CA1101332A

CA1101332A - Simplified method for preparation of high yield, high purity factor viii concentrate

Info

Publication number: CA1101332A
Application number: CA270,497A
Authority: CA
Inventors: Edward Shanbrom
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1976-01-30
Filing date: 1977-01-26
Publication date: 1981-05-19
Also published as: ES455473A1; NO145563C; SE7700864L; DE2703620A1; JPS52102410A; GB1557609A; AT354632B; FR2339621A1; DK146855C; NL7700927A; NL179290B; SE442953B; FR2339621B1; NO145563B; ATA53277A; NL179290C; DE2703620C2; AR214625A1; BE850852A; DK146855B

Abstract

Procédé de préparation d'un concentré de Facteur VIII, caractérisé par le fait qu'il comprend l'étape consistant à maintenir une solution tampon contenant le Facteur VIII et environ 6% de polyol à une température d'environ 0 à 5.degree.C jusqu'à ce que la précipitation se produise.A method of preparing a Factor VIII concentrate, characterized in that it comprises the step of maintaining a buffer solution containing Factor VIII and about 6% polyol at a temperature of about 0 to 5.degree. C until precipitation occurs.

Description

l~lL01332 On a décrit plusieurs procédés d:Lfférents pour la produc-tion du facteur antih~mophilique (AHF ou Facteur VIII), en vue d'une utilisatlon th~rapeutique, par exemple : précipltation selective, absorption et élution fractionnées, extraction en milieu faiblement ionique et chromatographie. Les produits chimiques ~es plus fr~uemment utilis~s pour la précipitation comprennent l'alcool, l'acide tannique, le sul~ate d'ammonium, I la glycine et le polyéthylène glycol. Bien que la purification ! du Facteur VIII entraine l'élimination diun certain nombre d'autres protéines plasmatiques, le fibrinogène esf, parmi ce6 protéines, de loin la plus importante et la plus gênante, en par-ticulier lorsqu'il est dénaturé par des procéd~s tels que la précipitation par l'alcool, la congélation et la d~congélation.
Ce fibrinogène dénaturé nuit ~ la filtration de l'AHF, provoque des pertes appréciables d'AHF pendant les étapes de puri~ication et diminue la solubilité du produit lyophilisé dans le fluide de reconstitution. Ainsi tout proc~d~ de purification de l'AHF
necessite l'élimination de quantités appréciables de fibrinog~-ne Les techniques de précipitation s~lective d~crites ci~dessus sont destinées a cela mais toutes ont l'inconvénient de dénaturer encore plus le-fibrinog~ne et llAHF ou d'occasionner des pertes - non souhaitables d'AHF.
- Les procedés utilisant la simple précipitation par le froid sans produits chimiques (cryopr~cipitation) sont limit~s aux productions de faibles quantités de Facteur VIII, habituellement dans les banques de sang, et aboutissent ~ des niveaux eleves de fibrinogène dans le sang lors de l'utilisation en thérapeuti-gue, ce qui est consideré comme indésirable par certains experts - en la matiere.
Les procédés qui comportent l'extraction du Facteur VIII
a partir de la cryoprécipitation dans des tampons de faible force ionique, tout en diminuant, dans une certaine mesure, la teneur en fibrinogène du produit final donnent encore une teneur en pro-téine indesixablement ~levée, nécessitent un é~uipement spécial et des procédés de oe~ntrifugation et sont limités en ce qui concerne la quantite totale d'AHF qui peut 8tre extraite du cryo-précipité sans nuire ~ la purification. O
D'autres problemes communément associ~s ~ la fabrication à grande échelle de l'AHF sont notamment la contamination du pro-4~ duit final par des substances pyrogènes, des isohemagglutinineset des virus qui provoguent 1 'hépatite (antig~ne associ~, de MK/ S. 2 .
1~3)133Z
, ,--'.
l'hepatite (HAA). Certains précipitants chimi~ues favorisent la présence de ces contaminants ind~sirables. Le polyéthylène gly-ccl est maintenant communément utilisé dans la production de concentr~is de Facteur VIII de grande pureté, mais ces techniques utilisent des concentrations de polymère si élevees que des ~tapes ultérieures de lavage et de reprécipitation sont nécessai-res pour eliminer du produit final les quantités en exc~s de po-lyéthylène glycol. Ces proc~idés conduisent ~lors ~ de nouvelles pertes indésirables d'AEIF. On cite ~ ce sujet, Wickerhauser M. :
Large-scale fractionation of Factor VIII- Concentrate from cryo-ethanol pre~ipitate (référence 1) ; Shanbrom, E. ~ Fekete, L. :
Production of stable high-potency human A~F using polyethylene ~lycol and glycine to fractionate a cryoprecipitate of AHF
concentrate , U.S. Patent No.3,631,018 -(reférence 2); Sgouris, 15 J . T. et Wickerhauser, M. : Vse of frozen cryoprecipitate for the preparation of clinical Factor VIII concen~rate, Trans~usion,13:~9 1973(référ.3);~ewman, Johnson, A.J., Karpatkin, M.H. et Puszkin, S. : Methods for the production of clinically effective interme-diate and high-purity Factor VIII concentrates , Brit.J.Haemat, 1971 211,(refer.4); ~ekete, L.F. and Holst, S.L. : Stabilization of AHF using Heparin, V.S. Patent N~ 3,803,115,(référence 5).
Le procédé d~icrit ici élimine virtuellement les probl~mes susmentionn~s, ne comporte pas les inco~v~nients associ~s aux techniques de précipitation chimique décrites précédemment ~it re~ose sur le simple pr~céd~ de la pr~cipitation s~ilective à froid du fibrinogène, de ses produits de dénaturation et de degradation, et de la concentrati~n selective de Facteur VIII par de petites qua~tités de polyol, par exemple de polyethylèneglycol ou de po-lyol Pluronic . L'elimination du fibrinog~ne, comme expli~u~
ci-après entra~ne également l'élimination de ses produits de d~inaturation et de dégradation.
L'~limination s~ilective du fibrinog~ne sans perte associ~e de ~acteur VIII n'a en gen~ral pas été effectuée précédemment en tant que m~ithode pratique pour la fabrication ~ grande ~chelle d'un c~ncentré purifie de AHF. En effet, Wickerhauser souligne l'importance de la limitation de dur~e et de la temp~irature d'~x-traction de l'AHP:"Des rendements un peu plus ~lev~is en AH~ sont obtenus par extraction prolong~e au tampon-Tris ~ 30~C pendant plus de 60 minutes, mais l'extrait est de plus en plus contaminé
par des agrégats de fibrinogène, ce qui rend le concentr~ final MK/ S.2 *Marque de Commerce ,3~
, difficilement filtrable".
Une 'echnique utilisant la pr~cipitation sélective de fibrinogène a basse temp~rature pour la fabricati~r~ ~ grande échelle avec un ren-dement ~levé de concentr~ de Fac~eur VIII de yrande pureté fait 1'ob-~et de 1~ demande de brevet nC258~324 dépos~e aux Canada le 3 Aout 1976~, de E. Shanbrom, intitul~e : "A simple method ~or the production of high-yield, high-purity Fact~ur VIII, (R~f.7). 11 est indiq~e que la préparation pourrait atre en~ore raffinee et concen-trée en utilisant une précipitation au poly~thylène glycol (P~G) froid.
Jusque récemment tous les procédés utilisant du PEG dans la fa-brication de concentrés d'AHF n~cessitent une ~tape additionnelle de lavage et/ou de repr~cipitation avec de la glycine ou de l'alcool parcP que le polym~re est utilisé ~ concentrations élev~es (10-12%), (voir les r~férences précitees). On a récemment utilisé l'id~e de précipitation ~ froid avec du PEG. Vermeer, C., Soute, B.A.~S., et Brummelhuis, H.G.J. : Improvement of the preparation of Factor VIII
Concentrates. Proc. of Int. Soc. ~aemos~asis and Thrombosis, Paris, July, 1975. (Réf.8). Cependant, la concentration de PEG u~ilis~e pour pr~cipiter le fibrinogène est de 2 ~ ~ seulement, ce ~ui c~nduit ~
obtenir un produit moins pur. De plus, ces auteurs n'ont pas consid~-ré comme importante ia concentration de protéines, ils ont utilis~
du mandelate pour éviter une préc~pitation irr~versible du fibrin~ge-ne et, ~ar cons~quent, ont obtenu un produit consid~rable~ent moins l ~ lL01332 Several processes have been described:
tion of antih ~ mophilic factor (AHF or Factor VIII), in view of a therapeutic use, for example: precipltation selective, fractional absorption and elution, extraction in weakly ionic medium and chromatography. Products more commonly used chemicals for precipitation include alcohol, tannic acid, ammonium sul ~ ate, I glycine and polyethylene glycol. Although the purification ! of Factor VIII causes elimination of a number other plasma proteins, fibrinogen esf, among ce6 protein, by far the most important and most annoying, in par particular when it is denatured by procedures such as alcohol precipitation, freezing and freezing.
This denatured fibrinogen harms ~ filtration of AHF, causes appreciable losses of AHF during the purification stages and decreases the solubility of the lyophilized product in the fluid of reconstruction. So any process of AHF purification requires the elimination of appreciable quantities of fibrinog ~ -ne The selective precipitation techniques described above are intended for this but all have the disadvantage of distorting even more le-fibrinog ~ ne and llAHF or to cause losses - not desirable from AHF.
- Processes using simple precipitation by cold without chemicals (cryopr ~ cipitation) are limited to production of small amounts of Factor VIII, usually in blood banks, and lead to high levels of fibrinogen in the blood when used therapeutically what is considered undesirable by some experts - in the matter.
Processes that involve the extraction of Factor VIII
from cryoprecipitation in low force buffers ionic, while decreasing, to a certain extent, the content in fibrinogen of the final product still give a content of pro-indefinitely raised teat, require special equipment and methods of oe ~ ntrifugation and are limited in that concerns the total amount of AHF that can be extracted from the cryopreservation precipitated without harming ~ purification. O
Other problems commonly associated with manufacturing large-scale AHF include contamination of the pro-4 ~ final product with pyrogenic substances, isohemagglutinins and viruses which provoke hepatitis (antigen not associated, MK / S. 2 .
1 ~ 3) 133Z
,, - '.
hepatitis (HAA). Certain chemical precipitants promote the presence of these unsurable contaminants. Polyethylene gly-ccl is now commonly used in the production of Concentrate of Factor VIII of high purity, but these techniques use such high polymer concentrations that ~ subsequent washing and reprecipitation steps are necessary res to remove from the final product excess quantities of po-lyethylene glycol. These proc ~ ideas lead ~ when ~ new unwanted AEIF losses. We quote on this subject, Wickerhauser M.:
Large-scale fractionation of Factor VIII- Concentrate from cryo-ethanol pre ~ ipitate (reference 1); Shanbrom, E. ~ Fekete, L.:
Production of stable high-potency human A ~ F using polyethylene ~ lycol and glycine to fractionate a cryoprecipitate of AHF
concentrate, US Patent No.3,631,018 - (reference 2); Sgouris, 15 J. T. and Wickerhauser, M.: Vse of frozen cryoprecipitate for the preparation of clinical Factor VIII concen ~ rate, Trans ~ usion, 13: ~ 9 1973 (ref. 3); ~ ewman, Johnson, AJ, Karpatkin, MH and Puszkin, S.: Methods for the production of clinically effective interme-diate and high-purity Factor VIII concentrates, Brit.J. Haemat, 1971 211, (refer.4); ~ ekete, LF and Holst, SL: Stabilization of AHF using Heparin, VS Patent N ~ 3,803,115, (reference 5).
The process described here virtually eliminates the problems above, does not include the inco ~ v ~ nients associated with chemical precipitation techniques described above ~ it re ~ dare on the simple pr ~ ced ~ of the pr ~ cipitation s ~ ilective cold fibrinogen, its denaturation and degradation products, and selective Concentration of Factor VIII by small qua ~ tities of polyol, for example polyethylene glycol or po-lyol Pluronic. Elimination of fibrinog ~ ne, as expli ~ u ~
below entered also does not eliminate its products from of inaturation and degradation.
Selective elimination of fibrinogen without associated loss of ~ actor VIII has not generally been done previously as a practical method for manufacturing ~ large ~ scale of a purified center of AHF. Wickerhauser points out the importance of limiting the duration and the temperature of ~ x-traction of AHP: "Yields slightly higher ~ is in AH ~ are obtained by prolonged extraction ~ e with Tris buffer ~ 30 ~ C for more than 60 minutes, but the extract is increasingly contaminated by fibrinogen aggregates, which makes the concentrate ~ final MK / S.2 *Trademark , 3 ~
, difficult to filter ".
A technique using selective fibrinogen precipitation at low temp ~ rature for large-scale manufacturing ~ r ~ ~ with a dement ~ levé de concentr ~ de Fac ~ eur VIII of yrande purity made 1'ob-~ and 1 ~ patent application nC258 ~ 324 filed in Canada on 3 August 1976 ~, by E. Shanbrom, entitled: "A simple method ~ or the production of high-yield, high-purity Fact ~ ur VIII, (R ~ f.7). 11 is indicates that the preparation could be refined and concentrated trée using poly ~ thylene glycol precipitation (P ~ G) cold.
Until recently all processes using PEG in the fa-brication of AHF concentrates requires an additional washing and / or repr ~ cipitation with glycine or alcohol since the polymer is used at high concentrations (10-12%), (see the aforementioned references). We recently used the idea precipitation precipitation ~ cold with PEG. Vermeer, C., Bunker, BA ~ S., and Brummelhuis, JGH: Improvement of the preparation of Factor VIII
Concentrates. Proc. of Int. Soc. ~ aemos ~ asis and Thrombosis, Paris, July, 1975. (Ref. 8). However, the concentration of PEG u ~ ilis ~ e for pr ~ precipitate fibrinogen is 2 ~ ~ only, this ~ ui c ~ nduit ~
get a less pure product. In addition, these authors did not consider -D as important ia protein concentration, they used ~
Mandelate to avoid prec ~ ir ~ versible pitation of fibrin ~ ge-ne and, ~ ar cons ~ quent, have obtained a considerable product ~ ent minus

