JP2000053581A - 減少した凝集物含量を有するタンパク質製剤の製造法および該製剤の使用 - Google Patents
減少した凝集物含量を有するタンパク質製剤の製造法および該製剤の使用Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 タンパク質の安全性、相容性および生物活性
が改善されている、減少した凝集物含量を有する医療用
のタンパク質製剤の、経済的かつ簡単に使用されうる製
造法の提供。 【解決手段】 熱処理前および／または熱処理後、タン
パク質製剤中に存在する凝集物、変性したタンパク質お
よび／または汚染物の分離を行う。
が改善されている、減少した凝集物含量を有する医療用
のタンパク質製剤の、経済的かつ簡単に使用されうる製
造法の提供。 【解決手段】 熱処理前および／または熱処理後、タン
パク質製剤中に存在する凝集物、変性したタンパク質お
よび／または汚染物の分離を行う。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、減少した凝集物含
量を有するタンパク質製剤を製造するための方法、殊に
血漿タンパク質、例えばアルブミンの医療用製剤を製造
するための方法に関する。
量を有するタンパク質製剤を製造するための方法、殊に
血漿タンパク質、例えばアルブミンの医療用製剤を製造
するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトの血漿タンパク質は数十年来大規模
に清浄化され、かつ治療および予防のために普及されて
いる。純粋なタンパク質からなる製剤、または１つの複
合した血漿混合物からのタンパク質画分からなる製剤に
は、種々の方法、例えば選択的沈殿作用による分画、ま
たはクロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマト
グラフィー、ゲル濾過および親和性クロマトグラフィー
によるタンパク質混合物の分離が使用されてよい。最適
な結果が得られるように、これらの方法は極めて頻繁に
組み合わせも行われる。
に清浄化され、かつ治療および予防のために普及されて
いる。純粋なタンパク質からなる製剤、または１つの複
合した血漿混合物からのタンパク質画分からなる製剤に
は、種々の方法、例えば選択的沈殿作用による分画、ま
たはクロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマト
グラフィー、ゲル濾過および親和性クロマトグラフィー
によるタンパク質混合物の分離が使用されてよい。最適
な結果が得られるように、これらの方法は極めて頻繁に
組み合わせも行われる。
【０００３】大規模な血漿タンパク質の分画には、久し
くエタノールを用いた沈殿法も認められていた(コーン
(Cohn)他、J.Am.Chem.Soc.68(1946),459〜475頁；Kistl
er und Nitschmann, Vox Sang. 7(1962), 414〜424
頁）。現在もなお、この方法を用いて世界的に大量の血
漿タンパク質、殊にアルブミン、免疫グロブリンおよび
血液凝固因子、ひいては他のタンパク質が、ヒトの血漿
から、特に医療用の目的で単離されている。しかし、血
漿タンパク質のエタノール分画は、いくつかの欠点を有
する。すなわち、殊に高いアルコール濃度および／また
は高い温度の場合、不安定なタンパク質の部分的な変性
が行われることがある。このような変性は、部分的また
は完全に、生理的機能の損失をもたらすか、または構造
的な変化をもたらし、これは前酵素の活性化において、
または新規の抗原決定基またはタンパク質凝集物の形成
として現れることがある。
くエタノールを用いた沈殿法も認められていた(コーン
(Cohn)他、J.Am.Chem.Soc.68(1946),459〜475頁；Kistl
er und Nitschmann, Vox Sang. 7(1962), 414〜424
頁）。現在もなお、この方法を用いて世界的に大量の血
漿タンパク質、殊にアルブミン、免疫グロブリンおよび
血液凝固因子、ひいては他のタンパク質が、ヒトの血漿
から、特に医療用の目的で単離されている。しかし、血
漿タンパク質のエタノール分画は、いくつかの欠点を有
する。すなわち、殊に高いアルコール濃度および／また
は高い温度の場合、不安定なタンパク質の部分的な変性
が行われることがある。このような変性は、部分的また
は完全に、生理的機能の損失をもたらすか、または構造
的な変化をもたらし、これは前酵素の活性化において、
または新規の抗原決定基またはタンパク質凝集物の形成
として現れることがある。
【０００４】考えられる感染性汚染物、例えばウイルス
または他の病原体を、失活させるため、血漿製剤を遮断
性の低温殺菌工程にかけることができる。アルブミンは
例えば、安定剤、例えばＮ−アセチルトリプトファネー
トまたはナトリウムカプリレートの存在下に、６０〜６
４℃に１０時間で加熱することによって、低温殺菌され
ることができる（ゲリス(Gellis)他、J.Clin.Invest. 2
7(1948), 239〜244頁）。他の低温殺菌法は、例えば米
国特許第２８９７１２３号；同第３２２７６２６号；同
第４３７９０８５号；同第４４４０６７９号；同第４６
２３７１７号および４８０３０７３号明細書中に開示さ
れている。血漿タンパク質の低温殺菌された製剤は、ウ
イルスおよび病原体の伝染に関連して、極めて安全であ
ることが判明した。低温殺菌の他の利点は、タンパク質
製剤に毒性の添加物質が添加されてはならず、したがっ
て多くの場合、最終容器中の病原体の失活が生じうるこ
とである。しかし、低温殺菌の欠点は、しばしば明らか
な凝集物形成の増大が見られることである。
または他の病原体を、失活させるため、血漿製剤を遮断
性の低温殺菌工程にかけることができる。アルブミンは
例えば、安定剤、例えばＮ−アセチルトリプトファネー
トまたはナトリウムカプリレートの存在下に、６０〜６
４℃に１０時間で加熱することによって、低温殺菌され
ることができる（ゲリス(Gellis)他、J.Clin.Invest. 2
7(1948), 239〜244頁）。他の低温殺菌法は、例えば米
国特許第２８９７１２３号；同第３２２７６２６号；同
第４３７９０８５号；同第４４４０６７９号；同第４６
２３７１７号および４８０３０７３号明細書中に開示さ
れている。血漿タンパク質の低温殺菌された製剤は、ウ
イルスおよび病原体の伝染に関連して、極めて安全であ
ることが判明した。低温殺菌の他の利点は、タンパク質
製剤に毒性の添加物質が添加されてはならず、したがっ
て多くの場合、最終容器中の病原体の失活が生じうるこ
とである。しかし、低温殺菌の欠点は、しばしば明らか
な凝集物形成の増大が見られることである。
【０００５】しかし部分的に多量の、見ることができる
