WO2004089403A1 - アルブミン凝集体及び／または不純蛋白質の除去方法 - Google Patents

アルブミン凝集体及び／または不純蛋白質の除去方法 Download PDF

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preparation
impurities
removal membrane
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PCT/JP2004/005086
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Yoshihiro Hayase
Kota Maemura
Rikiichi Tagawa
Hisashi Tanigawa
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Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/38—Albumins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock

Definitions

  • the present invention relates to the field of ethical drugs.
  • it is related with the manufacturing method of the serum albumin formulation which is 1 type of a plasma fraction formulation, and the formulation obtained by the said method. More specifically, a method for removing albumin aggregates and / or impurities, a method for producing an albumin preparation comprising the method for removing alpmin aggregates and / or impurities during the production process, and a method for producing the albumin preparations.
  • the present invention relates to an albumin preparation.
  • the present invention provides a method for producing an albumin preparation that maintains a high yield on an industrial scale, and an albumin preparation with reduced albumin aggregates and / or impurities.
  • Serum alpmin is a protein with a molecular weight of 66,000 Da and is an elliptical molecule consisting of 585 amino acids.
  • Serum albumin is the most abundant protein in plasma, which accounts for about 60% of all proteins, and is synthesized in the liver by the liver. It is involved in maintaining plasma colloid osmotic pressure in blood, neutralizing toxins and maintaining acid-base balance, and is responsible for nonspecific binding to many drugs and compounds and transporting them.
  • Albumin preparations prepared from the above-mentioned serum albumin are used for the treatment of burns, albumin loss due to Nephmouth syndrome, etc., hypoalbuminemia due to reduced albumin synthesis ability, hemorrhagic shock, and the like.
  • Albumin preparations (including heated human plasma proteins) are high-concentration protein preparations with a protein concentration of 4.4 to 25% (albumin content of 80% or 96% or more).
  • the volume per formulation is as large as 20 to 25 OmL, and in its production, it is required to process a large amount and a large volume of protein.
  • albumin preparation is a preparation that has been exposed to a high concentration of alcohol in the alcohol fractionation process in the production process and subjected to liquid heating for 60 hours at 60 ° C for the purpose of virus inactivation. Has been demonstrated by clinical use since 50 years.
  • albumin aggregates are formed in the albumin preparation through the alcohol fractionation and the heat treatment.
  • the causes of the formation of albumin aggregates are as follows: (1) contact with alcohol during alcohol fractionation, (2) aggregation of albumin itself by heat treatment, (3) interaction between albumin and impure protein during heat treatment Aggregation and the like. Although there is no direct knowledge that this aggregate affects the safety of the preparation, the aggregate is a protein modification that does not originally exist in the body, so it should not be contained in the preparation. Is desirable.
  • a purification method of human serum albumin a purification method usually used in protein chemistry, for example, salting-out method, ultrafiltration method, isoelectric precipitation method, ion exchange method, etc. Oral matography, gel filtration chromatography, affinity mouthmatography, etc. are selected or used in combination. Furthermore, liquid heat treatment for the purpose of virus inactivation is widely used at the final stage of the manufacturing process. It is known that a commercial albumin preparation produced by such a method contains 2 to 10% aggregates in the total protein by gel filtration analysis. It is also known that impure proteins other than albumin are present in 1 to 4% of all proteins.
  • Aggregates of human serum albumin are considered to be albumin aggregated by the action of impure proteins that are unstable to heat due to the liquid heat treatment described above.
  • the agglomerates are formed by combining two or more monomers, and the isoelectric point is very similar in chemical properties to the monomers and is usually produced in production. Separation is difficult with the purification method. For this reason, conventional techniques combine several purification methods such as gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity mouthmatography, isoelectric focusing, ammonium sulfate fractionation, and ethanol fractionation. (See Japanese Patent Publication No. 1 1-5 0 9 5 2 5 (Patent No. 2 9 2 6 7 2 2)).
  • impure proteins also contain other proteins such as haptoglobin, transferrin, and hemopexin as raw material-derived proteins, and even after these many purification steps, they are still in the final formulation. % Remaining and reducing impure protein as much as possible is an important manufacturing issue. Disclosure of the invention
  • an object of the present invention is to provide a method for reducing the aggregate content in an albumin preparation and a low-resolved albumin preparation having an aggregate content.
