NO149610B - Fremgangsmaate for rensing av den antihemofile faktor, faktor viii - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for rensing av den antihemofile faktor, faktor VIII, ved ekstrahering ved romtemperatur og med et vandig medium med lav ionestyrke, av et kryopresipitat oppnådd ved opptining av plasma.

Det har vært foreslått flere forskjellige metoder for fremstilling av den anti-hemofile faktor (AHF eller faktor VIII) for terapeutisk bruk, f. eks. selektiv utfelling, satsabsorbsjon og elu-ering, ekstraksjon i lavioniske media og kromatografi. De kjemikalier som oftest brukes for utfelling omfatter alkohol, garve-syre, ammoniumsulfat, glycin og polyetylenglykol. Mens rensing av faktor VIII medfører eliminering av et antall andre plasmaproteiner, er fibrinogen langt det viktigste og vanske-ligste av disse proteiner, spesielt når det er denaturert ved slike prosesser som alkoholutfelling, frysing og opptining. Dette denaturerte fibrinogen påvirker filtreringen av AHF, forårsaker betydelige tap av AHF under rensetrinnene og reduserer oppløseligheten av lyofilisert produkt i den rekonstituerende væske. Således krever enhver tilfredsstillende metode for rensing av AHF fjerning av betydelige mengder fibrinogen. De ovenfor beskrevne selektive utfellingsteknikker er ment til dette formål, men har alle de mangler at de enten denaturerer fibrinogen og AHF ytterligere eller gir uønskede tap av AHF.

Fremgangsmåter som benytter enkel kaldutfelling uten kjemikalier (kryoutfelling) er begrenset til produksjon i liten måle-stokk, vanligvis i blodbanker og resulterer ved terapeutisk bruk i blod med høyt innhold av fibrinogen, et trekk som be-traktes uønsket av flere eksperter.

Fremgangsmåter som omfatter ekstrahering av faktor VIII fra et kryopresipitat i buffere med lav ionestyrke har, selvom fibrin-ogeninnholdet i sluttproduktet er noe redusert, fremdeles et uønsket høyt proteininnhold, krever således spesialutstyr og fremgangsmåter for sentrifugering og er begrenset hva angår totalmengden AHF som ekstraheres fra kryopresipitatet uten å forringe rensingen.

Andre problemer som vanligvis forbindes med fremstilling i stor skala av AHF er forurensning med pyrogenstoffer og vira som forårsaker hepatitis (hepatitisassosiert antigen, HAA) i sluttproduktet. Med kjemiske utfellingsmidler kan disse uønskede forurensede stoffer i virkeligheten økes.

Den heri beskrevne fremgangsmåte eliminerer disse problemer og er fri for de mangler som opptrer i forbindelse med kjemiske utfellingsmidler og angår den enkle fremgangsmåte bestående i selektiv kaldutfelling av fibrinogen, denaturerte og nedbrutte produkter derav. (Angivelse med henblikk på fjerning av fibrinogen omfatter heretter fjerning av fibrinogen såvel som dettes denaturerte og nedbrutte produkter).

Den selektive utfelling av fibrinogen uten dermed forbundet tap av faktor VIII har tidligere ikke vært gjennomført som praktisk fremgangsmåte ved fremstilling i stor skala av et renset AHF-konsentrat. Således fremhever Wickerhauser (Henvisning I) vik-tigheten av å begrense tiden og temperaturen ved ekstrahering av AHF. "Noe høyere utbytter av AHF oppnås ved forlenget Tris-ekstraksjon [tris(hydroksymetyl)aminometan] ved 30°C ut over 60 min., men ekstraktet var i økende grad forurenset med aggre-gert fibrinogen som gjorde sluttkonsentratet lite filtrerbart. Omvendt ble det oppnådd lavere og variable AHF-utbytter ved kortere ekstraksjon eller ved lavere temperatur". Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen eliminerer alle disse problemer fordi enhver overdreven fibrinogenforurensning fjernes under avkjøling samtidig som det ikke går tapt noe AHF.

Mens virkningen av avkjølingen tidligere er bemerket av Hershgold et al (Henvisning 2), krevet disse 18-30 timer ved 4°C,

de oppnådde eller foreslo imidlertid ikke den akselererte og selektive utfelling av fibrinogen og isohemagglutininer ved lavere temperaturer på 0-2°C. Således eliminerer Hershgold et al i et senere arbeid totalt et avkjølingstrinn i et forsøk på

å fremstille meget sterkt renset AHF (Henvisning 3). Forfatt-erne (2) medgir at de ikke var istand til å gi et terapeutisk konsentrat som konsistent kunne filtreres sterilt, og de måtte ty til ytterligere trinn med alkohol eller glycinutfelling.

