TWI396696B

TWI396696B - 一種促進魚類卵黃生成之合成胜肽

Info

Publication number: TWI396696B
Application number: TW099108197A
Authority: TW
Inventors: ying nan Chen
Original assignee: Univ Nat Pingtung Sci & Tech
Priority date: 2010-03-19
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2013-05-21
Also published as: TW201132648A; US20110226188A1; US8536124B2

Description

一種促進魚類卵黃生成之合成胜肽

本發明係關於一種合成胜肽及其應用，特別是一種可以促進魚類卵黃生成之合成胜肽，及其在誘發和促進種魚成熟之應用。

台灣的水產養殖產業發展歷史悠久，近二十年來，由於養殖技術的科技化及養殖品種的多元化，帶動養殖產業快速發展與成長。台灣早期的魚類養殖大都以粗放混養的養殖形式，種苗來源多仰賴捕撈，故種苗數量、來源及品質多不穩定，無法符合產業發展之需求；近年來，因幼苗培育技術及人工餌料的建立，促使水產養殖之集約化、企業化，集約式養殖方式使養殖魚類之放養密度大幅度增加，因而對於種苗數量、質量上的需求也相對提升；因此，種苗的來源無法完全依賴自然捕撈，必須以人工繁殖技術誘導養殖魚類性腺發育、卵巢成熟(即卵黃發育達第三期)，再以環境因子或內分泌等刺激誘導排卵及產卵，培育稚魚以滿足現今養殖產業對種苗之需求；然而，目前多數養殖業者在種苗生產與開發上往往遭遇諸多問題，有必要針對養殖魚類生殖調控機制加以研究並建立良好的育苗系統。

魚類的生殖調控機制較為複雜且相關生理研究至近十數年才漸有成果展現，主要係由外在環境的刺激(如光週期、溫度等)以及內分泌系統而控制；一般而言，魚類的生殖內分泌應與脊椎動物相同，係由荷爾蒙分泌調控訊息傳遞，透過下視丘-腦下垂體-生殖性腺(hypothalamus-pituitary-gonad)之傳遞路徑，進而控制一連串的生殖反應，誘發生殖細胞之成長及成熟。下視丘係分泌促性腺激素釋素(Gonadotropin Releasing Hormone；GnRH)或促性腺激素抑制因子(Gonadotropin Inhibiting Factor；GnIF，如多巴胺Dopamine)分別刺激或抑制腦下垂體促性腺激素(Gonadotropin；GtH)之合成、釋放，該促性腺激素可經由血液輸送至卵細胞或精細胞膜上的接受器，促使蛋白質激酶磷酸化，誘發類固醇合成(Steroidogenesis)；其中，雌二醇係主導卵細胞之成熟，即為卵黃生成作用(Vitellogenesis)，再由成熟促動因子(maturation factor)之作用使卵細胞進入最後成熟階段，而成熟卵細胞(即卵黃第三期)則由水溫、光照及其他環境因子的誘導以致排卵及產卵，為雌魚性成熟之生理作用途徑及調控機制；其中，由下視丘所分泌之GnRH係由十個胺基酸所組成，為所有脊椎動物在繁殖調控上的負責連結外在刺激及內在分泌之主要機制，因此，脊椎動物之GnRH普遍具有很高的物種相似度，約50~90%。在過去研究中，已有多種GnRH由脊椎動物各物種中分離出來，一般認為，同一物種中應具有一種以上之GnRH，在該物種內分泌系統的調控上代表不同意義；而在魚類生殖細胞之發育成熟過程中，GnRH係分別在調控卵黃生成以及最後的成熟步驟中扮演重要角色。

由上所述，下視丘分泌之促性腺激素釋素(GnRH)及腦下垂體分泌之促性腺激素(GtH)皆為刺激魚類生殖發育之主要因子，習用種魚之人工繁殖操作多用腦下垂體注入法(Hypophysation)，即係以促性腺激素(GtH)處理以獲得預期的產卵結果，然而，該GtH係具有種間差異性且無法以合成方式取得，如以基因工程方式生產則成本偏高，故使用範圍受限；而目前養殖產業最常使用之激素製劑除含GtH成分之腦下垂體萃取或純化製劑外，還有人類胎盤絨毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin；hCG)及商用激素混合製劑[由LHRHA與多巴胺拮抗劑(Domperidome)混合]，兩者之使用皆為促進成熟種魚卵細胞之最後成熟，即由第三卵黃期至排卵、產卵的過程，然而，上述各種激素製劑皆無法促進養殖魚類卵細胞之早期發育，亦即無法誘發及促進養殖魚類卵黃生成作用，因此，對於生殖季節短暫，在人為養殖條件下難以自然發育成熟，成熟狀態不穩定，生殖季節不利於進行人工種苗培育或種苗來源稀少之養殖魚類，不易建立一有效控制產卵及種苗量產之技術，為現今養殖產業之發展瓶頸。