  • Albumin aggregate formed in the alcohol fraction (2) Albumin aggregate formed in the heat treatment, and (3) Albumin and impure protein interacted in the heat treatment. Broadly divided into aggregates. Therefore, the methods for reducing and removing the aggregates of anolebumin preparation are as follows: (1) reducing and removing albumin aggregates before heat treatment; (2) interacting with albumin during heating and coagulating. It was considered that the impure protein to be aggregated was reduced / removed in advance before the heat treatment, and (3) all aggregates generated after the heat treatment were reduced / removed.
  • an albumin aqueous solution containing an aggregate and an impure protein is a virus removal membrane, preferably a virus removal membrane having a pore size of 10 to 20 n ni. It was found that an effect of removing albumin aggregates and / or an impure protein having a molecular weight of about 7 to 300,000 or more can be obtained by filtration using a filter, and the present invention has been completed.
  • the ability to reduce and remove aggregates and impure proteins can be achieved only by a filtration step based on the principle of removal due to the difference in molecular size of the target substance, so that the composition of the chemical solution is not changed.
  • Alpmin monomer can be obtained in higher yield than before, and this makes it possible to provide formulations with better safety and stability. It became.
  • the albumin preparation of the present invention which has been made to solve the above-mentioned problems, is obtained by removing human serum albumin-containing aqueous solution and removing albumin aggregates and / or impure proteins contained in the aqueous solution with a virus removal membrane.
  • the special process is to attach to the process.
  • the virus removal membrane for removing albumin aggregates and impure proteins used in the present invention is preferably a virus removal membrane having a pore size of 10 to 20 nm.
  • a virus removal membrane having a pore size of 10 to 20 nm.
  • it is commercially available under the product names such as Branova 15 N (Asahi Kasei), Ultipore V FD V 20 (Paul), Pyasolve (Millipore)
  • the removal film is a suitable example.
  • albumin which is the main component of the preparation according to the present invention. Specifically, it is derived from mammals such as human, ushi, and rabbit, and is based on gene recombination technology. Examples include those derived from cultured cells, particularly those derived from humans, which are practical, for example, the V fraction obtained by Mr. Korn's cold alcohol fraction.
  • the method for producing an albumin preparation of the present invention includes all of the methods including a step of filtering the aqueous solution containing the alpmin to a virus removal membrane to remove albumin aggregates and impure proteins. That is, it does not deviate from the technical idea of the present invention no matter which stage is included. For example, by carrying out the filtration step of the present application prior to heat treatment for virus inactivation, albumin aggregates that have already been formed or albumin aggregates by interaction with albumin during the heat treatment step are formed. Contaminating proteins can be removed, or if the filtration step is carried out after heat treatment, it is possible to reduce and remove all aggregates produced by heating.
  • an aqueous solution containing albumin may be applied to an anion exchanger or a prefilter with a removal size of 35 to 200 nm before filtration of the virus removal membrane to reduce albumin aggregates and impure proteins.
  • an anion exchanger or a prefilter with a removal size of 35 to 200 nm before filtration of the virus removal membrane to reduce albumin aggregates and impure proteins.
  • the virus removal membrane process removes viruses that are likely to be mixed and reduces the impure protein that is an aggregate-forming factor in the heat treatment.
  • An albumin preparation with a low content can be obtained. Therefore, the albumin preparation obtained by the invention of the present application is safer and more stable because the virus is inactivated by the heat treatment, the virus is removed by the virus removal membrane, and the aggregates and impure proteins are reduced. It is an excellent formulation.
  • an albumin preparation can be prepared, for example, as follows.
  • Anion exchanger equilibrated with acetate buffer at pH 4-5 (preferably 4.4-4.6), EC5mS / cni or less (preferably 1.5 mS / cm or less) (eg DE AE-Sepharose (Amersham ), Q-Sepharose (Amersham 'Falmasia), DEAE-Toyono Kur' (East Soichi), QAE—Toyopearl
  • a pre-treated albumin-containing aqueous solution prepared in the above (2) adjusted to a protein concentration of 5 to 15 w / v% (preferably 6 to: L 0 w / v%) and pH 6 to 7.5 (preferably 6.6 to 7.2), Filter and collect using a filter capable of 35-200 nm size exclusion.
  • Branova 15N (Asahi Kasei) and protein concentration 5-15w / v% (preferably 6-1 0 w / v%), and an aqueous solution containing alpmine adjusted to pH 6 to 7.5 (preferably 6.6 to 7.2) is passed through and collected.
