CA1101332A - Procedes simplifies pour la preparation de concentres de facteur viii de tres grande purete - Google Patents

Abstract

Procédé de préparation d'un concentré de Facteur VIII, caractérisé par le fait qu'il comprend l'étape consistant à maintenir une solution tampon contenant le Facteur VIII et environ 6% de polyol à une température d'environ 0 à 5.degree.C jusqu'à ce que la précipitation se produise.

Description

l~lL01332 On a décrit plusieurs procédés d:Lfférents pour la produc-tion du facteur antih~mophilique (AHF ou Facteur VIII), en vue d'une utilisatlon th~rapeutique, par exemple : précipltation selective, absorption et élution fractionnées, extraction en milieu faiblement ionique et chromatographie. Les produits chimiques ~es plus fr~uemment utilis~s pour la précipitation comprennent l'alcool, l'acide tannique, le sul~ate d'ammonium, I la glycine et le polyéthylène glycol. Bien que la purification ! du Facteur VIII entraine l'élimination diun certain nombre d'autres protéines plasmatiques, le fibrinogène esf, parmi ce6 protéines, de loin la plus importante et la plus gênante, en par-ticulier lorsqu'il est dénaturé par des procéd~s tels que la précipitation par l'alcool, la congélation et la d~congélation.
Ce fibrinogène dénaturé nuit ~ la filtration de l'AHF, provoque des pertes appréciables d'AHF pendant les étapes de puri~ication et diminue la solubilité du produit lyophilisé dans le fluide de reconstitution. Ainsi tout proc~d~ de purification de l'AHF
necessite l'élimination de quantités appréciables de fibrinog~-ne Les techniques de précipitation s~lective d~crites ci~dessus sont destinées a cela mais toutes ont l'inconvénient de dénaturer encore plus le-fibrinog~ne et llAHF ou d'occasionner des pertes - non souhaitables d'AHF.
- Les procedés utilisant la simple précipitation par le froid sans produits chimiques (cryopr~cipitation) sont limit~s aux productions de faibles quantités de Facteur VIII, habituellement dans les banques de sang, et aboutissent ~ des niveaux eleves de fibrinogène dans le sang lors de l'utilisation en thérapeuti-gue, ce qui est consideré comme indésirable par certains experts - en la matiere.
Les procédés qui comportent l'extraction du Facteur VIII
a partir de la cryoprécipitation dans des tampons de faible force ionique, tout en diminuant, dans une certaine mesure, la teneur en fibrinogène du produit final donnent encore une teneur en pro-téine indesixablement ~levée, nécessitent un é~uipement spécial et des procédés de oe~ntrifugation et sont limités en ce qui concerne la quantite totale d'AHF qui peut 8tre extraite du cryo-précipité sans nuire ~ la purification. O
D'autres problemes communément associ~s ~ la fabrication à grande échelle de l'AHF sont notamment la contamination du pro-4~ duit final par des substances pyrogènes, des isohemagglutinineset des virus qui provoguent 1 'hépatite (antig~ne associ~, de MK/ S. 2 .
1~3)133Z
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l'hepatite (HAA). Certains précipitants chimi~ues favorisent la présence de ces contaminants ind~sirables. Le polyéthylène gly-ccl est maintenant communément utilisé dans la production de concentr~is de Facteur VIII de grande pureté, mais ces techniques utilisent des concentrations de polymère si élevees que des ~tapes ultérieures de lavage et de reprécipitation sont nécessai-res pour eliminer du produit final les quantités en exc~s de po-lyéthylène glycol. Ces proc~idés conduisent ~lors ~ de nouvelles pertes indésirables d'AEIF. On cite ~ ce sujet, Wickerhauser M. :
Large-scale fractionation of Factor VIII- Concentrate from cryo-ethanol pre~ipitate (référence 1) ; Shanbrom, E. ~ Fekete, L. :
Production of stable high-potency human A~F using polyethylene ~lycol and glycine to fractionate a cryoprecipitate of AHF
concentrate , U.S. Patent No.3,631,018 -(reférence 2); Sgouris, 15 J . T. et Wickerhauser, M. : Vse of frozen cryoprecipitate for the preparation of clinical Factor VIII concen~rate, Trans~usion,13:~9 1973(référ.3);~ewman, Johnson, A.J., Karpatkin, M.H. et Puszkin, S. : Methods for the production of clinically effective interme-diate and high-purity Factor VIII concentrates , Brit.J.Haemat, 1971 211,(refer.4); ~ekete, L.F. and Holst, S.L. : Stabilization of AHF using Heparin, V.S. Patent N~ 3,803,115,(référence 5).
Le procédé d~icrit ici élimine virtuellement les probl~mes susmentionn~s, ne comporte pas les inco~v~nients associ~s aux techniques de précipitation chimique décrites précédemment ~it re~ose sur le simple pr~céd~ de la pr~cipitation s~ilective à froid du fibrinogène, de ses produits de dénaturation et de degradation, et de la concentrati~n selective de Facteur VIII par de petites qua~tités de polyol, par exemple de polyethylèneglycol ou de po-lyol Pluronic . L'elimination du fibrinog~ne, comme expli~u~
ci-après entra~ne également l'élimination de ses produits de d~inaturation et de dégradation.
L'~limination s~ilective du fibrinog~ne sans perte associ~e de ~acteur VIII n'a en gen~ral pas été effectuée précédemment en tant que m~ithode pratique pour la fabrication ~ grande ~chelle d'un c~ncentré purifie de AHF. En effet, Wickerhauser souligne l'importance de la limitation de dur~e et de la temp~irature d'~x-traction de l'AHP:"Des rendements un peu plus ~lev~is en AH~ sont obtenus par extraction prolong~e au tampon-Tris ~ 30~C pendant plus de 60 minutes, mais l'extrait est de plus en plus contaminé
par des agrégats de fibrinogène, ce qui rend le concentr~ final MK/ S.2 *Marque de Commerce ,3~
, difficilement filtrable".
Une 'echnique utilisant la pr~cipitation sélective de fibrinogène a basse temp~rature pour la fabricati~r~ ~ grande échelle avec un ren-dement ~levé de concentr~ de Fac~eur VIII de yrande pureté fait 1'ob-~et de 1~ demande de brevet nC258~324 dépos~e aux Canada le 3 Aout 1976~, de E. Shanbrom, intitul~e : "A simple method ~or the production of high-yield, high-purity Fact~ur VIII, (R~f.7). 11 est indiq~e que la préparation pourrait atre en~ore raffinee et concen-trée en utilisant une précipitation au poly~thylène glycol (P~G) froid.
Jusque récemment tous les procédés utilisant du PEG dans la fa-brication de concentrés d'AHF n~cessitent une ~tape additionnelle de lavage et/ou de repr~cipitation avec de la glycine ou de l'alcool parcP que le polym~re est utilisé ~ concentrations élev~es (10-12%), (voir les r~férences précitees). On a récemment utilisé l'id~e de précipitation ~ froid avec du PEG. Vermeer, C., Soute, B.A.~S., et Brummelhuis, H.G.J. : Improvement of the preparation of Factor VIII
Concentrates. Proc. of Int. Soc. ~aemos~asis and Thrombosis, Paris, July, 1975. (Réf.8). Cependant, la concentration de PEG u~ilis~e pour pr~cipiter le fibrinogène est de 2 ~ ~ seulement, ce ~ui c~nduit ~
obtenir un produit moins pur. De plus, ces auteurs n'ont pas consid~-ré comme importante ia concentration de protéines, ils ont utilis~
du mandelate pour éviter une préc~pitation irr~versible du fibrin~ge-ne et, ~ar cons~quent, ont obtenu un produit consid~rable~ent moins