か、またはほぼ見ることができる粒子の発生をもたらす
前記の凝集物形成は、殊に医学的使用および薬学的使用
の場合、著しく不都合である。すなわち、粗大粒子は直
接毛細管の機能を損なうことがある。ほぼ見ることがで
きる粒子またはタンパク質凝集物の不都合な副作用は、
多種多様のタンパク質処方物にとって公知であり、かつ
記載されている。したがって多くの場合に認可を与える
当局は、例えばアルブミン溶液または免疫グロブリン溶
液の凝集物含量に関する境界値を主張する。免疫グロブ
リン溶液中の凝集物は、例えば補体系の制御されない活
性化を引き起こし、かつ重大な副作用をもまねく。アル
ブミン凝集物については、極めて迅速に循環から消滅
し、おそらくＲＥＳ系を遮断し、かつ組織体をショック
状態に対して敏感にすることが記載されている。したが
って、タンパク質溶液中の凝集物は極端な場合、どんな
事情があっても回避されなければならない生命に関わる
状況を招きうる。
か、またはほぼ見ることができる粒子の発生をもたらす
前記の凝集物形成は、殊に医学的使用および薬学的使用
の場合、著しく不都合である。すなわち、粗大粒子は直
接毛細管の機能を損なうことがある。ほぼ見ることがで
きる粒子またはタンパク質凝集物の不都合な副作用は、
多種多様のタンパク質処方物にとって公知であり、かつ
記載されている。したがって多くの場合に認可を与える
当局は、例えばアルブミン溶液または免疫グロブリン溶
液の凝集物含量に関する境界値を主張する。免疫グロブ
リン溶液中の凝集物は、例えば補体系の制御されない活
性化を引き起こし、かつ重大な副作用をもまねく。アル
ブミン凝集物については、極めて迅速に循環から消滅
し、おそらくＲＥＳ系を遮断し、かつ組織体をショック
状態に対して敏感にすることが記載されている。したが
って、タンパク質溶液中の凝集物は極端な場合、どんな
事情があっても回避されなければならない生命に関わる
状況を招きうる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】血漿タンパク質の極め
て広い使用範囲により、タンパク質の安全性、相容性お
よび生物活性が改善されうるような方法への極めて高い
需要がある。付加的に、このような方法は経済的かつ簡
単に使用されうるべきである。
て広い使用範囲により、タンパク質の安全性、相容性お
よび生物活性が改善されうるような方法への極めて高い
需要がある。付加的に、このような方法は経済的かつ簡
単に使用されうるべきである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】驚くべきことに、本発明
によれば、例えば考えられる感染性汚染物を除去するた
め実施される熱処理が、予め行われるか、または後で行
われる分離工程によって改善される場合、減少した凝集
物含量を有するタンパク質製剤が製造されることがで
き、その結果、最終生成物中では変性および／または凝
集物形成は傑出して減少されているか、または阻止され
ていることが確認された。引続き熱処理されるべきであ
るタンパク質またはタンパク質混合物は、分離工程によ
り所望の活性作用物質および天然作用物質に関連して増
量される。したがって本発明の対象は、熱処理を含む、
減少された凝集物含量を有するタンパク質製剤を製造す
るための方法であり、この場合、この方法は熱処理の前
および／または後に、タンパク質製剤中に存在する凝集
物、変性したタンパク質および／または汚染物の分離を
行うことによって特徴付けられる。
によれば、例えば考えられる感染性汚染物を除去するた
め実施される熱処理が、予め行われるか、または後で行
われる分離工程によって改善される場合、減少した凝集
物含量を有するタンパク質製剤が製造されることがで
き、その結果、最終生成物中では変性および／または凝
集物形成は傑出して減少されているか、または阻止され
ていることが確認された。引続き熱処理されるべきであ
るタンパク質またはタンパク質混合物は、分離工程によ
り所望の活性作用物質および天然作用物質に関連して増
量される。したがって本発明の対象は、熱処理を含む、
減少された凝集物含量を有するタンパク質製剤を製造す
るための方法であり、この場合、この方法は熱処理の前
および／または後に、タンパク質製剤中に存在する凝集
物、変性したタンパク質および／または汚染物の分離を
行うことによって特徴付けられる。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明による方法は、殊に血漿タ
ンパク質の製剤を製造するために適しているが、しかし
それに限定されるものではない。血漿タンパク質は、有
利にプラスミノゲン、アルブミン、第ＶＩＩＩ因子、第
ＩＸ因子、フィブロネクチン、免疫グロブリン、キニノ
ーゲン、アンチトロンビンＩＩＩ、α−１−アンチトリ
プシン、プレカリクレイン、フィブリノーゲン、トロン
ビン、（アポ−）リポタンパク質、および１つまたは複
数のこれらのタンパク質を含有する血漿タンパク分画か
らなる群から選択される。特に好ましくは、アルブミ
ン、免疫グロブリンまたは（アポ−）リポタンパク質か
らなる製剤、および最も好ましくはアルブミン製剤が製
造される。
ンパク質の製剤を製造するために適しているが、しかし
それに限定されるものではない。血漿タンパク質は、有
利にプラスミノゲン、アルブミン、第ＶＩＩＩ因子、第
ＩＸ因子、フィブロネクチン、免疫グロブリン、キニノ
ーゲン、アンチトロンビンＩＩＩ、α−１−アンチトリ
プシン、プレカリクレイン、フィブリノーゲン、トロン
ビン、（アポ−）リポタンパク質、および１つまたは複
数のこれらのタンパク質を含有する血漿タンパク分画か
らなる群から選択される。特に好ましくは、アルブミ
ン、免疫グロブリンまたは（アポ−）リポタンパク質か
らなる製剤、および最も好ましくはアルブミン製剤が製
造される。
【０００９】本発明による方法によって製造された、減
少した凝集物含量を有するアルブミン製剤は、医学的使
用のためには公知技術水準の調製物よりも、傑出して良
好である。本発明によるアルブミン製剤は、血漿増量剤
として使用されてよいか、あるいは熱傷の場合の治療に
も使用されることができる。その上、殊にわずかな濃度
の高活性タンパク質またはペプチド、例えば今日ではし
ばしば組み換え技術を用いて製造されるホルモン、ケモ
キン(Chemokine)、サイトカイニンまたは酵素が重要で
ある場合には、他の使用、例えば超音波画像または、安
定剤としてタンパク質溶液への添加も可能である。
少した凝集物含量を有するアルブミン製剤は、医学的使
用のためには公知技術水準の調製物よりも、傑出して良
好である。本発明によるアルブミン製剤は、血漿増量剤
として使用されてよいか、あるいは熱傷の場合の治療に
も使用されることができる。その上、殊にわずかな濃度
の高活性タンパク質またはペプチド、例えば今日ではし
