JP3009381B2 - 成熟ヒト インターロイキン１ - Google Patents
成熟ヒト インターロイキン１Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はインターロイキン１
（以下「ＩＬ−１」と称する）に関する。より詳しく
は、精製されたＩＬ−１、ＩＬ−１の等質状態への精製
方法、並らびに精製されたＩＬ−１のアミノ酸配列から
得られる合成オリゴヌクレオチドプローブを使用してＩ
Ｌ−１の遺伝子をクローニングしてＩＬ−１メッセンジ
ャーリボ核酸（「ｍＲＮＡ」）から合成される相補的デ
オキシリボ核酸（「ｃＤＮＡ」）ライブラリーをスクリ
ーニングすること、およびスクリーニングされたＩＬ−
１遺伝子の特性づけに関するものである。 【０００２】 【従来の技術】従来文献において「リンパ球活性化因
子」即ち「ＬＡＦ」として知られているＩＬ−１はマク
ロファージにより免疫応答を行いながら産生されるホル
モンである。この蛋白質因子は広範囲の免疫学的及び非
−免疫学的応答を支配する。例えば、ＩＬ−１は、内因
性或いは白血球発熱物質、Ｂ−細胞活性化因子（ＢＡ
Ｆ）、表皮胸腺細胞活性化因子（ＥＴＡＦ）、白血球内
因性メディエータ（ＬＥＭ）、慢性関節リューマチにお
ける骨吸収因子及び各種のその他の活性として称されて
いる活性を仲介するものと考えられている。その様なも
のとして、ＩＬ−１は上記活性を含むものとして本発明
において定義される免疫応答の治療の仲介を行うものと
して有望である。 【０００３】研究者はこれまでにＩＬ−１の多くの生物
学的特性を明らかにしてきたが、しかし、このホルモン
の化学的性質はよく理解されていない。今日まで、これ
は少なくとも部分的に必要な研究を行うために十分な量
の精製された形態でのＩＬ−１が利用可能でなかったこ
とにより妨げられてきたものである。 【０００４】過去において、ヒト及びネズミ源から得ら
れたＩＬ−１を精製し、部分的に特性評価を行う試みが
なされている。例えばマイゼル［Ｍｉｚｅｌ、１２２
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１６７−２１７２（１９７
９）］はマクロファージ細胞系統Ｐ３８８Ｄ1からのネ
ズミＩＬ−１の産生を報告している。培養液からのＩＬ
−１が硫酸アンモニウム沈殿、ジエチルアミノエチル
（「ＤＥＡＥ」）セルロースカラムクロマトグラフィ
ー、限外濾過及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００カラム
クロマトグラフィーに付された。得られた活性画分は１
２，０００〜１６，０００ダルトンの範囲の分子量を有
することが判明した。ポリアクリルアミドゲル中におけ
る等電点電気泳動によりＩＬ−１のｐＩは５．０〜５．
４の範囲にあることが判明した。 【０００５】引き続く報告において、マイゼル等［Ｍｉ
ｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，１２６ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
８３４〜８３７（１９８１）］は、上掲のマイゼエルの
文献において使用された同一のＰ３８８Ｄ1細胞系統か
らのＩＬ−１を硫酸アンモニウム沈殿、フェニルセファ
ロースクロマトグラフィー、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ
５４ゲル濾過クロマトグラフィー及び調整用平坦−床Ｉ
ＥＦにより「見かけ上の等質状態」まで精製することを
論じている。得られたＩＬ−１は約４．９〜５．１のｐ
Ｉ及び約１４，０００ダルトンの分子量を有することが
判明した。 【０００６】ブライデン等［Ｂｌｙｄｅｍ ｅｔ ａ
ｌ．，１１８ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１６３１−１６３８
（１９７７）］はＳｅｌｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００カラ
ムクロマトグラフィーによりヒトの末梢血液白血球から
調製されたＩＬ−１の濃縮方法を開示した。この方法は
粗製ＩＬ−１の４〜５倍の濃度が得られると報告され
た。粗製ＩＬ−１の調製の際に使用された血清からアル
ブミンを除去するためにＤＥＡＥ−Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａ
アニオン交換クロマトグラフィーが使用された。次いで
集められた活性画分がヒドロキシアパタイトカラムに吸
着され、次いでＣＭ−Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａカチオン交換
樹脂に適用された。これらの研究者はこれらの操作によ
り約２０％の最初のＩＬ−１が回収されたと報告されて
いる。得られたＩＬ−１は約１３，０００ダルトンの分
子量及び約６．８〜７．２のｐＩを有することが判明し
た。 【０００７】トガワ等［Ｔｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，
１２２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１２〜２１１８（１
９７９）］によりヒト白血球から調製された粗製ＩＬ−
１を先ず膜濾過に付し、次いでＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−１
００クロマトグラフィーカラムにかけたところ、これは
２個の主たる活性ピークを示し、その一つは１２，００
０〜２２，０００ダルトンの範囲にあるピークをもう一
つは約５０，０００〜７０，０００ダルトンの範囲のピ
ークを示した。低分子量領域の活性画分をプールし、次
いで青色Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム、ＤＥＡＥ−セルロ
ースイオン交換クロマトグラフィーカラム及びヒドロキ
シアパタイトクロマトグラフィーカラムにかけた。トガ
ワ等はこれらの操作の各々から得られる低分子量ＩＬ−
１活性が２％のヒト血清で戻され、濃縮され、及びＢｅ
ｏ−Ｇｅｌ Ｐ−１００上で再クロマトグラフを行なわ
れると相当な部分の高分子量活性が出現することを発見
した。 【０００８】ラッハマン［Ｌａｃｈｍａｎ，４２ Ｆｅ
ｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅ−ｄｉｎｇｓ ２６３
９−２６４５（１９８３）］は、急性単核細胞白血病或
いは急性骨髄性単核白血病患者から得られた末梢血液単
核細胞或いは白血病細胞からＩＬ−１を調製することを
報告した、殆んどの血清蛋白質から低分子量活性を分離
するために中空糸透過濾過及び限外濾過が使用された。
この低分子量活性はアンホリン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）
及びショ糖勾配中におけるＩＥＦに付された。この方法
によりＩＬ−１活性は約６．８〜７．２のｐＩ及び約１
１，０００ダルトンの分子量を有することが判明した。
ラッハマンは上記方法からのＩＬ−１活性の全体回収率
は悪く、約４％の範囲であると報告した。 【０００９】適量の均質なヒトＩＬ−１の利用可能性は
関節炎及びエリテマトーデスなどの自動免疫障害の研究
及び可能性のある治療において貴重であり得る。又、こ
れまでに利用可能であったよりもより純度が高く且つ多
量のヒトＩＬ−１は首尾よく傷及び火傷の治癒を達成す
るために有用となり得るものである。 【００１０】比較的多量の均質なヒトＩＬ−１を提供す
るための潜在的な方法は組み換えＤＮＡ技術によるもの
である。組み換えＤＮＡ技術は、蛋白質をコードする遺
伝子が一度単離され、且つ同定されると所望の蛋白質を
経済的に製造するために開発されてきた。その様な蛋白
質製造のための組み換えＤＮＡ技術の説明はＳｃｉｅｎ
ｃｅ誌の１９６巻（１９７７年４月）の編集及び賛助論
文に示されている。しかしながら、この文献に論じられ
ている組み換えＤＮＡ技術を利用するためにはヒトＩＬ
−１をコードする遺伝子を先ず単離しなければならな
い。 【００１１】 【発明が解決しようとする課題】本発明はＩＬ−１、ヒ
トＩＬ−１の等質状態までの精製、及び等質ＩＬ−１の
アミノ酸組成及び部分的アミノ酸配列の決定に関するも
のである。本発明に従い、ＩＬ−１の粗製調製物をイオ
ン交換クロマトグラフィーとアフィニティークロマトグ
ラフィー方法との組み合わせにより精製した。この精製
方法のアフィニティークロマトグラフィー部分は不溶性
マトリックスに結合した染料リガンドを利用した。従来
技術に基づいて、同一の精製方法は他の哺乳動物種、例
えばネズミ、ウシ、あるいはブタのＩＬ−１からのＩＬ
−１に対して首尾よく使用することが出来るものと思わ
れる。 【００１２】一度等質状態にまで精製されると、ＩＬ−
１分子のアミノ酸組成及び配列が分析された。分子のア
ミノ酸組成はアミノ酸アナライザーを使用して確認され
た。ＩＬ−１分子のＮ−末端部分のアミノ酸配列は、直
接エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解技術により、又、最初に
分子を分別し、高圧液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬ
Ｃ」）により断片を分離し、次いでＩＬ−１ペプチドを
含有するＨＰＬＣ画分をエドマン分解法により分析する
ことにより求めた。 【００１３】本発明の更に別の側面に従えば、ヒトＩＬ
−１をコードする遺伝子がｃＤＮＡライブラリーから上
記の如く求めたヒトＩＬ−１のアミノ酸配列の部分に対
応する合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて単離さ
れた。全ヒトＲＮＡは比較的高割合のＩＬ−１を産生す
ると考えられた細胞から抽出された。ポリアデニル化ｍ
ＲＮＡは全ＲＮＡ抽出物から単離された。ｃＤＮＡライ
ブラリーはサイズ分離ポリアデニル化ｍＲＮＡの逆転写
酵素による逆転写によって構成された。ＤＮＡはＤＮＡ
ポリメラーゼＩを用いて二本鎖にし、適当なクローニン
グベクター中に挿入した。得られた組み換えクローニン
グベクターを使用して適当な宿主を形質転換させた。 【００１４】形質転換された宿主を同定し、プールに組
み分けした。これらのプールから調製されたプラスミド
ＤＮＡを放射線標識されたオリゴヌクレオチドプローブ
とハイブリッド化した。プローブに対して陽性の信号を
与えたクローンのプールを同定し、次いで推定されたプ
ールを小分けし、ハイブリッド化スクリーニングを繰返
した。この操作により単一の形質転換体を最終的に同定
した。この形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、
制限エンドヌクレアーゼ消化により特徴付けを行った。
このＩＬ−１遺伝子の配列を決定して、その核酸及びア
ミノ酸組成を確立した。又ＩＬ−１遺伝子をＥ．ｃｏｌ
ｉ／酵母細胞系中でクローニングして成熟ＩＬ−１を発
現させ、次いで生物学的アッセイを行って発現された蛋
白質生成物がＩＬ−１であることを確認した。本願明細
書において「アリル変異体」とは、天然に存在する対立
遺伝子を意味し、人工的に修飾した遺伝子を含まない。 【００１５】 【課題を解決するための手段】ＩＬ−１の調製 ＩＬ−１の粗製調製物は末梢血液白血球から調製され
る。白血球は全血から周知の技術、例えば所定量のＦｉ
ｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ溶液に対する遠心分離などの
技術により分離される。血液から取り出された白血球は
ＩＬ−１分泌を誘発する適当な刺激剤を含有する培養培
地中においてｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。適当な培
養期間後に上澄液を遠心分離により取得し、使用される
まで貯蔵される。 【００１６】全血から取り出される白血球から得る代り
にむしろＩＬ−１は又任意の単核細胞に富んだ源から得
られる単核細胞から調製することが出来る。その様な単
核細胞源としては、単核白血病性脾臓細胞、リンパ細胞
及び肺胞マクロファージなどが挙げられる。 【００１７】末梢血液白血球を培養するために使用され
る培地は市販の培地、例えばイーグルの最小必須培地
（「ＭＥＭ」）或いはＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅ
ｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（「ＲＰＭＩ」）培
地により構成することが出来る。個々に或いは組み合わ
せて培養培地中に添加することのできる添加剤として
は、グルタミン、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びゲンタマイシ
ン、ペニシリン、ストレプトマイシンなどの各種抗生物
質が挙げられる。過去においては、血清も又通常添加剤
として使用されていた。しかしながら、本発明者等は、
本発明の方法においては血清が培養液中に使用されない
場合に、培養上澄液からのＩＬ−１の精製が容易に行わ
れることを見出した。血清を使用しない場合には、培養
液中に産生されるＩＬ−１の量が３〜４倍減少するが、
血清がないと又産生される全蛋白質が１００倍減少し、
それはＩＬ−１の精製に含まれる複雑さを少なくするも
のである。 【００１８】本発明について使用される好ましい刺激剤
としては、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、或いはエシェ
リヒア・コリ（「Ｅ．ｃｏｌｉ」，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）から抽出されたリポポリサッカライド
（「ＬＰＳ」）が挙げられる。更に、ホルボールエステ
ル類、例えばホルボールミリステート１３−アセテート
を刺激剤として使用することが出来る。 【００１９】白血球を培養してＩＬ−１の分泌を誘発す
る方法は各種環境条件下において行うことが出来る。し
かしながら、好ましくは約３５〜３８℃の温度範囲にお
いて空気中約５〜１０％のＣＯ2の加湿化雰囲気内にお
いて維持されるのがよい。末梢血液白血球を活性化剤に
より刺激することにより放出されるＩＬ−１の量は時間
と共に変化する。本発明者等はＩＬ−１発現の最適割合
は刺激後約２４〜７２時間において到達することを見出
した。 【００２０】アッセイ／分析 本発明において、ＩＬ−１活性度及び本発明の精製、ク
ローニング及びＩＬ−１発現操作の際の試料の蛋白質含
量を追跡するために胸腺細胞増殖アッセイ、ＩＬ−１転
換アッセイ及び蛋白質アッセイが使用される。又、精製
操作の際のＩＬ−１活性を分析するためにドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ」）及び二次元ゲル電気泳動が使用され
る。 【００２１】胸腺細胞増殖アッセイ このアッセイはＩＬ−１の試料のＣＤ−１マウスに由来
する胸腺細胞の増殖を誘発する能力を確認するものであ
る。このアッセイにおいて、１０〜１２週令のＣＤ−１
マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎ
ｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，メリーランド州、ウィ
ルミントン）から得られた約１×１０6個の胸腺細胞を
３倍逐次希釈のＩＬ−１含有試料の存在下において丸底
マイクロプレートウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｐｌａｓｔ
ｉｃｓ，ニューヨーク州、コーニング）に植付ける。胸
腺細胞は、５０単位／ｍｌ（「Ｕ／ｍｌ」）のペニシリ
ン、５０マイクログラム／ｍｌ（「μｇ／ｍｌ」）のス
トレプトマイシン、２ミリモル（「ｍＭ」）のグルタミ
ン、０．２ｍＭのゲンタマイシン、１０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液、（一緒に「補給ＭＥＭ」と称する）、ｐＨ
７．４を３％ｖ／ｖヒト血清及び１０-5モル（「Ｍ」）
２−メルカプトエタノールと共に含む１５０マイクロリ
ットル（「μｌ」）のＭＥＭ中において培養される。試
料は空気中５％ＣＯ2の雰囲気内で３７℃において７２
時間培養される。その後、培養物を約４時間０．５マイ
クロキューリ（「μＣｉ」）のトリチウム化したチモジ
ン（「3Ｈ−Ｔｄｒ」）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎ
ｕｃｌｅａｒ、マサチューセッツ州、ボストン、２Ｃｉ
／ｍＭ特異活性）でパルス処理した。その後培養物を例
えば多重自動化試料採取器を用いてガラス繊維フィルタ
ー片上に採取する。3Ｈ−Ｔｄｒの導入は次いで液体シ
ンチレーション計数により測定される。この操作の詳細
はギリス等により開示されている［Ｇｉｌｌｉｓ ｅｔ
ａｌ．，１２０Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０２７（１９
７８）］。 【００２２】この胸腺細胞増殖アッセイ方法により、Ｉ
Ｌ−１の存在下において培養されたＣＤ−１胸腺細胞の
みが照射線量に応じて3Ｈ−Ｔｄｒを取り込む。ＩＬ−
１の不存在下に培養されたＣＤ−１細胞はバックグラウ
ンド水準の3Ｈ−Ｔｄｒを導入するにすぎない。ＩＬ−
１活性は、上掲のギリス等によりインターロイキン−２
活性を求めるために使用された操作と同様にして3Ｈ−
Ｔｄｒ導入データの線状部分から計算される。ＩＬ−１
活性の単位は実験室の標準に対比して胸腺細胞3Ｈ−Ｔ
ｄｒ導入の５０％を発生する試料の希釈率の逆数として
求められる。例えば、ある試料が最大胸腺細胞3Ｈ−Ｔ
ｄｒ導入の５０％を１：１５の希釈率で発生するならば
ＩＬ−１の１単位（「Ｕ」）は１５０μｌのアッセイ容
積の１／１５に見出され、即ち１０μｌが活性の１Ｕを
含有するということができる。従って、全試料は１００
ＵのＩＬ−１活性／ｍｌを含有することになる［１００
０（μｌ／ｍｌ）÷１０μｌ（Ｕ当り）］（上掲のギリ
ス等の文献参照）。 【００２３】ＩＬ−１転換アッセイ ＩＬ−１活性の第２の代替的アッセイ法は、ＩＬ−１
は、本発明者等によってインターロイキン−２（「ＩＬ
−２」）非産生体ネズミ腫瘍細胞系統，ＬＢＲＭ−３３
−１４５，をＩＬ−２産生体に転換すると見い出された
事実を利用するもので、この方法を用いることができ
る。このアッセイにおいて、ＬＢＲＭ−３３−１Ａ５細
胞、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−８０７９は５０μｇ／ｍ
ｌのマイトマイシンＣを添加して不活性化され、３７℃
で１時間インキュベートされる。１００μｌの不活性化
ＬＢＲＭ−３３−１Ａ５細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）
はＩＬ−１の含有液体試料の逐次希釈液と共に等容量の
有糸分裂促進剤（ミトゲン）フィトヘムアグルチニン
（「ＰＨＡ」）（１％最終濃度）の存在下において９６
−ウエル平底プレート中において培養する。６〜２４時
間後ＩＬ−１誘発、ミトマイシンＣ−抑制のＬＢＲＭ−
３３−１Ａ５細胞（従って、ＩＬ−１活性）により発生
されたＩＬ−２の活性の存在を５０μｌのＩＬ−２依存
性ＣＴＬＬ−２細胞（８×１０4細胞／ｍｌ）を添加し
て直接的に確認する。マイクロウエル培養物を更に２０
時間インキュベート後、０．５μＣｉの3Ｈ−Ｔｄｒに
より４時間のパルス処理を行う（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｎｕｃｌａｒ，マサチューセッツ州、ボストン、２
Ｃｉ／ｍＭ特異活性）。その後、チミジン−パルス処理
された培養物を多重自動化試料採取器（ＭＡＳＨ II；
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ
ｓ，メリーランド州、ベテスダ）を用いてガラス繊維フ
ィルター片上に採取する。3Ｈ−Ｔｄｒ導入は液体シン
チレーション計数により測定する。この方法の詳細は上
記ギリス等の文献及び米国特許第４，４１１，９９２号
明細書に示されている。このアッセイにおいては、ＩＬ
−２の存在下において培養されたＣＴＬＬ−２細胞のみ
が照射線量に応じて3Ｈ−Ｔｄｒを導入する。ＩＬ−２
（従ってＩＬ−１）の不存在下において培養されたＣＴ
ＬＬ−２細胞はバックグラウンド水準の3Ｈ−Ｔｄｒを
導入するにすぎない。この「転換」アッセイはより迅速
である（２４時間以内に完結）ということ、及び上記胸
腺細胞増殖アッセイよりも１，０００〜１０，０００倍
感度が高いという利点を有する。しかしながら、「転
換」及び「増殖」の両アッセイを本発明において使用す
ることが出来る。 【００２４】蛋白質アッセイ 精製試料の蛋白質含量はＢｉｏｒａｄ社（カリフォルニ
ア州、リッチモンド）から市販されているＢｉｏｒａｄ
蛋白質アッセイにより求められる。このアッセイはウシ
血清アルブミンを標準として用いるものである。このア
ルブミンの原理及び詳細はブラッドフォード［Ｂｒａｄ
ｆｏｒｄ，７２ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４８
（１９７６）］に論じられている。 【００２５】ゲル電気泳動 培養上澄液及びクロマトグラフィーカラム画分はＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより分析して本発明の精製操作を追跡す
る。このアッセイはレムリ［Ｌａｅｍｍｌｉ，２２７
Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）６８０（１９７０）］の
ゲル重層方法に従って行われる。このアッセイは１０〜
２０％勾配のポリアクリルアミドゲルを用いる０．７５
ｍｍのＳＤＳスラブゲルを用いるものである。これらの
ゲルは一定の３０ｍＡ電流において運転される。得られ
たゲル試料は例えばオークリー等［Ｏａｋｌｅｙ ｅｔ
ａｌ．，１０５ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６１
（１９８０）］により記載されている方法により銀染色
される。 【００２６】高塩濃度を含有するこれらのアッセイ試料
は先ず０．１ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3中の０．００１％ＳＤ
Ｓに対して透析され次いで真空乾燥される。乾燥残渣を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ操作に先立ち還元緩衝液（２％ＳＤ
Ｓ）、１％ ２−メルカプトエタノール中に溶解する。 【００２７】二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動 本発明の精製操作完結後にＩＬ−１をサモンズ等［Ｓａ
ｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，２Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ
ｅｓｉｓ １３５（１９８１）］により記載されている
方法により二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分析する。この方法においては、凍結乾燥されたＩＬ
−１試料を水中１％（ｗ／ｖ）シクロヘキシルアミノエ
タン、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２％２−メルカプトエタ
ノール、１０％グリセロールで構成されたＳＤＳ可溶化
緩衝液２０μｌ中に再懸濁させる。これらの試料を１０
０℃に１０分間に亘り加熱する。２時間のプレフォーカ
シング後試料（１００℃においてＳＤＳ中で１０分間可
溶化）を第一次元のゲルに適用し、６００ボルトの定電
圧において２０時間フォーカシングを行なう。第一次元
のフォーカシングゲルを直接的にｐＨ勾配ゲル走査計に
より走査する。その後ゲルを平衡化緩衝液［水中９．３
％（ｖ／ｖ）グリセロール；５０％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｓ
−ＳＤＳ緩衝液（３０ｇ Ｔｒｉｓ、２ｇＤＳＤ／ｌ、
濃ＨＣｌによりｐＨ６．８に調製）、１％（ｗ／ｖ）Ｓ
ＤＳ；０．８％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール］
中で２分間濯ぎ、第二次元ゲル上の頂部におき、次いで
低温溶融アガロースで覆う。第二次元電気泳動（アクリ
ルアミドの１０〜２０％線状勾配）を染料前面がゲルの
底部に達するまで４０ｍＡ／ゲルの定電流において行な
う。５０％（ｖ／ｖ）エタノール及び１０％（ｖ／ｖ）
氷酢酸中で固定後、ゲルを上掲のサモンズ等の文献にお
ける色硝酸銀法により染色する。 【００２８】ＩＬ−１の精製 上記方法により調製された血液白血球培養物から得られ
る上澄液は、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオ
ン交換クロマトグラフィー、及びカラムマトリックスに
結合された染料配位子を用いたアフィニティクロマトグ
ラフィーにより精製される。全てのクロマトグラフィー
画分はＩＬ−１活性及び蛋白質濃度が分析される。適当
な場合にはｐＨ及び伝導率が測定される。各クロマトグ
ラフィー工程の後に、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析す
る。更に、アフィニティクロマトグラフィー操作の完結
後に活性画分を上記二次元ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分析する。 【００２９】カチオン交換クロマトグラフィー用の適当
なカラムは、スルホプロピルセファデックスＣ−２５
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ，ニュージャージ州、ピスカタウェイ）により構成さ
れる。好ましくは、カラムはＩＬ−１試料の適用前に緩
衝液で平衡化され、次いでＩＬ−１試料がカラムに適用
された後にＩＬ−１活性の溶出を行うことなく非結合蛋
白質を除去するために同一緩衝液或いは異った緩衝液で
洗浄する。ＩＬ−１のカラムからの溶出はＩＬ−１をカ
ラムから解離するために十分なｐＨの緩衝化された溶離
剤を用いて行われる。 【００３０】カチオン交換クロマトグラフィー法からの
プールされた活性画分は更にアニオン交換クロマトグラ
フィーにより精製される。本発明者等はこの目的のため
に適した適当なカラム材料はＤＥＡＥ−セファセル（Ｓ
ｅｐｈａｃｅｌ）であることを見出した。ＤＥＡＥ−Ｓ
ｅｐｈａｃｅｌカラムを緩衝液で平衡化させ、試料濃縮
液をカラムに適用する。溶出は先ず出発緩衝液で行い、
引続き同一緩衝液中に線形塩勾配を用いて行う。画分を
集め、上記の如く分析を行う。 【００３１】ＤＥＡＥ−セファセルカラムからプールさ
れた活性画分中のＩＬ−１は更に支持体マトリックスに
結合した合成トリアジニル織物染料配位子を用いたアフ
ィニティカラムクロマトグラフィーにより精製される。
青色或いは赤色を含む各種染色を使用することが出来
る。この染料は例えばアガロース、ポリアクリルアミ
ド、セルロース或いはシリカベース無機材料により構成
される適当なカラムマトリックスにトリアジン環へのエ
ーテル結合を介して或いは又染料の一級アミン或いはア
ントラキノン基を介して結合されている。直接的に支持
体マトリックスに結合されずにこの染料は高分子量デキ
ストランに結合され、デキストランが次いでカラムマト
リックスに固定されることも可能である。マトリックス
に結合した青色及び赤色染色配位子の部分的化学構造を
それぞれ第１図及び第２図に示す。これらの染料構造
は、例えばスルホン化アントラキノン基の位置をトリア
ジン環に対して交換するか或いはスルホン酸置換基の代
りにスルホン酸塩を置換することにより修正して類似体
を形成することが出来ることが了解されるべきである。
フルトン［Ｆｕｌｔｏｎ，Ｄｙｅ−Ｌｉｇａｎｄ Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，マサチューセッツ州、レキ
シトン、Ｓｔｕｄｉｏ ６，Ｉｎｅ．（１９８０）］参
照。 【００３２】ＳＰ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ）及びＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）上
で精製されたＩＬ−１含有画分を染料配位子カラムに適
用する前にプールされた活性画分のイオン強度を低下す
ることが必要な場合がある。又、Ｍｇ++或いはＣａ++の
ような二価カチオンの存在はＩＬ−１の染料配位子への
結合を高め得る。カラムは適当な緩衝液、例えばＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌで平衡化され、次いでＩＬ−１活性を含有す
るプールされたＤＥＡＥ画分をカラムに適用する。その
後カラムを同一の出発緩衝液で洗浄し、次いで溶出を同
一の緩衝液或いは特別の可溶性配位子中において線形塩
勾配を用いて行う。画分を集め上記の如く分析する。 【００３３】本発明者等は赤色トリアジニル織物染料
は、上記カラム条件下において使用すると、ＩＬ−１の
結合に特に高度に特異的であることを発見した。第２図
に対応するこの赤色染料の商品名は「プロシオン（Ｐｒ
ｏｃｉｏｎ）」レッド（反応性レッド１２０）（Ｉｍｐ
ｅｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ
ｓ）である。本発明者等は又、青色トリアジニル織物染
料は、上記カラム条件下において使用すると、ＩＬ−１
の結合に高度に特異的、即ち赤色トリアジニル織物染料
の場合の約８０％程度特異的であることをも発見した。
青色染料の商品名はシバクロン（登録商標）ブルー３６
Ａ（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）Ｂｌｕｅ３６Ａ）
（Ｃｉｂａ ＡＧ）である。 【００３４】上記精製方法により、本発明者等は出発上
澄液から約５３％の高収率を維持しながら９９％の純度
を越えてヒトＩＬ−１蛋白質を精製した。上記アッセイ
操作により、本発明者等はヒトＩＬ−１が約１７，５０
０ダルトンの分子量の単一分子量種より構成されること
を決定した。この分子量は従来ヒト或いはネズミのＩＬ
−１について報告されていたものよりも実質的に重いも
のである。更に、他の観察者らの報告とは反対に、本発
明者等によってはその他の分子量のＩＬ−１の種は見出
されなかった。上掲のラッハマン、トガワ等、マイゼル
等、及びブライデン等の文献を参照。しかしながら、本
発明を使用して本発明者等により経験されたＩＬ−１の
高い収率により上記精製方法の際に相当量の他の低分子
量のＩＬ−１種が失われたとは思われない。従って均等
なヒトＩＬ−１の真の分子量は１７，５００ダルトンで
ある。 【００３５】アミノ酸組成分析 他の蛋白質による汚染のないＩＬ−１の生物学的研究を
可能にしたことに加えて、等質なＩＬ−１を調製するこ
とが出来ることはＩＬ−１分子のアミノ酸組成を決定す
ることを可能にした。この情報を用いて、臨床的試験及
び究極的には臨床的用途のためのＩＬ−１遺伝子のクロ
ーニング及び大量の純粋ＩＬ−１の産生を助けることが
可能である。 【００３６】アフィニティクロマトグラフィー操作から
の精製ＩＬ−１の試料をニンヒドリン検出を用いた自動
化アナライザーを用いてアミノ酸組成の分析を行った。
観察されたピークは市販の記録積算計を用いて積分し
た。この技術により本発明者等は下記の例４における表
Ｉにまとめて示したＩＬ−１分子のアミノ酸組成を決定
した。 【００３７】アミノ酸残基システイン（Ｃｙｓ）は加水
分解に不安定であるのでこの残基は自動化ニンヒドリン
分析によっては検出されない。Ｃｙｓ残基の存在は以下
に述べるアミノ酸配列分析により検出した。又、自動化
ニンヒドリン分析は、アスパラギン酸残基とアスパラギ
ン残基とを区別せずに、又、グルタミン酸残基とグルタ
ミン残基の区別もしない。しかしながら、以下に述べる
アミノ酸配列分析から１個のアスパラギン残基及び６個
のグルタミン残基がＩＬ−１分子のＮ−末端部分（４２
個のアミノ酸残基よりなる）に検出された。この様に表
Ｉにおいてはグルタミン酸及びグルタミン残基と同様に
