【発明の詳細な説明】
NF-κBの活性化制御蛋白、IκB-β
本発明は、National Institute of Healthの番号RO1-AI33443の奨励金により
、政府の援助の下でなされたものである。政府は本発明に一定の権利を保有する
。
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、一般的には、遺伝子発現の制御の分野、特に転写因子NF-κBの制御
を行う新規な蛋白、IκB-βに関するものである。
２、関連技術の記載
NF-κB(nuclear factor-kappa B)、細胞をフォルボールエステル、リポポリサ
ッカライド(LPS)、インターロイキン１(IL-1)、及び腫瘍壊死因子-α(TNF-α)で
処理した際に、様々な遺伝子の制御を行う誘導的転写因子である。これらの制御
される遺伝子とは、免疫応答、急性期反応、及び炎症反応の初期過程に関与する
ものである。NF-κBはまた、いく種類かのウイルスの転写活性化にも関与してお
り、中でも最も注目すべきなのは、ヒト免疫不全ウイルス１型(HIV-I)とサイト
メガロウイルス(CMV)の転写活性化に関与していることである(Nabelら、Nature, 326
:711,1987; Kaufmanら、Mol．Cel．Biol.,7:3759,1987; Sambuc etti ら、
EMBO J,8:4251,1989)。
NF-κBは２量体を形成してはたらく転写因子であり、κBＤＮＡモチーフとよ
ばれる10塩基のシスエレメントを認識して結合し、遺伝子発現を制御する。従来
、p50/p65のヘテロダイマーのことをNF-κBと呼んでおり、またこの組み合わせ
が原形で、細胞中に最も豊富に存在する型であるが、最近いく種類かの、p50やp
65と異なりはするが非常に近縁の因子同士で形成されるホモダイマーやヘテロダ
イマーも、κB部位依存性にＤＮＡに結合し遺伝子制御を担う活性のあることが
明
らかになった。これらの様々な２量体を形成する因子は、Rel関連ポリペプチド
のファミリーのメンバーから成っている。このファミリーのサブクラスの一つは
、前駆体から蛋白分解のプロセッシングを受けて完成することと転写活性化ドメ
インだと認識される部位がないことを特徴とし、p50(NFKB1)やp50B(NFKB2，p52)
がこのグループに属する。一方、第２のサブクラスは、転写活性化ドメインだと
認識される部位を有し、p65(RelA)，RelB，c-Rel，及びショウジョウバエの蛋白
Dorsalがこのグループに属する。Rel関連ポリペプチドファミリーのメンバーは
すべて、Relホモロジードメイン(RHD)と呼ばれる300アミノ酸のホモロジーを有
する領域を共有しており、この部分でＤＮＡ結合と２量体形成がおこなわれる。
細胞質で、NF-κBとRel蛋白とは「Rel複合体」を形成している。
NF-κB転写因子、及び類縁の様々な型の因子の活性化は、TNFα，フォルボー
ル12ミリステート13アセテート(PMA),インターロイキン1(IL-1),及びインターロ
イキン2(IL-2)などの様々な因子により開始させることができる。活性化は、あ
らかじめ形成されて細胞質中に存在する、Rel複合体中のNF-κBが、細胞質中の
阻害蛋白からはずれるという翻訳後のイベントを介して進行する。Relファミリ
ーに属する転写因子の制御に共通の特徴は、IκBとして知られるあるクラスの阻
害分子により、細胞質中に不活性な複合体として隔離されていることである。(B
aeuerle および Baltimore，Cell,53:211-217,1988; BegおよびBaldwin，Genes
Dev.,7:2064-70,1993; Gilmore および Morin，Trends in Genetics,9:427-33,
1993)。細胞を様々な誘導物質、例えば、IL-1,TNF-α，LPS,二本鎖ＲＮＡやPMA
で処理すると、細胞質中の複合体は解離し、遊離したNF-κBは核へ移行する(Gri
lliら,International Rev．of Cytology,143:1-62,1993; Baeuerle および Henk
el，Annu．Rev．Immunol.,12:141-179,1994)。細胞質中の複合体の解離は、IκB
蛋白が初めにリン酸化され、続いて分解されることによると考えられている(Pal
ombellaら,Cell,78:773-785,1994; Ghosh および Baltimore，Nature,344:678-6
82,1990)。in vivoでのNF-κB活性化実験がいくつかなされ、IκBの一時的なリ
ン酸化が観察されている(Brownら,Proc．Natl．Acad．Sci.,U.S.A.,90:2532,199
3; Begら,Mol.Cell.Biol.,13:3001,1993)。
哺乳類細胞には、IκB-αとIκB-βという、生化学的に特徴づけられた２つの
主要型のIκB蛋白が存在する(Ghoshおよび Baltimore，既述; Zabel および Bae
uerle,Cell,61:255-265,1990)。さらに、他にも３つの蛋白がIκBとしてクロー
ニングされるか、もしくは、IκBであると目されている。その一つはニワトリの
pp40である。これは、哺乳類のIκB-αの相同体であり、ニワトリのがん遺伝子V
-relの阻害因子である(Davisら,Science,253:1268-1271,1991; tephens ら,Proc
. Natl．Acad．Sci．USA,80:6229-6232,1983)。２つ目はIκB-γである。これは
組織特異的な型で、選択的スプライシングによりp105蛋白のC端部分が生じたも
のである(Inoueら,Cell 68:1109-1120，1992)。最後は、がん遺伝子の候補であ
るBcl-3である(Franzosoら,Nature,359:339-342,1992; Nolanら,Mol.Cell Biol.
,13:3557-3566,1993; Ohnoら,Cell,60:991-997,1990)。クローニングされたIκB
蛋白すべてに共通の特徴は、アンキリンリピートとして知られる配列モチーフが
多コピー存在することである(Begおよび Baldwin,既述; Gilmore および Morin,
既述)。
ところが、IκB-γはマウスのプレB細胞でしか検出されておらず(Ghoshら,199
0;Inoueら，既述)、一方、Bcl-3はいくつかの組織でごくわずかな量で検出され
たにすぎない。さらに、IκB-γも(Liouら,EMBO J.,11:3003-3009,1992)、Bcl-3
も(Franzosoら,既述; Naumannら,EMBO J.12,213-222,1993; Nolanら,Cell 64:96
1-969,1991; Wulczyn ら,Nature 358:597-599,1992)、NF-κBのうちp50の２量体
に特異的であり、IκB-αとIκB-βのみがp65やc-relと相互作用する。よって、
原形的なNF-κBの活性を制御する応答性は、主として、これらIκBのアイソフォ
ームであることが示唆される。
IκB-αは以前にクローニングされ、その制御については、充分に研究がなさ
れている(Begら,Mol.Cell Bio.,13:3301-3310,1993; Begら,Genes Dev.,6:1899-
1913,1992; Brownら,Proc．Natl．Acad．Sci USA,90:2532-2536,1993; Davisら
，既述; Haskillら,Cell,65:1281-1289,1991; Henkelら,Nature,365:82-85,1993
; Mellitisら,Nucl．Acids Res.,21:5059-5066,1993; Miyamotoら,Mol．Cell Bi
ol.,14:3236-3282,1994; Palombellaら,既述; Riceおよび Ernst,EMBO J.,12:46
85-4695,1993; Scottら,Genes Dev.,7:1266-1276,1993;及び、Sunら,Science,25 9
:1912-1915,1993)。これらの研究により、IκB-αはNF-κBの活性を、自己制御
フ
ィードバック回路により制御していることが示唆された。NF-κBの活性の誘導に
つながるシグナルにより、IκB-α蛋白はリン酸化され、蛋白分解により急速に
消失する。しかしながら、IκB-αのプロモーターにはNF-κB部位が存在するた
め、誘導されて核移行したNF-κBは、ついでIκB-αのｍＲＮＡのレベルをアッ
プレギュレーションする(de Martinら,EMBO J.,12:2773-2779,1993; Le Bailら
，EMBO J．12:5043-5049,1993)。新たに合成されたIκB-αのｍＲＮＡは翻訳さ
れ、IκB-α蛋白が蓄積してきて、NF-κBによる応答は停止する。この機構によ
り、NF-κB応答遺伝子が一時的にだけ転写活性化されることが保証される。この
モデルにより、細胞中のNF-κB活性の制御はある程度説明がついたが、誘導物質
のうちいくつかのもの、特に細菌のリポポリサッカライド(LPS)がいかにして36
時間の長きにも渡ってNF-κBを持続的に活性化できるのかは説明がつかなかった
。NF-κBの持続的活性化は、分化の際、早期の胎生期やB細胞、マクロファージ
の発生時にも起こりうる。細胞質中のRel複合体のうちかなりの部分のものがIκ
B-βに結合しているので、LPSのような誘導物質や分化のシグナルは、IκB-βが
結合した複合体に影響を及ぼすことによりNF-κBを持続的に活性化する可能性が
ある。しかし、IκB-βのクローンが得られていなかったことと、IκB-βに特異
的に作用する薬剤がなかったことが原因で、ＩκB-βに結合した複合体がいかに
して、また、いつ活性化されるのかを明らかにすることはできなかった。
以前からIκB-βを単離し、精製しようと試みられてきたが、成功していなか
った。まず、既述のGhoshとBaltimoreが、ウサギの組織中で35kDの蛋白にIκBの
活性を見いだした。その後、ZabelとBaeuerle(Cell,61:255,1990)はp50:p65とI
κBの２つの型の複合体を２つの異なる活性として精製した。だが、IκB-αが均
一にまで精製される一方で、IκB-βは、活性のピークの画分に基づいて部分的
に精製できるに過ぎなかった。その後の研究のひとつでは、分子量40-43kD、pI4
.8-5.0 の範囲でIκBの活性を持つ蛋白を精製したと称されている(Linkら,J．Bi
ol.Chem.,267:239,1992)しかし、この活性を含む画分は不十分なものだったので
、ペプチドマッピンクやアミノ末端配列解析を行っても再現性がなかった。
NF-κBによる遺伝子制御は、後天性免疫不全症候群(AIDS)の病状の進行、外毒
素性ショック時の急性期反応および免疫細胞や血管内皮細胞の活性化、異系移植
片の拒絶反応、及び、放射線照射による反応等、多くの種類の病理学的事象に関
与している。さらに、NF-κBによる遺伝子の転写活性化は、HIVやCMVの複製に重
要である可能性もある。
それゆえに、IκB-β/NF-κB複合体の結合状態に影響を与える組成物、すなわ
ち、NF-κBによる転写活性化に影響を与える組成物を同定することは、この複合
体の解離を特異的に阻害する物質を同定するのに重要であり、そのような物質は
、抗炎症薬や免疫抑制剤として効果があるはずである。
発明の概要
本発明は、新規な、IκBファミリーの阻害分子のメンバーの発見に基づいてい
る。この新規な蛋白IκB-βは、NF-κBのサブユニットのp65(Rel A)およびc-Rel
に結合し、NF-κBのＤＮＡ結合を阻害する。IκB-αの反応が一時的なストレス
の状況による反応に関与している一方、IκB-βの場合に見られる持続的反応は
、典型的には、慢性炎症、慢性感染症や慢性的なストレス、あるいは分化などに
関与する。
第１の実施態様では、本発明により、還元状態でのSDS-PAGEで決定した分子量
が45kDの、単離されたIκB-βポリペプチドが提供される。IκB-βは、pIが約4.