  • Treatment of the present invention Liquid passing through the virus removal membrane
  • the recovered solution obtained in (4) was adjusted so that the protein concentration was 25 w / v%.
  • an ultrafiltration method was used. N-acetiltliptophan sodium and caprylic acid sodium are each added to a concentration of 0.08 mmo 1 per lg of protein, resulting in a solution pH of 6.9 ⁇ 0.5, which has a pore size of 0.2 2 ⁇ Using the following filtration membrane, sterilization filtration was performed to obtain a final Balta.
  • the final Balta heated at 60.0 ⁇ 0.5 ° C for 10 hours or more was aseptically dispensed into vials and sealed tightly.
  • the albumin-containing aqueous solution obtained in (1) of the preparation example was adjusted to a protein concentration of 5 w / v%.
  • Add N-acetyl liptophan sodium and caprylic acid sodium to 0.08 m mo 1 per lg of protein, respectively, and adjust the solution pH to 6.9 ⁇ 0.5, and this was heated to 60.0 ⁇ 0.5 ° C for 10 hours or longer, and ii) this albumin solution was applied to the virus removal membrane of the present invention (Branova 15 N, Asahi Kasei).
  • the albumin solution after filtration at a constant pressure of 5 kgf / cm 2 was measured by a monomer / polymer content test (gel filtration analysis applying the Japanese Pharmacopoeia, general test method, and liquid chromatographic method), respectively. .
  • the results are shown in Table 1.
  • Table 1 As is clear from Table 1, the effect of removing and reducing aggregates by the virus removal membrane treatment has been clarified, and the recovery rate of alpmin monomer is 100% or more, and the aggregate removal effect can be obtained with high efficiency. There was found. table 1
  • the aqueous solution containing albumin obtained by (1) of Preparation Example has a protein concentration of 8 w / V% ( And an albumin solution adjusted to pH 6.98 with a 1 w / V% sodium hydroxide solution, and ii) the albumin solution was removed from the virus removal membrane (Planova 15 N, Table 2 shows the results of the in-gel sedimentation reaction test of the albumin solution after the constant pressure filtration of 0.5 kgf / cm 2 was performed on Asahi Kasei. As is clear from Table 2, the removal effect of celluloblastin and transferrin was revealed by filtration of the virus removal membrane. Furthermore, the reduction effect of haptoglobin and hemopexin was found.
  • Virus removal membrane treatment was performed prior to the heating step to remove and reduce aggregates and impure proteins, and confirmed the effect of reducing the aggregate content in the preparation after heat treatment.
  • ii) Preparation examples (1) to (6) to (4) virus For the alpmin preparations obtained by removing the removal membrane treatment (untreated virus removal treatment), the monomer and polymer content tests (Japanese Pharmacopoeia, General Test Method, Liquid Chromatography Method were applied mutatis mutandis. Gel filtration analysis). The results are shown in Table 3. As is clear from Table 3, the albumin preparation with the virus removal membrane filtration of the present invention has a low dimer and multimer content and has the effect of suppressing the formation of aggregates, compared to the comparative preparation without virus removal membrane treatment. It has been found.
  • Example 3 Cell mouth plasmin (CP), haptoglobin (I-I p), and transferrin (cutter f) contents in the preparations of the present invention and comparative preparations were measured. The results are shown in Table 4.
  • the measurement method of the impure protein was performed by the nephrometry method. As shown in Table 4, it was found that the albumin preparation produced by the method according to the present invention had a plasma protein below the detection limit and contained very little impure protein and substantially no inclusion.

