JP2009292836A

JP2009292836A - ２つの性腺刺激ホルモン放出ホルモンおよびそれらを単離するための方法

Info

Publication number: JP2009292836A
Application number: JP2009211136A
Authority: JP
Inventors: Abhijit Chatterjee; チャッタージーアブヒジト; Partha Ray; レイパーサ; Subrata Dasgupta; ダスガプタスブラタ; Samir Bhattacharaya; バハッタチャラヤサミア; Santosh Pasha; パシャサントシュ
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR; Department of Biotechnology
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR; Department of Biotechnology
Priority date: 2002-01-30
Filing date: 2009-09-11
Publication date: 2009-12-17
Also published as: EP1470153B1; JP4394954B2; US6977242B2; WO2003064460A2; NO20043551L; DE60323052D1; AU2003202800B2; US20050233951A1; US7074758B2; WO2003064460A8; EP1470153A2; WO2003064460A3; ATE405579T1; US20030236185A1; JP2005529070A

Abstract

【課題】魚類の繁殖を誘導するための新規な性腺刺激ホルモン放出ホルモンを単離および同定すること。
【解決手段】２つの性腺刺激ホルモン放出ホルモンであるｍｕＧｎＲＨＩおよびｍｕＧｎＲＨＩＩであって、該ホルモンは、それぞれ、アミノ酸配列ＱＨＷＳＡＷＲＬＰＧおよびＱＨＷＳＷＧＩＬＰＧからなり、該ホルモンは、性腺刺激ホルモンの生成を活性化することによって、魚類における誘導性繁殖のために組み合わせおよび単独の両方で有用である、ホルモン。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規な２つの性腺刺激ホルモン放出ホルモンである、ｍｕＧｎＲＨＩおよびｍｕＧｎＲＨＩＩ（それぞれ、アミノ酸配列番号１（ＱＨＷＳＡＷＲＬＰＧ）および配列番号２（ＧＨＷＳＷＧＩＬＰＧ））に関し、これらは、組み合わせおよび単独の両方で、性腺刺激ホルモンの産生を活性化することによって魚類における誘導された繁殖に有用であり、そして、インディアンムーレルの脳からこれらを単離する方法、およびこの新規な性腺刺激ホルモン放出ホルモンを使用して魚類における繁殖を誘導する方法に関する。

性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）は、現在、魚類の誘導された繁殖のための最も利用可能なバイオテクノロジーのツールである。ＧｎＲＨは、全ての脊椎動物における生殖のカスケードの重要な調節因子であり、かつ中心的な開始因子である。

それは、デカペプチドであり、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の下垂体放出を誘導する能力を有するブタおよびヒツジの海馬から単離される。それ以来、ＧｎＲＨの１つの形態のみが、ＬＨおよびＦＳＨの放出を引き起こす唯一の神経ペプチドとして、胎盤哺乳動物（ヒトを含む）において最も同定されている。

しかし、非哺乳動物種（モルモットを除く）において、１２のＧｎＲＨ改変体が、現在構造的に明らかにされており、これらのうち、７つの異なる形態は、魚類から単離されている。構造的改変体およびそれらの生物学的活性に依存して、多くの化学的アナログが調製され、それらのうちの１つは、サケ（ｓａｈｎｏｎ）ＧｎＲＨアナログであり、現在、魚類の繁殖によく使用されており、全世界で市販されている。疑問なのは、なぜ魚類は、雄および雌のパートナーから生殖細胞を放出するために、この神経ペプチドホルモンによる誘導を必要とするのか、そしてなぜ、それにより、精子による卵母細胞の受精が水性環境において生じ得るのかということである。

実際、陸に固定された水における商業用の重要な培養可能な魚類のほとんどは、それらがホルモンによって誘導されるまで繁殖しない。海水または河川の水における魚類は、それらの繁殖のためにホルモンによる誘導を必要としない。しかし、海または河川における産生の収率を増加させるという意図で魚類を培養することは、可能ではない。培養は、制御可能な領域を必要とし、これが、収率を増大させるための水酸養殖が、陸に固定された水性本体（ここで、魚類は、通常、ホルモンの誘導なしに繁殖も産卵もしない）に制限される理由である。

魚肉は、全ての動物の肉のうちで最も高品質であることが見出されているので、最近、全世界の潮流として、主要な律速因子が繁殖されている漁業産業が非常に増加している。魚類の誘導された繁殖は、現在、ＧｎＲＨ技術の発展によって首尾良く達成される。この概要において、本発明者らの食物供給の非常に重要な領域のバイオテクノロジーを理解するための簡単な説明が、与えられる。

