ｍ）で行なう。アルカリ
金属、アルカリ土類金属、およびアンモニウム塩が望ま
しく、特に、ナ１ヘリウムやカリウムが望ましい。塩化
ナトリウムの使用が最も適し−Ｃいる。

高分子電解質樹脂に吸着したタンパクＩゴは、結合型で
保持することかぐさ、又は溶出液（ｉｔ！ｌ液）に抗体
に富んだ両分を溶出さ１４るＩζめ、ρ１１を約４．７
から約５．５（約５が望ましい）、イオン塩濃度的０．
０１から約０．１５Ｍ（望ましくは約０．０１から約０
．０／ＩＭ）に調節し、１１；２着（溶出）を行イ１う
ことができる。高分子電解質共重合体に結合した状態で
単クローン抗体を保持りることは、診断目的に有用でき
る１゜ 抗体が豊富／ｃＴ画分に、測定上、β−グロゾリンが渥
在していた場合、この両分をｐＨ約６．５）から約７．
５（望ましくは約７）で石分画に供しく、本質的に純粋
な単クローン抗体の沈澱を形成さＵることができる。ア
ルカリ金属、アルカリ土類金属、Ｊ５よびアンモニウｌ
Ｘ塩が好ｔ　ｂ　＜　、特に、硫酸アン−ｔニウムが好
ましい。塩分画のために約２から約２．４Ｍの硫酸アン
モニウムの使用が最もりｆましい。ト、；ｉの吸着及び
脱着にお【プる液相から固体を分離するのは、通常の濾
過および／ヌは遠心分離続く分離固体物質を洗浄して行
なうことができる。塩濃度は、透析、限外線通、および
／又は稀釈により減らずことができる。ｐＨの調製は、
例えば、クエン酸、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニ
ウムのような通常の酸や塩基で処理あるいは、リン酸緩
衝化生理食塩水（ＰＢＳ）のような既知のＭｖＭ物質を
使用して行なうことができる。

例１か６３で使用する高分子電解質共重合体は、エチレ
ンと無水マレイン酸の分子比率約１：１の共重合体Ｃ１
分子聞約１００，０００にル合し、（共重合体の反応部
位にＭづいて）約５モル％のメチルイミノビスブ【］ピ
ルアミンで架橋化され、ジメチルアミツブ［１ピルアミ
ン（高分子電解質Ａ９０モル％、高分子電解質Ｂ８０モ
ル％）で誘導合成した。高分子電解質Ｂの場合、残った
反応部位は、メトキシブ［１ピルアミンでブ１−１ツク
した。

誘導合成された共重合体は、塩酸塩の形に変え、濾過、
乾燥した。高分子電解質への結果【、１、表１から８に
、高分子電解質Ｂは表９に示Ｊ。高分子電解質共重合体
の塩基形態と同様、他の塩の形ｆぷが本発明の方法で使
用できる。

使用前に、乾燥した高分子′ａｆ解質共重合体（２０グ
ラム）を−晩０．０２Ｍ＋−１ｃ、Ｉ）１０、ＯＩＭＮ
ａＣｆＩに懸濁した。樹脂を濾過し、１ｐの０．０１Ｍ
ＮａＣＪに懸濁し、ｐＨをＩＮ、−Ｎ　ａ　ＯＨで７．
０に調整しＩζ。樹脂を濾過し、１ｇの０．０１ＭＮａ
Ｃｎで洗浄した。このように準備した後、以下の例１か
ら３の吸着工程に樹脂を使用した。

特定の物質ど条件が１述されているが、以−トの例では
、本発明はこれらの特定の物質、条ｆｆ、Ｊ３よび実施
例に限定されるものではない。

例　１ ９．２．２７．ハイブリトーン培養 ９．２．２７ハイブリドーマ細胞４Ｊ、　、　３７℃（
′、６％ウシ胎児面油（にＢＳ）　、４ｍＭ１−−グル
タミンを添加したダルベニ１の修正イーグル培地（ＤＭ
ＦＭ）で培養した。細胞は、６％ｌ−１３８−１）　Ｍ
　Ｆ　Ｍ　テｉｔａ度２ｍｆ！／Ｊｌｌ’ＣＶ（バツク
レル容量）となるように、そしＣ１米［０特許 第４，２８９，８５４紀明ＩＩ占に記述され−Ｃいる型
の１２１及び４０Ｂの連続培養潅流反応器へ接種Ｍるの
に−１−分＜ｒ　ｆａｔとイ、・るよう、だいたい１：
４に分割した。ｌ：）　ＣＶは、１〜ルバー１−、ヒツ
ト、おＪ、びフ１ターが、［アノリ゛）−イカル・パイ
Ａウミストリー１．１０６巻、１０９−１１３ページ（
１９８０年）に発表した測定方法により測定しｌご　。