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Abstract

　アルブミン凝集体及び/または不純蛋白質が低減された血清アルブミン製剤の製造方法を提供する。血清アルブミン含有水溶液を、好適には１０～２０ｎｍの孔径を有するウイルス除去膜で除去する工程に付すことからなる。これにより、アルブミン凝集体及び/または不純蛋白質が低減されたより安全性、安定性に優れたアルブミン製剤を製造することができる。

Description

明 細 書
アルプミン凝集体及び/または不純蛋白質の除去方法 技術分野
本願発明は、 医療用医薬品の分野に関する。 詳細には、 血漿分画製剤の一種で ある血清アルブミン製剤の製造方法及び当該方法で得られた製剤に関する。 さら に詳細には、 アルブミン凝集体及び/または不純物の除去方法、 製造工程中に前 記アルプミン凝集体及び/または不純物の除去方法を含んでなるアルブミン製剤 の製造方法、 並びに当該製造方法によって製造されるアルブミン製剤に関する。 本願発明により工業的規模での高い収率を維持したアルブミン製剤の製造方法並 びにアルブミン凝集体及び/または不純物が低減されたアルブミン製剤が提供さ れる。
背景技術
血清アルプミンは分子量 6 . 6万 D aの蛋白質で、 5 8 5個のアミノ酸からなる 楕円状の分子である。 血清アルブミンは全蛋白質中の約 6割を占める血漿中に最 も多く含まれる蛋白質であって、 生体内では肝臓で合成される。 そして、 血液中 で血漿膠質浸透圧の維持、 毒物の中和や酸塩基平衡の維持に関与しており、 また 多くの薬物や化合物と非特異的に結合し、 それらを運搬する役割を担う。
上記血清アルブミンを製剤化したアルブミン製剤は、 火傷、 ネフ口ーゼ症候群 等によるアルブミン喪失およびアルブミン合成能低下による低アルブミン血症、 出血性ショックなどの治療に用いられている。 アルブミン製剤 （加熱ヒト血漿蛋 白を含む） は、 蛋白質濃度が 4 . 4〜2 5 % (アルブミン含量が 8 0 %以上もし くは 9 6 %以上） という高濃度の蛋白質製剤である。 また、 製剤 1本あたりの容 量も 2 0〜2 5 O m Lと大量であり、 その製造においては大量かつ大容量の蛋白 質を処理することが求められる。
アルブミン製剤はその製造工程において、 アルコール分画工程では高い濃度の アルコールに曝され、 またウィルス不活化を目的とした 6 0 °C 1 0時間の液状加 熱が施された製剤であり、 そのウィルスに対する安全性は 5 0年来の臨床使用に より実証されている。 一方、 これらアルコール分画及び加熱処理を経ることで、 アルブミン製剤中には、 アルブミンの凝集体が形成される。 アルブミン製剤中に 存在するアルブミン凝集体形成の原因としては、 （ 1 ) アルコール分画時のアル コールとの接触、 （2 ) 加熱処理によるアルブミン自身の凝集、 ( 3 ) 加熱処理 におけるアルブミンと不純蛋白質との相互作用による凝集等が挙げられる。 この 凝集体が製剤の安全性に影響を及ぼす直接的な知見はないが、 当該凝集体は元来 生体中に存在していない蛋白質の変性物であることから、 製剤中に含有されてい ないことが望ましい。
従来の技術においては、 一般に、 ヒト血清アルブミンの精製方法としては、 蛋 白質ィ匕学において通常使用される精製方法、 例えば、 塩析法、 限外濾過法、 等電 点沈殿法、 ィォン交換ク口マトグラフィ一法、 ゲル濾過クロマトグラフィ一法、 ァフィ二ティーク口マトグラフィ一法等が選択され、 あるいは組み合わせて用い られる。 さらに製造工程の最終段階ではウィルス不活ィヒを目的とした液状加熱処 理が汎用されている。 このような方法で製造される市販のアルブミン製剤は、 製 剤中にゲル滤過分析で全蛋白質中の 2〜 1 0 %の凝集体が存在することが知られ ている。 また、 アルブミン以外の不純蛋白質も全蛋白質中で 1〜4 %存在してい ることが知られている。
ヒト血清アルブミンの凝集体は、 上記の液状加熱処理により共在する熱に不安 定な不純蛋白質の作用でアルブミンが凝集化したものと考えられている