2~ pur et un rendement moindre. De façon similaire, le procédé de Shan-~rom et Fekete tarticle cit~ ci-dessus) utili~e une concentration de proteines relativement faible pendant les ét~pes de précipitation au PEG, c'est-~-dire 1 volume de précipité dans 10 volumes de ~ampon dis-solvant, e~ cela oDnduit ~ un rendement tra~ faible et à une puret~
limit~e. Ces auteurs de m~me que Johnson et al (r~f.4~ et Johnson et al "Antihemophilic factor prepared from blood plasma using p~ly-ethylene glycol. U.S. Patent N~3,652,530, (r~f.6) ont utilis~ 10-12%
de PEG pour la concentxatlon finale de AHF, ce qui a n~cessité
une etape ~uppl~mentaire de dissoluticn et de repr~c~pitatlon par la glycine ou par l'~thanol a froid pour r~duire la teneur en PEG
du produit final. ~-~
~ ne autre preuve que la concentration de proteines et la précipitation au PEG
à frold sont importantes et conduisent à un produit original réside dans le fait que les isohemagglutinines "incomplètes" (anticorps) ~ont virtuellement éliminees, ce qui LK/ S.2 . .
. . .; ,, , ~ ~, ; :, . ., ,., , : :
l33~:
4 . -~vite le risque de reactions hémolytiques ~ui pourraient surve- i nir lorsque des injections massives de concentrés actuellement disponibles dans le co~erce sont nécessaires.
(Voir:Seeler,R.A.Telischi, M., Langehennig, P.L. et Ashenhurst, J.B. : Anti-A and Anti-B titers in coagulation concentrates.
Abst.Of Int. Soc~ of Blood Transf., Helsinki,1975,(ref.9).
Une autre caractéristique originale du produit de l'inven-tion est le haut degré de pureté (c'est-~-dire la faible teneur en proteine) en particulier en ce qui concerne la quantité de fibrinogène mesurable. Ce haut degré de purete donne un produit tres sol~ble, si soluble en fait qu'aucun matériau non dissous ne subsiste dans le flacon apres reconstitution. Ceci élimine - le besoin d'utiliser un filtre spécial ou une aiguille filtran-te pour eliminer la protéine non dissoute avant l'injection au ; 15 patient. On évite ainsi la contamination du concentré de Facteur VIII par des particules metalliques (Couper~ I.A., McAdam, J.H.
MacRenZie, M.S. et Davidson, J.~ Contamination of Factor VIII
Concentrates with metal particles. Lancet, Dec.~1,1974, p.l515 ~ (réf.10).
i-2o Le procédé décrit, ou partie de celui-ci, est egalement uti-le pour le "re-traitement" de lots pyrogéniques de concentres de Facteur VIII fabriquespar tout autre procédé, ce qui trans~or-¦ me le 'acteur ~III pyrogénique couteux non utilisable en un agent therapeutique utilisable précieux. Le produit re-traite est dé- -2S barrasse du materiau pyrogénique soit par une seule étape de precipitation à froid au PEG ~ 5%, soit en deux etapes par le procede decrit en detail dans la presente demande.
~ Les resultats inattendus et grandement améliores obtenus et decrits ici s~nt contraires-aux enseignements et suggestions de l'art antérieur, et ont eté découverts à l'origine plus par hasard qu'au cours d'une recherche syst~matique.
La presente invention est un procede spécifique pour la fabrication ~ une grande echelle d'un concentre de Facteur VIII
de tres grande purete. Parmi les traits les plus caracteristi-ques de l'invention, on cite la précipitation sele~tive de , quantites en excès de fibrinogène et de produits de dénaturation ¦ et de degradation, l'~limination d'autres proteines ind~sirables telles ~ue les isoh~magglutinines, et la concentration en une etape du Facteur VIII par précipitation ~ froid avec un polyol, 1 40 sans perte indésira~le a ~ activit~ AHF. Une autre caractéristique ! remarquable est le rendement étonnamment ~lev~ en Facteur VIII~ ¦
! MK/.S. 2 .. .

