DK146098B - Fremgangsmaade til rensning af faktor viii (antihemofil faktor) - Google Patents

Description

(19) DANMARK ( 1- ' S, Ϊ» L.- a φ (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 146098 Β

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Patentansøgning nr.: 3570/76 (51) lnt.CI.3: C 07 G 7/00 (22) Indleveringsdag: 06 aug 1976 (41) Aim. tilgængelig: 07 feb 1978 (44) Fremlagt: 27 )un 1983 (86) International ansøgning nr.: -(30) Prioritet: - (71) Ansøger: ‘INSTITUT MERIEUX; Lyon 69002, FR.

(72) Opfinder: Edward ‘Shanbrom; US.

(74) Fuldmægtig: Firmaet Chas. Hude_ (54) Fremgangsmåde til rensning af faktor VIII (antihe-mofil faktor)

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til rensning af faktor VIII (antihemofil faktor), ved hvilken man ekstraherer et kryobundfald, fremstillet af frossen plasma, i et vandigt medium ved omgivelsernes temperatur.

Der er beskrevet flere forskellige fremgangsmåder til fremstilling af antihemophil faktor (AHF eller faktor VIII) til terapeutisk an-

QQ

vendelse, f.eks. selektiv udfældning, portionsvis absorption og CO

ø) eluering, ekstraktion i medier med lav ionstyrke og kromatografi. Ke- Φ mikalier, der mest almindeligt anvendes til udfældning, indbefatter T“ *

Q

2 146098 alkohol, garvesyre, ammoniumsulfat, glycin og polyethylenglykol. Rensning af faktor VIII indebærer eliminering af mange forskellige andre plasmaproteiner, men fibrinogen er langt den vigtigste og besværligste af disse proteiner, især når den er denatureret ved sådanne processer som alkoholudfældning, frysning og optøning. Dette denaturerede fibrinogen skader filtreringen af AHF, forårsager kendelige tab af AHF under rensningstrinnene og nedsætter opløseligheden af det lyofilise-rede produkt i rekonstitueringsvæsker. Enhver tilfredsstillende fremgangsmåde til rensning af AHF kræver således fjernelse af betydelige mængder af fibrinogen. Den selektive udfældningsteknik, der er beskrevet ovenfor, er beregnet til dette formål, men alle har de ulemper, enten yderligere at denaturere fibrinogen og AHF eller at bevirke uønsket tab af AHF.·

Fremgangsmåder, der anvender simpel kold udfældning uden kemikalier (kryoudfældning), er begrænset til produktion i lille målestok, i reglen i blodbanker og resulterer i højt fibrinogenindhold i blodet, når det anvendes terapeutisk, en ejendommelighed,dér anses for uønsket af fagfolk.

Fremgangsmåder, der indebærer ekstraktion af faktor VIII fra kryo-bundfald i stødpuder med lav ionstyrke, nedsætter ganske vist fibrinogen-indholdet noget i slutproduktet, men der er stadig et uønsket højt proteinindhold, og fremgangsmåderne kræver specialudstyr og fremgangsmåder til centrifugering og er begrænsede med hensyn til den sanlede mængde AHF, der kan ekstraheres fra kryobundfaldet uden at skade rensningen.

Andre problemer, der almindeligvis står i forbindelse med fremstilling i stor målestok af AHF, er forureningen af pyrogene stoffer og viruser som forårsager hepatitis (hepatitis associeret antigen, HAA) i slutproduktet. Med kemiske udfældningsmidler kan disse uønskede forureninger faktisk blive forøget.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen eliminerer praktisk taget disse problemer, har ikke ulemperne, der står i forbindelse med kemiske udfældningmidler og er baseret på den simple metode til selektiv kold udfældning af fibrinogen og dets denaturerede og nedbrudte produkter. (Omtale i det følgende af fjernelse af fibrinogen indbefatter fjernelse af fibrinogen og dets denaturerede og nedbrudte produkter).

Den selektive udfældning af fibrinogen uden dermed forbundet tab af 3 146098 faktor VIII er ikke tidligere opnået som en praktisk metode til fremstilling i stor målestok af et renset AHF-koncentrat. Wickerhauser (l) understreger faktisk betydningen af at begrænse tiden og temperaturen ved ekstraktion af AHF. "Noget højere udbytte af 'AHF blev opnået ved forlænget trisekstraktion ved 30°C ud over 60 minutter, men ekstrakten var i stigende grad forurenet med aggregeret fibrinogen, som gjofle det endelige koncentrat dårligt at filtrere. Omvendt fremkom lavere og varierbare AHF udbytter ved kortere ekstraktion eller ved lavere temperatur." Fremgangsmåden ifølge opfindelsen eliminerer alle disse problemer, fordi en eventuel overskydende fibrinogenforurening fjernes under afkøling, medens intet af AHF tabes.

