JPS61501152A - ヒトのエリトロポエチンｃＤＮＡクロ−ン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトのＪリトロボＴチンＣＤＮＡクローンアメリカ合衆国政府は国ｆｆ　ｔ：Ｊ ｉ生研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｂ）　ヘ のＮｏ、　ＲＯ［−ｔｌｌ−２１６８３及びＮｏ、ＲＯ１ＨＬ３０８６２の交付 により、この発明に対する権利を右１６ものである。

発明の技術分野 本発明はヒトのエリトロポエチン（「ｐ）のＣｔ）ＮＡクローン、そのようなり ローンの同定及び製）閏、及びその表現生成物に関する。さらに特に本発明は （ａ）ヒトの腎臓のｍＲＮＡから構成されたＣＤＮＡライブラリから同定された ヒ１への「ｐのＣＤＮＡクローン、（ｂ）シｌ−のＥｐ　ｃＤＮＡの製造及びｐ ＢＲ３２２プラスミドへの挿入、 （ｃ）ｃＤＮＡを表現する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の生成、（ｄ）ＣＤＮＡの表 現の生成物に関する。

私の係属中のアメリカ特許出願番号５７０，０３９の全開示は１９８４年１月１ １日に出願され、その名称は「逆免疫親和性クロマトグラフィ精製法」であり、 ここに充分に説明され、参考文献として挿入され、以後、この出願を［Ｅｐ−精 製の特許出願」と名づける。

私の係属中のアメリカ特許出願番号５７０，０３９の全開示は１９８４年１月１ １日に出願され、その名称は［ヒトの尿の１リトロボエチンに対するモノクロナ ール抗体及び上記抗体を分泌するバイブリド−７」であり、ここに充分に説明さ れ、参考文献として挿入され、以後、この出願を「Ａｎｔｉ−Ｅｐの特許出願ｊ と名づける。両出願からの抜粋の」ピーを付録Ａ及びＢとして付記する。

従　来　技　術 ヒトのエリ１〜ロボ１チン（［ｐ）の信頼性のある豊富な供給は赤血球生成（ｅ ｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ）の分子論的機作をよりよく叩解するのに役立つの で長らく要求されてきた。か＜　Ｌ　Ｔ　（ａ）貧血症のため処置と診断の方法 の開発、及び（ｂ）哺乳類細胞の分化と発展の理解に寄与している。充分なヒ１ への［ｐが入手できないことは、粗製物質の不足、（のｍ製法の国難性及び［ｐ の生物発生に関する明確の知識の欠除に、にるものであった。

本発明によりなされた自然のままのヒトの［ｐの精製（Ｅｐ精製特許出願のなか に記載されている）の進歩は直接及び逆免疫親和性クロマ１−グラフィにより行 われ、モノクロノ−−ルＡｎローＥｐの製造（Ａｎロー［ｐ特許出願に記載され ている）において、表現（ｅＸｐｒｅｓｓｉｏｎ）についてＥｐ−タンパク質を 生成できるヒトのＥｐ遺伝子のクローンニング（ｃｌｏｎｉｎｇ　）を試みるこ とを可能とした。

発　明　の　開　示 本発明の目的はヒトのＥｐ−タンパク質の択一的源泉を提供することである。

本発明の他の目的はヒトのＥｐ　−ｍＲＮＡを同定することである。

本発明の他の目的はヒトのＥｐ　ＣＤＮＡを合成し、特性づけることである。

本発明の他の目的はヒトのＥｐ　ＣＤＮＡを表現する組換型生物を￥Ｊ造するこ とである。

本発明の他の目的はＥｐｃＤ’ＮＡの表現生成物を精製することである。

本発明の他の目的はヒトのＥｐ組成を同定し、ヒトのＥｐ　ｃＤＮＡの鎖を特性 づけることである。

本発明のこれらの目的は当業者には本明細書、請求の範囲、及び図面により明ら かになるであろう。

本発明の観点はペプチドを免疫化学的にモノクロナール抗体とじ１〜のエリトロ ポエチンに対する反応することに関することである。

本発明の他の観点は、上記ペプチドに対する断片遺伝子暗号情報で指定すること に関することである。

本発明の他の観点は上記ペプチドをＤＮＡ鎖の暗号情報で指定することからなる ＤＮＡ断片をそのなかに挿入したＤＮＡ分子に関することである。

本発明の他の観点は上記ペプチドを表現できる能力を有する生物、ＤＮＡ分子を 含む形質転換の生きている生物に関することである。

最後の本発明の観点は上記ペプチド、ＤＮＡ断片、ＤＮＡ分子及び生物を装造す る方法に関することぐある。

図面の簡単な説明 第１図はモノクロナールＡｎｔ　ｉ・Ｅ［）による翻訳生成物の免疫沈澱と試験 管内でのヒトの腎臓ρｏｌｙ（Ａ）“ｍ　ＲＮ　Ａの翻訳生成物の電気泳動の蛍 光写真である。

第２図は５Ｏ８−ＰＡＧＥにより溶解する粗製及び精製Ｅｌ）及びヒトの腎臓抽 出物の全タンパク質の銀染色を表わしている。

第２Ｂ図はＥＤ−特異性タンパク質の免疫学的検出を示づ゛同定試料からの免疫 、しみ（ｂｌｏｔ）の自動放射線写真を表わしている。

第３図は試験管中でのアガロースゲルの大きさで分別したｍＲＮＡの翻訳生成物 の電気泳動の自動放射線写真である。

第４Ａ図は集落雑種形成により検出される、陽性集落を持っているニトロセルロ ーズフィルターの自動放射線写真である。

第４Ｂ図はモノクロナールＡｎｔｉ−Ｅｌ）を使用して本来の放射標識免疫検定 法により検出されたベーターラクタマーゼ融合タンパク質として大腸菌（Ｅ、ｃ ｏｌｉ）に表わされた陽性クローンのｐＥｐ　２を持つ同型フィルターの自動放 射線写真である。

第５図は陽性ＥｐりＤ−ンに対してＣＤＮＡ挿入のアカロースゲルの電気泳動写 真であり、エチジウムプロミツド（ｅｔｈｉｃｌｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄ　）染色 及び紫外線透視法ｉ、：Ｊ：っテ’Ａ体的に示した。

第６Ａ図は陽性Ｅｐり［コーンをもって雑種形成により淘汰されたｍＲＮＡから の試験管内の翻訳生成物の電気泳肋蛍光写真である。

第６Ｂ図は陽性Ｅｐクローンをもって雑種形成により淘汰されたｍＲＮＡの試験 管内の翻訳生成物の電気泳動の　抗−Ｅｐ免疫しみ（ｔｍｍｕｎｏｂ＋ｏｔ）　 Ｔ”ある。

第７図は標識されてないＥｐの存在または不在において、分子量が２９．０００ 及び１５，０００の雑種淘汰翻訳生成物の競争的免疫沈澱の自動放射線写真であ る。

発明を実施するための最良の形態 クローンＥＤ　ＣＤＮＡのために、その機能的ｍＲＮＡは最初に分離される。こ のｍＲＮＡを分離する時の困難はＥｐ合成の特異性細胞の位置が明らかに確立さ れなかったが、腎臓が重要な役割を演じているという公知の事実から由来してい る。

生きている（ｖｉａｂｌｅ）ヒトの腎臓試料が不足していること及び彼等の低い Ｅｌ）水準がさらに困難をもたらしている。それ故に高いＥｐ−水準及び組ｇ　 （ｔｉｓｓｕｅ）をより多く手に入ることのできる源泉を探求することが必要で あった。

赤血球生成が種々の腎臓腫瘍と関連するかもしれないということはよく証明され てきた。成る腎臓のガン腫患者の腫瘍の抽出物がＥｌｌの増加水準を示し、その ような腫瘍がＥｐ型製造腫瘍としてしばしば考えられてきた。しかしながら、腎 臓のガン腫の腫瘍は極くまれに著しい増加Ｅｐ水準に達する。かくして外植（培 養において）の後、Ｅｐを製造するために腎臓ガン腫組織の能力はすこしも確約 するものでない。したがって、本発明者は増加したＥｐ−水準を示すヒトの腎臓 の腫瘍について広く研究を行ない、機能的Ｅｐ　ｍＲＮＡの継続的な源泉を固定 し、確実にすることに努力してきた。

本発明を導く研究において全３６の腎臓細胞のガン腫が試験された。これらのう ち２つは非常に高い水準のＥｐ　（０，９及び３単位／組織のｑ）を無酸素症の 赤血球増加症のハツカネズミの生物学検査により示した。正常の組織及びガン腫 組織の両方のガン腫をうけた腎臓の体外移植組織は高められたＥｐ−力価を示す ことが観察された。対比して、正常の腎臓の組織の対外移植組織は同様な検定に よりＥｐ活性が認められなかった。

本発明にさきだって、ヒトの腎１１ｍＲＮＡを分離するための特別な方法は存在 しなかった。腎臓の組織はｍ−ＲＮＡ不活性リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の なかに非常に豊富であり、均質化することは極端に困難である。さらに、腎臓抽 出試料を入手するのに限界があるために困難はさらにもたらされる。それ故、組 織試料（細胞形質、ミクロソーマル、及び核の分画）の通常の分別は実際的でな い。かくして、全細胞リボ核酸（ＲＮＡ）はまず砕いた腎臓細胞の抽出によって 分離するのが好ましく、メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）は次のようにして 選択的に濃縮される。

腎臓のガン腫をうけた組織のＥｐ−陽性試料からの正常及び腫瘍部分の両方とも ｍＲＮＡ製造に使用すべきである。方法全体にわたり、（内生または外生の）の りボヌクレレアーゼの劣化効果を最小にするため注意しなければならない。かく して、好ましくはＲＮａｓｅ　（ｍＲＮＡ不活化リボヌクレアーゼ）阻害剤は抽 出緩衝液のなかに導入される。試薬は殺菌され、ガラス器具は２５０℃で一夜間 ＲＮＡ試料と接触する前に加熱される。

バナジルリボヌクレオシド（ＶＲＮＳ）コンプレックスまたはＲＮａｓｉｎはＲ Ｎ　ａｓｅの外生の阻害物に好ましく、上述のＶＲＮＳをもってするのが最も好 ましい。また好ましくは抽出緩衝液がエチレングリコール、プロピレングリコー ル、または他の通常のグリコールのようなＣｈａｏｔｒｏｐｉｃ　ａｇｅｎｔの 組み合せ、または例えばサルコシル（５ａｒｋｏｓｙｌ　）　、グアニジンハイ ドロクロライト及びグアニジンイソチオシアナートのような解離剤及びベーター メルカプトエタノールのような還元剤を含んでいる。一般に、方法及び使用する 試薬は収量及び得られたｍＲＮＡの機能性に茗しく影響する。最も好ましくは抽 出Ｍ！７液はグアニジンチオイソシアナート、サルコシル、ベーターメルカプト エタノール、くえん酸ナトリウム及びバナジルリボヌクレアーゼコンプレックス を含んでいて、これらは細胞構成物、解離タンパク質、不活性分解酵素及びＲＮ 　ａｓｅを分解するのに役立っている。

本発明に用いられるｍＲＮＡ分離の方法は速みやかであり、好都合であり、良い 収りを与えている。最初の細胞の粉砕が非常に重要であり、好ましくは組織を乾 燥混合（ｄｒｙ−ｂｌｅｎｄｉｎａ）により（通常の混合器のなかと同じく）液 体窒素の存在ですべての酵素が不活性になるような充分に低温度を確保して達成 される。

粉末にした組織はそこで抽出緩衝液でもって処理される。

これは最も便利に完璧に粉末化混合器のなかで達成される。細胞物質の分解及び ＤＮＡの剪断はさらに混合（ｂｌｅｎｄｉｎｏ）により、試料を針（ｎｅｅｄｌ ｅ）に通過させて行う。剪断は混合物の粘度を著しく低下させることによって朗 示される。

ＩＪＩｒｉｃｈらの　々のインシュ１％　−ＨＰ・　−スミ゛の　５ｃｉｅｎｃ ｅ　１９６．１３１３（１９７７）の一般的方法は実施例２に記載したように特 別な変形をして使用した。

全ＲＮＡの濃度は２６０ｎｍでの吸光度によって測定された。

２６０／２３０及び２６０／２８０の吸光度の比は２８０に近接し、２に接近し ている。このことはタンパク質と炭水化物の汚染がないことを示している。組織 の７当りの０．５〜１ｍｇのＲＮＡの吸口が得られた。

ポリアデニレート化ＲＮ　Ａ　（１）ＯＩＶ（Ａ）　”　ＲＮＡ　）はそこで、 Ａｖｉｖ、Ｈ，らによって記載されたようにオリゴチミジル酸−セルローズ（０ １ｉｇｏ−ｄＴ−ｃｅｌ　１ｕｌｏｓｅ）カラムの上で選択された。

オリゴ　ミジル　−セルロー　の　の　ロマ　−フイによる　゛　口　響ンメツ センジャＲＮ　のＰｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　６９：１ ４０８−１４１２（１９７２）。選択したｐｏｌｙ（Ａ）　”　ＲＮＡはかくし て低温でエタノールのなかで貯蔵できる。