environ 20-40% de la quantit~ plasmatique théorique utilisee.
! De plus, et en dépit du rendement ~leve en AHF, la teneur en protéine s'est trouvée réduite de fa~on frappante, en partlcu-lier la teneur en fibrinogene, par comparaison avec d'autres ! 5 prodults. Ceci est illustr~ par le tableau I ci-dessous. Le beso~n d'un rendement ~levé de concentré d'AHF lyophilise, de grande puret~, est universellement reconnu et a retenu l'atten-tion sur un pla~ internatior.al. On cite : Recent Advances in Hemo-philia. Ann. N.Y.Acad.Sci. 240,1975, (réference 11); Pool, J.G.: !
Recent chapters in the Factor VIII saga : perils of a protein.
West J. of Med., 122:406, 1975,(reference 12) et l'on admet généralement que les concentres du commerce donnent habituelle-ment moins de 20% de l'AHF théoriquement présent dans le plasma, tandis que les rendements pour les produits hautement purifiés 15 sont encore plus faibles (reférence 11, pp.l56,208; réferences -5 et 8).
Dans le tableau I ci-apres les donnees, sauf en ce qui concer-ne les resultats obtenus selon le procéd~ de la présente demande sont extraites de l'article de Robert Breckenridge :"Recent 20 a~vances in hemophilia" Ann. N.Y. Acad.of Science,240.1975.
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La presente invention a pour objet un 2rocédé de préparation d'un concentre de Facteur VIII, caractérise par le fait ~u'il comprend 1'étape cons~stant ~ maintenir une solution tam~on conten~t le Facteur VIII et environ 6% en volume de polyol a une température s d'environ O ~ 5~C jusqu'~ ce que la précipitation se produlse.
L'invention a notamment pour obj~et un procéd~ caract~risé par le falt qu'il comprend les étapes consistant à précipiter le ~ribri-nogene sélectivement a partir d'une solution de plasma ou de cryopré-cipité de plasma dans un tampon par addition d'environ 4% en volume de polyol à ladite solution, à concentrer le Facteux VIII dans la solution en accroissant la concentration de polyol jusqu'~ environ 6% et ~ maintenir la solution contenant le polyol a 6% à une temp~-rature d'environ O à 5~C ~usqu' a ce que la précipitation se produise et ensuite ~ redissoudre le Facteur VIII pr~cipit~ dans une 301ution tampon pour obtenir une solution contenant un Facteur VIII de très grande pureté qui est sensiblement exempt de proteines ~trangères contaminan~es.
Dans ses modes d'exécution préférés, le procéde de l'invention présente les caract8ristiques suiva~tes, prises isolement ou en combinaison :
- la source de Facteur VIII est un cryop~écipité dissous dans environ 2 à 4 fois son volume de tampon;
- le rapport volumique du cryoprécipité au tampon est d'en~iron 1 à 3;
- le proced~ comprend les etapes subséquentes consistant ~ re-dissoudre le Facteur VIII pr~ciplté dans un tampon et ~ maintenir la solution résultante ~ une température d'env~ron 0,5 ~ 5~C pendant une période d'environ 12 a 24 heures et ensuite ~ séparer la matiere particulaire formée ~ partir de ladite solution pour obtenir ainsi un Facteur VIII pratiquement exempt de fibrinog~ne,de fragments de fibrinogene et de leurs complexes;
- les tampons sont des tampons citrate;
- les polyols utilisables comprennent les poly~thyl~neglycols en particulier le polyéthyl~neglycol 4000, et les copolym~res séquenc~s du type alpha-hydroxy omega-hydroxy, poly (oxyéthylène) poly~oxy-pro~ylène) poly (oxy~thyl~ne). Parmi ces copolym~res s~quenc~s on citera not~mnent ceux d~signés par la marque PLURONIC (WYANDOTTE
C~EMICALS ET UGI~E-KU~LMANN), et en particulier le PLuronic F68 qui est un copol~nère présentant les caractéristiques suivantes:
Poids moiéculair~ du groupement poly ~oxypropylane) de base: 1750 B/S.2 *Marque de Ca~nerce 33;~
8 ~ .
en~iron; pourcentage en poids de poly (oxy~thyl~ne): 80% environ;
- la precipitation du Facteur VIII en pr~sence ae 6% de polyol est effectuee de pr~ference ~ pH 6,8-7,2;
- la pr~ci~itation prealable du fibrinogane en pr~sence de 4~
de polyol est ef~ectuée de pr~f~rence à p~ 6,0~6,5 et ~ ~emperature d'environ 20-30~C.
Le procéde de 1'invention permet notamment d'~liminer les pyro-g~nçs d'une solution tampon de Facteur VIII; ce procedé est caracté-rise par le fait que l'on ajoute en~iron 6~ de polyol 3 ladite solu-tion et on malntient la solution résultante ~ une température d'en-viron 0~C ~ 5~C, pour pr~cipiter le Facteur VIII en laisqant en solu-tion le matériau pyroganique. Ce proc~dé peut 8tre mis en oeu~re selon les modes d'executlon pref~rés suivants :
- pour ef~ectuer l'addition de polyol aux solutions tamion de Facteur YIII on ajoute environ 4% de polyol, on s~pare le précipit~
de la solution, on ajoute 2~ de polyoi et maintient la qolution ~
une temparature de 0 ~ 5~C~Çusqu'~ ce que se produise la precipita-tion.du Facteur VIII;
- de pr~ erence, la solution ~ puri~ier contient environ 1 ~ 3%
2~ de proteine, et notamment 2 ~ 3%; -- le proc~dé comprend les ~tapes subsequentes consistant ~ re-dissoudre le Facteur VIII precipite dans un tampon citrate, ~ main-tenir la solution resultante ~ une temp~rature d'environ 0,5 ~ 5~C
pendant un laps de temps d'environ 12 ~ 2~ heures et ensuite ~ s~pa-rer la mati~re particulaire formée de ladite solution pour obtenir1Q Facteux VIII pratiquement exempt de ~ibrinog~ne, des fragmentsde fibrinog~ne, et des complexes de ceux-ci;
- l'in~ention a notamment pour objet un procédé de concentration du Facteur VIII caracteris~ par le fait qu'il comprend le maintien d'une solution d'environ 1 partie d'une ~raction sanguine contenant du Facteur VIII obtenue par cryoprécipitation de plasma dans environ 2 ~ pure and lower yield. Similarly, the Shan- process ~ rom and Fekete tarticle cit ~ above) utili ~ e a concentration of relatively low protein during precipitation PEG, that is to say ~ 1 volume of precipitate in 10 volumes of ~ ampon dis-solvent, e ~ that oDnduit ~ a yield tra ~ low and a purity ~
limited. These authors as well as Johnson et al (r ~ f.4 ~ and Johnson et al "Antihemophilic factor prepared from blood plasma using p ~ ly-ethylene glycol. US Patent N ~ 3,652,530, (r ~ f.6) used ~ 10-12%
of PEG for the final concentxatlon of AHF, which an ~ cessity a step ~ uppl ~ mentary dissoluticn and repr ~ c ~ pitatlon by glycine or cold ethanol to reduce the PEG content of the final product. ~ - ~
~ no other evidence than protein concentration and PEG precipitation to frold are important and lead to an original product lies in the makes "incomplete" isohemagglutinins (antibodies) ~ virtually eliminated, which LK / S.2 . .
. . . ,,, ~ ~,; :,. .,,.,,::
l33 ~:
4. -~ quickly the risk of hemolytic reactions ~ which could i nir when massive injections of concentrates currently available in the business are required.
(See: Seeler, RATelischi, M., Langehennig, PL and Ashenhurst, JB: Anti-A and Anti-B titers in coagulation concentrates.
Abst.Of Int. Soc ~ of Blood Transf., Helsinki, 1975, (ref. 9).
Another original characteristic of the product of the invention tion is the high degree of purity (that is to say ~ the low content protein) especially with regard to the amount of measurable fibrinogen. This high degree of purity gives a product very sol ~ ble, so soluble in fact that no undissolved material does not remain in the bottle after reconstitution. This eliminates - the need to use a special filter or a filter needle te to remove the undissolved protein before injection into the ; 15 patient. This prevents contamination of the Factor concentrate VIII by metallic particles (Cut ~ IA, McAdam, JH
MacRenZie, MS and Davidson, J. ~ Contamination of Factor VIII
Concentrates with metal particles. Lancet, Dec. ~ 1,1974, p.l515 ~ (ref. 10).
i-2o The process described, or part of it, is also used.
for the "re-treatment" of pyrogenic batches of concentrates Factor VIII manufactured by any other process, which trans ~ or-¦ me the 'actor ~ III expensive pyrogenic not usable as an agent valuable usable therapy. The reprocessed product is de- -2S barrasse of pyrogenic material either by a single step of cold precipitation at PEG ~ 5%, i.e. in two stages per the process described in detail in this application.
~ Unexpected and greatly improved results and described here are contrary to teachings and suggestions of the prior art, and were originally discovered more by chance that during a systematic search.
The present invention is a specific method for the manufacturing ~ a large scale of a Factor VIII concentrate very great purity. Among the most characteristic features ques of the invention, we cite the sele ~ tive precipitation of , excess amounts of fibrinogen and denaturing products ¦ and degradation, the elimination of other undesirable proteins such ~ ue isoh ~ magglutinins, and the concentration in one Factor VIII stage by cold precipitation with a polyol, 1 40 lossless unwanted ~ the a ~ activity ~ AHF. Another feature ! remarkable is the surprisingly high yield of Factor VIII ~ ¦
! MK / .S. 2 ...

about 20-40% of the theoretical plasma quantity used.
! In addition, and despite the high yield of AHF, the content of protein was found to be strikingly reduced, in part link fibrinogen content, compared with others ! 5 products. This is illustrated by Table I below. The ~ need of a yield ~ lifted from lyophilized AHF concentrate, great purity ~, is universally recognized and has held the attention tion on a pla ~ internatior.al. We quote: Recent Advances in Hemo-philia. Ann. NYAcad.Sci. 240.1975, (reference 11); Pool, JG:!
Recent chapters in the Factor VIII saga: perils of a protein.
West J. of Med., 122: 406, 1975, (reference 12) and we admit generally that commercial concentrates usually give-less than 20% of the AHF theoretically present in the plasma, while yields for highly purified products 15 are even weaker (reference 11, pp. 156.208; references -5 and 8).
In Table I below after the data, except for do the results obtained according to the procedure of this application are taken from Robert Breckenridge's article: "Recent 20 advances in hemophilia "Ann. NY Acad. Of Science, 240.1975.
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The subject of the present invention is a process for preparing a concentrate of Factor VIII, characterized by the fact that it comprises The step cons ~ stant ~ maintain a tam solution ~ we contain ~ t Factor VIII and about 6% by volume of polyol at a temperature s about 0 ~ 5 ~ C until precipitation occurs.
The invention has in particular for obj ~ and a procedure ~ caract ~ risé by the falt that it includes the steps of precipitating the ~ ribri-nogene selectively from a plasma or cryopre- solution plasma precipitate in a buffer by adding about 4% by volume polyol to said solution, to concentrate Factor VIII in the solution by increasing the polyol concentration up to ~ approx.
6% and ~ maintain the solution containing the polyol at 6% at a temp ~ -erasure of approximately 0 to 5 ~ C ~ until precipitation occurs and then redissolve the Factor VIII precept in a 301ution buffer to obtain a solution containing a Factor VIII of very high purity which is substantially free of foreign proteins contaminated.
In its preferred embodiments, the method of the invention has the following characteristics, taken in isolation or in combination :
- the source of Factor VIII is a cryop ~ ecipity dissolved in about 2 to 4 times its volume of buffer;
- The volume ratio of cryoprecipitate to the buffer is of ~ iron 1 to 3;
- the process ~ comprises the subsequent stages consisting of ~ re-dissolve the Factor VIII pr ~ ciplté in a buffer and ~ maintain the resulting solution ~ a temperature of approx ~ ron 0.5 ~ 5 ~ C for a period of about 12-24 hours and then ~ separate the material particulate formed from said solution to thereby obtain a Factor VIII practically free of fibrinogen, fragments fibrinogen and their complexes;
- the buffers are citrate buffers;
- the polyols which can be used include poly ~ thyl ~ neglycols in especially polyethyl ~ neglycol 4000, and block copolymers alpha-hydroxy, omega-hydroxy, poly (oxyethylene) poly ~ oxy-pro ~ ylene) poly (oxy ~ thyl ~ ne). Among these copolymers res quenc ~ s will cite not ~ mnent those signed by the brand PLURONIC (WYANDOTTE
C ~ EMICALS AND UGI ~ E-KU ~ LMANN), and in particular the PLuronic F68 which is a co-born with the following characteristics:
Weight per unit ~ of poly group (oxypropylane) base: 1750 B / S.2 * Mark of Ca ~ nerce 33; ~
8 ~.
in ~ iron; weight percent of poly (oxy ~ thyl ~ ne): about 80%;
- Factor VIII precipitation in the presence of 6% polyol is carried out pr ~ ference ~ pH 6.8-7.2;
- The pr ~ ci ~ prior itation of fibrinogane in the presence of 4 ~
of polyol is ef ~ carried out pr ~ f ~ rence at p ~ 6.0 ~ 6.5 and ~ ~ emperature about 20-30 ~ C.
The process of the invention makes it possible in particular to eliminate the pyro-g ~ nçs of a Factor VIII buffer solution; this process is characteristic made by the fact that we add in ~ iron 6 ~ polyol 3 said solu-tion and malntient the resulting solution ~ a temperature of-about 0 ~ C ~ 5 ~ C, to precipitate Factor VIII by leaving in solu-tion the pyrogenic material. This process can be implemented according to the following preferred execution modes:
- To ef ~ perform the addition of polyol to tamion solutions of Factor YIII about 4% polyol is added, the precipitate is separated ~
of the solution, add 2 ~ of polyoi and maintain the qolution ~
a temperature of 0 ~ 5 ~ C ~ Until ~ the precipitation occurs factor VIII;
- preferably, the puri ~ ing solution contains about 1 ~ 3%
2 ~ protein, including 2 ~ 3%; -- the process includes the subsequent steps consisting of dissolve the Factor VIII precipitate in a citrate buffer, ~ main-hold the resulting solution at a temperature of about 0.5 ~ 5 ~ C
for about 12 ~ 2 ~ hours and then ~ s ~ pa-rer the particulate matter formed from said solution to obtain 1Q Factors VIII practically free from ~ ibrinog ~ ne, fibrinog ~ ne fragments, and complexes thereof;
- In ~ ention particularly relates to a concentration process of Factor VIII caracteris ~ by the fact that it includes the maintenance of a solution of about 1 part of a blood reaction containing Factor VIII obtained by plasma cryoprecipitation in approximately