本發明之主要目的係針對上述問題加以改進，提供一種促進魚類卵黃生成的合成胜肽，係可以促進硬骨魚類卵細胞之早期發育、成熟。

本發明之次一目的係提供一種促進魚類卵黃生成的的製劑，可以調節重要養殖魚類之產卵季節。

本發明之又一目的係提供一種促進魚類卵黃生成的方法，以提高種魚性腺發育率，降低產業成本及提昇經濟效益。

為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段包含有：一種促進魚類卵黃生成的合成胜肽係為十個胺基酸所組成之胜肽(decapeptide)，具以下序列：Glu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly，該合成胜肽係係參照自一禽類所自然分泌之GnRH-II。

一種促進魚類卵黃生成之製劑，係包含上述之合成胜肽。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明一種促進魚類卵黃生成的合成胜肽，係為十個胺基酸所組成之胜肽(decapeptide)，該合成胜肽之序列係參照自一禽類(如雞、鴨或鵝等)所自然分泌之GnRH-II序列；該合成胜肽可以誘發及促進硬骨魚類之卵黃生成作用。將該合成胜肽埋植至一硬骨魚類之體壁或體腔，可以有效促進該硬骨魚類之卵黃生成及堆積，促使雌性種魚發育成熟，並且可調控該硬骨魚類雌性種魚之生殖季節。

更詳言之，本發明之合成胜肽，係參考自雞所自然分泌之GnRH-II之胺基酸序列p-Glu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly-NH₂ (請參見序列表，序列識別編碼：1)，由一胺基酸合成儀(即以solid-phase peptide synthesis方式合成)進行人工合成，該合成胜肽係具有以下序列：Glu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly(請參見序列識別編碼：2)，相較於該雞所自然分泌之GnRH-II，該合成胜肽N端之麩胺酸(Glu)未經環化而形成pyro-Glu，而該合成胜肽C端之甘胺酸(Gly)則未被醯胺化而轉成Gly-NH₂ ，因此，該合成胜肽之第一及第十個胺基酸皆未經修飾，亦即未被阻斷，與雞所自然分泌之GnRH Ⅱ在結構上略有不同，該合成胜肽可由Edman降解法(Edman degradation)進行胺基酸定序；一般而言，生物體所分泌之GnRH因具有很高的種間相似度，故由本發明之合成胜肽可以刺激多數硬骨魚類之腦下垂體，促使腦下垂體合成及釋放促性腺激素(GtH)，開啟該硬骨魚類之生殖內分泌系統，促使卵黃生成作用開始進行。

本發明一種促進魚類卵黃生成的方法，係將一製劑埋植於一硬骨魚類之體壁或體腔，如體側肌肉或腹腔，該製劑包含本發明之合成胜肽，使該合成胜肽可以在硬骨魚類體內緩慢釋放，刺激該硬骨魚類之卵細胞發育、成熟，進而調控該硬骨魚類之生殖季節。本實施例係將該合成胜肽混合一基質，再填入一玻璃管進行壓製，以便壓縮、固化而製成本發明之製劑，該合成胜肽之劑量可以為10微克(μg)~5毫克(mg)/單位個體重量，較佳係依照施用個體的種類及體重之不同稍作調整，如每單位鮨魚體重(公斤)施用100~500微克(μg)之合成胜肽；該基質係由一膽固醇(cholesterol)、一纖維素(cellulose)及少量油脂黏著劑所共同構成之混合物，其中，該膽固醇所占之質量比率約為 50~95%，纖維素則為5~50%，該合成胜肽係由膽固醇及纖維素包覆、壓製而呈緩釋錠劑形式，較佳係於壓製前混合少量油脂黏著劑(如植物油，椰子油)，以增加黏性加速製程；該合成胜肽係具有與禽類GnRH-II之胜肽序列(p-Glu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly-NH₂ )相同的序列及近似的結構，可以刺激該硬骨魚類之生殖內分泌系統；纖維素係具有組織支撐之功能，可以維持該製劑之構形；該膽固醇可以包覆該合成胜肽，使該合成胜肽具有緩釋效果，同時該膽固醇為生物體合成荷爾蒙之重要原料，可以輔助該硬骨魚類之生殖內分泌系統合成生殖激素。

請參照第1圖所示，係為本發明製劑之埋植示意圖，係由一注射器1將該製劑直接植入一硬骨魚類2背鳍21基部之肌肉中，使該製劑所含之合成胜肽可以緩慢釋放於該硬骨魚類中，以長時間刺激該硬骨魚類之腦下垂體釋放促性腺激素，使卵黃生成、堆積。為證實本發明一種促進魚類卵黃生成之合成胜肽可以有效促使硬骨魚類之卵黃生成堆積，係將該製劑埋植至一養殖硬骨魚類，觀察該養殖硬骨魚類之卵黃生成及卵細胞成熟情形。