Virkningen af afkølingen er tidligere beskrevet af Hershgold med flere (2), men de krævede 18-30 timer ved 4°C og kunne ikke opnå den fremskyndede og selektive udisLdning af fibrinogen og isohemaglutininer ved den lavere temperatur på 0-2°C. (I et senere arbejde eliminerer Hershgold med flere totalt et afkølingstrin i forsøg på at fremstille meget højt renset AHF (3)). Forfatterne (2) indrømmer, at de ikke var i stand til at fremstille et terapeutisk koncentrat, som kunne konsekvent sterilfiltreres og de måtte ty til yderligere trin med alkoholudfældning eller glycinudfældning. De slående forbedringer ifølge den foreliggende opfindelse var en uventet overraskelse i betragtning af de nedslående rapporter fra Hershgold og andre.

James og Wickerhauser (4) giver kommentaren "da endvidere metoden må udføres ved stuetemperatur for at undgå udfældning af fibrinogen", men de kunne ikke udvikle nogen fremgangsmåde til fremstilling af et faktor VIII-koncentrat under anvendelse af principperne ifølge opfindelsen. Deres slutprodukt var også et meget lavere udbytte og af en lavere renhed end det, der er beskrevet ifølge den foreliggende opfindelse. Yderligere behandling med PEG for at fjerne fibrinogen og forøge renheden resulterede i endnu mere slående tab af faktor VIII (1,5).

Det ser således ud til, at andre forskere længe har antaget eller konkluderet ud fra deres forsøg, at der ikke kunne forventes nogen særlige forbedringer i resultaterne ved anvendelse af de kun lidt lavere temperaturer, der anvendes til fældning og fjernelse af fibrinogen iter kun en meget kort udfældningstid. De uventede og meget forbedrede resultater, der er fundet ifølge opfindelsen går imod den kendte tekniks lære og antydninger og blev opnået ifølge opfindelsen mere ved en tilfældighed end ved beregning.

4 146098

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at ekstraktionen udføres ved hjælp af et vandigt medium med lav .tonstyrke, fortrinsvis vand,og at man derefter udfælder fibrinogenet af den fremkomne opløsning ved at afkøle opløsningen til en temperatur på ca. +1 til +2°C, og at man opsamler den fremkomne overliggende væske.

Opfindelsen angår en speciel metode til fremstilling i stor målestok af et renset faktor VIII-produkt. Blandt de mere enestående træk ved opfindelsen er den selektive kolde udfældning af overskydende mængder fibrinogen, dets denaturerede former og nedbrydningsprodukter i opløsning med lav ionstyrke uden tilsatte kemikalier og uden uønsket tab af AHF aktivitet. Et andet særligt træk er det overraskende høje udbytte af faktor VIII, ca.25-ca.30% af indholdet i det som udgangsmateriale anvendte plasma. Desuden og til trods for den høje AHF udvinding er proteinindholdet blevet reduceret 50-75% sammenlignet med andre produkter. Behovet for et højt udbytte og en høj renhed af frysetørret AHF.koncentrat har fået international anerkendelse og interesse (6,7), og der er almindelig enighed om, at industrielle koncentrater i reglen giver mindre end 20% af det teoretiske AHF, som findes i plasma (6,7,8).

Fortrinsvis består fremgangsmåden ifølge opfindelsen af følgende trin:

Ekstraktion af kryobundfaldet fra ca. 100 eller flere liter frossen plasma i fra ca. 2 til ca. 3 rumfang pyrogenfrit vand ved ca. 25-ca.

• 30°C og pH ca. 7 i ca.30-ca.60 minutter, fjernelse af lipider, denaturerede proteiner og prothrombinkompleks fra ekstraktopløsningen ved adsorption, udfældning af fibrinogen og dets denaturerede og nedbrudte produkter uden fjernelse af væsentlige mængder faktor VIII fra den fremkomne flydende ekstrakt ved afkøling af væsken til fra ca. 1°C til ca. 2°C i ca. 1/2 time til ca. 2 timer, adskillelse, stabilisering, klaring og sterilisering af den overliggende væske indeholdende ca.

80% eller mere af indholdet af faktor VIII i det som udgangsmateriale anvendte kryobundfald og lyofilisering af den stabiliserede overliggende væske.

5 146098

Eksempel 1.

Frossen plasma, f.eks. 100-3000 liter optøes ved fra ca. -5°C til ca. +2°C og samles i en passende beholder. Større rumfang kan behandles, men driften bliver vanskelig. Den kolde uopløselige fraktion (kryobundfald) opsamles fortrinsvis i centrifuger med kontinuerlig, gennemstrømning (Sharpless eller lignende centrifuger) ved mindre end 3°C. Andre opsamlingsmetoder kan anvendes,men er mindre effektive.

