JPH05506354A

JPH05506354A - 端が切り取られた軽鎖を有する活性プロテインｃ

Info

Publication number: JPH05506354A
Application number: JP91505079A
Authority: JP
Inventors: 宮城　文敬; 芳彦鷲見; 健司若林; フォスター，ドナルド　シー．
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド; 帝人株式会社
Priority date: 1990-02-09
Filing date: 1991-02-08
Publication date: 1993-09-22
Also published as: WO1991012320A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】端か切り取られた軽鎖を有する活性プロティンＣ技術分野本発明は一般的には血漿タンパク質およびそのタンパク質をコードするＤＮＡ配列に関し、より詳しくはヒト活性プロティンＣと実質的に同じ生物活性を有するタンパク質の生産に関する。

発明の背景プロティンＣは、生体内での血液凝固の調節およびフィブリン溶解活性の発生において重要な役割を果たすセリンプロテアーゼのチモーゲン、即ち前駆体である。それは−重鎖ポリペプチドとして肝臓で合成され、該ペプチドが相当なプロセシングを受け、ジスルフィド結合によって結合した重ｊｌ　（Ｍｒ＝４０，０００）と軽Ｍ　（Ｍｒ＝２１．０００）とから成る二本鎖分子になる。循環している二本鎖中間体は、重鎮のアミノ末端からの１２残基ペプチド（活性化ペプチドとして知られる）の除去を含むタンパク質分解プロセシングにより、［活性プロティンＣｌ　（ＡＰＣ）として知られる該分子の生物活性形態に変換される。この開裂反応は、生体内では内皮細胞補因子であるトロンプロティンＣは、それぞれグルタミン酸とアスパラギン酸残基の翻訳後修飾により形成される、γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）約９残基とβ−ヒドロキシアスパラギン酸１当量を含むビタミンに依存性糖タンパク質である。プロティンＣ中の特定のγ−カルボキングルタミン酸残基の翻訳後形成はビタミンＫを必要とする。それらの異常アミノ酸残基かカルシウムイオンに結合し、プロティンＣの生物活性に必要とされる該タンパク質とリン脂質との相互作用を招くと思われる。

他のビタミンに依存性血漿タンパク質、例えば第■因子、第Ｘ因子および第Ｘ因子の凝固促進作用とは異なり、活性プロティンＣ（ＡＰＣ）は限定タンパク質分解による第Ｖａ因子および第■ａ因子の不活性化を通して凝固過程の調節因子として働く。プロティンＣによる第Ｖａ因子および第■ａ因子の不活性化は、酸性リン脂質とカルシウムイオンの存在に依存する。プロティンＳか第Ｖａ因子のＡＰＣ触媒触媒タンパ分質分解進することによりこの活性を調節すると報告されている（Ｗａｌｋｅｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５５：　５５２１−５５２４゜１９８０）。

プロティンＣはまた、組織型プラスミノーゲン活性化因子の作用にも関係している（ＫｊｓｉｅｌおよびＰｕｊｉｋａ＊ａ、　Ｂｅｈｒｉｎｇ　［ｎｓｔ、　Ｍｉｔｔ。

７３：２９−４２．１９８３）。イヌへのウシＡＰＣの注入はプラスミノーゲン活性化因子の活性の増加を引き起こす（ＣＯ［ｌｌ＋）およびＥｓｏ＋ｏｎ、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

へのＡＰＣの添加が、ウロキナーゼ関連と組織型の両方のプラスミノーゲン活性化因子の活性増加を反映する、順化培地中のフィブリン溶解活性の迅速な用量依存性増加を引き起こすことを示した。ＡＰＣ処理は抗活性化因子活性の用量依存性減少ももたらす。加えて、内因性ＡＰＣに対するモノクローナル抗体を使った研究は（Ｓｎｏｗら、ＦＡＳＥＢ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ、　１９８８　）　、フィブリン溶解中の動脈の開通性を維持しそして組織梗塞の程度を限定するのにＡＰＣが関係しているとしている。

世界の成る地域では、約１６．０００分の１の人がプロティンＣ欠損を示すと見積もられている。プロティンＣ欠損は再発性血栓症に関連付けられており（Ｂｒｏｅｋｍａｎｓら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、３０９：３４０−３４４゜ｌ９８３およびＳｅ１１ｇ５ｏｈｎ　ら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、３１０：５５９−５６２．　１９８４）、遺伝的障害または外傷、例えば負傷、肝疾患または手術によって起こり得る。プロティンＣ欠損は一般に経口抗凝固物質を使って治療される。プロティンＣ含有正常血漿の注入によっても有益な効果が得られている（ＧａｒｄｉｎｅｒおよびＧｒｉｆｆｉｎ、　Ｂｒｏｗｎ、　Ｇｒｕｎｅ　＆　５ｔｒａｔｔｏｎ編、　Ｐｒｏｇ、ｉｎ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　１３：２６５−２７８．１９８３．　ＮＹを参照のこと）。

加えて、プロティンＣは血栓症、例えば静脈血栓症を治療するのに有用であるＣ３ｍ１ｔｈら、ＰＣＴ公開番号Ｎｏ、　Ｗｏ　８５１００５２１）。

活性プロティンＣは血栓症の治療用のチモーゲンよりも好ましいことがある。活性プロティンＣの利用はプロティンＣの生体内活性化の必要を回避し、従ってより迅速に作用する治療薬を提供する。

ヒヒ血栓モデルを使った幾つかの研究は、ＡＰＣが低用量でフィブリン沈着、血小板沈着および循環の低下の防止に効果的であることを示している（Ｇｒｕｂ６ｒら、Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　３７４ａ　：アブストラクト１３５３．　１９８７　＋　Ｗｉｄｒｏｗら、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　２５ｕｐｐｌ。

■アブストラクト７、　１９８８　：　Ｇｒｒｉｆｆｉｎら、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈｅｍａｔｏｓｔａｓｉｓ６２；アブストラクト１５１２．１９８９）。

最後に、外因性活性プロティンＣがグラム陰性敗血症の凝固障害および致死作用を防止することが示されている（Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、７９：９１８−９２５．１９８７）　、ヒヒを使った研究から得られたデータは、活性プロティンＣが敗血症に対して保護する上で本来の役割を果たすことを示唆している。

プロティンＣは、凝固因子濃縮物（ＭａｒＩａｒら、Ｂｌｏｏｄ　５９：ｌ０６７−１０７２、１９８２）または血漿（Ｋｉｓｊｅｌ、　Ｊ、　ＣＨｒ＋、　Ｉｎｖｅｓｔ、６４ニア６１−７６９゜１９７９）から精製しそして試験管内で活性化することができるが、出全材料の入手可能性が限定されていることおよび血漿中のプロティンＣの濃度が低いために、その方法は複雑である。ヒト血液から誘導される生成物の療法利用は病気の伝染の危険かあるので、遺伝子操作技術によりヒトプロティンＣまたは活性プロティンＣを製造することが好ましい。

ヒトプロティンＣの大部分をコードするクローン化ｃＤＮＡはＦｏｓｔｅｒおよびＤａｖｉｅ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１：４７６６−４７７０．１９８４）により開示されている。Ｆｏｓｅｅｒら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８２：４６７３−４６７７、１９８５）は、ヒトプロティンＣ遺伝子のヌクレオチド配列およびヒトプロティンＣの仮の構造を開示している。彼らは、ヒトプロティンＣの軽鎖が、Ｆｅｒｎｌｕｎｄおよび５ｔｅｎｆｌｏ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、虱１２１７０ −１２１７９．１９８２）により報告されたウシプロティンＣの重鎮のアミノ酸配列との類推によって、１５５アミノ酸を含むことを示唆している。Ｍｕｒｒａｙら（ヨーロッパ特許公開公報２１５．５４８）は、組換えプロティンＣおよび活性プロティンＣの製造方法を開示している。Ｂａｎｇら（米国特許４．７７５．６２４）は、カルボキシ末端配列Ｍｅｔ−Ｇｌ　ｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ −３ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕを有する１５５アミノ酸の活性軽鎖を有する組換えプロティンＣの製造方法を開示している。

しかしながら、活性プロティンＣは、貯蔵中に特に軽鎖のカルボキシ末端におけるタンパク質末端分解により、その構造が変化し得る。この構造変化は生物活性に影響を与えることがあり、次には医薬組成物の調製において重大な難点を生じ得る。従って、本発明の目的は医療用に一層安定なＡＰＣを提供することである。

発明の開示簡単に言えば、本発明は、重鎮と軽鎖を有するヒトプロティンＣの一層安定な活性形態を提供し、ここで前記軽鎖は、アミノ酸番号１のアラニンからアミノ酸番号１５０のリジンまでの図１のアミノ酸配列二アミノ酸番号１のアラニンからアミノ酸番号１５１のリジンまでの図１のアミノ酸配列：およびアミノ酸番号ｌのアラニンからアミノ酸番号１５２のアルギニンまでの図１のアミノ酸配列から成る群から選択されたアミノ酸配列から本質的に成る。他の態様では、活性ヒトプロティンＣは組換えプロティンＣを活性化することにより、血漿プロティンＣを活性化することにより、または直接発現により生産される。

本発明の別の観点では、活性ヒトプロティンＣの第一形態、活性ヒトプロティンＣの第三形態および／または活性ヒトプロティンＣの第三形態を含んで成る組成物が提供され、ここで前記第一形態はアミノ酸番号ｌのアラニンからアミノ酸番号１５０のリジンまでの図１のアミノ酸配列を有する軽鎖にジスルフィド結合した重鎮を含んで成り：第二形態はアミノ酸番号１のアラニンからアミノ酸番号１５１のリジンまでの図１のアミノ酸配列を育する軽鎖にジスルフィド結合した重鎮を含んで成り；そして第三形態はアミノ酸番号ｌのアラニンからアミノ酸番号１５２のアルギニンまでの図１のアミノ酸配列を有する軽鎖にジスルフィド結合した重鎮を含んで成る。該組成物の一態様では、第−形態対第三形態の比が約１＋１０〜約１０：１である。別の態様では、その比がｌ：５〜５：ｌである。更に別の態様では、その比が約１．３である。該組成物の更に他の態様では、第− 形態対第二形態の比が約１：１０〜約１０：１．好ましくは】：５〜５；１である。