これらの条件のもとでＲＮＡの安定性が確実にされる。

１）ＯＩＶ（Ａ）　＋　ＲＮＡがＥｐメツセンジャ（機能的ＥｐｍＲＮＡ）を含 むことを確認するためにオリゴｄＴ−セルローズー選択−ｍＲＮＡのいくつかが 隨鼠豆潰で翻訳される。翻訳は串受遺伝子細胞−ＴＬ離系または好ましくはｍＲ ＮＡ−依存ウサギ網状赤血球溶解産物系においてＰｅｌｈａｍ、Ｈ，Ｒ，Ｂ、ら の記載により行ワレタ。　”ｉＩｌ！１１Ｊ’）１立（７）−なｍＲＮへ−存１ ］系Ｅｕｒ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ　６７：２４７−２５６（１９７６）ｐｏｌｙ（ Ａ）＋腎ＲＲＮ　Ａにお（、する［ｐタンパク質のためのｍＲＮＡ暗号情報の存 在は翻訳生成物の免疫沈澱によって確認される。免疫沈澱はＫｅｓｓｌｃｒ、Ｓ 、Ｗによる鹿疲沈Ｊのためのブζｒ［・−・を、つタンパクｒ−Δの一管用ど　 γからｒ２、の　：　Ｈｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　７３：４４２．　（１９ ８１）により精製されたｔノクロナールＡｎｔｉ−ＥＤ　ｒｐＧ−７Ａ７として 名づけられている−をちって行われる。この特別な方法は実施例４に記載しであ る。彼等の分子量はそれぞれ２９．０００と１５，０００ダルトンである。（第 １図レーン２）。これらのポリ−ペプチドは予備免疫ハツカネズミ血清により沈 澱しない（第１図レーン３）し、彼等の外生の翻訳においてその免疫沈澱試料に 検出されない。

（第１図レーン６ど７）これらのポリペプチドの大きさは生れつきのＥｐに対し て予想するよりも小さい。しかしながら、つ与ギの網状赤血球溶解産物系におい て、ここではりボゾームがシトソール（Ｃｙｔｏｓｏｌ　）のなかにｉ離し、そ こでは小胞体膜組ｖ＆（ｃｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｓｉｍ　ｍｅ ｍｂｒａｎｃｅ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　）　、及び膜結合酵素がなく、グ リコジル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｔｏｎ　）のようなボス１へ一翻訳変形の起 るのが期待されない。かくして２９．０００ダルトンのポリペプチドはＡｎｔｉ −Ｅｌ）によって特異的に沈澱するが、Ｅｐのａｇ＋ｙｃｏｓｙ＋ａｔｅ型を表 わしている。１５，０００ダルトンのペプチドは免疫学的に関連する種を表わし ている。組織におけるこれらのポリペプチドの存在はまた信頼できるＥｐ　（第 ２図）を組織抽出物の免疫しみにより確認される。これらの実験の詳細は実施例 ４に記載しである。

かくして得られたｒｒ＋ＲＮ△の成るものはＢａ１ｌｅｙ、Ｊ、Ｈらによる乙肪 旦ニスｊ↓んλ］−勤−の−ｙＨめ殴側唾＝−直ス、暖剤−よ上ヱａ４Ｌｋ水Ｉ Ａｎａ１．Ｂｉｏｃｈｃｍ、７０ニア５（＋９７６）によりＣＩ−１３Ｃｌ−１ ３Ｈの存在においてアガ［］−スゲルの北で犬ささによる分別によりＥ　ｐ−ｍ 　ＲＮ△のなかで濃縮される。溶解ＲＮＡ分画は溶出さね、その試料は翻訳され る。Ｈ訳生成物ルよＥｐの存在に関し、好ましくはＫｅＳＳｅｌｅｒの方法（前 掲）によってモノクロプールＡｎｔ　ｉ　−Ｆｐでもっと免疫沈澱によって試験 される。

アカロース−ゲル−分別化ＲＮ△の分画は（第３図の１１分画のように）Ｅｐ　 ｍＲＮＡのなかで濃縮され、［３２硫黄１標１ｃＤＮΔに−これはＣＤＮＡ陽性 クローンの同定において雑種形成探索としで使用されるものであるが一逆転写さ れる。逆転写（鳥類骨髄芽球細胞症ウィルス（ＡＨＶ　）逆トランスクリブター ゼを使用する）はＴ４キナーゼＲＮＡ燐酸化処理が高い特異性放用能（１０７ｃ ｐｍ／ｍｉｃｒｏｇｒａｍ　（７）程度ノ）ヲ与エルノテ好マしく、トンスフ？ （→−ＲＮＡ）　、リボゾーマルを含んだ標識単一鎖になる傾向はない。

ｐｏｌｙ（Ａ）　’腎臓ｍＲＮＡの残りは鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として第１ のｃＤＮＡ鎖の合成にＡＭＶ逆１−ランスクリプターゼによってオリゴｄ　Ｔ　 （１２−１８）をプライマーとして存在させ、使用される。理由は （ａ）非常に稀な機会がこの場合にすなわち可成り高められたＥｐ活性をもって ヒトの腎臓試料の入手しやり−さが表わされた。

（ｂ）　ＲＮａｓｅ−豊富の腎臓組織からの完全なポリソームの製造において遭 遇した困難さ、全ヒトの腎臓ＣＤＮＡライブラリーの構造が着手された。この方 法はただ貴重なＲＮＡの制限量の取り扱いを最小にするばかりでなく、医学的興 味のある他の腎臓タンパク質をふるい分けすることを可能としている。勿論、そ のようなｃＤＮ△ライブラリはＥｐ−クローンのために多量の組換型のふるい分 けを必要とするであろう。

逆転写に対４る最適な条件はｍＲＮＡの特殊な型に高度に依存している。逆トラ ンスクリブタ−ぜの純度、そのＲＮａｓｅ汚染、ｍ　ＲＮ　Ａ　間に対する逆ト ランスクリブターゼの比、基質の濃度、Ｉｌｌ　Ｈ及び反応混合物のイオン条件 がすべて重要な因子であり、転写効率に影響を及ぼしている。

ｍＲＮＡｖｊ型のマイクログラム当り６単位の逆１〜ランスクリブターゼの比が 好ましい。バナジルリボヌクレオシドコンプレックスは不活性な汚染されている ＲＮａＳｅに対して転写反応混合物に加えられるのが好ましい。最も好ましい反 応条件は実施例５に説明されである。一般的な逆転写方法はＲｅｔＺｅｌ、Ｅ、 Ｆらの試験管　の３　し　ロ　イルス道トランスクリフー゛ニよ７　Ｎ　（７） 　’Ｊ’五ｉ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９：５１３−５１８゜（１９８０）により行 われる。

反応期間の終りで鋳型ＲＮＡはｄｓ７ｃＤＮＡの合成において鋳型ｍＲＮ△の妨 害を避けるためにＣＨ３ＨｔＪ叶でもって変性するのが好ましい。

相補的のＣＤＮＡは大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＤＮＡポリメラーゼ１の大きな（ ｋｌｅｎｏｗ）断片（５′・・・→３“のエキソヌクレアーゼ活性を持っていな い）を使用して［ｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ、Ａ　らの方法により合成される。Ｌ ユＬ去Ｕ佐玉りぷＪＪ’１Ｌｌａ遣清１減−Ｃｅ１１，７：２７９（１９７６） 、ここで前の段階から輪の逆トランスクリプターゼがプライマーどして役立って いる。ヘアピンループの共有結合で結合しているＣＤＮＡの第１及び第２の鎖は ヌクレアーゼＳ　により開裂される。必要とされるＳｌの９はアルカリ性アガロ ースゲル”電気泳動を使用−するパイロツール実験で滴定により決定されＤＮＡ 分子の大きさを視覚的に具体的に表している大ぎな断片（Ｋｌｅｎｏｗ）生成物 はｃＤＮＡの大きさの２倍の分子として挙動する。鈍い末端二重鎖のｃＤＮＡ（ ｄｓｃＤＮＡ）は最初のｃＤＮＡ鎖の大きざの２分子として挙動する。Ｓ１ヌク レアーゼの最適量はこの場合ではｄｓ　ｃＤＮＡのマイクログラム当り２５単位 であることが分かった。

この研究において６０マイク［」グラムのｐｏｌｙ（Ａ）　＋ＲＮＡは５マイク ログラムの鈍い一末端のｄｓ　ＣＤＮＡを生じた。

ｄｓ　ｃＤＮＡはＶｉ　ｌ　＋ａ−Ｋｏｍａｒｏｒｒらの、’鳳　０二＞”した プロインシコリン　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ　、　（ｕｓ Ａ）７２　：３２２７、（１９７８）によりホモポリメリックなｄｃ：ｃｊＧデ ィリング（ｔａｉｌｉｎ（１）によってｐＢＲ３２２のＰｓｔ　１制限エンドヌ クレアーゼの位置（アムピシリン抵抗遺伝子のなかに位置する）に挿入される。

オリゴ（ｄｃ）−ディルドＣＤＮＡ及びオリゴ（ｄＧ）−テールドベクトルは１ ：２の比て・なます＜　ａｎｎｅａ　ｌ　）のが好ましい。

ｐＢＲ３２２はプラスミドクローニングベタ１〜ルとして用途が広いことで好ま しい。両アンピシリン及びテトラサイクリン抵抗眉伝子を含み、緩和されたイリ 御の下にある。Ｐｓｔ　１の開裂位置はアンピシリン抵抗遺伝子のなかの単一開 裂位置である。Ｐｓ【１位置のなかへのクローニングはこの遺伝子を不活性にす る。

かくしてクローンはアンピシリンに感じ易くなるであろう。つけ加えて、彼等は またもしもプラスミドをとり上げるならば、テトラサイクリン耐性になるであろ う。

組換型のプラスミドはＨａｎｄｅｌ、Ｈ，らにより記載される熱的ショック及び 塩化カルシウムによりＤＮＡをとりあげるために成分をつくるＥ、ｃｏｌｉ　Ｃ ６００に転換した。カルシ　ム　−のバー１　アージ　ＮＡ、染　Ｊ、Ｈｏ１． Ｂｉｏｌ、５３・１５９（１９７０）被形質転移体はアンピシリン感受性及びテ トラサイクリン耐性のために選択される。上述したようにｐｓｔ　ｉ位置はアン ピシリン耐性遺伝子のなかにあり、形質転移体はアンピシリン感受性（Ａｍｐ） であり、テトラサイクリン−耐性（丁ｅｔＲ）である。

Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００はプラスミドの精製及び大規模な成長に対する良好な宿 主であり、ｄｃ：ｄＧのホモポリマーのテイリイング（ｔａｉｌｉｎｇ　）に対 してなまされるプラスミドベクトルの使用により高い効率をもって転換されるた めに受容体　（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ　）として使用されるのが好ましい。

形質転換の最大効率に対して細菌的培養は対数的に成長し、塩化カルシウムをも って処理時間で約５×１０７細胞／ｒｄの細胞密度である。形質転換前に１２〜 ２４時間、氷で細胞を保持すると、形質転換効率は著しく増大する。

最適形質転換の反応比は細胞懸濁液の１０マイクロリツタに対してｃＤＮＡの１ １−１Ｏｎである。多量のＣＤＮＡ懸濁液は低い形質転換効率を生じる。形質転 換植付媒体として寒天（ｔｏｐ　ａｇａｒ）を使用するのが好ましい。

Ｅｐ　ＤＮＡに合体される組換型のプラスミドの同定のために若干の方法がある が、集落（ｃｏｌｏｎｙ）は探索（ｐｒｏｂｅ　）として濃縮されたＥｐ　ｍＲ ＮＡから合成された［３２燐］標識ｃＤＮＡを使用して、集落雑種形成により最 初にふるい分けするのが好ましく、本来の場所の集落の放射元素標識免疫検定法 （ＲＩＡ）により精製したモノクロナールＡｎｔｉ−Ｅｐ　ＩｇＧを使用して行 われる。

集落雑種形成はＧｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｈらの一般的方法により■、　−を　むク ローンＤＮＡ’ｓの　゛　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。

５ｃｉ（ＵＳＡ）７２：３９６１（１９７５）行ワレルノカ好マシイ。ココテ小 規模にはくふるい分は法の感度を保持しながら短い供給にある物質を節約するた めに）非常に少分の探索として高い放射能をもつ［３２燐コ標識ｃＤＮＡを小さ なニトロセルローズフィルターに使用するのが良く、かくして一時に多数の集落 のふるい別けを可能とする。被形質転移体の複写集落は小さなフィルターの上で 成長され、集落は溶解され、ＤＮＡはアルカリ処理によって変性される。細胞断 片はブロティナーゼＫにより処理され、ＤＮＡは加熱してフィルターに固定され る。ＤＮＡは探索に対して雑種形成され、その探索はただその補足的ＤＮＡにの み結合し、自動放射線写真によって陽性集落は同定するのを可能とする。この方 法は非常に能率的であり、さらにふるい分けから集落の約９５％の消去を生じる 。