2~ pur et un rendement moindre. De façon similaire, le procédé de Shan-~rom et Fekete tarticle cit~ ci-dessus) utili~e une concentration de proteines relativement faible pendant les ét~pes de précipitation au PEG, c'est-~-dire 1 volume de précipité dans 10 volumes de ~ampon dis-solvant, e~ cela oDnduit ~ un rendement tra~ faible et à une puret~
limit~e. Ces auteurs de m~me que Johnson et al (r~f.4~ et Johnson et al "Antihemophilic factor prepared from blood plasma using p~ly-ethylene glycol. U.S. Patent N~3,652,530, (r~f.6) ont utilis~ 10-12%
de PEG pour la concentxatlon finale de AHF, ce qui a n~cessité
une etape ~uppl~mentaire de dissoluticn et de repr~c~pitatlon par la glycine ou par l'~thanol a froid pour r~duire la teneur en PEG
du produit final. ~-~
~ ne autre preuve que la concentration de proteines et la précipitation au PEG
à frold sont importantes et conduisent à un produit original réside dans le fait que les isohemagglutinines "incomplètes" (anticorps) ~ont virtuellement éliminees, ce qui LK/ S.2 . .
. . .; ,, , ~ ~, ; :, . ., ,., , : :
l33~:
4 . -~vite le risque de reactions hémolytiques ~ui pourraient surve- i nir lorsque des injections massives de concentrés actuellement disponibles dans le co~erce sont nécessaires.
(Voir:Seeler,R.A.Telischi, M., Langehennig, P.L. et Ashenhurst, J.B. : Anti-A and Anti-B titers in coagulation concentrates.
Abst.Of Int. Soc~ of Blood Transf., Helsinki,1975,(ref.9).
Une autre caractéristique originale du produit de l'inven-tion est le haut degré de pureté (c'est-~-dire la faible teneur en proteine) en particulier en ce qui concerne la quantité de fibrinogène mesurable. Ce haut degré de purete donne un produit tres sol~ble, si soluble en fait qu'aucun matériau non dissous ne subsiste dans le flacon apres reconstitution. Ceci élimine - le besoin d'utiliser un filtre spécial ou une aiguille filtran-te pour eliminer la protéine non dissoute avant l'injection au ; 15 patient. On évite ainsi la contamination du concentré de Facteur VIII par des particules metalliques (Couper~ I.A., McAdam, J.H.
MacRenZie, M.S. et Davidson, J.~ Contamination of Factor VIII
Concentrates with metal particles. Lancet, Dec.~1,1974, p.l515 ~ (réf.10).
i-2o Le procédé décrit, ou partie de celui-ci, est egalement uti-le pour le "re-traitement" de lots pyrogéniques de concentres de Facteur VIII fabriquespar tout autre procédé, ce qui trans~or-¦ me le 'acteur ~III pyrogénique couteux non utilisable en un agent therapeutique utilisable précieux. Le produit re-traite est dé- -2S barrasse du materiau pyrogénique soit par une seule étape de precipitation à froid au PEG ~ 5%, soit en deux etapes par le procede decrit en detail dans la presente demande.
~ Les resultats inattendus et grandement améliores obtenus et decrits ici s~nt contraires-aux enseignements et suggestions de l'art antérieur, et ont eté découverts à l'origine plus par hasard qu'au cours d'une recherche syst~matique.
La presente invention est un procede spécifique pour la fabrication ~ une grande echelle d'un concentre de Facteur VIII
de tres grande purete. Parmi les traits les plus caracteristi-ques de l'invention, on cite la précipitation sele~tive de , quantites en excès de fibrinogène et de produits de dénaturation ¦ et de degradation, l'~limination d'autres proteines ind~sirables telles ~ue les isoh~magglutinines, et la concentration en une etape du Facteur VIII par précipitation ~ froid avec un polyol, 1 40 sans perte indésira~le a ~ activit~ AHF. Une autre caractéristique ! remarquable est le rendement étonnamment ~lev~ en Facteur VIII~ ¦
! MK/.S. 2 .. .