ＧｎＲＨの構造 − ＧｎＲＨをデカペプチドとして哺乳動物の海馬から単離した（Ｂｕｒｇｕｓら，１９７２；Ｍａｓｔｕｏら，１９７１）。それ以来、ＧｎＲＨの幾つかの構造的改変体が、図１に見られ得るように記載されている（添付の図面の簡単な説明という表題の下に示される）。

ＧｎＲＨペプチド長における著しい保存が存在し、第１の４つの−ＮＨ２末端および２つの−ＣＯＯＨ末端アミノ酸は、異なる脊椎動物において顕著に保存されている。５アミノ酸残基と８アミノ酸残基との間にいかなる変化が生じようとも、８位は、最も可変的であり、続いて、６位、５位そして７位が可変的である。この非常に可変的な８位は、種間での生物学的活性のバリエーションにおけるその役割および下垂体細胞膜上のＧｎＲＨレセプターを認識する際のその重要な役割を示唆する。その生物学的機能を実行するために、それは、まず、下垂体性腺刺激細胞膜上のそのレセプターを認識し、そして、そのようにしなければならない場合、その線状構造は、ループへと変化する。ＧｎＲＨのＮＨ２−末端およびＣＯＯＨ−末端は、ＧｎＲＨがそのレセプターに結合する場合、近接して対向し、これは、残基５〜８を含むＰ−ＩＩ型ｒｕｍからの提案された結果である。このＰターンは、Ｎ末端とＣ末端とを整列させるヘアピンループを生成する（Ｓｅａｌｆｏｎら，１９９７）（図２）。（添付の図面の簡単な説明という表題の下に示される）。

インドの魚類からのＧｎＲＨ − インドは、幾つかの種類の固有の培養可能な硬骨魚を有するが、実際には、それらのＧｎＲＨについて何も知られていない。このことは、実に、非常に不幸なことであり、このために、本発明者らはなお、本発明者らの商業的に重要な培養可能な魚類の生殖の生物学を調査するために、他国からの供給に依存している。なぜなら、ＧｎＲＨは、生殖の制御機構の重要な調節因子であるからである。

数年前に、本発明者らは、この研究を開始し、そして重大な問題に直面した。このペプチドの単離のために、本発明者らは、精製の各工程において所望の分子を同定するためのアッセイシステムを必要とした。単離精製され、構造が決定された第１の魚類のＧｎＲＨは、サケＧｎＲＨであり（Ｓｈｅｒｗｏｏｄおよび協力者、１９８３）、そして最も現在のＧｎＲＨは、２０００年に２つの異なるグループ（ＣａｒｏｌｓｆｅｌｄらおよびＲｏｂｉｎｓｏｎら）によって精製および特徴付けされた。この期間の間、多くのＧｎＲＨ改変体が、この分子の免疫反応性に依存することによって単離されている。サケＧｎＲＨの単離の間、Ｓｈｅｒｗｏｏｄらは、哺乳動物の供給源由来の抗ＧｎＲＨ抗体を利用し、その後、彼女らは、他の供給源由来の異なるＧｎＲＨ形態を単離することを可能にするサケ抗ＧｎＲＨ抗体を発展させた。

本出願人らの研究室において、非特許文献１は、非常に信頼性の高いＧｎＲＨバイオアッセイを開発した。このバイオアッセイの基本的な原理は、ムーレル（ｍｕｒｒｅｌ）の一次下垂体細胞培養物からＧＴＨを放出させて、ＧＴＨ−ＲＩＡによって放出されるＧＴＨの量を決定することにある。

Ｊａｍａｌｕｄｄｉｎら、ＧｅｎｃｏｍｐＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１９８９年５月；７４(２)：１９０−８

（本発明の目的）
本発明の主な目的は、魚類の繁殖を誘導するための新規な性腺刺激ホルモン放出ホルモンを単離および同定することにある。

本発明の別の主な目的は、インディアンムーレル（ＩｎｄｉａｎＭｕｒｒｅｌ）脳から新規な性腺刺激ホルモン放出ホルモンを単離および配列決定する方法を開発することにある。

本発明のなお別の目的は、魚類における性腺刺激ホルモンの放出を増強させるための性腺刺激ホルモン放出ホルモンを開発することにある。

本発明のなお別の目的は、相乗効果を示す性腺刺激ホルモン放出ホルモンを開発することにある。

本発明のなお別の目的は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン活性を有する視床下部の種々の画分を開発することにある。

