NO149610B

NO149610B - PROCEDURE FOR CLEANING THE ANTIHEMOFILE FACTOR, FACTOR VIII

Info

Publication number: NO149610B
Application number: NO762742A
Authority: NO
Inventors: Edward Shanbrom
Original assignee: Merieux Inst
Priority date: 1976-08-06
Filing date: 1976-08-06
Publication date: 1984-02-13
Also published as: NO762742L; NO149610C

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for rensing av den antihemofile faktor, faktor VIII, ved ekstrahering ved romtemperatur og med et vandig medium med lav ionestyrke, av et kryopresipitat oppnådd ved opptining av plasma. The present invention relates to a method for purifying the antihemophilic factor, factor VIII, by extraction at room temperature and with an aqueous medium of low ionic strength, from a cryoprecipitate obtained by thawing plasma.

Det har vært foreslått flere forskjellige metoder for fremstilling av den anti-hemofile faktor (AHF eller faktor VIII) for terapeutisk bruk, f. eks. selektiv utfelling, satsabsorbsjon og elu-ering, ekstraksjon i lavioniske media og kromatografi. De kjemikalier som oftest brukes for utfelling omfatter alkohol, garve-syre, ammoniumsulfat, glycin og polyetylenglykol. Mens rensing av faktor VIII medfører eliminering av et antall andre plasmaproteiner, er fibrinogen langt det viktigste og vanske-ligste av disse proteiner, spesielt når det er denaturert ved slike prosesser som alkoholutfelling, frysing og opptining. Dette denaturerte fibrinogen påvirker filtreringen av AHF, forårsaker betydelige tap av AHF under rensetrinnene og reduserer oppløseligheten av lyofilisert produkt i den rekonstituerende væske. Således krever enhver tilfredsstillende metode for rensing av AHF fjerning av betydelige mengder fibrinogen. De ovenfor beskrevne selektive utfellingsteknikker er ment til dette formål, men har alle de mangler at de enten denaturerer fibrinogen og AHF ytterligere eller gir uønskede tap av AHF. Several different methods have been proposed for the preparation of the anti-haemophilic factor (AHF or factor VIII) for therapeutic use, e.g. selective precipitation, rate absorption and elution, extraction in ionic media and chromatography. The chemicals most often used for precipitation include alcohol, tannic acid, ammonium sulphate, glycine and polyethylene glycol. While purification of factor VIII entails the elimination of a number of other plasma proteins, fibrinogen is by far the most important and difficult of these proteins, especially when it is denatured by such processes as alcohol precipitation, freezing and thawing. This denatured fibrinogen affects the filtration of AHF, causes significant losses of AHF during the purification steps and reduces the solubility of lyophilized product in the reconstitution fluid. Thus, any satisfactory method for the purification of AHF requires the removal of significant amounts of fibrinogen. The selective precipitation techniques described above are intended for this purpose, but all have the shortcoming of either further denature fibrinogen and AHF or cause unwanted loss of AHF.

Fremgangsmåter som benytter enkel kaldutfelling uten kjemikalier (kryoutfelling) er begrenset til produksjon i liten måle-stokk, vanligvis i blodbanker og resulterer ved terapeutisk bruk i blod med høyt innhold av fibrinogen, et trekk som be-traktes uønsket av flere eksperter. Methods that use simple cold precipitation without chemicals (cryoprecipitation) are limited to production on a small scale, usually in blood banks, and result in therapeutic use in blood with a high content of fibrinogen, a feature that is considered undesirable by several experts.

Fremgangsmåter som omfatter ekstrahering av faktor VIII fra et kryopresipitat i buffere med lav ionestyrke har, selvom fibrin-ogeninnholdet i sluttproduktet er noe redusert, fremdeles et uønsket høyt proteininnhold, krever således spesialutstyr og fremgangsmåter for sentrifugering og er begrenset hva angår totalmengden AHF som ekstraheres fra kryopresipitatet uten å forringe rensingen. Methods that include the extraction of factor VIII from a cryoprecipitate in buffers with low ionic strength, although the fibrinogen content in the final product is somewhat reduced, still have an undesirably high protein content, thus require special equipment and procedures for centrifugation and are limited in terms of the total amount of AHF that is extracted from the cryoprecipitate without impairing the purification.