De slående forbedringer ifølge foreliggende oppfinnelse var en uventet overraskelse i lys av de lite oppmuntrende rapporter fra Hershgold og andre.

James og Wickerhauser (Henvisning 5) fremfører riktignok at fremgangsmåten må utføres ved romtemperatur for å unngå utfelling av fibrinogen, men disse kunne ikke utvikle noen fremgangsmåte for å fremstille et faktor Vlll-konsentrat ved bruk av prinsippene ifølge oppfinnelsen. Deres sluttprodukt ble også oppnådd i et meget lavere utbytte og med lavere renhet, sammenlignet med det som beskrives ifølge oppfinnelsen. Ytterligere behandling med PEG (polyesterglykol) for å fjerne fibrinogen og å øke renheten resulterte i ennå mere alvorlige tap av faktor VIII (Henvisning 1 og 6).

Det skal her videre henvises til DE-OS 2 516 186. Den fremgangsmåte som der beskrives omfatter på den ene side en avkjøling til en temperatur på 5-20°C og etter fjerning av det dannede presipitat et siste klaringstrinn av filtratet ved ultrasentri-fugering, et trinn som gjennomføres adskilt av avkjølingstrinn-et og som gjennomføres ved en temperatur på 0-18°C. I eksemplet utføres det siste klaringstrinn ved 15°C.

Foreliggende oppfinnelse har til hensikt å bedre den kjente teknikk og angår således en fremgangsmåte for rensing av den antihemofile faktor eller faktor VIII ved ekstrahering ved romtemperatur og med et vandig medium med lav ionestyrke av et kryopresipitat oppnådd ved opptining av plasma, og avkjøl-ing av den således oppnådde ekstrakt for utfelling av urenheter, hvoretter man fjerner det dannede presipitat og gjenvinner den overstående væske, og fremgangsmåten karakteriseres ved at kryopresipitatet fremstilles ved opptining av plasma til en temperatur opp til men ikke over +2°C og at man gjennom-fører ekstraheringen av kryopresipitatet ved pH7 med apyrogent vann til en temperatur på 20-30°C, og at avkjølingen gjennom-føres til en temperatur mellom +1 og +2°C i mellom 30 min. og 2 timer.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen skiller seg fra fremgangsmåten som angitt i DE-OS 2 516 186 ved at det overraskende er funnet at den antihemofile faktor og produktet som felles ut under avkjølingen ikke har de samme oppløselighetskarakteris-tika under avkjøling til temperatur på +1 til +2°C, selv om de har de samme oppløselighetskarakteristika (d.v.s. at de er uoppløselige) under oppvarming av frosset plasma til en temperatur opptil men ikke over +2°C, d.v.s. til det samme tempera-turintervall.

Således ser det ut til at andre i lang tid har antatt eller fra sin erfaring har konkludert at det ikke var å forvente noen spesiell forbedring av resultatene ved bruk av kun noe lavere temperaturer ved utfelling og fjerning av fibrinogen kun etter meget kort utfellingstid. De uventede og sterkt forbedrede resultater som ble funnet og som angis heri, er i sterk motset-ning til det som er beskrevet og foreslått i teknikkens stand.

Foreliggende oppfinnelse angår en spesifikk fremgangsmåte for fremstilling i stor skala av en faktor Vlll-konsentrat. Blant de mere unike trekk ved oppfinnelsen er den selektive kaldutfelling av eksessive mengder fibrinogen, dettes denaturerte former og nedbrytningsprodukter, i oppløsninger med lav ionestyrke, uten tilsatte kjemikalier, og uten uønskede tap av AHF-aktivitet. Et ytterligere fremtredende trekk er det overraskende høye utbytte av faktor VIII, omtrent 25-30% av det teoretiske plasma. I tillegg, og på tross av det høye AHF-utbytte, er proteininnholdet redusert 50-75%, sammenlignet med andre produkter. Dette er illustrert i tabellen. Behovet for et frysetørket AHF-konsentrat med høyt utbytte og med høy renhet har mottatt internasjonal anerkjennelse og oppmerksomhet (Henvisning 7, 8), og man er generelt enige i at kommersielle konsentrater vanligvis inneholder mindre enn 20% av det teoretiske AHF som er tilstede i plasma (Henvisning 7, 8 og 9).