陽性集落はとり出され、本来の集落ＲｒＡによりさらにふるい分けのためにニト ロセルローズフィルターの上で成長される。この方法は抗原決定群の表現（ｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎ）を必要とし、ＣＤＮＡの表現はＡｎｔｉ　ＥＤを確認するた めに適切な抗原位置を含んでいる融合ポリペプチドを製造するためにｐＢＲ３２ ２に挿入される。モノクロナールＡｎｔ−Ｅｐの入手が与えられると、ＲＩＡは 陽性クローンの同定のための選択される天然のふるい分は方法である。ＲＩＡは 特に抗原決定群を含む小口の抗原のみに要求される鋭敏な技術である。Ｈｅ　ｌ 　ｆｍａ、　Ｄ、　Ｈらの一般的方法が用いられた。ｃＤＮＡの−ライブラ１− の　ｒ・　・ふるいけによりニワトルのトロポミオシンを２′：！　るクローン のａ定　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）８０：３１（１９８ ３）ＲｒＡの多くの操作上の変化は（直接的または間接的か、１２３ヨウ素−標 識−Ａｎｔｉ−Ｅｐまたは１２５ヨウ素−標識第２抗体にするかは）可能である 。結合能力及び抗体の純度はＲＩＡ感度に著しく作用を及ぼす。かくして粗製の 腹水液体またはただ部分的に精製した抗体の使用は避けるべきである。

抗体の放射ヨウ素化（Ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ）はＨａｒｃｈａｌｏｎ ｉｓＪ、Ｊによる　ロブリン　び　のタンパ　の−部ヨ　−のためのｙ・°−Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１３３：２９９．（１９６９）に記載されているラクトース パーオキシダーゼ酵素ビーズ法により行なうのが好ましい。

この研究において３つの陽性クローンは同定されｐＥｐｌ２及び３と名づけられ た。すべての３つはモノクロナールＡｎｔ　１−Ｅｐ７Ａ７（１２５ヨウ素−標 識したもの及び標識されてないものの両方）と一致して反応した。

ＲＩＡＩＷ性クローンは培養で成長する。プラスミドＤＮＡは分離され、ｃＤＮ Ａ挿入の大きさは６％のポリアクリルアミドでの電気泳動により続いてＰｓｔ　 １制約エンドヌクレアーゼをもって消化することにより決定される。ファージφ ×１１４ＲＦＤＮＡ　Ｈａｅ　Ｉｌｌで消化した断片はサイズマーカーとして使 用される。挿入の大きざはｐＥｐｌ、２及び３に対してそれぞれ約１４００．６ ００、及び２００塩基対（ｂｐ）である。

陽性クローンが事実Ｅ　ｐ−ｆｆ１を含むことをさらに確認するために、Ｅｐ− 特異性ｍＲＮＡの雑種形成淘汰をＰａｒｎｅｓらが希ｍＮ　に　’７Ｇ［］−’ に・　るふるい　け　−Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　７ ８：２２５３　（１９８１）に記載したようにして行い、つぎのように修正した 。

プラスミドＤＮＡは１■／ｄで１１２０のなかに懸濁し、０、２５ＨのＮａＯＨ のなかで熱変性させ、中和し、ニトロセルローズの上にじみをつくる（　５ｐｏ ｔ　）。ＤＮＡを含むフィルターはｐｏｌｙ（Ａ）　”　ＲＮＡでもって雑種形 成される。比較的多量のｍＲＮＡを使用することは明白な結果のために賢明であ る（２．５マイクログラムのｐｏｌｙ（Ａ）　”　ＲＮＡ　／マイクログラムの プラスミドＤＮＡ）雑種−）５Ｊ汰「ｎ［【＼△はフィル今一・から溶層され、 上述した。−１′うに＋、ｌｔ験’ｉ”（内−Ｃ翻訳される。３５硫黄　標識翻 訳生成物はＳ　ＯＳ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｉ：及び蛍光間接撥影へにより分析される 。ずべての３つのり［１−ン雑種淘汰＋ｎＲＮ△は分子量が１５．０００．２９ ，０００．６６．０００及び９２，０００ダル（−ンのポリペプチドの合成に向 けられた。ポリペプチドの１０１定の最終確認は免疫プロディング（ｉｍｍＵＩ ｌｏｂｌｏｔ−ｔｉｎｇ　）及び競争的免疫沈澱によって行った。雑種淘汰ｍＲ ＮＡからの試験管中での翻訳生成物の５Ｏ３−ＰＡＧＥは精製モノクロノー−ル ＾ｎｔｉ−Ｅｐ　７Ａ７１ｇＧ　（Δｎｔｉ−Ｅｐ特許出願に記載されたように してｊ■られた）をもって免疫じみのために０．４５ミクロンボアの大ささの二 １−ロセルローズ紙のシートの上に電気泳動的に移転される。この方法はＴｏｗ ｂｉｎ、Ｈらのポリ　クリルアミ゛から二トロセノＵ上ニスシートへのタンパク 贋の一″′２゛０・　」１塁皇四Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳ Ａ）７６：４３５０（１９７９）に示され、実施例９に訂しく記載しである。

競争的免疫沈澱は実施例１０に記載されてあり、過剰な標識されてない精製Ｅｐ の存在において行われる。試験管のなかで合成されたポリペプチドの淘汰された 雑種について２９，０００ダルトン及び１５，０００ダルトンのポリペプチドが 免疫しみの上でＡｎｔｉ−ＥＤと反応させ、免疫沈澱により抗体結合のため真正 のＥｐと競争させる。

生れつきのヒ１への尿のＥｐの分子量は３４．０００ダルトンである。しかしな がら、仝腎ＲｍＲＮＡの試験管内翻訳生成物の免疫しみ及び免疫沈澱はすべて分 子量２９．０００ダルトン及び１５，０００ダル１ヘンの２つのポＩＪべｆチド ４牛成忙［ろ１、「ｐ−豊富の瞥ｆｆｉ＆悪性腫瘍試料から組織抽出物の免疫沈 Ｊ１２＋土’＜　／、Ｔ　Ｌれらの２つのポリペプチドに追加して３４　、００ ０ダルｌ＝シのポリペプチドを生成４る。３４．０００ダル［・ンのポリペプチ ドは）いλさが牛れ）さ゛のグリコ」シル化「ｐと同一で・ある。対照的に、２ ９．０００ダル１ヘンのポリペプチドは自然の、土まのグルＴｌシル化［ｐに予 想ｉ、？れるよりも小さい。メッゼージ依存ウサギ網状赤血球溶解産物系におけ る試験管内の翻訳は上述したようにＪ、り分子量が小ｃキいということで説明さ れると思われる１、′Ｌツク■ナールＡｎｔｉ−Ｅｐにより特異的に判別された 雑種淘汰２９，０００ダル１−ンのベゾチドはＥｐのアグリ〕シル化形であると 思われる。１５，０００ダル１ヘンのペプチドは明らかに免疫学的に関連があり 、抗原決定群を２９．０００ダルトン及び３４，０００ダルトンのベブブドに分 配していることは「ｐ関連タンパク質であると思われる。

生れつきのヒトの尿のＥｐの分子量からの判断すればクローンｐＥｐ１のｃＤＮ Ａ挿入は暗号情報の大きさの範囲内にあり、一方クローンｐＥｐ２とｐＥｐ３は 余りにも短く、Ｅｐの完全鎖を符号化できない。これらのＩ）　Ｎ　Ａは表現の ために十分の長さのヒトのＥｐ　ｃＤＮＡ鎖を製造するのに有用である。

選択的にｍＲＮＡの３゛末端に位置するｃＤＮＡ断片は制限写像により決定され たようにｍＲＮ△逆転写のプライマとして用いられるであろう。３°プライマが 特異正Ｅｐ　ｃＤＮＡ断片であるのでこの逆転写反応により合成されたＣＤＮＡ のみがＥｐ−ＣＤＮＡであろう。逆転写の最適化はＱＥＩ）ＣＤＮＡを生ずるの が期待される。

シーフェンシング（５ｅｑｕｅｎｃ　ｉ　ｎｇ　）はＨａｘａｍ、Ａ、Ｈらの＞ 　二９Ｉ−””ＬＤ　の　ｌ゛Ｐ　ｒ　ＯＣ−Ｎ　ａ　Ｃ、Ａ　Ｃａ　ｄ　、　 Ｓ　Ｃｊ　、　（ＩＪ　Ｓ　Ａ　）７４：５６０．　（１９７７）及び３ａｎｇ ｅｎ、　Ｆ、　らの鎖−・蛍　に　る　Ｎンーノエンジン“、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（（ＩＳＡ）７４：５４６３（１９７７）によって詳細 に記載された技術により行う。

次の例は本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない 。

淑貝」Ｊ１所： アガロース及びバナジル−ＸＴＰコンプレックスはベセスダリサーチラボラリト ーズ（ＢＲＬ）、ペセスダ、マリランドから得た。

クレアチンリン酸、スペルミジン、エセンシャルアミノ酸、ｕｅｐｅｓ　、子ウ シの９腺のＵ３Ｎ△、リソチーム、テトラサイクリン、アンピシリン、ｄｉｔｈ ｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、エチレンジアミントリアセテート（ＤＥＴ△）、ヘミン 、及びデオキシコール酸ナトリウムはシグマ　ケミカル　カンパニイ、セント・ ルイス、ミゾツーから１１だ。

規制エンドヌクレアーゼ、ｐＢＲ３２２プラスミド、　Ｌｃｏｌｉ　ＤＮへポリ メラーゼ１、ヌクレアーゼＳ１及びファージφＸ１７４　ＤＮＡ−Ｈａｅ　１１ １はニゴーイングランド　バイオラボス、ベバーリ、マサヂューセッツから得た 。

二１〜ロセル１］−ズフィルターはミルボア、ベットホルト、マサチコセ１ツか ら１７だ。

プロテインナーゼＫ及び子ウシの［ｌ［ｔＲＮＡはベーリンゲル　マンハイム　 バイオケミカル、インディアナポリス、インデアナから得た。

鳥類骨髄芽球症ウィルス（△ＭＶ）逆トランスクリブターゼはライフサイエンス 、インク・セン１へ・ペータースブルグ、フロツグから１ｑだ。

セハデエクスＧ１００及びプ「〕ティンＡはハルマシア、ビスキャドフェイ、ニ ュー・シト−ジーから（ｑた。

１．４−ピベロキシンージエタンズルホンｕ　（ＰＩＰＥＳ　）　。

脱イオン化ホルムアミド（ｄＦ）、グアニジン　イソチオンシアナート、セシウ ム　クロライド及びサルコシルはフルカ　ケミカル　コーポレーション、ハウバ ウグ、ニュー］−りから得た。

ウシ血清アルブミンはシュパルツーマン　バイオケミカル　スプリングバリー　 ニューヨークから得た。

オリゴ−ｄＴプライマー及びオリゴジチミジルセルローズはコーラボラディプリ サーブ、ワルサム、マサヂュセエツから得た。

［３５硫黄コーメヂオニン、１２５ヨウ素−山羊Ａｎｔｉ−ハッカネズミ免疫ク ロプリンＧ、及びラクトーゼパーオギシターゼ酵素ビーズはニューイングランド スフレアカンパニー、ボストン、マサチュ廿エツから１ｑた。

［）ＮａｓｅはＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　、フリーホルト、二１−ジョージから 得た。

ニトロセルローズシートはシュライヘルアントシュウール、キーン、ニューハン プシャから得た・トリトンＸ−Ｘ−１００（Ｔ洗浄剤はイーストマンコダック、 ポジニスター、ニューヨークから得た。

実施例１； いエリトロポエチン　Ｅ　を　る ヒトの　−　・の　六 ２年半の期間にわたってＥｐ活性を有する痛みのはげしい腎臓悪性腫瘍の試料に ついて広範な研究が行われた。腎摘出からの組織出来る限り新鮮に得られた正常 部分と悪性腫瘍部分との分離され、消毒液で洗浄し、血液及び異物物質を除去す るために氷冷した燐酸塩緩衝液食塩水で洗浄した。残留物はすみやかに液体窒素 で凍結させてＥｐ　ｍＲＮＡの分離のために一７０℃で貯蔵した。組織抽出物内 のＥ叶活性は先生吉工無酸素の赤血球増加症の（ｅｘｈｙｐｏｘｉｃ　ｐｏ＋ｙ ｃｙｔｈｅｍ；ｃ）ハツカネズミ試験方法により検定された。均質化された組織 は液体窒素中で試料を粉末化することによって製造され、Ｉ）Ｈ７，８の燐酸ソ ーダ２０ｍ　Ｍでもって、それを抽出する（Ｗｔ（Ｇ）／ｖｏｌ（ｍｌ）の比に 等しい）。