6でRelAおよびc-Relに結合し、配列番号2に記載のアミノ酸配列を持つポリペプ
チドである。IκB-βポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドの
配列も本発明に含まれる。
第２の実施態様では、本発明により、IκB-β/NF-κB複合体に影響を及ぼす組
成物を同定する方法が提供される。この方法は、調べる組成物、リン酸化された
IκB-β、およびNF-κBからなる構成要素を、これらが反応するために十分な条
件の下でインキュベートする工程と、この成分に起因するIκB-β/NF-κB複合体
への影響を測定する工程とを備える。この方法では、場合により、IκB-βと複
合体を形成したNF-κBを用いてもよい。例えば、キモトリプシン阻害剤や抗酸化
剤が、このような複合体に影響を及ぼす組成物であろう。
また、その他の実施態様としては、IκB-β/NF-κB複合体の解離に影響を及ぼ
す物質を同定する方法が本発明により提供される。この方法は、調べる組成物、
NF-κB活性を誘導する物質、指示細胞からなる構成要素をインキュベートする工
程と、NF- κB活性を検出する工程とを備える。本発明の方法で使用する指示細
胞中は、NF-κB活性を検出するためのリポーター遺伝子と機能的を発揮するよう
につながっている少なくとも1つのκB結合モチーフを含むことが好ましい。
また、本発明により、患者におけるNF-κB誘導遺伝子の転写活性化に関連した
免疫学的疾患あるいは細胞増殖性の疾患の治療法も提供される。この方法は、患
者にIκB-β/NF-κB複合体解離の阻害剤を、治療に有効な量だけ投与する工程を
含む。
図面の簡単な説明
図1(A)は、部分的に精製されたIκB(αおよびβ)画分(GhoshおよびBaltimore,
既述)が得られるまでの精製のスキームを示したもので、この画分はQセファロー
スカラムから幅広いピークとして溶出される。図1(B)は2種のIκBのアイソフォ
ームがMono Qカラムで分離されることを示しており、早く溶出されるほうの画分
がIκB-βを含む。セファロース12カラムから得られた精製されたIκB-β画分は
銀染色で解析された。
図2は、マウスのIκB-βのｃＤＮＡの塩基配列と、それから推定されるアミノ
酸配列を示している。図2(A)は「クローン15f」の配列と、予想される359アミノ
酸の蛋白を示している。下線を引いた配列は、推定上のカゼインキナーゼIIリン
酸化部位を示している。6つのアンキリンリピート配列は太字で示してある。ｃ
ＤＮＡから予測される配列に相当する精製されたウサギの蛋白から得られたペプ
チド配列が示されている。図2(B)はIκB-βと、他のIκBファミリーのメンバー
、マウスIκB-α、Bcl-3、IκB-γおよび、ショウジョウバエのcuctus蛋白との
比較をスキームで示している。影を付けてある部分は、各々のアンキリンリピー
トを示している。IκB-βの第3と第4のアンキリンリピートの間にあるスペース
は、cuctus蛋白の配列に類似している部分であり、他の蛋白では見られない。
図3はin vitroでのIκB-βの活性と、in vivoでのIκB-βの活性を示している
。
図3(A)は、T7プロモーターの支配下にpCDNA3ベクターにクローニングされ、TNT
ウサギ網状赤血球結合転写翻訳系をプログラムするために用いられた２種のIκB
をコードするｃＤＮＡを示している。翻訳された蛋白はSDS-PAGEで電気泳動し、
蛍光染色で可視化した。図3(B)は網状赤血球溶解液が、主としてp50:p65ヘテロ
ダイマーの型の内因性NF-κBを含むことを示している。精製したウサギのp50:p6
5NF-κBを加えるとシグナルが増強され、続いて行うIκB活性のアッセイを容易
に行うことができる。TNT溶解液に精製ウサギNF-κBを加えたところには、「+NF
-κB」と表示してある。また、「sense，β」と記した2つのレーンには、それぞ
れプラスミド1μg、および2μgを使用してプログラムされた２つの翻訳物が存在
する。翻訳溶解液はIgκBプローブを用いて、標準的なEMSAで解析した。図3(C)
は、SDS-PAGEにかけ、クマジーブルー染色したグルタチオン−アガロースアフィ
ニティーカラムで精製されたGST-IκB融合蛋白と、精製した融合蛋白とを示して
いる。図3(D)はGST-IκB蛋白の、p50、p65、およびc-Relに対する特異性を示し
ている。GST-IκB融合蛋白は、FPLC MonoQカラムとゲルろ過クロマトグラフィー
で部分的に精製された。SDS-PAGEの結果を示す。
図4は、COS細胞にIκB-αおよびIκB-βを、p50:p65、またはp50:c-Relと同時
発現させることによるＤＮＡ結合の阻害を示している。図4(B)は、図3(A)と同様
に、ルシフェラーゼリポーターの構築物の細胞含有物によって測定したときの転
写の阻害を示している。
図5には異なるマウス組織間のIκB-αおよびIκB-βの分布を調べるためのノ
ーザンブロットとリボヌクレアーゼ保護解析を行った結果を示してある。ノーザ
ンブロットは、IκB-αのためのｃＤＮＡ、続いて、IκB-βのためのｃＤＮＡを
プローブに用いて行った。リボヌクレアーゼ保護解析では、IκB-αおよびIκB-
βのためのプローブを同一のＲＮＡ試料における、ハイブリダイゼーションに用
いた。また、同一の試料を用いる別の反応を、β−アクチンのために用いた。
図6(A)、(B)、および(C)にはIκB-βのイムノブロットおよび免疫沈降による
解析の結果を示してある。図6(A)はウサギの肺由来の異なる画分で、漸時精製さ
れていく、クロマトグラフィーの画分を示している。Superose12画分は配列解析
に用いた試料と同等の純度である。IκB-βを調べるため、マウスのB細胞画分に
よるイムノブロットを最初に行い、抗体をはがしてから再び、アフィニティ精製
した抗IκB-β抗体でプローブした。図6(B)は免疫沈降の実験結果を示している
。この実験は、IκB-βに対する抗血清および、免疫処理前の血清を用いて、2x1
07の代謝標識したJurkat細胞で行った。免疫処理後の血清によるブロットでのみ
現れるバンドを矢印で示してある。図6(C)は図6(B)と同様にして1x108の未標識
細胞で行った免疫沈降の実験結果で、IκB-βの抗血清および免疫処理前の血清
も細胞量に比例して量を増加させて用いている。その後、免疫沈降物はSDS-PAGE
で分画し、PVDF膜に電気的に転写し、p65、c-Rel、IκB-αおよびIκB-βに対す
るウサギポリクローナル抗体でイムノブロットを行った。
図7はマウスB細胞系統におけるIκB-βおよびIκB-αの発現を示している。HA
FTL（プロＢ細胞）、PD31(プレＢ細胞)、WEHI（早期成熟B細胞）、およびS194（
形質細胞）のものが示してある。図7(B)はPD31プレB細胞を2μg/mlのLPSで4時間
および12時間、ならびに25ng/mlのPMAで8時間刺激した結果を示している。各レ
ーンにはＲＮＡを20μgのせて解析をしており、同一のブロットをIκB-β、β−
アクチン、IκB-αを用いて順次プローブした。
図8(A)は、10μg/mlのLPSおよび0.05単位/mlのIL-1で、図に示された時間だけ
刺激した70Z/3細胞を示してある。LPS刺激後120分および240分において、IκB-
β抗血清によるイムノブロットでみられるバンドはやや速く移動し、さらに早い
時点で見られるバンドとは異なる。しかしながらこのバンドもさらに刺激を続け
れば消失する(6時間および24時間)。IL-1で処理したサンプルをIκB-βでイムノ
ブロットしたものでは、2つの近接して並んだバンドを見分けることができる。
図8(B)において、Jurkat細胞はTNF-α(1ng/ml)で刺激し、一方70Z/3細胞は25ng/
mlのPMAで刺激した。図8(C)では、LPSまたはPMAで処理した細胞におけるIκB-α
およびNF-κBの活性化を有するIκB-βの分解との相関をスキームで示してある
。
図9は、シクロヘキシミド、TPCKおよびPDTCが、IκB-αおよびIκB-βのター
ンオーバーに及ぼす影響を示している。70Z/3細胞をまず20μg/mlのシクロヘキ
シミド、25μMのTPCK、あるいは25μMのPDTCにて30分処理した後、10μg/mlのLP
Sで、示された時間だけ刺激した。核および細胞質の抽出物を調製し、イムノブ
ロットおよびゲルリターデーションアッセイで解析を行った。
発明の詳細な説明
NF-κB転写因子複合体は、IκB阻害蛋白により細胞質中で隔離されている。様
々な細胞性刺激により、まだほとんどわかっていない機構によってこの阻害効果
はなくなり、NF-κBは核へ移行し、標的遺伝子の転写活性化につながる。それゆ
えに、NF-κBおよびIκB蛋白は厳密に制御された調節機構に関与している。本発
明により、新規なポリペプチドIκB-β、およびこのポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドの配列が提供される。
第１の実施態様においては、本発明により、本質的には図2および配列番号2に
示されているアミノ酸配列からなる、単離されたIκB-βポリペプチドが提供さ
れる。IκB-βポリペプチドは、還元SDS-PAGEにて測定される分子量が45kDで、p
Iは約4.6、p65(RelA)およびc-Relに結合し、配列番号2に示されているアミノ酸
配列を有することで特徴づけられる。IκB-βポリペプチドのアミノ酸配列は6つ
の連続したアンキリンリピートを有し、酸性アミノ酸に富み、推定PESTドメイン
を有する。
本明細書における、「単離された」あるいは「実質的に純粋」という用語は、
IκB-βポリペプチドと細胞内で自然に接している他の蛋白質、脂質、炭水化物
、あるいは他の物質が、実質的には混入していないIκB-βのことをさす。当業
者であれば、蛋白精製の標準的技術を用いてIκB-βを精製することができる。I
κB-β精製のスキームの1例が図1に示してある。実質的に純粋なIκB-βポリペ
プチドは、非還元条件のポリアクリルアミドゲル上では、1本の太いバンドを与
える。IκB-βの純度を測定するのにアミノ末端アミノ酸配列解析を用いること
もできる。本発明は機能性ペプチドであるIκβ、およびその機能性断片を含む
。本明細書における「機能性ポリペプチド」という用語は、定義された機能性ア
ッセイによって同定され、細胞に、特定の生物学的、形態学的、あるいは表現型
的な変化を与える生物学的機能あるいは活性を有するポリペプチドのことをさす
。IκB-βの機能性断片は、IκB-βの活性（例えば、NF-κBに結合して、その核
移行を阻害すること）があるかぎり、IκB-βポリペプチドの機能性断片の範疇
に
はいる。IκB-βの生物学的活性を有する、より小さいペプチドも本発明に含ま
れる。そのようなペプチドのNF-κBへの結合、および／または、遺伝子のNF-κB
による転写活性化の阻害のアッセイは、当業者に一般的に知られている方法を用
いて行うことが可能であり、本明細書の実施例に記載の方法もその一例である。
生物学的機能単位は、抗体分子が結合することのできるエピトープのような小さ
いポリペプチド断片から、細胞中で形態学的変化を特徴的に誘導、あるいはプロ
グラムすることのできる大きなポリペプチドにまでわたる。「機能性ポリヌクレ
オチド」は本明細書に記載されている機能性ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドのことをさす。
IκB-βの一次アミノ酸配列に小さな修飾が加えられたものは、本明細書に記
載のIκB-βポリペプチドと比較して、実質的に同等の活性を有する蛋白を生じ
るかも知れない。そのような修飾は、部位特異的変異導入によるように意図的な
ものである場合もあるし、また、自然突然変異で起こる場合もある。このような
修飾により生成するポリペプチドもIκB-β活性を持っているかぎりは本発明に
含まれる。さらに、１つあるいはそれ以上のアミノ酸を欠失させた場合も、その
結果生成する分子の構造は修飾を受けることになるが、その活性は顕著な変化を
しないこともありうる。このことは、活性のある、より小さな分子を開発するこ
とにつながり、そのような分子はより広範な用途に用いられるであろう。例えば
、IκB-β活性に必要ないかもしれないアミノ末端、あるいはカルボキシル末端
のアミノ酸を除去することが可能である。
本発明におけるIκB-βポリペプチドには、ペプチド配列に保存的変異をきた
したものも含まれる。本明細書における「保存的変異」と言う用語は、ポリペプ
チド中のアミノ酸残基が、他の生物学的に類似した残基に置換されることをさす
。保存的変異の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、あるいはメチオ
ニンのような疎水性残基の一つを別の疎水性残基に置換すること、または、アル
ギニンのリジンへの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸への置換、グルタミン
のアスパラギンへの置換といった、極性残基の一つを他の極性残基に置換するこ
となどがある。「保存的変異」という用語は、また、置換されたポリペプチドに
対する抗体をつくったときに、置換されていないポリペプチドにも免疫学的に反
応
するならば、置換されていないもとのアミノ酸に代えて、置換されたアミノ酸を
用いることも含む。
本発明により、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド配列から本質的になる単離されたポリヌクレオチドが提
供される。本明細書における「単離された」という用語は、IκB-βポリヌクレ
オチドと細胞内で自然に接している他の核酸、蛋白質、脂質、炭水化物、あるい
は他の物質が、実質的には混入していないポリヌクレオチドのことをさす。本発
明におけるポリヌクレオチド配列は、IκB-βをコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡ、
およびＲＮＡ配列を含む。IκB-βを全体的にあるいは部分的にコードしている
ポリヌクレオチドもまた、それらがIκB-β活性を有するポリペプチドをコード
する限りは、本明細書中では含まれるものと理解される。そのようなポリヌクレ
オチドには、天然に存在するもの、合成したもの、および意図的に操作を加えた
ポリヌクレオチドが含まれる。例えば、IκB-βポリヌクレオチドを部位特異的
変異導入に供することもできる。IκB-βのポリヌクレオチド配列は、アンチセ
ンス配列も含む。本発明におけるポリヌクレオチドは遺伝コードの縮重という性
質のためにヌクレオチド配列が変わったものも含まれる。アミノ酸は20種類あり
、そのほとんどは1つ以上のコドンで特定される。それゆえに、そのヌクレオチ
ド配列でコードされるIκB-βポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化しな
い（例えば、NF−κBに結合するなど）かぎりは、縮重によりヌクレオチド配列
が変化したものもすべて本発明に含まれる。さらに本発明には、配列番号2に記
載のアミノ酸配列を有し、IκB-βポリペプチドと免疫学的に反応する抗体が結
合するエピトープを少なくとも1つ有するポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド配列から本質的になるポリヌクレオチドも含まれる。
IκB-βをコードするポリヌクレオチドには、図2(A)（配列番号1）に記載のヌ
クレオチド配列、ならびにそれに相補的な核酸配列が含まれる。相補的な配列に
はアンチセンスヌクレオチドを含めてもよい。ＲＮＡの配列の場合には、図2(A)
のデオキシヌクレオチドのA,G,CおよびTを、それぞれリボヌクレオチドのA,G,C
およびUに置換する。本発明には、上記の核酸配列の断片で、長さが少なくとも1
5塩基あるものも含まれる。この15塩基というのは、断片が、ストリンジェント
な生理的条件下で、図2(A)（配列番号2）に記載の蛋白をコードするＤＮＡにハ
イブリダイゼーションするのに充分な長さである。
特に、本明細書において開示されるのは、IκB-βのｃＤＮＡ配列であり、そ
れは1077bpの転写されるエクソン（配列番号1）からなる。IκB-βのｍＤＮＡの
構造は、5´非転写領域および3´非転写領域の長さが非常に短い点でユニークな
ものである。特に、3´端にAUUUA配列を欠いていることから、IκB-αmＲＮＡと
は異なって、IκB-βmＲＮＡは安定で、迅速なターンオーバーに供されないこと
が示唆される。
本発明におけるＤＮＡ配列を得るにはいくつかの方法がある。例えば、ＤＮＡ
を、当業者にはよく知られているハイブリダイゼーションの技術を用いて単離す
ることができる。このような技術には、次のものが含まれるが、それのみに限定
されるものではない。
1）ゲノムＤＮＡライブラリー、あるいはｃＤＮＡライブラリーに対しプローブ