本発明のなお別の目的は、ＧｎＲＨの性腺刺激ホルモン放出ホルモン活性に対するカルシウムの効果を決定することにある。

本発明のなお別の実施形態は、上記新規な性腺刺激ホルモン放出ホルモンを使用して、魚類の繁殖を誘導する方法を開発することにある。

（発明の要旨）
本発明は、性腺刺激ホルモンの産生を活性化することによって、組み合わせておよび単独での両方において、魚類の繁殖を誘導するのに有用な、それぞれアミノ酸配列番号１（ＱＨＷＳＡＷＲＬＰＧ）およびアミノ酸配列番号２(ＱＨＷＳＷＧＩＬＰＧ)の、２つの新規な性腺刺激ホルモン放出ホルモン(ｍｕＧｎＲＨＩおよびｍｕＧｎＲＨＩＩ)、ならびにインディアンムーレル（ＩｎｄｉａｎＭｕｒｒｅｌ）脳からこれらの性腺刺激ホルモン放出ホルモンを単離する方法、ならびにさらに、これらの新規な性腺刺激ホルモン放出ホルモンを使用して、魚類の繁殖を誘導する方法に関する。
好適な実施形態によれば、本発明は例えば、以下のホルモンなどを提供する：
（項目１）
２つの性腺刺激ホルモン放出ホルモンであるｍｕＧｎＲＨＩおよびｍｕＧｎＲＨＩＩであって、該ホルモンは、それぞれ、アミノ酸配列ＱＨＷＳＡＷＲＬＰＧおよびＱＨＷＳＷＧＩＬＰＧからなり、該ホルモンは、性腺刺激ホルモンの生成を活性化することによって、魚類における誘導性繁殖のために組み合わせおよび単独の両方で有用である、ホルモン。
（項目２）
項目１に記載のホルモンであって、該ホルモンは、インディアンムーレル（ＩｎｄｉａｎＭｕｒｒｅｌ）の脳から得られる、ホルモン。
（項目３）
項目１に記載のホルモンであって、ｍｕＧｎＲＨＩＩは、ｍｕＧｎＲＨＩよりも活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモンである、ホルモン。
（項目４）
項目１に記載のホルモンであって、ｍｕＧｎＲＨＩは、性腺刺激ホルモン放出を約３０倍増加させる、ホルモン。
（項目５）
項目１に記載のホルモンであって、ｍｕＧｎＲＨＩＩは、性腺刺激ホルモン放出を約３５倍増加させる、ホルモン。
（項目６）
項目１に記載のホルモンであって、該２つのホルモンは、魚類の誘導性繁殖において相乗効果を示す、ホルモン。
（項目７）
項目１に記載のホルモンであって、約１：１の比率で組み合わせたｍｕＧｎＲＨＩおよびｍｕＧｎＲＨＩＩの両方は、性腺刺激ホルモン放出を約５０倍増加させる、ホルモン。
（項目８）
項目１に記載のホルモンであって、該ホルモンは、魚類の誘導性繁殖において種障壁を示さず、性腺刺激ホルモン放出が、２０〜５０倍の範囲で増加する、ホルモン。
（項目９）
項目１に記載のホルモンであって、該ホルモンは、組み合わせおよび単独の両方において、哺乳動物ＧｎＲＨ、サケＧｎＲＨ、ＧｎＲＨスーパー活性アナログ、および市販のＧｎＲＨＯｖａｐｒｉｍを含む他のＧｎＲＨよりも活性である、ホルモン。
（項目１０）
２つの新規な性腺刺激ホルモン放出ホルモンであるｍｕＧｎＲＨＩおよびｍｕＧｎＲＨ
ＩＩを単離および配列決定する方法であって、該ホルモンは、それぞれ、アミノ酸配列ＱＨＷＳＡＷＲＬＰＧおよびＱＨＷＳＷＧＩＬＰＧからなり、該ホルモンは、性腺刺激ホルモンの生成を活性化することによって、魚類における誘導性繁殖のために組み合わせおよび単独の両方で有用であり、該方法は、
（ａ）酸性条件において視床下部をホモジ−ネートする工程；
（ｂ）該ホモジネートを濾過して、脂肪および細胞破片を除去する工程；
（ｃ）該濾液にアセトンを段階的に添加して、３つの沈殿（すなわちＡＣＩ、ＡＣＩＩ、およびＡＣＩＩＩ）を得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）の沈殿中の性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）活性を評価する工程、
（ｅ）さらに分子排除クロマトグラフィーを用いて活性沈殿ＡＣＩＩのみを分画して、画分ＳＧＩおよび画分ＳＧＩＩを得る工程；
（ｆ）工程（ｅ）の画分中の性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）活性を評価する工程；
（ｇ）アニオンカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーを使用して活性画分ＳＧＩＩのみをさらに分画して、画分ＭＱＩ、ＭＱＩＩ、ＭＱＩＩＩ、およびＭＱＩＶを収集する工程；
（ｈ）工程（ｇ）の画分中の性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）活性を評価する工程であって、画分ＭＱＩおよび画分ＭＱＩＩのみが該活性を有する、工程；
（ｉ）カチオンカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーを使用して工程（ｈ）のＭＱＩをさらに分画して、画分ＭＳＩ、ＭＳＩＩ、ＭＳＩＩＩ、およびＭＳＩＶを得る工程；
（ｊ）工程（ｉ）の画分における性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）活性を評価する工程であって、ＭＳＩＩ画分のみが該活性を有する、工程；
（ｋ）逆相クロマトグラフィーを用いてＭＳＩＩ画分を分画して、画分ＳＲＰＩ、ＳＲＰＩＩ、およびＳＲＰＩＩＩを得る工程；
（ｌ）工程（ｋ）の画分中の性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）活性を評価する工程であって、画分ＳＲＰＩＩのみが該活性を有する工程；
（ｍ）逆相クロマトグラフィーを用いて工程（ｈ）のＭＱＩＩをさらに分画して、画分ＱＲＰＩ、ＱＲＰＩＩ、およびＱＲＰＩＩＩを得る工程；
（ｎ）工程（ｍ）の画分中の性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）活性を計算する工程であって、画分ＱＲＰＩＩのみが該活性を有する工程；ならびに
（ｏ）工程（ｎ）および（ｌ）のＱＲＰＩＩ画分およびＳＲＰＩＩ画分を配列決定し、それぞれｍｕＧｎＲＨＩおよびｍｕＧｎＲＨＩＩと命名する工程；
を包含する、方法。
（項目１１）
項目１０に記載の方法であって、画分ＳＧＩＩが、性腺刺激ホルモン放出を約２０倍増加させる、方法。
（項目１２）
項目１０に記載の方法であって、画分ＳＧＩＩが、性腺刺激ホルモン放出を約２０倍増加させる、方法。
（項目１３）
項目１０に記載の方法であって、画分ＭＱＩが、性腺刺激ホルモン放出を約１０倍増加させる、方法。
（項目１４）
項目１０に記載の方法であって、画分ＭＱＩＩが、性腺刺激ホルモン放出を約４０倍増加させる、方法。
（項目１５）
項目１０に記載の方法であって、画分ＭＳＩＩが、性腺刺激ホルモン放出を約４５倍増加させる、方法。
（項目１６）
項目１０に記載の方法であって、カルシウムが、ｍｕＧｎＲＨＩおよびｍｕＧｎＲＨ
ＩＩの性腺刺激ホルモン放出活性を増加させる、方法。
（項目１７）
項目１に記載の性腺刺激ホルモン放出ホルモンを使用して魚類において繁殖を誘導する方法であって、該方法は、
魚類を、該性腺刺激ホルモン放出ホルモンに曝露して、性腺刺激ホルモンを放出するのを補助する工程；および
該性腺刺激ホルモンを使用して、魚類において繁殖を誘導する工程；
を包含する、方法。