アスパラギン酸及びアスパラギン残基も一緒に掲げられ
ている。 【００３８】ＩＬ−１分子のＮ−末端部分のアミノ酸配
列分析 本発明者等は又ＩＬ−１分子のアミノ酸配列を検討し
た。本発明者等は、上記方法により調製された精製ＩＬ
−１中においてこの分子のＮ−末端が部分的に保護され
ていることを発見した。その様なものとして、この分子
は自動化アミノ酸配列装置に使用さるる化学的分析技術
に容易に従うことが出来ず、従って、全分子のアミノ酸
配列は標準的分析操作により決定することが出来なかっ
た。その結果、本発明者等は、２つの技術の組み合わせ
を用いて蛋白質分子のＮ−末端部分の配列を分析した。 【００３９】第１の技術として、本発明者等は上記方法
により等質状態に精製されたかなり大きな１１μｇを越
えるＩＬ−１を自動化配列決定装置を用いてアミノ末端
エドマン分解配列分析に付した。この技術によりＩＬ−
１分子のＮ−末端部分の最初の２０個の残基は次の配列
により構成されることが見出された： 【化５】ＮＨ2-Ａｌａ-Ｐｒｏ-Ｖａｌ-Ａｒｇ-Ｓｅｒ-
Ｌｅｕ-Ａｓｎ-Ｃｙｓ-Ｔｈｒ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ-Ａｓｐ-
Ｓｅｒ-Ｇｌｎ-Ｇｌｎ-Ｌｙｓ-Ｓｅｒ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-
Ｍｅｔ． ８番目の残基はＣｙｓと推定された。自動化配列決定操
作の８番目のサイクルにおいては、その他のの如何なる
残基も高収率で得られず、これは８番目の残基がＣｙｓ
（これはエドマン分解により肯定的には検出されな
い）、グリコシル化スレオニン残基或いはグリコシル化
セリン（Ｓｅｒ）残基により構成されるとの結論を示
す。これらの後者の２つの可能性は以下に論ずる如く、
アミノ酸組成分析からグルコサミン或いはガラクトサミ
ンは観察されないので除去された。これにより８番目の
残基がＣｙｓで構成されるとの結論が導かれる。 【００４０】第２のアミノ酸配列分析技術として、本発
明者等はアルギン残基における分子を酵素トリプシンを
用いて分別した。トリプシンがＩＬ−１分子を又リジン
部位において切断することを防止するためにリジン分子
の側鎖を特別のブロッキング剤を用いて保護した。好ま
しくは、トリプシンをＩＬ−１−トシルアミノ−Ｓ−フ
ェニルエチルクロロメチルケトン（「ＴＰＣＫ」）で処
理して、同時に存在し得るキモトリプシンなどのその他
の汚染酵素をを不活性化し、ＩＬ−１蛋白質が他の残基
において切断される可能性を最少にする。トリプシンを
使用する代りに、他の酵素を用いて他の残基部位におい
てＩＬ−１分子を切断することも可能であることは了解
されるべきである。 【００４１】ＩＬ−１分子の切断後得られたペプチド類
をＨＰＬＣ操作により疎水性に基づいて分離した。本発
明において使用されるＨＰＬＣ技術は蛋白質ＩＬ−１ペ
プチド類に最適に利用されるべき十分に大きな孔径、即
ち少なくとも３００Åの孔径を有する逆相のオクタデシ
ル結合シリカカラムを用いるのが好ましい。 【００４２】本発明の実施に当り使用するに適した逆相
ＨＰＬＣカラムは市販の商品である。この目的に好まし
いカラムはＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ，（カ
リフォルニア州、ヘスペリア）より市販されているＶｙ
ｄａｃ ２１８ ＴＰ逆相カラムである。このカラム
は、シロキサン（シリコン−酵素−シリコン）結合によ
り、５ミクロンの平均粒径に分類された３００Å孔径の
シリカゲル表面に共有的に結合されたオクタデシルシラ
ン基よりなる。他の逆相カラムの使用も本発明の範囲内
であることが了解されるべきである。 【００４３】オクタデシルカラムに結合したＩＬ−１ペ
プチド類はアセトニトリルの線形勾配を用いて溶出され
る。この目的のための好ましい勾配はトリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）、ｐＨ２．０中の０〜９５％（ｖ／ｖ）のア
セトニトリル勾配である。 【００４４】溶出されたペプチド類は市販の検出計を用
いて追跡するのが便利である。例えば、ＨＰＬＣカラム
から溶出された画分中の相対的蛋白質濃度は、自動化紫
外線分光光度計を用いて２３０ｎｍ波長における溶出物
質の吸光度を測定することにより求めることができる。
適当な自動化紫外線吸収検出装置はＷａｔｅｒｓ Ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｓ（メイン州、ミルフォード）から利用
可能である。或いは又、蛋白質の溶出はステイン及びモ
スケラ［Ｓｔｅｉｎ及びＭｏｓｃｈｅｒａ，７８Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．４３５（１９８１）］により記載
されている自動化蛍光検出装置を用いて追跡することも
出来る 溶出されたＨＰＬＣ画分の配列の分析は上記ゲル電気泳
動により行われ、各ＨＰＬＣ画分に含まれるべきペプチ
ド類の数を決定する。その後、ペプチド類を真空濃縮
し、次いでアミノ酸配列の分析を行う。これは市販の商
品である自動化配列決定装置を用いて行うのが好まし
い。この技術により本発明者等はヒトＩＬ−１分子のＮ
−末端部分近辺のＩＬ−１分子の主たる部分は次のアミ
ノ酸残基の配列により構成されることを発見した： 【化６】Ｓｅｒ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｍｅｔ-Ｓｅｒ-Ｇｌｙ-
Ｐｒｏ-Ｔｙｒ-Ｇｌｕ-Ｌｅｕ-Ｌｙｓ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-
Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｇｌｎ-Ｇｌｙ-Ｇｌｎ-Ａｓｐ-Ｍｅｔ-
Ｇｌｕ-Ｇｌｎ-Ｇｌｎ-Ｖａｌ-Ｖａｌ-Ｐｈｅ． このアミノ酸断片のアミノ末端部分の最初の４つの残基
は、自動化エドマン分解技術により上記で決定された配
列のＣ−末端部分の最後の４つの残基に対応し、従って
ＩＬ−１分子のＮ−末端部分の最初の４２個の残基は次
の配列より構成されるとの結論に導かれる： 【化７】ＮＨ2- Ａｌａ-Ｐｒｏ-Ｖａｌ-Ａｒｇ-Ｓｅｒ-
Ｌｅｕ-Ａｓｎ-Ｃｙｓ-Ｔｈｒ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ-Ａｓｐ-
Ｓｅｒ-Ｇｌｎ-Ｇｌｎ-Ｌｙｓ-Ｓｅｒ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-
Ｍｅｔ-Ｓｅｒ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-Ｔｙｒ-Ｇｌｕ-Ｌｅｕ-
Ｌｙｓ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｇｌｎ-Ｇｌｙ-
Ｇｌｎ-Ａｓｐ-Ｍｅｔ-Ｇｌｕ-Ｇｌｎ-Ｇｌｎ-Ｖａｌ-
Ｖａｌ-Ｐｈｅ． 【００４５】ヒトＩＬ−１産生細胞からのＲＮＡの調製 ヒトＩＬ−１産生細胞からの全ＲＮＡは標準的方法、例
えばチルギン等［Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１
８ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５２９４（１９７
９）］及びマニアティス等［Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８２）］に開示されていてる方法により抽出され
る。 【００４６】周知の如く、細胞からＲＮＡを抽出するに
際し、抽出の初期段階においてリボヌクレアーゼ（「Ｒ
Ｎａｓｅ」）活性を最小にすることが重要である。これ
を達成する１つの方法は、ＲＮａｓｅを含む細胞蛋白質
をＲＮＡａｓｅによるＲＮＡ加水分解の速度を越える速
度で変性することである。上記チルギン等及び上記マニ
アティス等の１９６の方法においては、これはグアニジ
ニウムチオシアネートを２−メルカプトエタノールなど
の還元剤と共に使用して行われている（蛋白質ジスルフ
ィド結合を破壊する）。ＲＮＡは標準的技術、例えばフ
ェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿或いはセ
シウムクロライドによる沈降などにより蛋白質から単離
される。 【００４７】次に、ポリアデニル化ｍＲＮＡを抽出蛋白
質から分離する。この分離操作を行うための幾つかの技
術が開発されているが、１つの好ましい方法は、ポリア
デニル化ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルロース上でエ
ドモンド等［Ｅｄｍｏｎｄｓｅｔ ａｌ．，６８ Ｐｒ
ｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １３３６
（１９７１）］、アヴィブ及びレダー［Ａｖｉｖ ａｎ
ｄ Ｌｅｄｅｒ，６９Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．１４０８（１９７２）］、及び上記マニアティ
スの１９７、に記載されているように、クロマトグラフ
を行うことである。オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラム
は負荷緩衝液を用いて調製され、ｍＲＮＡをカラムに適
用する。その後カラムを先ず緩衝溶液で洗浄して未ポリ
アデニル化ｍＲＮＡを除去し、次いでポリアデニル化ｍ
ＲＮＡを緩衝化された低イオン強度の溶離剤を用いてカ
ラムから溶出する。ポリアデニル化ｍＲＮＡの完全性は
ゲル電気泳動により検証される。 【００４８】ポリアデニルｍＲＮＡは次いでｍＲＮＡの
異なった大きさの群に応じたメチル水銀アガロースゲル
画分を介して電気泳動により大きさを決定され、次いで
例えばパルミター［Ｐａｌｍｉｔｅｒ，２４８ Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０９５（１９７３）］、ペルハム
及びジャクソン［Ｐｅｌｈａｍ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏ
ｎ，６７．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４６（１９
７６）］、及びリー等［Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２５３
Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．３４９４（１９７８）］
により記載されている標準的なウサギ網状赤血球溶解物
技術を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳される。ウサギ網
状赤血球アッセイ用のキットは多くの供給源、例えばＢ
ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ（メリーランド州、ゲテルスブルグ）などから
市販されている。或いは又ｍＲＮＡの翻訳は、ストマ等
［Ｓｔｏｍａ ｅｔ ａｌ．，７９．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ
ｙｍ．６８（１９８１）］により記載されている標準的
技術を用いてアフリカツメガエル（Ｘｅａｏｐｕｓ ｌ
ａｅｖｉｓ「Ｘ．ｌａｅｖｉｓ」）の卵母細胞へのｍＲ
ＮＡの微量注射により行うことも出来る。網状赤血球溶
解物翻訳或いはｍＲＮＡ微量注射卵母細胞により放出さ
れた液体を次いで上記アッセイを用いてＩＬ−１の活性
の存在の試験を行う。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて翻訳し
た際にＩＬ−１活性を与えたｍＲＮＡゲル画分をｃＤＮ
Ａ構成のためのｍＲＮＡ源として選択する。 【００４９】アフリカツメガエル卵母細胞翻訳操作にお
いては、約５０ナノリットル（「ｎｌ」）のｍＲＮＡ
（無菌Ｈ2Ｏ中に０．５〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解）
を各卵母細胞に注射する。卵母細胞をアフリカツメガエ
ル（Ｎａｓｃｏ，ウィスコンシン州、フォートアトキソ
ン）から採取し、１５０ｍｌの卵母細胞インキュベーシ
ョン培地（８８ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＫＣｌ．２．
４ｍＭ ＮａＨＣＯ3、０．８２ｍＭ ＭｇＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ、０．３３ｍＭ Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ、０．４
１ｍＭ ＣａＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、 ７．５ｍＭ Ｔｒｉｓ
ベース、１８単位／ｍｌ（１１μｇ／ｍｌ）ペニシリン
Ｇカリウム及び１８μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中
においてインキュベートする。培地の最終ｐＨをＨＣｌ
で７．６に調整し、次いで濾過により殺菌する。注射
後、卵母細胞を０．１ｍｌの新たな卵母細胞インキュベ
ーション培地中に入れ、１．５μｌの無菌の円錐状のポ
リプロピレンチューブ内で２３℃で１８時間インキュベ
ートする。インキュベーション後卵母細胞が培養された
液体を採取し、次いで上記アッセイ法を用いてＩＬ−１
活性の存在の試験を行う。 【００５０】ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの調製 上記の如く調製され分析されたｍＲＮＡに対応する二本
鎖ｃＤＮＡのライブラリーは逆転写酵素を用いた公知の
技術により構成される。本発明において使用されるその
様な方法の１つは上記マニアティス等の文献２３０に詳
細に説明されている。簡単に述べると、ポリアデニル化
ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡのポリアデニル化尾部にハイブリ
ダイズされたオリゴ−ｄＴを用いて第１のｃＤＮＡ鎖の
プライマーとして逆転写する。これにより第２のＤＮＡ
鎖の一体的プライマーとして役立つ最初のｃＤＮＡ鎖の
３’末端に「ヘヤピン」ループが生ずる。次いで、第２
のｃＤＮＡ鎖を酵素ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成
し、ヘヤピンループＳ１ヌクレアーゼにより切断し、二
本鎖ｃＤＮＡ分子を生成する。二本鎖ｃＤＮＡは任意の
便利な手段を用いて分別してより短い鎖を除去し、それ
により不用な小さなｃＤＮＡ画分のクローニングを回避
する。 【００５１】本発明に従えば、別の標準的操作方法を用
いてｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製することが出来
ることが理解されるべきである。その様な１つの代替技
術はランド等［Ｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，９ Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２５１（１９８１）］によ
り開示されている。ランド等の方法においては、ヘヤピ
ンループは第２のｃＤＮＡ鎖のプライマーとしては使用
されない。その代りに、第１のｃＤＮＡ鎖の３’末端
が、末端デオキシヌクレオチジルストランスフェラーゼ
（「ＴｄＴ」）を用いてｄＣＭＰ残基で尾部が付着され
る。これはポリ−Ｃの残基の３’尾部を生成する。次い
で、第２の鎖の合成は、３’尾部にハイブリダイズされ
たオリゴ−ｄＧにより開始される。この技術はマニアテ
ィス等の方法においてヘヤピンがＳ１ヌクレアーゼで切
断されるならば生じ得る第２のｃＤＮＡ鎖の５’尾部の
部分を失うことを避けるのに役立つといわれている。 【００５２】ｃＤＮＡのクローニング 次に、二本鎖ｃＤＮＡを、ベクターの複製のために相容
れることのできる原核生物或いは真核生物の宿主細胞を
形質転換するために使用されるクローニングベクター中
に挿入する。その後形質転換体が同定され、プラスミド
ＤＮＡがそれから調製される。 【００５３】本発明を実施するためには各種のクローニ
ングベクターを利用することが出来る。好ましいベクタ
ーはプラスミドであるが、ベクターはバクテリオファー
ジ或いはコスミドであってもよい。クローニングが哺乳
動物細胞内で行われる場合にはウィルスも又ベクターと
して使用することができる。 【００５４】プラスミドが使用される場合には、それは
天然源から得られても或いは人工的に合成されてもよ
い。選ばれる特別のプラスミドは、考えられている形質
転換宿主がＥ．ｃｏｌｉのような細菌、酵母その他の単
細胞微生物であるか否かに応じて適合性を有すべきであ
る。プラスミドは使用されるべき特別の宿主細胞に対し
て適切な複製源を有するべきである。又、プラスミドは
形質転換された宿主細胞が容易に同定され、かつ形質転
換を行わない細胞から容易に分離されることを可能にす
る表現型特性を有するべきである。その様な表現型特性
は成長抑制物質、例えば抗生物質などに対する耐性を与
える遺伝子を包含し得る。各種抗生物質、例えばテトラ
サイクリン、ストレプトマイシン、サルファ剤、ペニシ
リン及びアンピシリンなどに耐性を有する遺伝子をコー
ド化するプラスミドが市販されている。 【００５５】Ｅ．ｃｏｌｉが宿主細胞として使用される
場合には、本発明において使用することのできる多くの
可能性のあるクローニングプラスミドが市販されてい
る。本発明を実施するために好ましいプラスミドはｐＢ
Ｒ３２２である。このプラスミドはサットクリフ［Ｓｕ
ｔｃｌｉｆｆｅ，４３ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．７７（１
９７９）］に示されているように完全に配列決定されて
いる。このプラスミドの重要な利点はアンピシリン耐性
遺伝子におけるＰｓｔＩ部位を含む１１個の公知の独特
の制限部位を有することである。この特徴はホモポリマ
ーテーリング法によるクローニングに特に有用である。 【００５６】プラスミドの代りにバクテリオファージが
使用される場合には、その様なファージはプラスミドの
選択に当って述べた上記の実質的に同一の特性を有する
べきである。これは、表現型マーカー及び外来遺伝子の
付着のための連結可能な末端の存在を含むものである。 【００５７】好ましくは、本発明においてはブラントエ
ンドを有する二本鎖ｃＤＮＡをホモポリマーテーリング
によりプラスミドベクター中に挿入する。周知の如く、
この技術においてはｃＤＮＡの鎖及びプラスミドＤＮＡ
に相補的なホモポリマートラックが付加される。ベクタ
ー及び二本鎖ｃＤＮＡは次いで相補的なホモポリマーの
テール間に水素結合により結合され、Ｅ．ｃｏｌｉなど
の宿主細胞を形質転換することのできる開かれた環状の
ハイブリッド分子を形成する。 【００５８】ホモポリマーテーリングの１つの方法にお
いては約５０〜１５０ｄＡのヌクレオチド残基が線形化
プラスミドＤＮＡの３’末端に付加される。同様な数の
ｄＴヌクレオチド残基が二本鎖ｃＤＮＡの３’末端に付
加され、次いでｃＤＮＡ及びプラスミドが一緒に結合さ
れる。 【００５９】別の好ましい方法においては、ｄＧテール
が適当な制限酵素により切断されたクローニングベクタ
ーの３’末端に付加される。例えばｐＢＲ３２２プラス
ミドが使用される場合には、制限酵素ＰｓｔＩを使用し
てこのプラスミドをアンピシリン耐性遺伝子において消
化することが出来る。プラスミド中にｃＤＮＡセグメン
トを適当なアニーリング緩衝液を用いて挿入する前に二
本鎖ｃＤＮＡの３’末端に相補的ｄＣテールが付加され
る。 【００６０】二本鎖ｃＤＮＡはその他の各種標準的方法
によりプラスミドクローニングベクター中に挿入するこ
とが出来ることが了解されるべきである。１つのその様
な代替的技術はＤＮＡリガーゼを用いてｃＤＮＡ鎖の末
端に合成されたヌクレオチドリンカーを付着することを
含むものである。これらのリンカーは制限酵素で切断さ
れて同一酵素で切断されたプラスミド内に挿入するため
の付着末端を発生する。シエラー等［Ｓｃｈｅｌｌｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９６ Ｓｃｉｅｎｃｅ １７７−１
８０（１９７７）］、上掲マニアティス等の文献２１９
参照。 【００６１】上記の如く調製された組み換えＤＮＡプラ
スミドを使用して宿主細胞の形質転換を行う。宿主は任
意の適当な原核生物或いは真核生物細胞でよいが、好ま
しくは、良く同定された細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ或い
は酵母菌株がよい。その様な宿主は容易に形質転換さ
れ、培養液中で迅速な生育が可能である。他の形態の細
菌、例えばサルモネラ或いはニューモコッカス（Ｐｎｅ
ｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）などもＥ．ｃｏｌｉの代りに使用
することが出来る。細菌の代りにその他の単細胞生物、
例えば真菌類（ｆｕｎｇｉ）及び藻類（ａｌｇａｅ）な
ども使用することが出来る。いずれの宿主が選ばれるに
せよ、それは組み換えプラスミドを切断する制限酵素を
含有すべきではない。 【００６２】Ｅ．ｃｏｌｉが宿主として使用される場合
には、好ましい菌株はＭＭ２９４及びＲＲ１である。プ
ラスミドベクターによるＭＭ２９４の形質転換の実験方
法は上記マニアティス等の文献の２２５において、及び
ハナハン［Ｈａｎａｈａｎ１６６ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．５５７（１９８３）］に示されているように良く知
られている。ＲＲ１宿主のプラスミドベクターによる形
質転換の実験方法も又、ボリバー等［Ｂｏｌｉｖａｒ
ｅｔ ａｌ．，２ Ｇｅｎｅ ９５（１９７７］］及び
ピーコック等［Ｐｅａｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，６５５
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２４３
（１９８１）］に示されているように良く知られてい
る。適当な宿主として役立ち得るその他のＥ．ｃｏｌｉ
の菌株としては、ＤＨ１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３３８４
９）及びＣ６００が挙げられる。これらの菌株及びＭＭ
２９４及びＲＲ１菌株は広く市販されている。 【００６３】上記マニアティス等による文献及び上記ハ
ナハン等に文献に開示されているものを含む形質転換の
実験方法においては、細胞による制限されたプラスミド
の摂取により僅かに少量部分の宿主細胞が実際に形質転
換されるにすぎない。形質転換された細胞は、適当な生
育培地及び抗生物質などの表現型同定物質を含有する寒
天上に細胞培養液を置くことにより同定することが出来
る。適当な耐性遺伝子（例えば抗生物質に対する）を有
する細胞のみが生残る。組み換えｐＢＲ３２２のプラス
ミドがＥ．ｃｏｌｉ菌株ＭＭ２９４の形質転換に用いら
れる場合には形質転換された細胞はテトラサイクリンを
表現型同定物質として用いることにより同定することが
できる。 【００６４】合成オリゴヌクレオチドスクリーニングプ
ローブの調製 上記の如く決定されたヒトＩＬ−１分子のアミノ酸配列
のＮ−末端部分の１部に対応する放射線標識された合成
オリゴヌクレオチドをプローブとして用いてｃＤＮＡラ
イブラリーのスクリーニングを行う。この合成オリゴヌ
クレオチドプローブのライブラリークローンから調製さ
れたプラスミドｃＤＮＡとのハイブリッド化は引続いて
オートラジオグラフィーにより同定する。 【００６５】ＩＬ−１分子のアミノ酸組成のＮ−末端部
分は次の残基により構成されることが決定された： 【化８】ＮＨ2−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖｌａ−Ａｒｇ−Ｓ
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒ
ｇ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈ
ｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｍｅ
ｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ この配列情報を合成オリゴヌクレオチドプローブの基礎
として使用する。 【００６６】本発明者等はＩＬ−１遺伝子を含有すると
思われるプラスミドＤＮＡをスクリーニングするための
プローブに使用するための合成オリゴヌクレオチドを上
記アミノ酸配列から開発した。このプローブは、第１の
Ｍｅｔ残基から下流の上記アミノ酸配列によりコード化
されるアンチセンス配列に対応する次の配列により構成
されている： 【化９】 ５’−ＡＣ ＴＴＧ ＴＴＧ ＴＴＣ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＴＧ ＧＣＣ ＴＴＧ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＧＧＣ ＴＴＴ ＣＡＧ ＴＴＣ ＧＴＡ ＧＧＧ ＧＣＣ ＧＧＡ ＣＡＴ−３’． このプローブは容易に合成されるに十分に短いという利
点を有すると共にＩＬ−１遺伝子のプローブとして有用
な重要な情報を含有するに十分長いものである。上記説
明のオリゴヌクレオチド配列は、本発明の合成プローブ
の好ましい組成であるが、ＩＬ−１分子のＮ−末端アミ
ノ酸配列のその他のセグメントに対応するその他の組成
のプローブも又本発明の趣旨或いは範囲から離れること
なく使用することが出来ることが了解されるべきであ
る。 【００６７】合成オリゴヌクレオチドプローブは、ホス
ホジエステル或いはトリエステル方法などの公知の技術
により化学的に合成することが出来る。トリエステル合
成技術の詳細はスッド等［Ｓｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，４
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５５７（１９７
７）］及びヒロセ等［Ｈｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，２
８Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２４４９（１９７８）］に示され
ている。合成後オリゴヌクレオチドプローブをＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ及び32Ｐ−ＡＴＰで標識化する。
標識化操作からの標準的な実験方法は上記マニアティス
等の文献１２２に示されている。オリゴヌクレオチドプ
ローブはＯＨ５’末端を用いて合成することにより典型
的に必要とされるホスファターゼ操作を回避するのが有
利である。 【００６８】ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 本発明のスクリーニング操作において、形質転換体は各
々約２，０００個の形質転換体で構成されている群にプ
ールされる。複製されたプラスミドは、例えば、アルカ
リ性溶解などの数個の公知の技術の任意のものを用いて
形質転換体から抽出される。プラスミドＤＮＡはいずれ
もハイブリッドプラスミド上の独特の部位であるＰｖｕ
II及びＨｉｎｄIII制限部位においてプラスミドを切断
することにより調製される。得られたＤＮＡセグメント
をアガロースゲル上の電気泳動により分別し、次いで直
接的にサザン［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，９８ Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．５０３（１９７５）］により記載されている
サザンブロッティングにより分析する。サザンブロッテ
ィング操作（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇＰｒ
ｏｃｅｄｒｅ）におけるニトロセルロースフィルターに
結合するＤＮＡを，標識化されたオリゴヌクレオチドプ
ローブとハイブリダイズさせる。プローブにハイブリダ
イズする特異的ＤＮＡ断片をオートラジオグラフィーに
より同定する。 【００６９】オートラジオグラフィーに従って信号を与
える特別のクローンのプールをプレートから取り出し、
同一の上記オリゴヌクレオチドプローブを用いたニトロ
セルロースフィルター上における直接細菌コロニーハイ
ブリダイゼーションに使用する。ハイブリッド化完結後
にニトロセルロースフィルターをオートラジオグラフィ
ーにより追跡して最も大きな陽性のコロニーを同定す
る。本発明において発明者等は１つのその様なコロニー
を見出した。ＩＬ−１ Ｘ−１４と称されるプラスミド
ＤＮＡはこの特別の同定された陽性コロニーから調製さ
れる。 【００７０】スクリーニングされたｃＤＮＡの特性づけ 上記の如く得られたプラスミドＤＮＡは制限酵素マッピ
ングにより特徴付けられる。制限酵素マッピングに対す
る各種術策は上記マニアティス等の文献の３７４により
論じられている。１つの標準的技術は線状ＤＮＡの末端
−標識化断片の部分的消化を含むものである。この技術
はスミス及びビルンスチール［Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｂ
ｉｒｎｓｔｉｅｌ．３ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．
２３８７（１９７６）］により開発された。ＩＬ−１遺
伝子の領域におけるＩＬ−１×−１４プラスミドの部分
的制限酵素地図は第３図に示される。制限部位間の距離
は塩基対（「ｂｐ」）で与えられている。括弧内に示さ
れるＰｓｔＩ制限部位はクローニング操作により発生し
たものである。 【００７１】第３図に示されたプラスミドｃＤＮＡの地
図は連鎖−停止方法を用いて配列決定されたものであ
る。このヌクレオチド配列決定の方法はサンガー等［Ｓ
ａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，７０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）５４６３（１９７
７）］により始められたものであった。又、米国特許第
４，３２２，４９９号明細書参照。連鎖停止配列決定の
方法はＭ１３ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇと題されたＡｍｅｒｓｈａｍ Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ ［Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂｌｅｎｈｅｉｍ Ｃｒｅｓｅｎ
ｔ （１９８３）］（以下、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋと称する）、メッシング［Ｍｅｓｓｉｎｇ
２ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｉｃ
ａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉ
ｏｎ Ｎｏ．７９〜９９、２，４３〜４８（１９７
９）］、ノランダー等［Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，２６Ｇｅｎｅ １０１（１９８３）］、セレッテ
ィ等［Ｃｅｒｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， １１ Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５９９（１９８３）、及び
ビギン等［Ｂｉｇｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，８０ Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）３９６３
（１９８３）］などに示されている。興味の対象となる