を用いたハイブリダイゼーションを行い、相同的なヌクレオチド配列を得る
2）発現ライブラリーに対し抗体を用いたスクリーニングを行い、構造の特徴が
似ている、クローニングされたＤＮＡ断片を検出する。
本発明におけるIκB-βポリヌクレオチドは、哺乳類に属する生物由来のもの
が好ましい。核酸のハイブリダイゼーションを用いたスクリーニングの手順によ
り、適切なプローブが手に入れば、いかなる生物からいかなる遺伝子配列を単離
することも可能である。問題のIκB-β蛋白をコードするヌクレオチド配列の一
部に相当するオリゴヌクレオチドプローブを化学的に合成することが可能である
。このように合成オリゴヌクレオチドプローブを作成するには、短いオリゴペプ
チドの長さのアミノ酸配列が明らかにされていなければならない。IκB-β蛋白
をコードするＤＮＡ配列を遺伝コードから割り出すこともできるが、その場合に
は、コードの縮重も考慮に入れなければならない。縮重により配列が複数のもの
がありうる場合には、それらの配列のものを混合して反応を行うことが可能であ
る。これには、変性させた混合2本鎖ＤＮＡの不均一混合物が含まれる。このよ
うなスクリーニングにおいては、ハイブリダイゼーションは1本鎖ＤＮＡあるい
は変性させた2本鎖ＤＮＡを用いて行うのが好ましい。ハイブリダイゼーション
は、
目的のポリペプチドに関連するmＲＮＡ配列が極めて微量にしか存在しない材料
由来のｃＤＮＡクローンを検出する際に特に有用である。言い換えるなら、非特
異的結合を回避するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件
を用いることにより、例えば、混合物中の標的ＤＮＡのうちの1種類のプローブ
へのハイブリダイゼーションにより、その特定のｃＤＮＡクローンをオートラジ
オグラフィーにて可視化することが可能である。(Wallaceら,Nucl.Acid.Res.,9:
879,1981)。
IκB-βをコードする特異的ＤＮＡ配列は、次の方法によっても得られる。
1）ゲノムＤＮＡから2本鎖ＤＮＡ配列を単離する。
2）目的のポリペプチドに必要なコドンの配列を提供するためＤＮＡ配列を化学
的に製造する。
3）真核生物のドナー細胞から単離したmＲＮＡを逆転写することにより、2本鎖
ＤＮＡ配列をin vitroで合成する。3）の場合には、最終的には、一般にｃＤＮ
Ａと呼んでいる、mＲＮＡに相補的な2本鎖ＤＮＡが合成される。さらに、本発明
によるＤＮＡ配列はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて合成することによって
も得られる。
組換え法において使用するための特異的なＤＮＡ配列を得るための上記の3つ
の方法のうち、ゲノムＤＮＡ単離物を単離することは最も一般的でない。これは
、哺乳動物ポリペプチドの微生物での発現を得ることが望ましい場合にイントロ
ンの存在のために特にそうである。
所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が判っている場合、ＤＮＡ配
列の合成がよく選択される方法である。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の全
配列が判っていない場合、ＤＮＡ配列の直接の合成は不可能であり、選択される
方法はｃＤＮＡ配列の合成である。対象のｃＤＮＡ配列を単離するための標準的
な方法の一つとして、遺伝子発現の高いレベルを有するドナー細胞において豊富
なｍＲＮＡの逆転写に由来するプラスミドまたはファージ担持ｃＤＮＡライブラ
リーの形成がある。ポリメラーゼ連鎖反応法と併せて使用すると、わずかな発現
産物でもクローン化することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列の重要な部
分が判っている場合は、標的ｃＤＮＡ中に存在することが推定される配列を複製
する標識された単鎖または二本鎖ＤＮＡの生産を、単鎖形態に変性されたｃＤＮ
Ａのクローン化されたコピー上で行われるＤＮＡ/ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン法に使用することができる(Jayら，Nucl．Acid Res.，11:2325，1983)。
IκB-βに特異的な抗体を使用して、少くとも1つのエピトープを有するIκB-
βペプチドについて、λgt11のようなｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニン
グすることができる。そのような抗体は、ポリクローナルあるいはモノクローナ
ルに誘導されたものとすることができ、IκB-βｃＤＮＡの存在を示す発現産物
を検出するのに使用できる。
IκB-βをコードしているＤＮＡ配列を得るための好ましい方法はポリメラー
ゼ連鎖反応(PCR)によるものであり、これは核酸合成のin vitro法に基づき、こ
れによりＤＮＡの特定のセグメントが特異的に複製される。増幅されるＤＮＡ断
片に隣接する2つのオリゴヌクレオチドプライマーを利用して、ＤＮＡの熱変性
、プライマーのそれらに相補的な配列へのアニーリング、及びアニールされたプ
ライマーのＤＮＡポリメラーゼによる延長のサイクルを繰り返す。これらのプラ
イマーは標的配列の反対の鎖にハイブリダイズするが、ポリメラーゼによるＤＮ
Ａ合成がプライマーの間の領域にわたって進行する向きとされる。また、延長産
物自体がプライマーに相補的で結合することができるので、増幅の連続的なサイ
クルにより本質的には前のサイクルの中で合成された標的ＤＮＡの量が二倍にな
る。その結果、ほぼ2n(nは実施された増幅のサイクル数)の特異的な標的断片の
指数的蓄積が得られる(PCR Protocols，Eds．Innisら，Academic Press，Inc.，
1990参照、これは引用により本明細書の一部とする)。
IκB-βをコードしているＤＮＡ配列は、適当な宿主細胞へのＤＮＡ移入によ
りin vitro発現することができる。「宿主細胞」とは、ベクターが増殖すること
ができ、そのＤＮＡが発現できる細胞をいう。この用語は、該当宿主細胞の子孫
も含む。突然変異が複製の間に起こり得るので、全ての子孫が親細胞に同一でな
い可能性があると考えられる。しかしそのような子孫は、用語「宿主細胞」を使
用する場合には含まれるものとする。安定した移入の方法、即ち外来ＤＮＡが継
続的に宿主中で維持される方法は当分野において知られている。
IκB-βをコードしているポリヌクレオチド配列は、原核生物あるいは真核生
物のいずれにおいても発現することができる。宿主としては、微生物、酵母、昆
虫及び哺乳動物生物が含まれる。原核生物中で真核生物またはウイルス配列を有
するＤＮＡ配列を発現する方法は当分野において周知である。宿主中で発現及び
複製ができる生物学的に機能的なウイルス及びプラスミドＤＮＡベクターは当分
野において知られている。そのようなベクターを本発明のＤＮＡ配列を導入する
ために使用する。
当業者に周知の方法を、IκB-βコード配列及び適当な転写/翻訳調節シグナル
を含む発現ベクターを構築するのに使用することができる。そのような方法とし
ては、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成法、及びin vivo遺伝子組換え/遺伝学的
技術がある。例えば、Maniatisら，1989 Molecular Cloning A Laboratory Manu
al，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.に記載される方法を参照されたい。
種々の宿主-発現ベクター系をIκB-βコード配列を発現するために使用するこ
とができる。そのようなものとしては、限定するものではないが、IκB-βコー
ド配列を含む組換え体バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、あるいは
コスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌のような微生物；IκB-βコ
ード配列を含む組換え体酵母発現ベクターで形質転換された酵母；IκB-βコー
ド配列を含む組換え体ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイ
ルス(CaMV)、タバコモザイクウイルス(TMV))を感染させるかIκB-βコード配列
を含む組換えプラスミド発現ベクター(例えばＴｉプラスミド)で形質転換した植
物細胞系；IκB-βコード配列を含む組換え体ウイルス発現ベクター(例えばバキ
ュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系；またはIκB-βコード配列を含む組換え
体ウイルス発現ベクター(例えばレトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニア
ウィルス)を感染させた動物細胞系、あるいは安定した形質発現のために設計さ
れた形質転換動物細胞系等が挙げられる。IκB-βが炭水化物を含むと確認され
ていないので、細菌性発現系並びに翻訳及び翻訳後修飾がもたらされるもののい
ずれをも使用することができる(例えば哺乳動物、昆虫、酵母あるいは植物発現
系)。
使用する宿主/ベクター系により、多くの転写及び翻訳エレメントの任意のも
の、例えば構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写
ターミネーター等を発現ベクター中で使用することができる(例えば、Bitterら
，Methods in Enzymology，153:516-544，1987を参照)。例えば、細菌系中でク
ローン化する場合、バクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lacハ
イブリッドプロモーター)等のような誘導性のプロモーターを使用することがで
きる。哺乳動物細胞系中でクローン化する場合は、哺乳動物細胞のゲノムから得
られたプロモーター(例えばメタロチオネインプロモーター)あるいは哺乳動物ウ
イルス(例えば、レトロウイルス長鎖末端反復配列、アデノウイルス後期プロモ
ーター、ワクシニアウィルス7.5 Kプロモーター)を使用することができる。また
、組換え体ＤＮＡまたは合成法により生産されたプロモーターも挿入されたIκB
-βコード配列の転写を得るために使用することができる。
細菌系中では、発現されたものに意図される用途に応じて多くの発現ベクター
を有利に選択することができる。例えば大量のIκB-βを生産しなければならな
い場合は、容易に精製される融合タンパク質産物の高いレベルの発現を導くベク
ターが望ましい。回収のために切断部位を含むように合成されたものが好ましい
。そのようなベクターとしては、限定するものではないが、IκB-βコード配列
がLac Zコード領域を有するフレーム内でベクターに結合され、ハイブリッド-La
c Zタンパク質が生産されるようにした大腸菌発現ベクターpUR278(Rutherら，EM
BO J.，2:1791，1983)、pINベクター(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res.，1
3:3101-3109，1985; Van Heeke & Schuster，J．Biol．Chem.，264:5503-5509，
1989)等がある。
酵母中においては、構成的あるいは誘導性プロモーターを含む多くのベクター
を使用することができる。総説については、Current Protocols in Molecular B
iology，Vol．2，1988，Ed．Ausubelら，Greene Publish．Assoc．& Wiley Inte
rscience，Ch．13; Grantら，Expression and Secretion Vectors for Yeast，M
ethods in Enzymology，Eds.，1987; Wu & Grossman，31987，Acad．Press，N.Y
.，Vol．153，pp.516-544; Glover，1986，DNA Cloning，Vol.II，IRL Press，W
ash.，D.C.，Ch.3;及びBitter，1987，Heterologous Gene Expression in Yeast
, Methods in Enzymology，Eds．Berger & Kimmel，Acad．Press，N.Y.，Vol．1
52，pp．673-684; 及びThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，1
9
82，Eds．Strathernら，Cold Spring Harbor Press．Vol．I及びIIを参照された
い。ADH又はLEU2のような構成的な酵母プロモーター、あるいはGALのような誘導
性プロモーターを使用することができる(Cloning in Yeast．Ch．3，R．Rothste
in，DNA Cloning Vol．II．A Practical Approach，Ed．DM Glover，1986，IRL
Press．Wash.，D.C.)。あるいは、酵母染色体への外来ＤＮＡ配列の組込みを促
進するベクターを使用することができる。
植物発現ベクターを使用する場合、IκB-βコード配列の発現は多くのプロモ
ーターの任意のものにより駆動することができる。例えば、CaMVの35S ＲＮＡ及
び19S ＲＮＡプロモーターのようなウイルス性プロモーター(Brissonら，Nature
,310:511-514，1984)、TMVに対するコートタンパク質プロモーター(Takamatsuら
， EMBO J.，6:307-311，1987)を使用することができる。あるいは、RUBISCOの
小サブユニット(Coruzziら，EMBO J.，3:1671-1680，1984; Broglieら，Science
，224:838-843，1984)、大豆hsp17.5-E又はhsp17.3-B(Gurleyら，Mol．Cell．Bi
ol.，6:559-565，1986)のような熱ショックプロモーターのような植物プロモー
ターを使用することができる。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラス
ミド、植物ウイルスベクター、直接のＤＮＡ形質変換、マイクロインジェクショ
ン、エレクトロポレーション等を使用して植物細胞に導入することができる。そ
のような技術の総説については例えば、Weissbach & Weissbach，Methods for P
lant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII，pp．421-463，1
988;及びGrierson & Corey，Plant Molecular Biology，2d Ed.，Blackie，Lond
on，Ch.7-9，1988を参照されたい。
発現のために使用することができる別の発現系は、昆虫系である。そのような
系の一つとして、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)が、ベク
ターとして外来遺伝子の発現に使用される。このウイルスは、Spodoptera frugi
perda細胞中で増殖する。IκB-βコード配列は、ウイルスの非必須の領域(例え
ばポリヘドリン遺伝子)にクローン化し、AcNPVプロモーター(例えばポリヘドリ
ンプロモーター)の制御下に置くことができる。IκB-βコード配列が成功裏に挿
入されると、ポリヘドリン遺伝子が不活性化され、非閉塞組換え体ウイルス(即
ちポリヘドリン遺伝子によりコードされたタンパク性外皮を欠くウイルス)が生
産される。その後これらの組換え体ウイルスを使用して、Spodoptera frugiperd
a細胞に感染させ、ここで挿入された遺伝子が発現される(例えば、Smithら，J．
Viol.，46:584，1983; Smith，米国特許第4,215,051号を参照)。
真核生物系、好ましくは哺乳動物の発現系は、発現された哺乳動物タンパク質
の適当な翻訳後修飾が起こることを可能とする。転写一次産物の適当なプロセシ
ング、グリコシル化、リン酸化、そして有利には遺伝子産物の分泌のための細胞
器官を有する真核細胞を、IκB-βの発現のための宿主細胞として使用すること
ができる。哺乳動物細胞系が好ましい場合がある。そのような宿主細胞系として
は、限定するものではないが、CHO、VERO、BHK、Hera、COS、MDCK、-293及びWI3
8がある。
発現を導く組換え体ウイルスあるいはウイルス性エレメントを使用する哺乳動
物細胞系を製造することができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを使用