3 parties de tampon citrate contenant environ 6~ de polyol ~ une temp~rature d'environ 0 ~ 5~C pour provoquer la pr~cipitation du Facteur VIII de ladite solut~on, et la redissolution dudit Facteur VIII dans le tampon pour donner une solution de Facteur VIII de tras grande puret~.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
EXEM~LE
On d~cong~lo du plasma congel~ par exemple 100 ~ 3000 litres ~B/S.2 ' g ~ 2 ~, ., ~ temperature d'environ - 5~C ~ environ +2~C et on la recueille dans un recipient approprie. On peut traiter de plus grands volumes mais les operatlons devien~ent difficilcs. La fraction insoluble ~ ~roid (cryopr~clpit~) e~t recueillie, de préf~rence en ce~trifu-geuse ~ circulation continue (Sharpless ou appareil similaire) ~temp~rature inf~rieure ~ 3~C. D'autre.~ procedes de collecte peuvent~tre utilis8s mai - le proced~ comprend les etapes subséquentes consistant ~ re-on et ~ maintenir la te ~ séparer la matiere brinog~ne,de fragments s comprennent les poly~thyl~neglycols en omega-hydroxy, poly (oxyéthylène) poly~oxy-d~signés par la marque PLURONIC (WYANDOTTE
sentant les caractéristiques suivantes:
erce yl~ne): 80% environ;
- la pr~ci~itation prealable du fibrinogane en pr~sence de 4~
d'environ 20-30~C.
procedé est caracté-te ~ une température d'en-oc~dé peut 8tre mis en oeu~re tions tamion de et maintient la qolution ~
r~ erence, la solution ~ puri~ier contient environ 1 ~ 3%
prend les ~tapes subsequentes consistant ~ re-resultante ~ une temp~rature d'environ 0,5 ~ 5~C
re particulaire formée de ladite solution pour obtenir1Q Facteux VIII pratiquement exempt de ~ibrinog~ne, des fragments ne, et des complexes de ceux-ci;
fait qu'il comprend le maintien oprécipitation de plasma dans environ pour provoquer la pr~cipitation du er une solution de Facteur VIII de tras er.
g ~ 2 On peut traiter de plus grands volumes recueillie, de préf~rence en ce~trifu-s sont moins ef~icaces. Le cryopr~clpite est pes8, decoupe en petits morceaux ou m~lang~ dans un m~langeur de type Waring pendant quelques secondes pour produlre une pâte ou ~mulsion.
Ces morceaux de cryoprecipit~ ou cette pâte sont alors dissous dans 2 ~ 4 volumes de tampon constitu~ par du citrate de trisodium 0,02 M
de la glycine 0,1 M et on ajuste le pH ~ 6,9 par l'acide citrigue temp~rature de 20-30~C. Apr~s dissolution compl~te on pr~cipite selectivement le ~ibrinog~ne par addition de 4% de poly~thyl~ne glycol~
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1l332 4000 ou de Pluronic F-68 ~ pH de 6,0 ~ 6,5 et ~ une température d'environ 25~C. Le pr8cipite est ~liminé par centrifugation co~tinue dans un appareil de type Sharpless et le fluide surnageant est ajusté ~ pH 6,8-7,2. Une quantité supplémentaire de 2% de PEG ou de Pluronic F-68 est ajoutee et l'on refroidit la suspenslon a 0-5~C
jusgu'à ce produise une pr~cipitation vistble.
On utilise une cuve de r~action ~ double paroi pour toutes les ~tapes de dissolution et de pr~cipitation avec agitation continue, en prenant soin d'~viter la mousse.
La seconde etape de précipitation est suivie d'une centrifuga-tion à circulation continue e~ 1-2~C et on éllmine le surnageant.
ensuite On dissouy le precipite dans un tampon glycine-~itrate ou un tampon citrate, le volume dependant de la qualit~ du cryoprécipite et du nombre d'unites d'AHF pr~sentes dans la solution initiale.
Les deux proc~d~s pour calculer ce volume sont les suivants :
1. Dissoudre le précipité ~inal dans un volume de tampon égal 1/100 du volume de plasma d'ori~ine.
2. Dissoudre le pr~cipite final dans un volume de tampon ~gal e~ 15-25 fois le poids du précipité.
~a solution est alors ajust~e ~ un pH de 6,7-6,9 à llaide d'a-cide citrigue, clarifiee et ensuite stérilisée par passage du li-quide e~ travers des filtres e~ membrane micropores (hauteur de fil-tres 293 mm ou équivalents en cartouche) ayant par exemple des pores d'un diam~tre de 1,2 - 0,65-0,45 et 0,3 microns. La solu~ion stérile obtenue, contene~nt 20-40'~ environ du Facteur VIII dans le plasma de d~part est lvophilisée de mani~re usuelle pour le stockage.
On peut utiliser des varlantes de technique de fabrication, en employant en particulier du cryoprécipit~ recongelé ou des va-riantes de la Fraction I de Cohn, bien que dans de telles eondition le rendement en Facteur VIII soit moindre et d~pende de sa concen-tration dans le mat~riau de départ. La dissolution ou l'extraction initiale d'A~F peut être effectuee dans de l'eau distillée ou dans des tampons de faible force ionique comme le tampon Tris. Le temps d~ refroidissement peut également varier~soit augmenté, soit réalis~ de façon s~uentlelle sans sortir du cadre de l'invention.
De m~me, le t~ps d'extraction peut ~tre ac~ru jus~ul~ 24 heures dans le processus d~crit. De plus, le processus peut ~tre inter-om-pu a toute ~tape et repris un autre jour. Toutes ces variantes peuvent provoquer une certaine dimlnution du rendement ~ot~l d'A~F
'~ MB/ S.2 *Marque de Commerce du plasma de depart.
ExEM~LE N~II
Des lots pyrogèniques de concPn~ré de Facteur VIII de puret~
moyenne realisés par tout autre procédé, tel qu'extraction au tam-pon de faible force ioni~ue, pr~cipitation à la glycine, pr~cipita-tion au PEG, etc, peuvent etre repris selon le schéma indiqué dans 1'exemple I. Les flacons lyophilis~s sont reconstitu~s dans un volu-me d'eau exempt de pyrogène suffisant pour produire une teneur en protéines1-3 g~,les ~ontenus des flacons sont ensuite réunis dans une cuve et à nouveau soumis au traitement selon les étapes indi~uées dans l'Exemple I.
En variante, si les niveaux pyrogéniques sont seulement mod~ré
ment elevés et si le produit est dejà d'une purete elev~e, une seu-le etape de précipitatlon peut ~tre suffisante. Les flacons sont reconstitués comme d~crit ci-dessus et l'on ajoute 6~ de PEG ~ un pH de 6,8-7,2 ~ une température de 0-5~C. La precipitation formée est ensuite traitée comme avant et le surnageant contenant le maté-riau pyrogenique solubilis~ est élimin8.
EXEMPLE N~ III
On effectue le proc~d~ decrit dans l'exemple I.
- Cependant, avant d'effectuer les etapes finales de filtration on place le produit dans une chambre froide ~0~5~ ~ 5~c)et ~n le laisse reposer pendant 12-24 heure~. Le matériau floculant blanc qui se forme apres cette période de repos est élimin~ par décanta-tion, centrifugation ou prefiltration. Le produit final est stéri-lisé par filtration comme précédemment d~crit et soumis aux m~mes processus de lyophilisation. Ce produit est m~me plus purifi~ que les produits pr~cedents et donc plus facilement filtré. Il ne se produit pas de perte de Eacteur VIII du fait de cette étape s~p-plémentaire.