(Infusionstherapie, 16, 160， 160-164 (1989) ；および Vox Sang. 67, 125- 131 (1994)を参照） 。 当該凝集体は、 単量体が 2分子或いはそれ以上結合して形 成されるものであって、 等電点ゃ化学的性状が単量体と非常に似通っており、 通 常生産で行われる精製方法では分離が困難である。 そのため、 従来の技術ではゲ ル濾過クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティーク 口マトグラフィー、 等電点分画処理、 硫安分画処理、 ェタノ一ル分画処理など数 種類の精製方法を組み合わせて除去されてきた （特表平 1 1 - 5 0 9 5 2 5 (特 許第 2 9 2 6 7 2 2号） を参照） 。 また、 不純蛋白質についても、 原料由来の蛋 白質としてハプトグロビン、 トランスフェリンやへモぺキシン等の他の蛋白質が 夾雑蛋白質として含まれており、 これら多くの精製工程を経てもなお、 最終製剤 中に数％残存し、 不純蛋白質を極力低減することが製造上の重要な課題となって いる。 発明の開示
(発明が解決しようとする技術的課題）
精製方法を複数組み合わせると、 回収率の低下と共に生産性の低下を招く場合 が多い。 工業的観点から、 なるべく精製工程を少なくして凝集体及び不純蛋白質 を効率的に除去し、 かつアルブミンの単量体が高収率で回収できる方法の開発が 望まれている。
(その解決方法）
本願発明は、 薬液中のウィルス等病原体の除去を目的として使用されているゥ ィルス除去膜による濾過をアルブミン製剤の製造工程において行うことで、 製剤 中の凝集体含量を低減できることを見出し、 完成したものである。 すなわち、 本 願発明はアルブミン製剤中の凝集体含量を低減させる方法及び凝集体含量の低レヽ アルブミン製剤を提供することを目的とする。
アルコール分画及び加熱処理を経て得られたアルブミン製剤中の凝集体は、
( 1 ) アルコ一ル分画において生じたアルブミンの凝集体、 ( 2 ) 加熱処理にお いて生じたアルブミンの凝集体、 及び （3 ) 加熱処理においてアルブミンと不純 蛋白とが相互作用して生じた凝集体に大別される。 このことから、 ァノレブミン製 剤の凝集体を低減 ·除去する方法としては、 （ 1 ) 加熱処理前にアルブミンの凝 集体を低減 ·除去すること、 ( 2 ) アルブミンと加熱中に相互作用して凝集体と なる不純蛋白質を加熱処理前に予め低減 ·除去すること、 及び （3 ) 加熱処理後 に生じた全ての凝集体を低減 ·除去することが考察された。
本願発明者らは、 上記状況を鑑みて鋭意研究を進めた結果、 凝集体及び不純蛋 白質を含有するアルブミン水溶液をウィルス除去膜、 好ましくは 1 0〜 2 0 n ni の孔径を有するウィルス除去膜を用いて濾過することで、 アルブミンの凝集体及 び/または分子量約 7〜 3 0万以上の不純蛋白質の除去効果が得られることを見 出し、 本願発明を完成するに至った。
さらに、 本願発明では対象物質の分子サイズの相違による除去という原理に基 づレヽた濾過工程のみで凝集体と不純蛋白質の低減と除去が可能なこと力 ら、 薬液 の組成を変化させることなく、 これまでより高収率でアルプミン単量体を得るこ とができ、 これにより、 より安全性 ·安定性に優れた製剤を提供することが可能 となった。
上記の課題を解決すべくなされた本願発明のアルブミン製剤は、 製造方法にお いて、 ヒ ト血清アルブミン含有水溶液を、 該水溶液中に含まれるアルブミン凝集 体及び/または不純蛋白質をウィルス除去膜で除去する工程に付すことを特 ί敷と する。
本願発明で用いられるアルブミン凝集体及不純蛋白質を除去するウィルス除去 膜としては、 1 0〜2 0 n mの孔径を有するウィルス除去膜が好ましい。 この要 件を満たすウィルス除去膜であれば特段の制約はないが、 例えば、 ブラノバ 1 5 N (旭化成) 、 ウルチポア V F-D V 2 0 (ポール) 、 パイァソルブ （ミリポ ァ） 等の製品名で市販されている除去膜は好適な例として挙げられる。
本願発明に係る製剤の主成分であるアルブミンの由来には、 特に制限がなく具 体的には哺乳動物、 例えばヒ ト、 ゥシ、 ゥサギ等に由来するもの、 また、 遺伝子 組換え技術に基づく培養細胞に由来するもの等が挙げられ、 特にヒト由来のもの は実用的であり、 例えば、 コーン氏の冷アルコール分画によって得られた第 V画 分等が例示される。