抽出液はそこで細胞断片を除去するために３０分間３０．　ＯＯＯｘｇで遠心分 離した。透明上澄液はＥｐの生物学的検定に使用した。

３６の腎臓細胞の悪性腫瘍抽出物が試験された。２つの試験された高いＥｐ活性 （０９と３．０のＥｐ単位／ミリリットル）、６つの中位の活性（０，１〜０． ７ＥＩ）単位／ミリリットル）を示し、残りは最低限度の（＜　０．１ＥＩ）単 位／ミリリットル）または検出されないＥｐ活性のいずれかであった。検死割駒 試料からの正常の腎臓組織の抽出物はＥｐ活性は検出できなかったが、ときには ０．０５単位／ミリリットルより少ない活性を示すことがあった。腎臓の悪性腫 瘍試料のＥｐ活性の増加は腎臓の正常及び腫瘍部分両方に見いだされた。高いＥ ｐ生物学的活性をもつ試料がｍＲＮＡの製法に使用された。

実施例２： ヒトの−ＲＮＡの　と 赤血球増加症（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｏｓ　ｉ　Ｓ　）をもつ腎臓悪性腫瘍を患 らっている患者からの腎摘出及び３．０単位／組織のグラムの高いＥｐ活性（Ｅ ｐ陽性）が実施例１から選択された。

腎臓組織の正常及び腫瘍部分の両方とも（別々に）ｍＲＮＡの製造に使用された 。

全ヒト腎臓ｍＲＮＡは前掲の旧ｒｉｃｈらのグアニジン／セシウムクロライド法 により分離された。ＲＮＡ製造は必要とされる１０ｇの分量から造られた。凍結 組織は混合機の液体窒素のなかで粉末化された。抽出緩衝液は６Ｍのグアニジン イソチオシアナート１５ｍＭのくえん酸ナトリウムｐＨ７，０／　０．１Ｍのベ ーターメルカプトエタノール る。混合物はさらに３分間均質化された。ＤＮＡは混合物を２２ゲージニードル （ｇａｕｇｅ　ｎｅｅｄｌｅ）を通過させて、剪断した。その溶液は１５分間ｉ ｏ，　ｏｏｏｒｐｍで遠心分離し、上澄液は集められた。

セシウムクロライド（ＣｓＣＩ）は０．４ｇ／ｄの溶液で加えられ、生成溶液は ５．７ＭのＣｓＣ　Ｉ緩衝液の０．１ＭのＥＤＴＡ　（１）８７．５　）（　３ ｒｎｌｌのにクッショと２ｄの組織抽出物）を含み、ベックマンＳＷ５０．　１ 型遠心分Ｍ管のなかに置かれた。遠心分離は２０℃で１６時間、２５．００Ｏｒ ｐｍであった。ＲＮＡペレットは１０ｍ　ＭのＴｒｉｓ　ＨＣＩｐＨ７．４／　 ５ｃｒＲＭのＥＤＴＡ／　１％のＳＤＳのなかに溶解され、石炭酸、クロロホル ム／１−ブタノール（４：１，Ｖ／Ｖ　）で抽出され、エタノールでもって沈澱 させた。

阻歴因ブー胆り立五Ｉ 実施例２の全ＲＮＡはオリゴｄＴセルロースカラム（０、９Ｘ１０ｃｍ：ベッド 容１　６．４ｍ）により選択されたｐｏｌｙ（Ａ）　’であった。ＲＮＡは１０ ｍ　ＭのＴｒｉｓ−ＩＩＣＩ、０．５ＭのＮａＣ　Ｉ緩衝液に吸着された　ｐｏ ｌｙ　Ａ＋ＲＮＡは１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７、４　（１ｍＭのＥＤ ＴＡと０１％のＳＤＳとを含んでいる）で溶出された。

２倍容積のエタノールにより一２０℃、２４時間沈澱させた。ペレットは７０％ のエタノールで洗浄し、水に再懸濁し、−２０℃で貯蔵した。通常は全ＲＮＡの ０．５から１■が腎Ｉｊ１組織の各９から得られ、約２０μりのｐｏｌｙ　Ａ” 　ＲＮＡが全ＲＮＡのｑ当り得られた。

実施例４： １　・９　の　ｔ　と　′ 隨挾旦式の翻訳（　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　）は標識としてにゴーイングラン ドヌクレア１２３６　Ｃｉ／ｍｍｏｌ　）の［３５硫黄］−メチオニンを使用し てメツセージ依存ウサギ網状赤血球溶解産物系で行われた。溶解産物はモノクロ ナールＡｎｔｉ−Ｅｐ（５０μ！７／Ｉｎ１）の精製グロブリンＧで予め吸収さ れ、プロティンＡ　（　２５０μｇ／ｄ，　ＩｇＧ　Ｓｏｒｂ．ニュー、イング ランド酵素センター、ボストン、マサチュセエツから得た）を有する固定された ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）で浄化された 。反応混合物（２μｍ）は１〜５μｇ／ｄのｐｏｌｙ　Ａ”　ＲＮＡ、［３５硫 黄］メチオニン（　Ｎ　Ｅ　Ｎ　）　５５μＣｉＳＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）の ２０ｍＭ，ＫＣＩ　の８０ｍＭ。

ＨＩＪ（ＯＡＣ）　２の１．３ｍＭ及び網状赤血球溶解産物１０μｇを含んでい た。培養は３７℃で１時間行われた。標識付き翻訳生成物はヒトのＥｐに対して モノクロナール抗体の精製［ＱＧでもって免疫沈澱した。免疫沈澱は前掲のＫｅ ＳＳｌｅｒにより５から５０μｍのＩ（ＩＧを使用して行った。反応成分はマウ ス血清で予めに吸収され、培養は１０ｍＭのＴｒｔｓ−ＨＣＩ，　ｐＨ８．２／ 　０．１５　ＭのＮａＣＬのなかで４℃、２４時間行われた。免疫コンプレック スは４℃で１時間の培養により、プロティンＡを有する固定されたｓｔａ　ｈ　 ｌｏｃｏｃｃｕｓＤＴＡｌｏ．１％のドテシルズルホン酸ソーダ（Ｎａ’［ｌＯ ｄＳｏ　４）　／１％のデオキシコール酸ナトリウム／１％のＴｒｉｔｏｎｎ　 Ｘ−１００（緩衝液Ｗ）を用いて６回洗浄し、電気泳動分析のためゲル試料緩衝 液のなかに懸濁した。翻訳生成物及び彼等の免疫沈澱生成物はＳＤＡ−ＰＡＧＥ により分解し、蛍光間接撮影法により分析された（第１図）。２つの免疫特異性 ポリペプチドが固定され、一つは分子量約２９，０００ダルトンに移動し、他の ものは約１５，０００ダルトン（レーン２）に移動した。これらのポリペブチラ ドはマウスの前免疫血清（レーン３）により沈澱しなかったし、彼等は内生の翻 訳に及びその用翻訳の免疫沈澱した試料のなかに検出し・なかったくレーン６と ７）。トに示したように分子９２９，０００のベブプドはモノクロチールＡｎｔ ｉ−Ｅｐによって特異的に沈澱されたものであり、［ｐの７グリコシル化型（ａ ｇｌｙｃｏｄｙｌａｌｃｄｆｏｒｍ）を表わしＣいる。分子ｆｉ１５，０００ペ プチドは明らかに免疫学的に関連し−Ｃ」３す、）７グリコシル化の［ｐの前駆 体又は崩壊断片を表わし−Ｃいる。これらのポリペプチドの最初の組織抽出物に おける存在の証明のために免疫じみが行われた。粗製及びｖｉ製のじトの尿のＥ ｐは、またその免疫的特異性の直接的比較を！ｊえるために同じしみ（ｂｌｏｔ ）の上に含まれた。分子８３４，０００の甲−のポリベヂドは粗製及び精製Ｅｐ 　（第２図２Ｂのレーン２と３）の両方からしみでたが、組織抽出物において３ つのポリペプチドの分子量３４，０００．２９．０００及び１６，０００ダルト ンが検出された。３４　、０００ダルトンのポリペブチラドは真正なグルコシル 化［ｐと大きさが同一であり、より分子量の小さいボリベブ升ドは多分Ｅｐの崩 壊梨またはアグリコシル化前駆体の志願者（ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ）である。こ れらの免疫特異正ポリペプチドの存在は組織抽出物及び試験管内の翻訳生成物の 両方とも、機能的Ｅｐ　ｍＲＮＡの存在とＥｐ−関連型として彼等の同定を支持 しでいる。じみをつけないゲル試料の同一の組はＥｐ−特異性タンパク質（第２ Ｂ図）に関して、全タンパク質（第２Ａ図）のために銀染色を受警プた。七ノク ロナール７Ａ７の免疫特異性は自明である。これらの結果はモノクロブールＡｎ ｔｉ−Ｅｐがアグリコシル化Ｅｐ及びその前駆体及び断片と同様に天然グリコジ ル化Ｅｐと認められることを示している。

モノクロナール抗体はこの研究において使用されるヒ１〜の［ｐに対して、訂し く　Ａｎｔ　ニー［ｐ特訂出騨）に記載した。Ｊ、うにして製造した。

精製１ｇＧが本研究のおいて記載された寸べての免疫沈澱、免疫ふるい分け、及 び免疫しみ反応に用いられた。

実施例５： 二１礼広ｍ！皿ローニンーク 実施例３のｐｏｌｙ（＾）　”　賢Ｈｍ　ＲＮ　Ａ　（２０ｕ　ｇ）はｃＤＮＡ 酵素合成に対する鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として使用された。鳥類骨髄芽球ウ ィルス（Ａｖｉａｎ　ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ（ＡＨＶ）逆 １−ランスクブターゼはオリゴ−ｄ　Ｔ　１２−１８プライマーの存在において ＣＤＮＡの第１の鎖を合成するのに使用された。鋳型の２０μびについて５０μ ｊの反応混合物が記載された条件であった。反応混合物はｐｏｌｙ（八）　”　 ＲＮＡ鋳型、５０ｍ　ＭのＴｒｉｓ、変性ＲＮＡに対して１ｍＭのＣＨ３ＨｇＯ Ｈ，３０ｍＭのベーターメルカプトエタノール、１ｍＭのバナジル＠酸塩リボヌ クレオシドコンプレックス、２ｍＭの各デオキシリボヌクレオチド及び１２０単 位の逆１〜ラスクリブターゼを含んでいる。培養は４２℃、１時間であった。

遊離のヌクレオチドはしファデックスＧ１００によるゲル濾過によって除去され た。ＲＮＡ鋳型は１２ｍ　ＭのＣＨ３Ｈｇ叶　をもって処理することにより変性 された。ｃＤＮＡの第２の鎖はＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮ＾ポリメラーゼ１のＫ　ｌ　 ｅｎＯＷの断片を使用して合成した。反応（まｉｏｏｍ　ＭのＨｅｐｅｓ　、　 ｐＨ６，８，７０ｍＭのにＣ１，７ｍＭのＨ（ＩＣ＋２．１０ｍ　ＭのＤ　Ｔ　 Ｔ　、　２２．５ｍ１ｙｌのベーター−メルカプトエタノール０、　５ｍ　Ｍの 各デオキシリボヌクレオチド及び２９のｃＤＮＡ当りＫ　ｌ　ｅｎＯＷ酵素の１ ００単位から成っている。反応は１５℃で１８時間、最終容積１ｍＱのなかで行 われた。フェノール抽出、セハンデクスＧ１００のゲル濾過、エタノール沈澱の 後に、ｃＤＮＡは第２の鎖の５′末端でヘヤピンルーブを開裂するためＳ１ヌク レアーゼをもって処理された。必要とされる＄１の量は各実験のパイロット反応 においてアルカリ性寒夫ゲル゛電気泳動を使用して滴定された。最適濃度はこの 場合、二重鎖ＣＤＮＡのｎｇ当り２．５単位の８１ヌクレアーゼであることが分 かった。また反応混合物はＣｏｍ　ＭのＮａＡｃ，　ｐＨ４．６、３００ｍ　Ｍ のＮａＣ　ｌ、及び３ｍＭのＺｎＳＯ４を含んでいた。培養は３７℃で１時間で あった。

ｃＤＮＡはそこで末端トラスフェラーゼ及び３°末端に対して１０−、１５残渣 を加えたところｄ−シチジン三リン酸（　ｄＣＴＰ　）をもって処理された。Ｐ ｓｔ　１−ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｐＢＲ３２２は同様にして末端トラスフェラーゼ とｄ−グアノシン　５′−三リン酸（ｄＧＴＣ）で処理された。反応混合物は１ ４０ｍＭのカコジル酸カリウム、ｐＨ７、２１０．５　ｍＭのＣｏＣＩ　、２４ ０ｍ　ＭのｄＣＴＰ，またはｄＧＴＰ、１、５ｑ．／ｄのウシ血清アルブミン（ ＢＳＡ）と６０００単位／ｄの末端１〜ラスフエラーゼな含んでいる。ｃＤＮＡ はホモポリメリックｄｃ：ｄＧティリングによってｐＢＲ３２２のｐｓｔ　１サ イドのなかに挿入された。オリゴ（ｄＣ）−ティル化ｃＤＮＡ及びオリゴ（ｔｉ Ｇ）−−ティリングベクトルは４２℃で２時間、１：２のモル比でなまされた。