する場合、IκB-βコード配列をアデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば後
期プロモーター及び三分節系リーダー配列に結合することができる。その後この
キメラ遺伝子を、in vitroまたはin vivoの遺伝子組換えによってアデノウイル
スゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須の領域(例えば、
領域E1又はE3)中への挿入により、生存可能で感染宿主中でタンパク質を発現す
ることができる組換え体ウイルスが得られる(例えば、Logan & Shenk，Proc．Na
tl．Acad．Sci．USA，81:3655-3659，1984を参照)。あるいは、ワクシニアウィ
ルス7.5 Kプロモーターを使用することができる(例えば、Mackettら，Proc．Nat
l．Acad．Sci．USA，79:7415-7419，1982; Mackettら，J．Virol.，49:857-864,
1982; Panicaliら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，79:4927-4931，1982を参照)
。特に重要なものは、細胞質因子として複製する能力を有するウシ乳頭腫ウイル
スをベースとするベクターである(Sarverら，Mol．Cell．Biol.，1:486，1981)
。このＤＮＡのマウス細胞への導入後短時間で、プラスミドは細胞あたり約100
〜200のコピーに複製する。挿入されたｃＤＮＡの転写は、宿主の染色体へのプ
ラスミドの組込みを必要としないので、発現の高いレベルが得られる。これらの
ベクターは、例えばneo遺伝子のような選択可能なマーカーをプラスミド中に含
ませることによって安定した発現のために使用することができる。あるいは、レ
トロ
ウイルスゲノムを、宿主細胞中でのIκB-β遺伝子の発現を導入し発生させるこ
とができるベクターとして使用するために改変することができる(Cone & Mullig
an，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81:6349-6353；1984)。高レベルの発現は、
限定するものではないが、メタロチオニンIIAプロモーター及び熱ショックプロ
モーターのような誘導性のプロモーターを使用することによっても得られる。
組換え体タンパク質の長期的な、高い収量での生産のためには、安定した発現
が好ましい。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用せずに、適当な発現
調節エレメント(例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネータ
ー、ポリアデニル化部位等)により制御されるIκB-βｃＤＮＡ及び選択可能なマ
ーカーで宿主細胞を形質転換することができる。組換えプラスミド中の選択可能
なマーカーは選択に対する耐性を与え、細胞がプラスミドをそれらの染色体に安
定に組み込み、増殖して遺伝子座を形成し、これをさらにクローン化して細胞系
に拡張することを可能とする。例えば、外来ＤＮＡの導入後、製造された細胞を
富栄養培地中で1-2日間増殖させ、それから選択培地に切り替えることができる
。多くの選択系を使用することができ、そのようなものとして限定するものでは
ないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら，Cell，11:223，197
7)、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska &
Szybalski，Proc．Natl．Acid．Sci．USA，48:2026，1962)、及びアデニンホス
ホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら，Cell，22:817，1981)遺伝子を、tk-、h
gprt-またはaprt-細胞でそれぞれ使用することができる。また、代謝拮抗物質耐
性を選択の基礎として使用することができ、メトトレキセートに耐性を与えるdh
fr(Wiglerら，Natl．Acad．Sci．USA，77:3567，1980; O'Hareら，Proc．Natl．
Acad.Sci．USA，78:1527，1981)；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt(M
ulligan & Berg，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，78:2072，1981);アミノグリコ
シドG-418に対する耐性を与えるneo(Colberre-Garapinら，J．Mot．Biol.，150:
1，1981)；及びハイグロマイシンに対する耐性を与えるhygro(Santerreら，Gene
，30:147，1984)遺伝子に対する選択を使用することができる。最近、別の選択
可能な遺伝子が記載されている。即ち、細胞がトリプトファンの代わりにインド
ールを使用することを可能とするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノー
ルを利
用することを可能とするhisD(Hartman & Mulligan，Proc．Natl．Acad．Sci．US
A，85:8047，1988)、及びオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、2-(ジフルオロ
メチル)-DL-オルニチン(DFMO)に対する耐性を与えるODC(オルニチンデカルボキ
シラーゼ)(McConlogue L.，Current Communications in Molecular Biology，Co
ld Spring Harbor Laboratory ed.，1988)である。
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は当業者に周知の慣用の技術により行
うことができる。宿主が原核生物、例えば大腸菌の場合、ＤＮＡを取込むことが
できるコンピテント細胞を対数増殖期の後に回収された細胞から調製し、その後
当分野で周知の方法を使用してCaCl2法により処理することができる。あるいは
、MgCl2またはRbClを使用することができる。所望の場合、宿主細胞のプロトプ
ラストを形成した後に形質変換を行ってもよい。
宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム同時沈殿、エレクトロポレーシ
ョン、リポソームに収容されたプラスミドの挿入のような慣用の物理的手段、あ
るいはウイルスベクター等のＤＮＡのトランスフェクション方法を使用すること
ができる。真核生物細胞は、本発明のIκB-βをコードしているＤＮＡ配列と、
例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子のような選択可能な表現型をコード
している二番目の外来DNA分子とで同時に形質転換することもできる。また別の
方法は、シミアンウイルス40(SV40)又はウシ乳頭腫ウイルスのような真核生物ウ
イルスベクターを使用して、真核生物細胞を一時的に感染又は形質転換させてタ
ンパク質を発現する方法である(例えば、Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spri
ng Harbor Laboratory，Gluzman ed.，1982を参照)。
本発明により得られる微生物発現されたポリペプチドあるいはその断片の単離
と精製は、分取クロマトグラフィー法、モノクローナルまたはポリクローナル抗
体を使用する免疫学的分離等の慣用の手段により行うことができる。
本発明は、IκcB-βポリペプチドまたはIκB-βの免疫反応性断片と免疫反応
性である(例えば結合する)抗体を包含する。異なるエピトープ特異性を有するプ
ールされたモノクローナル抗体から本質的になる抗体、及び個別のモノクローナ
ル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法によっ
て(Kohlerら，Nature，256:495，1975)、前記タンパク質の断片を含む抗原から
作
られる。本発明で使用される抗体の用語は、完全な分子並びにその断片、例えば
IκB-β上のエピトープ決定基と結合することができるFab及びF(ab')2のような
断片を含む。
本発明で使用される用語「抗体」は、完全な分子並びにその断片、例えばエピ
トープ決定基と結合することができるFab、F(ab')2及びFvのような断片を含む。
これらの抗体フラグメントはその抗原あるいはレセプターと選択的に結合する能
力を有し、次のように定義される。
(1) Fabは、抗体全体を酵素パパインで消化することにより完全なＬ鎖と１つの
Ｈ鎖の部分を生成することにより製造できる抗体分子の一価の抗原結合断片を含
む断片である。
(2) Fab'は、抗体全体をペプシンで処理しその後還元して完全なＬ鎖とＨ鎖の部
分を生成することにより製造できる抗体分子の断片である。抗体分子あたり２つ
のFab'断片が得られる。
(3) (Fab')2は、抗体全体を酵素ペプシンで処理し、その後還元せずに得ること
ができる抗体の断片である。F(ab')2は２つジスルフィド結合により2つのFabが
一体に保持された２量体である。
(4) Fvは、2つの鎖として発現されたＬ鎖の可変領域とＨ鎖の可変領域を含んで
いる遺伝子工学的に製造された断片として定義される。
(5) 単鎖抗体(「SCA」)は、Ｌ鎖の可変領域とＨ鎖の可変領域を含んでいる遺伝
子工学的に製造された断片であって、適当なポリペプチドリンカーが結合して単
鎖分子として遺伝子融合したものと定義される。
これらの断片を製造する方法は、当分野で知られている(例えば、Harlow and
Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ne
w York(1988)を参照、引用により本明細書の一部とする)。
本発明で使用する用語「エピトープ」は抗体のパラトープが結合する抗原上の
抗原決定基の任意のものを意味する。エピトープ決定基は、通常アミノ酸又は糖
側鎖のような化学的に活性な表面の分子の群からなり、通常特異的な3次元構造
上の特徴並びに特異的な電荷特性を有する。
本発明のIκB-βポリペプチドに結合する抗体は、免疫抗原として完全なポリ
ペプチドあるいは対象の小ペプチドを含む断片を使用して製造することができる
。配列番号２のようなポリペプチド、即ち動物を免疫するために使用されるペプ
チドは、翻訳されたｃＤＮＡ又は化学合成により得られ、所望の場合にはキャリ
アータンパク質に抱合させることができる。化学的にペプチドに結合されるその
ようなキャリアーの一般に使用されるものとしては、キーホールリンペットヘモ
シニアン(KLH)、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン(BSA)、破傷風トキソイ
ド等がある。その後結合されたペプチドを動物(例えばマウス、ラット、ヤギ、
ウサギ等)を免疫するために使用する。
所望の場合は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体は、例えば、抗体の生
成の対象としたポリペプチドまたはペプチドが結合するマトリックスに結合し溶
出することによりさらに精製することができる。当業者は、ポリクローナル抗体
及びモノクローナル抗体の精製及び／または濃縮について免疫学的技術でよく知
られている種々の方法を知り得るであろう(例えば、Coliganら，Unit 9，Curren
t Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991、(引用により本明細書
の一部とする)を参照)。
抗イディオタイプ法を使用して、エピトープを模倣するモノクローナル抗体を
生産することも可能である。例えば、最初のモノクローナル抗体に対して形成さ
れた抗イディオタイプモノクローナル抗体は、最初のモノクローナル抗体により
結合されるエピトープの「イメージ」である、超可変部における結合ドメインを
有することになる。即ち本発明においては、本発明のIκB-βポリペプチドに結
合する抗体から形成された抗イディオタイプ抗体は、IκB-βが結合するP65又は
c-Rel上の部位に結合することができ、それによりIκB-βが細胞質中でNF-κBに
結合して隔離することを防ぐ。
別の態様においては、本発明はIκB-β/NF-κB複合体の完全性に作用する組成
物を同定するための方法を提供する。特定の理論に拘束されることを望むもので
はないが、この効果は例えばリン酸化されたIκB-βを分解するプロテアーゼを
阻害するか、刺激することであり得る。そのような組成物は、抗炎症剤及び免疫
抑制剤として有効であり得る。上記方法は、試験される組成物、IκB-β、好ま
しくはリン酸化されたIκB-β及びNF-κBを含む成分を、それらの成分が相互に
作用するのに十分な時間と条件でインキュベートし、その後前記組成物がIκB-
β/NF-κB複合体に対して有する前記効果、例えばIκB-βの分解に対する効果を
測定することを含む。例えば観察される効果は、IκB-β分解の阻害又は刺激で
あり得る。例えばプロテアーゼを阻害する組成物は、プロテアーゼがIκB-βを
分解することを防ぎ、それによってNF-κBが核に移動して遺伝子がNF-κBにより
トランス活性化されることを抑制する。組成物がIκB-βの安定性に対して有す
る効果は、免疫学的分析、核酸分析及びタンパク質分析を含む種々の方法により
測定することができる。IκB-βはその運命を測定することができるように標識
することができる。標識の例としては、放射性同位体、螢光化合物、生物発光化
合物、化学発光化合物、金属キレート化剤、酵素等がある。当業者であれば常用
の実験によりそのようなものを確認できるであろう。
IκB-β/NF-κB複合体に作用する組成物を同定するための本発明の方法は、好
ましくはIκB-βと結合するかそれと複合体を形成した、NF-κBを使用する。Iκ
B-β/NF-κB複合体に作用する組成物は、TPCKのようなキモトリプシン阻害剤を
含んでいてもよい。また組成物はPDTCのような抗酸化剤を含んでいてもよい。刺
激の後にIκB-βを分解することができる候補細胞質プロテアーゼは、キモトリ
プシン様活性を有する遍在的な700 kDマルチサブユニットプロテオソームである
(Vinitskyら，Biochemistry，31:9421，1992)。本明細書で記載するプロテオソ
ームは、複合触媒性の酵素複合体である。
本発明はさらに、試験される組成物、NF-κBの誘導物質及び指示細胞を含む成
分をインキュベートし、NF-κB活性を検出することを含む、IκB-β/NF-κB複合
体に作用する組成物を同定する方法を包含する。NF-κBの誘導物質は、試験され
る組成物の添加の前又は後に加えることができる。好ましくは組成物を加えた後
に加える。典型的には、NF-κBの誘導物質は、IκB-β/NF-κB複合体に作用する
能力に基づいて選択される。NF-κBの誘導物質としては、IL-1のようなサイトカ
イン、リポ多糖体(LPS)等がある。その他の誘導物質も当業者に知られている。
典型的には、本発明の方法によって同定された好ましい組成物は、IκB-β/NF-
κB複合体の解離を阻害するものである。
本発明の方法は、指示細胞中で行われる。「指示細胞」とは、その中でNF-κB
の活性化を検出することができるものである。哺乳動物宿主指示細胞の例として
は、pre-Ｂ細胞系、70Z/3、Jurkat T、COS、BHK、293、CHO、HepG2、HeLa細胞等
がある。NF-κBのレベルが検出できる限りその他の細胞系も指示細胞として使用
することができる。細胞を遺伝子組換えにより改変して、好ましくは機能可能な
ようにリポーター遺伝子に結合された、κB結合モチーフの一以上の別のコピー
をコードする発現ベクターを含むようにすることができる。また細胞をIκB-β
及びNF-κBを発現するように改変することもできる。好ましくは、NF-κBをコー
ドする発現ベクターは、IκB-βが結合する、NF-κBのp65またはc-Relサブユニ
ットのコード領域を含む。
宿主細胞は、ｃＤＮＡ発現ライブラリーに由来するプロテアーゼ遺伝子のNF-
κBとリポーター遺伝子に結合したκBモチーフを発現するように組換えＤＮＡに
より修飾された酵母とすることができる。プロテアーゼの発現により、IκBの分
解とNF-κBの活性化が起こり、従ってリポーター活性の誘導が得られる。組成物
の存在下ではプロテアーゼは阻害され、リポーター活性は得られない。酵母リポ