Andre problemer som vanligvis forbindes med fremstilling i stor skala av AHF er forurensning med pyrogenstoffer og vira som forårsaker hepatitis (hepatitisassosiert antigen, HAA) i sluttproduktet. Med kjemiske utfellingsmidler kan disse uønskede forurensede stoffer i virkeligheten økes. Other problems commonly associated with large-scale production of AHF are contamination with pyrogens and viruses that cause hepatitis (hepatitis-associated antigen, HAA) in the final product. With chemical precipitants, these unwanted pollutants can actually be increased.

Den heri beskrevne fremgangsmåte eliminerer disse problemer og er fri for de mangler som opptrer i forbindelse med kjemiske utfellingsmidler og angår den enkle fremgangsmåte bestående i selektiv kaldutfelling av fibrinogen, denaturerte og nedbrutte produkter derav. (Angivelse med henblikk på fjerning av fibrinogen omfatter heretter fjerning av fibrinogen såvel som dettes denaturerte og nedbrutte produkter). The method described herein eliminates these problems and is free from the shortcomings that occur in connection with chemical precipitation agents and concerns the simple method consisting in selective cold precipitation of fibrinogen, denatured and degraded products thereof. (Statement with a view to the removal of fibrinogen hereafter includes the removal of fibrinogen as well as its denatured and degraded products).

Den selektive utfelling av fibrinogen uten dermed forbundet tap av faktor VIII har tidligere ikke vært gjennomført som praktisk fremgangsmåte ved fremstilling i stor skala av et renset AHF-konsentrat. Således fremhever Wickerhauser (Henvisning I) vik-tigheten av å begrense tiden og temperaturen ved ekstrahering av AHF. "Noe høyere utbytter av AHF oppnås ved forlenget Tris-ekstraksjon [tris(hydroksymetyl)aminometan] ved 30°C ut over 60 min., men ekstraktet var i økende grad forurenset med aggre-gert fibrinogen som gjorde sluttkonsentratet lite filtrerbart. Omvendt ble det oppnådd lavere og variable AHF-utbytter ved kortere ekstraksjon eller ved lavere temperatur". Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen eliminerer alle disse problemer fordi enhver overdreven fibrinogenforurensning fjernes under avkjøling samtidig som det ikke går tapt noe AHF. The selective precipitation of fibrinogen without the associated loss of factor VIII has previously not been carried out as a practical method for large-scale production of a purified AHF concentrate. Thus, Wickerhauser (Reference I) emphasizes the importance of limiting the time and temperature when extracting AHF. "Slightly higher yields of AHF are obtained by prolonged Tris extraction [tris(hydroxymethyl)aminomethane] at 30°C over 60 min., but the extract was increasingly contaminated with aggregated fibrinogen which made the final concentrate unfilterable. Conversely, obtained lower and variable AHF yields with shorter extraction or at lower temperature". The method of the invention eliminates all these problems because any excessive fibrinogen contamination is removed during cooling while no AHF is lost.

Mens virkningen av avkjølingen tidligere er bemerket av Hershgold et al (Henvisning 2), krevet disse 18-30 timer ved 4°C, While the effect of cooling has previously been noted by Hershgold et al (Reference 2), these required 18-30 hours at 4°C,

de oppnådde eller foreslo imidlertid ikke den akselererte og selektive utfelling av fibrinogen og isohemagglutininer ved lavere temperaturer på 0-2°C. Således eliminerer Hershgold et al i et senere arbeid totalt et avkjølingstrinn i et forsøk på however, they did not achieve or suggest the accelerated and selective precipitation of fibrinogen and isohemagglutinins at lower temperatures of 0-2°C. Thus Hershgold et al in a later work completely eliminate a cooling step in an attempt to

å fremstille meget sterkt renset AHF (Henvisning 3). Forfatt-erne (2) medgir at de ikke var istand til å gi et terapeutisk konsentrat som konsistent kunne filtreres sterilt, og de måtte ty til ytterligere trinn med alkohol eller glycinutfelling. to produce highly purified AHF (Reference 3). The authors (2) admit that they were unable to provide a therapeutic concentrate that could be consistently sterile filtered, and they had to resort to additional alcohol or glycine precipitation steps.

De slående forbedringer ifølge foreliggende oppfinnelse var en uventet overraskelse i lys av de lite oppmuntrende rapporter fra Hershgold og andre. The striking improvements of the present invention were an unexpected surprise in light of the unencouraging reports of Hershgold and others.