ＤＮＡ配列をクローン化するためにＭ１３繊維状ファー
ジがベクターとして使用される。これらのファージベク
ターは連鎖停止方法により容易に配列化される一本鎖Ｄ
ＮＡ鋳型を与え、この方法は、遊離３’ヒドロキシル基
を有する短いプライマー鎖を有する一本鎖鋳型分子を開
始し、次いでＤＮＡポリメラーゼを用いて全ての４つの
デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、即ちｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（集合的に「ｄ
ＮＴＰｓ」と称する）をそれらの一つを放射標識して用
いた連鎖延長反応において鋳型鎖を複写することを含む
ものである。この合成反応において、３’−ヒドロキシ
ル末端を欠いているヌクレオチド特異的連鎖停止剤、例
えば２’，３’ジデオキシヌクレオチドトリホスフェー
ト（「ｄｄＮＴＰ」）を使用して一連の異なった長さの
連鎖延長を生成する。この停止剤はそれが成長ＤＮＡ鎖
に導入されることができるように正常な５’末端を有す
るが、しかし３’−ヒドロキシル末端を欠くものであ
る。停止剤が一度ＤＮＡ鎖中に一体化されると更にデオ
キシヌクレオチドトリホスフェートが付加されることが
出来ず、鎖の成長が停止する。各々四つのヌクレオチド
ｄＮＰＴｓ、即ちｄＡＴＰ、ｄＣＰＴ、ｄＧＴＰ及びｄ
ＴＴＰの一つのｄｄＮＴＰを有する四つの別々の合成反
応が行われる。正常なｄＮＰＴｓの一つは合成された鎖
がポリアクリルアミドゲル上で大きさにより分類された
後にオートラジオグラフすることができるように放射線
標識される。四つの反応からの連鎖延長物はオートラジ
オグラフィからの断片のパターンがクローン化されたＤ
ＮＡのＤＮＡ配列に対応するように別々のゲルレーン中
に隣り合わせて置かれる。 【００７２】上記技術により求められた第３図に示され
るプラスミドｃＤＮＡのＤＮＡ及び対応するアミノ酸配
列を第４図に示す。ヌクレオチド類は第４図に示した配
列の始めから番号が付されている。アミノ酸はＩＬ−１
蛋白質の成熟ＮＨ2−末端、即ち矢印で示されたＡｌａ
残基から始まり停止コドンＴＡＡに隣接して位置するＳ
ｅｒ残基（Ｎｏ．１５３）まで番号が付されている。Ａ
ｌａコドンからＴＡＧ停止コドンまでのＩＬ−１遺伝子
のコード化領域は第３図の箱部分として示されている。
第３図に示される制限酵素切断部位は又第４図にも示さ
れている。 【００７３】配列決定操作の準備に際して、第３図に示
されたプラスミドｃＤＮＡ部分は各種制限エンドヌクレ
アーゼで消化させ、次いで得られたＤＮＡ断片をＭ１３
ファージベクター中にクローン化して一本鎖ＤＮＡ鋳型
を形成する。センス及びアンチセンス鎖の中間位置から
上流及び下流の配列決定にはユニバーサルなプライマー
が使用される。単一の連鎖停止（鎖成長停止）方法を用
いたフラグメントの全長の配列決定から得られた配列結
果を信用するよりもむしろ追加の合成的に生成されたプ
ライマーを用いて鎖の長さに沿って他の中間位置から連
鎖停止方法が開始される。この方法により第３図に示さ
れるプラスミドｃＤＮＡの両鎖は重複して配列され、そ
れにより配列を重複して確認するのに役立つ。 【００７４】上記連鎖停止技術を用いる代りに本発明の
趣旨から離れることなくＩＬ−１の遺伝子の配列を行う
ためにその他の公知の方法を利用することが可能である
ことが了解されるべきである。例えば、７４ Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）５６０
（１９７７）に示されているマクサム（Ｍａｘａｍ）及
びギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）の化学的分解方法を使
用することができる。 【００７５】上記の如く調製され及び精製されたＩＬ−
１のアミノ酸配列の研究はスターン等の方法［Ｓｔｅｒ
ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．（ＵＳＡ）８７１（１９８４）］に従って行われ
た。エンドペプチダーゼ、シアノーゲンブロマイドを用
いてＩＬ−１をメチオニン残基において切断し、次いで
得られたフラグメントを標準的エドマン分解方法により
分析した。この方法により本発明者等はＩＬ−１蛋白質
のＣ−末端は次のアミノ酸配列：Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａ
ｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒより構成されていることを確認し
た。これは、「天然の」ＩＬ−１は、ｍＲＮＡからの翻
訳後にこの分子末端からアミノ酸の除去によって生じな
いことを確立するものである。これは、多くのコード化
された蛋白質がＩＬ−１のその前駆体からの成熟の際に
ＩＬ−１遺伝子のオープンリーディングフレームの５’
末端から除去されることが明らかなので重要である。 【００７６】ｃＤＮＡクローンからの機能的ＩＬ−１の
発現 ＩＬ−１×−１４クローンのｃＤＮＡコード領域が機能
的ＩＬ−１をコード化するか否かを決定するためにクロ
ーンが原核生物／真核生物宿主系において発現される。
ＩＬ−１×−１４クローンのコード化領域を含有するハ
イブリッドｃＤＮＡフラグメントが２組の複製配列、即
ちベクターの原核生物宿主細胞における増幅のための第
１の配列及び外来構造蛋白質即ちＩＬ−１の真核生物宿
主細胞における高割合の発現のための第２の配列を有す
るシャトル発現ベクター中に挿入される。形質転換され
た真核生物宿主細胞を採取し、上記の詳述した胸腺細胞
増殖アッセイ及びＩＬ−２転換アッセイを使用して成熟
ＩＬ−１の発現のアッセイを行う。 【００７７】各種タイプのシャトルベクターが開発され
ている。通常のタイプは、原核生物細胞、典型的には
Ｅ．ｃｏｌｉ中においてＤＮＡ複製の信号を与える複製
及びプロモーター配列のオリジン（ｏｒｉｇｉｎ）及び
真核生物細胞、最も普通には酵母細胞においてＤＮＡ複
製の信号を与える複製及びプロモーター配列の対比オリ
ジンを含む。シャトルベクターは又、形質転換された原
核生物細胞の選択のための薬剤耐性遺伝子のような表現
型マーカーも含む。シャトルベクターは形質転換された
真核生物細胞の選択のための対比の表現型マーカー変更
を有する。理想的には、高割合のＩＬ−１の発現のため
には望ましくない蛋白質の発現を避けるために真核生物
のプロモーター配列から全ての蛋白質コード化配列が除
去される。又、この目的のために天然或いは合成の開始
コドン配列、即ちＡＴＧがＩＬ−１遺伝子の挿入された
コード化領域の５’末端に付着される。 【００７８】本発明を実施するための好ましいシャトル
ベクターはｐＹ ＡＤＨで表わされる。模式的に第５図
に図示されるようにｐＹ ＡＤＨプラスミドは、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ中における高複写ＤＮＡ発現のための複製起点
（プラスミドｐＢＲ３２２から）及び形質転換された
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の選択のためのアンピシリン（「Ａｍ
ｐR」）耐性遺伝子を含む。このシャトルベクターは又
２μの円の複製起点、及び酵母栄養要求変異種（ｔｒｐ
マイナス）における形質転換された酵母宿主の選択のた
めの酵母ＴｒｐＩ遺伝子をも含む。このシャトルベクタ
ーは更に、このプラスミドの酵母及びＥ．ｃｏｌｉの宿
主の両者においての伸長のためのアルコールデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子（「ＡＤＨ」）からの酵母プロモーター配
列をも含む。このプロモーター配列は、この遺伝子の酵
母中における高割合の発現率により、及びこの遺伝子の
完全なＤＮＡ配列が知られているので、本発明において
使用するのに特に有利である。開始ＡＴＧコドンを含む
全ての蛋白質コード化配列はＡＤＨプロモーター断片か
ら除去された。このｐＹ ＡＤＨシャトルベクターは制
限酵素、即ちＥｃｏＲＩ及びＳｔｕＩで切断するための
多くの独特な基質部位を含む。 【００７９】第５図に図示される如く、ｐＹ ＡＤＨ
ＩＬ−１プラスミドは、ＩＬ−１遺伝子のコード化領域
をプラスミドｐＹ ＡＤＨ中に導入することによりＩＬ
−１遺伝子の発現のための発現ベクターとして調製され
る。このシャトルベクターの試料はＡＴＣＣ（１２３６
１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ Ｍａｒｙｌａｎｄ州 ２０８５２）に寄託Ｎｏ．３
９９６７で寄託されている。ＩＬ−１遺伝子のコード化
領域は上記で調製されたｃＤＮＡプラスミドから除去さ
れている。ＩＬ−１遺伝子のコード化領域の正確に５’
末端に独特の制限酵素切断部位がないためにコード化領
域の主たる部分はプラスミドｃＤＮＡから制限酵素Ｈｐ
ａII及びＰｓｔＩにより切断される。ＨｐａII部位は遺
伝子コード化領域の５’末端からやや下流に位置してい
る。その後遺伝子の切断された５’末端を含有する合成
オリゴヌクレオチドは「天然」の主たるＩＬ−１ｃＤＮ
Ａ断片への便利な連結のためのＨｐａII付着３’末端で
化学的に合成される。上記の如くＡＤＨプロモーター配
列の配列の下流の全ての蛋白質コード化配列は除去され
たので、合成オリゴヌクレオチドはＡＴＧ開始コドンで
もってその５’末端で合成される。 【００８０】このＩＬ−１ｃＤＮＡ断片を合成オリゴヌ
クレオチドと共に、合成オリゴヌクレオチドの５’末端
と主たるＩＬ−１ｃＤＮＡ断片の３’末端の立体配置に
対応する適当な制限酵素で予め消化されたシャトルベク
ターｐＹ ＡＤＨ中に挿入する。得られた組み換えシャ
トルベクターｐＹ ＡＤＨ ＩＬ−１を用いてシャトル
ベクターの高複写増幅のために原核生物宿主、例えば
Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換する。この最初の形質転換方法
の後、組み換えシャトルベクターをＥ．ｃｏｌｉ宿主か
ら単離し、次いでＩＬ−１の高割合発現のために真核生
物宿主、例えば酵母細胞を形質転換するために使用す
る。形質転換された酵母宿主を採取し、得られた上澄液
について上記胸腺細胞増幅及び／又はＩＬ−１転換アッ
セイを利用して生物学的活性のアッセイを行う。 【００８１】本発明の方法及び生成物を以下の具体例に
より更に説明する。 【００８２】 【実施例】例 １ ＩＬ−１製造 ヒトの全血（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、オレゴン赤十字から得
られた混合物）から得られた３５０〜４００ｍｌの白血
球濃縮物をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，ミズーリー州、セントルイ
ス）上に積層されたＣａ++，Ｍｇ++のないリン酸緩衝塩
水（「ＰＢＳ」）と混合し希釈し、次いで室温において
６００×ｇで３０分間遠心分離を行った。白血球よりな
る界面層を回収し、ＰＢＳで洗浄し、室温において４０
０×ｇで１０分間遠心分離を行った。細胞を更に２回Ｃ
ａ++，Ｍｇ++のないＰＢＳ中で洗浄し、各洗浄後２００
×ｇで１０分間遠心分離を行った。 【００８３】２×１０6細胞／ｍｌの濃度で得られた単
核細胞をスピナーフラスコ内でＭＥＭ培地中で培養し
た。この培地は５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍ
ｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、０．２ｍＭ
ゲンタマイシン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を
補給した。細胞は、０．０１ｍｇ／ｍｌの加熱不活性化
したホルマリン固定されたスタフィロコッカス・アウレ
ウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，
Ｉｇｓｏｒｂ，Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ，
Ｉｎｃ．マサチューセッツ州、マルデン）を添加するこ
とによりＩＬ−１産生の刺激を与えられた。汚染蛋白質
の産生を減少させるために血清は培養培地には添加しな
かった。空気中５％ＣＯ2の加湿された雰囲気において
３５℃で２４時間インキュベーション後培養物を室温に
おいて３０分間７０００×ｇ遠心分離を行い、次いで上
澄液を除去して使用するまでポリプロピレンボトルに−
２０℃で貯蔵した。 【００８４】例 ２ イオン交換クロマトグラフィー 例１で調製されたＩＬ−１含有上澄液をカチオン交換ク
ロマトグラフィー及びアニオン交換クロマトグラフィー
で精製した。これらのクロマトグラフィー操作は４℃で
行われ、それらに使用されたゲルはＩＬ−１活性の樹脂
への非特異的吸着を減少させるために０．１％Ｔｒｉｔ
ｏｎ−Ｘ及び１０％ｖ／ｖウシ胎児血清で予備処理し
た。クロマトグラフィー操作に先立ち、培養上澄液は上
記方法で分析した。粗製ＩＬ−１溶液は１．９８×１０
7Ｕの典型的な全活性、６．３７×１０4Ｕ／ｍｇ試料の
特異活性及び３．１１×１０5μｇの全蛋白質含量を有
していた。 【００８５】Ａ．カチオン交換クロマトグラフィー 培養上澄液のイオン強度は１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝
液ｐＨ４．０を１０ｍＭクエン酸塩の最終濃度まで添加
して調製し、又、濃塩酸でｐＨ４．０まで減少させた。
この様に調整された上澄液を予め１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、ｐＨ４．０と共に同一の緩衝液で平衡化しておいた
スルホプロピルＳｅｐｈａｄｅｘ（「ＳＰＳ」）Ｃ−２
５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ，ニュージャージー州、ピスカタウエイ）の３０×
１．６ｍｌのカラムに適用した。培養上澄液は４００ｍ
ｌ／時間の速度でカラムに適用した。 【００８６】負荷が完結後、カラムを１０カラム容の１
０ｍＭ−２Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸（「ＭＥ
Ｓ」）緩衝液ｐＨ５．０で洗浄し、未結合蛋白質を除去
した。結合蛋白質を次いでカラムに５０ｍｌ／時間の速
度で適用した４カラム容の１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ．ｐＨ８．１でカラムから溶出した。カラムのｐＨは
約３カラム容の溶離液を適用後に上昇したのがみとめら
れ、それによりＩＬ−１ピークの溶出がもたらされた。
カラム画分を集め、上記の如く分析した。 【００８７】本発明者らはカチオン交換カラムから溶出
したＩＬ−１が、約１．１×１０7Ｕの活性及び約２．
１０×１０5Ｕ／ｍｇの特異活性を示し、それにより最
初のＩＬ−１の約５６％を保持しながら約３倍のＩＬ−
１の活性の増大を達成することを見出した。又、約８０
％の汚染蛋白質がカチオン交換クロマトグラフィー操作
により除去された。 【００８８】Ｂ．アニオン交換クロマトグラフィー カチオン交換カラムからのプールされた濃縮液が更にＤ
ＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉ
ｎｅ Ｃｈｅｍｃａｌｓ，ニュージャージー州、ピスカ
タウェイ）のカラム上でアニオン交換クロマトグラフィ
ーにより更に精製された。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ
カラムは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ．ｐＨ８．１で平
衡化された。ＩＬ−１はこの同一の平衡化緩衝液でＳＰ
Ｓカラムから溶出されたのでＳＰＳプールを２０ｍｌ／
時間の速度で直接的にＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラ
ムに負荷し、それにより透析による活性の損失を回避し
た。負荷後、カラムを５カラム容の同一の平衡化緩衝液
で洗浄し、次いで溶出を４カラム容の１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ．ｐＨ８．１中の０〜４００ｍＭ ＮａＣｌ
の線形勾配を用いて行った。 【００８９】本発明者等はＩＬ−１活性が０．０８〜
０．１２Ｍ ＮａＣｌの鋭いピークにおいて溶出された
ことを見出した。溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、
幾つかの高分子量汚染物質並びに約１７，５００、１
５，０００及び１２，０００ダルトンの三つの主たる分
子量のバンドを示した。カラム溶出液の分析は７．７５
×１０6Ｕの全活性、２．５８×１０6Ｕ／ｍｇの特異活
性、３×１０3μｇの全蛋白質及び３９％の収率を示し
た。 【００９０】例 ３ アフィニティクロマトグラフィー 例２からの活性画分をプールして、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．１中で予備平衡化しておいた
アガロースマトリックスに結合された染料配位子「Ｐｒ
ｏｃｉｏｎ」赤色染料（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，メリーランド州、
ベテスダ．Ｃａｔ．Ｎｏ．５９２６ ＳＡ）の１０×
１．６ｃｍカラムを用いたアフィニティクロマトグラフ
ィー技術により更に精製した。ＩＬ−１の染料配位子カ
ラムへの結合を最適化するために、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈ
ａｃｅｌプールのイオン強度はプールを１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．１中で１：４で希釈するこ
とにより４０ｍＭ未満に低下させた。染料配位子カラム
は先ず４カラム容の同一出発緩衝液で洗浄して未結合蛋
白質を除去し、次いで溶出を１５カラム容の１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．１中の０〜１．０Ｍ
ＮａＣｌで構成されている線形勾配で行った。本発明
者等はＩＬ−１活性が典型的には０．５０〜０．５５Ｍ
ＮａＣｌにおける鋭いピークにおいて溶出されたこと
を見出した。カラム画分を集め上記の如く分析した。 【００９１】ＩＬ−１の活性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
析は、約１７，５００ダルトンの分子量を有する単一蛋
白質バンドを示した。上記の高分子量バンドはカラムか
ら溶出され１５，０００及び１２，０００ダルトンの低
分子量のバンドはより高い塩濃度において溶出された。
活性ＩＬ−１画分について行われた分析は、約６．２×
１０6ＵのＩＬ−１の全活性、約９．５×１０8Ｕ／ｍｇ
の特異活性及び約６．５μｇの全蛋白質含量を示した。
これは９９％を越えるＩＬ−１の総括純度及び出発上澄
液からの約３１％の収率に相当する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
及び染料配位子アフィニティクロマトグラフィー後に集
められた画分の銀染色から得られた単一の蛋白質バンド
から、又、分析された画分の特異活性からも、ＩＬ−１
分子の本質的な等質性は本発明によりＩＬ−１の高収率
を維持しながら達成されたことは明らかである。 【００９２】染料配位子アフィニティクロマトグラフィ
ーから得られた等質なＩＬ−１は又上記の如く銀染色と
共に二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっても
分析された。この操作も首尾一貫して全く同一の分子
量、即ち１７，５００ダルトンにおいて４つの染色スポ
ットをもたらし、同一色を銀染色において染色した。こ
れらのスポットは出発上澄液のいずれのロットが使用さ
れたかの如何に拘らず、常に同一の位置及び同一の相対
割合にあった。最も強いスポットは６．３〜５．９のｐ
Ｉを示した。他の３つのスポットはｐＨ勾配がより酸性
になるにつれて、染色度が弱くなる。これらの結果はお
そらく異ったアミド化の状態によりヒトＩＬ−１はｉｎ
ｖｉｖｏにおいて異った荷電状態にあることを示して
いる。銀染色が各スポットに対して全く同一の色をもた
らすという事実は同一の親蛋白質は全ての場合において
染色している可能性が最も強いことを示している。 【００９３】例 ４ アフィニティクロマトグラフィー−青色染料 例３の代替法として、例２からの活性画分をプールし、
次いで染料配位子がアガロースマトリックスに架橋され
たＣｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）Ｂｌｕｅ ３６Ａ染料
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓメリーランド州、ベセスダ、Ｃａｔ．Ｎ
ｏ．５９０４ ＳＡ）で構成されている、他は例３にお
いて使用されたのと本質的に同一のアフィニティクロマ
トグラフィー技術により更に精製する。活性画分につい
て行われた分析は約５．０×１０6ＵのＩＬ−１の全活
性及び約７．６×１０8Ｕ／ｍｇの特異活性を示し、そ
れは赤色染料由来ＩＬ−１中に存在していた活性の約８
０％であった。より高い純度を達成するためには、青色
染料配位子アフィニティクロマトグラフィーからの活性
画分を集め、その操作を繰り返すことが出来る。 【００９４】例 ５ アミノ酸組成分析 例３或いは４からの精製ＩＬ−１を５．７Ｎ ＨＣｌ
（濃ＨＣｌ（Ｋｏｄａｋ，ニューヨーク州、ロチェスタ
ー）から再蒸留）中において、真空中で２４時間及び４
８時間沸騰させて、ペプチド結合の加水分解及び遊離ア
ミノ酸の放出を行なった。加水分解後、試料を真空乾燥
し、次いで０．２Ｎのクエン酸ナトリウム、ｐＨ２．２
中に再懸濁させた。これらの試料を次いでニンヒドリン
検出を用いる単一カラムＬＫＢ Ｍｏｄｅｌ ４１５０
−Ａｌｐｈａ（英国、ケンブリッジ）アミノ酸アナライ
ザー中に注入した。存在する特別のアミノ酸の量に対応
する出力「ピーク」の面積をＬＫＢ Ｍｏｄｅｌ ２２
２０記録積分計により積分した。 【００９５】本技術により決定されたヒトＩＬ−１のア
ミノ酸組成を下記の表Ｉに示す。表Ｉに示される如く、
上記アミノ酸分析からはグルコサミン或いはガラクトサ
ミンは観察されず、これはヒトＩＬ−１は単一分子量種
としてポリアクリルアミドゲル上を移動するという、本
発明者等の従来の発見に一致するものである。これらの
観察の一方或いは両方はもしヒトのＩＬ−１が、付着し
た炭水化物部分を含むならば反対となるであろう。この
様にして、ヒトＩＬ−１が糖蛋白質であることは有りそ
うにない。 【００９６】 【表１】表 １ ヒトＩＬ−１のアミノ酸分析 アミノ酸 分子当りの残基数 Ａｓｐ／Ａｓｎ １４ Ｔｈｒ ８ Ｓｅｒ １１ Ｇｌｕ／Ｇｌｎ ２２ Ｐｒｏ ６ Ｇｌｙ １１ Ａｌａ ８ Ｃｙｓ １＊ Ｖａｌ １１ Ｍｅｔ ４ Ｉｌｅ ６ Ｌｅｕ １１ Ｔｙｒ ４ Ｐｈｅ １１ Ｈｉｓ ３ Ｌｙｓ １３ Ａｒｇ ３ ＊アミノ酸配列分析より決定 【００９７】例 ６ 分子のＮ−末端部分のアミノ酸配列分析 例３或いは４の染料配位子アフィニティクロマトグラフ
ィーからの等質ＩＬ−１を含有する画分を先ず脱イオン
蒸留水で１０倍に希釈し、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．０に
調整し、次いで０．５ｍｌベッド容量のＳＰＳ Ｃ−２
５クロマトグラフィーカラムに適用した。ＩＬ−１の適
用前にカラムを０．１Ｍクエン酸ナトリウム、０．０５
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０で構成されている緩衝液で平
衡化させた。ＩＬ−１の負荷後カラムを１０ｍｌの同一
緩衝液で洗浄し、次いで２０ｍｌの脱イオン蒸留水で洗
浄した。その後、ＩＬ−１を１０ｍＭ ホウ酸ナトリウ
ムｐＨ９．０で溶出した。 【００９８】第１の配列決定分析操作において、上記の
如く濃縮した１１．１μｇの等質なＩＬ−１を真空乾燥
し、次いでＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍ
ｏｄｅｌ ４７０蛋白質配列決定器を用いて直接的に自
動化アミノ末端Ｅｄｍａｎ分解に付した。この方法によ
り本発明者等は、ＩＬ−１分子のＮ−末端部分が次の配
列のアミノ酸残基よりなることを発見した： 【化１０】ＮＨ2−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−
Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ-Ｔｈｒ-Ｌｅｕ-Ａｒ
ｇ-Ａｓｐ-Ｓｅｒ-Ｇｌｎ-Ｇｌｎ-Ｌｙｓ-Ｓｅｒ-Ｌｅ
ｕ-Ｖａｌ-Ｍｅｔ． 第２の配列決定分析操作において等質なＩＬ−１を酵素
トリプシンで分別し、次いで自動化配列決定分析に付し
た。ＩＬ−１分子のトリプシンによる分別前にリジン残
基の側鎖を特別の試薬無水シトラコン酸で保護した。こ
の目的のために、ＳＰＳ Ｃ−２５カラム溶出液からの
画分を真空中で１ｍｌの最終容積まで濃縮した。１μｌ
の無水シトラコン酸（Ｐｉｅｒｃｅ）を濃縮ＩＬ−１に
添加し、次いでｐＨを５Ｎ ＮａＯＨで８．３に調整し
た。反応混合物を１５分間撹拌し、室温で１時間放置し
た。その時点において、第２の１μｌ量の無水シトラコ
ン酸を添加し、反応混合物を更に１５分間撹拌し、次い
で混合物を５Ｎ ＮａＯＨで８．３の最終ｐＨに調整し
た。室温において更に１時間放置後１００μｌの１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４及び１００μｌの１Ｍ
ＮＨ4ＨＣＯ3、ｐＨ７．８を反応混合物に添加して保護
工程（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ）を完結させ
た。 【００９９】次に、２μｇをＴＰＣＫ−処理トリプシン
（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）（１０μｌの１０ｍＭ Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ２．０中）を反応混合物に添加し、ＩＬ−１
分子をアルギニン残基において切断した。トリプシン添
加後、混合物をゆっくり５秒間撹拌し、次いで３７℃に
おいて２時間インキュベートした。インキュベーション
時間の完了後、更に２μｇのＴＰＣＫ−処理トリプシン
を添加し、混合物を更に２時間３７℃でインキュベート
した。混合物を次いで室温に冷却し、９０％のギ酸（Ｂ
ａｋｅｒ）でｐＨ２．５に調整した。室温で４時間放置
後酸性化された混合物を０．５ｍｌの６Ｍグアニジン−
ＨＣｌを添加して希釈し、次いで予め水中０．１％ＴＦ
Ａ（ｖ／ｖ）で平衡化しておいた４．６×２５０ｍｍの
Ｖｙｄａｃ ２１８ ＴＰカラムにＢｅｃｋｍａｎ Ｍ
ｏｄｅｌ １１２ポンプ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｍｉｔｈ
Ｋｌｉｎｅ Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて約１ｍｌ／分の
流速で注入した。この負荷されたカラムを先ず水中０．
１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）で洗浄し、未結合成分を除去し、
次いでＩＬ−１ペプチド類を０．５％／分の割合で１ｍ
ｌ／分の流速で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）中０〜１００
％アセトニトリルの線形勾配でカラムから溶出させた。
ペプチド類の溶出は、２３０ｎｍ波長における紫外線分
光光度法により検出した。 【０１００】ＩＬ−１ペプチド類を含有する個々の画分
或いは２以上の画分より構成されているプールの配列決
定を、自動化アミノ末端Ｅｄｍａｎ分解により行った。
配列決定前にＩＬ−１を含有するＨＰＬＣ画分をゲル電
気泳動により分析して、各画分中のペプチドの数を決定
した。その後、ペプチド類を真空濃縮して約３０μｌの
最終容積にして調整されたフィルター上にスポットし、
次いで４４℃において加熱室で乾燥した。乾燥フィルタ
ーをＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ
Ｎｏ．４７０Ａ自動化蛋白質配列決定器中に入れた。
この操作により本発明者等は、Ｎ−末端部分近辺のヒト
ＩＬ−１分子の主たる断片は次のアミノ酸残基の配列よ
り構成されていることを発見した： 【化１１】Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｎ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ
−Ｖａｌ−Ｐｈｅ． この配列のＮ−末端の最初の四つの残基は上記において
直接自動化蛋白質配列決定により求められたＣ−末端の
最後の四つの残基と一致し、この中間配列は上記Ｎ−末
端配列の続きであるとの結論に導く。 【０１０１】例 ７ 例１の第１段落において説明したようにして調製された
単核細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地中に１０％ウシ胎児
血清（ｖ／ｖ）と共にプラスチック培養フラスコに入れ
た。３７℃における２時間のインキュベーション後、非
付着細胞をデカンテーション分離し、次いで２０μｇ／
ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＰＳを含有する追加の血清補給
ＲＰＭＩ−１６４０培地をフラスコに再び満たした。１
６時間後、付着ＬＰＳ刺激細胞をＲＮＡとして採取し
た。 【０１０２】全ＲＮＡは付着性単核細胞から上記Ｃｈｉ
ｒｇｗｉｎ等の方法により抽出した。この操作におい
て、グアニジニウムチオシアネートを使用してＲＮａｓ
ｅによるＲＮＡ加水分解の速度を越える速度でＲＮａｓ
ｅを含む細胞蛋白質を変性した。ｍＲＮＡは細胞蛋白質
からセシウムクロライドの密なクッションを介して超遠
心分離により除去した。 【０１０３】その後、ポリアデニル化ｍＲＮＡを上記マ
ニアティス等の文献１９７により開示されている方法を
用いてオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィー
カラム上で抽出蛋白質から分離した。簡単に述べると、
カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐＨ７．６）、
０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸
（「ＥＴＤＡ」）及び０．１％ＳＤＳにより構成されて
いる適用緩衝液で準備した。蛋白質ペレットを水及び適
用緩衝液に溶解し、次いでカラムに負荷した。非吸着物
質を先ず適用緩衝液で洗浄し、次いで０．１Ｍ ＮａＣ
１を含有する適用緩衝液による追加の洗浄により溶出し
た。保持されたポリアデニル化ｍＲＮＡは１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−Ｃ１（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び
０．０５％ＳＤＳにより構成されている減少されたイオ
ン強度の緩衝液を用いて溶出した。溶出されたポリアデ
ニル化ｍＲＮＡを−２０℃において１／１０容酢酸ナト
リウム（３Ｍ、ｐＨ５．２）及び２．２容のエタノール
を用いて沈殿させた。ポリアデニル化ｍＲＮＡをオリゴ
（ｄＴ）−セルロースカラムから溶出後、ポリアデニル
化ｍＲＮＡの完全性を上記マニアティス等の文献１９９
において詳説されているアガロースゲルによる電気泳動
により確認した。 【０１０４】ポリアデニル化ｍＲＮＡはメチル水銀アガ
ロースによる電気泳動により大きさの分類を行った。ｍ
ＲＮＡの異った大きさの群に対応するゲル画分を次いで
上述の如き、ウサギ網状赤血球溶解物を使用して或いは
アフリカツメガエル卵母細胞に注射してｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで翻訳した。網状赤血球翻訳或いはｍＲＮＡ注射卵母
細胞により放出された液体について、上記アッセイを用
いてＩＬ−１活性の存在を試験した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ
で翻訳された際に、ＩＬ−１活性を生じたｍＲＮＡゲル
画分をｃＤＮＡ構成のためのｍＲＮＡ源として選択し
た。 【０１０５】例 ８ ｅＤＮＡライブラリーの構成 ｍＲＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡのライブラリーを例
７の精製ｍＲＮＡから上記マニアティスらの文献２２９
により詳説されている標準的操作方法を用いて調製し
た。オリゴ−ｄＴをｍＲＮＡのポリアデニル化された尾
部にハイブリダイズさせ、第１のｃＤＮＡ鎖の逆転写の
ためのプライマーとして用いた。酵素鳥類骨髄芽球症ウ
ィルス（「ＡＭＶ」）の逆転写酵素がｍＲＮＡを鋳型と
して用いて第１のＤＮＡ鎖を合成した。この方法の結
果、最初のｃＤＮＡ鎖の３’末端にヘアピンループが形
成され、それは第２のｃＤＮＡ鎖の一体的プライマーと
して役立った。ｍＲＮＡ鎖をＮａＯＨで分解後、第２の
ｃＤＮＡ鎖をＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成した。
次いでヘヤピンをヌクレアーゼＳ1で除去して二本鎖ｃ
ＤＮＡ分子を形成した。 【０１０６】この二本鎖ｃＤＮＡをＳｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ−４００（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ）カラムクロマトグラフィーにより大きな分
類に分別し、末端標識化されたｐＢＲ３２２ ＤＮＡの
断片を分子量マーカーとして用いるアルカリアガロース
ゲル電気泳動を使用する分析により追跡した。５００ｂ
ｐ未満の長さを有するＤＮＡ鎖は、これらの望ましくな
いｃＤＮＡ画分の不必要なクローニングを避けるために
除外した。 【０１０７】上記の如く調製された二本鎖ｃＤＮＡ画分
を上記マニアティス等の文献の２３９に始まる方法によ
りｐＢＲ３２２プラスミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉ
ｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ）のＰｓｔＩ部位中に挿入し
た。この操作において二本鎖ｃＤＮＡはその３’末端に
おいてポリ（ｄＣ）でテーリングされた。プラスミドｐ
ＢＲ３２２をＰｓｔＩエンドヌクレアーゼで消化し、次
いで３’末端にポリ（ｄＧ）でテーリングした。テーリ
ングされたプラスミドＤＮＡ及びテーリングされたｃＤ
ＮＡをアニーリング緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ，１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１（ｐＨ７．８）及び１０ｍＭ Ｅ
ＴＤＡ）でアニーリングし、新規な組み換えプラスミド
を形成した。ここに記載される全ての制限酵素はＮｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ
州、ベバリーから市販されているものである。 【０１０８】これらの組み換えプラスミドは上記ハナハ
ンの操作方法を用いてＥ．ｃｏｌｉ菌株ＭＭ２９４中に
形質転換された。ここに用いられたＥ．ｃｏｌｉ細胞は
高められた割合のＭｇ2+中における生育により調製され
た。形質転換宿主をプレート培養し、次いで形質転換体
を表現形同定剤としてテトラサイクリンを使用して同定
した。この技術を使用することにより、本発明者等は約
２×１０6個の独立の形質転換体を得た。 【０１０９】例 ９ 合成オリゴヌクレオチドスクリーニングプローブの調製 上記例８におけるようにして調製したｃＤＮＡライブラ
リーのスクリーニングにおけるプローブとして合成オリ
ゴヌクレオチドを使用した。このプローブは次の組成に
より構成されているものであった： 【化１２】 ５’ＡＣ ＴＴＧ ＴＴＧ ＴＴＣ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＴＧ ＧＣＣ ＴＴＧ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＧＧＣ ＴＴＴ ＣＡＧ ＴＴＣ ＧＴＡ ＧＧＧ ＧＣＣ ＧＧＡ ＣＡＴ ３’． このオリゴヌクレオチドプローブは上記スード等の文献
及び上記ヒロセ等の文献に詳説されているトリエステル
法により化学的に合成されたものであった。 【０１１０】化学合成が完了後、オリゴヌクレオチドプ
ローブの５’−末端を32Ｐで標識化した。標識化を容易
にすするためにオリゴヌクレオチドの５’末端はＯＨ末
端で合成され、それによりＤＮＡ断片の標識化をする際
に典型的に使用されなければならないホスファターゼ処
理を除去した。標識化方法は１μｌの合成オリゴヌクレ
オチドを１６μｌの32Ｐ−ＡＴＰ（３０００ｃｉ／ｍ
Ｍ）、１μｌ（１０Ｕ）のＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ及び２μｌの１０×キナーゼ緩衝液Ｉに添加すること
を含むものであった。１０×キナーゼ緩衝液Ｉは、０．
５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃ１（ｐＨ７．６）、０．１Ｍ Ｍｇ
Ｃｌ2、５０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭスペルミ
ジン及び１ｍＭ ＥＴＤＡより構成されているものであ
った。反応は３７℃で３０分間行われ、その後合成され
たオリゴヌクレオチド類をフェノール／クロロホルムで
抽出した。標識化されたプローブを未標識化オリゴヌク
レオチド類からＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ）上の
クロマトグラフィー或いはそれを通して遠心分離により
分離した。 【０１１１】例１０ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 上記例９において調製したｃＤＮＡライブラリーの最初
のスクリーニングを容易に行うために形質転換細菌培養
物を各々、約２，０００個の形質転換体の異ったクロー
ンを有する群にプール分けした。プラスミドＤＮＡをイ
シューホロヴィッツ及びバーク［Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉ
ｃｚ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ，９ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２９８９（１９８１）］に詳説されている標
準的アルカリ溶解法により宿主細菌の試料から除去し
た。単離されたプラスミドを２つのフラグメントに分離
した。これは先ずプラスミドを完全にＰｖｕII及びＨｉ
ｎｄIIIで消化することにより達成された。この目的の
ために、プラスミド類を２０μｌの１×ＨｉｎｄIII緩
衝液（７ｍＭ、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、７ｍＭ塩化マ
グネシウム、６０ｍＭ ＮａＣｌ）に再溶解し、次いで
１μｌのＰｖｕII及び１μｌのＨｉｎｄIII制限エンド
ヌクレアーゼを添加した。この混合物を３７℃で２時間
インキュベートした。 【０１１２】次に、プラスミド消化物を適当な大きさの
マーカーを用いて０．８％アガロースゲルによる電気泳
動により分別した。アガロースゲルは上記サザンにより
説明されている標準的方法を用いてニトロセルロースフ
ィルター上にプロットさせた。この転移操作後、フィル
ターを風乾し、約８０℃で真空下に２時間焼成し、ＤＮ
Ａ断片をニトロセルロースに結合させた。 【０１１３】結合されたＤＮＡを次いで標識化されたオ
リゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした。簡単
に述べると、焼成されたニトロセルロースを６×クエン
酸ナトリウム塩水（「ＳＳＣ」）（２０×ＳＳＣは８０
０ｍｌのＨ2Ｏ中１７５.３ｇのＮａＣｌ及び８８.２ｇ
のクエン酸ナトリウムにより構成され、ｐＨは１０ＮＮ
ａＯＨで７．０に調整されている）中に予備浸漬し、次
いで６×ＳＳＣ、０．５％ＮＰ４０洗剤、０．１％サレ
オシル、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶液（０．０２％Ｆｉ
ｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２
％ＢＳＡ）及び１００μｇ／ｍｌの変性鮭精液ＤＮＡ
（Ｓｉｇｍａ ＴｙｐｅIII、ナトリウム塩）より構成
されているプレハイブリダイゼーション緩衝液中におい
て５０℃で２〜４時間インキュベートした。フィルター
を、次いで上記ハイブリッド化溶液中において32Ｐ−標
識化オリゴヌクレオチドプローブ（１０6ｃｐｍ／μ
ｇ）（例３からのもの）で５０℃において一晩インキュ
ベートした。一晩のハイブリダイゼーション後、フィル
ターを室温で十分に６×ＳＳＣで洗浄し、次いで５０℃
で６×ＳＳＣにより５分間洗浄した。風乾後フィルター
を−７０℃でオートラジオグラフィーに付した。 【０１１４】オートラジオグラフィーから本発明者等は
幾つかのハイブリッド化バンドを見出した。プラスミド
ＤＮＡがハイブリッド化バンドを生成したクローンのプ
ールをプレートから取り出し次いで上記と同一のハイブ
リッド化条件下において標識化されたオリゴヌクレオチ
ドプローブを用いたニトロセルロースペーパー上の直接
細菌コロニーハイブリッド化に使用した。この方法によ
り、単一のコロニーが同定された。 【０１１５】例１１ スクリーニングされたｃＤＮＡの制限酵素マッピング ＩＬ−１ Ｘ−１４と称されるプラスミドが例１０に示
された操作により同定された陽性のコロニーから調製さ
れた。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＲＲ１中に形質転換されたＩＬ
−１ Ｘ−１４プラスミドの試料はＡＴＣＣに寄託番号
３９９２５で寄託されている。その後このＩＬ−１Ｘ−
１４プラスミドを、線形化されたＤＮＡの末端標識化さ
れた断片の部分消化を含む上記スミス及びブリンスチー
ルにより開発された技術を用いて制限酵素マッピングに
より分析した。ＤＮＡ断片をそれらの５’末端において
ポリヌクレオチドキナーゼ及び32Ｐ−ＡＴＰを用いて32
Ｐ−ホスホリル基で標識化した。標識化したＤＮＡ鎖を
次いで非対称的に適当な制限酵素で切断して各々その一
方の末端で標識された二つの断片を与えた。これらの標
識化された断片をゲル電気泳動により単離した。これら
の二つの断片の各々を適当な制限酵素により部分的に消
化した。大きなスペクトルの消化断片が生成されるが、
標識化された断片は各々共通の標識化された末端を有す
る単純な重複系列を形成する。これらの断片をゲル電気
泳動により分別し、次いでオートラジオグラフィーによ
り検査した。ゲル上の断片の位置は、プラスミドＤＮＡ
に沿った制限部位の順序に直接対応する。 【０１１６】この操作により本発明者等は、ＩＬ−１遺
伝子の領域におけるＩＬ−１Ｘ−１４のプラスミドの制
限部位を第３図に示されるように部分的にマッピングし
た。遺伝子の制限部位間に示される番号は塩基対にある
部位間の近似的距離に対応する。 【０１１７】例１２ スクリーニングされたｃＤＮＡの配列決定 第３図に示されるＤＮＡセグメントの配列決定は以下に
述べる変更を除いては上記Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈａｎｄ
ｂｏｏｋに記載されている方法と本質的に同一のジデオ
キシ連鎖−停止方法により行った。ＤＮＡセグメントを
ＨｉｎｄIII及びＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消
化し、次いで得られたＤＮＡ断片をＭ１３一本鎖フィラ
メント状ファージベクターの菌株ｍｐ１８及びｍｐ１９
（Ａｍｅｒｓｈａｍ イリノイ州、アーリントンハイ
ツ）にクローン化させた。上記ノランダー等の文献に示
されているこれらのｍｐ１８及びｍｐ１９ファージベク
ターは次の独特のクローニング部位を含有する：Ｈｉｎ
ｄIII；ＳｐｈＩ；ＰｓｔＩ；ＳａｌＩ；ＡｃｃＩ；Ｈ
ｉｎｃII；ＸｂａＩ；ＢａｍＨＩ；ＸｍａＩ；Ｓｍａ
Ｉ；ＫｐｎＩ；ＳｓｔＩ；及びＥｃｏＲＩ。ｍｐ１８及
びｍｐ１９ベクターの組成は上記制限部位の順序がｍｐ
１９ベクターにおいては反対になっていることを除いて
は同一であり、従って、ＤＮＡセグメントの両鎖をこれ
らの二つのベクターを用いて便利に配列決定することが
出来る。これらのｍｐ１８及びｍｐ１９ベクターは第３
図のｃＤＮＡセグメントの断片をその中に挿入されて菌
株Ｋ１２のＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０３及びＪＭ１０５
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州、ベセスダ）を形質転換
するために使用され、センス及びアンチセンス鎖の一本
鎖インサートを含有する複製一本鎖ＤＮＡ鋳型を生成し
た。 【０１１８】合成のユニバーサルのプライマー：５’−
ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴ−３’（Ｐ−Ｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ウイスコンシン州、ミルウォー
キー）をアニーリングして、一本鎖ＤＮＡ鋳型にし、上
記ヌクレオチド４７６〜４７７（第４図）の位置から上
流及び下流のＤＮＡ合成を開始するのに使用した。その
後、延長断片をゲル電気泳動により大きさ分離し、オー
トラジオグラフにかけ、断片のヌクレオチド断片を推定
した。三つの追加のプライマーを使用して、第４図のＤ
ＮＡのセンス鎖に沿った中間位置からの合成を開始し
た。ヌクレオチド６７１〜６８８（第４図）に対応する
５’−ＣＴＧＧＡＧＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＣ−３’の組
成を有するプライマーを使用して、ヌクレオチドＮｏ．
６８８から下流方向へのセンス鎖の合成を開始した。こ
のプライマー鎖の組成はユニバーサルなプライマーを使
用して予め得られた配列情報から確立された。組成：
５’−ＧＡＴＡＴＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣ−３’（第
４図のヌクレオチド８５１〜８６８に対応）の第２の合
成プライマーを使用してヌクレオチドＮｏ．８６８から
下流方向のセンス鎖の配列化をした。配列：５’−ＧＡ
ＴＴＣＧＴＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣ−３’（ヌクレオチド
Ｎｏ．２３５〜Ｎｏ．２１８に対応）を有する第３のプ
ライマーを使用してヌクレオチドＮｏ．２１８から上流
方向のアンチセンス鎖の配列化を行った。 【０１１９】上記の「歩み寄り（ｗａｌｋ ｄｏｗ
ｎ）」法により、第３図のプラスミドｃＤＮＡの両鎖は
重複した方法で配列決定され、それによりそれらのヌク
レオチド配列が確認された。本発明の趣旨から離れるこ
となく鎖に沿った他の位置から鎖延長を開始するために
その他の合成プライマーを使用することが可能であった
ことが了解されるべきである。上記プライマー鎖は上記
文献のスード等及び上記ヒロセ等の文献に詳説されてい
るトリエステル法により化学的に合成されたものであ
る。しかしながら、ホスホジエステル法などによるその
他の公知の技術を使用して、プライマー鎖を合成するこ
とができることが了解されるべきである。 【０１２０】デオキシアデノシン５’（アルファー［35
Ｓ］チオ）トリホスフェート（以下に「ｄＡＴＰ［α−
35Ｓ］」と称する）をジデオキシ配列反応における放射
活性標識として使用した。又、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋの３６頁に示されているゲルを使用する代
りに６％のポリアクリルアミドゲルを使用した（６％ポ
リアクリルアミドゲル、０．４ｍｍ厚、７Ｍ尿素１００
ｍＭ Ｔｒｉｓホウ酸塩（ｐＨ８．１）及び２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ含有）。 【０１２１】上記の如く第３図のプラスミドＤＮＡのヌ
クレオチド配列は第４図に図示されている。このＤＮＡ
のセグメントは成熟ＩＬ−１をコードするＩＬ−１遺伝
子の領域を含むことが見出された。これらのヌクレオチ
ド鎖は第４図のＤＮＡセグメントの始めから番号を付さ
れている。ヌクレオチド配列及び蛋白質配列分析により
求められた対応するアミノ酸は適当なコドンの上に示さ
れている。ＩＬ−１遺伝子のアミノ酸配列は、ＩＬ−１
分子の成熟ＮＨ2−末端、即ち第４図において矢印で印
されているＡｌａ残基（ここからアミノ酸残基の付番が
始まる）から停止コドンＴＡＡの直前のＳｅｒ残基（Ｎ
ｏ．１５３）まで延びている。各種制限酵素切断部位も
第４図に示されている。第４図におけるＩＬ−１遺伝子
のコード化領域は第３図における箱で囲んだ部分に図示
されている。 【０１２２】ＩＬ−１アミノ酸配列研究は上記スターン
等の文献の方法に従って行われたが、この方法において
はシアノ−ゲンブロマイドを用いてＩＬ−１をメチオニ
ン残基において切断した。得られた断片は標準的イオン
交換方法により大きさにより分離された。単離されたペ
プチド断片は次いでＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ Ｍｏｄｅｌ ４７０蛋白質配列決定器を用いて自
動化アミノ末端Ｅｄｍａｎ分解により配列決定された。
この方法により本発明者等は、ヌクレオチド配列により
得られた結果、即ちＩＬ−１蛋白質のＣ−末端がアミノ
酸配列：Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒによ
り構成されていることを確認した。これは、「天然」の
ＩＬ−１はｍＲＮＡからの翻訳後この分子末端からのア
ミノ酸除去により生成されないことを確立する。これ
は、第４図のＩＬ−１遺伝子のヌクレオチド配列から相
当な量のＲＮＡ配列がＩＬ−１のその前駆体からの成熟
に際し、ＩＬ−１遺伝子のＮ−末端から除去されている
のが明らかであるので重要である。 【０１２３】例１３ 成熟ＩＬ−１の発現 ＩＬ−１遺伝子のコード化領域を第３図のｃＤＮＡクロ
ーンから切り出し、次いでｐＹ ＡＤＨシャトルベクタ
ー中に挿入して組み換え発現プラスミドｐＹＡＤＨ Ｉ
Ｌ−１を形成した。ｐＹ ＡＤＨ ＩＬ−１シャトル発
現ベクターを調製するための再構成図式を第５図に示
す。このプラスミドはＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞中で増幅さ
れ、次いで成熟ＩＬ−１の高割合発現のために酵母宿主
細胞を形質転換するために使用される。発現されたＩＬ
−１の官能性は上記胸腺細胞増殖及びＩＬ−２転換アッ
セイを用いて確認された。 【０１２４】ＨｐａII部位（第４図の塩基＃４５７）か
ら遺伝子の３’側面領域に至るＩＬ−１遺伝子のコード
化領域の主たる部分を、上記マニアティス等の文献の１
０４に示されている標準的実験方法においてＨｐａII及
びＰｓｔＩ制限酵素を使用することにより第３図及び第
４図に図示するｃＤＮＡプラスミドセグメントから除去
した。このＩＬ−１遺伝子セグメントは、遺伝子の５’
末端に正確に対応する便利な制限部位が見出されなかっ
たので遺伝子の５’末端から２９ヌクレオチド下流に位
置するＨｐａII部位においてｃＤＮＡクローンから切断
した。切り出されたＩＬ−１遺伝子セグメントの３’−
ＰｓｔＩ部位はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで満たされ以
下に述べるシャトルベクターのＳｔｕＩ部位と適合性の
あるブラントエンドを形成した。 【０１２５】ＩＬ−１遺伝子のコード化領域の５’末端
部分を戻し添加するため及びコード化領域の５’末端に
おいて翻訳開始コドンを創り出すために合成オリゴヌク
レオチドを化学的に合成した。このオリゴヌクレオチド
の組成は下記表IIに示す如くＥｃｏ ＲＩ付着５’末端
に続いてＡＴＧ開始コドンがあり、次いでＩＬ−１遺伝
子のコード化領域の５’末端（ＨｐａII部位に至る）を
含む。表IIに示されたオリゴヌクレオチドは上記スード
等及び上記ヒロセ等の文献に詳説されているトリエステ
ル技術により化学的に合成されたものであるが、このオ
リゴヌクレオチドはホスホジエステル法などの他の方法
により調製することができることが了解されるべきであ
る。 【０１２６】 【表２】表II ECOR1 Met Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu 5'-AATTCAAC ATG GCA CCT GTA CGA TCA CTG AAC TGC ACG CCT -3' GTTG TAC CGT GGA CAT GCT AGT GAC TTG ACG TGC GAGGC HpaII 【０１２７】又、ＩＬ−１遺伝子のコード化領域をＨｐ
ａII部位において切断する代りに第４図のプラスミドｃ
ＤＮＡを遺伝子の５’側面領域における制限酵素におい
て切断することも可能である。その後側面領域のヌクレ
オチド類は標準的技術により逐次除去することができ
る。 【０１２８】ｐＹ ＡＤＨシャトルベクターは、この合
成オリゴヌクレオチド及び切り出されたＩＬ−１遺伝子
のコード化領域の主たる部分を連結するために上記マニ
アティス等の文献の１０４において示されている標準的
技術によりベクターを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ
ＲＩ及びＳｔｕＩを用いて完全に消化することにより調
製された。ｐＹ ＡＤＨプラスミドの消化から得られた
所望のより大きな断片は０．７％アガロースゲル上１０
０ボルトにおいて２２℃で２時間電気泳動を行うことに
より単離された。 【０１２９】第５図に示す如く、合成ＤＮＡオリゴマ
ー、ＩＬ−１遺伝子のコード化領域の切り出された主た
る部分及び所望の線形化されたｐＹ ＡＤＨ断片は、１
００μｇのｐＹ ＡＤＨベクター断片（Ｅｃｏ ＲＩ−
ＳｔｕＩ）、４０μｇの主たるＩＬ−１ ｃＤＮＡ断片
（ＨｐａII−ＰｓｔＩ［ブラント］）、５μｇの合成オ
リゴヌクレオチド（Ｅｃｏ ＲＩ−ＨｐａII）、１μｌ
のＴ４ ＤＮＡリガーゼ及び十分なＴ４リガーゼ緩衝液
（０．４Ｍ Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．４］、０．１ＭＭｇＣ
ｌ2、０．１Ｍジチオスレイトール、１０ｍＭスペルミ
ジン、１０ｍＭＡＴＰ及び１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）より構
成されており、２０μｌの反応容量を形成する反応混合
物中で一緒に連結された。反応は１５℃において１５時
間インキュベートすることにより行われた。 【０１３０】得られたｐＹ ＡＤＨ ＩＬ−１と称され
る組み換えプラスミドを次いで上記ボリバー等及び上記
ピーコック等の文献に示されているような標準的形質転
換技術を用いてＥ．ｃｏｌｉ菌株ＲＲ１中に形質転換さ
せた。宿主細胞を培養してｐＹ ＡＤＨ ＩＬ−１プラ
スミドを増幅し、次いでプラスミドを上記マニアティス
等の文献３６８及び上記インシュ−ホロビッツ及びバー
ク等により詳説されている標準的アルカリ方法により宿
主細菌から除去した。プラスミドＤＮＡを上記マニアテ
ィス等の文献の９３に示されているセシウムクロライド
−エチジウムブロマイド密度勾配における平衡になるま
で遠心分離して精製した。本発明の範囲及び趣旨から離
れることなく、その他のＥ．ｃｏｌｉから増幅されたプ
ラスミドＤＮＡを抽出／濃縮する技術を使用することが
出来ることを了解すべきである。 【０１３１】上記の如く調製された増幅ｐＹ ＡＤＨ
ＩＬ−１プラスミドを次いで使用して標準的技術により
Ｓ．セレビジアエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のプロ
ターゼ欠陥酵母菌株２０Ｂ−１２（アルファ、ｐｅｐ
４．３、Ｔｒｐ１）を形質転換させた。形質転換に先立
ち、２０Ｂ−１２菌株をＹＰ−グルコース培地（２００
ｍｌ）中の培養液中で生育させて２×１０7細胞個／ｍ
ｌの培養物を得た。これらの細胞を２２℃において５分
間１０００×ｇの遠心分離で採取し、次いで得られたペ
レットを無菌蒸留水で洗浄した。 【０１３２】これらの酵母細胞を次いで２０ｍｌのＳＥ
Ｄ（１Ｍソルビトール、２５ｍＭＥＴＤＡ［ｐＨ８．
０］、及び５０ｍＭジチオスレイトール）中に再懸濁さ
せて濃縮し、３０℃で１０分間インキュベートした。細
胞−緩衝液混合物を次いで３００×ｇで５分間遠心分離
した。ペレットを２００ｍｌの１Ｍソルビトールで一度
洗浄し、細胞を２０ｍｌのＳＣＥ（１Ｍソルビトール、
０．１Ｍクエン酸ナトリウム［ｐＨ５．８］、０．１Ｍ
ＥＴＤＡ）中に再懸濁した。細胞壁を破壊するために
グルスラーゼを０．２ｍｌの量で溶液に添加し、次いで
溶液を時々静かに振盪しながら３０℃で３０分間インキ
ュベートした。 【０１３３】スフェロプラストの存在は、１０μｌの酵
母細胞を顕微鏡スライド上に一滴の５％ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）（ｗｔ／ｖｏｌ．）中に希釈し、４
００×位相差における「ゴースト」を観察して分析し
た。 【０１３４】細胞混合物を次いで３００×ｇで３分間遠
心分離した。得られたペレットを２０ｍｌの１Ｍソルビ
トールで２回洗浄した。ペレットを次いで１回ＳＴＣ
（１Ｍソルビトール、１０ｍＭ ＣａＣｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ［ｐＨ７．５］）で洗浄した。 【０１３５】酵母スフェロプラストを次いでベッグス
［Ｂｅｇｇｓ，２７５ Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）
１０４（１９７８）］から適用された方法において予め
調製されたプラスミドベクターを用いて形質転換した。
ペレット化されたプロトプラストを１．０μｌのＳＴＣ
に懸濁させ、次いで１０μｌの使い捨てチューブ（Ｆａ
ｌｃｏｎ ＃ ２０５９）中の１００ｍｌのアリコート
に分割した。次いで１〜１０μｌのＤＮＡプラスミドを
各アリコート（０．５〜５μｇ）に添加した。混合物を
室温で１０分間静置し、次いで１ｍｌのＰＥＧ（２０％
ＰＥＧ ４０００、１０ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］）を各アリコートに添
加してＤＮＡ摂取を促進した。室温において１０分後、
混合物を３５０×ｇにおいて５分間遠心分離した。得ら
れたペレットを１５０μｌのＳＤＳ（１０ｍｌの２Ｍソ
ルビトール、６．７μｌのＹＥＰ［０．１３ｍｌの１Ｍ
のＣａＣｌ、２７μｌの１％ロイシン、及び３．７ｍｌ
のＨ2Ｏ］）に再懸濁させた。この混合物を３０℃で２
０分間インキュベートした。 【０１３６】その後、プロトプラスト／ＤＮＡ混合物を
１．２Ｍソルビトール及び３％寒天を含む酵母最少培地
の存在下において４５℃で且つトリプトファンなしにプ
レート培養した。この最少培地は０．６７Ｄｉｆｃｏ酵
母、窒素塩基、０．５％カザミノ酸、２％グルコースよ
り構成されているものであった。プロトプラスト／ＤＮ
Ａ混合物をこの培地中に維持することによりＴｒｐ／遺
伝子を含有する形質転換体のみが生き残った。 【０１３７】生物学的アッセイの前に、形質転換体を最
少培地から富有培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、
２％グルコース）に接種し、後期指数的生長相まで３０
℃で１５〜２０時間生育させた。採取時にプロテアーゼ
阻害剤フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳ
Ｆ）を１ｍＭまで添加した。培養物を次いで４００×ｇ
で遠心分離して細胞をペレット化した。その後細胞を１
度０．１ｖｏｌ．の冷Ｈ2Ｏ中において洗浄した。破壊
するために細胞を１ｍＭ ＰＭＳＦを含有する０．１
ｖｏｌ．の冷Ｈ2Ｏに再懸濁させ、ガラスビーズ（1/3
容）を用いて２分間渦巻き撹拌させた。細胞残骸及びガ
ラスビーズを遠心分離によりペレット化した。得られた
上澄液はＩＬ−１活性を示すことが判明した。これは上
澄液を上記胸腺細胞増殖及びＩＬ−１転換アッセイの両
者において利用することにより確認された。 【０１３８】本発明の分野の当業者には明らかな如く、
本発明の趣旨即ち本質的特徴から離れることなく特に開
示された実施態様以外の形態で本発明を実施することが
可能である。従って、上記本発明の特別の実施態様はあ
らゆる面において例示的なものであり限定的なものでは
ない。本発明の範囲は前記説明に含まれる具体例に限定
されるものではなく冒頭の特許請求に掲げられる通りの
ものである。
（以下「ＩＬ−１」と称する）に関する。より詳しく
は、精製されたＩＬ−１、ＩＬ−１の等質状態への精製
方法、並らびに精製されたＩＬ−１のアミノ酸配列から
得られる合成オリゴヌクレオチドプローブを使用してＩ
Ｌ−１の遺伝子をクローニングしてＩＬ−１メッセンジ
ャーリボ核酸（「ｍＲＮＡ」）から合成される相補的デ
オキシリボ核酸（「ｃＤＮＡ」）ライブラリーをスクリ
ーニングすること、およびスクリーニングされたＩＬ−
１遺伝子の特性づけに関するものである。 【０００２】 【従来の技術】従来文献において「リンパ球活性化因
子」即ち「ＬＡＦ」として知られているＩＬ−１はマク
ロファージにより免疫応答を行いながら産生されるホル
モンである。この蛋白質因子は広範囲の免疫学的及び非
−免疫学的応答を支配する。例えば、ＩＬ−１は、内因
性或いは白血球発熱物質、Ｂ−細胞活性化因子（ＢＡ
Ｆ）、表皮胸腺細胞活性化因子（ＥＴＡＦ）、白血球内
因性メディエータ（ＬＥＭ）、慢性関節リューマチにお
ける骨吸収因子及び各種のその他の活性として称されて
いる活性を仲介するものと考えられている。その様なも
のとして、ＩＬ−１は上記活性を含むものとして本発明
において定義される免疫応答の治療の仲介を行うものと
して有望である。 【０００３】研究者はこれまでにＩＬ−１の多くの生物
学的特性を明らかにしてきたが、しかし、このホルモン
の化学的性質はよく理解されていない。今日まで、これ
は少なくとも部分的に必要な研究を行うために十分な量
の精製された形態でのＩＬ−１が利用可能でなかったこ
とにより妨げられてきたものである。 【０００４】過去において、ヒト及びネズミ源から得ら
れたＩＬ−１を精製し、部分的に特性評価を行う試みが
なされている。例えばマイゼル［Ｍｉｚｅｌ、１２２
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１６７−２１７２（１９７
９）］はマクロファージ細胞系統Ｐ３８８Ｄ1からのネ
ズミＩＬ−１の産生を報告している。培養液からのＩＬ
−１が硫酸アンモニウム沈殿、ジエチルアミノエチル
（「ＤＥＡＥ」）セルロースカラムクロマトグラフィ
ー、限外濾過及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００カラム
クロマトグラフィーに付された。得られた活性画分は１
２，０００〜１６，０００ダルトンの範囲の分子量を有
することが判明した。ポリアクリルアミドゲル中におけ
る等電点電気泳動によりＩＬ−１のｐＩは５．０〜５．
４の範囲にあることが判明した。 【０００５】引き続く報告において、マイゼル等［Ｍｉ
ｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，１２６ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
８３４〜８３７（１９８１）］は、上掲のマイゼエルの
文献において使用された同一のＰ３８８Ｄ1細胞系統か
らのＩＬ−１を硫酸アンモニウム沈殿、フェニルセファ
ロースクロマトグラフィー、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ
５４ゲル濾過クロマトグラフィー及び調整用平坦−床Ｉ
ＥＦにより「見かけ上の等質状態」まで精製することを
論じている。得られたＩＬ−１は約４．９〜５．１のｐ
Ｉ及び約１４，０００ダルトンの分子量を有することが
判明した。 【０００６】ブライデン等［Ｂｌｙｄｅｍ ｅｔ ａ