該組成物のそれらの態様は小部分の他の残りの形態を含むことができる。

本発明の別の観点によれば、上記組成物中の比が、（ａｌ軽鎖と重鎮とを分離し；　（ｂ１分離した軽鎖を断片化してポリペプチドを生成せしめ、（Ｃ）該ポリペプチドを分画し：（ｄ）分画したポリペプチドを配列決定し、そしてｔｅｌ第 −形態対第二形態のモル比を算出するという段階を含んで成る方法により決定される。−態様では、分離段階か、−３Ｈ基を生成する重鎮と軽鎖との間のジスルフィド結合の還元、および次のジスルフィド化を防ぐための−ＳＨ基の修飾を含んで成る。

別の態様では、断片化段階がエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎを使ったタンパク質分解、またはエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎを使ったタンパク質分解に次いで場合によりペプチドの分離後のキモトリプシンを使ったタンパク質分解を含んで成る。更に別の態様では、分画段階が高性能液体クロマトグラフィーを含んで成る。

本発明のもう一つの観点によれば、（ａｌヒトプロティンＣを濃縮し。

（ｂｌ濃縮したプロティンＣの塩濃度を低下させて減塩溶液を生成せしめ、（Ｃ）前記減塩溶液をトロンビンに暴露してプロティンＣを活性化し：（ｄ）段１１ｆ（Ｃ１の生成物をイオン交換クロマトグラフィーにかけることにより活性プロティンＣをトロンビンから精製し、■または複数の精製された活性プロティンＣを含む画分を得：そして（ｅｌ精製された活性プロティンＣを含む画分を収集し、ここで精製された活性プロティンＣは活性プロティンＣｌ５０、活性プロティンＣ１６１および／または活性プロティン（：　ＩＩＮから本質的に成る、という方法により、ヒトプロティンＣからヒト活性プロティンＣｌ１１＋、ヒト活性プロティンＣＩ５１および／またはヒト活性プロティンＣ１５″を含んで成る組成物を製造する方法が提供される。別の態様では、前記組成物が活性プロティンＣＩ５０対活性プロティンＣＩｓ！を約１：１０〜約１０：ｌの比において含んで成る。更に別の態様では、その比が約ｌ：５〜５：１である。更なる態様では、その比が約１．３である。別の態様では、前記組成物が約１：１０〜約１０：ｌの比の活性プロティンＣＩ　Ｓ　Ｇ対活性プロティンＣＩｌ＋を含んで成る。

更に別の態様では、その比が約１＝５〜５：Ｉである。更なる態様では、その比が約１；３である。更なる態様では、暴露段階が、重量で約１１〜約２００１のプロティンＣ対トロンヒンの比を与えるように減塩溶液をトレニ゛ヂンと混合することを含んで成る。別の態様では、その比が約２０；Ｉである。更に別の態様では、ヒトプロティンＣが約２．０〜２．５■／−に濃縮される。他の態様では、精製段階がカチオン交換クロマトグラフィーの後にアニオン交換クロマトグラフィーを含んで成る。別の態様では、ヒトプロティンＣが、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養して軽鎖と活性化ペプチドとの接合部に配列Ｒ１−Ｒ２Ｒ２Ｒ４（ここでＲ５−Ｒ４はりジン残基またはアルギニン残基である）を育するプロティンＣ前駆体を発現せしめることにより生産される組換えプロティンＣである。

本発明の他の観点によれば、生理学的に許容される担体または希釈剤と、活性血漿プロティンＣまたは活性組換えプロティンＣとを含有する医薬組成物が提供され、ここで前記活性血漿プロティンＣまたは活性組換えプロティンＣは重鎮と軽鎖を有し、前記軽鎖が図１のアミノ酸番号１のアラニンから、アミノ酸番号１５０のリジン、アミノ酸番号１５１のリジンおよびアミノ酸番号１５２のアルギニンがら成る群から選択されたアミノ酸までのアミノ酸配列から本質的に成る。

別の態様では、該医薬組成物は約１：１０〜約１０：１の比の活性プロティンＣ＋ｓｏ対活性プロティンＣ口１を含んで成る。更なる態様では、その比か約１＝５〜５：ｌである。更に別の態様では、その比が約３：ｌである。

本発明の更に別の観点によれば、活性プロティンＣｌ５０、活性プロティンＣｔｉｔおよび活性プロティン（：Ｉ５１の闇のモル比を決定する方法か提供され、該方法は、（ａ）活性プロティンＣの重鎮と軽鎖を結合するジスルフィド結合を −ＳＨ基に還元し；（ｂ）更なるジスルフィド化を防ぐために前記−ＳＨ基を修飾し、（Ｃ）軽鎖を重鎮から分離し。

（ｄ］軽鎖を断片化し、（ｅ）断片化した軽鎖を分画し、げ）分画した軽鎖を配列決定し：そして（９活性プロテインＣ”’Ｎ活性プロティン（：　１５＋および活性プロティンＣｌ５１のモル比を算出することを含んで成る。

本発明の上記のおよび他の観点は下記の詳細な説明および添付図面への参照によって明らかになるであろう。

図面の簡単な説明図１は、全プロティンＣｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびヒトプロティンＣの推定アミノ酸配列を示す。矢印は活性化ペプチドと重鎮との接合部を示す。活性プロティンＣの重鎮はアミノ酸番号１７０のロイシンからアミノ酸番号４１９のプロリンまでである。

図２はベクターｐＤ３の作製を示す。使用した記号は、０−１：アデノウイルス５０−１地図単位配列；　Ｅ　：　ＳＶ４０エンハンサ−；ＭＬＰ：アデノウイルス２主要後期プロモーター、　Ｌｌ−３：アデノウイルス２三分節系リーダー；５’：５’スプライス部位；３’：３’スプライス部位：　ｐ（Ａ）　：ポリアデニル化シグナル：　ＤＨＦＲニジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子である。

図３はベクターｐＤＸの作製を示す。使用した記号は図２に示した通りである。

発明の詳細な説明本発明を記載する前に、以後に使用する幾つかの用語の定義を示すことがそれの理解に役立つであろう。

生物活性：　生物学的環境中（即ち生体内またはそれの試験管内複写物）の分子により行われる機能または一連の機能。タンパク質の生物活性は触媒活性とエフェクター活性とに分類することができる。ビタミンに依存性血漿タンパク質の触媒活性は、一般に基質の活性化または不活性化を引き起こす別の血漿タンパク質の特異的タンパク質分解的開裂を含む。エフェクター活性は、カルシウム、リン脂質もしくは他の小分子への、タンパク質のような巨大分子への、または細胞への生物活性分子の特異的結合を包含する。エフェクター活性は、生理的条件下ではしばしば触媒活性を増強するかまたは触媒活性に不可欠である。

活性プロティンＣについては、生物活性はその抗凝固性質とフィブリン溶解性質により特徴づけられる。活性プロティンＣは、酸性リン脂質とカルシウムの存在下で第Ｖａ因子と第■ａ因子を不活性化する。プロティンＳはこの機能の調節に関与すると思われる（Ｗａｌｋｅｒ、前掲）。活性プロティンＣは、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤のレベルの低下により媒介されると思われるフィブリン溶解作用も増強する（Ｖａｎ　Ｈｉｎｓｂｅ−ｒｇｈら、現ｏｏｄ　６５：４４４−４５１゜１９８５）。活性プロティンＣの触媒活性は重鎮にある。プロティンＣと実質的に同じ生物活性を有するタンパク質は、活性化されるまでこの活性を本質的に持たないだろう。

活性プロティンＣ：　上記に定義したような活性プロティンＣの活性を有するタンパク質。該タンパク質は、カルシウム結合性ｇｌａ領域を含むエフェクターとしての軽鎖にジスルフィド結合した触媒としての重鎮を含むだろう。軽鎖は、生来のヒトプロティンＣの１５０、１５１または１５２アミノ酸の軽鎖であることができ、またはそのエフェクター活性を実質的に変えないようなアミノ酸置換を含むこともできる。活性プロティンＣｌ５Ｄ　（ＡＰＣＩ１６）とは、軽鎖がアミノ酸番号ｌのアラニンからアミノ酸番号１５０のリジンまでの図１のアミノ酸配列を存する活性プロティンＣを言う。活性プロティンＣ１５１（ＡＰＣ”　” ）とは、軽鎖がアミノ酸番号ｌのアラニンからアミノ酸番号＋５１のリジンまての図１に記載のアミノ酸配列を育する活性プロティンＣを言う。活性プロティンＣ”２（ＡＰＣ”）とは、軽鎖かアミノ酸番号１のアラニンからアミノ酸番号１５２のアルギニンまでの図１に記載のアミノ酸配列を有する活性プロティンＣを言う。

プレープロペプチド：　幾つかのタンパク質のアミノ末端に存在し、通常は分泌経路を通した輸送の間にタンパク質から開裂されるアミノ酸配列。プレープロペプチドは、疎水性アミノ酸のコアの存在により特徴付けられる、細胞の分泌経路中にタンパク質を差し向ける配列（シグナルペプチド）を含んで成る。プレープロペプチドはプロセシングシグナルを含んで成ることもできる。本明細書で使用する時、［プレープロペプチド」なる用語は、天然に存在するプレープロペプチドの機能的部分を意味することもできる。

発現ベクター：　特に、タンパク質の発現を促進するプロモーターおよび他の配列、例えば転写ターミネータ−やポリアデニル化シグナルと一緒に、着目のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子。発現ベクターは更に、自己複製または宿主ゲノム中への組み込みのいずれかによる宿主細胞中での複製に備える遺伝情報を更に含む。組換えＤＮＡによく使われる発現ベクターの例はプラスミドおよびある種のウィルスであるが、両方の要素を含んでもよい。発現ベクターは選択マーカーを含むこともできる。

培養哨乳動物細胞：１Ｔｔｉ乳動物から単離されており、試験管内で増殖させることができる細胞。

ＤＮＡ構成物、　そうでなかったら天然には存在しないように配置された配列を含む人間の介入を経て作製されたＤＮＡ分子、またはそのような分子のクローン。

上述したように、プロティンＣは最初は一本鎖ポリペプチドとして生産され、これが広範なプロセシングを受けて活性プロティンＣを生じる。このプロセシングには、軽鎖のアミン末端領域中の特異的γ−カルボキシグルタミン酸残基の形成、アスパラギン酸残基のβ−ヒトロキンル化およびタンパク質分解的開裂が含まれる。