ばしば組み換え技術を用いて製造されるホルモン、ケモ
キン(Chemokine)、サイトカイニンまたは酵素が重要で
ある場合には、他の使用、例えば超音波画像または、安
定剤としてタンパク質溶液への添加も可能である。
【００１０】特に本発明による方法は、化学的に変性さ
れたタンパク質の製剤の製造にも適当であり、この場
合、タンパク質の官能基、殊に官能側鎖の変性が実施さ
れる。化学的に変性されたタンパク質、例えばアルブミ
ンは、例えば、生体内で所望の組織区分中には到達しな
いか、または遊離した形では望ましい活性を有していな
い官能分子の担体として、使用されてもよい。有利に化
学的変性は、ポリエチレングリコール変性、ヨウ化、ア
シル化、例えばアセチル化、例えば過酸化物を用いた酸
化、ニトロキシル化および、例えば二感応性リンカーを
用いた交差架橋からなる群から選択される。
れたタンパク質の製剤の製造にも適当であり、この場
合、タンパク質の官能基、殊に官能側鎖の変性が実施さ
れる。化学的に変性されたタンパク質、例えばアルブミ
ンは、例えば、生体内で所望の組織区分中には到達しな
いか、または遊離した形では望ましい活性を有していな
い官能分子の担体として、使用されてもよい。有利に化
学的変性は、ポリエチレングリコール変性、ヨウ化、ア
シル化、例えばアセチル化、例えば過酸化物を用いた酸
化、ニトロキシル化および、例えば二感応性リンカーを
用いた交差架橋からなる群から選択される。
【００１１】本発明による方法にとって本質的な工程、
すなわち熱処理前および／または熱処理後の凝集物、変
性したタンパク質および／または汚染物の少なくとも部
分的な分離は、公知の方法により、例えば遠心分離によ
る、沈殿した凝集物の分離と接続している、例えば硫酸
アンモニウム、エタノールまたはポリエチレングリコー
ルを用いた沈殿を含んでいてよい。その上、分離は、例
えばフラクトゲル(Fractogel)ＥＭＤ Ｂｉｏ ＳＥＣ
（メルク(Merck)）または他のゲル濾過媒体、例えばセ
ファデックス(Sephadex)またはセファローズ(Sepharos
e)（ファルマシア(Pharmacia))を用いたゲル濾過も含ん
でいてよい。しかし有利に、分離は膜に適した孔径度、
例えば３０〜１０００ｋＤおよび殊に１００〜５００ｋ
Ｄの排除尺度(Ausschlussgroesse)の使用下に膜濾過に
よって行われ、この場合、排除尺度を上回る分子量を有
する望ましくない成分は分離される。さらに分離には、
例えばウイルスの減損のために、例えば濾過材料ＤＶ２
０またはＤＶ５０(Pall Corp., ニューヨーク、ＵＳＡ
在）またはプラノバ(Planova)１５Ｎ(Asaki、東京、日
本在）の使用下に使用される微小濾過(Nanofiltration)
も、含まれてよい。
すなわち熱処理前および／または熱処理後の凝集物、変
性したタンパク質および／または汚染物の少なくとも部
分的な分離は、公知の方法により、例えば遠心分離によ
る、沈殿した凝集物の分離と接続している、例えば硫酸
アンモニウム、エタノールまたはポリエチレングリコー
ルを用いた沈殿を含んでいてよい。その上、分離は、例
えばフラクトゲル(Fractogel)ＥＭＤ Ｂｉｏ ＳＥＣ
（メルク(Merck)）または他のゲル濾過媒体、例えばセ
ファデックス(Sephadex)またはセファローズ(Sepharos
e)（ファルマシア(Pharmacia))を用いたゲル濾過も含ん
でいてよい。しかし有利に、分離は膜に適した孔径度、
例えば３０〜１０００ｋＤおよび殊に１００〜５００ｋ
Ｄの排除尺度(Ausschlussgroesse)の使用下に膜濾過に
よって行われ、この場合、排除尺度を上回る分子量を有
する望ましくない成分は分離される。さらに分離には、
例えばウイルスの減損のために、例えば濾過材料ＤＶ２
０またはＤＶ５０(Pall Corp., ニューヨーク、ＵＳＡ
在）またはプラノバ(Planova)１５Ｎ(Asaki、東京、日
本在）の使用下に使用される微小濾過(Nanofiltration)
も、含まれてよい。
【００１２】分離前、または有利に分離後に実施される
熱処理には、有利に長時間に亘る温度上昇、例えば公知
の方法で行われてよい低温殺菌工程が含まれる。常法に
よれば熱処理は、感染性汚染物を少なくとも十分に失活
させるため、タンパク質溶液を少なくとも５５℃に十分
な時間で加熱することを含む。加熱時間は有利に少なく
とも５時間、特に好ましくは約１０時間である。加熱の
際の温度は、有利に６０〜６５℃の範囲内にある。タン
パク質の失活を阻止するため、アルブミンの場合には熱
処理は有利に公知の安定剤、例えばＮ−アセチルトリプ
トファネートまたはナトリウムカプリレートの存在下に
実施される。
熱処理には、有利に長時間に亘る温度上昇、例えば公知
の方法で行われてよい低温殺菌工程が含まれる。常法に
よれば熱処理は、感染性汚染物を少なくとも十分に失活
させるため、タンパク質溶液を少なくとも５５℃に十分
な時間で加熱することを含む。加熱時間は有利に少なく
とも５時間、特に好ましくは約１０時間である。加熱の
際の温度は、有利に６０〜６５℃の範囲内にある。タン
パク質の失活を阻止するため、アルブミンの場合には熱
処理は有利に公知の安定剤、例えばＮ−アセチルトリプ
トファネートまたはナトリウムカプリレートの存在下に
実施される。
【００１３】多くのタンパク質混合物の場合、前記の分
離工程が既に凝集物、変性したタンパク質および／また
は汚染物の形成の本来十分な減少を生じさせるけれど
も、他の場合には所望の結果は、分離前にタンパク質製
剤中に存在する、凝集しうるか、および／または変性し
うる成分が分離可能な状態に移行されるような前処理工
程が実施されることによってのみ得ることができる。有
利に前処理工程は、製剤中に既に存在する変性された分
子、部分的に変性された分子または敏感な分子、または
汚染物を凝集させるか、または他の方法で、引続く分離
工程を用いて除去されることができる状態にもたらされ
るため、タンパク質製剤中の物理化学的パラメーターの
変化、殊に応力処理を含む。この物理化学的パラメータ
ーの変化は、例えばｐＨ値の変化、温度の変化、殊に上
昇、イオン強度または誘電率の変化、剪断力の導入、ま
たはこれらの２つまたはそれ以上の方法の組合せを含ん
でいてよい。
離工程が既に凝集物、変性したタンパク質および／また
は汚染物の形成の本来十分な減少を生じさせるけれど
も、他の場合には所望の結果は、分離前にタンパク質製
剤中に存在する、凝集しうるか、および／または変性し
うる成分が分離可能な状態に移行されるような前処理工
程が実施されることによってのみ得ることができる。有
利に前処理工程は、製剤中に既に存在する変性された分
子、部分的に変性された分子または敏感な分子、または
汚染物を凝集させるか、または他の方法で、引続く分離
工程を用いて除去されることができる状態にもたらされ