９．２．２７ハイブリドーマ細胞培養のいくつかを、１
９８／ＩＩ年７月１１日に公開されたヨーロッパ特ＪＩ
出願第１１３．３２８号に述べられている固定式維持リ
アクターシステムで保持した。米［１，１特許第４．２
８９，８ｂ４号明ｍ店記載の型のｄｔ流反応Ｗ　Ｇ、Ｌ
、１時間、ＰＣＶ１ｄ当り５Ｉｄの培地が潅流するよう
になつＣいた。培地のｐｌ＋を測定し、空気又は、０．
５ＭＮａ０ＨＩ部と０．５ＭＮａＨＣＯ３１部の滅菌混
合物中２から８％のＣＯ２の上層により保持した。ハイ
ブリドーマには、培地十に０２の気泡の層が保持される
速度（１−３１ｎｆ！／ｍ１１１　）　テ酸素が培地ニ
マキ散うさしる必要がある。

濾過したならし培地濾液（消費培地）は、各種回分で１
０，０００もしくは３０．ＯＯＯの分子量をカッ１−オ
フの市販の中空ファイバー濃縮器（アミコン）を使つ（
濃縮した。それぞれの回分の培地廃液は、だいたい５０
倍に濃縮した。

ＮａＣｆ１ｍ度（，１、Ｏ，、，０４Ｍ以下に、無菌水
ｃｍｍ液液稀釈して減らし、濃縮をくり返した。ならし
培地の濃縮液は、次段階に必要に＜ｇ６．１：′Ｃ″凍
結保存した。

」−ｊ ６グラムのタンパク質を含むならし培地の濃縮液に２０
グラムの紹過した高分子電解質共重合体樹脂Ａ（上記定
義）を加え、客間を０．０ＩＭＮａＣ１で１１にした。

培地の塩濃度は、樹脂への自涜タンパク質の最大吸着を
得るために、０．０４Ｍ以下に保持した。ｐＨは７に保
った。１）Ｈ７，０で１５分混合後、樹脂を濾過した。

脱着 ７５０ｄの０．ＯＩＭＮａｃＩを上ｋ（ＤＷＩＩ”Ａし
た樹脂に添加した。懸濁液のｔｉｌｌをクエン酸（１Ｎ
）で５．１から５．２５に調整した。樹脂を濾過して、
ｒｌり０−ン抗体が噛富イｊ諸液両分を得た。この両分
には試験の結果β−グロブリンが主混在物であることが
分った。この濾液を１１１５画分ど名付【ノ　ｌこ　。

塩　分　画 上記濾過画分（＋）１１５画分）を硫酸アンモニウム２
．０Ｍの状態にした（容ｈ１の増加を補うのに必要な硫
酸アンモニウムを添加）。硫酸アンモニウム１ｇに対し
、０．１５ｍ１の割合で水酸化アンモニウム（１Ｎ）を
添加し、混合物を約ρ１１７に保持した。混合物を４℃
で３０分間攪拌し、３０分間、１３０００　Ｘ　ｇで遠
心しＩこ。得られた単り□−ン抗体含有沈澱を硫酸アン
モニウム添加する前もとの濾液画分（脱＠段階の）の１
／１ｏの量でＰＢＳに溶解した。抗体は、容量の１／１
ｏまで２度濃縮し、ペリコン　の膜濃縮器（分子量１０
，０００の膜カッ１−オフ）を用いて硫酸アンモニウム
を除くためにＰＢＳに再懸濁しノご。抗体は０．２μフ
イルターで無菌ｍ過し、４℃で保存した。