同じく上述したように、ヒト活性プロティンＣは１５５アミノ酸残基から成る軽鎖を含むと思われる（Ｆｏｓｔｅｒら、前掲；　Ｂａｎｇら、前掲）。

しかしながら、本発明者らは、活性プロティンＣが不均一であり、１５０個、１５１個または１５２個のアミノ酸残基から成る生物活性種を含むことを発見した。この発見に基づいて、本発明者らは、活性化、直接発現および精製によって、限定された均一組成物として回収することができる組換えおよび血漿由来のプロティンＣの生産方法を開発した。本発明に従って生産される活性プロティンＣは、１５０゜１５１　または１５２アミノ酸の軽鎖を有するか、あるいは１５０．１５１および／または１５２アミノ酸軽鎖形態の混合物であろう。

プロティンＣをコードするクローン化ＤＮＡ配列は記載されてい４６７７、１９８５　；およびＢａｎｇら、米国特許第４．７７５．６２４号）。一般に、ｃＤＮＡ配列は介在配列を欠くため、組換えプロティンＣの生産に好ましい。プロティンＣをコードする相補的ＤＮＡは、標準的実験手順に従って肝細胞から調製したライブラリーから得ることができる。しかしながら、安定なりＮＡ配列をゲノムクローンから得ることもでき、または常法に従って新たに合成することもできることは理解されるだろう。合成ヌクレオチド配列を製造する技術は当業界で公知である。例えば、−セットの重複するオリゴヌクレオチドを合成し、二つ一組にしてアニーリングせしめ、重複する接着末端を育する二本鎖断片を得ることができる。次いでそれらの断片を必要であれば連結せしめ、完全なコード配列を与える。ゲノム配列を使う時には、イントロンを除去することか一般に望ましい。

もし部分的クローンが得られたら、エンドヌクレアーゼ開裂、連結およびループアウト突然変異誘発といった技術を使って、それらを正しい読み枠において連結して全長クローンを生成することが必要である。

的確な翻訳後プロセシング（例えばグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化）および宿主細胞からの分泌を獲得するために、プロティンＣコード配列は更にタンパク質のアミン末端にプレープロペプチドをコードするだろう。プレープロペプチドはプロティンＣのものであるか、または別のビタミンに依存性血漿タンパク質、例えば第■因子、第Ｘ因子、第Ｘ因子、プロトロンビンもしくはプロティンＳのものであることができる。

組換えプロティンＣのアミノ末端部分（ｇｌａ領域）は、第■因子、第Ｘ因子、第Ｘ因子、プロトロンビンおよびプロティンＳから成る群から選択されたビタミンに依存性血漿タンパク質のｇｌａ領域で置き換えることができる。ビタミンに依存性血漿タンパク質のアミノ末端部分は、それぞれのカルシウム結合活性の少なくとも一部の原因である。この機能的相同性の結果として、それらの分子のｇｌａ領域は互いに置き換えることができ、生じたキメラタンパク質は触媒領域に特異的な活性をなお保持していることが発見された。例えば、米国特許第４．７８９．９５０号に記載されたように、第Ｘ因子のアミノ末端ｇｌａ領域をアミノ酸３８のところで第■因子に連結し、第■因子の活性を有するタンパク質を製造することができる。第■因子、第Ｘ因子、第Ｘ因子、プロトロンビンおよびプロティンＳは、プロティンＣとのこのアミノ末端配列相同性を共存する。この相同性領域はほぼ３５〜４５個のアミノ酸残基に及び、Ｃ末端境界は一般にそれぞれの遺伝子中のエキソンーイントロン境界と一致する。ヒトプロティンＣのｇｌａ領域は、図１に示されるような成熟軽鎖のアミノ酸番号１から約アミノ酸番号３７まてである。それらのタンパク質のいずれかの遺伝子の５′コード領域を含んで成るクローン化配列を、プロティンＣ遺伝子の対応する配列と置き換えることができる。得られた活性プロティンＣ前駆体は、プロティンＣのｇｌａ領域欠損軽鎖に作用可能に連結されたｇｌａ領域を含んで成る軽鎖を含むだろう。そのようなプロティンＣ前駆体のプレープロ配列とｇｌａ領域は同じタンパク質に由来することが好ましい。

本発明のタンパク質は組換えプロティンＣまたは血漿プロティンＣから製造することができる。組換えプロティンＣおよび血漿プロティンＣの製造方法は当業界で既知である。

クローン化ＤＮＡ配列は、コードされるプロティンＣ前駆体のプロセシングを促進するために更に変更することができる。この点で好ましい変更は、配列Ｒ１− ’Ｒ２−Ｒ１−Ｒ４（ここでＲ３−Ｒ４の各々はりジン残基またはアルギニン残基である）を含む軽鎖と活性化ペプチドとの間の接合部の変更である。１つのそのような変更されたプロティンＣ前駆体はアミノ酸配列；軽＠（１５５アミノ酸）　−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−（ｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−重鎖を存する。

変更は部位特異的突然変異誘発によって達成することができる。部位特異的突然変異誘発の技術は当業界で公知であり、そして例えばＺｏｌｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈ　（ＤＮＡ　３：４７９−４８８．１９８４）により記載されている。あるいは、プロティンＣ配列を酵素的に開裂せしめて接合点あたりのヌクレオチドを除去し、そして重鎮と生来の軽鎖をコードする配列を開裂部位を含む合成リンカ −と結合せしめることができる。

本発明を実施するのに作用なりＮＡ配列は、ＡＰＣの直接発現をコードするものも包含する。ＡＰＣ前駆体配列は、米国特許出願環０７／１３０．３７０号およびヨーロッパ特許庁公開公報ＥＰ　３１９．９４４において記載されているような宿主細胞中でサツカロミセス・セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＫＥＸ２遺伝子と同時発現せしめることができる。

プロティンＣまたは活性プロティンＣ前駆体をコードするＤＮＡ配列は適当な発現ベクター中に挿入され、次いて培養哺乳動物細胞をトランスフェクトせしめるのに使われる。本発明を実施するのに使われる発現ベクターは、クローン化遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指令することができるプロモーターを含むだろう。好ましいプロモーターはウィルス性プロモーターと細胞性プロモーターの両方を包含する。この点で有用であるウィルス性プロモーターとしては、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、１：　８５４−８６４゜１９８１）およびＣＭＶプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅ１ｌ　４１：　５２１−５３０゜１９８５）が挙げられる。特に好ましいウィルス性プロモーターは、アデノウィルス２由来の主要後期プロモーター（Ｋａｕｆｍａｎおよび５ｈａｒｐ。

Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、２：　１３０４−１３１９．１９８２）である。細胞性プロモーターとしては、マウスに遺伝子プロモーター（Ｂｅｒｇｍａｎら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１ニア０４１−７０４５．１９８３）およびマウスＶＨプロモーター（Ｌｏｈら、Ｃｅ１ｌ　３３：８５−９３．１９８３）が挙げられる。特に好ましい細胞性プロモーターはメタロチオネイン■プロモーター（Ｐａｌｍｉ　ｔｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２２：８０９− ８１４．１９８３）である。発現ベクターは、プロモーターの下流であって且つプロティンＣ配列の挿入部位より上流にまたはプロティンＣ配列それ自体の内部に、−組のＲＮＡスプライス部位を含むこともできる。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウィルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得ることができる。発現ベクター中に一般に含まれるのは、挿入部位の下流に置かれる転写終結およびポリアデニル化シグナルである。

好ましいポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０由来の初期または後期ポリアデニル化シグナル（Ｋａｕｆｍａｎおよび５ｈａｒｐ、前掲）、アデノウィルス５２１ｂ領域由来のポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン遺伝子ターミネータ−（ＤｅＮｏｔｅら、Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９：３７１９− ３７３０．１９８１）およびプロティンＣ遺伝子ポリアデニル化シグナルが挙げられる。発現ベクターは、プロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に置かれるウィルスの非コードリーダー配列、例えばアデノウィルス２三分節系リーダー、並びにエンハンサ−配列、例えばＳＶ４０エンハンサ−およびアデノウィルスＶＡ　ＲＮＡをコードする配列を含んでもよい。

クローン化ＤＮＡ配列は、次いで例えばリン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅ１ｌ　１４ニア２５−７３２．１９７８　；　ＣａｒｓａｒａおよびＰｅａｒｓｏｎ、　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７：６０３−６１６．１９８１　；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：　４５６−４６７、　１９７３　）またはエレクトロボレーシコン（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯＪ、　１：８４１−８４５．１９８２　）により、培養唾乳類細胞に導入される。ＤＮＡを組み込んだ細胞を同定するために、通常、選択可能な表現型を付与する遺伝子（選択マーカー）が着目の遺伝子またはｃＤＮＡと一緒に細胞に導入される。好ましい選択マーカーとしては、ネオマイシン、ヒグロマイシンおよびメトトレキセートといった薬剤に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。選択マーカーは増幅可能な選択マーカーであってもよい。好ましい増幅可能な選択マーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ（’ＤＨＰＲ）をコードする遺伝子であり、これは薬剤メトトレキセートに対する耐性を付与する。選択マーカーはＴｈ１ｌｌｙ　（Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１１選択マーカーは、別々のプラスミド上において着目の遺伝子と同時に細胞に導入することができ、またはそれらを同一ブラスミド上において導入することもできる。同一プラスミド上の場合、選択マーカーと着目の遺伝子は異なるプロモーターの支配下にあっても同一プロモーターの支配下にあってもよい。

後者の配置は２シストロンメツセージを生じる。このタイプの構成物は当業界で既知である（例えば、ＬｅｖｉｎｓｏｎおよびＳｉｍｏｎｓｅｎ、米国特許第４．７１３．３３９号並びに米国特許出願環０７／２２６．１７３号）。細胞に導入される混合物に［キャリヤーＤＮＡ　Ｊ　として知られる追加のＤＮＡを加えることも有利である。

細胞がＤＮＡを取り込んだ後、それらを培養してプロティンＣまたは活性プロティンＣを生産せしめる。細胞は、標準法に従って、哺乳動物細胞の増殖に必要な栄養素を含む増殖培地中で培養される。

様々な適当な培地が当業界で知られており、一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラルおよび増殖因子を含有する。該培地は血清、例えばウシ血清を含んでもよく、無血清培地であってもよい。生物活性プロティンＣの生産のためには、培地は通常約０．１Ｍｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｒｒｄ！の濃度でビタミンにも含むだろう。次いで薬剤選択を適用して、安定な様式で選択マーカーを発現している細胞の増殖について選択を行う。増幅可能な選択マーカーによりトランスフェクトされている細胞に対しては、薬剤濃度を増加させてクローン化配列のコピー数の増加について選択し、それによって発現レベルを増加させることができる。次いで安定にトランスフェクトされた細胞のクローンをプロティンＣの発現についてスクリーニングする。