Kryobundfaldet vejes og blandes så med et lille rumfang destilleret pyrogenfrit vand, fortrinsvis i en blander af Waring-typen i nogle få sekunder til fremstilling af en opslæmning eller emulsion. Opslæmningen ekstraheres så i fra 2- ca. 3 rumfang destilleret pyrogenfrit vand ved pH ca. 7,0 i ca.3O-ca.60 minutter efter opvarmning til 20-30°C. Aluminiumhydroxidgel tilsættes så i en mængde fra 10-30 ml pr. liter og får lov at adsorbere i 15 minutter. 0,5-2,0 vægt$ tricalciumfosfat kan tilsættes til yderligere rensning og mængden af aluminiumhydroxid reduceres. Dette trin hjælper til fjernelse af lipider, denatureret proteiner og prothrombinkompleks. Hele fremgangsmåden udføres i en reaktionsbeholder med kappe og kontinuerlig omrøring,idet man drager omsorg for at undgå skumning. Beholderens indhold afkøles så til en indre temperatur fra ca. 1°C til ca. 2°C i ca.l/2-ca.2 timer. Det tunge bundfald, som dannes, fjernes ved centrifugering med kontinuerlig strømning (f.eks. Sharpless). Den overliggende væske stabiliseres med 0,02 molær trinatriumcitrat og 0,1 molær glycin ved en temperatur på 20-25°C og pH-værdien indstilles til 7,0 med citronsyre. Opløsningen klares så og steriliseres ved at lede væsken gennem 293 min Millipore membranfiltre (eller dermed ækvivalente patroner), der typisk har porer med en diameter på 1,2, 0,65, 0,45 eller 0,3 mikron. Den fremkomne sterile opløsning indeholdende fra ca. 25% til ca. 30% af faktor Vin i det oprindelige plasmaudgangsmateriale lyofiliseres på normal måde til lagring.

Variationer i fremstillingsteknikken, specielt anvendelse af genfrossen kryobundfald kan anvendes, omend udbyttet af faktor VIII i sådanne situationer vil blive formindsket og afhænger af dens koncentration i udgangsmateriale. Ekstraktion af AHF kan udføres i andre stødpuder med lav ionstyrke, såsom tris stødpude. Køletiden kan også varieres, forøges eller gentages flere gange med noget yderligere aggregering af faktor VIII, uden at der dermed afviges fra opfindelsen. Ligeledes kan ekstraktionstiden forøges op til 24 timer indenfor den beskrevne fremgangsmåde.

6 146098

Det fremkomne produkt kan lagres ved +5°C i lange tider, mindst et år og rekonstitueres i destilleret vand eller fysiologisk saltopløsning. På grund af dets forholdsvis lave fibrinogenindhold og højere albuminindhold går det meget hurtigt i opløsning. Da hele forarbejdningstiden er meget kort sammenlignet med andre fremstillingsmetoder fra det tidspunkt, hvor poserne med plasma åbnes er bakterievæksten begrænset. Den omstændighed, at ekstraktionen udføres i destilleret vand, nedsætter mængden af fibrinogen og gammaglobuliner, som går i opløsning. Ved afkøling til 2°C sker selektiv udfældning af overskydende fibrinogen og dets denaturerede og nedbrudte produkter og isohemaglutininer (makroglobuliner) uden måleligt tab af AHF. Det tunge fnuggede bundfald af fibrinogen indeslutter sandsynligvis desuden pyrogent materiale, der findes, og reducerer mængder af hepatitisa s so .ci er et antigen, (HAA eller hepatitis virus). Dette resulterer i et produkt, der er renset 30-60 gange sammenlignet med plasma og som har et meget lavt fibrinogen-indhold og "saltagtige" isohemaglutininer. Hvis det ønskes kan dette produkt renses yderligere og koncentreres på kendte måder eller nye måder. En stor fordel ved den foreliggende opfindelse er, at det yderst rene AHF kan fremstilles på mindre end 8 timer sammenlignet med 2-3 gange så lang tid ved de kendte fremgangsmåder.