例　２ Ｆ　１１−Ａ　１−８６−８３ハイブリドーマ培′Ｆ　
１１−Ａ　ｌ−８６−Ｆ３３ハイブリドーマ細胞を培養
し、上記、例１と同一条例で単クローン抗体を回収した
。但し、（ａ）　６％もしくは２％Ｆ’　［３Ｓｉ加（
７）ＲＰＭＩ−１６４０：ＤＭＥＭ（１：１）で細胞を
培養し、（ｂ）１２ＩＪの潅流システムのみで細胞を培
養、および（Ｃ）ならし培地（使用後の培地）をペリコ
ンのＭ濃ｗＩ器（ミリポア着）で分子ｍｉｏ、ｏｏｏカ
ッ１〜オフで濃縮した。

例　３ １６−１−２　Ｎハイブリドーマ培養 ならし培地（使用培地）をべり丁１ンの膜濃縮器上、分
子ｍ１ｏｏｏｏカツトオフで濃縮したことを除いて、１
２１潅流システムを用い、上記例１と同一条件下で、１
６−１−２Ｎハイブリドーマ細胞を培養し、単クローン
抗体を回収した。

上記例１から３の（培養初期の）培養培地、（培養終了
時の）ならし培地の濃縮液および（高分子電解質樹脂に
よる処理後の）ならし培地濃縮液から得られた単クロー
ン抗体の試料は以下に述べるような通常のアガロースゲ
ル電気泳動、ローリ−のタンパク測定法およびＥＬＩＳ
Ａ抗体測定法にＪ、り測定した。

電　気　泳　勅 ｐＨ８，０のバルビタール緩衝液でのアガロース・ゲル
電気泳動とクマジー・ブリリアント・・ブルー１（によ
る染色を、高分子電解質共重合体樹脂の処理ににる抗体
の分離の前後の試料中の＋ｆｉ１清タンパク質と抗体の
存在の確認のために用いた。電気泳動は、コーニング電
気泳動装置ＡＣＩ（フィックＡ７−・サイ１ンデイノツ
９社）を使用し一〇行なった。細胞培養から直接取った
試料は、電気泳動のゲルにのせる前に、分子１１５，０
００カットオフのミニコン８１５漠縮器（アミコン・コ
ーポレーシヨン）　？’　２５から５０倍に濃縮した。

１μｐの試料をアガロース・コニバーザル・プレート（
１％アガロース、５％蔗糖、０．０３５％ＥＤＴＡ、０
．０６５ＭバルビタールＭ衝液、＋）Ｈ８，６）のウェ
ルに注入した。プレー（〜を、０．０３５％ＥＤＴＡを
含むｐＨ８，６のバルビタール緩衝液で９０ポル１−３
０分間泳動した。プレー１〜を１０分間スルホサリヂル
酸（２００ｇ／水１４））で固定し、クマジー・１リリ
アンｊ〜・ブルーＲ（シグマ・ケミカル社＞（２，！ｌ
ｌｌ？１５％ｔｉｌｌｌ）で２時間染色した。プレー１
〜を水を交換しながら洗浄した。風乾後、ゲルマン ＡＣＤ１５デンシトメーターを用いて、６００　ｎｎ＋
でプレー１・を測定した。

タンパク測定 タンパク質澹度は、ローリ−等の方法（［ジャーナル・
オブ・ハイＡロジカル・ケミス［〜リ−」、１９３巻、
２６５−２７５ページ、（１９５１年））で測定した。

０．０５Ｍ／ｍｅウシ血清アルブミンの標準溶液、５．
１０．２５．５０、おＪ：び１００μρにぞって、５か
ら５０μ３のタンパク質を含む試料を１００μｇのＩ　
Ｎ　Ｎ　ａ　ＯＨに添加した。２％Ｎ８２ＣＯ３中０．
０２％ＣｕＳＯ４および、０．０４％酒石酸ナトリウム
の溶液、１−をそれぞれの試料に添加した。５０μｍの
２ＮフＡ−リン・フェノール試薬（フィッシャー・サイ
エンティフィック）を各試験管に添加した。室温で３０
分後、試料を７５０ｍμで、ギルフォードの２６０分光
光度計を用いて測定した。ブランクは、試料と標準液を
除いて全ての試薬を含んでい　１こ　。