本発明において使用される好ましい培養哨乳動物細胞としては、ＣＯ５−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）　、ＢＨＫおよび２９３　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５７３　：　Ｇｒａｈａｍら、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、３６：５９−７２．１９７７）細胞系が挙げられる。好ましいＢＨＫ細胞系はｔｋ−ｔｓ１３　ＢＨＫ細胞系（ＷａｅｃｈｔｅｒおよびＢａｓｅｒｇａ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９：１１０６−１１１０．１９８２）であり、以後ＢＨＫ　５７０細胞と称する。ＢＨＫ　５７０細胞系はメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号ＣＲＬ　１０３１４のちとに寄託されている。ｔｋ−ＢＨＫ細胞系は受託番号ＣＲＬ　１６３２のもとにＡＴＣＣから入手することもできる。更に、多数の他の細胞系を本発明において利用することができ、そのようなものとしてＲａｔ　Ｈｅｐ　Ｉ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６００）　、　Ｒａｔ　Ｈｅｐ　ＩＩ（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５４８）、ＴＣＭＫ　（ＡＴＣＣＣＣＬ　１３９）　、ヒト肺（ＡＴＣＣＣＣＬ　７５．１）、ヒト肝癌（ＡＴＣＣＨＴＢ−５２）　、　Ｈｅｐ　Ｇ２　（ＡＴＣＣＨＢ　８０６５）　、　ＮＣＴＣ１４６９（ＡＴＣＣＣＣＬ　９．１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣＣＣＬ　６１）およびＤＵＫＸ細胞（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７：４２１６−４２２０．１９８０）が挙げられる。

組換えプロティンＣは、細胞から順化培地を取り出し、次いで培地を例えば遠心または濾過により処理して残りの細胞や細胞破片を除去することによって単離される。次いでプロティンＣ含有培地を濃縮してその後の精製および取扱を容易にすることが好ましい。タンパク質溶液を濃縮する方法は当業界で既知であり、好ましい方法は限外濾過である。順化培地は典型的には約２０〜４０倍濃縮されるだろう。次いで例えばほぼ生理学的ｐＨの低塩緩衝液に対して順化培地を透析することにより処理して塩濃度を下げる。好ましい前記緩衝液は０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含む０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ、　ｐＨ７，４である。次いで濃縮された順化培地からプロティンＣを精製する。プロティンＣの精製方法は当業界で既知であり、そのような方法は、免疫アフィニティークロマトグラフィー、クエン酸バリウムでの沈澱および高性能液体クロマトグラフィーといった段階を含むことができる。好ましい精製方法は抗プロティンＣ抗体カラム上でのアフィニティークロマトグラフィーである。Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ　ら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６１：１１０９７−１１１０８．１９８６　）により記載されたようなカルシウム依存性モノクローナル抗体の利用が特に好ましい。順化培地は低濃度のＣａ”の存在下で、好ましくは該培地の組成を約５ｍＭ　ＣａＣｌ２に調整することにより、カラムに適用される。次いてキレート化剤、例えばｌＯｍＭＥＤＴＡを使ってカラムからプロティンＣを溶出せしめる。カラム画分を収集し、プロティンＣ含有画分をプールする。カラム溶出画分のプロティンＣ純度はポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定することができる。

１．９８１）に従ってヒト血漿からプロティンＣを単離することかでき、または市販の供給源から入手することもてきる。

チモーゲン形態で生産された場合は、精製したプロティンＣを活性化する。該タンパク質を好ましくは限外濾過により約０．０６〜６■／−１好ましくは約２．０〜２．５■／−の濃度に濃縮する。濃縮したタンパク質溶液中の塩濃度を、例えばほぼ生理学的ｐＨの低イオン強度緩衝液に対する透析により下げる。トロンビン、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満のウシβ−またはγ−トロンビンを含む精製ウシα−トロンビンとプロティンＣ溶液とを、約１．１〜約２００　：　１のプロティンＣ対トロンビンの重量比、好ましくは約２０＝１のプロティンＣ対トロンビンの重量比において混合することにより、活性化を行う。該溶液を混合し、約４°Ｃ〜約３７°Ｃの温度において０．５〜２４時間、好ましくは約３〜５時間インキュベートする。

次いでイオン交換クロマトグラフィーにより活性化混合物から活性プロティンＣを精製する。カチオン交換クロマトグラフィーとアニオン交換クロマトグラフィーを併用することが好ましい。

好ましい態様では、活性化混合物を希釈し、カチオン交換カラムに適用する。適当なカチオン交換体としてはＣＭイオン交換ゲルおよびＳＰイオン交換ゲルが挙げられる。特に好ましいカチオン交換体はＳ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）である。カラムハ低イオン強度でわずかに酸性の緩衝液、例えば０．０２Ｍ　ＭＥＳ／Ｔｒｉｓ　ｐＨ６，０゜０、０５Ｍ　ＮａＣ１で平衡化される。活性プロティンＣは塩勾配を使ってカラムから溶離される。ＡＰＣは素通り画分と約０．３〜０．５Ｍ　ＮａＣ１の塩濃度のところで溶出するだろう。トロンビンは約０．６Ｍ　ＮａＣ１のところてカラムから溶出するだろう。ＡＰＣ含有画分をプールし、例えば低塩緩衝液により約０．２Ｍ　ＮａＣ１以下に塩濃度を下げる。得られた低塩溶液をアニオン交換カラムに適用する。適当なアニオン交換体としてはＤＥＡＥイオン交換ゲルおよびＱＡＥイオン交換ゲルが挙げられる。特に好ましい交換体はＱ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ。

ＮＪ）である。ＡＰＣ含有画分を、わずかに酸性の低イオン強度緩衝液で予め平衡化されているカラムに適用する。塩勾配を使って、または約０．３〜０．５Ｍ　ＮａＣｌ、好ましくは約０．４Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液でカラムを洗浄することにより、ＡＰＣを溶出せしめる。カラム画分中のＡＰＣの存在は、２８０ｎｍでの吸光度をモニタリングす夛ことによりおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動により、精製操作を通じて決定することができる。

必要であれば、アフィニティークロマトグラフィー、好ましくは免疫アフィニティークロマトグラフィーにより、追加の精製を行ってもよい。例えば、プロティンＣの活性化ペプチドに特異的な抗体上での免疫アフィニティークロマトグラフィーにより、混入しているチモーゲンプロティンＣをＡＰＣ調製物から除去することができる。プロティンＣのｇｌａ領域に特異的な抗体を使った免疫アフィニティークロマトグラフィーにより追加の精製を行うこともできる。

活性プロティンＣ（ＡＰＣ）のカルボキシ末端は、Ｃ末端軽鎖ペプチドを単離し、当業界で既知の方法によりそれらを配列決定することにより、決定することができる。一般的には、まず軽鎖と重鎮を結合しているＳ−８結合を開裂せしめることによりＡＰＣの重鎮と軽鎖とを分離する。Ｓ−３結合の開裂には当業界において周知である多数の方法があり、例えばｐＨ８，３で６Ｍグアニジン−ＨＣｌ溶液中のジチオトレイトールを使う方法がある。好ましくは再ジスルフィド化を防ぐために開裂生成物をモノヨード酢酸で処理する。

次いで重鎮と軽鎖タンパク質混合物を、例えば逆相分配クロマトグラフィーにより、分画することができる。好ましい態様では、Ｐｏ１ｙ−Ｆカラム（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ）が使われる。

次いで単離した軽鎖を開裂処理して、生じたペプチドを配列決定する。処理方法としては、臭化シアンによるタンパク質分解、酵素的タンパク質分解、例えばエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎを使ったタンパク質分解が挙げられる。

軽鎖のペプチド断片の混合物を更にペプチド画分に分離することができる。好ましい方法は、オクタデシルシラノール（ＯＤＳ）カラムを使った逆相分配クロマトグラフィーである。次いで当業界で周知の方法のいずれかによりペプチド画分を配列決定することができる。

好ましくはアミノ酸シークエンサーが使われる。アミノ酸番号１２８に了ミノ末端を有するペプチドはピーク群の中に通常存在する。

アミノ酸配列分析の結果に基づいて、同じピーク中に含まれる他のペプチドの量を差し引くことにより、軽鎖ペプチド１２８−１５０の量（ピコモル）を決定する。ペプチドの量は、同じ回収率を示すアミノ酸が検出される最も初期のサイクルにおける各アミノ酸のモル比から決定される。軽鎖ペプチド１２８−１５２の量も同じ方法により決定する。ペプチド１２Ｂ−１５０〜ペプチド１２８−１５２のモル比はＡＰＣ”　’／ＡＰＣ”　’／ＡＰＣ’　”の比であると見なされる。

ＡｐＣ１６６、ＡＰＣ１５１およびＡＰＣＩ５２は、ＡＰＣ口２上２上在する２つの追加の塩基性アミノ酸により与えられる電荷の差に基づいて互いに分離することができる。プロティンＣは中性ｐＨではアニオン性であり、約４．５のｐＩを育し、アニオン交換クロマトグラフィーにより２形態の分離が容易である。この点で好ましいクロマトグラフィー担体はＤＥＡＥ樹脂、例えばＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）である。簡単に言えば、２形態のプロティンＣを含む溶液を約ｐＨ６，５においてアニオン交換カラムに適用する。約０〜ＩＭ　Ｍａｉｌの勾配といった塩勾配を使ってタンパク質を連続的に溶出せしめると、ＡｐＣ”はＡＰＣＩｓ’よりも低い塩濃度で溶出する。画分を集め、探準法、例えば２８０ｎｍでの溶液の吸光度によりタンパク質の存在をモニタリングする。同様にして、軽鎖上に存在する一つのＣ末端塩基性アミノ酸により与えられる電荷の差に基づいて、より長いまたは短い軽鎖種を含む混合物からＡＰＣ”　’が単離される。

エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎで処理することにより得られたペプチドを更にキモトリプシンで処理し、上記と同様な方法で分析することができる。血漿プロティンＣから誘導した活性プロティンＣについてのこの方法を使った分析は、主としてＡＰＣＩＳＧおよびＡＰＣＩＳ＋並びに少量のＡＰＣＩ　ｉ　！を示した。この分析をアミノ酸分析により確かめることができる。

本発明の活性プロティンＣは、通常は生理学的に許容される担体または希釈剤と共に、局所または静脈内投与用の医薬組成物において使用することができる。好ましい担体および希釈剤としては、水、緩衝化された水、０．４％食塩溶液、０．３％グリシン等が挙げられる。