請參照第2a及2b圖所示，本實施例係採用點帶石斑(Epinephelus coioides )進行試驗，該點帶石斑為台灣地區主要養殖之石斑魚種，市場價格高，於天然海域的分布範圍極廣，該點帶石斑之生殖季節為春末(4~5月)至夏中(6~8月)，有時會延長至秋初，由4~5年之成熟雌魚進行產卵；該點帶石斑之養殖技術在台灣雖已漸成熟，然而在繁殖發展上，卻無法改善；點帶石斑為適高水溫魚種，雖然台灣位處亞熱帶，其生殖季節高峰仍偏處春、夏季，又種魚在人工養殖狀態下須待其自然成熟後方能以激素注射促使其產卵，因此種苗生產技術及流程尚有瓶頸亟待突破。

請再參照第2a及2b圖所示，係將本發明之製劑及一商用激素製劑(如LHRHA)分別埋植至數組體重達2~3.5公斤之成熟點帶石斑，逐月抽取並監測該點帶石斑之卵細胞發育情況，判別卵巢成熟程度；其中，該商用激素製劑同樣混合一纖維素、一膽固醇及一植物油，再注入該玻璃管進行壓縮、固化，製成緩釋錠劑形式，以避免實驗差距；該點帶石斑卵細胞之發育情況及成熟度係由卵徑大小變化及卵黃堆積狀態判別，其卵細胞發育階段依序約略可分為1.卵黃泡期：卵徑大小為10~70微米(μm)；2.卵黃發育第一期：卵徑大小為70~120微米；3.卵黃發育第二期之卵徑大小為120~250微米；4.卵黃發育第三期：卵徑大小>400微米，此時卵細胞已完成卵黃堆積達成熟階段。數組點帶石斑之分組狀態如下表所示：

由第2a及2b圖結果，埋植本發明之製劑的第a1及a2組，該兩組點帶石斑於埋植本發明之製劑四個月後(8月埋植，埋植四個月後約為十二月)分別有100%及80%個體其卵巢內卵細胞的卵徑發育達250微米(μm)以上，並且該兩組點帶石斑各有83.3%及80%個體卵巢內卵細胞卵徑發育達400微米(μm)以上，即達成熟階段；而第a3組點帶石斑之卵巢，則係於埋植該商用製劑4個月後僅有41.7%個體卵巢內卵細胞卵徑發育達250微米(μm)，其中36.4%達400微米(μm)；而第a4組之點帶石斑則係於埋植該膽固醇製劑約4個月後(8月初埋植，埋植後4個月為12月)僅有16.7%個體卵巢內卵細胞之卵徑發育達400微米。此外，未作任何製劑處理的個體僅有7%個體卵巢內卵細胞卵徑發育達400微米(μm)(未於圖中呈現)。

再由第2a及2b圖結果，上述各製劑皆係於8月初埋植於數組點帶石斑之體側肌肉，其中，第a1、a2組點帶石斑係於埋植本發明之製劑後約4~5個月(12月左右)，各有83.3%及80%點帶石斑卵巢內卵細胞之卵徑已成長至400微米以上，顯示卵巢發育狀態已達發育後期，此時，可以藉由注射一商用GtH製劑(如hCG)或以其他環境刺激(如成熟雄性種魚之追尾求偶等)促使該兩組點帶石斑產卵，使該點帶石斑之自然生殖季節可由原本之春、夏季改變為秋末或冬季。

由以上結果顯示，本發明之製劑埋植於一硬骨魚類後，可以於2~4個月內有效促使該硬骨魚類卵巢卵細胞之發育成熟且達卵黃發育第三期(即卵徑達400微米以上)；相較於埋植一般商用激素製劑或合成生殖荷爾蒙之原料(膽固醇)對於硬骨魚類之卵巢生成作用具有較快且較佳的刺激效果；再者，藉由埋植本發明之製劑，可以改變或延長一硬骨魚類之生殖季節，使該硬骨魚類可於非自然生殖季節獲得良好的卵巢成熟結果；由此，本發明之合成胜肽確實有助於硬骨魚類卵細胞之早期發育及後期成熟，並且可以調控該硬骨魚類之生殖季節。

請參照第3圖所示，係本發明之製劑與多種市售商用激素製劑(包含Ovaprin：內含sGnRHA及domperidone；雌二醇(estradiol)及MixT：內含多種雄性素(androgen))施用於烏魚(Mugil cephalus )之結果，係將該製劑與上述其他商用激素製劑分別埋植至數組烏魚進行試驗，數組烏魚之埋植情況如下表所示。烏魚同樣為台灣重要的養殖魚類，係台灣特產烏魚子之來源，早年烏魚養殖種苗多由野生捕捉，但近年來由於養殖方式集約化且天然海域資源銳減，以致目前養殖魚苗主要仰賴人工繁殖，以維持市場需求量；烏魚的成長季為3~9月，9月以後卵巢開始發育進入生殖季節，11月至卵巢發育後期為烏魚子的主要產季。