environ 20-40% de la quantit~ plasmatique théorique utilisee.
! De plus, et en dépit du rendement ~leve en AHF, la teneur en protéine s'est trouvée réduite de fa~on frappante, en partlcu-lier la teneur en fibrinogene, par comparaison avec d'autres ! 5 prodults. Ceci est illustr~ par le tableau I ci-dessous. Le beso~n d'un rendement ~levé de concentré d'AHF lyophilise, de grande puret~, est universellement reconnu et a retenu l'atten-tion sur un pla~ internatior.al. On cite : Recent Advances in Hemo-philia. Ann. N.Y.Acad.Sci. 240,1975, (réference 11); Pool, J.G.: !
Recent chapters in the Factor VIII saga : perils of a protein.
West J. of Med., 122:406, 1975,(reference 12) et l'on admet généralement que les concentres du commerce donnent habituelle-ment moins de 20% de l'AHF théoriquement présent dans le plasma, tandis que les rendements pour les produits hautement purifiés 15 sont encore plus faibles (reférence 11, pp.l56,208; réferences -5 et 8).
Dans le tableau I ci-apres les donnees, sauf en ce qui concer-ne les resultats obtenus selon le procéd~ de la présente demande sont extraites de l'article de Robert Breckenridge :"Recent 20 a~vances in hemophilia" Ann. N.Y. Acad.of Science,240.1975.
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La presente invention a pour objet un 2rocédé de préparation d'un concentre de Facteur VIII, caractérise par le fait ~u'il comprend 1'étape cons~stant ~ maintenir une solution tam~on conten~t le Facteur VIII et environ 6% en volume de polyol a une température s d'environ O ~ 5~C jusqu'~ ce que la précipitation se produlse.
L'invention a notamment pour obj~et un procéd~ caract~risé par le falt qu'il comprend les étapes consistant à précipiter le ~ribri-nogene sélectivement a partir d'une solution de plasma ou de cryopré-cipité de plasma dans un tampon par addition d'environ 4% en volume de polyol à ladite solution, à concentrer le Facteux VIII dans la solution en accroissant la concentration de polyol jusqu'~ environ 6% et ~ maintenir la solution contenant le polyol a 6% à une temp~-rature d'environ O à 5~C ~usqu' a ce que la précipitation se produise et ensuite ~ redissoudre le Facteur VIII pr~cipit~ dans une 301ution tampon pour obtenir une solution contenant un Facteur VIII de très grande pureté qui est sensiblement exempt de proteines ~trangères contaminan~es.
Dans ses modes d'exécution préférés, le procéde de l'invention présente les caract8ristiques suiva~tes, prises isolement ou en combinaison :
- la source de Facteur VIII est un cryop~écipité dissous dans environ 2 à 4 fois son volume de tampon;
- le rapport volumique du cryoprécipité au tampon est d'en~iron 1 à 3;
- le proced~ comprend les etapes subséquentes consistant ~ re-dissoudre le Facteur VIII pr~ciplté dans un tampon et ~ maintenir la solution résultante ~ une température d'env~ron 0,5 ~ 5~C pendant une période d'environ 12 a 24 heures et ensuite ~ séparer la matiere particulaire formée ~ partir de ladite solution pour obtenir ainsi un Facteur VIII pratiquement exempt de fibrinog~ne,de fragments de fibrinogene et de leurs complexes;
- les tampons sont des tampons citrate;
- les polyols utilisables comprennent les poly~thyl~neglycols en particulier le polyéthyl~neglycol 4000, et les copolym~res séquenc~s du type alpha-hydroxy omega-hydroxy, poly (oxyéthylène) poly~oxy-pro~ylène) poly (oxy~thyl~ne). Parmi ces copolym~res s~quenc~s on citera not~mnent ceux d~signés par la marque PLURONIC (WYANDOTTE
C~EMICALS ET UGI~E-KU~LMANN), et en particulier le PLuronic F68 qui est un copol~nère présentant les caractéristiques suivantes:
Poids moiéculair~ du groupement poly ~oxypropylane) de base: 1750 B/S.2 *Marque de Ca~nerce 33;~
8 ~ .
en~iron; pourcentage en poids de poly (oxy~thyl~ne): 80% environ;
- la precipitation du Facteur VIII en pr~sence ae 6% de polyol est effectuee de pr~ference ~ pH 6,8-7,2;
- la pr~ci~itation prealable du fibrinogane en pr~sence de 4~
de polyol est ef~ectuée de pr~f~rence à p~ 6,0~6,5 et ~ ~emperature d'environ 20-30~C.
Le procéde de 1'invention permet notamment d'~liminer les pyro-g~nçs d'une solution tampon de Facteur VIII; ce procedé est caracté-rise par le fait que l'on ajoute en~iron 6~ de polyol 3 ladite solu-tion et on malntient la solution résultante ~ une température d'en-viron 0~C ~ 5~C, pour pr~cipiter le Facteur VIII en laisqant en solu-tion le matériau pyroganique. Ce proc~dé peut 8tre mis en oeu~re selon les modes d'executlon pref~rés suivants :
- pour ef~ectuer l'addition de polyol aux solutions tamion de Facteur YIII on ajoute environ 4% de polyol, on s~pare le précipit~
de la solution, on ajoute 2~ de polyoi et maintient la qolution ~
une temparature de 0 ~ 5~C~Çusqu'~ ce que se produise la precipita-tion.du Facteur VIII;
- de pr~ erence, la solution ~ puri~ier contient environ 1 ~ 3%
2~ de proteine, et notamment 2 ~ 3%; -- le proc~dé comprend les ~tapes subsequentes consistant ~ re-dissoudre le Facteur VIII precipite dans un tampon citrate, ~ main-tenir la solution resultante ~ une temp~rature d'environ 0,5 ~ 5~C
pendant un laps de temps d'environ 12 ~ 2~ heures et ensuite ~ s~pa-rer la mati~re particulaire formée de ladite solution pour obtenir1Q Facteux VIII pratiquement exempt de ~ibrinog~ne, des fragmentsde fibrinog~ne, et des complexes de ceux-ci;
- l'in~ention a notamment pour objet un procédé de concentration du Facteur VIII caracteris~ par le fait qu'il comprend le maintien d'une solution d'environ 1 partie d'une ~raction sanguine contenant du Facteur VIII obtenue par cryoprécipitation de plasma dans environ