ｌ．，１１８ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１６３１−１６３８
（１９７７）］はＳｅｌｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００カラ
ムクロマトグラフィーによりヒトの末梢血液白血球から
調製されたＩＬ−１の濃縮方法を開示した。この方法は
粗製ＩＬ−１の４〜５倍の濃度が得られると報告され
た。粗製ＩＬ−１の調製の際に使用された血清からアル
ブミンを除去するためにＤＥＡＥ−Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａ
アニオン交換クロマトグラフィーが使用された。次いで
集められた活性画分がヒドロキシアパタイトカラムに吸
着され、次いでＣＭ−Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａカチオン交換
樹脂に適用された。これらの研究者はこれらの操作によ
り約２０％の最初のＩＬ−１が回収されたと報告されて
いる。得られたＩＬ−１は約１３，０００ダルトンの分
子量及び約６．８〜７．２のｐＩを有することが判明し
た。 【０００７】トガワ等［Ｔｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，
１２２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１２〜２１１８（１
９７９）］によりヒト白血球から調製された粗製ＩＬ−
１を先ず膜濾過に付し、次いでＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−１
００クロマトグラフィーカラムにかけたところ、これは
２個の主たる活性ピークを示し、その一つは１２，００
０〜２２，０００ダルトンの範囲にあるピークをもう一
つは約５０，０００〜７０，０００ダルトンの範囲のピ
ークを示した。低分子量領域の活性画分をプールし、次
いで青色Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム、ＤＥＡＥ−セルロ
ースイオン交換クロマトグラフィーカラム及びヒドロキ
シアパタイトクロマトグラフィーカラムにかけた。トガ
ワ等はこれらの操作の各々から得られる低分子量ＩＬ−
１活性が２％のヒト血清で戻され、濃縮され、及びＢｅ
ｏ−Ｇｅｌ Ｐ−１００上で再クロマトグラフを行なわ
れると相当な部分の高分子量活性が出現することを発見
した。 【０００８】ラッハマン［Ｌａｃｈｍａｎ，４２ Ｆｅ
ｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅ−ｄｉｎｇｓ ２６３
９−２６４５（１９８３）］は、急性単核細胞白血病或
いは急性骨髄性単核白血病患者から得られた末梢血液単
核細胞或いは白血病細胞からＩＬ−１を調製することを
報告した、殆んどの血清蛋白質から低分子量活性を分離
するために中空糸透過濾過及び限外濾過が使用された。
この低分子量活性はアンホリン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）
及びショ糖勾配中におけるＩＥＦに付された。この方法
によりＩＬ−１活性は約６．８〜７．２のｐＩ及び約１
１，０００ダルトンの分子量を有することが判明した。
ラッハマンは上記方法からのＩＬ−１活性の全体回収率
は悪く、約４％の範囲であると報告した。 【０００９】適量の均質なヒトＩＬ−１の利用可能性は
関節炎及びエリテマトーデスなどの自動免疫障害の研究
及び可能性のある治療において貴重であり得る。又、こ
れまでに利用可能であったよりもより純度が高く且つ多
量のヒトＩＬ−１は首尾よく傷及び火傷の治癒を達成す
るために有用となり得るものである。 【００１０】比較的多量の均質なヒトＩＬ−１を提供す
るための潜在的な方法は組み換えＤＮＡ技術によるもの
である。組み換えＤＮＡ技術は、蛋白質をコードする遺
伝子が一度単離され、且つ同定されると所望の蛋白質を
経済的に製造するために開発されてきた。その様な蛋白
質製造のための組み換えＤＮＡ技術の説明はＳｃｉｅｎ
ｃｅ誌の１９６巻（１９７７年４月）の編集及び賛助論
文に示されている。しかしながら、この文献に論じられ
ている組み換えＤＮＡ技術を利用するためにはヒトＩＬ
−１をコードする遺伝子を先ず単離しなければならな
い。 【００１１】 【発明が解決しようとする課題】本発明はＩＬ−１、ヒ
トＩＬ−１の等質状態までの精製、及び等質ＩＬ−１の
アミノ酸組成及び部分的アミノ酸配列の決定に関するも
のである。本発明に従い、ＩＬ−１の粗製調製物をイオ
ン交換クロマトグラフィーとアフィニティークロマトグ
ラフィー方法との組み合わせにより精製した。この精製
方法のアフィニティークロマトグラフィー部分は不溶性
マトリックスに結合した染料リガンドを利用した。従来
技術に基づいて、同一の精製方法は他の哺乳動物種、例
えばネズミ、ウシ、あるいはブタのＩＬ−１からのＩＬ
−１に対して首尾よく使用することが出来るものと思わ
れる。 【００１２】一度等質状態にまで精製されると、ＩＬ−
１分子のアミノ酸組成及び配列が分析された。分子のア
ミノ酸組成はアミノ酸アナライザーを使用して確認され
た。ＩＬ−１分子のＮ−末端部分のアミノ酸配列は、直
接エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解技術により、又、最初に
分子を分別し、高圧液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬ
Ｃ」）により断片を分離し、次いでＩＬ−１ペプチドを
含有するＨＰＬＣ画分をエドマン分解法により分析する
ことにより求めた。 【００１３】本発明の更に別の側面に従えば、ヒトＩＬ
−１をコードする遺伝子がｃＤＮＡライブラリーから上
記の如く求めたヒトＩＬ−１のアミノ酸配列の部分に対
応する合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて単離さ
れた。全ヒトＲＮＡは比較的高割合のＩＬ−１を産生す
ると考えられた細胞から抽出された。ポリアデニル化ｍ
ＲＮＡは全ＲＮＡ抽出物から単離された。ｃＤＮＡライ
ブラリーはサイズ分離ポリアデニル化ｍＲＮＡの逆転写
酵素による逆転写によって構成された。ＤＮＡはＤＮＡ
ポリメラーゼＩを用いて二本鎖にし、適当なクローニン
グベクター中に挿入した。得られた組み換えクローニン
グベクターを使用して適当な宿主を形質転換させた。 【００１４】形質転換された宿主を同定し、プールに組
み分けした。これらのプールから調製されたプラスミド
ＤＮＡを放射線標識されたオリゴヌクレオチドプローブ
とハイブリッド化した。プローブに対して陽性の信号を
与えたクローンのプールを同定し、次いで推定されたプ
ールを小分けし、ハイブリッド化スクリーニングを繰返
した。この操作により単一の形質転換体を最終的に同定
した。この形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、
制限エンドヌクレアーゼ消化により特徴付けを行った。
このＩＬ−１遺伝子の配列を決定して、その核酸及びア
ミノ酸組成を確立した。又ＩＬ−１遺伝子をＥ．ｃｏｌ
ｉ／酵母細胞系中でクローニングして成熟ＩＬ−１を発
現させ、次いで生物学的アッセイを行って発現された蛋
白質生成物がＩＬ−１であることを確認した。本願明細
書において「アリル変異体」とは、天然に存在する対立
遺伝子を意味し、人工的に修飾した遺伝子を含まない。 【００１５】 【課題を解決するための手段】ＩＬ−１の調製 ＩＬ−１の粗製調製物は末梢血液白血球から調製され
る。白血球は全血から周知の技術、例えば所定量のＦｉ
ｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ溶液に対する遠心分離などの
技術により分離される。血液から取り出された白血球は
ＩＬ−１分泌を誘発する適当な刺激剤を含有する培養培
地中においてｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。適当な培
養期間後に上澄液を遠心分離により取得し、使用される
まで貯蔵される。 【００１６】全血から取り出される白血球から得る代り
にむしろＩＬ−１は又任意の単核細胞に富んだ源から得
られる単核細胞から調製することが出来る。その様な単
核細胞源としては、単核白血病性脾臓細胞、リンパ細胞
及び肺胞マクロファージなどが挙げられる。 【００１７】末梢血液白血球を培養するために使用され
る培地は市販の培地、例えばイーグルの最小必須培地
（「ＭＥＭ」）或いはＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅ
ｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（「ＲＰＭＩ」）培
地により構成することが出来る。個々に或いは組み合わ
せて培養培地中に添加することのできる添加剤として
は、グルタミン、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びゲンタマイシ
ン、ペニシリン、ストレプトマイシンなどの各種抗生物
質が挙げられる。過去においては、血清も又通常添加剤
として使用されていた。しかしながら、本発明者等は、
本発明の方法においては血清が培養液中に使用されない
場合に、培養上澄液からのＩＬ−１の精製が容易に行わ
れることを見出した。血清を使用しない場合には、培養
液中に産生されるＩＬ−１の量が３〜４倍減少するが、
血清がないと又産生される全蛋白質が１００倍減少し、
それはＩＬ−１の精製に含まれる複雑さを少なくするも
のである。 【００１８】本発明について使用される好ましい刺激剤
としては、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、或いはエシェ
リヒア・コリ（「Ｅ．ｃｏｌｉ」，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）から抽出されたリポポリサッカライド
（「ＬＰＳ」）が挙げられる。更に、ホルボールエステ
ル類、例えばホルボールミリステート１３−アセテート
を刺激剤として使用することが出来る。 【００１９】白血球を培養してＩＬ−１の分泌を誘発す
る方法は各種環境条件下において行うことが出来る。し
かしながら、好ましくは約３５〜３８℃の温度範囲にお
いて空気中約５〜１０％のＣＯ2の加湿化雰囲気内にお
いて維持されるのがよい。末梢血液白血球を活性化剤に
より刺激することにより放出されるＩＬ−１の量は時間
と共に変化する。本発明者等はＩＬ−１発現の最適割合
は刺激後約２４〜７２時間において到達することを見出
した。 【００２０】アッセイ／分析 本発明において、ＩＬ−１活性度及び本発明の精製、ク
ローニング及びＩＬ−１発現操作の際の試料の蛋白質含
量を追跡するために胸腺細胞増殖アッセイ、ＩＬ−１転
換アッセイ及び蛋白質アッセイが使用される。又、精製
操作の際のＩＬ−１活性を分析するためにドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ」）及び二次元ゲル電気泳動が使用され
る。 【００２１】胸腺細胞増殖アッセイ このアッセイはＩＬ−１の試料のＣＤ−１マウスに由来
する胸腺細胞の増殖を誘発する能力を確認するものであ
る。このアッセイにおいて、１０〜１２週令のＣＤ−１
マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎ
ｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，メリーランド州、ウィ
ルミントン）から得られた約１×１０6個の胸腺細胞を
３倍逐次希釈のＩＬ−１含有試料の存在下において丸底
マイクロプレートウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｐｌａｓｔ
ｉｃｓ，ニューヨーク州、コーニング）に植付ける。胸
腺細胞は、５０単位／ｍｌ（「Ｕ／ｍｌ」）のペニシリ
ン、５０マイクログラム／ｍｌ（「μｇ／ｍｌ」）のス
トレプトマイシン、２ミリモル（「ｍＭ」）のグルタミ
ン、０．２ｍＭのゲンタマイシン、１０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液、（一緒に「補給ＭＥＭ」と称する）、ｐＨ
７．４を３％ｖ／ｖヒト血清及び１０-5モル（「Ｍ」）
２−メルカプトエタノールと共に含む１５０マイクロリ
ットル（「μｌ」）のＭＥＭ中において培養される。試
料は空気中５％ＣＯ2の雰囲気内で３７℃において７２
時間培養される。その後、培養物を約４時間０．５マイ
クロキューリ（「μＣｉ」）のトリチウム化したチモジ
ン（「3Ｈ−Ｔｄｒ」）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎ
ｕｃｌｅａｒ、マサチューセッツ州、ボストン、２Ｃｉ
／ｍＭ特異活性）でパルス処理した。その後培養物を例
えば多重自動化試料採取器を用いてガラス繊維フィルタ
ー片上に採取する。3Ｈ−Ｔｄｒの導入は次いで液体シ
ンチレーション計数により測定される。この操作の詳細
はギリス等により開示されている［Ｇｉｌｌｉｓ ｅｔ
ａｌ．，１２０Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０２７（１９
７８）］。 【００２２】この胸腺細胞増殖アッセイ方法により、Ｉ
Ｌ−１の存在下において培養されたＣＤ−１胸腺細胞の
みが照射線量に応じて3Ｈ−Ｔｄｒを取り込む。ＩＬ−
１の不存在下に培養されたＣＤ−１細胞はバックグラウ
ンド水準の3Ｈ−Ｔｄｒを導入するにすぎない。ＩＬ−
１活性は、上掲のギリス等によりインターロイキン−２
活性を求めるために使用された操作と同様にして3Ｈ−
Ｔｄｒ導入データの線状部分から計算される。ＩＬ−１
活性の単位は実験室の標準に対比して胸腺細胞3Ｈ−Ｔ
ｄｒ導入の５０％を発生する試料の希釈率の逆数として
求められる。例えば、ある試料が最大胸腺細胞3Ｈ−Ｔ
ｄｒ導入の５０％を１：１５の希釈率で発生するならば
ＩＬ−１の１単位（「Ｕ」）は１５０μｌのアッセイ容
積の１／１５に見出され、即ち１０μｌが活性の１Ｕを
含有するということができる。従って、全試料は１００
ＵのＩＬ−１活性／ｍｌを含有することになる［１００
０（μｌ／ｍｌ）÷１０μｌ（Ｕ当り）］（上掲のギリ
ス等の文献参照）。 【００２３】ＩＬ−１転換アッセイ ＩＬ−１活性の第２の代替的アッセイ法は、ＩＬ−１
は、本発明者等によってインターロイキン−２（「ＩＬ
−２」）非産生体ネズミ腫瘍細胞系統，ＬＢＲＭ−３３
−１４５，をＩＬ−２産生体に転換すると見い出された
事実を利用するもので、この方法を用いることができ
る。このアッセイにおいて、ＬＢＲＭ−３３−１Ａ５細
胞、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−８０７９は５０μｇ／ｍ
ｌのマイトマイシンＣを添加して不活性化され、３７℃
で１時間インキュベートされる。１００μｌの不活性化
ＬＢＲＭ−３３−１Ａ５細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）
はＩＬ−１の含有液体試料の逐次希釈液と共に等容量の
有糸分裂促進剤（ミトゲン）フィトヘムアグルチニン
（「ＰＨＡ」）（１％最終濃度）の存在下において９６
−ウエル平底プレート中において培養する。６〜２４時
間後ＩＬ−１誘発、ミトマイシンＣ−抑制のＬＢＲＭ−
３３−１Ａ５細胞（従って、ＩＬ−１活性）により発生
されたＩＬ−２の活性の存在を５０μｌのＩＬ−２依存
性ＣＴＬＬ−２細胞（８×１０4細胞／ｍｌ）を添加し
て直接的に確認する。マイクロウエル培養物を更に２０
時間インキュベート後、０．５μＣｉの3Ｈ−Ｔｄｒに
より４時間のパルス処理を行う（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｎｕｃｌａｒ，マサチューセッツ州、ボストン、２
Ｃｉ／ｍＭ特異活性）。その後、チミジン−パルス処理
された培養物を多重自動化試料採取器（ＭＡＳＨ II；
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ
ｓ，メリーランド州、ベテスダ）を用いてガラス繊維フ
ィルター片上に採取する。3Ｈ−Ｔｄｒ導入は液体シン
チレーション計数により測定する。この方法の詳細は上
記ギリス等の文献及び米国特許第４，４１１，９９２号
明細書に示されている。このアッセイにおいては、ＩＬ
−２の存在下において培養されたＣＴＬＬ−２細胞のみ
が照射線量に応じて3Ｈ−Ｔｄｒを導入する。ＩＬ−２
（従ってＩＬ−１）の不存在下において培養されたＣＴ
ＬＬ−２細胞はバックグラウンド水準の3Ｈ−Ｔｄｒを
導入するにすぎない。この「転換」アッセイはより迅速
である（２４時間以内に完結）ということ、及び上記胸
腺細胞増殖アッセイよりも１，０００〜１０，０００倍
感度が高いという利点を有する。しかしながら、「転
換」及び「増殖」の両アッセイを本発明において使用す
ることが出来る。 【００２４】蛋白質アッセイ 精製試料の蛋白質含量はＢｉｏｒａｄ社（カリフォルニ
ア州、リッチモンド）から市販されているＢｉｏｒａｄ
蛋白質アッセイにより求められる。このアッセイはウシ
血清アルブミンを標準として用いるものである。このア
ルブミンの原理及び詳細はブラッドフォード［Ｂｒａｄ
ｆｏｒｄ，７２ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４８
（１９７６）］に論じられている。 【００２５】ゲル電気泳動 培養上澄液及びクロマトグラフィーカラム画分はＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより分析して本発明の精製操作を追跡す
る。このアッセイはレムリ［Ｌａｅｍｍｌｉ，２２７
Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）６８０（１９７０）］の
ゲル重層方法に従って行われる。このアッセイは１０〜
２０％勾配のポリアクリルアミドゲルを用いる０．７５
ｍｍのＳＤＳスラブゲルを用いるものである。これらの
ゲルは一定の３０ｍＡ電流において運転される。得られ
たゲル試料は例えばオークリー等［Ｏａｋｌｅｙ ｅｔ
ａｌ．，１０５ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６１
（１９８０）］により記載されている方法により銀染色
される。 【００２６】高塩濃度を含有するこれらのアッセイ試料
は先ず０．１ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3中の０．００１％ＳＤ
Ｓに対して透析され次いで真空乾燥される。乾燥残渣を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ操作に先立ち還元緩衝液（２％ＳＤ
Ｓ）、１％ ２−メルカプトエタノール中に溶解する。 【００２７】二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動 本発明の精製操作完結後にＩＬ−１をサモンズ等［Ｓａ
ｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，２Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ
ｅｓｉｓ １３５（１９８１）］により記載されている
方法により二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分析する。この方法においては、凍結乾燥されたＩＬ
−１試料を水中１％（ｗ／ｖ）シクロヘキシルアミノエ
タン、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２％２−メルカプトエタ
ノール、１０％グリセロールで構成されたＳＤＳ可溶化
緩衝液２０μｌ中に再懸濁させる。これらの試料を１０
０℃に１０分間に亘り加熱する。２時間のプレフォーカ
シング後試料（１００℃においてＳＤＳ中で１０分間可
溶化）を第一次元のゲルに適用し、６００ボルトの定電
圧において２０時間フォーカシングを行なう。第一次元
のフォーカシングゲルを直接的にｐＨ勾配ゲル走査計に
より走査する。その後ゲルを平衡化緩衝液［水中９．３
％（ｖ／ｖ）グリセロール；５０％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｓ
−ＳＤＳ緩衝液（３０ｇ Ｔｒｉｓ、２ｇＤＳＤ／ｌ、
濃ＨＣｌによりｐＨ６．８に調製）、１％（ｗ／ｖ）Ｓ
ＤＳ；０．８％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール］
中で２分間濯ぎ、第二次元ゲル上の頂部におき、次いで
低温溶融アガロースで覆う。第二次元電気泳動（アクリ
ルアミドの１０〜２０％線状勾配）を染料前面がゲルの
底部に達するまで４０ｍＡ／ゲルの定電流において行な
う。５０％（ｖ／ｖ）エタノール及び１０％（ｖ／ｖ）
氷酢酸中で固定後、ゲルを上掲のサモンズ等の文献にお
ける色硝酸銀法により染色する。 【００２８】ＩＬ−１の精製 上記方法により調製された血液白血球培養物から得られ
る上澄液は、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオ
ン交換クロマトグラフィー、及びカラムマトリックスに
結合された染料配位子を用いたアフィニティクロマトグ
ラフィーにより精製される。全てのクロマトグラフィー
画分はＩＬ−１活性及び蛋白質濃度が分析される。適当
な場合にはｐＨ及び伝導率が測定される。各クロマトグ
ラフィー工程の後に、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析す
る。更に、アフィニティクロマトグラフィー操作の完結
後に活性画分を上記二次元ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分析する。 【００２９】カチオン交換クロマトグラフィー用の適当
なカラムは、スルホプロピルセファデックスＣ−２５
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ，ニュージャージ州、ピスカタウェイ）により構成さ
れる。好ましくは、カラムはＩＬ−１試料の適用前に緩
衝液で平衡化され、次いでＩＬ−１試料がカラムに適用
された後にＩＬ−１活性の溶出を行うことなく非結合蛋
白質を除去するために同一緩衝液或いは異った緩衝液で
洗浄する。ＩＬ−１のカラムからの溶出はＩＬ−１をカ
ラムから解離するために十分なｐＨの緩衝化された溶離
剤を用いて行われる。 【００３０】カチオン交換クロマトグラフィー法からの
プールされた活性画分は更にアニオン交換クロマトグラ
フィーにより精製される。本発明者等はこの目的のため
に適した適当なカラム材料はＤＥＡＥ−セファセル（Ｓ
ｅｐｈａｃｅｌ）であることを見出した。ＤＥＡＥ−Ｓ
ｅｐｈａｃｅｌカラムを緩衝液で平衡化させ、試料濃縮
液をカラムに適用する。溶出は先ず出発緩衝液で行い、
引続き同一緩衝液中に線形塩勾配を用いて行う。画分を
集め、上記の如く分析を行う。 【００３１】ＤＥＡＥ−セファセルカラムからプールさ
れた活性画分中のＩＬ−１は更に支持体マトリックスに
結合した合成トリアジニル織物染料配位子を用いたアフ
ィニティカラムクロマトグラフィーにより精製される。
青色或いは赤色を含む各種染色を使用することが出来
る。この染料は例えばアガロース、ポリアクリルアミ
ド、セルロース或いはシリカベース無機材料により構成
される適当なカラムマトリックスにトリアジン環へのエ
ーテル結合を介して或いは又染料の一級アミン或いはア
ントラキノン基を介して結合されている。直接的に支持
体マトリックスに結合されずにこの染料は高分子量デキ
ストランに結合され、デキストランが次いでカラムマト
リックスに固定されることも可能である。マトリックス
に結合した青色及び赤色染色配位子の部分的化学構造を
それぞれ第１図及び第２図に示す。これらの染料構造
は、例えばスルホン化アントラキノン基の位置をトリア
ジン環に対して交換するか或いはスルホン酸置換基の代
りにスルホン酸塩を置換することにより修正して類似体
を形成することが出来ることが了解されるべきである。
フルトン［Ｆｕｌｔｏｎ，Ｄｙｅ−Ｌｉｇａｎｄ Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，マサチューセッツ州、レキ
シトン、Ｓｔｕｄｉｏ ６，Ｉｎｅ．（１９８０）］参
照。 【００３２】ＳＰ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ）及びＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）上
で精製されたＩＬ−１含有画分を染料配位子カラムに適
用する前にプールされた活性画分のイオン強度を低下す
ることが必要な場合がある。又、Ｍｇ++或いはＣａ++の
ような二価カチオンの存在はＩＬ−１の染料配位子への
結合を高め得る。カラムは適当な緩衝液、例えばＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌで平衡化され、次いでＩＬ−１活性を含有す
るプールされたＤＥＡＥ画分をカラムに適用する。その
後カラムを同一の出発緩衝液で洗浄し、次いで溶出を同
一の緩衝液或いは特別の可溶性配位子中において線形塩
勾配を用いて行う。画分を集め上記の如く分析する。 【００３３】本発明者等は赤色トリアジニル織物染料
は、上記カラム条件下において使用すると、ＩＬ−１の
結合に特に高度に特異的であることを発見した。第２図
に対応するこの赤色染料の商品名は「プロシオン（Ｐｒ
ｏｃｉｏｎ）」レッド（反応性レッド１２０）（Ｉｍｐ
ｅｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ
ｓ）である。本発明者等は又、青色トリアジニル織物染
料は、上記カラム条件下において使用すると、ＩＬ−１
の結合に高度に特異的、即ち赤色トリアジニル織物染料
の場合の約８０％程度特異的であることをも発見した。
青色染料の商品名はシバクロン（登録商標）ブルー３６
Ａ（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）Ｂｌｕｅ３６Ａ）
（Ｃｉｂａ ＡＧ）である。 【００３４】上記精製方法により、本発明者等は出発上
澄液から約５３％の高収率を維持しながら９９％の純度
を越えてヒトＩＬ−１蛋白質を精製した。上記アッセイ
操作により、本発明者等はヒトＩＬ−１が約１７，５０
０ダルトンの分子量の単一分子量種より構成されること
を決定した。この分子量は従来ヒト或いはネズミのＩＬ
−１について報告されていたものよりも実質的に重いも
のである。更に、他の観察者らの報告とは反対に、本発
明者等によってはその他の分子量のＩＬ−１の種は見出
されなかった。上掲のラッハマン、トガワ等、マイゼル
等、及びブライデン等の文献を参照。しかしながら、本
発明を使用して本発明者等により経験されたＩＬ−１の
高い収率により上記精製方法の際に相当量の他の低分子
量のＩＬ−１種が失われたとは思われない。従って均等
なヒトＩＬ−１の真の分子量は１７，５００ダルトンで
ある。 【００３５】アミノ酸組成分析 他の蛋白質による汚染のないＩＬ−１の生物学的研究を
可能にしたことに加えて、等質なＩＬ−１を調製するこ
とが出来ることはＩＬ−１分子のアミノ酸組成を決定す
ることを可能にした。この情報を用いて、臨床的試験及
び究極的には臨床的用途のためのＩＬ−１遺伝子のクロ
ーニング及び大量の純粋ＩＬ−１の産生を助けることが
可能である。 【００３６】アフィニティクロマトグラフィー操作から
の精製ＩＬ−１の試料をニンヒドリン検出を用いた自動
化アナライザーを用いてアミノ酸組成の分析を行った。
観察されたピークは市販の記録積算計を用いて積分し
た。この技術により本発明者等は下記の例４における表
Ｉにまとめて示したＩＬ−１分子のアミノ酸組成を決定
した。 【００３７】アミノ酸残基システイン（Ｃｙｓ）は加水
分解に不安定であるのでこの残基は自動化ニンヒドリン
分析によっては検出されない。Ｃｙｓ残基の存在は以下
に述べるアミノ酸配列分析により検出した。又、自動化
ニンヒドリン分析は、アスパラギン酸残基とアスパラギ
ン残基とを区別せずに、又、グルタミン酸残基とグルタ
ミン残基の区別もしない。しかしながら、以下に述べる
アミノ酸配列分析から１個のアスパラギン残基及び６個
のグルタミン残基がＩＬ−１分子のＮ−末端部分（４２
個のアミノ酸残基よりなる）に検出された。この様に表
Ｉにおいてはグルタミン酸及びグルタミン残基と同様に
アスパラギン酸及びアスパラギン残基も一緒に掲げられ
ている。 【００３８】ＩＬ−１分子のＮ−末端部分のアミノ酸配
列分析 本発明者等は又ＩＬ−１分子のアミノ酸配列を検討し
た。本発明者等は、上記方法により調製された精製ＩＬ
−１中においてこの分子のＮ−末端が部分的に保護され
ていることを発見した。その様なものとして、この分子
は自動化アミノ酸配列装置に使用さるる化学的分析技術
に容易に従うことが出来ず、従って、全分子のアミノ酸
配列は標準的分析操作により決定することが出来なかっ
た。その結果、本発明者等は、２つの技術の組み合わせ
を用いて蛋白質分子のＮ−末端部分の配列を分析した。 【００３９】第１の技術として、本発明者等は上記方法
により等質状態に精製されたかなり大きな１１μｇを越
えるＩＬ−１を自動化配列決定装置を用いてアミノ末端
エドマン分解配列分析に付した。この技術によりＩＬ−
１分子のＮ−末端部分の最初の２０個の残基は次の配列
により構成されることが見出された： 【化５】ＮＨ2-Ａｌａ-Ｐｒｏ-Ｖａｌ-Ａｒｇ-Ｓｅｒ-
Ｌｅｕ-Ａｓｎ-Ｃｙｓ-Ｔｈｒ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ-Ａｓｐ-
Ｓｅｒ-Ｇｌｎ-Ｇｌｎ-Ｌｙｓ-Ｓｅｒ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-
Ｍｅｔ． ８番目の残基はＣｙｓと推定された。自動化配列決定操
作の８番目のサイクルにおいては、その他のの如何なる
残基も高収率で得られず、これは８番目の残基がＣｙｓ
（これはエドマン分解により肯定的には検出されな
い）、グリコシル化スレオニン残基或いはグリコシル化
セリン（Ｓｅｒ）残基により構成されるとの結論を示
す。これらの後者の２つの可能性は以下に論ずる如く、
アミノ酸組成分析からグルコサミン或いはガラクトサミ
ンは観察されないので除去された。これにより８番目の
残基がＣｙｓで構成されるとの結論が導かれる。 【００４０】第２のアミノ酸配列分析技術として、本発
明者等はアルギン残基における分子を酵素トリプシンを
用いて分別した。トリプシンがＩＬ−１分子を又リジン
部位において切断することを防止するためにリジン分子
の側鎖を特別のブロッキング剤を用いて保護した。好ま
しくは、トリプシンをＩＬ−１−トシルアミノ−Ｓ−フ
ェニルエチルクロロメチルケトン（「ＴＰＣＫ」）で処
理して、同時に存在し得るキモトリプシンなどのその他
の汚染酵素をを不活性化し、ＩＬ−１蛋白質が他の残基
において切断される可能性を最少にする。トリプシンを
使用する代りに、他の酵素を用いて他の残基部位におい
てＩＬ−１分子を切断することも可能であることは了解
されるべきである。 【００４１】ＩＬ−１分子の切断後得られたペプチド類
をＨＰＬＣ操作により疎水性に基づいて分離した。本発
明において使用されるＨＰＬＣ技術は蛋白質ＩＬ−１ペ
プチド類に最適に利用されるべき十分に大きな孔径、即
ち少なくとも３００Åの孔径を有する逆相のオクタデシ
ル結合シリカカラムを用いるのが好ましい。 【００４２】本発明の実施に当り使用するに適した逆相
ＨＰＬＣカラムは市販の商品である。この目的に好まし
いカラムはＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ，（カ
リフォルニア州、ヘスペリア）より市販されているＶｙ
ｄａｃ ２１８ ＴＰ逆相カラムである。このカラム
は、シロキサン（シリコン−酵素−シリコン）結合によ
り、５ミクロンの平均粒径に分類された３００Å孔径の
シリカゲル表面に共有的に結合されたオクタデシルシラ
ン基よりなる。他の逆相カラムの使用も本発明の範囲内
であることが了解されるべきである。 【００４３】オクタデシルカラムに結合したＩＬ−１ペ