本願発明のアルブミン製剤の製造方法は、 上記アルプミンを含有する水溶液を ウィルス除去膜に濾過し、 アルブミン凝集体及び不純蛋白質を除去する工程を含 むものであれば、 すべてを包含する。 すなわち、 どの段階で当該工程が含まれよ うとも本願発明の技術思想から外れるものではない。 例えば、 ウィルス不活化を 目的とする加熱処理以前に本願の濾過工程を実施することにより、 すでに形成さ れたアルブミン凝集体または加熱処理の工程中にアルブミンとの相互作用により アルブミン凝集体を形成させる夾雑蛋白質を除去することができ、 あるいは当該 濾過工程を加熱処理後に行えば、 加熱によって生じる全ての凝集体を低減 ·除去 することが可能となる。
また、 必要に応じてウィルス除去膜濾過前にアルブミンを含有する水溶液を陰 イオン交換体や除去サイズが 3 5〜2 0 0 n mのプレフィルターに供してアルブ ミンの凝集体及び不純蛋白質の低減 ·除去を前処理として実施することも、 本願 発明の効果を助長する好ましい実施態様である。
(従来技術より有効な効果） 本願発明の製造方法によれば、 ウィルス除去膜工程により、 混入が危惧される ウィルスを除去すると共に加熱処理での凝集体形成因子である不純蛋白質を低減 化することができるため、 凝集体及び不純蛋白質含量の少ないアルブミン製剤を 得ることができる。 従って、 本願発明により得られたアルブミン製剤は、 加熱処 理でウイルスが不活化されていると共にウィルス除去膜でゥィルスが除去され、 凝集体及び不純蛋白質が低減化された、 より安全性、 安定性に優れた製剤である。 発明を実施するための最良の形態
本発明に従い、 アルブミン製剤は例えば以下のようにして調製することができ る。
(1) アルブミン含有水溶液の調製
コーン氏のアルコール分画によって得られた第 V画分ペーストに、 注射用水 (日局） をペースト重量の 2倍以上カ卩ぇ撹拌溶解し、 P艮外濾過法により脱アルコ ールしたアルブミン画分を、 pH4〜5 (好ましくは 4.4〜 4.6 ) 、 EC 5m S/cm以下 （好ましくは 1.5mS/cm以下） 、 蛋白濃度 5〜15w/v% (好 ましくは 8〜12w/v%) に調整する。
( 2 ) ィオン交換体による前処理の方法
pH4〜5 (好ましくは 4.4〜 4.6) 、 EC5mS/cni以下 （好ましくは 1. 5 m S / c m以下) の酢酸バッファ一で平衡化した陰ィオン交換体 (例えば、 D E AE—セファロース (アマシャム ' ファノレマシア） 、 Q-セファロース （アマ シャム ' フアルマシア） 、 DEAE-トヨノくール' (東ソ一) 、 QAE—トヨパール
(東ソ一） ） に、 前記 （1) で調製されたアルブミン含有水溶液を展開し、 素通 り画分を回収する。
(3) フィルターによる前処理の方法
蛋白濃度 5〜15w/v% (好ましくは 6〜： L 0 w/v%) 、 pH6〜7.5 (好ましくは 6.6〜 7.2) に調整された前記 （2) の前処理をしたアルブミン 含有水溶液を、 35〜200 nmのサイズ排除が可能なフィルターを用いて濾過 し、 回収する。
(4) 本願発明の処理： ウィルス除去膜への通液
ブラノバ 15N (旭化成） に、 蛋白濃度 5〜15w/v% (好ましくは 6〜1 0 w/v%) 、 pH6〜7.5 (好ましくは 6.6〜7.2) に調整されたアルプミ ン含有水溶液を通液し、 回収する。
(5) バルタ調製
(4) で得られた回収液を、 蛋白濃度を 5〜30 w/v% (通常 5または 20 〜25w/v%) になるように調整する。 この際、 蛋白の濃縮が必要な場合には 限外濾過法を用いた。 蛋白 l g当り、 N-ァセチルトリプトフアンナトリゥム及 ぴカプリル酸ナトリウムをそれぞれ 0.08 mm o 1となるように加え、 溶液 p Hを 6.9±0.5とし、 これを孔径 0.22 μπι以下の濾過膜を用いて除菌濾過 して最終パルクとする。
(6) 加熱処理及び小分け分注
最終バルタを 60.0 ± 0. 5 °Cで 10時間以上加熱したものを、 所定量ずつ バイアルに無菌的に分注して、 密栓する。