医薬組成物は安定剤や補助剤を含んでもよい。それらの組成物は常用の公知の滅菌技術により滅菌してもよい。得られた水溶液は使用のため包装するか、または無菌条件下で濾過して凍結乾燥することかできる。凍結乾燥製剤は使用前に無菌の水溶液と混合すればよい。

該組成物は、適当な生理的条件に必要な場合、医薬上許容される補助物質、例えばｐＨ調節剤、緩衝剤、張度（浸透圧）調節剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、アミノアセテート等、並びに追加の治療成分、例えばプラスミノーゲン活性化因子、ヘパリンまたは抗トロンビン■を更に含むことができる。それらの組成物中のプロティンＣの濃度は広範囲で異なることができ、即ち約０．５重量％はどの低濃度から、１５〜２０］ｉ量％はどの高濃度までに及び、これは選ばれた特定の投与形式に従って、主に液量、粘度等により選択されるだろう。

静注入用の典型的医薬組成物は、２５０〜１０１００Ｏの無菌リンガ−溶液と１〜ｌＯ■のプロティンＣを含有するように作製することができる。非経口投与可能な化合物を調製するための実際の方法は、当業者にとって公知または明白であり、そして例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　、　第１６版、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ。

εａｓｔｏｎ、　ＰＡ　（１９８２）　（これは参考として本明細書に組み込まれる）により詳細に記載されている。

プロティンＣを含有する医薬組成物は予防的および／または治療的処置のために投与することができる。治療的適用では、組成物は病気とその合併症を治癒するかまたは少なくとも部分的に緩和するのに十分な量で投与される。この用途に有効な量は病気または負傷の重さおよび患者の一般状態に依存するであろうが、通常は１日あたりプロティンＣ約０．１■〜約３００■の範囲であろう。１日あたりプロティンＣ約１■〜約２５■の用量がより普通に使われるであろう。

本発明の物質は一般に重い病気または負傷状態、即ち生命にかかわる状態または潜在的に生命にかかわる状態において使うことができることを念頭に置かなければならない。そのような場合、実質的過剰のそれらのプロティンＣ組成物を投与することが可能であり、治療する医師によって望ましいと感じられることもある。

予防的適用では、プロティンＣを含む組成物は、患者自身の抗凝血能力またはフィブリン溶解能力を増強するために、負傷もしくは病気状態にかかりやすいかまたはその危険がある患者に投与される。

この用途では、正確な量は患者の健康状聾および内在性プロティンＣの通常レベルに依存するが、通常は体重７０ｋｇあたり約０．５■〜約２５０■、特に体重７０ｋｇあたり約１■〜約２５■の範囲である。

次の実施例は例示の目的で与えられ、限定目的ではない。

実施例制限エンドヌクレアーゼおよびその他のＤＮＡ修飾酵素（例えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、子ウシアルカリホスファターゼ、ＤＮＡポリメラーゼ■　〔フレノウ断片〕、Ｔ４ポリヌクレオチドリガーゼ）はＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）とＮｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから入手し、そして特記しない限り製造業者により指示される通りに使用した。

オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８０Ａ　ＤＮＡ合成装置上で合成し、変性ゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。大腸菌（ε、　ｃｏｌｊ　）細胞はＭａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２）により記載された通りに形質転換せしめた。

Ｍ１３およびｐＵＣクローニングベクター並びに宿主株はＢＲＬから入手した。

ＦｏｓｔｅｒおよびＤａｖｉｅ　（前掲）により記載されたようにしてヒトプロティンＣの一部分をコードするｃＤＮＡを調製した。簡単に言えば、常法によりヒト肝［１ｍＲＮＡからλｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーを作製した。

ヒトプロティンＣに対する１２″■−標識アフィニティー精製抗体を使ってクローンをスクリーニングし、プレートリゼート法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲）により陽性クローンからファージを調製し、そして塩化セシウム勾配によってバンド沈降せしめた。Ｅｃｏ　Ｒ［を使ってｃＤＮＡ挿入断片を取り出し、プラスミドｐＵｃ９　（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ１９：　２５９− ２６８．１９８２）中にサブクローニングした。制限断片をファージベクターＭ１３ｍｐｌＯとＭＩ３ｍｐＨ（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１０１：２０−７７、１９８３）中にサブクーニングし、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：５４６３−５４６７、１９７７）　１．ニーより配列決定した。ヒトプロティンＣの既知部分配列（Ｋｉｓｉｅｌら、前掲、　１９７９）と一致するＤＮＡを含み、そして軽鎖のアミノ酸６４で始まり重鎮を経て３′非コード領域に及ぶプロティンＣをコードするクローンを選択した。このクローンをλＨＣｌ３７５と命名した。アミノ酸２４からプロティンＣをコードする第二のｃＤＮＡクローンも同定した。大きい方のクローンからの挿入断片をｐＵＣＱ中にサブクローニングし、得られたプラスミドをｐＨＣλ６Ｌと命名した。このクローンは、重鎮コード領域、終結コドンおよび３′非コード領域を含むプロティンＣの主要部分をコードする。

λＨＣｌ３７５からのｃＤＮＡ挿入断片をα−”Ｐ　ｄＮＴＰｓを使ってニックトランスレーションせしめ、該断片を用いて、Ｗｏｏ　（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

６８：３８１−３９５．１９７９）により変更されたＢｅｎｔｏｎおよびＤａｂｉｓのプラークハイブリダイゼーション法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９６：１８１− １８２．１９７７）を使ってファージλＣｈａｒｏｎ　４Ａ　（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら、Ｃｅ１ｌ　１５：６８７−７０２．　１９７８）中のヒトゲノムライブラリーを探査した。陽性クローンを単離し、プラーク精製した（Ｆｏｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：４６７３− ４６７７、１９８５　；これは参考として本明細書に組み込まれる）。

陽性クローンから調製したファージＤＮＡ　（Ｓｉｌｈａｖｙら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｉｔｈ　Ｇｅｎｅ　Ｆｕｓｉｏｎ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８４中）をＥｃｏ　Ｒ１またはＢｇｌＩＩで消化し、ゲノム挿入断片を精製し、ｐＵｃＧ中にサブクローニングした。このゲノム挿入断片の制限断片をＭ１３ベクター中にサブクローニングし、そして配列決定してそれらの同一性を確かめ、遺伝子全体のＤＮＡ配列を確立した。

ｐＨＣλ６ＬのｃＤＮＡ挿入断片をニックトランスレーションせしめ、該断片を用いてファージλＣｈａｒｏｎ　４Ａライブラリーを探査した。該ｃＤＮＡの５ ′末端と３′末端から作ったプローブにハイブリダイズする１つのゲノムクローンが同定された。このファージクローンをＥｃｏ　Ｒ［で消化し、プロティンＣ遺伝子の５′末端に相当する４、４ｋｂ断片をｐＵｃ９中にサブクローニングした。得られた組換えプラスミドをｐＨＣＲ４，４と命名した。完全ＤＮＡ配列分析は、ｐＨＣＲ４，４中の挿入断片が１２６３塩基対（ｂｐ）のイントロンにより隔てられた７０　ｂｐと１６７　ｂｐの２つのエクソンを含んで成ることを明らかにした。第一のエクソンはアミノ酸−４２〜−１９をコードし；第二のエクソンはアミノ酸−１９〜３７をコードする。配列分析によって完全なプロティンＣ遺伝子のＤＮＡ配列が確証された。

プロティンＣのプレープロペプチドのアミノ酸−４２〜−１９に相当するエクソンを含むゲノム断片を単離し、ニックトランスレージタンし、そしてＨｅｐ　Ｇ２細胞からのｍＲＮＡを使ってＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎの技術（Ｇｅｎｅ　２５：２６３−２６９．１９８３）により作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使った。この細胞系はヒト肝抽胞に由来し、プロティンＣを合成することが以前に示されている（ＦａｉｒおよびＢａｈｎａｋ、　Ｂｌｏｏｄ　６４：１９４−２０４．１９８４）　、ファージλ ｇｔｌｌのＥｃｏ　Ｒ［部位に挿入されたｃＤＮＡを含んで成る１０個の陽性クローンか同定された。これらをプロティンＣ遺伝子の５′非コード領域に相当するオリゴヌクレオチドプローブを使ってスクリーニングした。１つのクローンがこのプローブでも陽性であったので、その全ヌクレオチド配列を決定した。該ｃＤＮＡは７０　ｈｐの５′非翻訳配列、ヒトブレープロプロチインＣの全コード配列、および２番目のポリアデニル化部位に相当する全３′非コード領域を含んだ（図１）。

ベクターｐＤＸは、図２および３に記載のようにしてｐＤＩ（ＦＲＩＩＩ（Ｂｅｒｋｎｅｒおよび５ｈａｒｐ、Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３：８４１ −８５７．１９８５）から誘導した。

１０℃ｇのプラスミドを１００μｍの制限緩衝液Ａ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８、ｌ０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．６ｎ＋Ｍ　ＮａＣｌ、　７ｍＭβ−ＭＳ）ｆ）中で３７℃にて１０分間５単位のＰｓｔ　Ｉで消化することにより、ｐＤＨＦＲＩＩ中のＤＨＰＲ配列のすぐ上流のＰｓｔ１部位を８ｃｌ　Ｉ部位に変換した。ＤＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈澱せしめ、そして１０ｍＭ　ｄＣＴＰと１６単位のＴ４　ＤＮＡポリメラーゼを含む４０μｌのポリメラーゼ緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，７ｎ＋ＭＭｇＣ１２，７ｍＭβ−ＭＳＨ）中に再懸濁し、１２°Ｃで６０分間インキュベートした。エタノール（Ｅｔ（ｌ）Ｉ）沈澱後、該ＤＮＡを、４００単位のＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを含む１４μｌのリガーゼ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８゜１０ｍＭ　ＭｇＣＩｔ、　ＩｍＭ　ＤＴＴ、　１．４ｄ　ＡＴＰ）中で２．５μｇのリン酸化されたＢＣＩＩリンカ−に１２℃で１２時間連結せしめた。フェノール抽出とＥｔＯＨ沈澱後、ＤＮＡを１２０μｌの制限緩衝液Ｂ　（７５ｍＭ　ＫＣｌ、　６ｍＭ　Ｔｒｉｓ。

ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣ１□、　１ｍＭ　ＤＴＴ）に再懸濁し、８０単位のＢｃｌＩて５０°Ｃにて６０分間消化し、次いでアガロース上で電気泳動した。■型プラスミドＤＮＡ　（１０１，ｔｇ）をゲルから単離し、５０単位のＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを含む緩衝液Ｃ１０μＩ中で１２°Ｃにて２時間連結せしめ、これを用いて大腸菌１（１３１０１を形質転換せしめた。迅速ＤＮＡ調製分析により陽性コロニーを同定し、陽性コロニーから調製したプラスミドＤＮＡ　（ρＤ）ＩＦＩ？　’と命名）を用いてｄａＩｌｌ−大腸菌を形質転換せしめた。

次いでｐＤＨＦＲ’　（１５μｇ）とｐｓＶ４０　（ｐＭＬ−１のＢａｍ　Ｈ［部位中にクローニングされたＢａｍ　Ｈ１消化ＳＶ４０　ＤＮＡを含む）　（２５μｇ）を１００μｌノ制限緩衝液Ｂ中で２５単位のＢｃｌ　Ｉで５０°Ｃにて６０分間消化した後、５０単位のＢａｔｎＨＩを添加し、３７°Ｃで６０分間更にインキュベートすることにより、プラスミドｐＤ２’を作製した。ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により回収し、４．９　ｋｂ（７）　１）ＤＨＰＲ’ 断片と０．２　ｋｂ（７）ＳＶ４０断片を単離した。それらの断片（ｐＤＨＦＲ ’　ＤＮＡ　２００　ｎｇ、　ＳＶ４０　ＤＮＡ　１００　ｎｇ）を、１００単位のＴ４ポリヌクレオチドリカーゼを含む１０μＩのリガーゼ緩衝液中で１２° Ｃにて４時間インキュベートし、得られた構成物（ｐＤ２’　）を用いて大腸菌ＲＲＩを形質転換せしめた。

ｐＢＲ３２２領域中の「毒物」配列（Ｌｕ５ｋｙおよびＢｏｔｃｈａｎ、Ｎａｔｕｒｅ２９３ニア９−８１．１９８１）を削除することによりプラスミドｐＤ２　’を変形した。　ｐＤ２’　（６，６μｇ）とｐＭＬ−１（ＬｕｓｋＹおよびａｏｔｃｈａｎ、前掲）　（４μｇ）を各々１０単位のＥｃｏ　Ｒ［とＮｒｕ　［と共に５０μｌの制限緩衝液Ａ中で３７°Ｃにて２時間インキュベートし、次いでアガロースゲル電気泳動した。

１．７ｋｂのｐＤ２’断片と１．８ｋｂのｐＭＬ−１断片を単離し、１００単位のＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを含む２０μｌのリガーゼ緩衝液中で１２°Ｃにて２時間−緒に連結せしめ（各５０ｎｇ）　、連結生成物を用いて大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換せしめた。所望の構成物（ｐＤ２と命名）を含むコロニーを迅速調製分析により同定した。次いで１０℃ｇのｐＤ２を５０μｌの制限緩衝液Ａ中で各２０単位のＥｃｏ　Ｒ［とＢｇｌＩ［により３７°Ｃにて２時間消化した。ＤＮＡをアガロース上で電気泳動し、ｐｕｔ、−ｔ　、３　’スプライス部位およびポリ（Ａ）配列を含む所望の２．８ｋｂ断片を単離した。

プラスミドｐＤＨＦＲＩ［Ｉを変形し、Ｓａｃ　Ｉｔ　（Ｓｓｔ　Ｉ［）部位をＨｉｎｄｌＩ［部位またはＫｐｎ　Ｉ［部位のいずれかに変換した。まず、　ｌＯμｇのｐＤＨＦＲ■を２０単位の５ｓｔＩＩで３７°Ｃにて２時間消化した後、フェノール抽出し、エタノール沈澱せしめた。再懸濁したＤＮＡを、］ＯｍＭ　ｄＣＴＰと１６単位の７４　ＤＮＡポリメラーゼを含むポリメラーゼ緩衝液１００μｌ中で１２°Ｃにて６０分間インキュベートし、フェノール抽出し、透析し、そしてエタノール沈澱せしめた。ＤＮＡ　（５μｇ）を、４００単位のＴ４リガーゼを含む２０μｌの緩衝液Ｃ中で、５０　ｎＨのリン酸化されたＨｉｎｄｌＩ［またはＫｐｎ　Ｉリンカ−と１２°Ｃにて１０時間連結せしめ、フェノール抽出し、そしてエタノール沈澱せしめた。得られたプラスミドを５０μｌの制限緩衝液Ａ中に再懸濁した後、適宜５０単位のＨｉｎｄＩ［［またはにρｎＩで消化し、アガロース上で電気泳動した。ゲルから単離したＤＮＡ　（２５０ｎｇ）を、４００単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを含む３０μｌのリガーゼ緩衝液中で１２°Ｃにて４時間連結せしめ、この連結生成物を用いて大腸菌ＲＲＩを形質転換した。得られたプラスミドをｐＤＨＦＲＩ［［（ＨｉｎｄＩ）およびｐＤＨＦＲＩ［（Ｋｐｎ　Ｉ　）と命名した。次いでＢｇｌＩＩとＫｐｎ　Ｉでの消化後アガロースゲル電気泳動によりｐＤＨＦＲＩＩＩ　（Ｋｐｎ　Ｉ　）から７００ｂｐのＫｐｎＩ　−ＢｇｌＩ［断片を精製した。

ｐＤＨＦＲＩＩＩ（Ｈｉｎｄ　Ｉ［）中にＳＶ４０エンハンサ−を挿入した。５０ＭｇのＳＶ４０　ＤＮＡを１２０μｍの制限緩衝液Ａ中で５０単位のＨｉｎｄｌＩ［と共に３７°Ｃで２時間インキュベートし、ＨｉｎｄｌＩ［ＳＶ４０断片（５０８９−９６８ｂｐ）をゲル精製した。プラスミドｐＤＨＦＲＩ［［（Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ）　（１０μｇ）を２５０　ｎｇの子ウシ腸ホスファターゼにより３７°Ｃにて１時間処理し、フェノール抽出し、エタノール沈澱せしめた。この直鎖状プラスミド（５０ｎｇ）を、２００単位のＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを使って１６μｍのリガーゼ緩衝液中で１２°Ｃにて３時間２５０　ｎｇの５Ｖ４０−Ｈｉｎｄ　ｍ断片と連結せしめ、この連結生成物を用いて大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換せしめた。このプラスミドから７００塩基対のＥｃｏ　Ｒ［−ＫｐｎＩ断片を単離した。

次いでプラスミドｐＤ３を作製した。７００　ｂｐのＫｐｎＩ　−ＢｇｌＩＩ断片と７００　ｂｐのＥｃｏ　Ｒ１−ＫｐｎＩ断片（各５０ｎｇ）を、２００単位のＴ４ポリヌクレオチドリカーゼを使って１２°Ｃで４時間、２．８ｋｂのｐＭＬ−１、３’スプライス部位およびポリ（Ａ）断片１０　ｎｇと連結せしめ、次いでこの連結生成物を用いて大腸菌ＲＲＩを形質転換せしめた。迅速調製分析により陽性コロニーを検出し、ｐＤ３　（図２）の大量調製を行った。

同様にしてベクターｐＤ３’を作製した。ただし、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（即ち、ＳＶ４０　Ｒａｍ　Ｈｌ　［２５３３ｂｐ］　〜Ｂｃｌ　Ｉ　［２７７０ｂｐ］断片）を後ろ向きに挿入した。即ち、ｐＤ３　’は遺伝子挿入部位としてＢａｍＨＩ部位を含む（図３）。

次いで図３に示されるようにｐＤ３とｐＤ３’からベクターｐＤＸを作製した。

Ｅｃｏ　Ｒ１開裂、Ｓｌヌクレアーゼとのインキュベーション、次いでＢｃｌＩリンカ−との連結により、ｐＤ３　’中のＥｃｏ　Ｒｒ部位をＢｃ１１部位に変換した。陽性と同定されたコロニーからＤＮＡを調製し、変更された制限部位を含む１．９ｋｂのＸｈｏ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片をアガロースゲル電気泳動により調製した。第二の変更として、発現ベクター中に遺伝子を挿入するためのユニークＥｃｏ　Ｒ（部位を作るために、Ｂｃｌ　Ｉで消化したｐＤ３を、リン酸化されたＥｃｏ　Ｒ［−Ｂｃｌ　Ｉアダプター（オリゴヌクレオチドＺＣ５２５：　５　’　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＴ　３’　：およびＺＣ５２６：　５　’　ＧＡＴ　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＴＣＣ３’から作製）と連結せしめた。陽性コロニーを制限エンドヌクレアーゼ分析により同定し、このコロニーからのＤＮＡを使って、変更制限部位を含む２．３ｋｂのＸｈｏＩ　−ＰｓｔＩ断片を単離した。上記の２つのＤＮＡ断片を一緒にＴ４　ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートし、大腸菌ＨＢＩＯＩ中に形質転換せしめ、制限分析によって陽性のコロニーを同定した。プラスミドＤＮＡを単離し、ｐＤＸと命名した（図３）。このプラスミドは、外来遺伝子の挿入のためのユニークＥｃｏ　Ｒ１部位を含む。

Ｂ、　ｃＤＮＡ発現プロティンＣｃＤＮＡをＥｃｏ　Ｒ１断片としてｐＤＸ中に挿入した。制限分析により組換えプラスミドをスクリーニングし、プロモーター要素に関して正しい方向でプロティンＣ挿入断片を有するものを同定し、正しいクローンからプラスミドＤＮＡ　（ｐＤＸ／ＰＣと命名）を調製した。

ｐＤＸ／ＰＣ中のｃＤＮＡ挿入断片は５′非コード領域中にＡＴＧコドンを含むので（図１参照）、トランスフェクションと発現実験の前に該ｃＤＮＡにおいて欠失変異誘発を行った。オリゴヌクレオチド指令突然変異誘発の標準手順に従って３塩基対の欠失を行った。変異ｃＤＮＡを含むｐＤＸ型ベクターをｐ５９４と命名した。

−重鎖プロチインＣから二本鎖形懸へのプロセシングを増加させるために、２つの追加のアルギニン残基を該タンパク質に導入し、４つの塩基性アミノ酸から成る開裂部位を生ぜしめた。ＰＣ９６２と命名された得られたプロティンＣ変異前駆体は、軽鎖と重鎮の間の開裂部位に配列Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐを含むＡｒｇ−Ａｓｐ結合におけるプロセシングが二本鎖プロティンＣ分子をもたらす。