再結合プラスミドは熱衝撃及びＣａＣ１２処理によりＦ．ｃｏｌｉ菌株Ｃ６００ に転移した。被形質転移体（　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ　）はテトラサイク リン耐性（Ｔｅｔ　Ｒ）及びアンピシリン感受性（ＡＩｐＳ）のため選択された 。

１７！の一夜間Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｃ６００培養は５００−フラスコのなかでＬ−煮 つゆ（ｂｒｏｔｈ　）の１００−のなかに接種された。細胞は３１℃で約５ｘｌ Ｏ７ｃｅｌｌｓ／ｄの密度まで烈しく振冴して成長させた。

培養は氷で１０分間冷却された。そこで４℃で１０分間４，ＯＯＯｘ　ｇで遠心 分離した。上澄液は捨てられ、細胞は氷冷した消Ｒ溶液の１００ｍＭのＣａＣ　 ｌ　２と２０ｍ　Ｍの酢ａソーダｐＨ６．５のなかに（最初の培養容積の５分の １）懸濁された。生成した懸濁液は２０分間氷の上に保持し、再び１０分間遠心 分離した。上澄液は捨てられ、細胞は０．１ＭのＣａＣ　ｌ　２と２０ｍ　Ｍの 酢酸ソーダの氷冷した消毒液のなかに（最初の培養容積の１００分の１）再懸濁 された。

懸濁物は２０時間氷の上に保持した。

１００μｇの細胞懸濁液は１からｉｏｎ　ｇのベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）が１０ 本の管に各々に加えられた。１ｄのＬＢ煮つゆが各管に加えられ、培養は３７℃ で１時間振盪してバクテリアを回収させ、抗生物質抵抗性を表現するのを可能と するため行った。

被形質転移体はテトラサイクリン耐性（ＴｅｔＲ）及びアンピシリン感受性（Ａ ｎｐ　Ｓ　）のためＬＢ−Ｔｅｔ板（１０７の　ｂａＣｔＯ−ｔｒｙｐｔＯｎｅ 、５３のＮａＣ　ｌ、３．５ｍ（１Ｎ）のＮａＯＨ、及び２ｓｕ　ｑ　／ｍのア ムピシリンを含むリットル当りの１５Ｌｊの寒天含む）上で、１−８−へｍｐ板 （ア１ーラリ゛イクリンの代りにアムピシリンの１００μ３／′ｍｌを含む）１ −で淘汰された。集落（　ｃｏｌｃｎｉｅｓ）ははじめの３７℃の培養のあと、 １２〜１６時間で表われ始めた。転移頌歌はテトラサイクリン陽性のための淘汰 でｃＤＮＡのマイクログラム当り５×１０５の被形質転移体であった。被形性転 移体の約９５％はテトラサイクリン−抗性及びアムピシリンー感受性の両方であ った。

実施例６： Ｅ−ｍＲＮＡの　び　３２　ｃＤＮＡ　のへメチル　ハイ゛ロオキサイ゛アガロ ース゛ル　５゜１）ＯＩＶ（Ａ）　”　ＲＮＡ（５０Ｍｇ）は４０ボルトで１５ 時間、低融アガロース（ＢＲＬベセスダ、マリ−ランド）を使用して１２．５ｍ 　ＭのＣＩ′１３　・Ｈｌ；ＩＯＨを含んだ１．５％のアガロースゲルのなかで 電気泳動により分別した。Ｂｅｔａ細胞のリポソームＲＮＡ及びサイズマーカー のφｘ１７４１１ａｅ　ＩＩＩ　ｄｉｇｅｓｔを含んだゲルレーン（Ｇｅｌ　１ ａｎｅｓ　）は０、５Ｍの酢酸アンモンニウムのなかで浸出し、エチイジウムブ ロミド（ｅｔｈｙｉｄｉｕｎ＋　ｂｒｏＩＩｌｉｄｅ　）で染色した。ｐｏｌｙ （Ａ）＋を含むゲルレーンは１００ｍＭのＤＴＴのなかでＲＮＡのリナチュレー ション（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）を可能とするため浸出した。レーンは３０ の分画に細片化し、ＲＮＡは制御したマイクロ並加熱及びフェノール抽出により ひきつづいてエタノール沈澱によって、これらの分画から抽出した。分別された ＲＮＡの部分は試験管内で翻訳され、翻訳生成物の免疫沈澱はＥｐ　ｍＲＮＡの なかに濃縮された分画を画定するため実施例４において記載したように行われた 。３５硫黄−標識化した翻訳生成物及びその免疫沈澱物は５Ｏ３−ＰＡＧＥによ って分析した。Ｅｐ　ｍＲＮＡの大部分は分画数１１に（第３図、１ル−ン）　 、Ａｎｔｉ−Ｅｐ　７Ａ７によって翻訳生成物の免疫沈澱によって検出され、分 けられた。（第１図のレーン（４）とレーン（５））、リボゾームＲＮＡとマー カーとしてのφ×ＤＮＡ　１ｌａｅ　ＩＩＩ断片を使用して分画数１１は大きさ で１４００塩基対（ｂｐ）にほぼ相当している。この分画は実施例５による３２ 燐−標識単鎖ｃＤＮＡを合成するのに使用された。比放射能の１１０７ｃｐ／μ グを得た。３２ｖＡ−標識ｃＤＮＡは再結合プラスミドの最初のふるい分けの探 索として使用した。

実施例７： ＣＮ　−イ　−１の　のふ　い　け： の　チ　− 実施例５からのＴｅｔ　Ｒ及びＡＩＩＩｐ８の被形質転換体は個々に採取され、 ニトロセルローズフィルター（ミリボア、１００の格子をつけた正方形を含む４ ．５１１１＋りの上で成長させた。１００の集落の各の集落は格子正方形のなか で各１２のフィルターにおいて培養された。各フィルターは１Ｂ−Ｔｅｔ板の表 面に置かれ、３７℃で２０時間培養した。被形質転移体はＥｐ遺伝情報において 濃縮され、大きざで分別されたｍＲＮＡから合成した３２燐ｃＤＮＡを使用して 雑種形成集落の変形によってふるい分けされた。

集落を有するフィルターは０．４ＨのＮａＯＨで中和され、プロテイナーゼにで 処理された。ＤＮＡは揉圧、８０℃で４時間加熱され、フィルターに固定された 。１２のフィルターは３ｄの探索のなかで１ｘ　１１０６ｃｐ／ｘｉ！にて一緒 にして５０％の脱イオン化ホルムアミド（ＤＦ）及び０．７５ＭのＮａＣｌ／　 ７５ｍ　Ｍのくえん酸ナトリウム中３７℃で２４時間、雑種形成した。フィルタ ーは０．３ＭのＮａＣｌ／　３０ｍ　Ｍのくえん酸ナトリウムをもって室温で（ ４０分１／洗浄）６回洗浄し、吸いとり、乾燥し、フィルムにさらした。

雑種形成集落を有する代表的なフィルターは第４Ａ図に示され、２つの種類の陽 性集落が検出された。１つは全集落の０．１〜０４％からなり、探索に対して非 常に強力に雑種形成し、自動放射線写真上に濃い班点を生じた。第２の種類は全 集落の５％からなり、第１の種類が行ったよりもかなり強度は小さく、変化した 度合で探索に雑種形成した。残りの集落は陰性であった。この予備的ふるい分け によって約９５％の被形質転換体がさらにふるい分けされ、消去された。

実施例８二 プラスミ゛ＤＮＡの　と・　の　・ふるい　け免疫学的ふるい分けは前掲のＨｅ ｌｆｍａｎらの一般的方法を使用し、ヒトのＥｐに対するモノクロナール抗体を もって本来の位置の集落の放射標識免疫検定法（ＲＩＡ＞により行った。細菌集 落は上に記載したように４．５Ｃｒｎのニトロセルローズフィルター上で成長さ せ、３０分間、Ｃ）ＩＣ＋３蒸気で溶解した。各フィルターは室温で一夜間、お だやかに振盪して、ペトリ皿のなかで溶解緩衝液の１０＃ｌｉ！をもって処理し た。溶解緩衝液は３％のウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）、５０Ｍｇ／ｄのりソ チーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）　、５０ｍＭのＴｒｉｓ　ＨＣＩ　ｐＨ７，４のな かの２μｇ／ｄのＤＮａｓｅ／１５０ｍＨのＮａＣｌ　（Ｔｒｉｓ／５ａｌｉｎ ｅ　）を含んでいる。フィルターはＴｒｉｓ／５ａｌｉｎｅで完全にそそぎ洗い し、室温で１時間、Ｔｒｉｓ／５ａｌｉｎｅ／３％のＢＳＡのなかの精製１ｏＧ 　７Ａ７（Ｉｍｙ／ｍ）の５−をもって培養した。フィルターは非特異的に吸収 された抗体を除去するために１洗浄当り４５分間にかけて同じ緩′ｆｉ液をもっ て６回洗浄した。結合した抗体は１２５ヨウ素標識親和力のヤギ抗ハツカネズミ ＩｇＧをもって１時間の培養により検出された（　１ｘ　１１０６ｃｐ／ｍ　＞ 。フィルターは緩衝液Ｗをもって６〜８回の洗浄により協力に洗浄し、自動放射 線写真により分析した。陽性の集落は１２５ヨウ素標識モノクロナール抗−Ｅｐ を使用して直接集落ＲＩＡにより実証された（　２ｘ１０６ｃｐｍ／ｄ）。放射 能ヨード化法はラクトーズバーオキシダーゼ方法により行った。すべてのＲＩＡ において精製されたＥｐの種々な量をもってじみのついたフィルターが抗体の免 疫学的検出の特異性のための対照として含まれた。そのような対照においてｌｎ ｇより少ない精！１！Ｅｐが検出できた。

集落雑種形成の陽性組換型を採取し、７Ａ７と共に本来の型の集落ＲＩＡによる 免疫学的なふるい分けのために公認の型で格子のニトロセルローズフィルター上 で成長させた。この方法はＡｎｔｉ−Ｅｐ承認のためにふされしい抗原位置を含 む融合ポリペプチドを生成するためにｐＢＲ３２２ベーターラクターセオベロン に挿入されたｃＤＮＡの表現に置き直す。１．４Ｘ　１０５の被形質転移体から ３つの陽性集落が７Ａ７と一致して反応し、同定された。これらの集落は１）Ｅ ｌ）　１．２及び３と名づけられた。そのような陽性集落（ｐＥｐ　２　）の検 出を示すところの代表的なフィルターは第４Ｂ図に示しである。陽性集落の免疫 特異性はざらに１２５］つ索標識７Ａ７を使用して直接集落Ｒ１△により確認し た。

すべての三つの集落は陽性に一致して［１２５ヨウ素１７Ａ７と反応した。これ らの集落のグラスミドＤＮＡは以ト記収するように分離され、その大きさが決定 された。

プラスミドＤＮＡはＢｉｒｎｂｏｉｍ、Ｈ，Ｃらのアルカリ溶解法（ａｌｋａｌ ｉｎｅ　１ｙｓｉｓ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）により製造された。１区会ｌラスミ ゛ＤＮＡのふるいＬｐｉ　（７）　ｔ、、　へＬ皿１１ユユユ且皿列ＬＮｕｃ、 Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　７：１５１３．（１９７９）　”ｔシて２０℃で６時間、 ４０．　ＯＯＯｒｐｍの回転数ｒ　５Ｗ５０．１ロータ・−のなかで１ＭのＮａ Ｃｌをもって遠心分離により精製した。規制エンドスフレアーゼによる消化は供 給省のすすめる条件のもどＣ行った。ゲル電気泳動は６％のポリアクリルアミド ゲルまたは１％のアガロースゲルのなかで行った。φｘ１７４　ＲＦ　ＤＮＡ− ）１ａｅ　ＩＩＩの消化断片はマーカートシテ用いた。ｐｏｐ　１．２及び３そ れぞれ゛に対して挿入の大きさは１　、４００．６００及び２００［％対（ｂａ ｓｅ　ｐａｉｒｓ）である。（それぞれ第５図のレーン２．４そして１） 実施例９： ｍ　ＲＮ　Ａの　３≦　のパ　び１　の　９ｍＲＮＡの淘汰はＰａｒｎｅｓら（ 前場）の変形方法で行った。

プラスミドＤＮＡは１Ｒｇ／ｍで水のなかに懸濁され、０．２５ＮのＮａＯＨの なかで９６℃で２分間加熱することにより変性し、すみやかに冷却し１１Ｃ１で 中和し、ニトロセルロース上で飽和してじみをつけた。フィルターは９０℃で２ 時間加熱し、そこでプラスミドＤＮＡのμ３当り２５μ３のｐｏ１１／（Ａ）　 ＋ＲＮＡの比でヒトの腎臓のｐｏｌｙ（Ａ）　＋ＲＮＡと一諸に雑種形成した。