ーターの研究で典型的に使用されるマーカーの例としては、βガラクトシダーゼ
(β-gal)、HIS3及びLEU2栄養選択マーカー等がある。
リポーター遺伝子は、NF-κB活性化の促進または抑制の検出のための表現型に
より同定可能なマーカーである。本発明で好ましく使用される標識としては、そ
の発現がルシフェラーゼアッセイによって検出可能なLUC遺伝子がある。原核生
物発現ベクター中で典型的に使用されるマーカーの例としては、アンピシリン(
β-ラクタマーゼ)、テトラサイクリン及びクロラムフェニコール(クロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ)に対する抗生物質耐性遺伝子がある。哺
乳動物発現ベクター中で典型的に使用される、本発明に好ましいそのようなマー
カーの例としては、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、アミノグリコシドホスホト
ランスフェラーゼ(neo、G418)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、ハイグロマ
イシン-B-ホスホトランスフェラーゼ(HPH)、チミジンキナーゼ(TK)、キサンチン
グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPRT、gpt)及びβ-ガラクトシダ
ーゼ(β-gal)の遺伝子等がある。
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質変換は、当業者に周知の慣用の技術により
行うことができる。宿主が大腸菌のような原核生物の場合、対数増殖期の後に回
収した細胞からＤＮＡを取込むことができるコンピテント細胞を調製することが
でき、その後当分野で周知の方法によりCaCl2法により処理することができる。
あるいは、MgCl2またはRbClを使用することができる。また形質変換は、宿主細
胞のプロトプラストを形成した後、またはエレクトロポレーションによっても行
うことができる。
宿主が本発明の方法において好ましい真核生物である場合、リン酸カルシウム
同時沈殿、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームに
収容したプラスミドの挿入のような慣用の物理的な方法、あるいは、ウイルスベ
クター等のＤＮＡのトランスフェクション方法を使用することができる。真核細
胞も、本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列と、単純ヘルペスチミ
ジンキナーゼ遺伝子のような選択可能な表現型をコードしている二番目の外来Ｄ
ＮＡ分子で同時形質転換することができる。もう一つの方法は、シミアンウイル
ス40(SV40)又はウシ乳頭腫ウイルスのような真核生物ウイルスのベクターを使用
し、一時的に真核細胞を感染または形質転換し、タンパク質を発現する方法であ
る(Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman ed.,
1982)。
本発明においては、好ましくはリポーター遺伝子に機能可能なように結合され
た、κB結合モチーフポリヌクレオチド配列、IκB-β及びNF-κBポリヌクレオチ
ド配列を組換え発現ベクターに挿入することができる。用語「組換え発現ベクタ
ー」は、遺伝的配列の挿入または取込みにより操作されたプラスミド、ウイルス
、あるいは当分野で知られるその他のビヒクルをいうものである。そのような発
現ベクターは、宿主の挿入された遺伝子配列の効率的な転写を容易にするプロモ
ーター配列を含むものである。発現ベクターは典型的には複製開始点とプロモー
ター、並びに形質転換細胞の表現型選択を可能とする特異的な遺伝子を含む。本
発明での使用に適するベクターとしては、限定するものではないが、細菌中での
発現用のT7ベースの発現ベクター(Rosenbergら，Gene 56:125，1987)、哺乳動物
細胞中の発現用のpMSXND発現ベクター(Lee and Nathans，J．Biol．Chem．263:3
521，1988)、及び昆虫細胞中での発現用のバキュロウイルスから誘導されたベク
タ
ー等がある。ＤＮＡセグメントは、例えばプロモーター(例えば、T7、メタロチ
オネインI、又は多面体プロモーター)のような調節エレメントに機能可能なよう
に結合してベクター中に存在させることができる。
本発明の方法におけるNF-κB活性の検出は、リポーター遺伝子の遺伝子産物の
レベルを測定することによって検出することができる。検出の方法は、例えば、
免疫学的なもの、核酸分析によるもの、タンパク質分析によるもの、栄養選択に
よるもの、あるいは酵素的アッセイによるもの等とすることができる。その他の
通常の方法も当業者に理解されるであろう。
また別の態様においては、本発明は患者のNF-κB遺伝子活性化に関連する免疫
病理学的症状を治療する方法を提供する。好ましくは、免疫病理学的症状はIL-1
生産又はLPS刺激作用と関連するものである。前記方法は、患者にIκB-β/NF-κ
B複合体解離の阻害剤の治療上有効な量を与えることを含む。用語「免疫病理学
的症状」は、免疫反応又は免疫性を一般に含むいかなる疾患も含む。本明細書で
使用する「治療上有効な」とは、NF-κB障害の原因を改善するのに十分な量の阻
害剤の量をいう。「改善する」は、治療を受ける患者の障害の有害な効果を軽減
することをいう。本発明の対象は好ましくはヒトであるが、NF-κB障害を有する
任意の動物、例えばヒト骨髄を移植されたSCIDマウス(ヒト化SCID)を本発明の方
法によって治療することができると考えられる。本発明の方法によって治療する
ことができる免疫病理学的症状の例としては、後天性免疫不全障害(AIDS)、毒素
ショック症候群、慢性炎症(例えば、関節炎)、同種移植片拒絶反応、紫外線及び
放射線反応、免疫反応及び急性期の反応の間のＴ細胞、Ｂ細胞及びマクロファー
ジの活性化に関連する障害、腫瘍壊死因子によって媒介される悪液質のような進
行癌と関連する障害等が挙げられる。本質的に、NF-κB/IκB-β結合/解離に疫
学的に関連するいかなる障害も治療できると考えられる。
具体的には、本発明の方法は、敗血症、または敗血症の徴候の１以上を有する
患者を治療するのに使用することができる。該方法は、敗血症の徴候を示してい
る患者あるいは敗血症を発症する危険がある患者に、IκB-β/NF-κB複合体解離
の阻害剤の治療上有効な量を投与することを含む。阻害剤は本明細書で記載した
本発明の方法によって同定することができる。改善することができる症状として
は、発熱、低血圧症、好中球減少症、白血球減少症、血小板減少症、汎発性血管
内凝固、成人呼吸窮迫症候群、ショック及び多臓器不全のようなTNFの血液レベ
ルの一過性の増加に関連するものが挙げられる。そのような治療を必要とする患
者としては例えば、グラム陰性の細菌感染症、ヘビ毒中毒又は肝機能不全から生
じる内毒血症のような毒血症に罹る危険のある患者が挙げられる。さらに、グラ
ム陽性細菌、ウイルス又は真菌に感染している患者は敗血症の徴候を示し得、本
明細書に記載するような治療の方法が有益であり得る。本発明の方法により特に
利益を得ることができる患者は、大腸菌、Haemophilus influenza B、Neisseria
meningitides、ブドウ球菌、又は肺炎球菌感染に罹っている患者である。敗血
症の危険を有する患者として、火傷、射創を有するか、腎不全又は肝不全に罹っ
た患者が挙げられる。
また別の態様においては、本発明は、NF-κBトランス活性化に関連するウイル
スの活性化をモジュレートする方法であって、IκB-β/NF-κB複合体解離の阻害
剤のモジュレートに有効な量にウイルスを含む細胞を接触させることを含む方法
を包含する。用語「モジュレートする」は、ウイルスの活性化を阻害すること又
は刺激することをいう。NF-κBによってトランス活性化されるいかなるウイルス
も含まれ、例えば、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)あるいはサイトメガロウィルス(
CMV)のようなヘルペスウイルスが含まれる。例えば、CMVの活性化を調節する方
法は、CMV網膜炎の治療において有用である。
NF-κB/IκB-β解離の阻害剤を患者に投与する場合、阻害剤は注射又は時間を
かけた徐々の点滴等により非経口的に投与することができる。阻害剤は、静脈内
、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮または体外に投与することができる。阻害
剤のデリバリーのための方法は、マイクロスフェア又はプロテイノイド中にカプ
セル化することによる経口的なもの、エアロゾルによる肺へのデリバリー、ある
いはイオン電気導入法または経皮エレクトロポレーションによる経皮的なものを
含む。その他の投与方法も当業者に理解されるであろう。
本発明の阻害剤の非経口投与用の製剤は、滅菌された水性または非水性の溶液
、懸濁液及びエマルションを含む。非水性の溶剤の例としては、プロピレングリ
コール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油及びオレイン酸エ
チ
ルのような注射可能な有機エステルが挙げられる。水性のキャリアーとしては、
水、アルコール性/水性溶液、エマルション及び懸濁液が挙げられ、生理食塩水
、緩衝された媒体等が含まれる。非経口的なビヒクルとしては、塩化ナトリウム
溶液、リンガーデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸化リン
ガーあるいは不揮発性油等が挙げられる。静脈内用のビヒクルとしては、流体及
び栄養補充物、電解質補充物(例えばリンガーデキストロースをベースとしたも
の)等が挙げられる。防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗菌物質、抗酸化剤、
キレート剤、不活性ガス等も存在させることができる。
さらに別の態様においては、本発明は患者の細胞増殖疾患を治療する方法を提
供し、該方法における障害はNF-κB/IκB-β複合体結合/解離と関連するもので
ある。そのような障害は例えば、NF-κBの継続的な活性化によるものである。用
語「細胞増殖性疾患」は、形態学的に周囲の組織と異なるように見える場合が多
い、悪性腫瘍及び非悪性細胞集団を示す。例えば前記方法は、例えば肺、乳房、
リンパ系、胃腸、尿生殖系のような種々の器官系の悪性腫瘍、並びに、大部分の
大腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、肺の非小細胞癌、小腸癌、食道癌等の腺癌を治療
するのに有用で有り得る。
前記方法はまた、非悪性の又は免疫関連細胞増殖性疾患、例えば乾癬、尋常性
天疱瘡、ベーチェット症候群、急性呼吸不全症候群(ARDS)、虚血性心疾患、透析
後症候群、白血病、リウマチ様関節炎、後天性免疫不全症候群、脈管炎、脂質性
組織球増殖症、敗血症性ショック、一般的な炎症等の治療にも有用である。本質
的に、IκB-β/NF-κB複合体に疫学的に関連するいかなる障害も治療できると考
えられる。
精巣中でIκB-βが高いレベルで発現されるので、この組織に関連する本発明
のポリペプチド、ポリヌクレオチド及び抗体を使用した種々の用途がある。その
ような用途としては、精巣中でのNF-κB遺伝子活性化と関連する細胞増殖疾患の
治療がある。また、種々の精巣の発生上又は後天性の障害も、IκB-β適用の対
象となり得る。そのような障害としては、限定するものではないが、ウイルス感
染症(例えばウイルス性睾丸炎)、自己免疫状態、精子生産又は機能不全、外傷、
睾丸腫瘍等がある。
これまでの記載は説明のためのものであって本発明の範囲を限定するものでは
ない。実際に当業者であれば本明細書の記載に基づいて過度の実験を行うことな
く別の態様を想到し、実施できるであろう。
実施例１
材料及び方法
１．ウサギ肺からのIκB-βの精製
合計4 kgのウサギ肺からIκB-βの精製を行い、各1 kgの個別の精製を４回行
った。精製の最初の段階はIκB-αの精製についてGhosh，S．and Baltimore，D
．Nature，344:678-682，1990が報告したように行った。この精製は、フェニル
セファロース段階を行わず、FPLCヒドロキシルアパタイトカラム(Pentax)を通常
の樹脂の代わりに使用したことにおいて以前に行われたものとは異なる。部分的
に精製されたNF-κB:IκB複合体を0.8% DOCで解離させ、Q-セファロースアニオ
ン交換カラムで分画化した。NF-κB活性の大部分は100 mM KClフロースルー中に
溶出し、IκBがカラムに結合して残った。結合タンパク質を100-600 mM KCl勾配
で溶出すると、IκBが250-350 mM KClの間に幅広いピークとして溶出した。その
後、IκBの混合物をFPLC Mono Qカラムで100-800 mM KCl勾配で分画化した。Iκ
B活性は2つのピークとして溶出され、先に溶出された(-300 mM KClにおける)ピ
ークがIκB-βを含んでいた。IκB-βのプールを、ヒドロキシルアパタイトとFP
LC Superose-12ゲル濾過カラムでさらにクロマトグラフィーにかけた。IκB-β
活性を含んでいるピーク画分の50μlをSDS-PAGEで分析し、タンパク質を銀染色
法によって視覚化した。最終的なSuperose-12ゲル濾過カラムの後の純粋なタン
パク質の収量は約2μgであり、その約1.8μgをSDS-PAGE及びニトロセルロース膜
へのエレクトロブロッティングに使用した。移動の後、約1μgのタンパク質(-20
pmol)がトリプシンによる消化と配列決定に利用できた。
２．精製されたIκB-βタンパク質の配列決定
ニトロセルロースの上の45kDタンパク質バンドをトリプシンで消化し、放出さ
れたペプチドを以前に記載されたようにして小口径HPLCにより分離した(Ghoshら
、
Cell 62:1019-1029，1990)。トリプシン自己消化バックグラウンド上に6つのピ
ークが観察された。以前に記載された微量分析法(Erdjument-Bromageら、RX Ang
eletti ed.，4:419-426，1993)を使用して、4つのペプチドから配列情報を得た
が、その１つは混合物であった。3つの純粋なペプチドの配列は、1.4 pmolの収
量のT15、LYAAxA(G)VCVAE(配列番号3)、1.6 pmolのT27、LQLEAENYDGxTPLxVA(v)(
配列番号4)及び1.5 pmolのT41、PLHLAVEAQAAD(V)LELL(配列番号5)であった。配
列は当業者に知られている一文字標記により示したもので、xはその位置で残基
が同定されなかったことを示し、括弧は同定の信頼度がより低いことを示す。小
文字の括弧中のアミノ酸は非常に低いレベルで存在しただけのものである。
３．マウスLyD9 pro-B細胞ｃＤＮＡライブラリーからのIκB-βｃＤＮＡのクロ ーニング
EcoRI及びBamHI制限部位を含む縮重PCRプライマーを、ペプチドT27(配列番号4
)及びT41(配列番号5)からの両方向の配列を使用して合成した。ウサギ肺全ＲＮ
Ａを使用してPCR用のｃＤＮＡテンプレートを合成した。プライミングにはラン
ダムヘキサマーを使用した。逆転写反応混合物の約1/10を、プライマーの異なる
組み合わせ、5’T27＋3’T41及び5’T41及び3’T27を使用したPCR反応に使用し
た。35サイクルの増幅の後に合成されたPCR産物は、エチジウムブロミド染色に
おいて明らかな産物は含んでいなかった。そこで全反応混合物を精製し、2つの
別の制限酵素で消化し、その後同じ酵素で消化されたBluescriptベクターに連結
した。両方の連結により2、3のクローンを得、そこから単離された少量のＤＮＡ
を配列決定した。5’T27＋3’T41からのクローンの１つは160 bpの挿入物を含ん
でおり、これはプライマーを設計するのに使用したペプチドをコードしている配
列であり得る。ノーザンブロットにおいてこの挿入物をプローブとして使用した
場合、ウサギ肺及びマウスLyD9ＲＮＡの両方からの1.3kbの単一のバンドにハイ
ブリダイズした。この結果は、ウサギからの160bp PCR産物に相同なｍＲＮＡ種
がマウスにただ一つ存在することを強く示唆している。
そこでこの挿入物を、市販のものあるいはマウスLyD9もしくは22D6細胞系から
製造した種々のライブラリーをスクリーニングするプローブとして使用した。大
きいｃＤＮＡ(>1 kb)についてサイズ選択した複数のライブラリー、従ってマウ
スpro-B細胞系、LyD9からのｃＤＮＡを有するλgt11の中の新しいｃＤＮＡライ
ブラリーの複数のスクリーニングからクローンは得られなかった。ｃＤＮＡは0.