変異原性オリゴヌクレオチドＺＣ９６２（５’　ＡＧＴ　ＣＡＣＣＴＧ　ＡＧＡ　ＡＧＡＡＡＡ　ＣＧＡ　ＧＡＣＡ　３”）とオリゴヌクレオチドＺＣ５５０（５’　ＴＣＣＣＡＧ　ＴＣＡ　ＣＧＡ　ＣＧＴ　３”）を使った部位特異的突然変異誘発（本質的にはＺｏｌｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈ、ＤＮＡ　３：４７９−４８８．１９８４により記載されている）によってクローン化ｃＤＮＡを変更することにより、変異体分子を作製した。プラスミドｐ５９４を５ｓｔＩで消化し、約８４０　ｂｐの断片をＭｌａｍｐＨ中にクローニングし、−重鎖鋳型ＤＮＡを単離した。突然変異誘発後、正しいクローンを配列決定により同定した。複製可能型ＤＮＡを単離し、５ｓｔＩで消化し、そして変異断片を回収した。この変異断片を２部分連結において５ｓｔＩ切断ｐ５９４と連結せしめた。所望の方向で挿入された５ｓｔＩ断片を有するクローンを制限酵素マツピングにより同定した。得られた発現ベクターをｐＤＸ／ＰＣ９６２と命名した。

１０ＭｇのプラスミドｐＤＸ／ＰＣ９６２とｐＫｏ−ｎｅｏ　（ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、貝３２７−３４１．１９８２）を、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，６と１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む水性溶液５２５μｌに溶解し、これに７５μ！の水性２Ｍ　ＣａＣｌ２を添加した。次に、攪拌しながら６００μｌの２ｘＨｅｐｅｓ緩衝化塩溶液（０，２８Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、　１．５ｍＭリン酸水素ナトリウム、　ｐＨ７，２）を滴下添加し、得られた溶液を２０分分間−ておいた。

次いでこの溶液を、ｌＯ％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＩＸＰｓＮ抗生物質混合物（Ｇｉｂｃｏ　６００−５６４０）および２ｍＭ　Ｌ−グルタミンを含むダルベ・ノコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）の入った直径１０ｃｍのプレート中で培養している２９３細胞上に注いだ。細胞を更に３７°Ｃ，５％ＣＯｔ濃度において６時間培養し、プラスミドを含む塩を細胞上に落ち着かせた。次いで培地を除去し、１５％グリセロールを含むＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７，５）２−を細胞に添加した。混合物を室温で２分間放置しトランスフェクションを行った。

細胞から上溝を除去し、ｌＯ％ＦＣＳ　、Ｉ　ＸＰＳＮおよび２ｍ１ｉｌ　Ｌ− グルタミンを含む１０ｒｎｌのＤＭＥＭを添加し、細胞を３７°Ｃおよび５％Ｃ０２にお゛いてインキュベートした。

トランスフェクト細胞を、ｌＯ％ＦＣＳ　、１　ｘＰＳＮ抗生物質混合物（Ｇｉｂｃｏ　６００−５６４０）、２．０ｍＭＬ−グルタミンおよびビタミンＫ（５ μｇ／ｒｎＩ）を含むＤ−１ｔｌＥＭ中で４８時間増殖させた。

トリプシンの添加により細胞をプレートから取り出し、次いて直径１５ａｎのプレートに移した。

５００μｇ／−のＧ−４１８中で１４日間細胞を選別し、得られたコロニーをイムノフィルターアッセイ（ＭｃＣｒａｃｋｅｎおよびＢｒｏｗｎ、Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉ−ｑｕｅｓ、　８２−８７．３月７４月、１９８４）によりスクリーニングした。プレートをＰＢＳまたは無血清培地（０μβＭ＋ペニシリン−ストレプトマイシン、５μｇ／ｒ！ＬｌビタミンＫ）で洗浄した。該細胞の上にテフロンＴＭメッシュを載せた。ニトロセルロースフィルターを適宜ＰＢＳまたは無血清培地で湿らせ、前記メツシュの上に載せた。３７°Ｃで４時間のインキュベーション後、フィルターを取り出して緩衝液Ａ（５０ｍＭ　ＴｒＩｓ。

ｐＨ７，４，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．０５％ＮＰ−４０，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，０，２５％ゼラチン）中に室温で３０分間浸した。振盪しながら、フィルターをビオチン標識ヒツジ抗プロティンＣポリクローナル抗体（フィルター緩衝液中１μｇ／ｍ／）中で室温で１時間インキュベートした。次いで緩衝液Ａ中でフィルターを洗浄した後、アビジン接合西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　（緩衝液Ａ中に１　＋　１０００希釈したもの）中で振盪しながら室温で１時間インキュベートした。フィルターを緩衝液Ｂ　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１（Ｃ１，ｐＨ７，４，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ＩＭ　ＮａＣｌ、　０．２５％ゼラチン、０．４％サルコシル、０．０５％ＮＰ−４０）中で、次に８２０中で洗浄し、そして発色試薬（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ　ｐＨ７，４，１５０ｍＭ　ＮａＣ１中ＨＲＰ発色試薬［Ｂｉｏ−Ｒａｄｌ　６０ｍｇ　、メタノール２０ｒｎｉ、ＨｚＯｔ　１００μｌ　）中でインキュベートした。フィルターをＨ２Ｏに移すことにより反応を停止させた。最も強く反応するコロニー６つをシリンダークローニングにより取り、１０ａｎプレート中で個々に増殖させた。培養物がほぼ周密になった時、プロティンＣ生産レベルをＥＬｒＳＡにより測定した。

２９３／９６２　＃Ｉ　１．８２９３／９６２　＃２　１．５２９３／９６２　＃３　２．ＯＢ、ＢＨＫ細胞中へのｐＤＸ／ＰＣ９６２のトランスフェクション本質的には上述した通りに、ただしｐＫＯ−ｎｅｏをプラスミドｐＳＶ２−ＤＨＰＲ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍａｔ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１　：８４５−８４６．　１９８１）に、そしてＧ−４１８選択をメトトレキセート（２５０ｎＭ）に置き換えて、ＢＨＫ５７０細胞を同時トランスフェクトせしめた。プロティンＣ生産について細胞をスクリーニングし、ＥＬ［ＳＡによりプロティンＣ生産を測定した。３つのクローンについての発現レベルを表２に示す。

実施例５活性組換えプロティンＣの生産トランスフェクトされた２９３細胞（２９３／９６２　！１３）を無血清ＩＴＥＳ−ｅＲＤＦ培地（表３）中で３日間培養した。

インスリン　９μｇ／ｒｎＩトランスフェリン　１０Ｍｇ／− エタノールアミン　ＩＯμＭセレニット　２０　ｎＭ ”　ｅＲＤＦ中の濃度（Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｊ、　Ａｇｒｉｃ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｊａｐａｎ　５８：５７５、１９８４を参照のこと）。

抗プロティンＣモノクローナル抗体（６Ｈ２）カラムを使って無血清培養上清から組換えプロティンＣを精製した。６Ｈ２モノクローナル抗体は、Ｃａ”イオンの存在下ではプロティンＣ（“ＰＣ“）に結合しそしてＣａ”イオンの非存在下ではＰＣに結合しないことにより特徴づけられる。このモノクローナル抗体の性質およびこの抗体を使ったＰＣの精製は特開昭６１−１３４３９９と特開平１− ８５０９１において開示されている。

上滑液を濾過して細胞破片を除去した後、上清を限外濾過により２０〜４０倍濃縮した。次いで濃縮物をＴＢＳ　（Ｔｒｉｓ緩衝化塩溶液、０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ　ｐＨ７，４，０，１５Ｍ　ＮａＣ１）に対して透析した。即座に使用しない時は、使用直前まで濃縮物を一４０°Ｃで保存した。

上記濃縮物的２５（Ｗに、最終濃度が約５ｍＭ　Ｇａｅｌ、になるまでＩＭ（ａＣｌ　２溶液を添加した。この濃縮物を次いで５ｍＭ　ＣａＣ１□を含むＴＢＳで緩衝化されたＣｅ１ｌｕｌｏｆｉｎｅ　”　（生化学工業）カラム（１，５ｃｍ　ｘ　５．０ｏｎ）上に置き、組換えプロティンＣを吸着する抗プロティンＣモノクローナル抗体６Ｈ２で固定した。

次いて０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ７，４，１，ＯＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＣａＣ１ｚ緩衝液てカラムを徹底的に洗浄した。２８０ｎｍの波長での溶出液の吸光度が０．０１未満であることを確認した後、カラムに結合しているｒＰＣを０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ　ｐＨ７，４，０，１５Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ緩衝液で溶出せしめた。

ｒＰＣはカラムから単一ピークとして溶出した。非還元条件下での２０％５ＤＳ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、該タンパク質が単一バンド中にあることを示した。この方法によって約１５■の８発材料から約１Ｏ０７■のｒＰＣが得られた（収率的７１％）。

Ｂ１組換えプロティンＣの活性化（１）活性化反応活性化のために、ＹＭＩＯウルトラメンブランフィルタ−（Ａｍｉｃｏｎ。

Ｄａｎｖｅｒｓ、　Ｍａｓｓ、）を付けたＡｍ１ｃｏｎ濃縮器を使ってｒＰＣ溶液を２■／−に濃縮し、そして０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ　ｐｆ（７，５，０，１５Ｍ　ＮａＣＩＪｉ！衝液に対して透析した。前記２■／ｍｉ’ｒＰｃ溶液１８６０μｌに、水性２．７■／−のウシトロンビン溶液（持出製薬）６９μ ｌ、水性５００ｍＭ　ＥＤＴＡ　６μβ、およびＴＢＳ　１０６５μｌを添加し、３−の合計容量にした。

徹底的混合後、混合物を３７℃の水浴中で３時間インキュベートし、組換えプロティンＣを活性化した。

（２）活性組換えプロティンＣ（ＡｒＰＣ）の精製カチオン交換カラムとアニオン交換カラムを使って活性化混合物からトロンビンを除去しＡｒＰＣを精製した。

（ａｌカチオン交換カラム３−の０．０２Ｍ　ＭＥＳ　（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸〕／Ｔｒｉｓ　ｐｉ（６，０，０，０５Ｍ　ＮａＣｌ緩衝液の添加により、ＡｒＰＣ溶液を２倍希釈した。この希釈溶液を同緩衝液により平衡化されている１、５ａｎｘ４ａｏのＳ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、カラムに吸着した画分を０．０５〜１．０ＭＮａＣ１の直線勾配によって溶出せしめ、素通り画分、洗浄画分および濃縮画分を得た。ＡｒＰＣは素通り画分と０．３〜０．５Ｍ　ＮａＣ１画分に含まれていた。トロンビンは約０．６Ｍ　ＮａＣ１のところで溶出された。この操作によりＡｒＰＣとトロンビンはほぼ完全に分離された。ＡｒＰＣを含む画分を一緒にプールし、この溶液の約３０１ｎＩを等量の０．０２Ｍ　ＭＥＳ／ＴｒｉｓｐＨ６，０緩衝液に添加し、ＮａＣｌの濃度を下げた。