ＥＬＩＳＡ抗体測定 複合酵素としてアルカリフォスファターゼを用いた酵素
免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）は、エングヴアル等が「イ
ミュノケミストリー」、８巻、８７’ｌ−８７４ページ
（１９７１年）に述べた方法に従い行なった。９．２．
２７と１６−１−２Ｎ抗体の分析は、ヤギ抗マウスＦ（
ａｂ’）２（カッペル・ラボラ！・リーズ）で］−１〜
した多穴プレートで行く【つた。上記抗体の稀釈液もし
くは、プロティンＡ−ｙＪ製の９．２．２７１１１りＬ
ｌ−ン抗体標準品をつギルに接種した。ウェルを洗浄し
、ヤギ抗マウスＩｑ（γ、μ、α、に、λ）Ｉ（ＪＧと
結合したアルカリフォスファターゼを、その中に接種し
た。結合したＷｌ系はパラニ１〜［］フェニルリン酸を
用いＣ１つギル中に産生されるパラニ）゛・ロフェノー
ルを４１０ｒｎμでミクロ］−リリ・ミニ・リーダーＭ
Ｒ５９０（ダイナチック・ラボラ１〜リーズ）により測
定することにＪこり、調べた。

ウシツマミルトロピン抗体Ｆ１１−ＡＩ−Ｃ３６−８３
の分析は、多穴プレートへのホルモンの吸着により行な
つＩご。プロディン八により精製した股木由来のＦｌｌ
−Δ１−１３６−８３を、椋準品として使用した。Ａ７
ギ抗マウス抗体に結合したアルカリ・フォスファターゼ
とパラニド［１）１ニルリン酸基質を結合した単クロー
ン抗体の検出に使用した。

表１は、（ａ）６％ウシ胎児血清を添加した最初の培養
培地、そして（ｂ）９．２．２７、Ｆ　１１−Ａ　Ｉ−
Ｂ　６−、　Ｂ　３．１６−１−２Ｎハイブリドーマを
生育したならし培地（使用後の培地）の５０倍濃縮液の
中の電気泳動により検出した相対的なタンパク質の割合
（％）を示している３゜表２−４は、抗体分離に用いた
ならし培地の濃縮液について、タンパク質の製電、主要
タンパク質の割合（％）、ハイシリドーマ培養に用いた
血清の割合（％）を示しでいる。表２に示されている’
Ｊ、２．２７．ハイブリドーマは、連続培養システム（
ＣＣ８）と固定組持リアクター（ＳＭＲ）の両方で培養
したが、一方、表３及び４の１−１１−Ａ　Ｉ−８６−
８３と１６−１−２Ｎのハイブリドーマは連続培養シス
テム（ＣＣ８）のみで培養した。抗体産生は、通常の６
％血清以下の濃痕て・保持した。９．２．２７ハイプリ
ドーマの場合、１ｆＩＩ清濃度は、０．２５％５％ウシ
胎清と低いものであった。抗体産生はまた、ＤＭＥＭに
５％Ｓｙｎｍｅｄを添加した培地でＳＭＲで観察した。

５ＶｎＲＩｅｄは、カリフォルニア州アナハイムのケン
タウルス・コーポレーションから人手できる重数のウシ
アルブミン、ブタ・インシュ１リン、ヒト・１〜ランス
フエリンを添加した無血清培地ひある。

ならし培地の濃縮液をρ１１７で高分子電解質樹脂Ａに
接触さぜるど、大部分のタンパク質は樹脂に吸着された
。０．０１ＭＮａＣＪで、樹脂１ｇあたり０．３ｇのタ
ンパク質の樹脂に入れｌ、：タンパク質で、基本的には
全ての抗体、β、α２およびアルブミンが樹脂に吸着さ
れた。５０倍濃縮のｐＨ７，０未吸着物質の電気泳動に
は、抗体やアルノミンは児られなかった。

樹脂に結合したタンパク質をクエン酸でｐＨ約５．０か
ら５．２に調整して０．０１ＭＮａＣ，Ｏで抽出するこ
とにより、主たる混在物としＣβ−グロブリンを含む抗
体の豊富な両分を得た。ｐＨを注意深く保持することに
より、表５．７および８に示したように、９．２．２７
、Ｆｌｌ−ＡＩ−１３６−８３，１６−１−２Ｎのなら
し培地の濃縮液から始めて、約６０％抗体を含む両分が
得られた。表５はまた、９．２．２７１１ｆ５縮液の８
種の別の精製から回収された抗体の比較を示している。