るため、タンパク質製剤中の物理化学的パラメーターの
変化、殊に応力処理を含む。この物理化学的パラメータ
ーの変化は、例えばｐＨ値の変化、温度の変化、殊に上
昇、イオン強度または誘電率の変化、剪断力の導入、ま
たはこれらの２つまたはそれ以上の方法の組合せを含ん
でいてよい。
【００１４】特に有利に、この前処理工程はタンパク質
製剤の温度上昇を含む。この温度上昇の程度および時間
は、その都度のタンパク質製剤もしくはその敏感性に依
存する。一方では、できるだけ大部分の凝集しうる成分
を分離可能な状態へと移行させるため、温度上昇および
その時間は十分であるべきであるが；他方では、望まれ
る製剤中のタンパク質の失活をできるだけ十分に阻止す
るため、条件は過度に激烈に選択されてはならない。多
数のタンパク質、例えばアルブミンに関しては、タンパ
ク質製剤を４０〜７０℃、殊に４５〜６５℃の温度に、
３０分ないし４時間、殊に１時間ないし２.５時間にわ
たって加熱することが有効であることが判明した。
製剤の温度上昇を含む。この温度上昇の程度および時間
は、その都度のタンパク質製剤もしくはその敏感性に依
存する。一方では、できるだけ大部分の凝集しうる成分
を分離可能な状態へと移行させるため、温度上昇および
その時間は十分であるべきであるが；他方では、望まれ
る製剤中のタンパク質の失活をできるだけ十分に阻止す
るため、条件は過度に激烈に選択されてはならない。多
数のタンパク質、例えばアルブミンに関しては、タンパ
ク質製剤を４０〜７０℃、殊に４５〜６５℃の温度に、
３０分ないし４時間、殊に１時間ないし２.５時間にわ
たって加熱することが有効であることが判明した。
【００１５】最後に本発明はなお、本発明による方法に
よって製造された、減少した凝集物含量を有するタンパ
ク質製剤にも関する。このタンパク質製剤は、殊に医学
的使用に関して、公知技術水準の製剤よりも著しく好適
であり、それというのも、本発明によるタンパク質製剤
が医療用の使用の際に著しく少ない非相容性反応を生じ
るからである。
よって製造された、減少した凝集物含量を有するタンパ
ク質製剤にも関する。このタンパク質製剤は、殊に医学
的使用に関して、公知技術水準の製剤よりも著しく好適
であり、それというのも、本発明によるタンパク質製剤
が医療用の使用の際に著しく少ない非相容性反応を生じ
るからである。
【００１６】最後に、さらに次の例につき本発明を詳説
する。
する。
【００１７】
【実施例】例１ アルブミン溶液（１０ミリモル／ｌのＮａＣｌ中で１０
％）を４５℃で９０分間インキュベートした。引続き、
３００ｋＤの分子量カットオフを有するカセットを通し
てダイアフィルトレーションした(diafiltrieren)。主
にモノマーアルブミンを含有する限外濾液は、安定剤
（１６ミリモル／ｌのＮａ−カプリレート、１６ミリモ
ル／ｌのアセチルトリプトファン）の存在下に、６０℃
で１０時間低温殺菌した。
％）を４５℃で９０分間インキュベートした。引続き、
３００ｋＤの分子量カットオフを有するカセットを通し
てダイアフィルトレーションした(diafiltrieren)。主
にモノマーアルブミンを含有する限外濾液は、安定剤
（１６ミリモル／ｌのＮａ−カプリレート、１６ミリモ
ル／ｌのアセチルトリプトファン）の存在下に、６０℃
で１０時間低温殺菌した。
【００１８】結果：凝集物含量は、前インキュベート後
２％、限外濾過後（限外濾液）中で０.１％を上回り、
および低温殺菌後０.６％であった。限外濾過の残留物
中では、凝集物の著しい増量が測定された（８０％を上
回る）。前インキュベーションおよび引き続くダイアフ
ィルトレーションなしで低温殺菌後、６％の凝集物含量
が測定された。結果は、アルブミンの前インキュベーシ
ョン中に安定剤（Ｎ−アセチルトリプトファネートおよ
びナトリウムカプリレート）を添加することによって本
質的に影響を及ぼされたわけではない。
２％、限外濾過後（限外濾液）中で０.１％を上回り、
および低温殺菌後０.６％であった。限外濾過の残留物
中では、凝集物の著しい増量が測定された（８０％を上
回る）。前インキュベーションおよび引き続くダイアフ
ィルトレーションなしで低温殺菌後、６％の凝集物含量
が測定された。結果は、アルブミンの前インキュベーシ
ョン中に安定剤（Ｎ−アセチルトリプトファネートおよ
びナトリウムカプリレート）を添加することによって本
質的に影響を及ぼされたわけではない。
【００１９】同様の試験を、商業的に入手できるアルブ
ミン溶液（１４０ミリモル／ｌのＮａＣｌ、１２ミリモ
ル／ｌのＮ−アセチルトリプトファネートおよびＮａ−
カプリレート中２０％）を用いて実施した。実験中の溶
液の挙動および結果は、出発材料としてのアルブミン溶
液１０％と本質的に同一であった。
ミン溶液（１４０ミリモル／ｌのＮａＣｌ、１２ミリモ
ル／ｌのＮ−アセチルトリプトファネートおよびＮａ−
カプリレート中２０％）を用いて実施した。実験中の溶
液の挙動および結果は、出発材料としてのアルブミン溶
液１０％と本質的に同一であった。
【００２０】溶液中の凝集物の測定：高性能ゲル濾過(H
igh Performance Gel Filtration)により、ｐＨ７.０、
７０ミリモル／ｌのリン酸カリウム−緩衝剤中スペロー
ズ(Superose)ＨＲ１０／３０カラム（ファルマシア(Pha
rmacia) ）上で、１.０ｍｌ／分の流れを用いて、タン
パク質１ｍｇを分離した。２８０ｎｍの場合に吸収を測
定することによって、検出を行った。試験体のモノマー
含量もしくは凝集物含量を、タンパク質ピークの平面を
介して計算した。
igh Performance Gel Filtration)により、ｐＨ７.０、
７０ミリモル／ｌのリン酸カリウム−緩衝剤中スペロー
ズ(Superose)ＨＲ１０／３０カラム（ファルマシア(Pha
rmacia) ）上で、１.０ｍｌ／分の流れを用いて、タン
パク質１ｍｇを分離した。２８０ｎｍの場合に吸収を測
定することによって、検出を行った。試験体のモノマー
含量もしくは凝集物含量を、タンパク質ピークの平面を
介して計算した。
【００２１】例２ アルブミン溶液（１０％、それぞれ８ミリモル／ｌの安
定剤を含有する）を、１モル／ｌのＮａＯＨを用いてｐ
Ｈ１０.５に調節し、引続き、６５℃で２時間加熱し
た。その後、溶液を室温に冷却し、１モル／ｌのＨＣｌ
を用いてｐＨ値を７に逆滴定した。
定剤を含有する）を、１モル／ｌのＮａＯＨを用いてｐ
Ｈ１０.５に調節し、引続き、６５℃で２時間加熱し
た。その後、溶液を室温に冷却し、１モル／ｌのＨＣｌ
を用いてｐＨ値を７に逆滴定した。
【００２２】選択的沈殿により、形成された凝集物を次
のように除去した： （ａ）溶液に、２５％、３０％または３５％の飽和に至
るまで硫酸アンモニウムを添加した。その後生じる混濁
を、遠心分離により除去し、かつ残滓をゲル濾過により