請再參照第3圖所示，上述各製劑係於五月初即分別埋植至各組烏魚之體側肌肉，第b5組烏魚則不作任何處理；逐月抽取並監測各組烏魚之卵細胞發育情況，判別卵巢成熟程度；該烏魚之卵細胞發育情形則同樣由卵徑大小變化及卵黃堆積狀態判別。

由第3圖結果，第b1組烏魚於埋植本發明之製劑3個月後(約為7~8月時)卵細胞即開始發育，逐漸由100~120微米成長至>400微米(至10月時)；而第b2組烏魚則係於埋植該Ovaprin製劑後5個月內(5~10月)皆未見卵巢發育跡象；第b3組烏魚係於埋植該雌二醇製劑4個月後始發現卵細胞發育(此時約為卵細胞100~120微米)，成長至第5個月時卵徑仍小於400微米；第b4組烏魚則於埋植該MixT製劑後3~4個月時卵細胞開始發育，卵徑由100~120微米漸成長至250微米左右(至10月時)；而第b5組烏魚係於自然放養環境中，於自然生殖季節(9月以後)前其卵細胞卵徑皆僅達170微米左右，至十月份則稍微成長至200微米，尚未發育成熟。

由以上結果顯示，本發明之製劑相較於其他市售商用激素製劑(如Ovaprin等)，對於刺激硬骨魚類之卵巢早期發育進展較快且效果較佳；並且，本發明之製劑可有效誘使一硬骨魚類於非自然生殖季節出現卵細胞發育的現象；由此可知，本發明之合成胜肽可以應用於新激素製劑之開發，建立促進養殖魚類卵細胞早期發育(即卵黃生合成與卵黃於卵細胞內之堆積)及後期成熟以達產卵之技術，並且，該合成胜肽係由人工方式合成(胺基酸合成儀)，生產成本低，具有量產價值，相較於其他商用激素則具有較高的經濟效益與較高的應用價值，可用以開發新激素製劑應用於養殖魚類之種苗生產，以促進養殖產業的收益。

本發明一種促進魚類卵黃生成的合成胜肽，係為十個胺基酸所組成之胜肽，具以下序列：Glu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly，該合成胜肽之序列係參照自一禽類所分泌之GnRH-II(序列為p-Glu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly-NH₂ )，具有刺激硬骨魚類卵細胞之早期發育、成熟之功效。

本發明一種促進魚類卵黃生成的製劑，該製劑係包含該合成胜肽，可以於一硬骨魚類體內緩慢釋放，誘使該硬骨魚類於非自然生殖季節出現卵細胞發育的現象，為本發明之功效。

本發明一種促進魚類卵黃生成的方法，係利用該製劑應用於水產養殖，提高種魚性腺發育率，降低產業成本，具有增加養殖產業收益之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

〔本發明〕

1‧‧‧注射器

2‧‧‧硬骨魚類

21‧‧‧背鳍

第1圖：本發明一種促進魚類卵黃生成製劑之埋植示意圖。

第2a圖：本發明一種促進魚類卵黃生成製劑於點帶石斑之施用效果示意圖。

第2b圖：本發明一種促進魚類卵黃生成製劑於點帶石斑之施用效果又一示意圖。

第3圖：本發明一種促進魚類卵黃生成製劑於烏魚之施用效果示意圖。

<110> 國立屏東科技大學

<120> 一種促進魚類卵黃生成之合成胜肽以及方法

<160> 2

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 雞

<220>

<223> cGnRH-II

<400> SEQUENCE：1

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220> unblock N-terminal & C-terminal

<223> decapeptide

<400> SEQUENCE：2

1‧‧‧注射器

2‧‧‧硬骨魚類

21‧‧‧背鳍

Claims

一種促進魚類卵黃生成的合成胜肽，係為十個胺基酸所組成之胜肽(decapeptide)，具序列識別編碼：2所示之序列。
一種促進魚類卵黃生成之製劑，係由專利範圍第1項所述之合成胜肽及醫藥上可接受的賦型劑所組成。
依申請專利範圍第2項所述之一種促進魚類卵黃生成之製劑，其中，該製劑係由一纖維素、一膽固醇及少量油脂黏著劑所組成之基質包覆該合成胜肽。
依申請專利範圍第2項所述之一種促進魚類卵黃生成之製劑，其中，該合成胜肽之劑量為10微克(μg)至5毫克(mg)/單位個體重量(公斤)。
依申請專利範圍第2項所述之一種促進魚類卵黃生成之製劑，其中，該製劑係呈一緩釋錠劑形式。