James og Wickerhauser (Henvisning 5) fremfører riktignok at fremgangsmåten må utføres ved romtemperatur for å unngå utfelling av fibrinogen, men disse kunne ikke utvikle noen fremgangsmåte for å fremstille et faktor Vlll-konsentrat ved bruk av prinsippene ifølge oppfinnelsen. Deres sluttprodukt ble også oppnådd i et meget lavere utbytte og med lavere renhet, sammenlignet med det som beskrives ifølge oppfinnelsen. Ytterligere behandling med PEG (polyesterglykol) for å fjerne fibrinogen og å øke renheten resulterte i ennå mere alvorlige tap av faktor VIII (Henvisning 1 og 6). James and Wickerhauser (Reference 5) state that the method must be carried out at room temperature to avoid precipitation of fibrinogen, but they could not develop any method for producing a factor VIII concentrate using the principles according to the invention. Their final product was also obtained in a much lower yield and with lower purity, compared to what is described according to the invention. Further treatment with PEG (polyester glycol) to remove fibrinogen and increase purity resulted in even more severe losses of factor VIII (References 1 and 6).

Det skal her videre henvises til DE-OS 2 516 186. Den fremgangsmåte som der beskrives omfatter på den ene side en avkjøling til en temperatur på 5-20°C og etter fjerning av det dannede presipitat et siste klaringstrinn av filtratet ved ultrasentri-fugering, et trinn som gjennomføres adskilt av avkjølingstrinn-et og som gjennomføres ved en temperatur på 0-18°C. I eksemplet utføres det siste klaringstrinn ved 15°C. Here, further reference should be made to DE-OS 2 516 186. The method described there comprises, on the one hand, cooling to a temperature of 5-20°C and, after removal of the formed precipitate, a final clarification step of the filtrate by ultracentrifugation , a step which is carried out separately from the cooling step and which is carried out at a temperature of 0-18°C. In the example, the last clarification step is carried out at 15°C.

Foreliggende oppfinnelse har til hensikt å bedre den kjente teknikk og angår således en fremgangsmåte for rensing av den antihemofile faktor eller faktor VIII ved ekstrahering ved romtemperatur og med et vandig medium med lav ionestyrke av et kryopresipitat oppnådd ved opptining av plasma, og avkjøl-ing av den således oppnådde ekstrakt for utfelling av urenheter, hvoretter man fjerner det dannede presipitat og gjenvinner den overstående væske, og fremgangsmåten karakteriseres ved at kryopresipitatet fremstilles ved opptining av plasma til en temperatur opp til men ikke over +2°C og at man gjennom-fører ekstraheringen av kryopresipitatet ved pH7 med apyrogent vann til en temperatur på 20-30°C, og at avkjølingen gjennom-føres til en temperatur mellom +1 og +2°C i mellom 30 min. og 2 timer. The present invention aims to improve the known technique and thus relates to a method for purifying the antihemophilic factor or factor VIII by extraction at room temperature and with an aqueous medium with low ionic strength of a cryoprecipitate obtained by thawing plasma, and cooling the thus obtained extract for precipitation of impurities, after which the formed precipitate is removed and the overlying liquid is recovered, and the method is characterized by the fact that the cryoprecipitate is produced by thawing plasma to a temperature up to but not above +2°C and that one carries out the extraction of the cryoprecipitate at pH7 with pyrogen-free water to a temperature of 20-30°C, and that the cooling is carried out to a temperature between +1 and +2°C for between 30 min. and 2 hours.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen skiller seg fra fremgangsmåten som angitt i DE-OS 2 516 186 ved at det overraskende er funnet at den antihemofile faktor og produktet som felles ut under avkjølingen ikke har de samme oppløselighetskarakteris-tika under avkjøling til temperatur på +1 til +2°C, selv om de har de samme oppløselighetskarakteristika (d.v.s. at de er uoppløselige) under oppvarming av frosset plasma til en temperatur opptil men ikke over +2°C, d.v.s. til det samme tempera-turintervall. The method according to the invention differs from the method stated in DE-OS 2 516 186 in that it has surprisingly been found that the antihemophilic factor and the product which precipitates during cooling do not have the same solubility characteristics during cooling to a temperature of +1 to +2 °C, although they have the same solubility characteristics (i.e. they are insoluble) during heating of frozen plasma to a temperature up to but not above +2°C, i.e. to the same temperature range.