Det ovenfor anførte eksempel er den optimale fremgangsmåde, der i øjeblikket kendes til udførelse af opfindelsen. Det vil dog være klart, at opfindelsen kan udføres gennem anvendelse af sædvanlige forarbejdningsmetoder og materialer på opfindelsens principper. Medens det f.eks. i almindelighed ikke er økonomisk praktisk at begynde med mindre end ca. 100 liter plasma eller kryobundfald fra denne mængde plasma, er det klart, at der ikke er nogen afgørende betydning forbundet med hverken den øvre eller den nedre værdi for rumfanget, der er anført i eksemplet, og variationer på 50% af disse værdier har ingen indflydelse på opfindelsen. Metoderne i det optimale eksempel udføres under anvendelse af velkendt og let tilgængeligt udstyr, såsom en Sharpless centrifuge, en Waring blander osv., men det vil erkendes, at disse trin som sådan isoleret fra opfindelsens princip og det anvendte udstyr ikke er af afgørende betydning,og at variationer kan foretages •indenfor opfindelsens rammer, afhængende af hvem der udfører arbejdet og hvilket udstyr, der står til rådighed. Adsorption af aluminiumhydroxid er i sig selv en kendt foranstaltning og ikke af afgørende betydning for opfindelsens ide. Der er betydelig frihed ved udførelsen af dette trin, f.eks. ved at benytte andre adsorbenter osv. eller samme formål kan opnås gennem et ækvivalent trin eller ved helt at 7 146098 udelade det. Når først den overliggende væske indeholdende faktor VIII er opnået i højt udbytte, behandles den på sædvanlig måde, f.eks. bliver den klaret og steriliseret gennem standard mikroporerfiltrering, lyofiliseret for at koncentrere faktor VIII i et lille let lagret rumfang, og kan let rekonstitueres under anvendelse af sædvanlige væsker, f.eks. pyrogenfrit vand eller fysiologisk saltopløsning.

Eksempel 2.

215 liter frossen plasma blev tøet ved at holde en temperatur, der ikke overstiger +2°C. Den uopløselige fraktion (eller kryobundfald) blev opsamlet i centrifuger med kontinuert gennemstrømning og med et kølesystem, der holder temperaturen på mindre end +3°C. Kryobundfaldet blev ekstraheret med to rumfang destilleret pyrogenfrit vand ved 20°C, pH 7, i 30 minutter.

Aluminiumhydroxidgel blev tilsat i en mængde på 2 liter pr. kg kryo= bundfald. Derefter blev produktet afkølet til +2°C i 30 minutter. Bundfaldet blev så fjernet ved centrifugering.

Supernatanten blev stabiliseret med trinatriumcitrat og glycin og steriliseret ved at passere en milliporemembran som beskrevet i det foregående eksempel. Den fremkomne sterile opløsning (5,2 liter) indeholdt 12,2 enheder F. VIII/ml, hvilket svarer til et udbytte på 30% beregnet på udgangsplasmaen.

Fibrinogenindholdet var 6,7 g/1.

Det totale proteinindhold var 15,03 g/1.

Beregnet for 4000 enheder faktor VIII:

Fibrinogen: 2,2 g.

Proteiner: 4,9 g.

Dette resultat er sammenstillet med analyseresultater for tre kendte produkter i nedenstående tabel.

Undersøgt produkt Total fibrinogen Total proteiner (faktor VIII)_(g/4000 U.faktor VIII) (g/4000 U. faktor VIII)

Armour Pharmaceutical 2,0______14_;___

Abbot___4,8_____20_

Hyland__1,0________5,6__

Ifølge opfindelsen_ 2,2_______4,9_ 8 146098

Om produktet Hyland, der er fremstillet ifølge amerikansk patent nr. 3.803.115, skal bemærkes, at udbyttet af faktor VIII i forhold til udgangsplasmaen kun er 12,5 - 13,6%, hvilket udbytte kan forhøjes til 17%, hvis processen udføres i nærværelse af heparin.

Litteraturhenvisninger i beskrivelsen_ I. Wickerhauser, M.: Large scale fractionation of Factor VIII -Concentrate from cryoethenol precipitate.

Thromb. Diath. Haemorrh. 43?165. 1971 2j_ Hershgold, EJ., Pool, J.G., and Papperhagen, A.R. The potent antihemophilic concentrate derived from a cold insoluble fraction of human plasma; Characterization and further data on preparation and cli trial. J. Lab. Clin. Med.. 67:25. 1966.

3j_ Hershgold, E.J., Davison, A.M., & Janzen, M.E. Isolation and some chemical properties of human Factor VIII (antihemophilic factor).

J. Lab. Clin. Med., 77:185. 1971 4. James, H.L. and Wickerhauser, M.: Development of large scale fractionation methods. Vox Sang. 23:402, 1972.

5. Sgouris, J.T. and Wickerhauser, M.: Use of frozen cryoprecipitate for the preparation of clinical Factor VIII concentrate. Transfusion 13:399, 1973.

6. Recent advances in Hemophilia. Ann. N.Y. Acad. Sci. 240, 1-426, 1975« 7. Pool, J.G. Recent chapters in the Factor VIII sage: perils of a protein. West. J.of Med. 122:406, 1975

Fekete, L.F. and Holst, S.L. Stabilization of AHF using Heparin.

U.S. Patent No. 3.803.115. April 9, 1974.