3 parties de tampon citrate contenant environ 6~ de polyol ~ une temp~rature d'environ 0 ~ 5~C pour provoquer la pr~cipitation du Facteur VIII de ladite solut~on, et la redissolution dudit Facteur VIII dans le tampon pour donner une solution de Facteur VIII de tras grande puret~.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
EXEM~LE
On d~cong~lo du plasma congel~ par exemple 100 ~ 3000 litres ~B/S.2 ' g ~ 2 ~, ., ~ temperature d'environ - 5~C ~ environ +2~C et on la recueille dans un recipient approprie. On peut traiter de plus grands volumes mais les operatlons devien~ent difficilcs. La fraction insoluble ~ ~roid (cryopr~clpit~) e~t recueillie, de préf~rence en ce~trifu-geuse ~ circulation continue (Sharpless ou appareil similaire) ~temp~rature inf~rieure ~ 3~C. D'autre.~ procedes de collecte peuvent~tre utilis8s mai - le proced~ comprend les etapes subséquentes consistant ~ re-on et ~ maintenir la te ~ séparer la matiere brinog~ne,de fragments s comprennent les poly~thyl~neglycols en omega-hydroxy, poly (oxyéthylène) poly~oxy-d~signés par la marque PLURONIC (WYANDOTTE
sentant les caractéristiques suivantes:
erce yl~ne): 80% environ;
- la pr~ci~itation prealable du fibrinogane en pr~sence de 4~
d'environ 20-30~C.
procedé est caracté-te ~ une température d'en-oc~dé peut 8tre mis en oeu~re tions tamion de et maintient la qolution ~
r~ erence, la solution ~ puri~ier contient environ 1 ~ 3%
prend les ~tapes subsequentes consistant ~ re-resultante ~ une temp~rature d'environ 0,5 ~ 5~C
re particulaire formée de ladite solution pour obtenir1Q Facteux VIII pratiquement exempt de ~ibrinog~ne, des fragments ne, et des complexes de ceux-ci;
fait qu'il comprend le maintien oprécipitation de plasma dans environ pour provoquer la pr~cipitation du er une solution de Facteur VIII de tras er.
g ~ 2 On peut traiter de plus grands volumes recueillie, de préf~rence en ce~trifu-s sont moins ef~icaces. Le cryopr~clpite est pes8, decoupe en petits morceaux ou m~lang~ dans un m~langeur de type Waring pendant quelques secondes pour produlre une pâte ou ~mulsion.
Ces morceaux de cryoprecipit~ ou cette pâte sont alors dissous dans 2 ~ 4 volumes de tampon constitu~ par du citrate de trisodium 0,02 M
de la glycine 0,1 M et on ajuste le pH ~ 6,9 par l'acide citrigue temp~rature de 20-30~C. Apr~s dissolution compl~te on pr~cipite selectivement le ~ibrinog~ne par addition de 4% de poly~thyl~ne glycol~
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1l332 4000 ou de Pluronic F-68 ~ pH de 6,0 ~ 6,5 et ~ une température d'environ 25~C. Le pr8cipite est ~liminé par centrifugation co~tinue dans un appareil de type Sharpless et le fluide surnageant est ajusté ~ pH 6,8-7,2. Une quantité supplémentaire de 2% de PEG ou de Pluronic F-68 est ajoutee et l'on refroidit la suspenslon a 0-5~C
jusgu'à ce produise une pr~cipitation vistble.
On utilise une cuve de r~action ~ double paroi pour toutes les ~tapes de dissolution et de pr~cipitation avec agitation continue, en prenant soin d'~viter la mousse.
La seconde etape de précipitation est suivie d'une centrifuga-tion à circulation continue e~ 1-2~C et on éllmine le surnageant.
ensuite On dissouy le precipite dans un tampon glycine-~itrate ou un tampon citrate, le volume dependant de la qualit~ du cryoprécipite et du nombre d'unites d'AHF pr~sentes dans la solution initiale.
Les deux proc~d~s pour calculer ce volume sont les suivants :
1. Dissoudre le précipité ~inal dans un volume de tampon égal 1/100 du volume de plasma d'ori~ine.
2. Dissoudre le pr~cipite final dans un volume de tampon ~gal e~ 15-25 fois le poids du précipité.