分離に用いた濃縮液は、表２に記載した濃縮液の目的の
最終タンパク濃度をうえるような吊での組合わせであっ
た。抗体の最初のけとして供した抗体のダラムは、試料
のタンパク測定によりアカロース電気泳動のΔＣ１）１
５スキヤンから得られる抗体％を乗じて得た。

表６は、Ｅ　Ｌ、　Ｉ　Ｓ　Ａ試験で測定した、回収９
．２．２７抗体を示している。表７は、０１１５画分℃
・ウシ・ツマ１へ１〜ロピン抗体の回収を示している。

分析データは、［Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ分析にすｍＩこ。

表８は、１６−１−２　Ｎ抗体のｐ１１５両分での抗体
の回収を示している。

表　６ ＥＬＩＳＡによる９、２．２７．５４抗体の回収４２６
　６７４　２．３２　１．８７　１．８６−ＥＬＩＳＡ
による検出 表　７ ＥＬＩＳＡによるｌ”　１１−△Ｌ１３６　［３３抗体
のｌ！ｌ′ｉ＋収４９８　４０２　（２％）　２０．０
　１８７．２０　５６．８０本培養細胞に用いたウシ胎
児自消の％ ＋高分子電解質共重合体樹脂Ａ 表　８ ８３８　２０　６　０．４３　０．３６　７２本ＥＬＩ
ＳＡによる検出 ＊＊電気泳動による検出 →高分子電解質共重合体樹脂Ａ 表９は、高分子電解質共重合体樹脂８（上記定義）を用
いたＦ　１１−Ａ　１−８６−８３抗体分離の結果を示
している。０１１５両分での抗体の５０％回収は、高分
子電解質共重合体樹脂Ａで観察された結果と等価であっ
た。

表　９ ４９２　（２％）　１０　７９．５　７２．４　５０．
３＊ＥＬ、ｌＳへによる検出 ＊＊電気泳動による検出 ＋＾分子電ｗＩ質共重合体樹脂Ｂ 表５の３種の精製、即ち、４２９．４３３．４３６につ
いて、エンドトキシンの存在の分析をおこなった。初期
のならし培地の濃縮液、０８７での樹脂吸着からの濾液
、ｐＨ５での脱着からの濾液について、標準リムルス・
アメボサイト・ライセード・テストがおこなわれた。こ
れは、グラム陰性菌の内毒素発熱物質を検出するカブト
ガニ（リムルス・ボリフ■ムス）の変形ＩＩＩ胞のライ
セードの存在下での発熱物質のゲル化に基づ＜　ｉｎ　
ＶｉｔｒＯでの試験である。表１０に述べている結果は
、ｐＨ５でのｌｔ［なしに、ｐ１１７での樹脂への吸着
によって、エンドトキシンの水準が顕著に低下している
ことを示している。このエンド１−ギシンの除去は、単
クローン抗体の治療利用には望ま′しいことである。