図１は、天然に存在する脊椎動物および原索動物ＧｎＲＨの主なアミノ酸配列の比較を示す。下線を引いたアミノ酸は、哺乳動物ＧｎＲＨと比較して、異なる形態を表す。図２は、ＧｎＲＨのヘアピンループを示す。図３は、アセトン画分から得られた異なる画分のムーレルＧｎＲＨ活性の試験を示す。３つの異なる画分の調製の後、１００マイクログラムのタンパク質を、インビトロで下垂体細胞培養物に添加し、そしてＧｔＨの放出をＲＩＡによって測定した。図４は、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムからの哺乳動物ＧｎＲＨの溶出プロファイルを示す。ＡＣＩＩ画分を、１Ｎの酢酸に溶解し、そして２４ｍｌ／時間の流速でＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラム（５８×１．５ｃｍ）から溶出した。図５ａは、ＦＰＬＣＭｏｎｏＱカラムからのムーレルＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５Ｐ−ＩＩの溶出プロファイルを示す。ＳＧＩＩ画分を、緩衝液Ａ−２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）に溶解し、そしてＦＰＬＣアニオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ）へと注入した。まず、カラムを緩衝液Ａで洗浄し、次いで、緩衝液Ｂ−２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）（１ＭのＮａＣｌを含む）で溶出した。図５ｂは、ＦＰＬＣＭｏｎｏＳカラムからのムーレルＭｏｎｏＱ未結合ピーク（ＭＱＩ）の溶出プロファイルを示す。ＭＱＩを、緩衝液Ａ−５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．８）に溶解し、そしてＦＰＬＣカチオン交換カラム（ＭｏｎｏＳ）に注入した。まず、カラムを、緩衝液Ａで洗浄し、次いで、緩衝液Ｂ−５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．８）（０．５ＭＮａＣｌを含む）で溶出した。図６は、ＦＰＬＣＰｅｐ−ＲＰＣカラムからのＭｏｎｏＱＰ−ＩＩ（ａ）およびＭｏｎｏＳＰ−ＩＩ（ｂ）の溶出プロファイルを示す。ＧｎＲＨに富んだ画分（ＭｏｎｏＱＰ−ＩＩ）および（ＭｏｎｏＳＰ−ＩＩ）を、個々に水中の溶媒Ａ−０．１％ＴＦＡに溶解し、そしてＦＰＬＣペプチド逆相クロマトグラフィー（Ｐｅｐ−ＲＰＣ）に個々に注入した。始めに、カラムを溶媒Ａで洗浄し、次いでアセトニトリル中の溶媒Ｂ−０．１％ＴＦＡで溶出した。図７は、ｍｕＧｎＲＨＩおよびｍｕＧｎＲＨＩＩのアミノ酸配列を示す。