7〜1.6 kbでサイズ選択し、1.3 kbのサイズを有するIκB-βをコードするｍＲＮ
Ａの比率を増加させた。このライブラリーからの106クローンのスクリーニング
において、同じｃＤＮＡを含む15の陽性のクローンが得られた。クローン15fを
以降の分析のために選択した。
４．in vitro 翻訳
IκB-α及びIκB-βの両方のin vitro翻訳は、Promegaから得たウサギ網状赤
血球溶解物中で行った。転写/翻訳結合系(TnT)を、特定の構築物に応じてT7また
はT3ＲＮＡポリメラーゼとともに使用した。90分培養した後、溶解物の2μlをSD
S-PAGEにより分析し、合成されたタンパク質を蛍光間接撮影法によって検出した
。
５．GST-I κB融合物の発現
グルタチオン-S-トランスフェラーゼを有するIκB-α及びIκB-βの融合物を
、PCRによるGEX-2tベクター中へのクローン化により生成した。DH-5α細胞中の
これらの構築物を小培養物中で一晩増殖させた。一晩培養物を1:50に培地で希釈
し、約0.3のOD600の密度に増殖させ、0.4 mM IPTGで4時間誘導した。その後細胞
を回収し、凍結融解により溶解し、その後超音波破砕した。可溶性抽出物を使用
してGST-融合タンパク質を精製した。抗原としてIκB-βを使用した場合、抽出
物は最初にグルタチオン-アガロースアフィニティークロマトグラフィー及びそ
の後のFPLC Mono Qアニオン交換及びSephacrylゲル濾過クロマトグラフィーによ
り精製した。
６．免疫沈降分析
細胞(2x107)を、透析された5％ウシ胎仔血清を含むRPMI中で45分間Translabel
(ICN)により標識した。標識化に続いて細胞を1.2 mlのTNTバッファー(20 mM Tri
s-HCl、1% Triton X-100及び200 mM NaCl)中で溶解し、遠心分離し、上清を回収
した。上清の300μlを各免疫沈降に使用し、容量はTNTバッファーにより1 mlに
した。その後5 μlの免疫前または免疫血清と20μlのプロテインＡセファロース
の1:1スラリーを加えて４℃で一晩インキュベートした。その後、サンプルを遠
心分離し、プロテインＡセファロースをTNTバッファーで5回洗浄し、最後にペレ
ットを2X SDSサンプルバッファーの中で5分間煮沸し、SDS-PAGEにかけた。電気
泳動の後、ゲルを固定し、Amplify(Amersham)中で培養した。その後乾燥したゲ
ルを蛍光間接撮影に供した。
７．ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析は、全体的に細胞抽出物の約25μlを使用して行った
。SDS-ポリアクリルアミドゲルからタンパク質をPVDF膜上にエレクトロブロット
した。膜は5% Blottoでブロックし、一次抗体をBlottoに加えた。その後の洗浄
と二次抗体とのインキュベーションはTTBS中で行った。一次抗体によって検出さ
れたタンパク質を、Amersham(ECL)からの試薬を使用した化学発光アッセイを行
い、フィルムへ露出することにより視覚化した。使用したIκB-α抗体はペプチ
ドに対して生成されたアフィニティ精製ウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz
Biot echnology)又は組換え体完全長タンパク質に対するアフィニティ精製抗体
であった。p50及びIκB-β抗体は、精製された組換え体タンパク質に対して生成
されたウサギポリクローナル抗血清であった。
８．ノーザンブロットとリボヌクレアーゼ保護アッセイ
ノーザンブロット分析を、標準的プロトコルに従って全ＲＮＡまたはポリA＋
ＲＮＡについて行った。ＲＮＡサンプル(全体で25 μg、ポリA+について3μg)を
、ホルムアルデヒド-アガロースゲル上で分画化した。Stratagene Posiblot装置
を使用してナイロン膜へのＲＮＡの移動を行い、核酸を膜に紫外線架橋した。ハ
イブリダイゼーション用のＤＮＡプローブはランダムプライミングプロトコルに
よって標識し、50%ホルムアミドバッファー中42℃でハイブリダイズさせた。ハ
イブリダイゼーションの後、上昇するストリンジェント条件下でブロットを洗浄
し、典型的には0.2X SSC，0.5% SDSにより65℃で最終的な洗浄を行った。
リボヌクレアーゼ保護アッセイはAmbion（RPA IIキット）からのプロトコール
および試薬を用いて実施した。T7 RNAポリメラーゼを用いるin vitro転写により
β- アクチン、ＩκＢ−βおよびＩκＢ−αのための250、200 および150 塩基
のアンチセンスプローブをつくった。ポリアクリルアミドゲルから標識プローブ
を切りだし、溶出した。次に、各サンプルにつき10μg の全ＲＮＡにプローブを
42℃で一夜ハイブリダイズさせた。その後サンプルをRNAse で消化し、ゲル電気
泳動により分析した。
９．DEAE- デキストラン法によるトランスフェクション
それぞれのトランスフェクションにつき約107個の細胞を用いた。ＤＮＡをMgC
l2/CaCl2含有バッファー中に取り上げた。次に全容量１ml中に0.5 μg/mlの最終
濃度となるまでDEAE- デキストランを加えた。細胞をこの溶液中に加え、20分イ
ンキュベートした。その後クロロキンを含む培地を加え、さらに30分インキュベ
ートした。細胞を遠心して洗浄した後、新鮮な培地で48時間プレートした。最後
に、細胞を収穫し、PBS で洗浄し、NP-40 含有バッファー中で溶解し、Promega
からのプロトコールに従って抽出物のルシフェラーゼ活性をアッセイした。
10．細胞下分画化のためのNP-40 細胞溶解手順
それぞれの時点で約2×107個の細胞を用いた。細胞を低速遠心でペレットとし
、PBS で洗浄した後 200μl のバッファーＡ（20mM Hepes，pH7.9，10mM NaCl，
1mM EDTA，1mM DTT およびプロテアーゼ阻害剤）中に再懸濁した。細胞を膨潤さ
せた後、５μl の0.5% NP-40を加え、10秒間穏やかにボルテックス混合した。遠
心後、核ペレットをバッファーＡで洗浄し、50μl のバッファーＣ(20mM Hepes,
pH7.9，0.4M NaCl，1mM EDTA，1mM DTT およびプロテアーゼ阻害剤)中に再懸濁
し、４℃で15分間振盪した。抽出物を遠心し、上清にグリセロールを加えて5%と
した。低速遠心後に得られた細胞質画分は100,000gで１時間遠心し、上清を100m
M NaClおよび5%グリセロールに調整した。
実施例２
ウサギ肺からのＩκＢ−βの精製および配列決定
ＩκＢ−βの精製は相当量のＮＦ−κＢ：ＩκＢ複合体を含むことが前もって
証明されたウサギ肺の細胞質ゾル抽出物から行った（Ghosh and Baltimore,前掲
; Ghosh ら，前掲）。この精製ではＮＦ−κＢ：ＩκＢ複合体と遊離のＩκＢタ
ンパク質とのクロマトグラフ特性の差異を利用する。精製プロトコールの初期工
程は部分的に精製されたＮＦ−κＢ：ＩκＢ（αおよびβ）複合体をもたらし、
次にこの複合体をデオキシコール酸(DOC)により解離させ、そしてアニオン交換
クロマトグラフィーを用いてＮＦ−κＢとＩκＢのプールに分離した（Ghosh an
d Baltimore,前掲）。ＩκＢ−αおよびＩκＢ−βイソフォームの混合物を追加
のクロマトグラフ工程(例えば、Mono Qアニオン交換、ヒドロキシルアパタイト
、Superose 12)にかけて高度に濃縮されたＩκＢ−β画分を得た。ＩκＢ−βを
精製する従来の試みでは、これらの工程をこれまで利用したことがなかった。精
製タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲルで分画化し、ニトロセルロース膜に
移行させた。膜上のタンパク質をPonceau S で染色し、濃く染まっているＩκＢ
−βバンドを切り出した。このタンパク質を膜上でトリプシンにより消化し、溶
出したペプチドを逆相HPLCカラムで分画化した。４種類のペプチドの配列を解析
したところ、そのうちの１つは混合物であったが、他の３つは純化されたペプチ
ドであった。
図１はウサギ肺の細胞質ゾルからのＩκＢ−βの精製を示す。図１（Ａ）は、
部分的に精製されたＩκＢ（αおよびβ）画分（Ghosh and Baltimore,前掲）を
もたらす精製スキームを示し、前記の画分はQ-Sepharose カラムから幅広のピー
クとして溶出される。図１（Ｂ）は、２つのＩκＢイソフォームがMono Qカラム
で分割され、より速く溶出するピークがＩκＢ−βを含有することを示す。Supe
rose 12 カラムからの精製ＩκＢ−β画分を銀染色で分析した。
実施例３
ＩκＢ−βｃＤＮＡの分子クローニングおよび配列決定
実施例２で同定されたペプチドの２つの配列は、それらがアンキリンリピート
から誘導されたものであることを明らかにした。これらのアンキリン関連ペプチ
ド配列に基づく縮重ＰＣＲプライマーを合成し、ウサギ肺ＲＮＡからのｃＤＮＡ
を鋳型としてＰＣＲを行うために使用した。ＰＣＲの産物をクローニングすると
160 bp断片が得られ、この断片は、配列決定した際に、プライマーの作成に用い
たペプチドをコードするのに必要な、完全な配列を含むことがわかった。この完
全な断片は２つのアンキリンリピートをほとんどコードしていた。ノーザンブロ
ット分析により、この160 bp断片はウサギ肺だけでなくマウスＢ細胞系のLyD9に
も存在する1.3 kbのｍＲＮＡに由来するものであることが示された。160 bp断片
をプローブとして用いてマウスLyD9 cDNA の0.7-1.6 kbサイズ分画化ライブラリ
ーをスクリーニングし、複数のクローンを得た。これらのクローンの配列は、部
分精製タンパク質画分のサイズ45kDより小さい推定分子量41kDのタンパク質をコ
ードし得る359 個のアミノ酸のオープンリーディングフレームを明らかにした。
しかしながら、推定pIが4.6 であることは、部分的に精製されたとされるタンパ
ク質のpIとよく一致している(Linkら，J．Biol．Chem.，267:239-246，1992)。
このｃＤＮＡ配列はＰＣＲ断片の全160 bp配列を含み、またクローニングに使用
されなかった第３のペプチド配列も含んでおり、かくして、このクローン化ｃＤ
ＮＡが精製されたＩκＢ−βタンパク質をコードしている可能性が最も高い。
図２はマウスＩκＢ−βｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列
を示す。図２（Ａ）はクローン“１５ｆ”の配列を示し、予想された359 アミノ
酸タンパク質も示す。下線を施した配列は推定上のカゼインキナーゼII部位を表
す。６つのアンキリンリピート配列は太字で示してある。ｃＤＮＡからの予想配
列に対応している精製ウサギタンパク質から得られたペプチド配列が示される。
図２（Ｂ）はＩκＢ−βと、ＩκＢファミリーの他のメンバーであるマウスＩκ
Ｂ−α、Ｂｃ１−３、ＩκＢ−γおよびショウジョウバエ(Drosophila)のカクタ
ス(cactus)とを比較した模式図である。陰影をつけたボックスは個々のアンキリ
ンリピートを表す。第３と第４のアンキリンリピート間の間隔はカクタスにおけ
るその配置と類似しており、他のタンパク質には見られない。
一次配列は、ＩκＢ−βがすべてのクローン化ＩκＢタンパク質の特徴となる
構成、つまり６つの連続したアンキリンリピートを含むことを示している（図２
Ｂ）(Beg and Baldwin，Mol．Cell．Biol.，7:2064-2070，1993; Gilmore and M
orin，Trends in Genetics，9:427-433，1993)。ＩκＢ−βと他のＩκＢタンパ
ク質との配列比較は、異なるＩκＢの同一位置のアンキリンリピート間の類似性
が同じＩκＢのリピート間の類似性よりも大きいことを明らかにする（Gilmore
and Morin,前掲）。ＩκＢ−βにおける第３と第４のアンキリンリピート間の比
較的広い間隔は、カクタス（ショウジョウバエのrel-相同体dorsalのＩκＢ様イ
ンヒビター）におけるその配置と類似しており、他のＩκＢタンパク質には見ら
れない（Geislerら，Cell，71:613-621，1992; Kidd，S.，Cell，71:623-635，1
992）。カルボキシ末端領域はプロリンとグルタミン酸とセリンの残基に富み、
このことはそれが迅速なタンパク質ターンオーバー（代謝回転）を合図すること
に関係している配列、PESTドメインでありうることを示唆している（Haskill ら
，Cell，65:1281-1289，1991）。ＩκＢ−βは、推定上のカゼインキナーゼII部
位を含めて、ＩκＢ−αと同じ数のセリン／トレオニン残基を含有するが、他の
イソフォーム中に存在しているタンパク質キナーゼＣリン酸化部位を欠いている
（Haskill ら，前掲）。ＩκＢ−βｍＲＮＡの構造は、それが非常に短い5'およ
び3'非翻訳領域を含んでいるという点でユニークである。特に、ＩκＢ−αのｍ
ＲＮＡと違って、3'末端にAUUUA 配列がないということは、ＩκＢ−βのｍＲＮ
Ａが安定していて速やかなターンオーバーを受けないことを示唆している（Capu
t ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83:1670-1674，1986；Davis ら，Science,
253:1268-1271，1991; Haskill ら，前掲; Shaw and Kamen，Cell，46:659-667
,1986）。
実施例４
ＩκＢ−βはｐ６５およびｃ−Ｒｅｌと相互作用する
ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質の特性付けを始めるために、ウサギ網
状赤血球の溶解物中でクローンをin vitroで翻訳させた。図３はin vivo で発現
させたin vitroでのＩκＢ−βの活性を示す。パネル３（Ａ）では、２つのＩκ
ＢをコードするｃＤＮＡをT7プロモーターの制御下でpCDNA3ベクターにクローニ
ングし、TNT ウサギ網状赤血球連結転写−翻訳系をプログラム化するために使用
した。翻訳されたタンパク質をSDS-PAGEにかけ、フルオログラフィーで視覚化し
た。図３（Ｂ）は、主にｐ５０：ｐ６５ヘテロダイマーである内因性ＮＦ−κＢ
を含む網状赤血球溶解物を示す。精製したウサギｐ５０：ｐ６５ ＮＦ−κＢの
添加はシグナルを増強して、その後のＩκＢ活性のアッセイを容易にする。TNT