Fremgangsmåteeksempel

Frosset-plasma, f. eks. 100-3000 1, opptines ved fra -5 til omkring +2°C og samles i en egnet beholder eller lignende. Større volumer kan behandles, men driften blir vanskelig. Den kalde uoppløselige fraksjon (kryoprecipitat) samles, fortrinnsvis i en kontinuerlig strømningssentrifuge ("Sharpless" e.l.) ved under 3°C. Andre samlemetoder kan benyttes, men er mindre effektive. Kryoprecipitatet veies og blandes deretter med en liten mengde destillert pyrogenfritt vann, fortrinnsvis i en blander av "Waring"-typen i noen få sekunder for å gi en oppslem-ming eller emulsjon. Oppslemmingen ekstraheres deretter i fra 2 til omkring 3 volumer destillert vann ved omkring pH 7,0 i omkring 30 til omkring 60 min. etter oppvarming til 20-30°C. Aluminiumhydroksydgel tilsettes deretter i en mengde fra 10-30 ml/l og tillates å adsorbere i 15 min. Trikalsiumfosfat, 0,5-2,0 vekt-%, kan tilsettes for ytterligere rensing og mengden aluminiumhydroksyd reduseres. Dette trinn understøtter fjerning av lipider, denaturerte proteiner og protrombinkompleks. Hele fremgangsmåten gjennomføres i en reaksjonsbeholder med kappe under kontinuerlig omrøring mens man passer på å unngå skumming. Innholdet i beholderen avkjøles deretter til en indre temperatur på fra 1 til 2°C ifra i~2 timer. Den tunge utfelling som dannes fjernes ved kontinuerlig strømningssentrifugering (f. eks. "Sharpless"). Den overstående væske stabiliseres med 0,02 molar trinatriumsitrat og 0,1 molar glycin ved en temperatur på 20-25°C og pH-verdien justeres til 7,0 med sitronsyre. Oppløsningen klares deretter og steriliseres ved å føre væsken gjennom 293 mm "Millipore"-membranfiltre (eller tilsvarende filtre), f. eks. med porediametre på 1,2, 0,65, 0,45 eller 0,3 ym. Den resulterende sterile oppløsning inneholdende fra 25-30% av faktor VIII i det originale plasmautgangsmateriale lyofiliseres på vanlig måte for lagring.

Det resulterende produkt kan lagres ved +5°C i lang tid, i det minste 1 år, og kan rekonstitueres i destillert vann eller fysiologisk saltoppløsning. På grunn av det relativt lave fibrin-ogeninnhold og det høyere albumininnhold, går det lett i opp-løsning. Fordi hele prosesstiden er meget kort sammenlignet med andre fremgangsmåter fra det tidspunkt da plasmaposen åpnnes, blir bakterieveksten redusert. Det faktum at ekstraheringen gjennomføres i destillert vann reduserer mengden av fibrinogen og gammaglobuliner som går i oppløsning. Ved avkjøling til 2°C inntrer selektiv utfelling av overskytende fibrinogen og dettes denaturerte og nedbrytningsprodukter og isohemagglutiner (makroglobuliner) uten målbare tap av AHF. I tillegg fører det tunge flokkulerende precipitat av fibrinogen til en medrivning av tilstedeværende pyrogene stoffer og reduserer mengden av hepatitis asossiert antigen (HAA eller hepatitis virus). Dette resulterer i et produkt som i forhold til plasma er renset 30-6 0 ganger, og det har et meget lavt innhold av fibrinogen og "saltoppløsning" isohemagglutiner. Hvis ønskelig kan dette produkt renses ytterligere og konsentreres ved kjente eller nye fremgangsmåter. Som et eksempel på en ny fremgangsmåte kan faktor Vlll-preparater med ekstremt høy renhet fremstilles ved ytterligere trinn som omfatter tilsetning av 3-6% poyol (PEG eller "pluronic" (henvisning 10) og deretter avkjøling i 1-2 timer ved 0-2°C. Se referanse 7 i tabellen. En stor fordel ved foreliggende oppfinnelse er at det ekstremt rene AHF kan fremstilles på mindre enn 8 timer, sammenlignet med de 2-3 ganger så lange tidsrom man måtte ta i betraktning ved tidligere fremgangsmåter.