表　１０ ４２９　３０．００　０．１８　１．２０４ａ３　１６
．７５　０．２５　０．９２４３６　２４．３８　０．
２６　１．０４本マザチューセッツ州ウッド・ボール ＡＳＳＯＣｉａｔｅＳ　ｏｆ　Ｃａｐｅ　Ｃｏｄ、　Ｉ
ｎｃ、ににる分析代理人　浅　村　皓 第１頁の続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　試験管内でハイブリドーマ細胞を生育した不飽
   和ｔツマ−と、２価の低級アルキルアミノ低級アル：１
   ルイミド官能側基を含む４から６個の炭素１ｊｌ−１”
   −を右りるα、β−不飽和ポリカルボン酸又は無水物ど
   の水不溶性で架橋化した高分子電解貿其・丁−合体の吸
   ンンにＪ、り前記細胞培養培地又は、その濃縮液を処即
   りることを特徴とづる、上記方法。 （２）Ａレノイン系不飽和上ツマ−は」−チレンであり
   、α、β−不飽和ポリカルボン酸又は無水物はンレイン
   酸又はぞの無水物である、特許請求の範囲第１　］ｊ’
   Ｊ記載の１ｊ法。 （３）　ジ低級アルキルアミノ低級アルキルイミドはジ
   メチルアミン１０ピルイミドである、特許請求の範囲第
   ２項記載の方法。 （４）　高分子電解質共重合体はジメチルアミノプロピ
   ルイミドを約３モル％から約１００モル％含む、特許請
   求の範囲第３項記載の方法。 （５）　高分子電解質共重合体に吸着したタンパク質の
   説着工程を含む、特許請求の範囲第１狼記載の方法。 （６）　ｐＨが約６．５から約７．５で、イオン塩淵度
   が約０．０１から約０．１５Ｍで・、吸ン１を行なう、
   特Ｈ’ｌ請求の範囲第１項記載の方法。 （１）　約４，７から約５．５のｐ＋＋、Ｊ＞Ｊ、び約
   ０．０１から約０．１５ＭのイΔン塩淵１身（゛脱着を
   行なう、特許請求の範囲第！’）　ＪＫ４記載の方法。 （８）　約４゜７から約５．５のｐＨおよび約０　、０
   １　ｈ”：＞約０　、１５　Ｍ　’／）　イＡン４１１
   ＫＩ１．Ｃｔ”ｅｌｌｉ着を行なう、特ム′１ム＾求の
   ｆｌわ囲第６１ｆ１記載の方法。 （９）　ハイブリドーマ細胞を試験ｔａ・内で生育ざＵ
   た後の培養培地中り１］−ン抗体を分１ｉ１１１Ｊる方
   法にＪ５いて、約３［ル％から約１００モル％のジメブ
   ルアミノプ［ｊピルイミド官能側基を含む１チレン及び
   マレイン酸／ｊ　Ｌ　＜　４．Ｋ　：ぞの無水物の水不
   溶性、架橋化しＩＣ高分子電解質の共重合体で脱着して
   Ｆ記培地又はその濃縮液を処理し、続いてこの高分子電
   解質共重合体に吸着したタンパク質を脱着し、吸着は約
   ６．５から約７．５のｐ１目３よび約０．０１から約０
   ．０４Ｍのイオン塩ＩＵで行ない、そして脱着は約４．
   ７から約５．５のρＩＩおＪ、び約０．０１から約０．
   ０４Ｍのイオン塩１ｍで行なうことを特徴とする、上記
   方法。 （１０）　脱着タンパク質を塩により沈澱さ「る１程を
   含む、特許請求の範囲第ｂ　】ｎ記載の方法。 （１１）脱着タンパク質を塩により沈澱ざｌる■程を含
   む、特許請求の範囲第８項記載の方法。 （１２）沈澱に用いる塩が硫酸アンモニウムＣある、特
   許請求の範囲第１０項記載の方法。 （１３）沈澱に用いる塩が硫酸アンモニウムである、特
   ｈ！１晶求の範囲第１１項記載の方法。 （１４）ハイブリドーマ細胞を試験管内で生育させた後
   の培養培地から単り１］−ン抗体を分１１１Ｉｌ′！ｉ
   る方法におい−（、約３モル％から約１００　′Ｅル％
   のジメチルアミツブ１」ピルイミド官能側基を含む、エ
   チレン及びマレイン酸もしくはその無水物の水不溶性、
   架橋化した高分子電解質共重合体ｅ吸着し、続いてこの
   高分子電解質共重合体に吸着したタンパク質を脱着処理
   し、その後脱着したタンパク質を塩沈澱させ、吸着を約
   ６．５から約７．５のｐｌ＋および約０．０１から約０
   ．０４Ｍのイオン塩濃度で行ない、脱着を約４．７から
   約５．５のｐＨおよび約０．０１から約０．０４Ｍのイ
   オン塩濃度で行ない、又、沈澱に用いる塩は、約２から
   約２．４Ｍの硫酸アンモニウムであることを特徴とする
   、上記方法。 （１５）ハイブリドーマは９．２．２７ハイブリドーマ
   である、特許請求の範囲第１項記載の方法。 （１６）ハイブリドーマは、９．２．２７ハイブリドー
   マである、特許請求の範囲第９１＃記載の方法。 （１１）　ハイブリドーマは、９．２．２７ハイｌリド
   ーンである、特許請求の範囲第１４Ｉｎ記載の方法。 （１８）特許請求の範囲第１１ｎに定義された高分子電
   解質共重合体に結合する単クローン抗体。