(本発明の詳細な説明）
従って、本発明は、性腺刺激ホルモンの産生を活性化することによって、組み合わせておよび単独での両方において、魚類の繁殖を誘導するのに有用な、それぞれアミノ酸配列番号１（ＱＨＷＳＡＷＲＬＰＧ）およびアミノ酸配列番号２(ＱＨＷＳＷＧＩＬＰＧ)の、２つの新規な性腺刺激ホルモン放出ホルモン(ｍｕＧｎＲＨＩおよびｍｕＧｎＲＨＩＩ)、ならびにインディアンムーレル（ＩｎｄｉａｎＭｕｒｒｅｌ）脳からこれらの性腺刺激ホルモン放出ホルモンを単離する方法、ならびにさらに、これらの新規な性腺刺激ホルモン放出ホルモンを使用して、魚類の繁殖を誘導する方法に関する。

さらに、本発明は、性腺刺激ホルモンの産生を活性化することによって、組み合わせておよび単独での両方において、魚類の繁殖を誘導するのに有用な、それぞれアミノ酸配列ＱＨＷＳＡＷＲＬＰＧおよびＱＨＷＳＷＧＩＬＰＧの、２つの新規な性腺刺激ホルモン放出ホルモン(ｍｕＧｎＲＨＩおよびｍｕＧｎＲＨＩＩ)に関する。

本発明の１つの実施形態において、上記ホルモンは、インディアンムーレル（ＩｎｄｉａｎＭｕｒｒｅｌ）脳から得られる。

本発明の別の実施形態において、ｍｕＧｎＲＨＩＩは、ｍｕＧｎＲＨＩよりもさらに活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモンである。

本発明のなお別の実施形態において、ｍｕＧｎＲＨＩは、性腺刺激ホルモン放出を約３０倍増加させる。

本発明のなお別の実施形態において、ｍｕＧｎＲＨＩＩは、性腺刺激ホルモン放出を約３５倍増加させる。

本発明のなお別の実施形態において、ｍｕＧｎＲＨＩおよびｍｕＧｎＲＨＩＩの両方を、１：１の割合で組み合わせることによって、性腺刺激ホルモン放出を約５０倍増加させる。

本発明のなお別の実施形態において、上記ホルモンは、誘導された魚類の繁殖において相乗効果を示す。

本発明のなお別の実施形態において、ｍｕＧｎＲＨＩおよびｍｕＧｎＲＨＩＩの両方を組み合わせることによって、性腺刺激ホルモン放出を約５０倍増加させる。

本発明のなお別の実施形態において、上記ホルモンは、誘導された魚類の繁殖において種障壁を示さず、性腺刺激ホルモン放出は、２０〜５０倍の範囲で増加する。

本発明のなお別の実施形態において、上記ホルモンは、組み合わせておよび単独での両方において、他のＧｎＲＨ(哺乳動物ＧｎＲＨ、サケＧｎＲＨ、ＧｎＲＨスーパー活性アナログ、および市販のＧｎＲＨＯｖａｐｒｉｍが挙げられる)よりもさらに活性である。