以下に、 調製例及び実施例に従って本願発明を詳説するが、 本願発明はこれら 実施例に何等限定されるものではない。
調製例
(アルブミン製剤の調製）
(1) アルブミン含有水溶液の調製
コ一ン氏のアルコール分画によつて得られた第 V画分ペーストに、 注射用水 (日局） をペースト重量の 2倍以上カ卩ぇ撹拌溶解し、 限外濾過法により脱アルコ ールしたアルブミン画分を、 pH4.54、 EC 1.5mS/cm以下、 蛋白濃度
12 w/v%に調整した。
(2) イオン交換体による前処理の方法
pH4. 51、 EC 5mS/c m以下の酢酸バッファ一で平衡化した陰イオン交 換体 （Q—セファロース （アマシャム . フアルマシア） ） に、 前記 （1) で調製 されたアルブミン含有水溶液を展開し、 素通り画分を回収した。
(3) フィルターによる前処理の方法
蛋白濃度 8w/v%、 pH 6.98に調整された前記 （2) の前処理をしたアル ブミン含有水溶液を、 100 nmのサイズ排除が可能なフィルターを用いて濾過 し、 回収した。 ( 4 ) 本願発明の処理： ウィルス除去膜への通液
ブラノバ 1 5N (旭化成） に、 蛋白濃度 8w/v%、 pH6. 98に調整された アルブミン含有水溶液を通液し、 回収した。
(5) バルタ調製
(4) で得られた回収液を、 蛋白濃度を 25w/v%になるように調整した。 この際、 蛋白の濃縮が必要な場合には限外濾過法を用いた。 蛋白 l g当り、 N- ァセチルトリプトフアンナトリゥム及びカプリル酸ナトリゥムをそれぞれ 0. 0 8mmo 1となるように加え、 溶液 pHを 6. 9±0. 5とし、 これを孔径 0. 2 2 μπι以下の濾過膜を用いて除菌濾過して最終バルタとした。
(6) 加熱処理及び小分け分注
最終バルタを 60. 0 ± 0. 5 °Cで 1 0時間以上加熱したものを、 所定量ずつ バイアルに無菌的に分注して、 密栓した。
実施例 1
(凝集体の除去 ·低減化効果とアルブミン単量体の回収率の確認）
本願発明による凝集体の除去 ·低減化効果とアルブミン単量体の回収率の確認 をするために、 i ) 調製例の （1) により得られるアルブミン含有水溶液を蛋白 濃度 5w/v%となるように注射用水 （日局） で調整し、 蛋白 l g当り、 N-ァセ チルトリプトフアンナトリゥム及びカプリル酸ナトリゥムをそれぞれ 0. 08 m mo 1 となるように加え、 溶液 pHを 6. 9 ± 0. 5とし、 これを 60. 0 ± 0. 5 °Cで 1 0時間以上加熱したアルブミン溶液と、 ii)このアルブミン溶液を本願 発明のウィルス除去膜 (ブラノバ 1 5 N、 旭化成) に 0. 5 k g f /cm2の定圧 濾過を実施した後のアルブミン溶液を、 それぞれ単量体 ·重合体含量試験 （日本 薬局方、 一般試験法、 液体クロマトグラフ法を準用したゲル濾過分析） により測 定した。 その結果を表 1に示す。 表 1から明らかなように、 ウィルス除去膜処理 による凝集体の除去及び低減化効果が判明し、 さらにアルプミン単量体の回収率 も 100%以上で高効率に凝集体の除去効果が得られることが判明した。 表 1
ウィルス除去膜濾過による凝集体の除去効果とアルプミン単量体の回収率
Figure imgf000009_0001
実施例 2
(ウィルス除去膜による不純蛋白質の除去及び低減化効果の確認）
本願発明のウィルス除去膜による不純蛋白質の除去及び低減化効果を確認する ために、 i ) 調製例の （1 ) により得られるアルブミン含有水溶液を蛋白濃度 8 w/ V %となるように注射用水 （日局） で調整し、 1 w/ V %水酸化ナトリウム溶 液で p Hを 6 . 9 8に調整したアルブミン溶液と、 ii)このアルブミン溶液を本願 発明のウィルス除去膜 （プラノバ 1 5 N、 旭化成） に 0 . 5 k g f / c m2の定圧 濾過を実施した後のアルブミン溶液を、 それぞれゲル内沈降反応試験を実施した 結果を表 2に示す。 表 2力 ら明らかなようにウィルス除去膜濾過によりセルロブ ラスミン、 トランスフェリンの除去効果が判明した。 さらに、 ハプトグロビン、 へモぺキシンの低減化効果が判明した。
表 2