プチド類はアセトニトリルの線形勾配を用いて溶出され
る。この目的のための好ましい勾配はトリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）、ｐＨ２．０中の０〜９５％（ｖ／ｖ）のア
セトニトリル勾配である。 【００４４】溶出されたペプチド類は市販の検出計を用
いて追跡するのが便利である。例えば、ＨＰＬＣカラム
から溶出された画分中の相対的蛋白質濃度は、自動化紫
外線分光光度計を用いて２３０ｎｍ波長における溶出物
質の吸光度を測定することにより求めることができる。
適当な自動化紫外線吸収検出装置はＷａｔｅｒｓ Ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｓ（メイン州、ミルフォード）から利用
可能である。或いは又、蛋白質の溶出はステイン及びモ
スケラ［Ｓｔｅｉｎ及びＭｏｓｃｈｅｒａ，７８Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．４３５（１９８１）］により記載
されている自動化蛍光検出装置を用いて追跡することも
出来る 溶出されたＨＰＬＣ画分の配列の分析は上記ゲル電気泳
動により行われ、各ＨＰＬＣ画分に含まれるべきペプチ
ド類の数を決定する。その後、ペプチド類を真空濃縮
し、次いでアミノ酸配列の分析を行う。これは市販の商
品である自動化配列決定装置を用いて行うのが好まし
い。この技術により本発明者等はヒトＩＬ−１分子のＮ
−末端部分近辺のＩＬ−１分子の主たる部分は次のアミ
ノ酸残基の配列により構成されることを発見した： 【化６】Ｓｅｒ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｍｅｔ-Ｓｅｒ-Ｇｌｙ-
Ｐｒｏ-Ｔｙｒ-Ｇｌｕ-Ｌｅｕ-Ｌｙｓ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-
Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｇｌｎ-Ｇｌｙ-Ｇｌｎ-Ａｓｐ-Ｍｅｔ-
Ｇｌｕ-Ｇｌｎ-Ｇｌｎ-Ｖａｌ-Ｖａｌ-Ｐｈｅ． このアミノ酸断片のアミノ末端部分の最初の４つの残基
は、自動化エドマン分解技術により上記で決定された配
列のＣ−末端部分の最後の４つの残基に対応し、従って
ＩＬ−１分子のＮ−末端部分の最初の４２個の残基は次
の配列より構成されるとの結論に導かれる： 【化７】ＮＨ2- Ａｌａ-Ｐｒｏ-Ｖａｌ-Ａｒｇ-Ｓｅｒ-
Ｌｅｕ-Ａｓｎ-Ｃｙｓ-Ｔｈｒ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ-Ａｓｐ-
Ｓｅｒ-Ｇｌｎ-Ｇｌｎ-Ｌｙｓ-Ｓｅｒ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-
Ｍｅｔ-Ｓｅｒ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-Ｔｙｒ-Ｇｌｕ-Ｌｅｕ-
Ｌｙｓ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｇｌｎ-Ｇｌｙ-
Ｇｌｎ-Ａｓｐ-Ｍｅｔ-Ｇｌｕ-Ｇｌｎ-Ｇｌｎ-Ｖａｌ-
Ｖａｌ-Ｐｈｅ． 【００４５】ヒトＩＬ−１産生細胞からのＲＮＡの調製 ヒトＩＬ−１産生細胞からの全ＲＮＡは標準的方法、例
えばチルギン等［Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１
８ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５２９４（１９７
９）］及びマニアティス等［Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８２）］に開示されていてる方法により抽出され
る。 【００４６】周知の如く、細胞からＲＮＡを抽出するに
際し、抽出の初期段階においてリボヌクレアーゼ（「Ｒ
Ｎａｓｅ」）活性を最小にすることが重要である。これ
を達成する１つの方法は、ＲＮａｓｅを含む細胞蛋白質
をＲＮＡａｓｅによるＲＮＡ加水分解の速度を越える速
度で変性することである。上記チルギン等及び上記マニ
アティス等の１９６の方法においては、これはグアニジ
ニウムチオシアネートを２−メルカプトエタノールなど
の還元剤と共に使用して行われている（蛋白質ジスルフ
ィド結合を破壊する）。ＲＮＡは標準的技術、例えばフ
ェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿或いはセ
シウムクロライドによる沈降などにより蛋白質から単離
される。 【００４７】次に、ポリアデニル化ｍＲＮＡを抽出蛋白
質から分離する。この分離操作を行うための幾つかの技
術が開発されているが、１つの好ましい方法は、ポリア
デニル化ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルロース上でエ
ドモンド等［Ｅｄｍｏｎｄｓｅｔ ａｌ．，６８ Ｐｒ
ｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １３３６
（１９７１）］、アヴィブ及びレダー［Ａｖｉｖ ａｎ
ｄ Ｌｅｄｅｒ，６９Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．１４０８（１９７２）］、及び上記マニアティ
スの１９７、に記載されているように、クロマトグラフ
を行うことである。オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラム
は負荷緩衝液を用いて調製され、ｍＲＮＡをカラムに適
用する。その後カラムを先ず緩衝溶液で洗浄して未ポリ
アデニル化ｍＲＮＡを除去し、次いでポリアデニル化ｍ
ＲＮＡを緩衝化された低イオン強度の溶離剤を用いてカ
ラムから溶出する。ポリアデニル化ｍＲＮＡの完全性は
ゲル電気泳動により検証される。 【００４８】ポリアデニルｍＲＮＡは次いでｍＲＮＡの
異なった大きさの群に応じたメチル水銀アガロースゲル
画分を介して電気泳動により大きさを決定され、次いで
例えばパルミター［Ｐａｌｍｉｔｅｒ，２４８ Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０９５（１９７３）］、ペルハム
及びジャクソン［Ｐｅｌｈａｍ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏ
ｎ，６７．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４６（１９
７６）］、及びリー等［Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２５３
Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．３４９４（１９７８）］
により記載されている標準的なウサギ網状赤血球溶解物
技術を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳される。ウサギ網
状赤血球アッセイ用のキットは多くの供給源、例えばＢ
ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ（メリーランド州、ゲテルスブルグ）などから
市販されている。或いは又ｍＲＮＡの翻訳は、ストマ等
［Ｓｔｏｍａ ｅｔ ａｌ．，７９．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ
ｙｍ．６８（１９８１）］により記載されている標準的
技術を用いてアフリカツメガエル（Ｘｅａｏｐｕｓ ｌ
ａｅｖｉｓ「Ｘ．ｌａｅｖｉｓ」）の卵母細胞へのｍＲ
ＮＡの微量注射により行うことも出来る。網状赤血球溶
解物翻訳或いはｍＲＮＡ微量注射卵母細胞により放出さ
れた液体を次いで上記アッセイを用いてＩＬ−１の活性
の存在の試験を行う。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて翻訳し
た際にＩＬ−１活性を与えたｍＲＮＡゲル画分をｃＤＮ
Ａ構成のためのｍＲＮＡ源として選択する。 【００４９】アフリカツメガエル卵母細胞翻訳操作にお
いては、約５０ナノリットル（「ｎｌ」）のｍＲＮＡ
（無菌Ｈ2Ｏ中に０．５〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解）
を各卵母細胞に注射する。卵母細胞をアフリカツメガエ
ル（Ｎａｓｃｏ，ウィスコンシン州、フォートアトキソ
ン）から採取し、１５０ｍｌの卵母細胞インキュベーシ
ョン培地（８８ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＫＣｌ．２．
４ｍＭ ＮａＨＣＯ3、０．８２ｍＭ ＭｇＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ、０．３３ｍＭ Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ、０．４
１ｍＭ ＣａＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、 ７．５ｍＭ Ｔｒｉｓ
ベース、１８単位／ｍｌ（１１μｇ／ｍｌ）ペニシリン
Ｇカリウム及び１８μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中
においてインキュベートする。培地の最終ｐＨをＨＣｌ
で７．６に調整し、次いで濾過により殺菌する。注射
後、卵母細胞を０．１ｍｌの新たな卵母細胞インキュベ
ーション培地中に入れ、１．５μｌの無菌の円錐状のポ
リプロピレンチューブ内で２３℃で１８時間インキュベ
ートする。インキュベーション後卵母細胞が培養された
液体を採取し、次いで上記アッセイ法を用いてＩＬ−１
活性の存在の試験を行う。 【００５０】ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの調製 上記の如く調製され分析されたｍＲＮＡに対応する二本
鎖ｃＤＮＡのライブラリーは逆転写酵素を用いた公知の
技術により構成される。本発明において使用されるその
様な方法の１つは上記マニアティス等の文献２３０に詳
細に説明されている。簡単に述べると、ポリアデニル化
ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡのポリアデニル化尾部にハイブリ
ダイズされたオリゴ−ｄＴを用いて第１のｃＤＮＡ鎖の
プライマーとして逆転写する。これにより第２のＤＮＡ
鎖の一体的プライマーとして役立つ最初のｃＤＮＡ鎖の
３’末端に「ヘヤピン」ループが生ずる。次いで、第２
のｃＤＮＡ鎖を酵素ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成
し、ヘヤピンループＳ１ヌクレアーゼにより切断し、二
本鎖ｃＤＮＡ分子を生成する。二本鎖ｃＤＮＡは任意の
便利な手段を用いて分別してより短い鎖を除去し、それ
により不用な小さなｃＤＮＡ画分のクローニングを回避
する。 【００５１】本発明に従えば、別の標準的操作方法を用
いてｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製することが出来
ることが理解されるべきである。その様な１つの代替技
術はランド等［Ｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，９ Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２５１（１９８１）］によ
り開示されている。ランド等の方法においては、ヘヤピ
ンループは第２のｃＤＮＡ鎖のプライマーとしては使用
されない。その代りに、第１のｃＤＮＡ鎖の３’末端
が、末端デオキシヌクレオチジルストランスフェラーゼ
（「ＴｄＴ」）を用いてｄＣＭＰ残基で尾部が付着され
る。これはポリ−Ｃの残基の３’尾部を生成する。次い
で、第２の鎖の合成は、３’尾部にハイブリダイズされ
たオリゴ−ｄＧにより開始される。この技術はマニアテ
ィス等の方法においてヘヤピンがＳ１ヌクレアーゼで切
断されるならば生じ得る第２のｃＤＮＡ鎖の５’尾部の
部分を失うことを避けるのに役立つといわれている。 【００５２】ｃＤＮＡのクローニング 次に、二本鎖ｃＤＮＡを、ベクターの複製のために相容
れることのできる原核生物或いは真核生物の宿主細胞を
形質転換するために使用されるクローニングベクター中
に挿入する。その後形質転換体が同定され、プラスミド
ＤＮＡがそれから調製される。 【００５３】本発明を実施するためには各種のクローニ
ングベクターを利用することが出来る。好ましいベクタ
ーはプラスミドであるが、ベクターはバクテリオファー
ジ或いはコスミドであってもよい。クローニングが哺乳
動物細胞内で行われる場合にはウィルスも又ベクターと
して使用することができる。 【００５４】プラスミドが使用される場合には、それは
天然源から得られても或いは人工的に合成されてもよ
い。選ばれる特別のプラスミドは、考えられている形質
転換宿主がＥ．ｃｏｌｉのような細菌、酵母その他の単
細胞微生物であるか否かに応じて適合性を有すべきであ
る。プラスミドは使用されるべき特別の宿主細胞に対し
て適切な複製源を有するべきである。又、プラスミドは
形質転換された宿主細胞が容易に同定され、かつ形質転
換を行わない細胞から容易に分離されることを可能にす
る表現型特性を有するべきである。その様な表現型特性
は成長抑制物質、例えば抗生物質などに対する耐性を与
える遺伝子を包含し得る。各種抗生物質、例えばテトラ
サイクリン、ストレプトマイシン、サルファ剤、ペニシ
リン及びアンピシリンなどに耐性を有する遺伝子をコー
ド化するプラスミドが市販されている。 【００５５】Ｅ．ｃｏｌｉが宿主細胞として使用される
場合には、本発明において使用することのできる多くの
可能性のあるクローニングプラスミドが市販されてい
る。本発明を実施するために好ましいプラスミドはｐＢ
Ｒ３２２である。このプラスミドはサットクリフ［Ｓｕ
ｔｃｌｉｆｆｅ，４３ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．７７（１
９７９）］に示されているように完全に配列決定されて
いる。このプラスミドの重要な利点はアンピシリン耐性
遺伝子におけるＰｓｔＩ部位を含む１１個の公知の独特
の制限部位を有することである。この特徴はホモポリマ
ーテーリング法によるクローニングに特に有用である。 【００５６】プラスミドの代りにバクテリオファージが
使用される場合には、その様なファージはプラスミドの
選択に当って述べた上記の実質的に同一の特性を有する
べきである。これは、表現型マーカー及び外来遺伝子の
付着のための連結可能な末端の存在を含むものである。 【００５７】好ましくは、本発明においてはブラントエ
ンドを有する二本鎖ｃＤＮＡをホモポリマーテーリング
によりプラスミドベクター中に挿入する。周知の如く、
この技術においてはｃＤＮＡの鎖及びプラスミドＤＮＡ
に相補的なホモポリマートラックが付加される。ベクタ
ー及び二本鎖ｃＤＮＡは次いで相補的なホモポリマーの
テール間に水素結合により結合され、Ｅ．ｃｏｌｉなど
の宿主細胞を形質転換することのできる開かれた環状の
ハイブリッド分子を形成する。 【００５８】ホモポリマーテーリングの１つの方法にお
いては約５０〜１５０ｄＡのヌクレオチド残基が線形化
プラスミドＤＮＡの３’末端に付加される。同様な数の
ｄＴヌクレオチド残基が二本鎖ｃＤＮＡの３’末端に付
加され、次いでｃＤＮＡ及びプラスミドが一緒に結合さ
れる。 【００５９】別の好ましい方法においては、ｄＧテール
が適当な制限酵素により切断されたクローニングベクタ
ーの３’末端に付加される。例えばｐＢＲ３２２プラス
ミドが使用される場合には、制限酵素ＰｓｔＩを使用し
てこのプラスミドをアンピシリン耐性遺伝子において消
化することが出来る。プラスミド中にｃＤＮＡセグメン
トを適当なアニーリング緩衝液を用いて挿入する前に二
本鎖ｃＤＮＡの３’末端に相補的ｄＣテールが付加され
る。 【００６０】二本鎖ｃＤＮＡはその他の各種標準的方法
によりプラスミドクローニングベクター中に挿入するこ
とが出来ることが了解されるべきである。１つのその様
な代替的技術はＤＮＡリガーゼを用いてｃＤＮＡ鎖の末
端に合成されたヌクレオチドリンカーを付着することを
含むものである。これらのリンカーは制限酵素で切断さ
れて同一酵素で切断されたプラスミド内に挿入するため
の付着末端を発生する。シエラー等［Ｓｃｈｅｌｌｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９６ Ｓｃｉｅｎｃｅ １７７−１
８０（１９７７）］、上掲マニアティス等の文献２１９
参照。 【００６１】上記の如く調製された組み換えＤＮＡプラ
スミドを使用して宿主細胞の形質転換を行う。宿主は任
意の適当な原核生物或いは真核生物細胞でよいが、好ま
しくは、良く同定された細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ或い
は酵母菌株がよい。その様な宿主は容易に形質転換さ
れ、培養液中で迅速な生育が可能である。他の形態の細
菌、例えばサルモネラ或いはニューモコッカス（Ｐｎｅ
ｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）などもＥ．ｃｏｌｉの代りに使用
することが出来る。細菌の代りにその他の単細胞生物、
例えば真菌類（ｆｕｎｇｉ）及び藻類（ａｌｇａｅ）な
ども使用することが出来る。いずれの宿主が選ばれるに
せよ、それは組み換えプラスミドを切断する制限酵素を
含有すべきではない。 【００６２】Ｅ．ｃｏｌｉが宿主として使用される場合
には、好ましい菌株はＭＭ２９４及びＲＲ１である。プ
ラスミドベクターによるＭＭ２９４の形質転換の実験方
法は上記マニアティス等の文献の２２５において、及び
ハナハン［Ｈａｎａｈａｎ１６６ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．５５７（１９８３）］に示されているように良く知
られている。ＲＲ１宿主のプラスミドベクターによる形
質転換の実験方法も又、ボリバー等［Ｂｏｌｉｖａｒ
ｅｔ ａｌ．，２ Ｇｅｎｅ ９５（１９７７］］及び
ピーコック等［Ｐｅａｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，６５５
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２４３
（１９８１）］に示されているように良く知られてい
る。適当な宿主として役立ち得るその他のＥ．ｃｏｌｉ
の菌株としては、ＤＨ１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３３８４
９）及びＣ６００が挙げられる。これらの菌株及びＭＭ
２９４及びＲＲ１菌株は広く市販されている。 【００６３】上記マニアティス等による文献及び上記ハ
ナハン等に文献に開示されているものを含む形質転換の
実験方法においては、細胞による制限されたプラスミド
の摂取により僅かに少量部分の宿主細胞が実際に形質転
換されるにすぎない。形質転換された細胞は、適当な生
育培地及び抗生物質などの表現型同定物質を含有する寒
天上に細胞培養液を置くことにより同定することが出来
る。適当な耐性遺伝子（例えば抗生物質に対する）を有
する細胞のみが生残る。組み換えｐＢＲ３２２のプラス
ミドがＥ．ｃｏｌｉ菌株ＭＭ２９４の形質転換に用いら
れる場合には形質転換された細胞はテトラサイクリンを
表現型同定物質として用いることにより同定することが
できる。 【００６４】合成オリゴヌクレオチドスクリーニングプ
ローブの調製 上記の如く決定されたヒトＩＬ−１分子のアミノ酸配列
のＮ−末端部分の１部に対応する放射線標識された合成
オリゴヌクレオチドをプローブとして用いてｃＤＮＡラ
イブラリーのスクリーニングを行う。この合成オリゴヌ
クレオチドプローブのライブラリークローンから調製さ
れたプラスミドｃＤＮＡとのハイブリッド化は引続いて
オートラジオグラフィーにより同定する。 【００６５】ＩＬ−１分子のアミノ酸組成のＮ−末端部
分は次の残基により構成されることが決定された： 【化８】ＮＨ2−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖｌａ−Ａｒｇ−Ｓ
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒ
ｇ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈ
ｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｍｅ
ｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ この配列情報を合成オリゴヌクレオチドプローブの基礎
として使用する。 【００６６】本発明者等はＩＬ−１遺伝子を含有すると
思われるプラスミドＤＮＡをスクリーニングするための
プローブに使用するための合成オリゴヌクレオチドを上
記アミノ酸配列から開発した。このプローブは、第１の
Ｍｅｔ残基から下流の上記アミノ酸配列によりコード化
されるアンチセンス配列に対応する次の配列により構成
されている： 【化９】 ５’−ＡＣ ＴＴＧ ＴＴＧ ＴＴＣ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＴＧ ＧＣＣ ＴＴＧ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＧＧＣ ＴＴＴ ＣＡＧ ＴＴＣ ＧＴＡ ＧＧＧ ＧＣＣ ＧＧＡ ＣＡＴ−３’． このプローブは容易に合成されるに十分に短いという利
点を有すると共にＩＬ−１遺伝子のプローブとして有用
な重要な情報を含有するに十分長いものである。上記説
明のオリゴヌクレオチド配列は、本発明の合成プローブ
の好ましい組成であるが、ＩＬ−１分子のＮ−末端アミ
ノ酸配列のその他のセグメントに対応するその他の組成
のプローブも又本発明の趣旨或いは範囲から離れること
なく使用することが出来ることが了解されるべきであ
る。 【００６７】合成オリゴヌクレオチドプローブは、ホス
ホジエステル或いはトリエステル方法などの公知の技術
により化学的に合成することが出来る。トリエステル合
成技術の詳細はスッド等［Ｓｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，４
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５５７（１９７
７）］及びヒロセ等［Ｈｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，２
８Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２４４９（１９７８）］に示され
ている。合成後オリゴヌクレオチドプローブをＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ及び32Ｐ−ＡＴＰで標識化する。
標識化操作からの標準的な実験方法は上記マニアティス
等の文献１２２に示されている。オリゴヌクレオチドプ
ローブはＯＨ５’末端を用いて合成することにより典型
的に必要とされるホスファターゼ操作を回避するのが有
利である。 【００６８】ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 本発明のスクリーニング操作において、形質転換体は各
々約２，０００個の形質転換体で構成されている群にプ
ールされる。複製されたプラスミドは、例えば、アルカ
リ性溶解などの数個の公知の技術の任意のものを用いて
形質転換体から抽出される。プラスミドＤＮＡはいずれ
もハイブリッドプラスミド上の独特の部位であるＰｖｕ
II及びＨｉｎｄIII制限部位においてプラスミドを切断
することにより調製される。得られたＤＮＡセグメント
をアガロースゲル上の電気泳動により分別し、次いで直
接的にサザン［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，９８ Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．５０３（１９７５）］により記載されている
サザンブロッティングにより分析する。サザンブロッテ
ィング操作（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇＰｒ
ｏｃｅｄｒｅ）におけるニトロセルロースフィルターに
結合するＤＮＡを，標識化されたオリゴヌクレオチドプ
ローブとハイブリダイズさせる。プローブにハイブリダ
イズする特異的ＤＮＡ断片をオートラジオグラフィーに
より同定する。 【００６９】オートラジオグラフィーに従って信号を与
える特別のクローンのプールをプレートから取り出し、
同一の上記オリゴヌクレオチドプローブを用いたニトロ
セルロースフィルター上における直接細菌コロニーハイ
ブリダイゼーションに使用する。ハイブリッド化完結後
にニトロセルロースフィルターをオートラジオグラフィ
ーにより追跡して最も大きな陽性のコロニーを同定す
る。本発明において発明者等は１つのその様なコロニー
を見出した。ＩＬ−１ Ｘ−１４と称されるプラスミド
ＤＮＡはこの特別の同定された陽性コロニーから調製さ
れる。 【００７０】スクリーニングされたｃＤＮＡの特性づけ 上記の如く得られたプラスミドＤＮＡは制限酵素マッピ
ングにより特徴付けられる。制限酵素マッピングに対す
る各種術策は上記マニアティス等の文献の３７４により
論じられている。１つの標準的技術は線状ＤＮＡの末端
−標識化断片の部分的消化を含むものである。この技術
はスミス及びビルンスチール［Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｂ
ｉｒｎｓｔｉｅｌ．３ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．
２３８７（１９７６）］により開発された。ＩＬ−１遺
伝子の領域におけるＩＬ−１×−１４プラスミドの部分
的制限酵素地図は第３図に示される。制限部位間の距離
は塩基対（「ｂｐ」）で与えられている。括弧内に示さ
れるＰｓｔＩ制限部位はクローニング操作により発生し
たものである。 【００７１】第３図に示されたプラスミドｃＤＮＡの地
図は連鎖−停止方法を用いて配列決定されたものであ
る。このヌクレオチド配列決定の方法はサンガー等［Ｓ
ａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，７０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）５４６３（１９７
７）］により始められたものであった。又、米国特許第
４，３２２，４９９号明細書参照。連鎖停止配列決定の
方法はＭ１３ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇと題されたＡｍｅｒｓｈａｍ Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ ［Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂｌｅｎｈｅｉｍ Ｃｒｅｓｅｎ
ｔ （１９８３）］（以下、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋと称する）、メッシング［Ｍｅｓｓｉｎｇ
２ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｉｃ
ａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉ
ｏｎ Ｎｏ．７９〜９９、２，４３〜４８（１９７
９）］、ノランダー等［Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，２６Ｇｅｎｅ １０１（１９８３）］、セレッテ
ィ等［Ｃｅｒｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， １１ Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５９９（１９８３）、及び
ビギン等［Ｂｉｇｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，８０ Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）３９６３
（１９８３）］などに示されている。興味の対象となる
ＤＮＡ配列をクローン化するためにＭ１３繊維状ファー
ジがベクターとして使用される。これらのファージベク
ターは連鎖停止方法により容易に配列化される一本鎖Ｄ
ＮＡ鋳型を与え、この方法は、遊離３’ヒドロキシル基
を有する短いプライマー鎖を有する一本鎖鋳型分子を開
始し、次いでＤＮＡポリメラーゼを用いて全ての４つの
デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、即ちｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（集合的に「ｄ
ＮＴＰｓ」と称する）をそれらの一つを放射標識して用
いた連鎖延長反応において鋳型鎖を複写することを含む
ものである。この合成反応において、３’−ヒドロキシ
ル末端を欠いているヌクレオチド特異的連鎖停止剤、例
えば２’，３’ジデオキシヌクレオチドトリホスフェー
ト（「ｄｄＮＴＰ」）を使用して一連の異なった長さの
連鎖延長を生成する。この停止剤はそれが成長ＤＮＡ鎖
に導入されることができるように正常な５’末端を有す
るが、しかし３’−ヒドロキシル末端を欠くものであ
る。停止剤が一度ＤＮＡ鎖中に一体化されると更にデオ
キシヌクレオチドトリホスフェートが付加されることが
出来ず、鎖の成長が停止する。各々四つのヌクレオチド
ｄＮＰＴｓ、即ちｄＡＴＰ、ｄＣＰＴ、ｄＧＴＰ及びｄ
ＴＴＰの一つのｄｄＮＴＰを有する四つの別々の合成反
応が行われる。正常なｄＮＰＴｓの一つは合成された鎖
がポリアクリルアミドゲル上で大きさにより分類された
後にオートラジオグラフすることができるように放射線
標識される。四つの反応からの連鎖延長物はオートラジ
オグラフィからの断片のパターンがクローン化されたＤ
ＮＡのＤＮＡ配列に対応するように別々のゲルレーン中
に隣り合わせて置かれる。 【００７２】上記技術により求められた第３図に示され
るプラスミドｃＤＮＡのＤＮＡ及び対応するアミノ酸配
列を第４図に示す。ヌクレオチド類は第４図に示した配
列の始めから番号が付されている。アミノ酸はＩＬ−１
蛋白質の成熟ＮＨ2−末端、即ち矢印で示されたＡｌａ
残基から始まり停止コドンＴＡＡに隣接して位置するＳ
ｅｒ残基（Ｎｏ．１５３）まで番号が付されている。Ａ
ｌａコドンからＴＡＧ停止コドンまでのＩＬ−１遺伝子
のコード化領域は第３図の箱部分として示されている。
第３図に示される制限酵素切断部位は又第４図にも示さ
れている。 【００７３】配列決定操作の準備に際して、第３図に示
されたプラスミドｃＤＮＡ部分は各種制限エンドヌクレ
アーゼで消化させ、次いで得られたＤＮＡ断片をＭ１３
ファージベクター中にクローン化して一本鎖ＤＮＡ鋳型
を形成する。センス及びアンチセンス鎖の中間位置から
上流及び下流の配列決定にはユニバーサルなプライマー
が使用される。単一の連鎖停止（鎖成長停止）方法を用
いたフラグメントの全長の配列決定から得られた配列結
果を信用するよりもむしろ追加の合成的に生成されたプ
ライマーを用いて鎖の長さに沿って他の中間位置から連
鎖停止方法が開始される。この方法により第３図に示さ
れるプラスミドｃＤＮＡの両鎖は重複して配列され、そ
れにより配列を重複して確認するのに役立つ。 【００７４】上記連鎖停止技術を用いる代りに本発明の
趣旨から離れることなくＩＬ−１の遺伝子の配列を行う
ためにその他の公知の方法を利用することが可能である
ことが了解されるべきである。例えば、７４ Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）５６０
（１９７７）に示されているマクサム（Ｍａｘａｍ）及
びギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）の化学的分解方法を使