本発明の１つの実施形態において、それぞれアミノ酸配列ＱＨＷＳＡＷＲＬＰＧおよびＱＨＷＳＷＧＩＬＰＧの、２つの新規な性腺刺激ホルモン放出ホルモン(ｍｕＧｎＲＨＩおよびｍｕＧｎＲＨＩＩ)を単離および配列決定する方法は、性腺刺激ホルモンの産生を活性化することによって、組み合わせておよび単独での両方において、魚類の繁殖を誘導するのに有用である。

本発明の別の実施形態において、酸性条件で視床下部を均質化する。

本発明のなお別の実施形態において、上記ホモジネートを濾過して、脂肪および細胞片を除去する。

本発明のなお別の実施形態において、前記の濾液にアセトンを徐々に添加して、３つの沈殿物（すなわちＡＣＩ、ＡＣＩＩ、およびＡＣＩＩＩ）を得る。

本発明のなお別の実施形態において、前記沈殿物中の性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）活性を評価する。

本発明のなお別の実施形態において、分子排除クロマトグラフィーを用いて活性沈殿物ＡＣＩＩのみをさらに分画し、画分ＳＧＩおよび画分ＳＧＩＩを得る。

本発明のなお別の実施形態において、前記工程の画分中の性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）活性を評価する。

本発明のなお別の実施形態において、アニオンカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーを使用して、活性画分ＳＧＩＩのみをさらに分画し、画分ＭＱＩ、ＭＱＩＩ、ＭＱＩＩＩ、およびＭＱＩＶを収集する。

本発明のなお別の実施形態において、前記工程の画分中の性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）活性を評価し、画分ＭＱＩおよび画分ＭＱＩＩのみがこの活性を有する。

本発明のなお別の実施形態において、カチオンカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーを使用してＭＱＩをさらに分画し、画分ＭＳＩ、ＭＳＩＩ、ＭＳＩＩＩ、およびＭＳＩＶを得る。

本発明のなお別の実施形態において、前記工程の画分中の性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）活性を評価し、画分ＭＳＩＩのみがこの活性を有する。

本発明のなお別の実施形態において、逆相クロマトグラフィーを用いてＭＳＩＩ画分を分画し、画分ＳＲＰＩ、ＳＲＰＩＩ、およびＳＲＰＩＩＩを得る。

本発明のなお別の実施形態において、前記工程の画分中の性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）活性を評価し、画分ＳＲＰＩＩのみがこの活性を有する。

本発明のなお別の実施形態において、逆相クロマトグラフィーを用いて、さらにＭＱＩＩを分画し、画分ＱＲＰＩ、ＱＲＰＩＩ、およびＱＲＰＩＩＩを得る。

本発明のなお別の実施形態において、前記工程の画分中の性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）活性を計算し、画分ＳＲＰＩＩのみがこの活性を有する。

本発明のなお別の実施形態において、上記工程のＱＲＰＩＩおよびＳＲＰＩＩ画分を配列決定し、それぞれｍｕＧｎＲＨＩおよびｍｕＧｎＲＨＩＩと命名する。

本発明のなお別の実施形態において、画分ＳＧＩＩは、性腺刺激ホルモン放出を約２０倍まで増加する。

本発明のなお別の実施形態において、画分ＭＱＩは、性腺刺激ホルモン放出を約１０倍まで増加する。

本発明のなお別の実施形態において、画分ＭＱＩＩは、性腺刺激ホルモン放出を約４０倍まで増加する。

本発明のなお別の実施形態において、画分ＭＳＩＩは、性腺刺激ホルモン放出を約４５倍まで増加する。

本発明のなお別の実施形態において、カルシウムは、ｍｕＧｎＲＨＩおよびｍｕＧｎＲＨＩＩの性腺刺激ホルモン放出活性を増加する。

前記新規性腺刺激ホルモン放出ホルモンを使用して、魚類の繁殖を誘導する方法（前記方法は、前記性腺刺激ホルモン放出ホルモンに魚類を曝露し、性腺刺激ホルモンの放出を助け、そして前記性腺刺激ホルモンを使用して魚類の繁殖を誘導する工程を包含する）。

（ムーレルＧｎＲＨの精製）
（（ｉ）抽出および溶媒分画）
視床下部を、冷やしながら、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーにおいて、１ｍＭＰＭＳＦを含有する１Ｎ酢酸を用いてホモジナイズした。泡立ちを避けるため、ホモジナイズを、非常に慎重かつゆっくり行った。粗製ホモジネートのｐＨを、ｐＨ３．２に維持した。抽出材料を二重に折り畳んだチーズクロスを介して濾過し、脂肪および細胞片を除去した。