溶解物には、“＋ＮＦ−κＢ”で示されるように精製ウサギＮＦ−κＢをアッセ
イのために補充した。アンチセンスＲＮＡを作製するため、5'末端で切断するBa
mH1 を用いてプラスミドを線状にし、T7 RNAポリメラーゼの代わりにSP6 RNA ポ
リメラーゼを用いた。２つの“センスＩκＢ−β”レーンは、それぞれ１μg と
２μg のプラスミドを用いてプログラム化された２つの翻訳を表す。標準EMSA上
でIgκＢプローブを用いて翻訳溶解物を分析した。図３（Ｃ）では、ＧＳＴ−Ｉ
κＢ融合タンパク質をグルタチオン−アガロースアフィニティーカラムで精製し
、精製したタンパク質をSDS-PAGEでクーマシーブルー染色を用いて分析した。図
３（Ｄ）はｐ５０、ｐ６５およびｃ−Ｒｅｌに対するＧＳＴ−ＩκＢタンパク質
の特異性を示す。ＧＳＴ−ＩκＢ融合タンパク質をFPLC Mono Q およびゲル濾過
クロマトグラフィーで部分的に精製した。部分精製したＧＳＴ−ＩκＢ融合タン
パク質それぞれ50ngを、６μl のin vitro翻訳し35Ｓ標識したｐ５０、ｐ６５お
よびｃ−Ｒｅｌと混合した。室温で５分インキュベーション後、グルタチオン−
アガロースの１：１スラリーを20μl 加え、２分インキュベートして遠心した。
アガロースビーズをPBS で洗浄し、SDS-サンプルバッファー中で５分煮沸し、溶
出したタンパク質をSDS-PAGEで分析した。ゲルを固定し、Amplify(Amersham)で
処理し、フルオログラフにかけた。インプットレーンは2.5μl の溶解物を含み
、一方ＧＳＴレーンは５μl の溶解物からの沈降タンパク質を表す。
オープンリーディングフレームは41kDa のタンパク質を予告するが、in vitro
翻訳タンパク質は見かけ分子量45kDa で移動し、これは精製タンパク質のサイズ
（図３Ａ）に非常に類似している。少量の合成45kDa タンパク質は、ウサギ網状
赤血球溶解物中の内因性ＮＦ−κＢ（主にｐ５０：ｐ６５である）のＤＮＡ結合
を効果的に抑制することができた（図３Ｂ）（Davisら，前掲）。翻訳ＩκＢ−
βも、溶解物に添加した際に、外因性ＮＦ−κＢ（ウサギ肺から精製したｐ５０
：
ｐ６５）のＤＮＡ結合を抑制することができた。しかし、ＩκＢ−βが特異的Ｒ
ｅｌタンパク質に対してＩκＢ−αとは異なった優先的性質を示すかどうかを調
べる系統的な定量分析を行うには、in vivo 翻訳ＩκＢ−βタンパク質の合成量
が十分でなかった。
ｐ６５およびｃ−Ｒｅｌに対するＩκＢ−αとＩκＢ−βの相対的親和性につ
いての独立した確証を得るために、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）に融合させた全長ＩκＢタンパク質を細菌に産生させ、Ｒｅｌタンパク質と
の結合能を試験した。ＧＳＴ−ＩκＢタンパク質を、in vitro翻訳し35Ｓ標識し
たＲｅｌタンパク質と混合した（図３Ｃ）。ＩκＢ−Ｒｅｌタンパク質複合体を
グルタチオン−アガロースを用いて沈殿させ、十分に洗浄し、結合したＲｅｌタ
ンパク質をSDS-PAGEにかけてフルオログラフィーで分析した。ＩκＢ−αとＩκ
Ｂ−βはどちらも効率的かつ特異的にｐ６５およびｃ−Ｒｅｌと相互作用して、
それらを沈降させたが、ｐ５０とは相互作用しなかった（図３Ｄ）。いずれの場
合にも、ｐ６５の方がｃ−Ｒｅｌよりも効率的に沈降した。
クローン化ｃＤＮＡが細胞内で活性であるか否かを調べるために、ＩκＢ−α
およびＩκＢ−βのｃＤＮＡをｐ５０、ｐ６５およびc−ＲｅｌのｃＤＮＡとと
もにＣＯＳ細胞に同時トランスフェクトした。図４はＩκＢ−βによるin vivo
でのＤＮＡ結合および転写活性化の抑制を示す。図４（Ａ）は、ＩκＢ−αおよ
びＩκＢ−βとの同時トランスフェクションの際の、ＣＯＳ細胞におけるトラン
スフェクトｐ５０：ｐ６５およびｐ５０：ｃ−ＲｅｌによるＤＮＡ結合の抑制を
示す。ＣＯＳ細胞をpCDNA3ベクター単独、ｐ５０＋ｐ６５（各３μｇ）、ｐ５０
＋ｃ−Ｒｅｌ(各３μｇ)、ｐ５０＋ｐ６５＋ＩκＢ−αまたはＩκＢ−β(３μg
＋３μg ＋５μg)、およびp５０＋ｃ−Ｒｅｌ＋ＩκＢ−αまたはＩκＢ−β(３
μg ＋３μg ＋５μg)によりトランスフェクトした。すべての場合に、トランス
フェクトしたＤＮＡの総量はベクターＤＮＡを添加することで11μgとした。Ｉ
κＢ含有レーンの残留複合体はこれら２種類のＩκＢによって抑制されないｐ５
０ホモダイマー複合体を含んでいた。図４（Ｂ）は、（Ａ）と類似したトランス
フェクションにルシフェラーゼリポーター構築物を含めることで測定された、転
写抑制を示す。ｐ６５およびｃ−Ｒｅｌの両方からルシフェラーゼ単位により
測定された転写量は相対100 単位に調整されたが、実際にはｃ−Ｒｅｌの方がｐ
６５よりもトランス活性化において効率的でなかった。
トランスフェクト細胞から調製された抽出物の分析は、ｐ６５およびｃ−Ｒｅ
ｌによるＤＮＡ結合がＩκＢイソフォームにより抑制されたが、ＩκＢ−βはｃ
−Ｒｅｌに対してあまり効率的でないようである（図４Ａ）。これらのトランス
フェクションに、２つのκＢ部位により駆動されるルシフェラーゼ遺伝子を含む
リポーター構築物を含めることにより、両ＩκＢイソフォームがｐ６５およびｃ
−Ｒｅｌにより媒介される転写を抑制できることがわかり、このことはゲル遅延
アッセイの結果と一致している（図４Ｂ）。
実施例５
ＩκＢ−βのｍＲＮＡはさまざまな組織で広く発現されている
ＩκＢ−βがいくつかの組織でユニークな機能を果たしているのかを調べるた
めに、２つのＩκＢイソフォームのｍＲＮＡの発現パターンをノーザンブロット
を使って分析した。マウスの脳、心臓、肝臓、肺、脾臓および精巣由来の全ＲＮ
Ａをニトロセルロース上にブロットし、ＩκＢ−βのｃＤＮＡを用いて釣り上げ
た。図５はＩκＢ−βｍＲＮＡの発現パターンを示す。異なるマウス組織におけ
るＩκＢ−αおよびＩκＢ−βの分布に関するノーザンブロットおよびリボヌク
レアーゼ保護分析。各レーンにつきそれぞれの組織(Clontech)から得られた全Ｒ
ＮＡ（ノーザンブロットの場合は25μg、リボヌクレアーゼ保護の場合は10μg）
を用いた。ノーザンブロットではＩκＢ−αおよびＩκＢ−βのｃＤＮＡを用い
て順次釣り上げた。リボヌクレアーゼ保護アッセイではＩκＢ−αおよびＩκＢ
−βのプローブを同一のＲＮＡサンプルでのハイブリダイゼーションのために使
用した。β−アクチンのために同一のサンプルとの別の反応を使用した。
試験した全組織において低いが様々なレベルでＩκＢ−βをコードする1.3kb
のｍＲＮＡが検出され、精巣では著しく高い発現レベルが観察された（図５）。
ＩκＢ−αｍＲＮＡについての同一ブロットの再釣り上げ(reprobing)から、同
様に約1.6kb のＩκＢ−αｍＲＮＡも種々の組織で発現されることが明らかにな
ったが、精巣では全く発現されず、脾臓では増大した発現が見られた。精巣での
ＩκＢ−βの増大した発現は、精巣の分化または機能におけるこのＩκＢの別の
役割を示すのかもしれない。観察された発現パターンはさらに、同一のＲＮＡサ
ンプルにおいてＩκＢ−αおよびＩκＢ−βのプローブを用いるリボヌクレアー
ゼ保護アッセイを実施することによっても証明され、これらの結果はノーザン分
析から得られた結果と同じであった（図５）。
実施例６ ＩκＢ−βはin vivo ではｐ６５およびｃ−Ｒｅｌとの複合体として存在する
ＩκＢ−βの調節をさらに詳しく調べるために、ＧＳＴ−ＩκＢ−β融合タン
パク質に対するウサギポリクローナル抗血清を誘導させた。図６はＩκＢ−βの
イムノブロットおよび免疫沈降分析を示す。図６（Ａ）では、改良NP-40 細胞溶
解プロトコールを用いて、種々の細胞系から細胞質および核抽出物を調製し、ウ
エスタン分析のために25μg の各抽出物を使用した。ウサギ肺からの異なる画分
は次第に純化されたクロマトグラフィー画分である。Superose 12 画分は配列決
定のために使用したサンプルと同じものである。最初にマウスＢ細胞画分とのイ
ムノブロットを用いてＩκＢ−βを検索し、次いでストリップし、アフィニティ
ー精製したＩκＢ−β抗体を用いて再検索した。図６（Ｂ）では、ＩκＢ−βに
対する抗血清および対応する免疫前血清を用いて、2×107個の代謝的に標識した
Jurkat細胞に対して免疫沈降を実施した。免疫血清でのみ出現するバンドが示さ
れる。NP-40 で中和した煮沸サンプルからの免疫沈降を他のサンプルと同様に実
施した。図６（Ｃ）では、図６（Ｂ）のごとく、比例して多量の免疫および免疫
前血清を用いて１×108個の未標識細胞に対して免疫沈降を実施した。その後免
疫沈降物をSDS-PAGEで分画化し、PVDF膜に電気泳動的に移行させ、ｐ６５、ｃ−
Ｒｅｌ、ＩκＢ−αおよびＩκＢ−βに対するウサギポリクローナル抗体を用い
てイムノブロットした。
種々の細胞からの細胞質ゾル抽出物とウサギ肺からの精製画分の両方のイムノ
ブロットにおいて、この抗血清は約45kDの１つの主要バンドを認識した（図６Ａ
）。検出されたタンパク質の大きさは精製したＩκＢ−βタンパク質の大きさと
同じであった。たいていの細胞では大部分のＩκＢ−βタンパク質が細胞質中
にあった（図６Ａ）。核中に存在する少量は抽出手順の人工産物(artifact)であ
る可能性があるが、これらの同一細胞中のＩκＢ−αタンパク質はもっぱら細胞
質ゾルに存在した。こうした実験からの予期せざる知見は、細胞中のＩκＢ−β
タンパク質のレベルが（精製した組換え細菌タンパク質の既知量に対する抗体の
力価を測定することにより、同等の親和力の抗体を使用して）ＩκＢ−αより多
くないにしても少なくとも等しいように思われることであり、以前に報告された
その豊富さの比較的低い推定量は精製中の大幅な減量のせいであるかもしれない
。細胞により多量のＩκＢ−βが含まれることは、ＩκＢ−αとＩκＢ−βがど
ちらもＮＦ−κＢ活性を調節するうえで主要な役割を果たしていることを示唆す
るだろう。
ＩκＢ−βタンパク質はヒト胎盤およびウサギ肺からｐ５０：ｐ６５との複合
体として精製された。それゆえ、このタンパク質は細胞中ではｐ５０：ｐ６５と
の複合体として存在しているように思われた(Davis ら，前掲; Ghosh and Balti
more,前掲; Linkら，前掲; Zabel and Baeuerle，Cell 61:255-265，1990)。上
記の実験は、ＩκＢ−βタンパク質がｐ６５ともｃ−Ｒｅｌとも等しく結合でき
ることを示した。したがって、ｐ６５とｃ−Ｒｅｌの両方を含むリンパ球様細胞
では、ＩκＢ−βは両Ｒｅｌタンパク質との複合体として存在しているはずであ
る。この仮説を試験するために、ＩκＢ−β抗血清とその対応する免疫前血清を
用いてJurkat細胞の抽出物に対して免疫沈降を実施した。免疫血清は約４０、４
６、６５、７０、１０５および１１０ｋＤのポリペプチドを共沈させ、これらは
それぞれＩκＢ−α、ＩκＢ−β、ｐ６５、ｃ−Ｒｅｌ、ＮＦ−κＢｐ１００お
よびＮＦ−κＢｐ１０５の大きさに類似していた（図６Ｂ）（約８０ｋＤの追加
のポリペプチドは既知のいずれのＲｅｌタンパク質にも対応しない）。ＩκＢ−
βは効率よく標識されず、しかもｐ５０および免疫グロブリンＨ鎖とオーバーラ
ップするので、それをこれらのゲルにおいて明確に解像できなかった。Jurkat細
胞およびWEHI 231細胞からＩκＢ−αを免疫沈降させた際にも同様のパターンが
観察された(Rice and Ernst，EMBO J.，12:4685-4695，1993)。ＳＤＳと一緒に
予め煮沸しNP-40 で中和した抽出物に対して実施した免疫沈降はｐ４０とＩκＢ
−βだけを含んでいて他のタンパク質を含んでいなかったが、このことはそれら
が細胞抽出物中でＩκＢ−βと非共有結合で会合していることを示す（図６Ｂ）
（ｐ４０はたぶん抗血清と交差反応したのだろう）。会合しているこれらのポリ
ペプチドが実際にＲｅｌファミリーのメンバーであることを証明するために、未
標識細胞抽出物に対して免疫沈降を実施し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで
分画化し、そしてｐ６５、ｃ−Ｒｅｌ、ＩκＢ−βおよびＩκＢ−αに対する抗
体を用いてイムノブロットを行った（図６Ｃ）。こうした実験は免疫沈降物中の
一次抗体を二次抗体で検出することにより制限されるので、免疫グロブリンバン
ド（２５、５０、１００および１５０ｋＤ）とオーバーラップするバンドは分析
され得ない。それゆえ、我々はこれらのイムノブロットを用いてｐ５０、ｐ５２
、ｐ１００およびｐ１０５がＩκＢ−βとともに共免疫沈降されるのかどうか判
定することができなかった。しかし、ＩκＢ−β抗血清がｐ６５およびｃ−Ｒｅ
ｌタンパク質を共免疫沈降させること、およびｐ４０タンパク質がＩκＢ−αで
はないことを確認することができた（図６Ｃ）。また、ＩκＢ−β抗血清を用い
て同じイムノブロットを試験することで、ＩκＢ−βそれ自体が免疫沈降される
ことが明らかにされた。免疫沈降前にＳＤＳと共に煮沸した抽出物を用いて同じ
実験を繰り返すことで、ＩκＢ−βのみが免疫沈降されることが示された。それ
ゆえ、これらの結果は、ｐ５０およびｐ５２（その有無を決定することはできな
かった）のほかに、ＩκＢ−βは細胞中でｐ６５、ｃ−Ｒｅｌおよび８０、１０
５、１１０ｋＤの他の３つのタンパク質との複合体として存在することを示す。
実施例７
ＮＦ−κＢ活性の誘導はＩκＢ−βｍＲＮＡレベルの
アップレギュレーションをもたらさない
ＩκＢ−αおよびＩκＢ−βのｍＲＮＡのレベルを、マウスＢ細胞の異なる発
生段階を提示する細胞系、いくつかの細胞型の中で、特にＮＦ−κＢが構成的に
活性である成熟Ｂ細胞で試験した(Sen and Baltimore，Cell，47:921-928，1986
)。図７は、ＩκＢ−βのｍＲＮＡレベルがＮＦ−κＢにより調節されないこと
を示す。図７（Ａ）は、マウスＢ細胞系のHAFTL（プロＢ）、PD 31（プレＢ）、
WEHI 231（早期成熟Ｂ）および S 194（形質細胞）におけるＩκＢ−βおよびＩ
κＢ−αの発現を示す。それぞれの細胞系から調製した全ＲＮＡ 10 μg を、Ｉ
κＢ−α、ＩκＢ−βおよび5-アクチンのアンチセンスプローブを用いるリボヌ
クレアーゼ保護アッセイに使用した。アクチンプローブをより低い比活性へと標
識することにより同一ゲル上での露光を可能にした。図７（Ｂ）は、PD31プレＢ
細胞を２μg/mlのＬＰＳで４または12時間刺激し、25 ng/mlのＰＭＡで８時間刺
激したことを示す。その後細胞を回収し、グアニジウムチオシアネート−酸フェ