用することができる。 【００７５】上記の如く調製され及び精製されたＩＬ−
１のアミノ酸配列の研究はスターン等の方法［Ｓｔｅｒ
ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．（ＵＳＡ）８７１（１９８４）］に従って行われ
た。エンドペプチダーゼ、シアノーゲンブロマイドを用
いてＩＬ−１をメチオニン残基において切断し、次いで
得られたフラグメントを標準的エドマン分解方法により
分析した。この方法により本発明者等はＩＬ−１蛋白質
のＣ−末端は次のアミノ酸配列：Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａ
ｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒより構成されていることを確認し
た。これは、「天然の」ＩＬ−１は、ｍＲＮＡからの翻
訳後にこの分子末端からアミノ酸の除去によって生じな
いことを確立するものである。これは、多くのコード化
された蛋白質がＩＬ−１のその前駆体からの成熟の際に
ＩＬ−１遺伝子のオープンリーディングフレームの５’
末端から除去されることが明らかなので重要である。 【００７６】ｃＤＮＡクローンからの機能的ＩＬ−１の
発現 ＩＬ−１×−１４クローンのｃＤＮＡコード領域が機能
的ＩＬ−１をコード化するか否かを決定するためにクロ
ーンが原核生物／真核生物宿主系において発現される。
ＩＬ−１×−１４クローンのコード化領域を含有するハ
イブリッドｃＤＮＡフラグメントが２組の複製配列、即
ちベクターの原核生物宿主細胞における増幅のための第
１の配列及び外来構造蛋白質即ちＩＬ−１の真核生物宿
主細胞における高割合の発現のための第２の配列を有す
るシャトル発現ベクター中に挿入される。形質転換され
た真核生物宿主細胞を採取し、上記の詳述した胸腺細胞
増殖アッセイ及びＩＬ−２転換アッセイを使用して成熟
ＩＬ−１の発現のアッセイを行う。 【００７７】各種タイプのシャトルベクターが開発され
ている。通常のタイプは、原核生物細胞、典型的には
Ｅ．ｃｏｌｉ中においてＤＮＡ複製の信号を与える複製
及びプロモーター配列のオリジン（ｏｒｉｇｉｎ）及び
真核生物細胞、最も普通には酵母細胞においてＤＮＡ複
製の信号を与える複製及びプロモーター配列の対比オリ
ジンを含む。シャトルベクターは又、形質転換された原
核生物細胞の選択のための薬剤耐性遺伝子のような表現
型マーカーも含む。シャトルベクターは形質転換された
真核生物細胞の選択のための対比の表現型マーカー変更
を有する。理想的には、高割合のＩＬ−１の発現のため
には望ましくない蛋白質の発現を避けるために真核生物
のプロモーター配列から全ての蛋白質コード化配列が除
去される。又、この目的のために天然或いは合成の開始
コドン配列、即ちＡＴＧがＩＬ−１遺伝子の挿入された
コード化領域の５’末端に付着される。 【００７８】本発明を実施するための好ましいシャトル
ベクターはｐＹ ＡＤＨで表わされる。模式的に第５図
に図示されるようにｐＹ ＡＤＨプラスミドは、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ中における高複写ＤＮＡ発現のための複製起点
（プラスミドｐＢＲ３２２から）及び形質転換された
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の選択のためのアンピシリン（「Ａｍ
ｐR」）耐性遺伝子を含む。このシャトルベクターは又
２μの円の複製起点、及び酵母栄養要求変異種（ｔｒｐ
マイナス）における形質転換された酵母宿主の選択のた
めの酵母ＴｒｐＩ遺伝子をも含む。このシャトルベクタ
ーは更に、このプラスミドの酵母及びＥ．ｃｏｌｉの宿
主の両者においての伸長のためのアルコールデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子（「ＡＤＨ」）からの酵母プロモーター配
列をも含む。このプロモーター配列は、この遺伝子の酵
母中における高割合の発現率により、及びこの遺伝子の
完全なＤＮＡ配列が知られているので、本発明において
使用するのに特に有利である。開始ＡＴＧコドンを含む
全ての蛋白質コード化配列はＡＤＨプロモーター断片か
ら除去された。このｐＹ ＡＤＨシャトルベクターは制
限酵素、即ちＥｃｏＲＩ及びＳｔｕＩで切断するための
多くの独特な基質部位を含む。 【００７９】第５図に図示される如く、ｐＹ ＡＤＨ
ＩＬ−１プラスミドは、ＩＬ−１遺伝子のコード化領域
をプラスミドｐＹ ＡＤＨ中に導入することによりＩＬ
−１遺伝子の発現のための発現ベクターとして調製され
る。このシャトルベクターの試料はＡＴＣＣ（１２３６
１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ Ｍａｒｙｌａｎｄ州 ２０８５２）に寄託Ｎｏ．３
９９６７で寄託されている。ＩＬ−１遺伝子のコード化
領域は上記で調製されたｃＤＮＡプラスミドから除去さ
れている。ＩＬ−１遺伝子のコード化領域の正確に５’
末端に独特の制限酵素切断部位がないためにコード化領
域の主たる部分はプラスミドｃＤＮＡから制限酵素Ｈｐ
ａII及びＰｓｔＩにより切断される。ＨｐａII部位は遺
伝子コード化領域の５’末端からやや下流に位置してい
る。その後遺伝子の切断された５’末端を含有する合成
オリゴヌクレオチドは「天然」の主たるＩＬ−１ｃＤＮ
Ａ断片への便利な連結のためのＨｐａII付着３’末端で
化学的に合成される。上記の如くＡＤＨプロモーター配
列の配列の下流の全ての蛋白質コード化配列は除去され
たので、合成オリゴヌクレオチドはＡＴＧ開始コドンで
もってその５’末端で合成される。 【００８０】このＩＬ−１ｃＤＮＡ断片を合成オリゴヌ
クレオチドと共に、合成オリゴヌクレオチドの５’末端
と主たるＩＬ−１ｃＤＮＡ断片の３’末端の立体配置に
対応する適当な制限酵素で予め消化されたシャトルベク
ターｐＹ ＡＤＨ中に挿入する。得られた組み換えシャ
トルベクターｐＹ ＡＤＨ ＩＬ−１を用いてシャトル
ベクターの高複写増幅のために原核生物宿主、例えば
Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換する。この最初の形質転換方法
の後、組み換えシャトルベクターをＥ．ｃｏｌｉ宿主か
ら単離し、次いでＩＬ−１の高割合発現のために真核生
物宿主、例えば酵母細胞を形質転換するために使用す
る。形質転換された酵母宿主を採取し、得られた上澄液
について上記胸腺細胞増幅及び／又はＩＬ−１転換アッ
セイを利用して生物学的活性のアッセイを行う。 【００８１】本発明の方法及び生成物を以下の具体例に
より更に説明する。 【００８２】 【実施例】例 １ ＩＬ−１製造 ヒトの全血（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、オレゴン赤十字から得
られた混合物）から得られた３５０〜４００ｍｌの白血
球濃縮物をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，ミズーリー州、セントルイ
ス）上に積層されたＣａ++，Ｍｇ++のないリン酸緩衝塩
水（「ＰＢＳ」）と混合し希釈し、次いで室温において
６００×ｇで３０分間遠心分離を行った。白血球よりな
る界面層を回収し、ＰＢＳで洗浄し、室温において４０
０×ｇで１０分間遠心分離を行った。細胞を更に２回Ｃ
ａ++，Ｍｇ++のないＰＢＳ中で洗浄し、各洗浄後２００
×ｇで１０分間遠心分離を行った。 【００８３】２×１０6細胞／ｍｌの濃度で得られた単
核細胞をスピナーフラスコ内でＭＥＭ培地中で培養し
た。この培地は５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍ
ｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、０．２ｍＭ
ゲンタマイシン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を
補給した。細胞は、０．０１ｍｇ／ｍｌの加熱不活性化
したホルマリン固定されたスタフィロコッカス・アウレ
ウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，
Ｉｇｓｏｒｂ，Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ，
Ｉｎｃ．マサチューセッツ州、マルデン）を添加するこ
とによりＩＬ−１産生の刺激を与えられた。汚染蛋白質
の産生を減少させるために血清は培養培地には添加しな
かった。空気中５％ＣＯ2の加湿された雰囲気において
３５℃で２４時間インキュベーション後培養物を室温に
おいて３０分間７０００×ｇ遠心分離を行い、次いで上
澄液を除去して使用するまでポリプロピレンボトルに−
２０℃で貯蔵した。 【００８４】例 ２ イオン交換クロマトグラフィー 例１で調製されたＩＬ−１含有上澄液をカチオン交換ク
ロマトグラフィー及びアニオン交換クロマトグラフィー
で精製した。これらのクロマトグラフィー操作は４℃で
行われ、それらに使用されたゲルはＩＬ−１活性の樹脂
への非特異的吸着を減少させるために０．１％Ｔｒｉｔ
ｏｎ−Ｘ及び１０％ｖ／ｖウシ胎児血清で予備処理し
た。クロマトグラフィー操作に先立ち、培養上澄液は上
記方法で分析した。粗製ＩＬ−１溶液は１．９８×１０
7Ｕの典型的な全活性、６．３７×１０4Ｕ／ｍｇ試料の
特異活性及び３．１１×１０5μｇの全蛋白質含量を有
していた。 【００８５】Ａ．カチオン交換クロマトグラフィー 培養上澄液のイオン強度は１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝
液ｐＨ４．０を１０ｍＭクエン酸塩の最終濃度まで添加
して調製し、又、濃塩酸でｐＨ４．０まで減少させた。
この様に調整された上澄液を予め１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、ｐＨ４．０と共に同一の緩衝液で平衡化しておいた
スルホプロピルＳｅｐｈａｄｅｘ（「ＳＰＳ」）Ｃ−２
５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ，ニュージャージー州、ピスカタウエイ）の３０×
１．６ｍｌのカラムに適用した。培養上澄液は４００ｍ
ｌ／時間の速度でカラムに適用した。 【００８６】負荷が完結後、カラムを１０カラム容の１
０ｍＭ−２Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸（「ＭＥ
Ｓ」）緩衝液ｐＨ５．０で洗浄し、未結合蛋白質を除去
した。結合蛋白質を次いでカラムに５０ｍｌ／時間の速
度で適用した４カラム容の１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ．ｐＨ８．１でカラムから溶出した。カラムのｐＨは
約３カラム容の溶離液を適用後に上昇したのがみとめら
れ、それによりＩＬ−１ピークの溶出がもたらされた。
カラム画分を集め、上記の如く分析した。 【００８７】本発明者らはカチオン交換カラムから溶出
したＩＬ−１が、約１．１×１０7Ｕの活性及び約２．
１０×１０5Ｕ／ｍｇの特異活性を示し、それにより最
初のＩＬ−１の約５６％を保持しながら約３倍のＩＬ−
１の活性の増大を達成することを見出した。又、約８０
％の汚染蛋白質がカチオン交換クロマトグラフィー操作
により除去された。 【００８８】Ｂ．アニオン交換クロマトグラフィー カチオン交換カラムからのプールされた濃縮液が更にＤ
ＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉ
ｎｅ Ｃｈｅｍｃａｌｓ，ニュージャージー州、ピスカ
タウェイ）のカラム上でアニオン交換クロマトグラフィ
ーにより更に精製された。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ
カラムは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ．ｐＨ８．１で平
衡化された。ＩＬ−１はこの同一の平衡化緩衝液でＳＰ
Ｓカラムから溶出されたのでＳＰＳプールを２０ｍｌ／
時間の速度で直接的にＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラ
ムに負荷し、それにより透析による活性の損失を回避し
た。負荷後、カラムを５カラム容の同一の平衡化緩衝液
で洗浄し、次いで溶出を４カラム容の１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ．ｐＨ８．１中の０〜４００ｍＭ ＮａＣｌ
の線形勾配を用いて行った。 【００８９】本発明者等はＩＬ−１活性が０．０８〜
０．１２Ｍ ＮａＣｌの鋭いピークにおいて溶出された
ことを見出した。溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、
幾つかの高分子量汚染物質並びに約１７，５００、１
５，０００及び１２，０００ダルトンの三つの主たる分
子量のバンドを示した。カラム溶出液の分析は７．７５
×１０6Ｕの全活性、２．５８×１０6Ｕ／ｍｇの特異活
性、３×１０3μｇの全蛋白質及び３９％の収率を示し
た。 【００９０】例 ３ アフィニティクロマトグラフィー 例２からの活性画分をプールして、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．１中で予備平衡化しておいた
アガロースマトリックスに結合された染料配位子「Ｐｒ
ｏｃｉｏｎ」赤色染料（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，メリーランド州、
ベテスダ．Ｃａｔ．Ｎｏ．５９２６ ＳＡ）の１０×
１．６ｃｍカラムを用いたアフィニティクロマトグラフ
ィー技術により更に精製した。ＩＬ−１の染料配位子カ
ラムへの結合を最適化するために、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈ
ａｃｅｌプールのイオン強度はプールを１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．１中で１：４で希釈するこ
とにより４０ｍＭ未満に低下させた。染料配位子カラム
は先ず４カラム容の同一出発緩衝液で洗浄して未結合蛋
白質を除去し、次いで溶出を１５カラム容の１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．１中の０〜１．０Ｍ
ＮａＣｌで構成されている線形勾配で行った。本発明
者等はＩＬ−１活性が典型的には０．５０〜０．５５Ｍ
ＮａＣｌにおける鋭いピークにおいて溶出されたこと
を見出した。カラム画分を集め上記の如く分析した。 【００９１】ＩＬ−１の活性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
析は、約１７，５００ダルトンの分子量を有する単一蛋
白質バンドを示した。上記の高分子量バンドはカラムか
ら溶出され１５，０００及び１２，０００ダルトンの低
分子量のバンドはより高い塩濃度において溶出された。
活性ＩＬ−１画分について行われた分析は、約６．２×
１０6ＵのＩＬ−１の全活性、約９．５×１０8Ｕ／ｍｇ
の特異活性及び約６．５μｇの全蛋白質含量を示した。
これは９９％を越えるＩＬ−１の総括純度及び出発上澄
液からの約３１％の収率に相当する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
及び染料配位子アフィニティクロマトグラフィー後に集
められた画分の銀染色から得られた単一の蛋白質バンド
から、又、分析された画分の特異活性からも、ＩＬ−１
分子の本質的な等質性は本発明によりＩＬ−１の高収率
を維持しながら達成されたことは明らかである。 【００９２】染料配位子アフィニティクロマトグラフィ
ーから得られた等質なＩＬ−１は又上記の如く銀染色と
共に二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっても
分析された。この操作も首尾一貫して全く同一の分子
量、即ち１７，５００ダルトンにおいて４つの染色スポ
ットをもたらし、同一色を銀染色において染色した。こ
れらのスポットは出発上澄液のいずれのロットが使用さ
れたかの如何に拘らず、常に同一の位置及び同一の相対
割合にあった。最も強いスポットは６．３〜５．９のｐ
Ｉを示した。他の３つのスポットはｐＨ勾配がより酸性
になるにつれて、染色度が弱くなる。これらの結果はお
そらく異ったアミド化の状態によりヒトＩＬ−１はｉｎ
ｖｉｖｏにおいて異った荷電状態にあることを示して
いる。銀染色が各スポットに対して全く同一の色をもた
らすという事実は同一の親蛋白質は全ての場合において
染色している可能性が最も強いことを示している。 【００９３】例 ４ アフィニティクロマトグラフィー−青色染料 例３の代替法として、例２からの活性画分をプールし、
次いで染料配位子がアガロースマトリックスに架橋され
たＣｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）Ｂｌｕｅ ３６Ａ染料
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓメリーランド州、ベセスダ、Ｃａｔ．Ｎ
ｏ．５９０４ ＳＡ）で構成されている、他は例３にお
いて使用されたのと本質的に同一のアフィニティクロマ
トグラフィー技術により更に精製する。活性画分につい
て行われた分析は約５．０×１０6ＵのＩＬ−１の全活
性及び約７．６×１０8Ｕ／ｍｇの特異活性を示し、そ
れは赤色染料由来ＩＬ−１中に存在していた活性の約８
０％であった。より高い純度を達成するためには、青色
染料配位子アフィニティクロマトグラフィーからの活性
画分を集め、その操作を繰り返すことが出来る。 【００９４】例 ５ アミノ酸組成分析 例３或いは４からの精製ＩＬ−１を５．７Ｎ ＨＣｌ
（濃ＨＣｌ（Ｋｏｄａｋ，ニューヨーク州、ロチェスタ
ー）から再蒸留）中において、真空中で２４時間及び４
８時間沸騰させて、ペプチド結合の加水分解及び遊離ア
ミノ酸の放出を行なった。加水分解後、試料を真空乾燥
し、次いで０．２Ｎのクエン酸ナトリウム、ｐＨ２．２
中に再懸濁させた。これらの試料を次いでニンヒドリン
検出を用いる単一カラムＬＫＢ Ｍｏｄｅｌ ４１５０
−Ａｌｐｈａ（英国、ケンブリッジ）アミノ酸アナライ
ザー中に注入した。存在する特別のアミノ酸の量に対応
する出力「ピーク」の面積をＬＫＢ Ｍｏｄｅｌ ２２
２０記録積分計により積分した。 【００９５】本技術により決定されたヒトＩＬ−１のア
ミノ酸組成を下記の表Ｉに示す。表Ｉに示される如く、
上記アミノ酸分析からはグルコサミン或いはガラクトサ
ミンは観察されず、これはヒトＩＬ−１は単一分子量種
としてポリアクリルアミドゲル上を移動するという、本
発明者等の従来の発見に一致するものである。これらの
観察の一方或いは両方はもしヒトのＩＬ−１が、付着し
た炭水化物部分を含むならば反対となるであろう。この
様にして、ヒトＩＬ−１が糖蛋白質であることは有りそ
うにない。 【００９６】 【表１】表 １ ヒトＩＬ−１のアミノ酸分析 アミノ酸 分子当りの残基数 Ａｓｐ／Ａｓｎ １４ Ｔｈｒ ８ Ｓｅｒ １１ Ｇｌｕ／Ｇｌｎ ２２ Ｐｒｏ ６ Ｇｌｙ １１ Ａｌａ ８ Ｃｙｓ １＊ Ｖａｌ １１ Ｍｅｔ ４ Ｉｌｅ ６ Ｌｅｕ １１ Ｔｙｒ ４ Ｐｈｅ １１ Ｈｉｓ ３ Ｌｙｓ １３ Ａｒｇ ３ ＊アミノ酸配列分析より決定 【００９７】例 ６ 分子のＮ−末端部分のアミノ酸配列分析 例３或いは４の染料配位子アフィニティクロマトグラフ
ィーからの等質ＩＬ−１を含有する画分を先ず脱イオン
蒸留水で１０倍に希釈し、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．０に
調整し、次いで０．５ｍｌベッド容量のＳＰＳ Ｃ−２
５クロマトグラフィーカラムに適用した。ＩＬ−１の適
用前にカラムを０．１Ｍクエン酸ナトリウム、０．０５
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０で構成されている緩衝液で平
衡化させた。ＩＬ−１の負荷後カラムを１０ｍｌの同一
緩衝液で洗浄し、次いで２０ｍｌの脱イオン蒸留水で洗
浄した。その後、ＩＬ−１を１０ｍＭ ホウ酸ナトリウ
ムｐＨ９．０で溶出した。 【００９８】第１の配列決定分析操作において、上記の
如く濃縮した１１．１μｇの等質なＩＬ−１を真空乾燥
し、次いでＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍ
ｏｄｅｌ ４７０蛋白質配列決定器を用いて直接的に自
動化アミノ末端Ｅｄｍａｎ分解に付した。この方法によ
り本発明者等は、ＩＬ−１分子のＮ−末端部分が次の配
列のアミノ酸残基よりなることを発見した： 【化１０】ＮＨ2−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−
Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ-Ｔｈｒ-Ｌｅｕ-Ａｒ
ｇ-Ａｓｐ-Ｓｅｒ-Ｇｌｎ-Ｇｌｎ-Ｌｙｓ-Ｓｅｒ-Ｌｅ
ｕ-Ｖａｌ-Ｍｅｔ． 第２の配列決定分析操作において等質なＩＬ−１を酵素
トリプシンで分別し、次いで自動化配列決定分析に付し
た。ＩＬ−１分子のトリプシンによる分別前にリジン残
基の側鎖を特別の試薬無水シトラコン酸で保護した。こ
の目的のために、ＳＰＳ Ｃ−２５カラム溶出液からの
画分を真空中で１ｍｌの最終容積まで濃縮した。１μｌ
の無水シトラコン酸（Ｐｉｅｒｃｅ）を濃縮ＩＬ−１に
添加し、次いでｐＨを５Ｎ ＮａＯＨで８．３に調整し
た。反応混合物を１５分間撹拌し、室温で１時間放置し
た。その時点において、第２の１μｌ量の無水シトラコ
ン酸を添加し、反応混合物を更に１５分間撹拌し、次い
で混合物を５Ｎ ＮａＯＨで８．３の最終ｐＨに調整し
た。室温において更に１時間放置後１００μｌの１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４及び１００μｌの１Ｍ
ＮＨ4ＨＣＯ3、ｐＨ７．８を反応混合物に添加して保護
工程（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ）を完結させ
た。 【００９９】次に、２μｇをＴＰＣＫ−処理トリプシン
（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）（１０μｌの１０ｍＭ Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ２．０中）を反応混合物に添加し、ＩＬ−１
分子をアルギニン残基において切断した。トリプシン添
加後、混合物をゆっくり５秒間撹拌し、次いで３７℃に
おいて２時間インキュベートした。インキュベーション
時間の完了後、更に２μｇのＴＰＣＫ−処理トリプシン
を添加し、混合物を更に２時間３７℃でインキュベート
した。混合物を次いで室温に冷却し、９０％のギ酸（Ｂ
ａｋｅｒ）でｐＨ２．５に調整した。室温で４時間放置
後酸性化された混合物を０．５ｍｌの６Ｍグアニジン−
ＨＣｌを添加して希釈し、次いで予め水中０．１％ＴＦ
Ａ（ｖ／ｖ）で平衡化しておいた４．６×２５０ｍｍの
Ｖｙｄａｃ ２１８ ＴＰカラムにＢｅｃｋｍａｎ Ｍ
ｏｄｅｌ １１２ポンプ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｍｉｔｈ
Ｋｌｉｎｅ Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて約１ｍｌ／分の
流速で注入した。この負荷されたカラムを先ず水中０．
１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）で洗浄し、未結合成分を除去し、
次いでＩＬ−１ペプチド類を０．５％／分の割合で１ｍ
ｌ／分の流速で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）中０〜１００
％アセトニトリルの線形勾配でカラムから溶出させた。
ペプチド類の溶出は、２３０ｎｍ波長における紫外線分
光光度法により検出した。 【０１００】ＩＬ−１ペプチド類を含有する個々の画分
或いは２以上の画分より構成されているプールの配列決
定を、自動化アミノ末端Ｅｄｍａｎ分解により行った。
配列決定前にＩＬ−１を含有するＨＰＬＣ画分をゲル電
気泳動により分析して、各画分中のペプチドの数を決定
した。その後、ペプチド類を真空濃縮して約３０μｌの
最終容積にして調整されたフィルター上にスポットし、
次いで４４℃において加熱室で乾燥した。乾燥フィルタ
ーをＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ
Ｎｏ．４７０Ａ自動化蛋白質配列決定器中に入れた。
この操作により本発明者等は、Ｎ−末端部分近辺のヒト
ＩＬ−１分子の主たる断片は次のアミノ酸残基の配列よ
り構成されていることを発見した： 【化１１】Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｎ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ
−Ｖａｌ−Ｐｈｅ． この配列のＮ−末端の最初の四つの残基は上記において
直接自動化蛋白質配列決定により求められたＣ−末端の
最後の四つの残基と一致し、この中間配列は上記Ｎ−末
端配列の続きであるとの結論に導く。 【０１０１】例 ７ 例１の第１段落において説明したようにして調製された
単核細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地中に１０％ウシ胎児
血清（ｖ／ｖ）と共にプラスチック培養フラスコに入れ
た。３７℃における２時間のインキュベーション後、非
付着細胞をデカンテーション分離し、次いで２０μｇ／
ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＰＳを含有する追加の血清補給
ＲＰＭＩ−１６４０培地をフラスコに再び満たした。１
６時間後、付着ＬＰＳ刺激細胞をＲＮＡとして採取し
た。 【０１０２】全ＲＮＡは付着性単核細胞から上記Ｃｈｉ
ｒｇｗｉｎ等の方法により抽出した。この操作におい
て、グアニジニウムチオシアネートを使用してＲＮａｓ
ｅによるＲＮＡ加水分解の速度を越える速度でＲＮａｓ
ｅを含む細胞蛋白質を変性した。ｍＲＮＡは細胞蛋白質
からセシウムクロライドの密なクッションを介して超遠
心分離により除去した。 【０１０３】その後、ポリアデニル化ｍＲＮＡを上記マ
ニアティス等の文献１９７により開示されている方法を
用いてオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィー
カラム上で抽出蛋白質から分離した。簡単に述べると、
カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐＨ７．６）、
０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸
（「ＥＴＤＡ」）及び０．１％ＳＤＳにより構成されて
いる適用緩衝液で準備した。蛋白質ペレットを水及び適
用緩衝液に溶解し、次いでカラムに負荷した。非吸着物
質を先ず適用緩衝液で洗浄し、次いで０．１Ｍ ＮａＣ
１を含有する適用緩衝液による追加の洗浄により溶出し
た。保持されたポリアデニル化ｍＲＮＡは１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−Ｃ１（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び
０．０５％ＳＤＳにより構成されている減少されたイオ
ン強度の緩衝液を用いて溶出した。溶出されたポリアデ
ニル化ｍＲＮＡを−２０℃において１／１０容酢酸ナト
リウム（３Ｍ、ｐＨ５．２）及び２．２容のエタノール
を用いて沈殿させた。ポリアデニル化ｍＲＮＡをオリゴ
（ｄＴ）−セルロースカラムから溶出後、ポリアデニル
化ｍＲＮＡの完全性を上記マニアティス等の文献１９９
において詳説されているアガロースゲルによる電気泳動
により確認した。 【０１０４】ポリアデニル化ｍＲＮＡはメチル水銀アガ
ロースによる電気泳動により大きさの分類を行った。ｍ
ＲＮＡの異った大きさの群に対応するゲル画分を次いで
上述の如き、ウサギ網状赤血球溶解物を使用して或いは
アフリカツメガエル卵母細胞に注射してｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで翻訳した。網状赤血球翻訳或いはｍＲＮＡ注射卵母
細胞により放出された液体について、上記アッセイを用
いてＩＬ−１活性の存在を試験した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ
で翻訳された際に、ＩＬ−１活性を生じたｍＲＮＡゲル
画分をｃＤＮＡ構成のためのｍＲＮＡ源として選択し
た。 【０１０５】例 ８ ｅＤＮＡライブラリーの構成 ｍＲＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡのライブラリーを例
７の精製ｍＲＮＡから上記マニアティスらの文献２２９
により詳説されている標準的操作方法を用いて調製し
た。オリゴ−ｄＴをｍＲＮＡのポリアデニル化された尾
部にハイブリダイズさせ、第１のｃＤＮＡ鎖の逆転写の
ためのプライマーとして用いた。酵素鳥類骨髄芽球症ウ
ィルス（「ＡＭＶ」）の逆転写酵素がｍＲＮＡを鋳型と
して用いて第１のＤＮＡ鎖を合成した。この方法の結
果、最初のｃＤＮＡ鎖の３’末端にヘアピンループが形
成され、それは第２のｃＤＮＡ鎖の一体的プライマーと
して役立った。ｍＲＮＡ鎖をＮａＯＨで分解後、第２の
ｃＤＮＡ鎖をＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成した。
次いでヘヤピンをヌクレアーゼＳ1で除去して二本鎖ｃ
ＤＮＡ分子を形成した。 【０１０６】この二本鎖ｃＤＮＡをＳｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ−４００（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ）カラムクロマトグラフィーにより大きな分
類に分別し、末端標識化されたｐＢＲ３２２ ＤＮＡの
断片を分子量マーカーとして用いるアルカリアガロース
ゲル電気泳動を使用する分析により追跡した。５００ｂ
ｐ未満の長さを有するＤＮＡ鎖は、これらの望ましくな
いｃＤＮＡ画分の不必要なクローニングを避けるために
除外した。 【０１０７】上記の如く調製された二本鎖ｃＤＮＡ画分
を上記マニアティス等の文献の２３９に始まる方法によ
りｐＢＲ３２２プラスミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉ
ｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ）のＰｓｔＩ部位中に挿入し
た。この操作において二本鎖ｃＤＮＡはその３’末端に
おいてポリ（ｄＣ）でテーリングされた。プラスミドｐ
ＢＲ３２２をＰｓｔＩエンドヌクレアーゼで消化し、次
いで３’末端にポリ（ｄＧ）でテーリングした。テーリ
ングされたプラスミドＤＮＡ及びテーリングされたｃＤ
ＮＡをアニーリング緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ，１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１（ｐＨ７．８）及び１０ｍＭ Ｅ
ＴＤＡ）でアニーリングし、新規な組み換えプラスミド
を形成した。ここに記載される全ての制限酵素はＮｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ
州、ベバリーから市販されているものである。 【０１０８】これらの組み換えプラスミドは上記ハナハ
ンの操作方法を用いてＥ．ｃｏｌｉ菌株ＭＭ２９４中に
形質転換された。ここに用いられたＥ．ｃｏｌｉ細胞は
高められた割合のＭｇ2+中における生育により調製され
た。形質転換宿主をプレート培養し、次いで形質転換体
を表現形同定剤としてテトラサイクリンを使用して同定
した。この技術を使用することにより、本発明者等は約
２×１０6個の独立の形質転換体を得た。 【０１０９】例 ９ 合成オリゴヌクレオチドスクリーニングプローブの調製 上記例８におけるようにして調製したｃＤＮＡライブラ