セファデックス(Sephadex)Ｇ−２５（ＰＤ−１０、ファ
ルマシア(Pharmacia)）上で、１５０ミリモル／ｌのＮ
ａＣｌ中で再平衡化した。引続き、安定剤（Ｎａ−カプ
リレート、Ｎ−アセチルトリプトファネート、それぞれ
８ミリモル／ｌ）の存在下に、６０℃で１０時間低温殺
菌した。
のように除去した： （ａ）溶液に、２５％、３０％または３５％の飽和に至
るまで硫酸アンモニウムを添加した。その後生じる混濁
を、遠心分離により除去し、かつ残滓をゲル濾過により
セファデックス(Sephadex)Ｇ−２５（ＰＤ−１０、ファ
ルマシア(Pharmacia)）上で、１５０ミリモル／ｌのＮ
ａＣｌ中で再平衡化した。引続き、安定剤（Ｎａ−カプ
リレート、Ｎ−アセチルトリプトファネート、それぞれ
８ミリモル／ｌ）の存在下に、６０℃で１０時間低温殺
菌した。
【００２３】（ｂ）溶液に、６.１％、７.１％または
８.３％の最終濃度になるまで、ポリエチエレングリコ
ール（ＰＥＧ）３０００を添加し、およびこれに起因す
る混濁を遠心分離により除去した。引続き、残滓を
（ａ）と同様に再平衡化し、かつ最終生成物を取得する
ため安定剤の存在下に低温殺菌した。
８.３％の最終濃度になるまで、ポリエチエレングリコ
ール（ＰＥＧ）３０００を添加し、およびこれに起因す
る混濁を遠心分離により除去した。引続き、残滓を
（ａ）と同様に再平衡化し、かつ最終生成物を取得する
ため安定剤の存在下に低温殺菌した。
【００２４】結果：
【００２５】
【表１】
【００２６】例３ ＰＥＧの活性化：塩化シアヌール５.５ｇを、炭酸ナト
リウム１０ｇを含有する無水ベンゾール４００ｍｌ中に
溶解した。ＰＥＧ１９００ １９ｇを混合物に添加し、
室温で一晩中攪拌した。溶液を濾過し、石油エーテル６
００ｍｌをゆっくり添加した。懸濁液を濾過し、かつ沈
殿物をベンゾール４００ｍｌ中に溶解した。遊離塩化シ
アヌールを除去するため、沈殿工程および濾過工程を、
数回繰り返した。
リウム１０ｇを含有する無水ベンゾール４００ｍｌ中に
溶解した。ＰＥＧ１９００ １９ｇを混合物に添加し、
室温で一晩中攪拌した。溶液を濾過し、石油エーテル６
００ｍｌをゆっくり添加した。懸濁液を濾過し、かつ沈
殿物をベンゾール４００ｍｌ中に溶解した。遊離塩化シ
アヌールを除去するため、沈殿工程および濾過工程を、
数回繰り返した。
【００２７】アルブミンでの活性化したＰＥＧの形成：
ｐＨ９.２、０.１モル／ｌのテトラホウ酸ナトリウム１
００ｍｌ中にアルブミン１ｇを溶解した。４℃で、活性
化したＰＥＧ８ｇを添加し、かつｐＨ値を１時間の間
９.２に維持した。このように第１アミノ基８０〜９０
％をＰＥＧを用いて変性した。反応後ダイアフィルトレ
ーション（１０ｋＤ遮断膜）により過剰のＰＥＧを除去
し、かつ１０ミリモル／ｌのＮａＣｌに対して溶液を再
緩衝させた。引続き、溶液を例１の場合と同様に４５℃
で前インキュベートし、３００ｋＤカセットを通してダ
イアフィルトレーションし、安定剤の存在下に６０℃で
１０時間低温殺菌した。
ｐＨ９.２、０.１モル／ｌのテトラホウ酸ナトリウム１
００ｍｌ中にアルブミン１ｇを溶解した。４℃で、活性
化したＰＥＧ８ｇを添加し、かつｐＨ値を１時間の間
９.２に維持した。このように第１アミノ基８０〜９０
％をＰＥＧを用いて変性した。反応後ダイアフィルトレ
ーション（１０ｋＤ遮断膜）により過剰のＰＥＧを除去
し、かつ１０ミリモル／ｌのＮａＣｌに対して溶液を再
緩衝させた。引続き、溶液を例１の場合と同様に４５℃
で前インキュベートし、３００ｋＤカセットを通してダ
イアフィルトレーションし、安定剤の存在下に６０℃で
１０時間低温殺菌した。
【００２８】結果：前インキュベーションなしで、ＰＥ
Ｇ変性されたアルブミン中で１０％の凝集物含量が測定
された。前インキュベーションおよび引き続くダイアフ
ィルトレーションによって、凝集物含量は４.５％に低
減されることができた。
Ｇ変性されたアルブミン中で１０％の凝集物含量が測定
された。前インキュベーションおよび引き続くダイアフ
ィルトレーションによって、凝集物含量は４.５％に低
減されることができた。
【００２９】例４ ２０％のアルブミン溶液を、ｐＨ９.５、０.１モル／ｌ
のホウ酸塩緩衝剤を用いて、１０％に希釈し、かつ０℃
に冷却した。引続き、２０％（ｖ／ｖ）の冷えたＫＪ３
溶液を添加し、０℃で３０分インキュベートした。Ｎａ
ＳＯ３（１モル／ｌ）数滴を添加することによって、反
応を停止し、タンパク質溶液を６０℃で２時間インキュ
ベートし、かつ冷却した。一定部分を６０℃で８時間イ
ンキュベートした（凝集物形成の判定のため）。
のホウ酸塩緩衝剤を用いて、１０％に希釈し、かつ０℃
に冷却した。引続き、２０％（ｖ／ｖ）の冷えたＫＪ３
溶液を添加し、０℃で３０分インキュベートした。Ｎａ
ＳＯ３（１モル／ｌ）数滴を添加することによって、反
応を停止し、タンパク質溶液を６０℃で２時間インキュ
ベートし、かつ冷却した。一定部分を６０℃で８時間イ
ンキュベートした（凝集物形成の判定のため）。
【００３０】溶液の残りを、３００ｋＤ膜を介して、１
４０ミリモル／ｌのＮａＣｌ ４.５回量に対してダイ
アフィルトレーションした。最後に、残留物を２０％の
タンパク質濃度に蒸発濃縮した。限外濾液を、１０ｋＤ
のダイアフィルトレーションにより再緩衝した：１４０
ミリモル／ｌのＮａＣｌ １０回量に対するダイアフィ
ルトレーション、および引続く１５〜２０％のタンパク
質含量への１０ｋＤａダイアフィルトレーション膜での
濃縮。生じるタンパク質溶液を、例１の場合のように、
安定剤の存在下に低温殺菌した。
４０ミリモル／ｌのＮａＣｌ ４.５回量に対してダイ
アフィルトレーションした。最後に、残留物を２０％の
タンパク質濃度に蒸発濃縮した。限外濾液を、１０ｋＤ
のダイアフィルトレーションにより再緩衝した：１４０
ミリモル／ｌのＮａＣｌ １０回量に対するダイアフィ
ルトレーション、および引続く１５〜２０％のタンパク
質含量への１０ｋＤａダイアフィルトレーション膜での
濃縮。生じるタンパク質溶液を、例１の場合のように、
安定剤の存在下に低温殺菌した。
【００３１】前処理（前インキュベーション、３００ｋ
Ｄダイアフィルトレーション）を用いて、ヨウ化したア
ルブミン中では５.２％の凝集物含量が達成され、前処
理なしでは、１２.７％の凝集物含量が測定され、すな
わち約５９％の低減が達成されることができた。
Ｄダイアフィルトレーション）を用いて、ヨウ化したア
ルブミン中では５.２％の凝集物含量が達成され、前処
理なしでは、１２.７％の凝集物含量が測定され、すな
わち約５９％の低減が達成されることができた。
【００３２】例５ アルブミン（２０％）を、ｐＨ７.５の飽和したＮａ−
アセテート溶液を用いて１：２に希釈し、０℃に冷却し
た。１時間で、無水酢酸を分けて添加した（予じめ装入
したタンパク質と同一の重量）。引続き、ｐＨ値を７.