次いでそれを凍結乾燥し、そして−８０℃でさらなる使用まで保存した。乾燥抽出物を、０．１Ｎ酢酸中でもどし、等量の冷却アセトンを添加し、−２０℃で１５分間、維持した。

厚い沈殿物（ＡＣＩ）が、懸濁液の底に現れるが、透明な上清をデカントし、そして２倍量の冷却アセトンを添加し、そして−２０℃で３０分間維持し、その後、別の薄い沈殿物層（ＡＣＩＩ）が現れた。再度、透明な上清をデカントし、そして２倍量の冷却アセトンをそれに添加し、そして−２０℃で１４時間維持した。

これは、別の薄い沈殿物層（ＡＣＩＩＩ）の出現を生じ、そして透明な上清への冷却アセトンのさらなる添加は、−２０℃で３日間維持した後にさえ、少しの沈殿物の形成も生じなかった。これらの３つのアセトン画分を、石油エーテル（４０〜６０℃）で抽出し、アセトン、脂質および他の疎水性物質を除去した。

最終沈殿物を、８，０００ｇ、１５分間、４℃で遠心分離し、そして残渣をさらなる使用まで、−８０℃で保存した。ＧｎＲＨ濃縮画分を、インビトロの下垂体細胞培養物からのＧＴＨ放出の原理に基づいて、ＡＣＩＩとして同定した（図３）。

（分子排除クロマトグラフィー）
ＡＣＩＩをＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラム上の分子排除クロマトグラフィーに供することにより、ＧｎＲＨをさらに精製した。０．０５ＭＰＢＳを用いたカラムの溶出は、２つの異なるピーク（ＳＧＩおよびＳＧＩＩ）を生じた（図４）。従って、哺乳動物ＧｎＲＨを流し、カラム上のパターンを同定した。インビトロにおける下垂体細胞インキュベーションからのＧＴＨ放出の原理に基づいて、ＧｎＲＨが、ＳＧＩＩに局在することを見出した。以下の表１に示される。

（表１）
ムーレル下垂体細胞インキュベーションからのＧｔＨ放出期間における、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５溶出画分の生物活性

（（ｉｉ）イオン交換クロマトグラフィー）
これを、ＦＰＬＣＭｏｎｏＱ（アニオン性）およびＭｏｎｏＳ（カチオン性）イオン交換クロマトグラフィーを用いて、さらに精製した。プールし、透析し、そして凍結乾燥した分子排除クロマトグラフィー工程（ＳＧＩＩ）の活性ピークを、ＭｏｎｏＱカラムに負荷し；ＭｏｎｏＱカラムを２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）で洗浄して、非結合性ピーク（ＭＱＩ）を生じたが、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）含有ＮａＣｌ（１．０Ｍ）を用いた勾配溶出においては、３つの結合性ピーク（ＭＱＩＩ、ＭＱＩＩＩおよびＭＱＩＶ）を得た（図５ａ）。

インビトロの下垂体細胞培養物からのＧＴＨ放出の原理に基づいた、ＧｎＲＨ活性のアッセイは、結合性ＭＱＩＩが最大ＧｎＲＨ活性を有することを同定したが、ＭＱＩＩＩおよびＭＱＩＶは、極わずかな活性を示した（以下の表２ａに示される）。

（表２ａ）
ムーレル下垂体細胞インキュベーションからのＧｔＨ放出期間における、ＦＰＬＣＭｏｎｏＱおよびＭｏｎｏＳ溶出画分の生物活性

^ａ各ピーク由来の２μｇのタンパク質を、インキュベーションシステムに加えた。値は、４つの実験の平均±ＳＥＭである。

驚いたことに、ＭｏｎｏＱ溶出の非結合性ピーク（ＭＱＩ）はまた、有意な量のＧｎＲＨ活性を示し、従って、ＧｎＲＨのカチオン形態の存在を示唆した。

従って、ＭＱＩをＭｏｎｏＳ（カチオン性）カラムに充填し；５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．８）でカラムを洗浄し、単一の非結合性ピーク（ＭＳＩ）を得たが、０．５ＭＮａＣｌを用いるその後の勾配溶出においては、３つの結合性ピーク（ＭＳＩＩ、ＭＳＩＩＩおよびＭＳＩＶ）を得た（図５ｂ）。４つ全てのピークにおける、ＧｎＲＨ活性のアッセイは、ＭＳＩＩが、ＧｎＲＨに非常に富むことを同定した（以下の表２ｂに示される）。