Les produits résultants peuvent être stock~s ~ ~5~C pendant une p~riode prolongée d~n ~ deux ans, et reconsti~u~s dans de l'eau distillée ou un sé_um physiologique. Du fait de sa tr~s grande pureté et de son extremement faible teneur en fibrinogene, le produit lyophilis~ se laisse dissoudre tr~s rapidement (1-2 minutes).
Le temps total de _raitement étant très court compare aux au~xes procedes de fabxication depuis le moment o~ les sacs de plasma sont ouverts, le développement de bacteries se ~rouve limite. Le fait que la dissolution initiale est effectu~e dlns de petites quantit~s seulement de tc~mpon diminue la quantit~ de gamma-~lobu-~ MB~ S.2 lines pouvant er_rer dans la solutio~ et la pr~cipitation optimale du fibrinog~ne en excès se produit e~ utilisant une concentration en polyol de 4~. De plus, le lourd pr~cipit~ floculant de fibrino-~ene emprisonne probablement le mat~riau pyrogènique pr~sent et réduit les quantit~s d'a~tigène associ~ de l'hépatite (HAA ou virus de l'h~patite). En n'utilisant que 6% cle polyol dans l'~tape de pr~- -cipitation ~ froid, les prot~ines ind~sirables, en particulier les isohemagglutinines qui peuvent avoir ~-té dissoutes même dans des volumes moindr~ de tampon, ne pr~cipitent pas avec l'AH~ et sont éliminées avec le surnageant. On ~btient ~nsi un produit purif ié
200 à 400 fois, par rapport au plasma, et contenant tres peu de fibrinogene et d'isohémagglutinines, Les concentr~s de Facteur VIII fabxiqués avec de plus grands volumes de tampon d'extraction, par exemple 10 volumes (ref~rence 2) ne présentent pas le mame degré de pureté ou le meme rendement d'AHF(ref~rences 1,2,3,4,8), probablement à cause du fait que le rapport opt~mal de la prot~ine au polymère pour la coprecipitation n'a pas et~ obtenu. Si on le désire ce produit peut ~etre encore purifie et concentr~ par des procéd~s connus ou de nouveaux procédés. ~n grand avantage de la presente invention réside dans le fait qu'on peut effectuer la production ~ grande ~chelle d'AXF tres pure en la moiti~e ou les deux tiers du temps requis dans d'autres proc~dés.
Les exemples donnes precédemment sont l~s proced~s opt~mum connus actuellement pour la mise en oeuvre de l'invention. Il est c~air, cependant, que l'invention peut être mlse en oeuvre par l'application de techniques de traitement et de mat~riaux c~n~en-tionnels selon le principe de la présente invention . Par exemple~
bier. qu'il ne soit pas en g~n~ral ~conomique de debuter avec moins de l~0 litres environ de plasma, ou de cryopr~cipit~ de cette quan-tite de pl~sma, il n'y a ~videmment pas d'in-onv~nient ~ utiliser les valeurs sup~rieures ou inf~rieures de volume donn~es dan~ l'e~
xemple et des variantes de cinquante pour cent ou analogu s dans ces ~aleurs ne serait pas pr~judiciables ~ l'invention. Les pro-cessus dans l'exemple optimal sont mis en oeuvre en utilisant un ~quipement connu et ~acilement disponible, tel que l'appareil centr;fugeur Sharpless, le m~langeux Waring, etc~mais chacun peut - voir que ces ~tapes en elles-m~mes, isol~es du principe inventif, et les ~quipements englobés, ne sont pas essentiels et un grand nombre de variantes sont ~ la dlsp~sition de 1ihomme de 1'art sans sortir du cadre de 1'in~ention selon le personnel et l'~quipement MB~ S.2 *Marque de Commerce _ -' ~ ~ ' ' ! . . ; . . ~
, ' ~ ~ ',, 1,. ,'.~."'''. '''' ., , ' ,'' ' '' ' , 13 ~ 32 disponibles, etc... Une fois ~ue l'on a obtenu le li~uide surnageant,contenant le facteur VTII avec un bon rendement, on le traitede mani~re conventionnelle pour stockage et reconstitution; par exemple, il est clarifi~ et sterilise, à travers un filtre micropores stan-dard,lyophilise pour concentrer le Facteur VIII en un petit volumefacilement stockable et reconstitu~ en utilisant des liquides conven-tionnels, par exemple de l'eau distillee apyrogène ou un sérum physiologique.
L'invention n'est pas limitee par les details ae procede donnes ~ titre d'exemples. Le produit obtenu poss~de des caract~ris-tiques originales, bénefiques pour l.e patient et distinctes de celles de tous les autres concentres de Facteur VIII actuellement fabriques:
1) Pureté la plus élevee et donc la plus grande "activite specifique";
2) Solubillté la plus grande, en ce qui concerne sa rapidité
et la solubilite finale, ce qui le rend id~al pour le traitement d'urgence;
3) La plus faible teneur en proteine, ce qui diminue les reac-tions secQndaires indesirables. 3 parts of citrate buffer containing about 6 ~ polyol ~ one temperature of about 0 ~ 5 ~ C to cause precipitation Factor VIII of said solut ~ on, and redissolution of said Factor VIII in buffer to give a factor VIII solution of tras great purity ~.
The following examples illustrate the invention without, however, limit.
EXAMPLE
We freeze frozen plasma ~ for example 100 ~ 3000 liters ~ B / S.2 '' g ~ 2 ~,., ~ temperature of about - 5 ~ C ~ about + 2 ~ C and we collect it in a suitable container. We can process larger volumes but the operations become difficult. The insoluble fraction ~ ~ roid (cryopr ~ clpit ~) e ~ t collected, preferably ~ rence in this ~ trifu-geuse ~ continuous circulation (Sharpless or similar device) ~ lower temperature ~ 3 ~ C. On the other hand, ~ collection methods can be used - the method includes the subsequent steps consisting of on and ~ maintain the you ~ separate the material brinog ~ ne, of fragments s include poly ~ thyl ~ neglycols in omega-hydroxy, poly (oxyethylene) poly ~ oxy-d ~ signed by the brand PLURONIC (WYANDOTTE
feeling the following characteristics:
erce yl ~ ne): about 80%;
- The pr ~ ci ~ prior itation of fibrinogane in the presence of 4 ~
about 20-30 ~ C.
process is character-te ~ a temperature of-oc ~ die can be implemented tamion of and maintain the qolution ~
r ~ erence, the solution ~ puri ~ ier contains about 1 ~ 3%
takes the ~ subsequent steps consisting of ~
resulting ~ a temperature of about 0.5 ~ 5 ~ C
re particulate formed of said solution to obtain 1Q Factors VIII practically free of ~ ibrinog ~ ne, fragments ne, and complexes thereof;
fact that he understands keeping plasma oprecipitation in about to cause precipitation er a solution of Factor VIII of tras er.
g ~ 2 We can process larger volumes collected, preferably in this ~ trifu-s are less effective. The cryopr ~ clply is pes8, cut into small pieces or m ~ lang ~ in a m ~ langeur type Waring for a few seconds to produce a paste or ~ emulsion.
These pieces of cryoprecipit ~ or this paste are then dissolved in 2 ~ 4 volumes of buffer consisting of 0.02 M trisodium citrate 0.1 M glycine and adjust the pH ~ 6.9 with citric acid temperature of 20-30 ~ C. After complete dissolution we precipitate selectively ~ ibrinog ~ ne by adding 4% poly ~ thyl ~ ne glycol ~
,. . . _. . _ _ _. . _. . . _. .