~a solution est alors ajust~e ~ un pH de 6,7-6,9 à llaide d'a-cide citrigue, clarifiee et ensuite stérilisée par passage du li-quide e~ travers des filtres e~ membrane micropores (hauteur de fil-tres 293 mm ou équivalents en cartouche) ayant par exemple des pores d'un diam~tre de 1,2 - 0,65-0,45 et 0,3 microns. La solu~ion stérile obtenue, contene~nt 20-40'~ environ du Facteur VIII dans le plasma de d~part est lvophilisée de mani~re usuelle pour le stockage.
On peut utiliser des varlantes de technique de fabrication, en employant en particulier du cryoprécipit~ recongelé ou des va-riantes de la Fraction I de Cohn, bien que dans de telles eondition le rendement en Facteur VIII soit moindre et d~pende de sa concen-tration dans le mat~riau de départ. La dissolution ou l'extraction initiale d'A~F peut être effectuee dans de l'eau distillée ou dans des tampons de faible force ionique comme le tampon Tris. Le temps d~ refroidissement peut également varier~soit augmenté, soit réalis~ de façon s~uentlelle sans sortir du cadre de l'invention.
De m~me, le t~ps d'extraction peut ~tre ac~ru jus~ul~ 24 heures dans le processus d~crit. De plus, le processus peut ~tre inter-om-pu a toute ~tape et repris un autre jour. Toutes ces variantes peuvent provoquer une certaine dimlnution du rendement ~ot~l d'A~F
'~ MB/ S.2 *Marque de Commerce du plasma de depart.
ExEM~LE N~II
Des lots pyrogèniques de concPn~ré de Facteur VIII de puret~
moyenne realisés par tout autre procédé, tel qu'extraction au tam-pon de faible force ioni~ue, pr~cipitation à la glycine, pr~cipita-tion au PEG, etc, peuvent etre repris selon le schéma indiqué dans 1'exemple I. Les flacons lyophilis~s sont reconstitu~s dans un volu-me d'eau exempt de pyrogène suffisant pour produire une teneur en protéines1-3 g~,les ~ontenus des flacons sont ensuite réunis dans une cuve et à nouveau soumis au traitement selon les étapes indi~uées dans l'Exemple I.
En variante, si les niveaux pyrogéniques sont seulement mod~ré
ment elevés et si le produit est dejà d'une purete elev~e, une seu-le etape de précipitatlon peut ~tre suffisante. Les flacons sont reconstitués comme d~crit ci-dessus et l'on ajoute 6~ de PEG ~ un pH de 6,8-7,2 ~ une température de 0-5~C. La precipitation formée est ensuite traitée comme avant et le surnageant contenant le maté-riau pyrogenique solubilis~ est élimin8.
EXEMPLE N~ III
On effectue le proc~d~ decrit dans l'exemple I.
- Cependant, avant d'effectuer les etapes finales de filtration on place le produit dans une chambre froide ~0~5~ ~ 5~c)et ~n le laisse reposer pendant 12-24 heure~. Le matériau floculant blanc qui se forme apres cette période de repos est élimin~ par décanta-tion, centrifugation ou prefiltration. Le produit final est stéri-lisé par filtration comme précédemment d~crit et soumis aux m~mes processus de lyophilisation. Ce produit est m~me plus purifi~ que les produits pr~cedents et donc plus facilement filtré. Il ne se produit pas de perte de Eacteur VIII du fait de cette étape s~p-plémentaire.
Les produits résultants peuvent être stock~s ~ ~5~C pendant une p~riode prolongée d~n ~ deux ans, et reconsti~u~s dans de l'eau distillée ou un sé_um physiologique. Du fait de sa tr~s grande pureté et de son extremement faible teneur en fibrinogene, le produit lyophilis~ se laisse dissoudre tr~s rapidement (1-2 minutes).