Således ser det ut til at andre i lang tid har antatt eller fra sin erfaring har konkludert at det ikke var å forvente noen spesiell forbedring av resultatene ved bruk av kun noe lavere temperaturer ved utfelling og fjerning av fibrinogen kun etter meget kort utfellingstid. De uventede og sterkt forbedrede resultater som ble funnet og som angis heri, er i sterk motset-ning til det som er beskrevet og foreslått i teknikkens stand. Thus, it appears that others have assumed for a long time or have concluded from their experience that no particular improvement of the results was to be expected by using only somewhat lower temperatures for precipitation and removal of fibrinogen only after a very short precipitation time. The unexpected and greatly improved results which were found and which are stated herein, are in strong contrast to what is described and proposed in the prior art.

Foreliggende oppfinnelse angår en spesifikk fremgangsmåte for fremstilling i stor skala av en faktor Vlll-konsentrat. Blant de mere unike trekk ved oppfinnelsen er den selektive kaldutfelling av eksessive mengder fibrinogen, dettes denaturerte former og nedbrytningsprodukter, i oppløsninger med lav ionestyrke, uten tilsatte kjemikalier, og uten uønskede tap av AHF-aktivitet. Et ytterligere fremtredende trekk er det overraskende høye utbytte av faktor VIII, omtrent 25-30% av det teoretiske plasma. I tillegg, og på tross av det høye AHF-utbytte, er proteininnholdet redusert 50-75%, sammenlignet med andre produkter. Dette er illustrert i tabellen. Behovet for et frysetørket AHF-konsentrat med høyt utbytte og med høy renhet har mottatt internasjonal anerkjennelse og oppmerksomhet (Henvisning 7, 8), og man er generelt enige i at kommersielle konsentrater vanligvis inneholder mindre enn 20% av det teoretiske AHF som er tilstede i plasma (Henvisning 7, 8 og 9). The present invention relates to a specific method for the production on a large scale of a factor Vlll concentrate. Among the more unique features of the invention is the selective cold precipitation of excessive amounts of fibrinogen, its denatured forms and breakdown products, in solutions with low ionic strength, without added chemicals, and without unwanted loss of AHF activity. A further prominent feature is the surprisingly high yield of factor VIII, approximately 25-30% of the theoretical plasma. In addition, and despite the high AHF yield, the protein content is reduced by 50-75%, compared to other products. This is illustrated in the table. The need for a high-yield, high-purity freeze-dried AHF concentrate has received international recognition and attention (References 7, 8), and it is generally agreed that commercial concentrates usually contain less than 20% of the theoretical AHF present in plasma (References 7, 8 and 9).