５に調節し、試験体を１.２μｍのフィルターを通して
濾過し、かつ１０ｋＤのダイアフィルトレーションによ
り再緩衝した（１４０ミリモル／ｌのＮａＣｌ ３０回
量に対して）。
アセテート溶液を用いて１：２に希釈し、０℃に冷却し
た。１時間で、無水酢酸を分けて添加した（予じめ装入
したタンパク質と同一の重量）。引続き、ｐＨ値を７.
５に調節し、試験体を１.２μｍのフィルターを通して
濾過し、かつ１０ｋＤのダイアフィルトレーションによ
り再緩衝した（１４０ミリモル／ｌのＮａＣｌ ３０回
量に対して）。
【００３３】タンパク質溶液を、６０℃で２時間インキ
ュベートし、次に冷却し、かつ３００ｋＤ膜を介して、
１４０ミリモル／ｌのＮａＣｌ ４回量に対してダイア
フィルトレーションした。最後に、残留物を約２０％に
蒸発濃縮した。限外濾液を、１０ｋＤのダイアフィルト
レーションにより再緩衝し（１５０ミリモル／ｌのＮａ
Ｃｌ １０回量に対するダイアフィルトレーション）、
および１５〜２０％のタンパク質含量へと同一膜で濃縮
した。引続き、アセチル化したアルブミンの溶液を、例
１の場合のように、安定剤の存在下に低温殺菌した。
ュベートし、次に冷却し、かつ３００ｋＤ膜を介して、
１４０ミリモル／ｌのＮａＣｌ ４回量に対してダイア
フィルトレーションした。最後に、残留物を約２０％に
蒸発濃縮した。限外濾液を、１０ｋＤのダイアフィルト
レーションにより再緩衝し（１５０ミリモル／ｌのＮａ
Ｃｌ １０回量に対するダイアフィルトレーション）、
および１５〜２０％のタンパク質含量へと同一膜で濃縮
した。引続き、アセチル化したアルブミンの溶液を、例
１の場合のように、安定剤の存在下に低温殺菌した。
【００３４】前処理（前インキュベーション、３００ｋ
Ｄ、ダイアフィルトレーション）を用いて、最終生成物
中では、６２％の凝集物含量を測定し、前処理なしで
は、アセチル化した生成物がゲル化し、すなわち可溶性
タンパク質はもはや存在しなかった。
Ｄ、ダイアフィルトレーション）を用いて、最終生成物
中では、６２％の凝集物含量を測定し、前処理なしで
は、アセチル化した生成物がゲル化し、すなわち可溶性
タンパク質はもはや存在しなかった。
【００３５】例６ ０.５ミリモル／ｌのＥＤＴＡを有するアルブミン溶液
（１０％）を、０.１モルの過クロル酸を用いてｐＨ３.
２に調節し、かつ３０℃に加熱した。タンパク質溶液
に、０.５ミリモル／ｌのＨ２Ｏ２を添加した。引続
き、３０℃で２時間インキュベートした。インキュベー
ション後、１４０ミリモル／ｌのＮａＣｌ４回量に対し
て１０ｋＤのダイアフィルトレーションを行った。残留
物を３００ｋＤ膜を介して、１４０ミリモル／ｌのＮａ
Ｃｌ ２回量に対してダイアフィルトレーションし、最
後に、残留物を１５〜２０％のタンパク質濃度に蒸発濃
縮した。
（１０％）を、０.１モルの過クロル酸を用いてｐＨ３.