4000 or Pluronic F-68 ~ pH 6.0 ~ 6.5 and ~ a temperature about 25 ~ C. The pr8cipite is ~ eliminated by centrifugation co ~ continuous in a Sharpless type device and the supernatant is adjusted ~ pH 6.8-7.2. An additional 2% of PEG or Pluronic F-68 is added and the suspenslon is cooled to 0-5 ~ C
until this produces a vistble precipitation.
We use a double-walled reaction tank for all ~ dissolution and precipitation stages with continuous stirring, taking care to avoid foam.
The second precipitation step is followed by centrifuga-tion with continuous circulation e ~ 1-2 ~ C and the supernatant is removed.
then The precipitate is dissolved in a glycine-~ itrate buffer or a citrate buffer, the volume depending on the quality of the cryoprecipitate and the number of units of AHF present in the initial solution.
The two methods for calculating this volume are as follows:
1. Dissolve the ~ inal precipitate in an equal volume of buffer 1/100 of the volume of ori ~ ine plasma.
2. Dissolve the final precipitate in a volume of gal buffer e ~ 15-25 times the weight of the precipitate.
~ a solution is then adjusted ~ e ~ a pH of 6.7-6.9 using a-citric acid, clarified and then sterilized by passing the li-which is through filters and micropore membrane (wire height-very 293 mm or equivalent in cartridge) having for example pores with a diameter of 1.2 - 0.65-0.45 and 0.3 microns. The solution sterile obtained, contains ~ nt 20-40 '~ of Factor VIII in the starting plasma is freeze-dried in the usual manner for the storage.
Variants of manufacturing technique can be used, by using in particular cryoprécipit ~ refrozen or laughing at Cohn's Fraction I, although in such conditions Factor VIII yield is lower and depends on its concentration tration in the starting material. Dissolution or extraction initial A ~ F can be done in distilled water or in low ionic strength buffers such as the Tris buffer. The weather cooling may also vary ~ either increased or real ~ so s ~ uentlelle without departing from the scope of the invention.
Likewise, the extraction t ~ ps can be ac ~ ru juice ~ ul ~ 24 hours in the described process. In addition, the process may be inter-om-was able to stop and resume another day. All these variants may cause some reduction in yield ~ ot ~ l of A ~ F
'~ MB / S.2 *Trademark starting plasma.
EXEM ~ LE N ~ II
Pyrogenic batches of purity Factor VIII conc ~ re ~
average carried out by any other process, such as extraction with a tam-pon of weak force ioni ~ eu, pr ~ cipitation with glycine, pr ~ cipita-PEG, etc., can be used according to the scheme indicated in Example I. The lyophilised vials are reconstituted in a volu-me of pyrogen-free water sufficient to produce a content of proteins1-3 g ~, the ~ ontenus of the vials are then combined in a tank and again subjected to the treatment according to the stages indi ~ uées in Example I.
Alternatively, if the pyrogenic levels are only mod ~ re ment high and if the product is already of a high purity, only the precipitation step may be sufficient. The bottles are reconstituted as d ~ crit above and we add 6 ~ PEG ~ a pH 6.8-7.2 ~ a temperature of 0-5 ~ C. The precipitation formed is then treated as before and the supernatant containing the material riau pyrogenic solubilis ~ is eliminated8.
EXAMPLE N ~ III
The procedure described in Example I is carried out.
- However, before performing the final filtration steps the product is placed in a cold room ~ 0 ~ 5 ~ ~ 5 ~ c) and ~ n the let stand for 12-24 hours ~. The white flocculating material which forms after this rest period is eliminated ~ by decantation-tion, centrifugation or prefiltration. The final product is steri-read by filtration as previously described and subject to the same lyophilization process. This product is even more purified than previous products and therefore more easily filtered. He does not produces no loss of Actor VIII due to this step s ~ p-plementary.
The resulting products can be stored ~ s ~ ~ 5 ~ C for one prolonged period of two years, and reconstituted in water distilled or physiological salt. Because of its very large size purity and its extremely low fibrinogen content, the lyophilised product can be dissolved very quickly (1-2 minutes).
The total processing time is very short compared to the extra fabxication processes since the time when ~ plasma bags are open, the development of bacteria is limited. The that the initial dissolution is carried out in small only amount of tc ~ mpon decreases the amount of gamma- ~ lobu-~ MB ~ S.2 lines can er_rer in the solution and optimal precipitation excess fibrinog does not occur using a concentration polyol of 4 ~. In addition, the heavy flocculant pr ~ cipit of fibrino-~ ene probably traps the pyrogenic material ~ present and reduces the amount of associated hepatitis A (HAA or virus) of hepatitis). Using only 6% polyol in the pre step - - -cold cipitation, unsuitable proteins, in particular isohemagglutinins which may have been dissolved even in lower buffer volumes, do not precipitate with HA and are eliminated with the supernatant. We get ~ nsi if a purified product 200 to 400 times, compared to plasma, and containing very little fibrinogen and isohemagglutinins, Factor concentrates VIII manufactured with larger volumes of extraction buffer, for example 10 volumes (ref ~ rence 2) do not have the same degree of purity or the same yield of AHF (references 1,2,3,4,8), probably due to the fact that the opt ~ wrong ratio of the protein to the polymer for coprecipitation did not and ~ obtained. If we want this product can ~ still be purified and concentrated ~ by known procedures or new methods. ~ n great advantage of the present invention resides in the fact that the production ~ large ~ very pure AXF scale in half or two-thirds of the time required in other processes.
The examples given above are the ~ s ~ opt ~ mum currently known for implementing the invention. It is c ~ air, however, that the invention can be implemented by the application of processing techniques and materials c ~ n ~ en-tional according to the principle of the present invention. For example ~
beer. that it is not generally economic to start with less ~ 0 liters of plasma, or cryopr ~ cipit ~ of this amount tite de pl ~ sma, there is ~ obviously no in-onv ~ deny ~ use higher or lower volume values given in e ~
xample and fifty percent variants or the like in these ~ aleurs would not be pr ~ legal ~ the invention. Professionals-stops in the optimal example are implemented using a ~ known equipment and ~ readily available, such as the device centr; runaway Sharpless, the languid Waring, etc ~ but everyone can - see that these ~ steps in themselves, isolated from the inventive principle, and the equipment included, is not essential and a great number of variants are ~ the dlsp ~ sition of 1'homme of art without going beyond the scope of the arrangement according to the personnel and the equipment MB ~ S.2 * Trademark _ -'~ ~''! . . ; . . ~
, '~ ~' ,, 1 ,. , '. ~. "'''.''''.,,','''''', 13 ~ 32 available, etc ... Once we have obtained the supernatant liquid containing the factor VTII with a good yield, we treat it conventional manner for storage and reconstitution; for example, it is clarified and sterilized through a standard micropore filter sting, lyophilize to concentrate Factor VIII in a small volume that can be easily stored and reconstituted using suitable liquids.
tional, for example pyrogenic distilled water or a serum physiological.
The invention is not limited by the details of this process give examples. The product obtained has characteristics ~ ris-original ticks, beneficial for the patient and distinct from those of all the other Factor VIII concentrates currently manufactured:
1) Highest purity and therefore greatest "activity specific";
2) Highest solubility, as regards its speed and the final solubility, which makes it ideal for processing emergency;
3) The lower protein content, which decreases the reac-unwanted secretaries.