Fremgangsmåteeksempel Procedure example

Frosset-plasma, f. eks. 100-3000 1, opptines ved fra -5 til omkring +2°C og samles i en egnet beholder eller lignende. Større volumer kan behandles, men driften blir vanskelig. Den kalde uoppløselige fraksjon (kryoprecipitat) samles, fortrinnsvis i en kontinuerlig strømningssentrifuge ("Sharpless" e.l.) ved under 3°C. Andre samlemetoder kan benyttes, men er mindre effektive. Kryoprecipitatet veies og blandes deretter med en liten mengde destillert pyrogenfritt vann, fortrinnsvis i en blander av "Waring"-typen i noen få sekunder for å gi en oppslem-ming eller emulsjon. Oppslemmingen ekstraheres deretter i fra 2 til omkring 3 volumer destillert vann ved omkring pH 7,0 i omkring 30 til omkring 60 min. etter oppvarming til 20-30°C. Aluminiumhydroksydgel tilsettes deretter i en mengde fra 10-30 ml/l og tillates å adsorbere i 15 min. Trikalsiumfosfat, 0,5-2,0 vekt-%, kan tilsettes for ytterligere rensing og mengden aluminiumhydroksyd reduseres. Dette trinn understøtter fjerning av lipider, denaturerte proteiner og protrombinkompleks. Hele fremgangsmåten gjennomføres i en reaksjonsbeholder med kappe under kontinuerlig omrøring mens man passer på å unngå skumming. Innholdet i beholderen avkjøles deretter til en indre temperatur på fra 1 til 2°C ifra i~2 timer. Den tunge utfelling som dannes fjernes ved kontinuerlig strømningssentrifugering (f. eks. "Sharpless"). Den overstående væske stabiliseres med 0,02 molar trinatriumsitrat og 0,1 molar glycin ved en temperatur på 20-25°C og pH-verdien justeres til 7,0 med sitronsyre. Oppløsningen klares deretter og steriliseres ved å føre væsken gjennom 293 mm "Millipore"-membranfiltre (eller tilsvarende filtre), f. eks. med porediametre på 1,2, 0,65, 0,45 eller 0,3 ym. Den resulterende sterile oppløsning inneholdende fra 25-30% av faktor VIII i det originale plasmautgangsmateriale lyofiliseres på vanlig måte for lagring. Frozen plasma, e.g. 100-3000 1, thawed at from -5 to around +2°C and collected in a suitable container or similar. Larger volumes can be processed, but operation becomes difficult. The cold insoluble fraction (cryoprecipitate) is collected, preferably in a continuous flow centrifuge ("Sharpless" etc.) at below 3°C. Other collection methods can be used, but are less effective. The cryoprecipitate is weighed and then mixed with a small amount of distilled pyrogen-free water, preferably in a "Waring" type mixer for a few seconds to produce a slurry or emulsion. The slurry is then extracted in from 2 to about 3 volumes of distilled water at about pH 7.0 for about 30 to about 60 min. after heating to 20-30°C. Aluminum hydroxide gel is then added in an amount from 10-30 ml/l and allowed to adsorb for 15 min. Tricalcium phosphate, 0.5-2.0% by weight, can be added for further purification and the amount of aluminum hydroxide is reduced. This step supports the removal of lipids, denatured proteins and prothrombin complex. The entire procedure is carried out in a jacketed reaction vessel under continuous stirring while taking care to avoid foaming. The contents of the container are then cooled to an internal temperature of from 1 to 2°C from i~2 hours. The heavy precipitate that forms is removed by continuous flow centrifugation (eg "Sharpless"). The supernatant liquid is stabilized with 0.02 molar trisodium citrate and 0.1 molar glycine at a temperature of 20-25°C and the pH value is adjusted to 7.0 with citric acid. The solution is then clarified and sterilized by passing the liquid through 293 mm "Millipore" membrane filters (or equivalent filters), e.g. with pore diameters of 1.2, 0.65, 0.45 or 0.3 um. The resulting sterile solution containing from 25-30% of factor VIII in the original plasma starting material is lyophilized in the usual manner for storage.

Det resulterende produkt kan lagres ved +5°C i lang tid, i det minste 1 år, og kan rekonstitueres i destillert vann eller fysiologisk saltoppløsning. På grunn av det relativt lave fibrin-ogeninnhold og det høyere albumininnhold, går det lett i opp-løsning. Fordi hele prosesstiden er meget kort sammenlignet med andre fremgangsmåter fra det tidspunkt da plasmaposen åpnnes, blir bakterieveksten redusert. Det faktum at ekstraheringen gjennomføres i destillert vann reduserer mengden av fibrinogen og gammaglobuliner som går i oppløsning. Ved avkjøling til 2°C inntrer selektiv utfelling av overskytende fibrinogen og dettes denaturerte og nedbrytningsprodukter og isohemagglutiner (makroglobuliner) uten målbare tap av AHF. I tillegg fører det tunge flokkulerende precipitat av fibrinogen til en medrivning av tilstedeværende pyrogene stoffer og reduserer mengden av hepatitis asossiert antigen (HAA eller hepatitis virus). Dette resulterer i et produkt som i forhold til plasma er renset 30-6 0 ganger, og det har et meget lavt innhold av fibrinogen og "saltoppløsning" isohemagglutiner. Hvis ønskelig kan dette produkt renses ytterligere og konsentreres ved kjente eller nye fremgangsmåter. Som et eksempel på en ny fremgangsmåte kan faktor Vlll-preparater med ekstremt høy renhet fremstilles ved ytterligere trinn som omfatter tilsetning av 3-6% poyol (PEG eller "pluronic" (henvisning 10) og deretter avkjøling i 1-2 timer ved 0-2°C. Se referanse 7 i tabellen. En stor fordel ved foreliggende oppfinnelse er at det ekstremt rene AHF kan fremstilles på mindre enn 8 timer, sammenlignet med de 2-3 ganger så lange tidsrom man måtte ta i betraktning ved tidligere fremgangsmåter. The resulting product can be stored at +5°C for a long time, at least 1 year, and can be reconstituted in distilled water or physiological saline. Due to the relatively low fibrinogen content and the higher albumin content, it dissolves easily. Because the entire process time is very short compared to other methods from the moment the plasma bag is opened, bacterial growth is reduced. The fact that the extraction is carried out in distilled water reduces the amount of fibrinogen and gamma globulins that dissolve. On cooling to 2°C, selective precipitation of excess fibrinogen and its denatured and breakdown products and isohemagglutinins (macroglobulins) occurs without measurable loss of AHF. In addition, the heavy flocculating precipitate of fibrinogen leads to an entrainment of pyrogenic substances present and reduces the amount of hepatitis associated antigen (HAA or hepatitis virus). This results in a product that, compared to plasma, is purified 30-60 times, and it has a very low content of fibrinogen and "saline solution" isohemagglutinins. If desired, this product can be further purified and concentrated by known or new methods. As an example of a new method, extremely high purity Factor Vlll preparations can be prepared by additional steps comprising the addition of 3-6% poyol (PEG or "pluronic" (Ref. 10) and then cooling for 1-2 hours at 0- 2° C. See reference 7 in the table. A major advantage of the present invention is that the extremely pure AHF can be produced in less than 8 hours, compared to the 2-3 times as long time periods that had to be taken into account in previous methods.