雑種形成は　１００μ９の全容積中６５％　（Ｖ／Ｖ　）　Ｄ　Ｆ／２０ｍＭノ Ｌ４−　ヒヘＤ：Ｆ−シンージエタルズルホン耐（ＰＩＰ［：Ｓ　＞　、ｐＨ６ ，４１０，２％の５ＤＳ１０．４８のＮａＣｌ　／子牛の肝＠　ｔ　ＲＮ　Ａの ｕ認当り　１００μシを含み、３時間、５０″Ｃで行なった。雑種選択されたｍ ＲＮＡを９０秒間１００℃で、水の２００μ９をもって溶出し、そこｒ−液体窒 素中で・すばやく凍結した。溶出液はキャリＡ７としＣ子牛の肝ＩＱｔＲＮＡの １０・−２０μ７を使用して■タノー７１／により沈澱する。雑種選択化ｍＲＮ △は試験管内で翻訳され、３５＠黄標識翻訳生成物は５Ｏ３−ＰＡＧＥにより溶 解され、蛍光間接撮影法により分析した（第６図）。第６図Ａから明らかのよう にｐＥｐＬ２及び３によって選択されたＲＮＡ５はづべて４つの３５硫貨標識ポ リベブヂドの合成に向けれられたくそれぞれレーン４．５、そして６）。これら のベブチッドの分子♀はゲルマ−カーに比例して、約９２，０００．６６．００ ０．２９．０００及び１５，０００ダルトンであった。９２．０００ダルトンの バンドは内生の翻訳（レーンＯ）に見られた。ｐＢＲ３２２において選択された 試料（レーン１）はずっと小さい強度であった。６６．０００．２９．０００及 ヒ１５．０００り／Ｌ、トンノポリヘフチトハレーン（０）トレーン（１）にお いて検出されなかったし、それらはエリトロポエチン（［ρ）−特異性であるこ とを示している。

これらのポリペブチラドの固定の最終確認は実施例１０に記載したように免疫し み、及び競争的免疫沈澱により行った。

実施例１０： しみ　−　・　゛　に　リ −５で八゛した　、タンパク Δ梗」 タンパク質の電気泳動移転はＴｏｗｂ　ｉ　ｎらのく前掲）一般的方法により行 われた。ニトロセルロースは０．４５μ雇の孔の大きさのものが使用された。移 転は２５ｍＭのＴｒｉｓ　ＨＣＬ　ｐＨ８，４／１９２ｍＨのグリシン／２０％ のメタノール（Ｖ／Ｖ　）のなかで１２時間、０３５アンペアで行われ、そこで ３時間、１アンペアで■［５０電源をもツｕｏｅｒｅｒのＴＥ４２　Ｔｒａｎｓ ｐｈｏｒユニットを用いて行った。゛市気泳動のしみはＴｒｉｓ／５ａｌｉｎｅ ですすぎ洗いし、残留タンパク質結合位置を飽和させるために４０’Ｃｒ　１時 間、３％ＢＳＡ／丁ｒｉｓ／５ａｌｉｎｅをもって培養した。そこでそれは、４ ℃で一夜間または室温で１時間、３％のＢＳＡ／Ｔｒｉｓ／５ａｌｉｎｅのなか で７Ａ７　（１ｑ／ｄ）をもっと培養した。Ｔｒｉｓ／５ａｌｉｎｅをもって洗 浄したのら、しみは室温で１時間１２５ヨード標識ヤギ抗−ハツカネズミ免疫グ ロブリンＧ　（１，２ｘ１０６ｃｐｍ／ｄ）をもって培養した。しみは完全に緩 衝液Ｗをもって一洗浄当り４５分間かけて６〜１０回洗浄し、フィルムにさらし た。結果は第６図Ｂに示した。２つのポリペブチラドの分子ｍ２９，０００と１ ５，０００は＾ｎｔｉ−ＥＤによって免疫しみされたが、分子量９２，０００と ６６．０００のポリペプチドは検出されなかった。このことは全腎Ｒｐｏｌｙ（ Ａ）÷ＲＮＡ　（レーン２及び３）の翻訳において雑種選択ｍＲＮＡ　（レーン ４．５及び６）と同じように真実である。このことは高分子聞タンパク質の有効 でない転移によるのか、または抗原的理解を訣くことによるかは検討が残されて いる。

競争的免疫沈澱の３５硫黄標識雑種選択翻訳生成物は免疫反応混合物に精製され た非標識の生れつきのＥｐを添加して行った。３５硫黄−標識分子ｆｉｉ２９， ０００及び１５，０００のポリペブチラドは非標ＩＥｐの不在において（第７図 のレーン３　）　、７Ａ７によって免疫沈澱された。これらのポリペブチラドの 沈澱は過剰の非標識Ｅｐ　（レーン４と５）を追加して培養した。予備免疫ハツ カネズミ血清はこれらのベブヂッド（レーン１）を沈澱しなかったし、内生の翻 訳（レーン２）において何ら沈澱が検出されなかった。２μグの標識しない精製 Ｅｐ　（レーン４）の存在において約５０％の妨害が生じ、９０％以上の妨害は 標識しない精製Ｅｐ　（レーン５）の１０μ７の添加により観察された。これら の結果は雑種淘汰翻訳生成物の２９．０００及び１５，０００ダルトンのポリペ プチドがモノクロナールＡｎｔｉ−Ｅｌ）　７Ａ７によって認められ、真正なＥ ｐが抗体結合に対して彼等に匹敵することを示している。

△−１ 工１〜ロポエ　゛　Ｆ　の　７ 本方法によれば、痛みのはげしい貧血症患石から採取した非濃縮または濃縮尿を Ｉｌｌ物質として用いることができる。

出発試料は最初遠心分離し不溶性材料を除去するのが好ましく、疎水性相互作用 クロマトグラフィ（ＨＩＣ）により免疫吸収剤の繰返し使用によりさらに効果的 になり、多量の尿の汚染物質を除去するためにＬｅｅ−ＨａＬＩｎ（１，Ｓによ って記載された方法で精製された。ヒ１−のエリトロポエチン　離のための　゛ 出ンｌ〕Ｂｌｏ。

ｄ、５６：６２０−６２４（＋９８０）、　ＨＩ　Ｃはそのなかでゲルが疎水性 基を含んでいるところの架橋された中性のゲルクロマトグラフカラムを通して粗 製物質を処理することを包含している。フエニールセハロースＣＬ４Ｂが待にＥ ｐとの可逆的結合を強くしかも容易に与えるので好ましい。オクチルーセハロー スは使自できるがしかしそれからＥｐを溶出するのが完全にできない。

この工程で得られた［ｐの特異性活性は出発物質の効力に依存するが、一般には タンパク質のη当り１１５と２５０単位の間の第四にある。収率は通常的８０％ である。Ｅｐの１単位はヒトの尿のエリトロポエチンの第２回国際標準製造（Ｔ ＲＰ）の０．５■を含む活性として定義され（世界保健機構、生物学的標準物研 究所ハムフステート、ロンドン、イギリス）または、この製法の１アンプルの内 容物の１／１０をもって定義した。

ＨＩＣ−製造物質はＥｐに対する抗体を育てるための免投原（１！後Ａｎｔｉ− ＥＤと名づりる）及び通常恩されている不純物（以後「Ａｎ口＝■」と名づける ）として使用づることができる。

これは抗体製造の実験全動物を使用するときに単一免疫で便宜的に３５なうこと ができる。免疫（よこの技術の公知の方法により行われる。Ｅｐの場合、他の弱 い免疫原に最初の注射に追加して若干の追加抗原刺激注射を含むのが好ましい。

Ａｎｔｉ−Ｅｐ力価は１体力無酸素・赤血球増加症（ｅｘｈｙｐｏｘｉｃ　ｐｏ ｌｙｃｙｔｈｅｍｉｃ）ハツカネズミの生物学的検定、Ｃａｍ１ｓｃｏｌ　ｉ　 、　Ｊ、　Ｆ、及びＧｏｒｄｏｎ、　Ａ、Ｓ、のＧｏｒｄｏｎＡ、　Ｓ、編集゛ 古血の１整のなかのエリトロボ工−゛ノ４−・　、　びスー　メレデス、コーホ 、ニューヨーク、１９７０年３７０−３９６頁により決定された。

赤血球増加病はハツカネズミに低圧酸素症（ｈｙｐｏｂａ　ｌ　１ｃｈｙｐｏｘ ｉａ）により誘起される。霞いタンパク質濃度を維持し、Ｅｐ−活性を安定化す るために、検定のＥｐ試料は緩衝アルブミン溶液のなかで調合される。試料はポ スト低酸素症のハツカネズミの腹膜内に注射される。Ｅｐ−活性は赤血液細胞に とりこみ５９鉄の刺激物によって測定され、５９鉄とりこみはガンマ−計数器で 決定される。結果はＷ　ＨＯからの第２のＩＲＰを使用して得られた値と比較さ れる。Ａｎｔｉ−Ｅ　Ｉ）力価は赤血液細胞におけるＥｐ−刺激５９鉄のとりこ みを中和する能力を検定することにより決定される。

そこで免疫した実験掌の動物は最終的には出血される。

最後の注射の後の出血から抗血清は分離され、Ａｎｔｉ−ＥＤ力価が検定され、 非免疫グロブリンを消去するために免疫親和性クロマトグラフィにより精製され る。ウサギ抗血清は山羊−（Ａｎｔｉ−ウサギ）免疫グロブリンが共有結合的に 結合しているところのセハロース４Ｂカラムを通して処理される。非免疫グロブ リンは、カラムから取り除かれ、特異性免疫グロブリンは、たとえば３Ｍのチオ シアン酸ナトリウム（Ｎａ　ＳＣＮ＞または０．２Ｍの酢酸をもって溶出される 。

かくして得られた特異性免疫グロブリン調整品はＡｎｔｉ−［ｐをＡｎｔｉ−１ から分離するために処理される。この目的には高度に精製したＥｐの調整品を使 用するのが好ましい。しかしながら、本発明は、抗体の製造およびまたは分離に 純粋なＥｐをｍしない。便宜的方法により製造したところの部分的に精製したＥ ｐ　（または他の部分的に精製した抗原）が本発明の方法を実施するのに適して いる。

抗体の分離は新しい原理と方法により達成される。それらは支持マトリックスに 対する抗原の可逆的結合を使用し、活性の実質的な損失なしにＡｎｔｉ−ＥＤ　 （または他の抗体）の精製に用いられた後の価値あるＥｐ　（または他抗原）の 回収を可能とする。

抗体の分離方法は小賽胚しクチンーセハロース４ＢＩＧＬＳ）カラムが精ＩＥｐ で被覆され、生物学的特異性及び免疫学的特異性の配位子に対する異なる親和力 を持つことが利用される。方法は４つの工程を含んでいる。

１、精製［ｐはＷＧＬＳ−Ｅｐコンプレックスを精製するためにＷＧＬＳに結合 させる。小菱胚レクチンとそのＮ−アセチルグルコサミニル残香との相互作用に よりＥｐはＷ　Ｇ　Ｌ　Ｓに堅く結合する。

２、精製ウサギ免疫グロブリンの親和力はＷＧＬＳ：Ｅｐカラムを通して処理さ れる。Ａｎｔｉ−Ｅ　ＤはＷ　Ｇ　Ｌ　Ｓ　−ＣＤコンプレックスに結合し、一 方Ａｎｔｉ−１ではなくしかし流出液のなかに取り除かれ、あとの使用には無視 する。勿論、最初の精製Ｅｐは第１段階においてＷＧＬＳカラムを被覆するのに 使用するが均質でなかった。その不純物もまた第１段階のＷＧＬＳカラムに運ば れる。その結果、Ａｎｔｉ−ｉの小分画は第１工程のＷＧＬＳ−Ｅｐカラムに結 合する。このことは以下記述するように通常の免疫親和性技術の短所であり、本 発明はそれに打ち勝つものである。ＷＧＬＳ−Ｅｐコンプレックスに結合するＡ ｎｔｉ−Ｅ　１１は溶出され、好ましくは再び　Ａｎｔｉ−［Ｅｐ　／　Ａｎｔ ｉ−Ｉの免疫グロブリンの完全な溶解を確実にするために再生ＷＧＬＳ−Ｅｐカ ラムを通して処理される。第１及び第２の分離からＡｎｔｉ−Ｉ自在の溶出液は 蓄えられ、Ａｎｔｉ−１はそれから回収される。

３、免疫コンプレックス（Ｅ　Ｉ）−（Ａｎｔｉ−Ｅ　ｐ）　）の構成物の間の 親和力が　ＥＰと蔗糖−レクチンコンプレックス（ＷＧＬＳ−［Ｅｐ）との間の 親和力より低いためにＷ　Ｇ　Ｌ　Ｓ　−Ｅ　Ｄ−（Ａｎｔｉ−Ｅｐ）からＡｎ ｔｉ−Ｅｌ）が弱い酸または解離試薬を使用して選択的に溶出することができる 。解灯条件のもと、低い　ｐＨでＥｐに結合するＷＧＬＳの能力はＷＧＬＳをＡ ｎｔｉ−Ｅ　ｐ精製のＡ−５ ため有用な吸収剤にし、同時に価値あるＥｐの回収を可能にする。、（以下、第 ４工程を見よ）。　かくして回収されたＡｎｔし「ｐは溶出から（透析により） 分離され、凍結乾燥され、後の使用のため禅結しで貯蔵される。