ノール抽出法を用いて全ＲＮＡを調製した。各レーンで20μg のＲＮＡを分析し
、同じブロットをＩκＢ−β、β−アクチンおよびＩκＢ−αで順次検索した。
ＩκＢ−αのｍＲＮＡの発現は成熟Ｂ細胞では非常に増加する。というのは、
これらの細胞の核ＮＦ−κＢが自己調節的に、たぶんＩκＢ−αプロモーター中
に存在するＮＦ−κＢ部位を介して、この遺伝子の発現をアップレギュレートす
るからである（図７Ａ）(de Martinら，EMBO J.，12:2773-2779，1993; Le Bail
ら，EMBO J.，12:5043-5049，1993)。対照的に、ＩκＢ−βのｍＲＮＡのレベル
は成熟Ｂ細胞において顕著に変化しておらず、このことはその発現が核ＮＦ−κ
Ｂによるアップレギュレーションを受けていないことを示唆する（図７Ａ）。Ｉ
κＢ−βのｍＲＮＡの発現が実際に核ＮＦ−κＢとは無関係であることを証明す
るために、プレＢ細胞をＰＭＡまたはＬＰＳで処理し、ＩκＢ−αとＩκＢ−β
のｍＲＮＡレベルをノーザン分析により測定した。ＬＰＳによる誘導の４および
12時間後、ＩκＢ−αのｍＲＮＡレベルの著しい増加が見られたが、ＩκＢ−β
のｍＲＮＡレベルは相対的に未変化のままであった（図７Ｂ）。ＩκＢ−βのｍ
ＲＮＡの3'非翻訳領域はAUUUA配列（この配列は速やかなＲＮＡターンオーバー
を知らせるもので、ＩκＢ−αをコードする転写産物中に存在する）を含まない
ので、Ｉκ−βのｍＲＮＡは長い半減期をもつと思われる（Caput ら，前掲; Ha
skillら，前掲; Shaw and Kamen，前掲）。したがって、これらの結果は、Ｉκ
Ｂ−αと違って、ＩκＢ−βは迅速な応答の調節には利用されないが、より永続
的な変化をもたらす持続的シグナルへの応答に利用されうることを示唆している
。
実施例８
ＩκＢ−αおよびＩκＢ−βに及ぼす
ＬＰＳ、ＩＬ−１、ＰＭＡおよびＴＮＦ−αの影響
ＮＦ−κＢの活性化後のＩκＢ−βの運命を調べるために、プレＢ細胞をＬＰ
ＳまたはＩＬ−１で処理し、細胞下画分をイムノブロッティングとゲル遅延アッ
セイで分析した。図８はＬＰＳ、ＩＬ−１、ＰＭＡおよびＴＮＦ−αがＩκＢ−
αとＩκＢ−βの示差的分解を引き起こすことを示す。70Ｚ/3細胞（ＬＰＳ、Ｉ
Ｌ−１、ＰＭＡのとき）およびJurkat細胞（ＴＮＦ−αのとき）を異なる誘導物
質でさまざまな時間にわたり処理した。ゲル遅延アッセイには８μg の核抽出物
を使用し、一方イムノブロッティングには25μg の細胞質抽出物を使用した。図
８（Ａ）では、70Ｚ/3細胞を10μg/mlのＬＰＳか0.05ユニット/ml のＩＬ−１の
いずれかを用いて表示時間にわたり刺激した。120 分および240 分のＬＰＳ刺激
後にＩκＢ−β抗血清を用いるイムノブロット上に見られたバンドは、それがわ
ずかに速く移動する比較的早い時点で見られたバンドと異なっている。しかしな
がら、このバンドはさらなる刺激（６および２４時間）後には消失する。ＩＬ−
１処理サンプルのＩκＢ−βイムノブロットには、ぴったりと間隔をおいて並ん
だ２つのタンパク質を見分けることができる。図８（Ｂ）では、Jurkat細胞をＴ
ＮＦ−α(１ng/ml)で刺激し、70Ｚ/3細胞を25 ng/mlのＰＭＡで処理した。図８
（Ｃ）は、ＬＰＳまたはＰＭＡで処理した細胞における、ＩκＢ−αとＩκＢ−
βの分解とＮＦ−κＢの活性化との相関関係を示す模式図である。曲線は例示の
ためであって、定量的なものではない。
イムノブロッティング分析は、両方の誘導物質がともにＩκＢ−αタンパク質
（刺激後約30分で速やかに分解される）を低下させるが、このタンパク質は２時
間以内に再出現することを明らかにした（図８Ａ）。これに対して、両誘導物質
により45kDa のＩκＢ−βバンドは早い時点（約30分）であまり影響されなかっ
たが、その後ＩκＢ−βレベルは減少し、２時間までにほとんど消失した（図８
Ａ）。刺激期間を６時間および24時間に増加させても全体的なパターンは変わら
なかった。ＩκＢ−αタンパク質のレベルは未刺激対照と類似していたが、Ｉκ
Ｂ−βのレベルは非常に減少した。この実験は、ＬＰＳおよびＩＬ−１による刺
激後のＩκＢ−βのパターンの微妙な差異を浮かび上がらせた。持続的なＬＰＳ
刺激はＩκＢ−βタンパク質を完全に消失させたが、持続的なＩＬ−１刺激はＩ
κＢ−βレベルの劇的な低下を引き起こしたものの、24時間の刺激後でさえも若
干の残留ＩκＢ−βを検出することができた。イムノブロットでは、ＩκＢ−β
抗体がぴったりと間隔をおいて並んだ二重バンドを異なる細胞において時々検出
し、刺激後に上方のバンドは優先的に消失した（図８Ａに見られる）。上方のバ
ンドは分解の標的とされるリン酸化形態を表す。ゲル遅延アッセイは、核ＮＦ−
κＢのＤＮＡ結合活性がＩκＢ−αが失われるやいなや出現し、たとえ新たに合
成されたＩκＢ−αが蓄積されて１時間以内に再出現したとしても、アッセイの
間中（約24時間）検出され続けることを示した（図８Ａ）。したがって、より遅
い時点で検出された核ＮＦ−κＢはＩκＢ−β複合体のために放出されるのかも
しれない。
ＰＭＡによる70Ｚ/3細胞の処理またはＴＮＦ−αによるJurkat細胞の処理は、
ＮＦ−κＢ活性の迅速なしかし一過性の誘導をもたらす。典型的には、この活性
は30分以内でピークとなり、その後徐々に衰退して４〜６時間以内で基底線レベ
ルに達する。かくして、これはＮＦ−κＢのＬＰＳ誘導（より遅い速度でもって
増加するが、その後誘導物質の継続的存在下で36時間以上持続する）とは異なる
。ＬＰＳによるＮＦ−κＢの持続的誘導はＩκＢ−αとＩκＢ−βの両方の逐次
的分解により達成されたので、我々はＰＭＡまたはＴＮＦ−αによる一過性誘導
がＩκＢ−α複合体にのみ影響を及ぼすか否かを調べようとした。この可能性を
試験するため、70Ｚ/3細胞をＰＭＡで処理し、Jurkat細胞をＴＮＦ−αで処理し
た。その後、これらの細胞から得られた細胞下抽出物をイムノブロッティングと
ゲル遅延アッセイで分析した。ＮＦ−κＢの活性化および衰退の速度は以前に報
告されたものと似通っていた。すなわち、約30分でピークとなり、その後４時間
までシグナルの顕著な減少が見られた（図８Ｂ）。細胞質画分のイムノブロット
は、両方の誘導物質が30分までにＩκＢ−αタンパク質を消失させ、その後１時
間までにそれが合成されて再出現することを示した。しかしながら、両方の誘導
物質とも、ＩκＢ−βに対して何の影響も及ぼさなかった。それゆえ、このこと
は、ＩκＢ−βの分解がＮＦ−κＢの持続的活性化に関与していることを示す。
さらに、これらの結果は、２つのＩκＢの活性化が別個のシグナル伝達経路を必
要とすることを強く示唆した。２つのＩκＢイソフォームの示差的分解を図８Ｃ
に模
式的に示してある。
実施例９
ＴＰＣＫおよびＰＤＴＣはＩκＢ−βの分解をブロックする
異なるシグナル伝達経路が２つのＩκＢに向けられるのか否かを調べるため、
多数のインヒビターを試験し、ＩκＢ−αおよびＩκＢ−βのＬＰＳ誘導分解に
及ぼすそれらインヒビターの影響を検討した。細胞刺激後のＩκＢ−αの分解は
タンパク質合成インヒビターであるシクロヘキシミド(cycloheximide)により影
響されず、このことは新しいタンパク質合成が必要とされないことを示唆する(H
enkelら，Nature，365:82-85，1993; Sunら，Science，259:1912-1915，1993)。
ＩκＢ−βの活性化は別の経路を介して起こりうるので、シクロヘキシミドがＩ
κＢ−βの分解に影響を及ぼすかを調べた。70Ｚ/3細胞を25μg/ml（これらの細
胞の全タンパク質合成をブロックする濃度）のシクロヘキシミドで30分間予備処
理し、その後ＬＰＳでそれらを刺激した。ゲル遅延アッセイは、シクロヘキシミ
ド自体がいくらかのＮＦ−κＢ活性を誘導したが、これらの細胞におけるＮＦ−
κＢ活性化のパターンを変えないことを示した（図９）。予測されるように、シ
クロヘキシミド処理細胞から消失したＩκＢ−αは再び現れることはなかった。
なぜなら、新たなタンパク質合成が起こっていなかったからである。ＩκＢ−β
も非シクロヘキシミド処理細胞と同様の速度で消失し、このことは両ＩκＢの活
性化がどのような新しいタンパク質合成をも必要としない別個のシグナル伝達経
路を介して起こることを示唆している。
次にキモトリプシンインヒビターＴＰＣＫを試験した。というのは、それがＮ
Ｆ−κＢの活性化およびすべての既知の誘導物質によるＩκＢ−αの付随的消失
をブロックすることが実証され、ＴＰＣＫがＩκＢ−α分解に関与するプロテア
ーゼを阻害するという示唆へ導いたからである（Henkelら，前掲; Mellitisら，
Nucl．Acids Res.，21:5059-5066，1993）。しかしながら、最近の研究は、ＴＰ
ＣＫがＩκＢに影響を与えるシグナル伝達経路の共通のエレメントを妨害するこ
とによってＮＦ−κＢ活性化を抑制するということを示唆する（Palombellaら，
Cell，78:773-785，1994）。ＩκＢ−β分解に及ぼすＴＰＣＫの影響を調べるた
め、70Ｚ/3細胞をＴＰＣＫと共に30分プレインキュベートし、続いてＬＰＳでさ
まざまな時間処理した（図９）。誘導細胞の核抽出物に対するゲル遅延アッセイ
は、25μM のＴＰＣＫがＮＦ−κＢのＬＰＳ誘導を完全にブロックすることを示
した。処理細胞の細胞質抽出物に対するイムノブロット分析は、ＩκＢ−αとＩ
κＢ−βのどちらもＴＰＣＫの存在下で影響されないことを明らかにしたが、こ
れは誘導ＮＦ−κＢ活性の欠如と一致した結果である。同様の結果がＰＤＴＣを
用いたときにも見られた。ＰＤＴＣは、酸化的フリーラジカルを必要とする今の
ところまだ確認されていないメカニズムを介して、種々の誘導物質に応答してＮ
Ｆ−κＢの活性化をブロックする抗酸化剤である（Schreck ら，EMBO J.，10:22
47-2258，1991; Sunら，前掲）。ＬＰＳで処理した70Ｚ/3細胞では、25μM のＰ
ＤＴＣがゲル遅延アッセイで試験したときのＮＦ−κＢの誘導と、イムノブロッ
ト分析で試験したときのＩκＢ−αおよびＩκＢ−βの分解を、どちらもほぼ完
全にブロックした（図９）。かくして、ＩκＢ−αおよびＩκＢ−β複合体の活
性化をもたらす経路は異なるけれども、それらはＴＰＣＫとＰＤＴＣに感受性で
あるいくつかの共通のステップを必要とする。要約
本発明は、哺乳動物細胞におけるＩκＢの第２の主要なイソフォームのクロー
ニングおよび特性付けを提供する。以前の報告と対照的に、ＩκＢ−αおよびＩ
κＢ−βは同様の抑制活性を示すことがわかり、細胞内では同一のタンパク質を
含有する複合体として存在している (Kerrら，Genes Dev.，6:2352-2363，1992;
Kerrら，Genes Dev.，5:1464-1476，1991)。２つのＩκＢイソフォーム間の主
な相違点は、ＮＦ−κＢ活性の異なる誘導物質に対するそれらの応答にある。あ
る種の誘導物質はＩκＢ−α複合体にのみ作用することにより一過性の活性化を
引き出し、一方、他の誘導物質は両方のＩκＢ−αおよびＩκＢ−β複合体に作
用することで、より持続的な変化をもたらす。ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＰＭＡ、
ＬＰＳを含めて、大部分の誘導物質はリン酸化を介する細胞質ＮＦ−κＢ複合体
の迅速な解離と、これに続くＩκＢ−αタンパク質の分解を引き起こす（Begら
，前掲; Brown ら，前掲; Henkelら，Nature，365:82-85，1993; Mellitisら，
前
掲; Palombellaら，前掲; Scott ら，前掲;Sun ら，前掲）。ＩκＢ−αと会合
したＲｅｌ複合体は遊離後に核に移動して遺伝子発現を活性化する。核ＮＦ−κ
Ｂの出現の反応速度はＩκＢ−αの消失と相関しており、このことはＩκＢ−α
の分解がＲｅｌ複合体（これにＩκＢ−αが結合している）の放出の前提条件で
あることを強く示唆している。しかしながら、ＮＦ−κＢの活性化はまた、たぶ
んＩκＢ−αプロモーター中のＮＦ−κＢ部位を介する、ＩκＢ−αのｍＲＮＡ
レベルのアップレギュレーションをもたらす（de Martinら，前掲; Le Bail ら
，前掲）。続いてＩκＢ−αタンパク質が蓄積し、すぐに（約１時間）未刺激細
胞のレベルに達する。新たに合成されたＩκＢ−αの免疫沈降は、それがＮＦ−
κＢと複合体を形成していることを示す（Ｓun ら，前掲）。それゆえ、ＮＦ−
κＢの活性化は一時的に起こる。なぜならば、新たに合成されたＩκＢ−αタン
パク質が自己調節フィードバックループのために持続的活性化をブロックするか
らである。誘導物質がその環境に短時間存在するとき、その系は速やかに未刺激
状態に戻る。
このモデルはＮＦ−κＢの一時的誘導を明らかにするが、細胞をＬＰＳで刺激
したとき、核ＮＦ−κＢがどのようにして36時間も持続しうるのかを説明できな
かった。というのは、ＩκＢ−αの分解およびもとのレベルへの再合成が初めの
２時間以内に起こるからである。本発明は、ＩκＢ−βが約１時間後に失われだ
し、ＬＰＳが存在している間は現れないことを示す。これはもっともらしい説明
を提供する。なぜならば、ＩκＢ−αと違って、ＩκＢ−βから放出されたＮＦ
−κＢは自己調節フィードバック機構によってダウンレギュレートされないとい
うことを、ＩκＢ−βのｍＲＮＡの転写を誘導する長命の核ＮＦ−κＢが示唆す
るからである。それゆえ、ＮＦ−κＢの活性化は、ＬＰＳのような持続的な誘導
物質による刺激で、ＮＦ−κＢが最初にＩκＢ−α複合体から放出され、次にＩ
κＢ−β複合体から放出されるという新規な二相様式で起こるのだろう。
本発明の目下好適な実施態様に関して説明してきたが、本発明の精神から逸脱
することなく、さまざまな変更を行い得ることを理解すべきである。したがって
、本発明は次の請求の範囲によってのみ制限されるものである。
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(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＤＵ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Ｃ０７Ｋ 14/47 33/566
16/18 Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹ
33/53 ＡＤＳ
33/566 ＡＢＢ
// Ｃ１２Ｐ 21/08 ＡＤＺ