4) La plus faible teneur en immunoglobulines ce qui diminue les reactions allergiques;
S)/isohemagglutinines négligeable/ qui ~limine les r~actions hemolytiques.
6) la plus faible teneur en fibrinogene, ce qui diminue les complications d'hyperfibrinogenemie.
7) Aucune aiguille filtrante n'est n~cessaire~donc le risque de presence de particules etrang~res est elimin~;
8) L'elimination des pvrogènes durant le processus conserve le facteur VIII utilisable.
Ces avantages et d'autres ressortent du proced~ decrit ici, illustr~ par des exemples non limitatifs et d~fini dans les reven-dications. En r~sume le proc~de de l'invention pour preparer un concentre de Facteur VIII est la decouverte qu'en maintenant une solution tampon contenant du Facteur VIII et environ 6% de polyol ~ une temperature d'environ 0~C ~ environ 5~C la precipitation du Facteur VIII se produit, procurant ainsi une tr~s grande puret~ au Facteur VIII qui ~est sensiblement exempt de proteines ~t~ang~res contaminantes. ~ 4) The lower immunoglobulin content which decreases allergic reactions;
S) / negligible isohemagglutinins / which eliminates reactions hemolytics.
6) the lower fibrinogen content, which decreases the complications of hyperfibrinogenemia.
7) No filter needle is necessary ~ therefore the risk presence of foreign particles is eliminated;
8) The elimination of pvrogens during the process keeps usable factor VIII.
These and other advantages emerge from the process described here, illustrated by nonlimiting examples and defined in the res-dications. In summary the process of the invention for preparing a of Factor VIII is the discovery that by maintaining a buffer solution containing Factor VIII and approximately 6% polyol ~ a temperature of about 0 ~ C ~ about 5 ~ C the precipitation of Factor VIII occurs, providing very high purity at Factor VIII which ~ is substantially free of protein ~ t ~ ang ~ res contaminating. ~