Det ovenfor gitte eksempel er den optimale fremgangsmåte som idag er benyttet for gjennomføring av fremgangsmåten. Det vil imidlertid være klart at oppfinnelsen kan praktiseres ved an-vendelse av konvensjonelle behandlingsteknikker og stoffer. The example given above is the optimal method that is used today for carrying out the method. However, it will be clear that the invention can be practiced using conventional treatment techniques and substances.

Mens det generelt ikke er økonomisk å begynne med mindre enn omkring 100 1 plasma eller kryoprecipitat fra denne mengde plasma, er det klart at det ikke foreligger noen kritiske gren-ser hverken opp eller ned hva angår volumverdiene som er gitt i eksemplet, og i variasjoner på 50% eller deromkring hva angår disse verdier påvirker ikke oppfinnelsen. Fremgangsmåtene i det optimale eksempel gjennomføres ved bruk av godt kjent og lett tilgjengelig utstyr slik som "Sharples"-sentrifuger, "Waring"-blandere osv., men det er åpenbart at det avhengig av foreliggende utstyr og annet kan brukes andre egnede ting. Adsorbsjonen av aluminiumhydroksyd er et velkjent trinn per se og ikke kritisk for oppfinnelsen. Således kan det anvendes andre adsorbsjonsmidler, eller det kan benyttes ekvivalente trinn eller det kan helt utelates. Når den overstående væske inneholdende faktor VIII med høy gjenvinningsgrad er oppnådd, behandles denne på vanlig måte for lagring og rekonstituering, dvs. den klares og steriliseres ved vanlig mikroporefiltrering, lyofiliseres for å konsentrere faktor VIII til et lite volum som lett kan lagres, og rekonstitueres ved bruk av konvensjonelle væsker, f. eks. pyrogenfritt vann eller fysiologisk saltoppløsning. While it is generally not economical to start with less than about 100 L of plasma or cryoprecipitate from this amount of plasma, it is clear that there are no critical limits either up or down to the volume values given in the example, and in variations of 50% or thereabouts as regards these values does not affect the invention. The procedures in the optimal example are carried out using well-known and readily available equipment such as "Sharples" centrifuges, "Waring" mixers, etc., but it is obvious that depending on the equipment available and otherwise, other suitable things can be used. The adsorption of aluminum hydroxide is a well-known step per se and not critical to the invention. Thus, other adsorbents can be used, or equivalent steps can be used or it can be completely omitted. When the supernatant containing factor VIII with a high degree of recovery has been obtained, it is processed in the usual way for storage and reconstitution, i.e. it is clarified and sterilized by conventional micropore filtration, lyophilized to concentrate factor VIII into a small volume that can be easily stored, and reconstituted when using conventional liquids, e.g. pyrogen-free water or physiological saline solution.

Litteraturhenvisninger: Literature references:

1. Vickerhauser, M.: "Large scale fractionation of Factor Vlll-Concentrate from cryoethenol precipitate". " Tromb, 1. Vickerhauser, M.: "Large scale fractionation of Factor Vlll-Concentrate from cryoethenol precipitate". " Thrombus,

Diath, haemorrh." 43:165, 1971. Diath, Haemorrh.” 43:165, 1971.