ウィルス除去膜濾過による主な血漿蛋白質の除去及び低減化 （ゲル内沈降反応試 験）
Figure imgf000009_0002
一：未検出
実施例 3
(製剤中の凝集体含量を低減する効果の確認)
ウィルス除去膜処理を加熱工程に先立って実施して凝集体及び不純蛋白質を除 去及び低減化し、 加熱処理後の製剤中の凝集体含量を低減する効果を確認するた めに、 i) 本願発明の調製例 (1) 〜 （6) により得られたアルブミン製剤 （ゥ ィルス除去膜処理実施） と、 ii) 調製例 (1) 〜 （6) より （4) のウィルス除 去膜処理除いた工程によって得られたアルプミン製剤 （ウィルス除去膜処理未実 施） について、 それぞれ単量体 ·重合体含量試験（日本薬局方、 一般試験法、 液 体クロマトグラフ法を準用したゲル濾過分析）により測定した。 その結果を表 3 に示す。 表 3から明らかなようにウィルス除去膜処理未実施の比較製剤に比べ、 本願発明のウィルス除去膜濾過を実施したアルブミン製剤は二量体及び多量体の 含量が低く、 凝集体形成抑制効果があることが判明した。
表 3
ウィルス除去膜濾過によるアルブミン製剤の凝集体の抑制効果
Figure imgf000010_0001
実施例 4
(製剤中の不純蛋白質含量を低減する効果の確認）
ウィルス除去膜処理を加熱工程に先立つて実施して凝集体及び不純蛋白質を除去 及び低減化し、 加熱処理後の製剤中の不純蛋白質含量を低減する効果を確認する ために、 実施例 3に記載の本願発明製剤及び比較製剤中のセル口プラスミン （C P) 、 ハプトグロビン (I- I p ) 、 トランスフェリン (丁 f ) 含量の測定を行った。 その結果を表 4に示す。 尚、 不純蛋白質の測定法はネフエロメトリー法により行 つた。 表 4に示すとおり、 本願発明による方法で製造したアルブミン製剤は、 い ずれの血漿蛋白質も検出限界以下であり、 不純蛋白質が極めて少なく実質的に含 まれていないことが判明した。
表 4
ウィルス除去膜濾過によるアルブミン製剤の不純蛋白質の除去効果
本願発明製剤 比較製剤
25%製剤におい CP (mg/d L) ≤ 0.5 ≤ 0.5 て Hp (mg/d L) ≤ 0.5 0. 7
T f (mg/d L) ≤ 1.0 ≤ 1.0

Claims

請 求 の 範 囲
1 . アルプミンの凝集体及び/または不純物を含有する溶液をゥィルス除去膜に 通液させることを特徴とする、 アルブミン凝集体及び/または不純物の除去方法。
2 . ウィルス除去膜が 1 0〜 2 0 n mの孔径を有するものである請求項 1記載の アルブミン凝集体及び/または不純物の除去方法。
3 . アルブミンの凝集体及び/または分子量約 7〜 3 0万以上の不純蛋白質が除 去される、 請求項 1または請求項 2に記載のアルブミン凝集体及び/または不純 物の除去方法。
4 . 請求項 1ないし 3のいずれかに記載のアルブミン凝集体及び/または不純物 の除去方法を含んでなる、 アルブミン製剤の製造方法。
5 . アルブミンの凝集体及び/または不純物を含有する溶液をウィルス除去膜に 通液させる工程が、 ウィルス不活性化を目的とする溶液の加熱処理工程の後に実 施されるものである、 請求項 4記載のァルブミン製剤の製造方法。
6 . アルプミンの凝集体及び/または不純物を含有する溶液をゥィルス除去膜に 通液させる工程が、 ウィルス不活性ィヒを目的とする溶液の加熱処理工程の前に実 施されるものである、 請求項 4記載のアルブミン製剤の製造方法。
7 . アルブミンの凝集体及び/または不純物を含有する溶液をウィルス除去膜に 通液させる工程の前にアルブミンの凝集体及び/または不純蛋白質の低減 ·除去 のための前処理工程を実施する、 請求項 4ないし 6のいずれかに記載のアルブミ ン製剤の製造方法。
8 . 前処理工程を陰イオン交換体または除去サイズが 3 5〜2 0 O n mのプレフ ィルターを用いて行う、 請求項 7記載のアルブミン製剤の製造方法。
9 . 請求項 4ないし 8のいずれかに記載のアルブミン製剤の製造方法によって製 造される、 アルブミン凝集体及び zまたは不純物が低減されたアルブミン製剤。
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