Le temps total de _raitement étant très court compare aux au~xes procedes de fabxication depuis le moment o~ les sacs de plasma sont ouverts, le développement de bacteries se ~rouve limite. Le fait que la dissolution initiale est effectu~e dlns de petites quantit~s seulement de tc~mpon diminue la quantit~ de gamma-~lobu-~ MB~ S.2 lines pouvant er_rer dans la solutio~ et la pr~cipitation optimale du fibrinog~ne en excès se produit e~ utilisant une concentration en polyol de 4~. De plus, le lourd pr~cipit~ floculant de fibrino-~ene emprisonne probablement le mat~riau pyrogènique pr~sent et réduit les quantit~s d'a~tigène associ~ de l'hépatite (HAA ou virus de l'h~patite). En n'utilisant que 6% cle polyol dans l'~tape de pr~- -cipitation ~ froid, les prot~ines ind~sirables, en particulier les isohemagglutinines qui peuvent avoir ~-té dissoutes même dans des volumes moindr~ de tampon, ne pr~cipitent pas avec l'AH~ et sont éliminées avec le surnageant. On ~btient ~nsi un produit purif ié
200 à 400 fois, par rapport au plasma, et contenant tres peu de fibrinogene et d'isohémagglutinines, Les concentr~s de Facteur VIII fabxiqués avec de plus grands volumes de tampon d'extraction, par exemple 10 volumes (ref~rence 2) ne présentent pas le mame degré de pureté ou le meme rendement d'AHF(ref~rences 1,2,3,4,8), probablement à cause du fait que le rapport opt~mal de la prot~ine au polymère pour la coprecipitation n'a pas et~ obtenu. Si on le désire ce produit peut ~etre encore purifie et concentr~ par des procéd~s connus ou de nouveaux procédés. ~n grand avantage de la presente invention réside dans le fait qu'on peut effectuer la production ~ grande ~chelle d'AXF tres pure en la moiti~e ou les deux tiers du temps requis dans d'autres proc~dés.
Les exemples donnes precédemment sont l~s proced~s opt~mum connus actuellement pour la mise en oeuvre de l'invention. Il est c~air, cependant, que l'invention peut être mlse en oeuvre par l'application de techniques de traitement et de mat~riaux c~n~en-tionnels selon le principe de la présente invention . Par exemple~
bier. qu'il ne soit pas en g~n~ral ~conomique de debuter avec moins de l~0 litres environ de plasma, ou de cryopr~cipit~ de cette quan-tite de pl~sma, il n'y a ~videmment pas d'in-onv~nient ~ utiliser les valeurs sup~rieures ou inf~rieures de volume donn~es dan~ l'e~
xemple et des variantes de cinquante pour cent ou analogu s dans ces ~aleurs ne serait pas pr~judiciables ~ l'invention. Les pro-cessus dans l'exemple optimal sont mis en oeuvre en utilisant un ~quipement connu et ~acilement disponible, tel que l'appareil centr;fugeur Sharpless, le m~langeux Waring, etc~mais chacun peut - voir que ces ~tapes en elles-m~mes, isol~es du principe inventif, et les ~quipements englobés, ne sont pas essentiels et un grand nombre de variantes sont ~ la dlsp~sition de 1ihomme de 1'art sans sortir du cadre de 1'in~ention selon le personnel et l'~quipement MB~ S.2 *Marque de Commerce _ -' ~ ~ ' ' ! . . ; . . ~
, ' ~ ~ ',, 1,. ,'.~."'''. '''' ., , ' ,'' ' '' ' , 13 ~ 32 disponibles, etc... Une fois ~ue l'on a obtenu le li~uide surnageant,contenant le facteur VTII avec un bon rendement, on le traitede mani~re conventionnelle pour stockage et reconstitution; par exemple, il est clarifi~ et sterilise, à travers un filtre micropores stan-dard,lyophilise pour concentrer le Facteur VIII en un petit volumefacilement stockable et reconstitu~ en utilisant des liquides conven-tionnels, par exemple de l'eau distillee apyrogène ou un sérum physiologique.
L'invention n'est pas limitee par les details ae procede donnes ~ titre d'exemples. Le produit obtenu poss~de des caract~ris-tiques originales, bénefiques pour l.e patient et distinctes de celles de tous les autres concentres de Facteur VIII actuellement fabriques:
1) Pureté la plus élevee et donc la plus grande "activite specifique";
2) Solubillté la plus grande, en ce qui concerne sa rapidité
et la solubilite finale, ce qui le rend id~al pour le traitement d'urgence;
3) La plus faible teneur en proteine, ce qui diminue les reac-tions secQndaires indesirables.