（ｉｉｉ）逆相クロマトグラフィー
本発明者らは、ここで、研究中の２つの形態のＧｎＲＨを有していた−一方は、アニオン性形態（ＭＱＩＩ）であり、他方は、カチオン性形態（ＭＳＩＩ）であった。両方を、Ｐｅｐ−ＲＰＣカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。両方の場合において、ＭＱＩＩまたはＭＳｎのいずれかでカラムを充填した後、未結合のタンパク質を、水中０．１％のトリフルオロ酢酸で溶出し、一方、結合した物質を、アセトニトリル中０．１％のトリフルオロ酢酸の勾配で溶出した。ＭＱＩＩは、１つの未結合ピーク（ＱＲＰＩ）および２つの結合ピーク（ＱＲＰＨおよびＱＲＰＨＩ）に分離しした（図６ａ）；ＭＳＨは、１つの未結合ピーク（ＳＲＰＩ）および２つの結合ピーク（ＳＲＰＩＩおよびＳＲＰＩＤ）になった（図６ｂ）。ＧｎＲＨは、ＱＲＰＨおよびＳＲＰＨに位置することが見出され（図６の挿入図）、そしてｍｕＧｎＲＨＩ（アニオン性）およびｍｕＧｎＲＨＨ（カチオン性）と称した。

（ｉｖ）精製ＧｎＲＨの機能的活性
ｍｕＧｎＲＨＩおよびｍｕＧｎＲＨＩＩの両方は、ムーレル下垂体細胞からＧＴＨが放出される際に、非常に活性であり、ｍｕＧｎＲＨＩＩの方が、わずかに活性が大きい。さらに、これら２つのＧｎＲＨは、異なる種のコイにおいてほとんど等しく作用し、種の境界を示さない（以下の表３に示される）。

（表３）
ムーレルＧｎＲＨＩおよびＩＩに応答する、異なるコイの下垂体からの性腺刺激ホルモン放出の比較

^＊ｐ＜０．０１（コントロールと比較した場合）
驚くべきことに、組み合わせて添加した場合、ｍｕＧｎＲＨＩおよびＩＩは、組合せの結果として非常に有意なＧＴＨ放出の増加を示す（以下の表４に示される）。

値は、５つの実験の平均±ＳＥＭである。
^＊ｐ＜０．０１（哺乳動物またはサケのＧｎＲＨと比較した場合）
^＊＊ｐ＜０．０１（ＧｎＲＨ過活性アナログと比較した場合）。

実際、単独であろうと組合せであろうと、ｍｕＧｎＲＨは、哺乳動物ＧｎＲＨ、サケＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ過活性アナログと比較して有意に大きな活性を有していた。

本発明の実施形態において、ＧｎＲＨＩおよびＩＩへのカルシウムの添加は、ＧｎＲＨＩおよびＩＩの性腺刺激ホルモン放出活性を増加させる。

これら両方の合成ＧｎＲＨは、研究室環境および現場環境において、サケＧｎＲＨ、そのアナログおよび他の過活性アナログ、ならびに市販製品の「Ｏｖａｐｒｉｍ」と比較してはるかに大きな活性を示した。これら２つのデカペプチド（ムーレルＧｎＲＨＩおよびＩＩ）のアミノ酸配列は、本発明者らが特許を申請したため、本明細書中に示すことが出来なかった。従って、このＩｎｄｉａｎＰｒｏｄｕｃｔ（ムーレルＧｎＲＨＩ＋ＩＩ）は、国内市場および国際市場のための大きな期待が持たれる。

上記の結果は、インディアンムーレルＧｎＲＨ（Ｉ＋ＩＩ）を、非常に有望な世界的競合相手として位置付ける。なぜなら、ＳｙｎｄｅｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃａｎａｄａによって調製されるサケＧｎＲＨアナログ（Ｏｖａｐｒｉｍ）は、市場を支配しており、養殖魚を繁殖するために世界中で大規模に販売されているからである。

ムーレルＧｎＲＨ（ＧｎＲＨＩおよびＩＩ）の両方は、新規であり、現在までに発見された天然に存在するＧｎＲＨは、このような配列を有さない（図７）。合成ＧｎＲＨの活性は、コイを繁殖させるための研究室（下垂体細胞培養物）および現場で試験されている。

上記の新規の性腺刺激ホルモン放出ホルモンを使用して、魚の繁殖を誘導する方法は、魚をこの性腺刺激ホルモン放出ホルモンに曝露して、性腺刺激ホルモンの放出を助ける工程、およびこの性腺刺激ホルモンを使用して魚類の繁殖を誘導する工程を包含する。

Claims

本明細書中に記載の発明。