２に調節し、かつ３０℃に加熱した。タンパク質溶液
に、０.５ミリモル／ｌのＨ２Ｏ２を添加した。引続
き、３０℃で２時間インキュベートした。インキュベー
ション後、１４０ミリモル／ｌのＮａＣｌ４回量に対し
て１０ｋＤのダイアフィルトレーションを行った。残留
物を３００ｋＤ膜を介して、１４０ミリモル／ｌのＮａ
Ｃｌ ２回量に対してダイアフィルトレーションし、最
後に、残留物を１５〜２０％のタンパク質濃度に蒸発濃
縮した。
【００３６】限外濾液を、１０ｋＤのダイアフィルトレ
ーションにより再緩衝し（１４０ミリモル／ｌのＮａＣ
ｌ １０回量）、および同一膜で１０〜１５％のタンパ
ク質含量へと濃縮した。引続き、酸化したアルブミンの
溶液を、例１の場合のように、安定剤の存在下に低温殺
菌した。
ーションにより再緩衝し（１４０ミリモル／ｌのＮａＣ
ｌ １０回量）、および同一膜で１０〜１５％のタンパ
ク質含量へと濃縮した。引続き、酸化したアルブミンの
溶液を、例１の場合のように、安定剤の存在下に低温殺
菌した。
【００３７】前処理（３００ｋＤダイアフィルトレーシ
ョン）を用いて、最終生成物中では１.１％の凝集物含
量が測定された。前処理なしでは、酸化したアルブミン
は１１.１％の凝集物含量を有した。したがって、凝集
物含量は約９０％低減されることができた。
ョン）を用いて、最終生成物中では１.１％の凝集物含
量が測定された。前処理なしでは、酸化したアルブミン
は１１.１％の凝集物含量を有した。したがって、凝集
物含量は約９０％低減されることができた。
【００３８】例７ アルブミン溶液（１０％、２０ｍｌ）を、ＮａＯＨを用
いてｐＨ８.５〜９.０に調節した。その上、トリエタノ
ールアミン２ｍｌ中に懸濁したジメチル−スベリミダー
ト５０ｍｇをｐＨ９.７で添加し、かつ室温で２時間イ
ンキュベートした。ｐＨ８.５、０.１モル／ｌのトリス
１０％（ｖ／ｖ）を添加することによって、反応を停止
させた。引続き、タンパク質溶液を６０℃で２時間イン
キュベートし、その後冷却した。この溶液１５ｍｌを、
３００ｋＤ膜を介して、ダイアフィルトレーションした
（１４０ミリモル／ｌのＮａＣｌ １２回量に対し
て）。最後に、残留物をできるだけ高濃度に蒸発濃縮し
た。
いてｐＨ８.５〜９.０に調節した。その上、トリエタノ
ールアミン２ｍｌ中に懸濁したジメチル−スベリミダー
ト５０ｍｇをｐＨ９.７で添加し、かつ室温で２時間イ
ンキュベートした。ｐＨ８.５、０.１モル／ｌのトリス
１０％（ｖ／ｖ）を添加することによって、反応を停止
させた。引続き、タンパク質溶液を６０℃で２時間イン
キュベートし、その後冷却した。この溶液１５ｍｌを、
３００ｋＤ膜を介して、ダイアフィルトレーションした
（１４０ミリモル／ｌのＮａＣｌ １２回量に対し
て）。最後に、残留物をできるだけ高濃度に蒸発濃縮し
た。
【００３９】限外濾液を、１０ｋＤのダイアフィルトレ
ーションにより１４０ミリモル／ｌのＮａＣｌ ３０回
量に対して再緩衝し、引続き、１４０ミリモル／ｌのＮ
ａＣｌに対する真空透析により、１５〜２０％のタンパ
ク質含量へと濃縮した。引続き、架橋剤によって変性さ
れたアルブミン溶液を、例１の場合のように、安定剤の
存在下に低温殺菌した。
ーションにより１４０ミリモル／ｌのＮａＣｌ ３０回
量に対して再緩衝し、引続き、１４０ミリモル／ｌのＮ
ａＣｌに対する真空透析により、１５〜２０％のタンパ
ク質含量へと濃縮した。引続き、架橋剤によって変性さ
れたアルブミン溶液を、例１の場合のように、安定剤の
存在下に低温殺菌した。
【００４０】前処理（インキュベーション、３００ｋＤ
ダイアフィルトレーション）を用いて、最終生成物中で
は２.５％の凝集物含量が測定された。前処理なしで
は、変性されたアルブミンは２０.５％の凝集物含量を
有した。したがって、凝集物含量は約８８％低減される
ことができた。
ダイアフィルトレーション）を用いて、最終生成物中で
は２.５％の凝集物含量が測定された。前処理なしで
は、変性されたアルブミンは２０.５％の凝集物含量を
有した。したがって、凝集物含量は約８８％低減される
ことができた。
【００４１】例８ アルブミン溶液（タンパク質１０％、エタノール１０％
中）に、４−（２−ブロムアセトアミド）−２，２，
６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシ（ＢｒＡ
ｃＴＰＯ；エタノール中に溶解、５００ｍｇ／ｍｌ）を
添加した（ＢｒＡｃＴＰＯ ０.１７７ｇ／ｇタンパク
質）。溶液を４５℃に加熱し、ｐＨ値をＮａＯＨを用い
て９.５に調節し、苛性アルカリ溶液を連続的に添加す
ることによって、２〜３時間この数値に維持した。引続
き、ＨＣｌを用いてｐＨ値を７.２に逆滴定し、溶液を
６０℃に９０分加熱した。その後、１４０ミリモル／ｌ
のＮａＣｌ １５回量を用いて３００ｋＤダイアフィル
トレーションを行った。限外濾液を、１０ｋＤ、１４０
ミリモル／ｌのＮａＣｌ ５〜１０回量を用いてダイア
フィルトレーションし、および最後に同一膜で２０％の
タンパク質含量へと、濃縮した。溶液を、例１の場合の
ように、安定剤の存在下に低温殺菌した。
中）に、４−（２−ブロムアセトアミド）−２，２，
６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシ（ＢｒＡ
ｃＴＰＯ；エタノール中に溶解、５００ｍｇ／ｍｌ）を
添加した（ＢｒＡｃＴＰＯ ０.１７７ｇ／ｇタンパク
質）。溶液を４５℃に加熱し、ｐＨ値をＮａＯＨを用い
て９.５に調節し、苛性アルカリ溶液を連続的に添加す
ることによって、２〜３時間この数値に維持した。引続
き、ＨＣｌを用いてｐＨ値を７.２に逆滴定し、溶液を
６０℃に９０分加熱した。その後、１４０ミリモル／ｌ
のＮａＣｌ １５回量を用いて３００ｋＤダイアフィル
トレーションを行った。限外濾液を、１０ｋＤ、１４０
ミリモル／ｌのＮａＣｌ ５〜１０回量を用いてダイア
フィルトレーションし、および最後に同一膜で２０％の
タンパク質含量へと、濃縮した。溶液を、例１の場合の
ように、安定剤の存在下に低温殺菌した。
【００４２】前処理（インキュベーション、３００ｋＤ
ダイアフィルトレーション）を用いて、ポリニトロキシ
ル化したアルブミン中では０.１％の凝集物含量が測定
された。前処理なしでは、変性されたアルブミンは５.
５％の凝集物含量を有した。したがって、凝集物含量は
９０％を上回って低減されることができた。
ダイアフィルトレーション）を用いて、ポリニトロキシ
ル化したアルブミン中では０.１％の凝集物含量が測定
された。前処理なしでは、変性されたアルブミンは５.