Det ovenfor gitte eksempel er den optimale fremgangsmåte som idag er benyttet for gjennomføring av fremgangsmåten. Det vil imidlertid være klart at oppfinnelsen kan praktiseres ved an-vendelse av konvensjonelle behandlingsteknikker og stoffer.

Mens det generelt ikke er økonomisk å begynne med mindre enn omkring 100 1 plasma eller kryoprecipitat fra denne mengde plasma, er det klart at det ikke foreligger noen kritiske gren-ser hverken opp eller ned hva angår volumverdiene som er gitt i eksemplet, og i variasjoner på 50% eller deromkring hva angår disse verdier påvirker ikke oppfinnelsen. Fremgangsmåtene i det optimale eksempel gjennomføres ved bruk av godt kjent og lett tilgjengelig utstyr slik som "Sharples"-sentrifuger, "Waring"-blandere osv., men det er åpenbart at det avhengig av foreliggende utstyr og annet kan brukes andre egnede ting. Adsorbsjonen av aluminiumhydroksyd er et velkjent trinn per se og ikke kritisk for oppfinnelsen. Således kan det anvendes andre adsorbsjonsmidler, eller det kan benyttes ekvivalente trinn eller det kan helt utelates. Når den overstående væske inneholdende faktor VIII med høy gjenvinningsgrad er oppnådd, behandles denne på vanlig måte for lagring og rekonstituering, dvs. den klares og steriliseres ved vanlig mikroporefiltrering, lyofiliseres for å konsentrere faktor VIII til et lite volum som lett kan lagres, og rekonstitueres ved bruk av konvensjonelle væsker, f. eks. pyrogenfritt vann eller fysiologisk saltoppløsning.

Litteraturhenvisninger:

1. Vickerhauser, M.: "Large scale fractionation of Factor Vlll-Concentrate from cryoethenol precipitate". " Tromb,

Diath, haemorrh." 43:165, 1971.

2. Hershgold, E.J., Pool, J.G. og Papperhager, A.R. "The Potent antihemophilic concentrate derived from a cold in-soluble fraction of human plasma; Characterization and further data on preparation and clinical trial." " J. Lab. Cli. Med.", 67:23, 1966 3. Hershgold, E.J., Davidson, A.M., & Janzen, M.E., "Isolation and some chemical properties of human factor VIII (antihemophilic factor)". " J. Lab. Clin. Med.," 77:185, 1971 4. Shanbrom, E. & Fekete, L. "Production of stable hig potency human AHF using polyethylene glycol and glycine to fractio-nate a cryoprecipitate of AHF concentrate. US patent nr. 3. 631. 018. 5. James, H.L. og Wickerhauser, M.: "Development of large scale fractionations methods." "Vox Sang." 23:402, 1972

(c.A. TJ 137124c)

6. Sgouris, J.T. og Wickerhauser, M.: "Use of frozen cryoprecipitate for the preparation of clinical Factor VIII concentrate". " Transfusjon" 13:399, 1973. 7. "Recent Advances in Hemophilia". " Ann. N. Y. Acad. Sei." 240, 1-426, 1975. 8. Pool, J.G. "Recent chapters in the Factor VIII saga: perils of a protein". West. J. of Med." 122:406, 1975 9. Fekete, L.F. og Holst, S.L. "Stabilization of AHF using Heparin". US- patent nr. 3 803 115 tilsvarende NO-PS 142381). 10. "Alpha-hydro-omega-hydroxy-poly(oxyethylene)poly(oxypropy-lene)poly(oxyethylene) block copolymer", " BASF- Wyandatte Corp.": "The Wonderful World of Pluronic Polyols", 1971.

(PEG er forkortelsen for polyetylenglykol).

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for rensing av den antihemofile faktor ved ekstrahering ved romtemperatur og med et vandig medium med lav ionestyrke av et kryopresipitat oppnådd ved opptining av plasma, og avkjøling av den således oppnådde ekstrakt for utfelling av urenheter, hvoretter man fjerner det dannede presipitat og gjenvinner den overstående væske,karakterisert ved at kryopresipitatet fremstilles ved opptining av plasma til en temperatur opp til men ikke over +2°C, og at man gjennomfører ekstraheringen av kryopresipitatet ved pH7 med apyrogent vann ved en temperatur på 20-30°C, og at avkjølingen av ekstrakten gjennomføres til en temperatur mellom +1 og +2°C i mellom 30 min. og 2 timer.