4) La plus faible teneur en immunoglobulines ce qui diminue les reactions allergiques;
S)/isohemagglutinines négligeable/ qui ~limine les r~actions hemolytiques.
6) la plus faible teneur en fibrinogene, ce qui diminue les complications d'hyperfibrinogenemie.
7) Aucune aiguille filtrante n'est n~cessaire~donc le risque de presence de particules etrang~res est elimin~;
8) L'elimination des pvrogènes durant le processus conserve le facteur VIII utilisable.
Ces avantages et d'autres ressortent du proced~ decrit ici, illustr~ par des exemples non limitatifs et d~fini dans les reven-dications. En r~sume le proc~de de l'invention pour preparer un concentre de Facteur VIII est la decouverte qu'en maintenant une solution tampon contenant du Facteur VIII et environ 6% de polyol ~ une temperature d'environ 0~C ~ environ 5~C la precipitation du Facteur VIII se produit, procurant ainsi une tr~s grande puret~ au Facteur VIII qui ~est sensiblement exempt de proteines ~t~ang~res contaminantes. ~

Claims (17)

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation d'un concentre de Facteur VIII, caractérisé
par le fait qu'il comprend l'étape consistant à maintenir une solution tampon contenant le Facteur VIII et environ 6% de polyol à une température d'environ 0 à 5°C jusqu'à ce que le précipitation du Facteur VIII se produise.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérise par le fait qu'il comprend les étapes consistant à précipiter le fibrinogène sélectivement à partir d'une solution de plasma ou de cryoprécipité de plasma dans un tampon par addition d'environ 4% en volume de polyol à ladite solution, à
concentrer le Facteur VIII dans la solution en accroissant la concentration de polyol jusqu'à environ 6% et à maintenir la solution contenant le polyol à 6% à une température d'environ 0 à 5°C jusqu'à ce que la précipitation se produise et ensuite à redissoudre le Facteur VIII précipité dans une solution tampon pour obtenir une solution contenant un Facteur VIII de très grande pureté qui est sensiblement exempt de protéines étrangères contaminantes.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la source de Facteur VIII est un cryoprécipité dissous dans environ 2 à 4 fois son volume de tampon.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le rapport volumique de cryoprécipité au tampon est d'environ 1 à 3.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à redissoudre le Facteur VIII précipité dans un tampon et à maintenir la solution résultante à une température d'environ 0.5 à 5°C pendant une période d'environ 12 à 24 heures et ensuite à séparer la matière particulaire formée à partir de ladite solution pour obtenir ainsi un Facteur VIII
pratiquement exempt de fibrinogène, de fragments de fibrinogène et de leurs complexes.