2. Hershgold, E.J., Pool, J.G. og Papperhager, A.R. "The Potent antihemophilic concentrate derived from a cold in-soluble fraction of human plasma; Characterization and further data on preparation and clinical trial." " J. Lab. Cli. Med.", 67:23, 1966 3. Hershgold, E.J., Davidson, A.M., & Janzen, M.E., "Isolation and some chemical properties of human factor VIII (antihemophilic factor)". " J. Lab. Clin. Med.," 77:185, 1971 4. Shanbrom, E. & Fekete, L. "Production of stable hig potency human AHF using polyethylene glycol and glycine to fractio-nate a cryoprecipitate of AHF concentrate. US patent nr. 3. 631. 018. 5. James, H.L. og Wickerhauser, M.: "Development of large scale fractionations methods." "Vox Sang." 23:402, 1972 2. Hershgold, E.J., Pool, J.G. and Papperhager, A.R. "The Potent antihemophilic concentrate derived from a cold in-soluble fraction of human plasma; Characterization and further data on preparation and clinical trial." " J. Lab. Cli. Med.", 67:23, 1966 3. Hershgold, E.J., Davidson, A.M., & Janzen, M.E., "Isolation and some chemical properties of human factor VIII (antihemophilic factor)". " J. Lab. Clin. Med.," 77:185, 1971 4. Shanbrom, E. & Fekete, L. "Production of stable high potency human AHF using polyethylene glycol and glycine to fractionate a cryoprecipitate of AHF concentrate. US Patent No. 3. 631. 018. 5. James, H.L. and Wickerhauser, M.: “Development of large scale fractionations methods.” “Vox Sang.” 23:402, 1972

(c.A. TJ 137124c) (c.A. TJ 137124c)

6. Sgouris, J.T. og Wickerhauser, M.: "Use of frozen cryoprecipitate for the preparation of clinical Factor VIII concentrate". " Transfusjon" 13:399, 1973. 7. "Recent Advances in Hemophilia". " Ann. N. Y. Acad. Sei." 240, 1-426, 1975. 8. Pool, J.G. "Recent chapters in the Factor VIII saga: perils of a protein". West. J. of Med." 122:406, 1975 9. Fekete, L.F. og Holst, S.L. "Stabilization of AHF using Heparin". US- patent nr. 3 803 115 tilsvarende NO-PS 142381). 10. "Alpha-hydro-omega-hydroxy-poly(oxyethylene)poly(oxypropy-lene)poly(oxyethylene) block copolymer", " BASF- Wyandatte Corp.": "The Wonderful World of Pluronic Polyols", 1971. 6. Sgouris, J.T. and Wickerhauser, M.: "Use of frozen cryoprecipitate for the preparation of clinical Factor VIII concentrate". "Transfusion" 13:399, 1973. 7. "Recent Advances in Hemophilia". " Ann. N. Y. Acad. Sei." 240, 1-426, 1975. 8. Pool, J.G. "Recent chapters in the Factor VIII saga: perils of a protein". West. J. of Med." 122:406, 1975 9. Fekete, L.F. and Holst, S.L. "Stabilization of AHF using Heparin". US Patent No. 3,803,115 corresponding to NO-PS 142381). 10. "Alpha-hydro- omega-hydroxy-poly(oxyethylene)poly(oxypropylene)poly(oxyethylene) block copolymer", "BASF-Wyandatte Corp.": "The Wonderful World of Pluronic Polyols", 1971.

(PEG er forkortelsen for polyetylenglykol). (PEG is the abbreviation for polyethylene glycol).

Claims

Process for purifying the antihemophilic factor by extracting at room temperature and with an aqueous medium of low ionic strength a cryoprecipitate obtained by thawing plasma, and cooling the thus obtained extract to precipitate impurities, after which the precipitate formed is removed and the supernatant is recovered liquid, characterized in that the cryoprecipitate is produced by thawing plasma to a temperature up to but not above +2°C, and that the extraction of the cryoprecipitate is carried out at pH7 with pyrogenic water at a temperature of 20-30°C, and that the cooling of the extract is carried out at a temperature between +1 and +2°C for between 30 min. and 2 hours.