４、［ｐはＡｎｔｉ−Ｅ　Ｄが溶出されたＷＧＬＳ−Ｅｐからさらに溶出するこ とにより好ましくはＮ−７セチルグルコサミンまたはＮ、Ｎ−ジアセチルキトビ オーセによってをもって回収Ｊることができる。これは免疫吸収剤が不可逆的に 支持マトリックスと結合して回収できないので通常の免疫親和力方法のもとでは できない。抗原の供給が（免疫吸収剤として使用される）制限されるときにはそ のような物質の回収は非常に価値ある〕約となる。代りにＷＧＬＳ−Ｅｐのカラ ムが再生され、再び使用づることができる。

かくして回収されたＡｎｔｉ−［ｐ及びＡｎｔｉ−）は別々にＣＮｒ′３ｒ−活 性化セハロース４Ｂに共有結合的に結合する。結合方法は一般的にＡｘｅｎ、　 Ｒらのハロ゛ン′シアンによるボリサッ女之ヱ上−＆用工Ａユ之バク質　びバッ チ゛の′う＝ｒ・すＡＮａｔｕｒｅ。

２１４：１３０２ｉ３０４．　（１９６７）によって記載された。そのように製 造されたセハロース−（Ａｎｔｉ−Ｅ　ｐ）及びセハロース（Ａｎｔｉ−Ｉ　） がＥｐの直接免疫′ＰＡ相カタカクロマ１〜グラフイＩＡＣ）及び逆免疫親和力 クロマトグラフィ（ＲＩＡＣ）精製のためにカラム型式において使用される。

ＨＩＣのより間装されたＥｐはさらにＤＩＡＣによりセハロース（Ａｎｔｉ−Ｅ 　ｐ）カラムの上で精製される。この精製はカラ△−６ ムから溶出液のなかに運ばれるところの汚染の大部分をとり除くことにある。一 方Ｅｐはカラムの１：に維持される。しかしながらこの段階で抗体はある小量の 不純物に対してＡｎｔｉ−Ｅ　ｐの免疫親和力精製における均質な「ｐが欠ける ためにセハロースー（Ａｎｔｉ−Ｅ　ｐ）カラムに存在するであろうことに注意 りることは重要である。これは通常の直接免疫親和力技術の極限的限界である。

セハロース−（Ａｎｔｉ−Ｅ　Ｉ）１カラムからのＥｐは適当な緩耐液をもって 溶出される。緩衝液の選択は［ｐ−活性を維持するために重要である。例えば、 ９”ｉ　ｉｉｎ、使用される免疫コンプレックスは酸性緩衝液または無秩序イオ ン（グリシン塩化水素緩衝液またはヂオシアン酸ソーダの、ような）を解離して Ｅｐを不活性にするが、一方簡単なアルカリは脱着を不完全にする。本発明者は １０から２０％の極性還元剤（グリセリンまたは伯の通常の１．２グリコール） 及び解離剤（グアジン、塩化水素、または尿素）を含むことは、アルカリ溶離剤 （Ｎ　ａ　Ｏｌ−１のような）においてＥｐ活性を保存しながら、免疫吸収剤か らＥｐを効果的弛緩を促進することを見い出した。丁ヂレングリコール及びグア ニジン塩化水素が好ましく、それは容易に除去され、Ｅｐ−活性に関して損害を 与えないと思われる。

かくして溶出したＥｐは水及び燐酸ソーダ緩衝液に対して免疫学的に完全に透析 される。これらの条件のもとてＤＩＡＣは非常に効果的であり、高度のｔＨＭ要 因（通常約１６９倍以上のＨＩ　Ｃ）及び高収量（通常的８０％またはそれ以上 ）を与える。しかしながら、ＤＩＡＣの主な制限は最初のＥｐ製造における不鈍 物である。これらの不純物に対する抗体は精製系で運ばれ、セハロースー（Ａｎ ローＥｐ）カラムにおける彼等の抗原を免疫吸収する１、結果としてＤＩＡＣ主 ＡＣの純度は抗体精製に対するＷＧＩ−Ｓカラム（第１工程）の製法に用いられ るところの最初のＥｐの純度を超えることができない。

この点においてさらに精製はＡｎｔｉ−１と結合する他のセハロース力ラムで達 成される。Ａｎｔｉ（ｐがただ不純物に対して小分画の抗体を含むのみで、Ａｎ ｔｉ−１は大口のこれらの抗体から成っている。かくしてセハロース−（Ａｎｔ ｉ−１）カラムはＤＩＡＣ−精ＶＪ　Ｅ　Ｄに含まれるすべての不純物に実質的 に結合する充分な抗体位置を与えることができるであろう。

セハロース−（Ａｎｔｉ−１）カラムの上でＤＩＡＣ−精製したＥｐ−を充分に 与えるときには痕跡の不純物は相当する抗体と特異的免疫コンプレックスの生成 によりカラムのなかに維持され、それはカラムの上に多く過剰に存在し、一方精 製Ｅｐは選択的に流出液のなかに取り除かれる。この工程は最初の抗原よりもざ らに＄’１ｆｆｌｆされているＥｐの製造を与える。そのような効果は他の通常 の免疫親和力技術では達成し得ない。この免疫親和力クロマトグラフィ工程は、 不純物がここで彼等の抗体と結合し一方価値あるタンパク質は流出液のなかに取 り除かれるが、逆免疫親和力クロマトグラフィ（ＲＩＡＣ）として参照される。

逆免疫親和カクロマ１〜グラフイエ程において除かれる不純物は一定集合の残留 法の汚染物である。不純物は多くの分離技術においてＥｐと一緒に精製されで来 るので全くバッチからバッチへと均一にされる。かくして抗血清を発生するのに 使用する異なった源泉からの粗製尿はＨＩＣ−Ｄ　ＩＡＣ，−ＲＩＡＣの方法に より効果的に精製できる。これらの小源の不純物のＤＩＡＣ−精製Ｅｐの免疫吸 着に要求されるＡｎｔｉ−１の♀はセハロースー（Ａｎｔｉ−［）カラムの全容 量に対して比較的小さい。さらに逆免疫親和カクロマトグラフィは汚染する不純 物のみを免疫吸着する。Ｅｐの脱着は必要′Ｃ″ない。かくして価値ある試料の 取り扱いを最小にし、したがって収量を増加する。カラムに保持される不純物は 適当な酸性離溶剤をちつで溶出することにより免疫吸着剤からつづいて解離する ことができる。カラムはかくして再生され容易に次の使用のために再生される。

流れ図において種々の工程の概略を次頁に説明する。

Ａ　−、’？ Ａ−１０ Ｄ　ＩＡＣ”ＲＩＡＣ精製されたＥｐは通常の精製技術（好ましくはクロマトグ ラフ技術および／またはゲル濾過）を使用するところの精製をさらに試みること により均質性が試験でき、生物学的活性を検定できる。

Ｄ　ＩＡＣ−ＲＩＡＣの精製されたＥｐはさらに均質性が試験され、電気泳動技 術によってゲル電気泳動、等電的集中、及び以下記載する公知の方法による非解 離系におけるｄｉｓｃ電気泳動のような技術によって特徴づけられる。

（ａ）　Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ、に、：バクー１アファージＴ４のヘラ゛の　セン ソの−の　゛　・タンパ３．　Ｎａｔｌｌｒｅ　２２７：　６８０−６８５（１ ９７０）　： （ｂ）Ｃａｔｓｉｍｐｏｏｌａｓ、Ｎ、ｅｔ　ａｔ　（Ｅ　ｄ　）　；　２　・ 　の　・、！、−五多」　ニューヨーク、ブレニウムプレス、（１９７７）、及 び（Ｃ）Ｄａｖｉｓ、Ｂ、Ｊ、：Ｄｉｓｃ　＝’　−１１：ヒトの血゛　ンパク 　に・　るＴ゛と　、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、　１２１：４０４− ４２７、　（１９６４）。

次の例は本発明を説明するのに役立ち本発明の範囲を限定するものではない。

叛−１ フェニル・セハロースＣＬ４Ｂ、ＣｏｎＡ−セハロース４Ｂ１小娶胚レクチンー セハロース６ＭＢ、ＣＮＢｒＮＢｒ活性セスロース４ＢテックスＧ１００はハラ マシアラボラトリーズインク、（ビスカッタウェイ　ニューヨーク）から得た。

グアニジン塩酸塩（超純）シュパルツーマン　バイオケミカエリス（スプリング バレー、ニューヨーク）から１９だ。

エチレングリコール、Ｎ−アセチルグルコサミンはシグマケミカル　カンパニ　 セントルイス　ミヅリーから得た。他のすべての試薬は他に特記しないかぎりフ イシャーサイエンティフィツカンバニ、フエラウン　ニューヨ−クずべてのカラ ムの溶離剤の濃度は他に特記しない限り、アミコン限外濾過装置ＹＭ１０メンバ ーを使用して４℃で行われた。

モノクロナールＡｎｔ　ｒ　− エリトロポエチン（Ｅｐ）は弱い免疫原である。したがって、入手しやすい純粋 なＥｐと最初の免疫方法の選択（動物、位置、及びスケジュール）は要求される 性質を有するモノクロナールＡｎｔｉ−Ｅ　ｐを信頼性よく分泌するためのハイ ブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）の能力及びハイブリドーマ生成の効率に実質 的に作用するものである。

ヒトのＥｐは貧血癌患者の尿からフェニル・セハロース０Ｌ４Ｂの上の疎水性相 互作用クロマトグラフィによって分離した。ひきつづいて直接免疫親和力クロマ トグラフィにより生成し、ひきつづき逆免疫親和力クロマトグラフィにより（Ｅ ｌｌ精製特許出願に記載されたように）精製し、免疫原として使用される。かく して精製されたＥｐの純度は他の研究者によって提供された均質Ｅｐの純度と比 較された。結果は第１図に示しである。抗原としてこの研究に使用される物質は Ｅｐ′Ｒ１特許出願のなかで充分に記載されているように、ゲル等電的集中（ｇ ｅｌ　１ｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ）及び非解離条件のもとての 電気泳動により単一のバンドを示している。

改鼓二造の免疫及びその後の融合は不安定の雑種分泌免疫グロブリンＭを生じた 。先体力の第１注射及び仄鼠豆造の押し上げ（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）の組み合せは 不安定な種を生成した。

その故にＬ体力の免疫は好ましい。Ｆｅｍａｌｅ研究所のハツカネズミがむしろ 使用される。多位置での多注用は満足的免疫Ｂ−２ 応答を（りる確率を増加する。免疫応答は恐ら（Ｋｌｉｎｍａ口、ＮＲの方法、 １工及１第２クロナール゛ｆ−ヌ」１悲底凰立■又立皿匁し１．ＪＴ、Ｅｘｌｌ 、Ｈｅｄ、１３５：　２４１−２６０（１９７２）。以下実施例２に詳しく説明 されているが、固相敢ＤＡ標識免疫検定法（ＳＰＲＩＡ）によって検定される。

免疫マウス白酒のＥｐ−中和化能力は１体力の低酸素赤血球増カロ症ハツカネズ ミ方法により、Ｅｐ−精製特許出願に記載したようにして、最も信頼性のある方 法として（最も費用のかかり、時間、消費で′あるが）検定するのが好ま（）い 。満足な免疫応答についてハツカネズミが選択される。　免疫応答をＡｎｔｉ− Ｅｐ力価及び［Ｅ　ｐ−中和化力価によって測定する。満足と考えられる応答は Ａｎｔｉ−ＥＤ力価が第１Ａ図の１　：　１０，０００連続の稀釈でづくなくと も５０％結合を示づべきであり、Ｅｐ−中和化力価は１ｏＯＥｌ）１位７／ｄの ハッカネズミ血清以上の中和を示（゛べきＣある。これらの性能の特徴はむしろ Ｅｐの弱い免疫的性質を考慮すると（”ばらしいことである。したがって免疫に 使用される［ｐは最高に精製すべきであり、免疫されたハツカネズミの数は、相 対的に大きくすべきである。一般的には注意深い選択と免疫プロトコルの作成を 暇定づると一匹のハツカネズミについで６回免疫され、満足できる免疫応答を示 している。