５％の凝集物含量を有した。したがって、凝集物含量は
９０％を上回って低減されることができた。
【００４３】例９ アポリポタンパク質Ａ−１の溶液（１０ｇ／ｌ、１０ミ
リモル／ＮａＣｌ中）を、ｐＨ５.０で、６０℃、２時
間でインキュベートした。引続き、ｐＨ値を７.５に調
節し、グアニジン−ＨＣｌを２モル／ｌの濃度になるま
で添加し、かつ４５℃で２時間インキュベートした。こ
の溶液を、３００ｋＤ膜を介してダイアフィルトレーシ
ョンし（１０ミリモル／ｌのＮａＣｌ １０回量）、引
続き、１０ｋＤ膜を用いてダイアフィルトレーション
し、かつ１０ｇ／ｌに濃縮した。
リモル／ＮａＣｌ中）を、ｐＨ５.０で、６０℃、２時
間でインキュベートした。引続き、ｐＨ値を７.５に調
節し、グアニジン−ＨＣｌを２モル／ｌの濃度になるま
で添加し、かつ４５℃で２時間インキュベートした。こ
の溶液を、３００ｋＤ膜を介してダイアフィルトレーシ
ョンし（１０ミリモル／ｌのＮａＣｌ １０回量）、引
続き、１０ｋＤ膜を用いてダイアフィルトレーション
し、かつ１０ｇ／ｌに濃縮した。
【００４４】前処理なしでは（４試験）、アポリポタン
パク質Ａ−１溶液中で２.４％〜５.４％の凝集物含量が
測定され、前処理を用いて（３試験）、凝集物含量は
０.４〜０.８％に低減されることができた。
パク質Ａ−１溶液中で２.４％〜５.４％の凝集物含量が
測定され、前処理を用いて（３試験）、凝集物含量は
０.４〜０.８％に低減されることができた。
【００４５】例１０ 免疫グロブリンＧの溶液（２０ｇ／ｌ、３ミリモルＮａ
Ｃｌ／Ｌ以上）を、ｐＨ７.０、４５℃で１２時間イン
キュベートした。凝集物の含量は、前処理中に０.１未
満〜１.０％に上昇した。引続き、アクリルゲル（セフ
ァリル(Sepharyl)Ｓ−３００ＨＲ）を介してゲル濾過
し、ｐＨ値をＨＣｌを用いて５.３に調節し、かつ１０
ｋＤ膜を用いて１２０ｇ／ｌに濃縮した。凝集物含量は
０.２％であり、かつ６ヶ月に亘る貯蔵の間３７℃で安
定したままであった。処理されていない比較溶液中で
は、含量は同一条件下で０.８％に上昇した。
Ｃｌ／Ｌ以上）を、ｐＨ７.０、４５℃で１２時間イン
キュベートした。凝集物の含量は、前処理中に０.１未
満〜１.０％に上昇した。引続き、アクリルゲル（セフ
ァリル(Sepharyl)Ｓ−３００ＨＲ）を介してゲル濾過
し、ｐＨ値をＨＣｌを用いて５.３に調節し、かつ１０
ｋＤ膜を用いて１２０ｇ／ｌに濃縮した。凝集物含量は
０.２％であり、かつ６ヶ月に亘る貯蔵の間３７℃で安
定したままであった。処理されていない比較溶液中で
は、含量は同一条件下で０.８％に上昇した。
【００４６】
【発明の効果】本発明による方法は、特に減少した凝集
物含量を有する医療用のタンパク質製剤を製造するため
に好適である。有利に凝集物含量は、分離工程を用いな
い１つのタンパク質製剤 − 他の場合には同一のタン
パク質製剤 − に対して少なくとも約１０％、特に好
ましくは少なくとも約３０％、および最も好ましくは少
なくとも約５０％減少される。場合によっては、むしろ
約９０％またはそれ以上の凝集物含量の減少が達成され
る。
物含量を有する医療用のタンパク質製剤を製造するため
に好適である。有利に凝集物含量は、分離工程を用いな
い１つのタンパク質製剤 − 他の場合には同一のタン
パク質製剤 − に対して少なくとも約１０％、特に好
ましくは少なくとも約３０％、および最も好ましくは少
なくとも約５０％減少される。場合によっては、むしろ
約９０％またはそれ以上の凝集物含量の減少が達成され
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ペーター ゲー レルヒ スイス国 ベルン ローゼンヴェーク 20
Claims (24)
- 【請求項１】 熱処理を含む、減少した凝集物含量を有
するタンパク質製剤の製造法において、熱処理前および
／または熱処理後、タンパク質製剤中に存在する凝集
物、変性したタンパク質および／または汚染物の分離を
行うことを特徴とする、減少した凝集物含量を有するタ
ンパク質製剤の製造法。 - 【請求項２】 血漿タンパク質の製剤を製造する、請求
項１記載の方法。 - 【請求項３】 血漿タンパク質を、プラスミノゲン、ア
ルブミン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、フィブロネク
チン、免疫グロブリン、キニノーゲン、アンチトロンビ
ンＩＩＩ、α−１−アンチトリプシン、プレカリクレイ
ン、フィブリノーゲン、トロンビン、（アポ−）リポタ
ンパク質、および１つまたは複数のこれらのタンパク質
を含有する血漿タンパク分画からなる群から選択する、
請求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 アルブミン、免疫グロブリンまたは（ア
ポ−）リポタンパク質の製剤を製造する、請求項１から
３までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項５】 化学的に変性されたタンパク質の製剤を
製造する、請求項１から４までのいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項６】 化学的変性を、ポリエチレングリコール
変性、ヨウ化、アシル化、酸化、ニトロキシル化、およ
び交差架橋からなる群から選択する、請求項５記載の方
法。 - 【請求項７】 感染性汚染物を少なくとも十分に除去す
るため、熱処理が、タンパク質製剤を少なくとも５５℃
に十分な時間に亘って加熱することを含む、請求項１か
ら６までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】 熱処理時間が少なくとも５時間である、
請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項９】 熱処理を安定剤の存在下に実施する、請
求項１から８までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１０】 分離が沈殿工程を含む、請求項１から
９までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１１】 沈殿を、硫酸アンモニウム、エタノー
ルまたはポリエチレングリコールを添加することによっ
て行う、請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 分離がゲル濾過工程を含む、請求項１
から１１までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１３】 分離が微小濾過を含む、請求項１から
１２までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１４】 分離が膜濾過を含む、請求項１から１
３までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１５】 膜濾過のため、３０〜１０００ｋＤの
排除尺度を選択する、請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 分離の前に前処理工程を実施し、その
際にタンパク質製剤中に存在する凝集しうる成分および
／または変性しうる成分を、分離可能な状態に移行させ
る、請求項１から１５までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１７】 前処理工程が、タンパク質製剤中の物
理化学的パラメーターの変化を含む、請求項１６記載の
方法。 - 【請求項１８】 物理化学的パラメーターの変化が、ｐ
Ｈ値の変化、温度上昇、イオン強度または誘電率の変
化、剪断力の導入、またはこれらの方法の２つまたはそ
れ以上の組合せを含む、請求項１７記載の方法。 - 【請求項１９】 タンパク質製剤の温度を上昇させる、
請求項１８記載の方法。 - 【請求項２０】 タンパク質製剤を３０分〜４時間に亘
って４０〜７０℃の温度に加熱する、請求項１９記載の
方法。 - 【請求項２１】 タンパク質製剤を１時間〜２.５時間
に亘って４５〜６５℃の温度に加熱する、請求項２０記
載の方法。 - 【請求項２２】 減少した凝集物含量を有する医療用タ
ンパク質製剤を製造するための、請求項１から２１まで
のいずれか１項記載の方法の使用。 - 【請求項２３】 凝集物含量が、分離工程を用いないタ
ンパク質製剤に対して、少なくとも約１０％減少されて
いる、請求項２２記載の使用。 - 【請求項２４】 凝集物含量が少なくとも約５０％減少
されている、請求項２３記載の使用。
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