リーのスクリーニングにおけるプローブとして合成オリ
ゴヌクレオチドを使用した。このプローブは次の組成に
より構成されているものであった： 【化１２】 ５’ＡＣ ＴＴＧ ＴＴＧ ＴＴＣ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＴＧ ＧＣＣ ＴＴＧ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＧＧＣ ＴＴＴ ＣＡＧ ＴＴＣ ＧＴＡ ＧＧＧ ＧＣＣ ＧＧＡ ＣＡＴ ３’． このオリゴヌクレオチドプローブは上記スード等の文献
及び上記ヒロセ等の文献に詳説されているトリエステル
法により化学的に合成されたものであった。 【０１１０】化学合成が完了後、オリゴヌクレオチドプ
ローブの５’−末端を32Ｐで標識化した。標識化を容易
にすするためにオリゴヌクレオチドの５’末端はＯＨ末
端で合成され、それによりＤＮＡ断片の標識化をする際
に典型的に使用されなければならないホスファターゼ処
理を除去した。標識化方法は１μｌの合成オリゴヌクレ
オチドを１６μｌの32Ｐ−ＡＴＰ（３０００ｃｉ／ｍ
Ｍ）、１μｌ（１０Ｕ）のＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ及び２μｌの１０×キナーゼ緩衝液Ｉに添加すること
を含むものであった。１０×キナーゼ緩衝液Ｉは、０．
５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃ１（ｐＨ７．６）、０．１Ｍ Ｍｇ
Ｃｌ2、５０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭスペルミ
ジン及び１ｍＭ ＥＴＤＡより構成されているものであ
った。反応は３７℃で３０分間行われ、その後合成され
たオリゴヌクレオチド類をフェノール／クロロホルムで
抽出した。標識化されたプローブを未標識化オリゴヌク
レオチド類からＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ）上の
クロマトグラフィー或いはそれを通して遠心分離により
分離した。 【０１１１】例１０ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 上記例９において調製したｃＤＮＡライブラリーの最初
のスクリーニングを容易に行うために形質転換細菌培養
物を各々、約２，０００個の形質転換体の異ったクロー
ンを有する群にプール分けした。プラスミドＤＮＡをイ
シューホロヴィッツ及びバーク［Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉ
ｃｚ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ，９ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２９８９（１９８１）］に詳説されている標
準的アルカリ溶解法により宿主細菌の試料から除去し
た。単離されたプラスミドを２つのフラグメントに分離
した。これは先ずプラスミドを完全にＰｖｕII及びＨｉ
ｎｄIIIで消化することにより達成された。この目的の
ために、プラスミド類を２０μｌの１×ＨｉｎｄIII緩
衝液（７ｍＭ、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、７ｍＭ塩化マ
グネシウム、６０ｍＭ ＮａＣｌ）に再溶解し、次いで
１μｌのＰｖｕII及び１μｌのＨｉｎｄIII制限エンド
ヌクレアーゼを添加した。この混合物を３７℃で２時間
インキュベートした。 【０１１２】次に、プラスミド消化物を適当な大きさの
マーカーを用いて０．８％アガロースゲルによる電気泳
動により分別した。アガロースゲルは上記サザンにより
説明されている標準的方法を用いてニトロセルロースフ
ィルター上にプロットさせた。この転移操作後、フィル
ターを風乾し、約８０℃で真空下に２時間焼成し、ＤＮ
Ａ断片をニトロセルロースに結合させた。 【０１１３】結合されたＤＮＡを次いで標識化されたオ
リゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした。簡単
に述べると、焼成されたニトロセルロースを６×クエン
酸ナトリウム塩水（「ＳＳＣ」）（２０×ＳＳＣは８０
０ｍｌのＨ2Ｏ中１７５.３ｇのＮａＣｌ及び８８.２ｇ
のクエン酸ナトリウムにより構成され、ｐＨは１０ＮＮ
ａＯＨで７．０に調整されている）中に予備浸漬し、次
いで６×ＳＳＣ、０．５％ＮＰ４０洗剤、０．１％サレ
オシル、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶液（０．０２％Ｆｉ
ｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２
％ＢＳＡ）及び１００μｇ／ｍｌの変性鮭精液ＤＮＡ
（Ｓｉｇｍａ ＴｙｐｅIII、ナトリウム塩）より構成
されているプレハイブリダイゼーション緩衝液中におい
て５０℃で２〜４時間インキュベートした。フィルター
を、次いで上記ハイブリッド化溶液中において32Ｐ−標
識化オリゴヌクレオチドプローブ（１０6ｃｐｍ／μ
ｇ）（例３からのもの）で５０℃において一晩インキュ
ベートした。一晩のハイブリダイゼーション後、フィル
ターを室温で十分に６×ＳＳＣで洗浄し、次いで５０℃
で６×ＳＳＣにより５分間洗浄した。風乾後フィルター
を−７０℃でオートラジオグラフィーに付した。 【０１１４】オートラジオグラフィーから本発明者等は
幾つかのハイブリッド化バンドを見出した。プラスミド
ＤＮＡがハイブリッド化バンドを生成したクローンのプ
ールをプレートから取り出し次いで上記と同一のハイブ
リッド化条件下において標識化されたオリゴヌクレオチ
ドプローブを用いたニトロセルロースペーパー上の直接
細菌コロニーハイブリッド化に使用した。この方法によ
り、単一のコロニーが同定された。 【０１１５】例１１ スクリーニングされたｃＤＮＡの制限酵素マッピング ＩＬ−１ Ｘ−１４と称されるプラスミドが例１０に示
された操作により同定された陽性のコロニーから調製さ
れた。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＲＲ１中に形質転換されたＩＬ
−１ Ｘ−１４プラスミドの試料はＡＴＣＣに寄託番号
３９９２５で寄託されている。その後このＩＬ−１Ｘ−
１４プラスミドを、線形化されたＤＮＡの末端標識化さ
れた断片の部分消化を含む上記スミス及びブリンスチー
ルにより開発された技術を用いて制限酵素マッピングに
より分析した。ＤＮＡ断片をそれらの５’末端において
ポリヌクレオチドキナーゼ及び32Ｐ−ＡＴＰを用いて32
Ｐ−ホスホリル基で標識化した。標識化したＤＮＡ鎖を
次いで非対称的に適当な制限酵素で切断して各々その一
方の末端で標識された二つの断片を与えた。これらの標
識化された断片をゲル電気泳動により単離した。これら
の二つの断片の各々を適当な制限酵素により部分的に消
化した。大きなスペクトルの消化断片が生成されるが、
標識化された断片は各々共通の標識化された末端を有す
る単純な重複系列を形成する。これらの断片をゲル電気
泳動により分別し、次いでオートラジオグラフィーによ
り検査した。ゲル上の断片の位置は、プラスミドＤＮＡ
に沿った制限部位の順序に直接対応する。 【０１１６】この操作により本発明者等は、ＩＬ−１遺
伝子の領域におけるＩＬ−１Ｘ−１４のプラスミドの制
限部位を第３図に示されるように部分的にマッピングし
た。遺伝子の制限部位間に示される番号は塩基対にある
部位間の近似的距離に対応する。 【０１１７】例１２ スクリーニングされたｃＤＮＡの配列決定 第３図に示されるＤＮＡセグメントの配列決定は以下に
述べる変更を除いては上記Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈａｎｄ
ｂｏｏｋに記載されている方法と本質的に同一のジデオ
キシ連鎖−停止方法により行った。ＤＮＡセグメントを
ＨｉｎｄIII及びＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消
化し、次いで得られたＤＮＡ断片をＭ１３一本鎖フィラ
メント状ファージベクターの菌株ｍｐ１８及びｍｐ１９
（Ａｍｅｒｓｈａｍ イリノイ州、アーリントンハイ
ツ）にクローン化させた。上記ノランダー等の文献に示
されているこれらのｍｐ１８及びｍｐ１９ファージベク
ターは次の独特のクローニング部位を含有する：Ｈｉｎ
ｄIII；ＳｐｈＩ；ＰｓｔＩ；ＳａｌＩ；ＡｃｃＩ；Ｈ
ｉｎｃII；ＸｂａＩ；ＢａｍＨＩ；ＸｍａＩ；Ｓｍａ
Ｉ；ＫｐｎＩ；ＳｓｔＩ；及びＥｃｏＲＩ。ｍｐ１８及
びｍｐ１９ベクターの組成は上記制限部位の順序がｍｐ
１９ベクターにおいては反対になっていることを除いて
は同一であり、従って、ＤＮＡセグメントの両鎖をこれ
らの二つのベクターを用いて便利に配列決定することが
出来る。これらのｍｐ１８及びｍｐ１９ベクターは第３
図のｃＤＮＡセグメントの断片をその中に挿入されて菌
株Ｋ１２のＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０３及びＪＭ１０５
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州、ベセスダ）を形質転換
するために使用され、センス及びアンチセンス鎖の一本
鎖インサートを含有する複製一本鎖ＤＮＡ鋳型を生成し
た。 【０１１８】合成のユニバーサルのプライマー：５’−
ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴ−３’（Ｐ−Ｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ウイスコンシン州、ミルウォー
キー）をアニーリングして、一本鎖ＤＮＡ鋳型にし、上
記ヌクレオチド４７６〜４７７（第４図）の位置から上
流及び下流のＤＮＡ合成を開始するのに使用した。その
後、延長断片をゲル電気泳動により大きさ分離し、オー
トラジオグラフにかけ、断片のヌクレオチド断片を推定
した。三つの追加のプライマーを使用して、第４図のＤ
ＮＡのセンス鎖に沿った中間位置からの合成を開始し
た。ヌクレオチド６７１〜６８８（第４図）に対応する
５’−ＣＴＧＧＡＧＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＣ−３’の組
成を有するプライマーを使用して、ヌクレオチドＮｏ．
６８８から下流方向へのセンス鎖の合成を開始した。こ
のプライマー鎖の組成はユニバーサルなプライマーを使
用して予め得られた配列情報から確立された。組成：
５’−ＧＡＴＡＴＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣ−３’（第
４図のヌクレオチド８５１〜８６８に対応）の第２の合
成プライマーを使用してヌクレオチドＮｏ．８６８から
下流方向のセンス鎖の配列化をした。配列：５’−ＧＡ
ＴＴＣＧＴＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣ−３’（ヌクレオチド
Ｎｏ．２３５〜Ｎｏ．２１８に対応）を有する第３のプ
ライマーを使用してヌクレオチドＮｏ．２１８から上流
方向のアンチセンス鎖の配列化を行った。 【０１１９】上記の「歩み寄り（ｗａｌｋ ｄｏｗ
ｎ）」法により、第３図のプラスミドｃＤＮＡの両鎖は
重複した方法で配列決定され、それによりそれらのヌク
レオチド配列が確認された。本発明の趣旨から離れるこ
となく鎖に沿った他の位置から鎖延長を開始するために
その他の合成プライマーを使用することが可能であった
ことが了解されるべきである。上記プライマー鎖は上記
文献のスード等及び上記ヒロセ等の文献に詳説されてい
るトリエステル法により化学的に合成されたものであ
る。しかしながら、ホスホジエステル法などによるその
他の公知の技術を使用して、プライマー鎖を合成するこ
とができることが了解されるべきである。 【０１２０】デオキシアデノシン５’（アルファー［35
Ｓ］チオ）トリホスフェート（以下に「ｄＡＴＰ［α−
35Ｓ］」と称する）をジデオキシ配列反応における放射
活性標識として使用した。又、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋの３６頁に示されているゲルを使用する代
りに６％のポリアクリルアミドゲルを使用した（６％ポ
リアクリルアミドゲル、０．４ｍｍ厚、７Ｍ尿素１００
ｍＭ Ｔｒｉｓホウ酸塩（ｐＨ８．１）及び２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ含有）。 【０１２１】上記の如く第３図のプラスミドＤＮＡのヌ
クレオチド配列は第４図に図示されている。このＤＮＡ
のセグメントは成熟ＩＬ−１をコードするＩＬ−１遺伝
子の領域を含むことが見出された。これらのヌクレオチ
ド鎖は第４図のＤＮＡセグメントの始めから番号を付さ
れている。ヌクレオチド配列及び蛋白質配列分析により
求められた対応するアミノ酸は適当なコドンの上に示さ
れている。ＩＬ−１遺伝子のアミノ酸配列は、ＩＬ−１
分子の成熟ＮＨ2−末端、即ち第４図において矢印で印
されているＡｌａ残基（ここからアミノ酸残基の付番が
始まる）から停止コドンＴＡＡの直前のＳｅｒ残基（Ｎ
ｏ．１５３）まで延びている。各種制限酵素切断部位も
第４図に示されている。第４図におけるＩＬ−１遺伝子
のコード化領域は第３図における箱で囲んだ部分に図示
されている。 【０１２２】ＩＬ−１アミノ酸配列研究は上記スターン
等の文献の方法に従って行われたが、この方法において
はシアノ−ゲンブロマイドを用いてＩＬ−１をメチオニ
ン残基において切断した。得られた断片は標準的イオン
交換方法により大きさにより分離された。単離されたペ
プチド断片は次いでＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ Ｍｏｄｅｌ ４７０蛋白質配列決定器を用いて自
動化アミノ末端Ｅｄｍａｎ分解により配列決定された。
この方法により本発明者等は、ヌクレオチド配列により
得られた結果、即ちＩＬ−１蛋白質のＣ−末端がアミノ
酸配列：Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒによ
り構成されていることを確認した。これは、「天然」の
ＩＬ−１はｍＲＮＡからの翻訳後この分子末端からのア
ミノ酸除去により生成されないことを確立する。これ
は、第４図のＩＬ−１遺伝子のヌクレオチド配列から相
当な量のＲＮＡ配列がＩＬ−１のその前駆体からの成熟
に際し、ＩＬ−１遺伝子のＮ−末端から除去されている
のが明らかであるので重要である。 【０１２３】例１３ 成熟ＩＬ−１の発現 ＩＬ−１遺伝子のコード化領域を第３図のｃＤＮＡクロ
ーンから切り出し、次いでｐＹ ＡＤＨシャトルベクタ
ー中に挿入して組み換え発現プラスミドｐＹＡＤＨ Ｉ
Ｌ−１を形成した。ｐＹ ＡＤＨ ＩＬ−１シャトル発
現ベクターを調製するための再構成図式を第５図に示
す。このプラスミドはＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞中で増幅さ
れ、次いで成熟ＩＬ−１の高割合発現のために酵母宿主
細胞を形質転換するために使用される。発現されたＩＬ
−１の官能性は上記胸腺細胞増殖及びＩＬ−２転換アッ
セイを用いて確認された。 【０１２４】ＨｐａII部位（第４図の塩基＃４５７）か
ら遺伝子の３’側面領域に至るＩＬ−１遺伝子のコード
化領域の主たる部分を、上記マニアティス等の文献の１
０４に示されている標準的実験方法においてＨｐａII及
びＰｓｔＩ制限酵素を使用することにより第３図及び第
４図に図示するｃＤＮＡプラスミドセグメントから除去
した。このＩＬ−１遺伝子セグメントは、遺伝子の５’
末端に正確に対応する便利な制限部位が見出されなかっ
たので遺伝子の５’末端から２９ヌクレオチド下流に位
置するＨｐａII部位においてｃＤＮＡクローンから切断
した。切り出されたＩＬ−１遺伝子セグメントの３’−
ＰｓｔＩ部位はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで満たされ以
下に述べるシャトルベクターのＳｔｕＩ部位と適合性の
あるブラントエンドを形成した。 【０１２５】ＩＬ−１遺伝子のコード化領域の５’末端
部分を戻し添加するため及びコード化領域の５’末端に
おいて翻訳開始コドンを創り出すために合成オリゴヌク
レオチドを化学的に合成した。このオリゴヌクレオチド
の組成は下記表IIに示す如くＥｃｏ ＲＩ付着５’末端
に続いてＡＴＧ開始コドンがあり、次いでＩＬ−１遺伝
子のコード化領域の５’末端（ＨｐａII部位に至る）を
含む。表IIに示されたオリゴヌクレオチドは上記スード
等及び上記ヒロセ等の文献に詳説されているトリエステ
ル技術により化学的に合成されたものであるが、このオ
リゴヌクレオチドはホスホジエステル法などの他の方法
により調製することができることが了解されるべきであ
る。 【０１２６】 【表２】表II ECOR1 Met Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu 5'-AATTCAAC ATG GCA CCT GTA CGA TCA CTG AAC TGC ACG CCT -3' GTTG TAC CGT GGA CAT GCT AGT GAC TTG ACG TGC GAGGC HpaII 【０１２７】又、ＩＬ−１遺伝子のコード化領域をＨｐ
ａII部位において切断する代りに第４図のプラスミドｃ
ＤＮＡを遺伝子の５’側面領域における制限酵素におい
て切断することも可能である。その後側面領域のヌクレ
オチド類は標準的技術により逐次除去することができ
る。 【０１２８】ｐＹ ＡＤＨシャトルベクターは、この合
成オリゴヌクレオチド及び切り出されたＩＬ−１遺伝子
のコード化領域の主たる部分を連結するために上記マニ
アティス等の文献の１０４において示されている標準的
技術によりベクターを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ
ＲＩ及びＳｔｕＩを用いて完全に消化することにより調
製された。ｐＹ ＡＤＨプラスミドの消化から得られた
所望のより大きな断片は０．７％アガロースゲル上１０
０ボルトにおいて２２℃で２時間電気泳動を行うことに
より単離された。 【０１２９】第５図に示す如く、合成ＤＮＡオリゴマ
ー、ＩＬ−１遺伝子のコード化領域の切り出された主た
る部分及び所望の線形化されたｐＹ ＡＤＨ断片は、１
００μｇのｐＹ ＡＤＨベクター断片（Ｅｃｏ ＲＩ−
ＳｔｕＩ）、４０μｇの主たるＩＬ−１ ｃＤＮＡ断片
（ＨｐａII−ＰｓｔＩ［ブラント］）、５μｇの合成オ
リゴヌクレオチド（Ｅｃｏ ＲＩ−ＨｐａII）、１μｌ
のＴ４ ＤＮＡリガーゼ及び十分なＴ４リガーゼ緩衝液
（０．４Ｍ Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．４］、０．１ＭＭｇＣ
ｌ2、０．１Ｍジチオスレイトール、１０ｍＭスペルミ
ジン、１０ｍＭＡＴＰ及び１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）より構
成されており、２０μｌの反応容量を形成する反応混合
物中で一緒に連結された。反応は１５℃において１５時
間インキュベートすることにより行われた。 【０１３０】得られたｐＹ ＡＤＨ ＩＬ−１と称され
る組み換えプラスミドを次いで上記ボリバー等及び上記
ピーコック等の文献に示されているような標準的形質転
換技術を用いてＥ．ｃｏｌｉ菌株ＲＲ１中に形質転換さ
せた。宿主細胞を培養してｐＹ ＡＤＨ ＩＬ−１プラ
スミドを増幅し、次いでプラスミドを上記マニアティス
等の文献３６８及び上記インシュ−ホロビッツ及びバー
ク等により詳説されている標準的アルカリ方法により宿
主細菌から除去した。プラスミドＤＮＡを上記マニアテ
ィス等の文献の９３に示されているセシウムクロライド
−エチジウムブロマイド密度勾配における平衡になるま
で遠心分離して精製した。本発明の範囲及び趣旨から離
れることなく、その他のＥ．ｃｏｌｉから増幅されたプ
ラスミドＤＮＡを抽出／濃縮する技術を使用することが
出来ることを了解すべきである。 【０１３１】上記の如く調製された増幅ｐＹ ＡＤＨ
ＩＬ−１プラスミドを次いで使用して標準的技術により
Ｓ．セレビジアエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のプロ
ターゼ欠陥酵母菌株２０Ｂ−１２（アルファ、ｐｅｐ
４．３、Ｔｒｐ１）を形質転換させた。形質転換に先立
ち、２０Ｂ−１２菌株をＹＰ−グルコース培地（２００
ｍｌ）中の培養液中で生育させて２×１０7細胞個／ｍ
ｌの培養物を得た。これらの細胞を２２℃において５分
間１０００×ｇの遠心分離で採取し、次いで得られたペ
レットを無菌蒸留水で洗浄した。 【０１３２】これらの酵母細胞を次いで２０ｍｌのＳＥ
Ｄ（１Ｍソルビトール、２５ｍＭＥＴＤＡ［ｐＨ８．
０］、及び５０ｍＭジチオスレイトール）中に再懸濁さ
せて濃縮し、３０℃で１０分間インキュベートした。細
胞−緩衝液混合物を次いで３００×ｇで５分間遠心分離
した。ペレットを２００ｍｌの１Ｍソルビトールで一度
洗浄し、細胞を２０ｍｌのＳＣＥ（１Ｍソルビトール、
０．１Ｍクエン酸ナトリウム［ｐＨ５．８］、０．１Ｍ
ＥＴＤＡ）中に再懸濁した。細胞壁を破壊するために
グルスラーゼを０．２ｍｌの量で溶液に添加し、次いで
溶液を時々静かに振盪しながら３０℃で３０分間インキ
ュベートした。 【０１３３】スフェロプラストの存在は、１０μｌの酵
母細胞を顕微鏡スライド上に一滴の５％ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）（ｗｔ／ｖｏｌ．）中に希釈し、４
００×位相差における「ゴースト」を観察して分析し
た。 【０１３４】細胞混合物を次いで３００×ｇで３分間遠
心分離した。得られたペレットを２０ｍｌの１Ｍソルビ
トールで２回洗浄した。ペレットを次いで１回ＳＴＣ
（１Ｍソルビトール、１０ｍＭ ＣａＣｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ［ｐＨ７．５］）で洗浄した。 【０１３５】酵母スフェロプラストを次いでベッグス
［Ｂｅｇｇｓ，２７５ Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）
１０４（１９７８）］から適用された方法において予め
調製されたプラスミドベクターを用いて形質転換した。
ペレット化されたプロトプラストを１．０μｌのＳＴＣ
に懸濁させ、次いで１０μｌの使い捨てチューブ（Ｆａ
ｌｃｏｎ ＃ ２０５９）中の１００ｍｌのアリコート
に分割した。次いで１〜１０μｌのＤＮＡプラスミドを
各アリコート（０．５〜５μｇ）に添加した。混合物を
室温で１０分間静置し、次いで１ｍｌのＰＥＧ（２０％
ＰＥＧ ４０００、１０ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］）を各アリコートに添
加してＤＮＡ摂取を促進した。室温において１０分後、
混合物を３５０×ｇにおいて５分間遠心分離した。得ら
れたペレットを１５０μｌのＳＤＳ（１０ｍｌの２Ｍソ
ルビトール、６．７μｌのＹＥＰ［０．１３ｍｌの１Ｍ
のＣａＣｌ、２７μｌの１％ロイシン、及び３．７ｍｌ
のＨ2Ｏ］）に再懸濁させた。この混合物を３０℃で２
０分間インキュベートした。 【０１３６】その後、プロトプラスト／ＤＮＡ混合物を
１．２Ｍソルビトール及び３％寒天を含む酵母最少培地
の存在下において４５℃で且つトリプトファンなしにプ
レート培養した。この最少培地は０．６７Ｄｉｆｃｏ酵
母、窒素塩基、０．５％カザミノ酸、２％グルコースよ
り構成されているものであった。プロトプラスト／ＤＮ
Ａ混合物をこの培地中に維持することによりＴｒｐ／遺
伝子を含有する形質転換体のみが生き残った。 【０１３７】生物学的アッセイの前に、形質転換体を最
少培地から富有培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、
２％グルコース）に接種し、後期指数的生長相まで３０
℃で１５〜２０時間生育させた。採取時にプロテアーゼ
阻害剤フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳ
Ｆ）を１ｍＭまで添加した。培養物を次いで４００×ｇ
で遠心分離して細胞をペレット化した。その後細胞を１
度０．１ｖｏｌ．の冷Ｈ2Ｏ中において洗浄した。破壊
するために細胞を１ｍＭ ＰＭＳＦを含有する０．１
ｖｏｌ．の冷Ｈ2Ｏに再懸濁させ、ガラスビーズ（1/3
容）を用いて２分間渦巻き撹拌させた。細胞残骸及びガ
ラスビーズを遠心分離によりペレット化した。得られた
上澄液はＩＬ−１活性を示すことが判明した。これは上
澄液を上記胸腺細胞増殖及びＩＬ−１転換アッセイの両
者において利用することにより確認された。 【０１３８】本発明の分野の当業者には明らかな如く、
本発明の趣旨即ち本質的特徴から離れることなく特に開
示された実施態様以外の形態で本発明を実施することが
可能である。従って、上記本発明の特別の実施態様はあ
らゆる面において例示的なものであり限定的なものでは
ない。本発明の範囲は前記説明に含まれる具体例に限定
されるものではなく冒頭の特許請求に掲げられる通りの
ものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１図は青色染料配位子の部分的構造式を図示
するものである。 【図２】第２図は赤色染料配位子の部分的構造式を図示
するものである。 【図３】第３図はＩＬ−１遺伝子の部分的制限地図を図
示するものである。 【図４】第４図は２枚よりなり、第３図のヌクレオチド
断片に含まれるＩＬ−１遺伝子のヌクレオチド配列及び
対応するアミノ酸配列を図示するものであり、ヌクレオ
チドは第４図に示された配列の始めから番号を付されて
おり、アミノ酸は蛋白質の成熟ＮＨ2−末端、即ち矢印
で示されたＡｌａ残基から残基番号１５３の停止コドン
ＡＴＴまで番号が付されている。 【図５】第５図は官能性ＩＬ−１を発現する目的で酵母
宿主を形質転換するために使用されたシャトルベクター
におけるＩＬ−１遺伝子の解読領域をクローン化するた
めに使用された術策を図示するものである。
するものである。 【図２】第２図は赤色染料配位子の部分的構造式を図示
するものである。 【図３】第３図はＩＬ−１遺伝子の部分的制限地図を図
示するものである。 【図４】第４図は２枚よりなり、第３図のヌクレオチド
断片に含まれるＩＬ−１遺伝子のヌクレオチド配列及び
対応するアミノ酸配列を図示するものであり、ヌクレオ
チドは第４図に示された配列の始めから番号を付されて
おり、アミノ酸は蛋白質の成熟ＮＨ2−末端、即ち矢印
で示されたＡｌａ残基から残基番号１５３の停止コドン
ＡＴＴまで番号が付されている。 【図５】第５図は官能性ＩＬ−１を発現する目的で酵母
宿主を形質転換するために使用されたシャトルベクター
におけるＩＬ−１遺伝子の解読領域をクローン化するた
めに使用された術策を図示するものである。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(31)優先権主張番号 ６７６５３３
(32)優先日 昭和59年11月30日(1984．11．30)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ６８７６４６
(32)優先日 昭和59年12月31日(1984．12．31)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(72)発明者 デイビッド、ジェー、コスマン
アメリカ合衆国ワシントン州、シアト
ル、トゥエルブス、アベニュ、イース
ト、310
(72)発明者 ケニス、エッチ、グラブスタイン
アメリカ合衆国ワシントン州、シアト
ル、ナンバー、フォーハンドレッド、エ
ンド、フォーティースリー、エヌ、イ
ー、セブンティーフィフス、ストリー
ト、5829
(72)発明者 トマス、ピー、ホップ
アメリカ合衆国ワシントン州、シアト
ル、フィフティーファースト、エスダブ
リュ、4842
(72)発明者 シャーリー、アール、クロンハイム
アメリカ合衆国ワシントン州、シアト
ル、サーティーシックス、エヌイー、
11526
(72)発明者 アルフ、ディー、ラーセン
アメリカ合衆国ワシントン州、シアト
ル、ナンバー、フィフティーン、サミッ
ト、アベニュ、イースト、320
(72)発明者 カール、ジェー、マーチ
アメリカ合衆国ワシントン州、シアト
ル、エイス、エスダブリュ、8133
(72)発明者 ブルース、エイ、モスリー
アメリカ合衆国ワシントン州、シアト
ル、トゥウェンティーセカンド、エヌイ
ー、8215
(72)発明者 バージニア、エル、プライス
アメリカ合衆国ワシントン州、シアト
ル、ボイアー、アベニュ、イースト、
2617
(56)参考文献 特開 昭61−119191（ＪＰ，Ａ)
・Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，81（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ
1984）ｐ．7909−7911
・Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，122（1979)
ｐ．2112−2118
・Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇｓ，42（1983）ｐ．2639−
2645
・Ｎａｔｕｒｅ，309（Ｍａｙ 1984)
ｐ．56−59
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．以下のアミノ酸配列： 【化１】 Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser を有する活性成熟ヒトＩＬ−１タンパク質をコードする
単離されたＤＮＡ分子、または前記ＤＮＡ分子のアリル
変異体であって、胸腺細胞増殖アッセイにおいてＩＬ−
１生物活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分
子。 ２．ｃＤＮＡである、請求項１に記載の単離されたＤＮ
Ａ分子。 ３．前記活性成熟ヒトＩＬ−１タンパク質が、Ｎ末端に
メチオニン残基を有している、請求項１に記載の単離さ
れたＤＮＡ分子。 ４．前記活性成熟ヒトＩＬ−１タンパク質が、アッセイ
細胞株ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８０７９からのインターロイ
キン２放出を刺激する、請求項１に記載の単離されたＤ
ＮＡ分子。 ５．以下の塩基配列： 【化２】 を含む、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。 ６．以下のアミノ酸配列： 【化３】 Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser を有する活性成熟ヒトＩＬ−１タンパク質をコードする
単離されたＤＮＡ分子、または前記ＤＮＡ分子のアリル
変異体であって、胸腺細胞増殖アッセイにおいてＩＬ−
１生物活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子
を含んでいる組換え発現ベクター。 ７．以下のアミノ酸配列： 【化４】 Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser を有する活性成熟ヒトＩＬ−１タンパク質をコードする
単離されたＤＮＡ分子、または前記ＤＮＡ分子のアリル
変異体であって、胸腺細胞増殖アッセイにおいてＩＬ−
１生物活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子
を含んでいる組換え発現ベクターによって形質転換され
た、細菌または酵母細胞である宿主細胞。 ８．前記細胞が大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）である、請求項
７に記載の宿主細胞。 ９．前記細胞がサッカロマイセス・セルビシエ（Ｓ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である、請求項７に記載の宿
主細胞。
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