ハイブリドーマは、満足できる免疫応答を示すハツカネズミの牌臓リンパ球から 及び非分泌ハツカネズミの骨髄腫細胞から融合される。Ｎ５−１　、非免疫グロ ブリン分泌骨髄腫細胞系のＢａ１ｂ／　ｃ　ｏｒｉｇｉｎは、商業的に入手でき （Ｈｕｔａｎｔ　Ｃｅ１ｌ［３−３ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ、Ｃａｍｄｅｎ、Ｎ、Ｊかう）、８−７ザグ７ニンにλ１７Ｊる抗性は 好ましい。他の型の骨髄［１胞系は原則的に、にｏｈｌｅｒ、　Ｇ、、Ｈｏｗｅ 、　Ｓ、　Ｃ，、及びＨｉ　ｌ５ｔｅｉｎ、　Ｋらが討論したこれらを含むのが 適当であるだろう、３免支グ旦１男−ス分１五１誹力磨ＪａＪＬ’ｉ’Ｌ且血至 ■辺］了７．　［ｕｒ、ＪＩｍｍｕｎｏｌ、　（１９７６）　、　６　：　２９ ２−２９５融合は、Ｋｅｎｎｅｔｔ　、　Ｒ，Ｈの一般的方法により行われ以下 実施例２に説明されているように変形して行った。　ｆ／’）旦−ｊ−）Ｉｔ坑 一体。−ノ又イーＬ史ドー二了：　生４姐学−０辻」［に、住１と−々新−に智 ＋２；　ｈ＜　１，１　（Ｋｅｎｎｅｔｔら編※ｉ）　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓ ｓ、　３６５−３６７　（１９８０）融合雑種が供給され、選択的媒体で成長さ せる。生きのこったハイブリドーマ細胞はこれらの媒体から培養ぐ生長し、培養 媒体は固相放射標識免疫検定法（ＳＰＲＩＡ）によりに１１０ｍａｎ（ｍ掲）の 方法によりＡｎｔｉ−Ｅｌ）の存在をふるい分けづる。

陽性のハイブリドーマ培養はそこでＥｐ−中和化のために好ましくは、無酸素の 赤血球増加症のマウス方法によって検定される。

Ｅ叶結合及びまたは［ｐ−中和が確認されたのら、陽性のハイブリドーマ培養は 免疫学的にクローンされ、液体媒体中で成長される。直接的クローニング及び再 クローニングはハイブリドーマの安定性を確認する桝めに必要である。再クロー ニングについて陽性である陽性培養から誘導されたクローン集落の１００％まで 安定であるハイブリトーン培養は従来技術においては通常前えられない。本発明 のハイブリドーマ細胞の安定性は延長期間（１〜２年）　Ａｎｔｉ−Ｅｐ必泌に 低下しないのが確認されている。全部で１０の融合において６４６０ハイブリド ーマから（以後７Ａ７．７８９及び２Ａ１０と名づけられる）３つの安定なり【 ］−ンが分離された。

Ａｎｔｉ−Ｅ　ｐ−分泌ハイブリドーマの成功したクローニングの後、多分の高 い力価抗体が培養においてハイブリドーマを生長することによりまたは好しくは 腹水誘起（ａＳＣｉｔｅＳ　１ｎｄＬＩｃｔｉｏｎ）によって得ることができる 。腹水腫瘍はｐｒｉｓｔａｎｃｅ準備された遺伝子組成が同一なハツカネズミに クローンハイブリドーマ細胞の腹膜内ｉ）：射により誘起できる（準備したハツ カネズミ当り約１０７ハイブリドーマ細胞）。腹水が数週間発生ずるように〈好 ましくは２−３週間）したのちに、腹水液体は、腹膜腔からとりだされる（客体 ができるかぎり多くのハイブリドーマが２１）られるためにｈ！　返し集めるこ とができ、好ましい）。腹水液体のモノクロリ゛−ルＡｎｔｉ−Ｅｒｌ活性を５ ＰＲＩＡにより試験する。

腹水のＡｎｔｉ−ＥＥｐ活性が事実免疫グロブリンによっていることを確認する ために、安定な抗体調整品を製造するためにプロテアーゼ及びヌクレアーゼのよ うな遊離の分離醇索がＥｐ〜粘製のために適当であり、ＥｐｍＲＮＡの同定及び Ｅｐ−ｃＤＮ△ライブラリのふるい分けのために腹水免疫グロブリンは、精製さ れねばならない。腹水免疫グロブリン及びそのサブクラスは設計を援け、さらに 効果的精製法を開発する特徴がある。

免疫グロブリン鎖の型は同型（１ｓｏｔｙｐｅ）特異性ウサギの抗−ハツカネズ ミ免疫グロブリンキット（ボウリンゲル−マンハイム、インディアナポリス、イ ンデアナ）を使用して特性を調べる。この試験はまた免疫精製の後の結果を確認 するために使用される。

本研究で製造された３つの安定なり［］−ンに相当する３つの抗体の型はＩｇＧ ２ａ／ｋ　（７Ａ７から）及びＩｇＧ、Ｏ／ｋ　（７８９及び２Ａ１０から）で あった。

抗体の精製技術はきびしい障害を示す多くの方法に対して最大の効果が挙げられ るようにした。

タンパク質Δ−セハロース親、和カクロマトグラフイはＩｇＧ　２　ａ／にの精 製に一般的に満足される。しかしながら、この親和力吸収剤はＩＯＱρに効果的 に結合することに（ｐＨａ、ａのようなわずかに塩基性のｐ［（においてさえも ）うまくいかない。

硫酸アンモニウムによる分別、ジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ−セ ルロース）　イオン交換及びセハテツクスＧ−２００ゲル濾過はプロテアーゼ及 びヌクレアーゼを汚染しているすべてを除去するのにうまくいかないこれらの分 解酵素は抗体に、「ρ−活性に（吸収剤としてモノクロナールＡｎｔｉ−Ｅｐを 使用するときの免疫親和カクロントグラノイによる精製のあいだに）及びＥ　Ｉ ）−ｍ　ＲＮ　Ａの安定性に（ポリソーム（ＤＯｌｙＳＯｍｅ）免疫沈澱による 精製のあいだに）イ１害である。　Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｆ　−Ａｆｆｉｇｅｌ　ｂｌｕ ｅクロマ！〜グラフィはプロテアーゼ及びＲＮ　ａｓｅを効果的に除去するが最 大に効果を挙げるのが困難であり（各抗体が別々に決定されねばならない最大溶 解条件）、シばしば収量が低い。タンパク質Ａ−セハロースＣＬ　４　Ｂ親和カ クロマ１−グＢ−６ ラノイは硫酸アン上ニウムをもっｒ：溶出した１ｇｇ２ａの沈澱にひきつづいて 、七ツク［コナールＡｎｔｉ−Ｅｐ　７△７の精製に使用づる。収量は通常すく なくとも９０％である。セハロース４８にユバＪＴ結合的に結合しでいる親和力 精製の山羊の抗ハッカネズミ免疫グロブリンがＴｉ１ｌ精製のために効果的であ り、プロテアーゼ及びＲＮ　ａｓｅを除去する。モノクロナールＡｎｔｉ−Ｅｌ ）　７Ｂ９及びＡｎｔｉ−Ｅ　ｐ２　Ａ　１０　（ＴｇＧ　ｌ　／ｋ）　（７） 精％Ｊ　ｋ−用イルＺ　トができる。両［ノクロナール製造は検出可能な分解酵 素活性から自由にすることができる。かくして回収精製されてた免疫グロブリン は５ＰＲＩＡにより〈生れつきのＥ叶結合能力を測定することにより）定量化す ることができる。彼等のＨ鎖及び１−鎖は５ＬＳ−ＰＡＧＥにより特徴づけるこ とができる。Ｅｐ−中和能力は先体吉工無酸素赤血球増加症ハッカネズミ生物検 定により試験することができる。１れつきのＥｐ−結合は免疫しみ及び１２５ヨ ウ索−Ｅｐ（変性）結合は免疫沈澱により決定される。

ハイブリドーマ７△７は７Ｂ１または２Ａ１０のいずれよりず−と強いＡｎｔｉ −ＥＥｔ＋　％Ｊ造者であり、多くの抗体のように１０倍以上分泌する。この研 究において分離された３つの抗体のうち、２△１０のみが［ｐを中和する。、ス べての３つの抗体はうまれつきのＥｐ及び１２５］つ素標識のＥｐ両方に結合す るのが認められる。

本発明のモノクロナール抗体とＷｅｉｓｓ、ら（前掲）により報告された抗体と の間の結合親和力の左置は非標識Ｅｐをもっ１２５ヨウ素−Ｅｏの競争的放用− 免疫沈澱において標識−Ｅｐに対する牛まれつきのＥｐの比は１２５」つ素［ｐ −結合の５０％阻害を起すのに充分Ｃあった。（ＷｅｉｓＳらにＡ３いで報告さ れた２５００の比に対抗するものとして）という事実により説明されている。本 発明の抗体の増加した結合親和力は免疫吸収剤として精製したモノクロナールＡ ｎｔｉ−Ｅｐを使用し、免疫親和力クロマトグラフィにより、Ｅｐの精製に使用 することをここに開示し非中和の抗体を与えるので著しく重要である。７Ａ７（ ＴａＧ２ａ）からの免疫グロブリンは多量分泌づるため好ましく鳥収予で効果的 に精製することができ、［ｐを中和しない。

免疫親和力クロマトグラフィ（免疫吸収剤として７Ａ７からのモノクロナールＡ ｎｔｉ−Ｅ　Ｉ）を使用して）によるＥｐの精製はこの段階で純度のＥｐとＤＩ ＡＣ及びＲＩＡＣとの組み合せについて得られたそれらに対して比較し得る程度 に得られる。

ざらにこれらの七ツク［］ナール抗体はヒツジ、ウサギ、ネヅミ及びハツカネズ ミのような他の動物からのＥｌ）を認める故に、彼等はまたこれら及び伯の種か らのＥｐの親和力、精製に非常に有用であるだろう。

ざらにＥｐ−精製のために改良された手段を提供することに付は加えて、本発明 によるモノクロナールＡｎｔｉ−Ｅｐの製造と精製は、赤血球生成に関する研究 を促進するものと期待される。本発明のモノクロナールＡｎｔｉ−Ｅｌ）はＥｐ 一応答的細胞、「ｐ−特異的受容体セル及びＥｐ−合成細胞の検出のために有効 な探査を提供している。免疫傾向検査及び放射標識免疫検査技術を結合して有利 に使用することができる。Ｅｐ−遺伝子の調整は正ＦＩ６．２ ＦＩ６．４ ｒｌ　−入　−Ｉ ＦＩＧ、ｅＡ　ＦＩＧ、６Ｂ 国際調査報告 Ｉｌｌｌｍｌｔｏ−＾ｌ１１１１ａｆ１１６Ａ醜Ｐσｒ／ＵＳ８５１０００５４

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトのエリトロポエチンに対するモノクロナール抗体と免疫化学的に反応す るペプチド。
2. ２．すくなくとも１つのデオキシリボ核酸断片が上記ペプチドに対するデオキシ リボ核酸連鎖の暗号情報づけからなるものを含むつ１つの有機体から製造される ことを特徴とする特許請求範囲第１項記載によりペプチド。
3. ３．上記デオキシリボ核酸断片からなる表現ベクトルによって上記有機体が転移 されることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載によるペプチド。
4. ４．一つの有機体により製造される融合タンパク質であり、上記タンパク質が実 質的に、ヒトのエリトロポエチンに対するモノクロナール抗体と免疫化学的に反 応し、有機体の内生タンパク質の一部分からなることを特徴とする融合タンパク 質。
5. ５．ヒトのエリトロポエチンに対するモノクロナール抗体と免疫化学的に反応す るペプチドをデオキシヌクレオシド連鎖暗号情報づけすることを特徴とするデオ キシリボ核酸断片。
6. ６．特許請求の範囲第５項によるデオキシリボ核酸断片からなる組換型のデオキ シリボ核酸。
7. ７．特許請求の範囲第６項による組換型のデオキシリボ核酸により転移された有 機体。
8. ８．エシエリキヤ属（大腸菌種）のバクテリアからなることを特徴とする特許請 求の範囲第７項記載による有機体。
9. ９．上記デオキシリポ核酸断片により暗号情報づけられたぺプチドの表現に適切 である上記分子の内の一つの位置に上記デオキシリボ核酸断を含むことを特徴と する特許請求の範囲第６項記載による組換型デオキシリボ核酸分子。
10. １０．上記ぺプチドが融合タンパク質として表現の可能性のあることを特徴とす る特許請求の範囲第９項記載による組換型デオキシリボ核酸分子。
11. １１．上記組換型デオキシリボ核酸分子はＰＢＲ３２２から誘導された雑種プラ スミドであることを特徴とする特許請求の範囲第６項による組換型分子。
12. １２．上記デオキシリボ核酸断片が上記プラスミドのプロビデンシア属種１の開 裂位置に挿入されることを特徴とする特許請求の範囲第１１項記載による組換型 分子。
13. １３．上記デオキシリボ核酸断片がホモポリメリックなｄＣ：ｄＧテイリングに よって挿入されることを特徴とする特許請求の範囲第１２項記載による組換型デ オキシリボ核酸分子。
14. １４．純粋形のヒトのエリトロポエチン遺伝情報を運搬する機能的メッセンジャ ーリボ核酸分子。
15. １５．腎臓悪性腫瘍細胞から誘導され上記腎臓悪性腫瘍が高いエリトロポエチン 力価を有することを特徴とする特許請求の範囲第１４項記載による機能的メッセ ンジャーリボ核酸分子。
16. １６．上記力価が約１単位／組織のｇより大きいことを特徴とした特許請求の範 囲第１５項記載による機能的メッセンジャーリボ核酸分子。