6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que dans le but d'enlever les pyrogènes d'une solution tampon de Facteur VIII, on ajoute environ 6% de polyol à ladite solution et on maintient la solution résultante à une température d'environ 0°C à 5°C, pour précipiter le Facteur VIII en laissant en solution le matériau pyrogènique.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que pour effectuer l'addition de polyol aux solutions tampon de Facteur VIII
on ajoute environ 4% de polyol, on sépare le précipité de la solution, on ajoute encore 2% de polyol et maintient la solution à une température de 0° à 5°C environ jusqu'à ce que se produise la précipitation du Facteur VIII.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que la solution contient environ 1 à 3% de protéine.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 et 8, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à redissoudre le Facteur VIII précipité dans un tampon citrate, à maintenir la solution résultante à une température d'environ 0.5 à 5°C pendant un laps de temps d'environ 12 à 24 heures et ensuite à séparer la matière particulaire formée de ladite solution pour obtanir le Facteur VIII pratiquement exempt de fibrinogène, des fragments de fibrinogène et des complexes de ceux-ci.

10. Procédé de concentration du Facteur VIII, caractérisé par le fait qu'il comprend le maintien d'une solution d'environ 1 partie d'une fraction sanguine contenant du Facteur VIII obtenue par cryoprécipitation de plasma dans environ 3 parties de tampon citrate contenant environ 6%
de polyol à une température d'environ 0 à 5°C pour provoquer la précipitation du Facteur VIII de ladite solution et la redissolution dudit Facteur VIII dans le tampon pour donner une solution de Facteur VIII
de très grande pureté.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 3, caractérisé par le fait que les tampons sont des tampons citrate.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 3, caractérisé par le fait que le polyol est un polyéthylèneglycol.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 10, caractérisé par le fait que le polyol est un copolymère séquencé alpha-hydroxy omega-hydroxy poly (oxyéthylène) poly (oxypropylène) poly (oxyéthylène).

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 10, caractérisé par le fait que la précipitation du Facteur VIII est effectuée a pH 6.8 - 7.2.

15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 et 7, caractérisé par le fait que la précipitation préalable du fibrinogène est effectuée à pH 6.0-6.5 et à température d'environ 20-30°C.

16. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la source de Facteur VIII est un cryoprécipité dissous dans environ 2 à 4 fois son volume de tampon.

17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé par le fait que le rapport volumique de cryoprécipité au tampon est d'environ 1 à 3.