Claims

1. Process for the preparation of a Factor VIII concentrate, characterized by the fact that it includes the step of maintaining a solution buffer containing Factor VIII and approximately 6% polyol at a temperature about 0 to 5 ° C until precipitation of Factor VIII occurs happen.

2. Method according to claim 1, characterized in that it includes the steps of selectively precipitating fibrinogen from a plasma solution or plasma cryoprecipitate in a buffer by adding approximately 4% by volume of polyol to said solution, concentrate Factor VIII in the solution by increasing the concentration polyol up to about 6% and maintain the solution containing the polyol at 6% at a temperature of about 0 to 5 ° C until precipitation happen and then redissolve the Factor VIII precipitated in a buffer solution to obtain a solution containing a Factor VIII of very high purity which is substantially free of foreign proteins contaminating.

3. Method according to claim 2, characterized in that the source of Factor VIII is a cryoprecipitate dissolved in about 2 to 4 times its buffer volume.

4. Method according to claim 3, characterized in that the volume ratio of cryoprecipitate to buffer is approximately 1 to 3.

5. Method according to any one of claims 2 to 4, characterized in that it includes the steps of redissolving Factor VIII precipitated in a buffer and to maintain the solution resulting at a temperature of about 0.5 to 5 ° C for a period about 12 to 24 hours and then to separate the particulate matter formed from said solution to thereby obtain a Factor VIII
practically free of fibrinogen, fragments of fibrinogen and their complex.

6. Method according to claim 1, characterized in that for the purpose of removing pyrogens from a Factor VIII buffer solution, about 6% polyol is added to said solution and the resulting solution at a temperature of about 0 ° C to 5 ° C, to precipitate Factor VIII leaving the pyrogenic material in solution.

7. Method according to claim 6, characterized in that to add polyol to Factor VIII buffer solutions about 4% polyol is added, the precipitate is separated from the solution, another 2% of polyol is added and the solution is kept at temperature from about 0 ° to 5 ° C until precipitation occurs of Factor VIII.

8. Method according to claim 7, characterized in that the solution contains approximately 1 to 3% protein.

9. Method according to any one of claims 7 and 8, characterized in that it includes the steps of redissolving Factor VIII precipitated in citrate buffer, to maintain the solution resulting at a temperature of about 0.5 to 5 ° C for a period of time about 12 to 24 hours and then to separate the particulate matter formed of said solution to obtain Factor VIII practically free fibrinogen, fibrinogen fragments and complexes thereof.

10. Factor VIII concentration process, characterized by fact that it includes maintaining a solution of about 1 part of a factor VIII blood fraction obtained by cryoprecipitation of plasma in about 3 parts of citrate buffer containing about 6%
polyol at a temperature of about 0 to 5 ° C to cause the precipitation of Factor VIII of said solution and redissolution said Factor VIII in the buffer to give a Factor VIII solution very high purity.

11. Method according to any one of claims 1, 2 or 3, characterized in that the buffers are citrate buffers.

12. Method according to any one of claims 1, 2 or 3, characterized in that the polyol is a polyethylene glycol.

13. Method according to any one of claims 1, 2 or 10, characterized in that the polyol is an alpha- block copolymer hydroxy omega-hydroxy poly (oxyethylene) poly (oxypropylene) poly (oxyethylene).

14. Method according to any one of claims 1, 2 or 10, characterized by the fact that the precipitation of Factor VIII is carried out at pH 6.8 - 7.2.

15. Method according to any one of claims 2 and 7, characterized by the fact that the prior precipitation of fibrinogen is carried out at pH 6.0-6.5 and at a temperature of around 20-30 ° C.

16. Method according to claim 1, characterized in that the source of Factor VIII is a cryoprecipitate dissolved in approximately 2 to 4 times its buffer volume.

17. Method according to claim 16, characterized in that the volume ratio of cryoprecipitate to the buffer is approximately 1 to 3.