（ｂｌアニオン交換カラム前の段階において得られたＡｒＰＣ溶液（６０ｍｌ”）を、０．０２Ｍ　ＭＥＳ／ＴｒｉｓｐＨ６，０，０，０５Ｍ　ＮａＣｌ緩衝液で平衡化されている１、ＯａｎＸ３．６　ａｎのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、カラムに吸着しているＡｒＰＣを０．４Ｍ　ＮａＣ１を含む０．０２Ｍ　ＭＥＳ／Ｔｒｉｓ　ｐＨ６，０緩衝液で溶出せしめた。これによってＡｒＰＣを含む単一ピークが得られた（２８０　ｎｍでの吸光度分析による）。

ＡｒＰＣは非還元条件下での１０％−２０％勾配５ＯＳ−ＰＡＧＥ上で単一バンドとして存在した。

（Ａ）ヒト血漿プロティンＣ（ｐＰＣ）の活性化精製ヒトプロティンＣ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、。

５ｏｕｔｈ　Ｂｅｎｄ、　Ｅｎｄ、）　［（ロットＨＰＣ２２０）］を限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ　ＹＭＩＯ）を使って濃縮し、０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ　ｐＨ７，４，０，１５Ｍ　ＮａＣ１緩衝液（ＴＢＳ）に対して透析した。得られた２、２■／ｒｎｌのｐＰＣ溶液８６５μｌに、２．７■／ｒＩＬｌの水性ウシトロンビン溶液（持出製薬）３４μ１１水性の５００ｍＭ　ＥＤＴＡ　３μｌおよびＴＢＳ　５９８　ｔｔ　Ｉ！を添加して１．５ｍｌの合計容量にした。徹底的混合後、混合物を３７°Ｃの水浴中で３時間インキユベートシて活性血漿プロティンＣ（ＡｐＰＣ）を与えた。

（Ｂ）活性ヒト血漿プロティンＣの精製ＡｒＰＣの精製について上述した方法を使って、活性化反応後のＡｐＰＣ含有混合溶液から活性血漿プロティンＣ（ＡｐＰＣ）を精製した。

ＡｐＰＣを含む単一ピーク（２８０ｎｍでの吸光度分析）が得られ、非還元条件下での１０−２０％勾配５ＤＳ−ＰＡＧＥにより単一バンドであることが示された。

結合しているＳ−８結合の還元により精製ＡＰＣの重鎮と軽鎖を互いに分離した。約５６０μｇ　（ＰＣの吸光度に基づいて測定）のＡＰＣを、ｌＯ■のジチオトレイトールを含む６Ｍ塩酸グアニジン−０，５Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８，３）　３−中でＮ２ガス雰囲気下で６５°Ｃにて６時間インキユベートシた。４３■／イのモノヨード酢酸水溶液（ｐＨ４−６）　２５０μβを添加し、この反応液を３７°Ｃで３０分間インキュベートして−ＳＨ基を一３ＣＨ２ＣＯＯＨ基に変換し、ジスルフィド化を防いだ。得られた低分子量溶質を、約１０容の水を溶液側に徐々に添加して溶液の量をほぼ一定に維持しながら、限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏ、）を通して透過させた。

混合重鎮および軽鎖タンパク質の水溶液を、表４に示される条件下で６．２　ｍｍ　Ｘ　８０ｍｍのＰｏ１ｙ−Ｆカラム（ＤｕＰｏｎｔ　Ｃｏ、）を使った逆相分配クロマトグラフィーにより分画した。

表４溶媒Ａ　：　０．　ＩＭ　ＮＨ４ＨＣＯ２（ｐＨ８）溶媒Ｂ・　アセトニトリル流速：　０．５ｒｄ１分検出：　２１５　ｎｍカラム温度：室温単離した軽鎖を含む画分（１０％〜２０％勾配５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上のＭｒ　２０．０００のバンドの存在により決定）を−８０″Ｃで凍結乾燥し、そして２００μｆのＯ，１Ｍ尿素、　５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解した。０．６μｇ　（約４重量％水溶液）のエンドプロテイナーゼＡｓｐ− Ｎ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を添加し、混合物を３７°Ｃて６時間インキュベートして軽鎖中のアスパラギン酸のアミノ末端側でペプチド結合を切断した。

得られた軽鎖ペプチド断片混合物を、表５に示される条件下でオクタデシルシラノール（ＯＤＳ）カラムを使った逆相分配クロマトグラフィーにより分画した。

嚢」− 溶媒Ａ：　０．１容量％トリフルオロ酢酸、■容量％アセトニトリル／Ｈ２０流速：　０．５ｍｌ／分カラム温度：室温４７７Ａ型プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、　。

Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃａ１ｉｆ、）を使ってペプチドピークを配列決定した。アミノ酸１２８にアミノ末端を有するペプチドは通常ＣＩ８カラム上で６０〜７０分の保持時間を有するピークの中に存在した。

アミノ酸配列分析は、２つの異なる軽鎖カルボキシ末端アミノ酸、リジン（アミノ酸番号１５０）およびアルギニン（アミノ酸番号１５２）の存在を指摘した。

エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎはアミノ酸番号１５０、１５１．１５２および１５３の間のペプチド結合を切断する活性を持たないので、上述のようにして生成された活性プロティンＣの軽鎖のカルボキシ末端はリジンおよびアルギニンであると結論づけられた。

アミノ酸配列分析の結果に基づいて、同じピーク中に含まれる他のペプチドの量を差し引くことにより軽鎖ペプチド１２８−１５０の量（ピコモル）を決定した。ペプチドの量は、同じ回収率を示すアミノ酸が検出される最も早いサイクルにおける各アミノ酸のモル比から決定した。軽鎖ペプチド１２８−１５２の量も同じ方法で決定した。

ペプチド１２８−１５０対ペブｆ　）’　１２８−１５２（７）　モル比（ＡＰＣ’　”／ＡＰＣ’　”）ハｌ：３であることがわかった。

（Ａ）ヒト血漿プロティンＣ（ｐＰＣ）の活性化モノクローナル抗体カラムを使って精製されたヒトプロティンＣを、限外濾過膜（Ａ＋ｎ１ｃｏｉ　ＹＭＩＯ）を使って濃縮し、０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ７，４，Ｏ，１５Ｍ　ＮａＣ１緩衝液（ＴＢＳ）に対して透析した。得られた２■／−のｐＰＣ溶液４５０ μｌに、２．７■／−の水性ウシトロンビン溶液（持出製薬）１７μｃ水性５００ｍＭ　ＥＤＴＡ　２ａ　１およびＴＢＳ　５３１　μＡを添加して１．０＋ｎＩ！の合計容量にした。徹底的混合後、混合物を３７°Ｃの水浴中で３時間インキュベートして活性血漿プロティンＣ（ＡｐＰＣ）を与えた。

（Ｂ）活性ヒト血漿プロティンＣの精製ＡｒＰＣの精製について上述した方法を使って、活性化反応後のＡｐＰＣ含存混合溶液から活性血漿プロティンＣ（ＡｐＰＣ）を精製した。

ＡｐＰＣを含む単一ピーク（２８０ｎｍでの吸光度分析）が得られ、非還元条件下での１．０−２０％勾配５ＤＳ−ＰＡＧＥにより単一バンドであることが示された。

実施例９結合しているＳ−８結合の還元によりＡｐＰＣの重鎮と軽鎖を互いに分離した。

約５５０μｇ　（ＰＣの吸光度に基づいて測定）のＡＰＣを、１０■のジチオトレイトールを含む６Ｍ塩酸グアニジン−０，５Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８，３）　３−中でＮ２ガス雰囲気下で６５℃にて４時間インキュベートした。４３■ ／ｒｒｔｌのモノヨード酢酸水溶液（ｐＨ４，６）　２５０μｌを添加し、この反応液を３７°Ｃで３０分間インキュベートして−ＳＨ基を一３ＣＨ２ＣＯＯＨ基に変換し、ジスルフィド化を防いだ。得られた低分子量溶質を、約１０容の水を溶液側に徐々に添加して溶液の量をほぼ一定に維持しながら、限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏ、）を通して透過させた。

混合重鎮および軽鎖タンパク質の水溶液を、表６に示される条件下で６．２　ｍｒｎ　Ｘ　８０ｍｍのＰｏ１ｙ−Ｆカラム（ＤｕＰｏｎｔ　Ｃｏ、）を使った逆相分配クロマトグラフィーにより分画した。

表６溶媒Ａ　：　０．　ＩＭ　ＮＨ，ＨＣＯ２（ｐＨ８）溶媒Ｂ：　アセトニトリル流速：　０．５ｍ１１分カラム温度：室温検出：　２１５　ｎｍカラム温度：室温単離した軽鎖を含む画分（１０％〜２０％勾配ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル上のＭｔ　２０．０００のバンドの存在により決定）を−８０°Ｃて凍結乾燥し、そして２００μｍのｏ、ｉＭ尿素、　５０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ８，０）に溶解した。０．６μｇ　（約４重量％水溶液）のエンドブロテイナーセＡｓｐ− Ｎ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を添加し、混合物を３７°Ｃで６時間インキュベートして軽鎖中のアスパラギン酸のアミノ末端側でペプチド結合を切断した。

得られた軽鎖ペプチド断片混合物を、表７に示される条件下てオクタデシルシラノール（ＯＤＳ）カラムを使った逆相分配クロマトグラフィーにより分画した。

溶媒Ａ：　０．１容量％トリフルオロ酢酸、１容量％アセトニトリル／Ｈ２０流速：　０．５ｒｎＩ／分カラム温度：室温検出：　２１５　ｎｍアミノ酸１２８にアミノ末端を有するペプチドは、一般にＣ１８カラム上で６０〜７０分の保持時間を有するピークの中に存在した。

キモトリプシンタンパク質分解ＣＩ８カラム上で６０〜７０分の保持時間を有するピークの両分を取り出し、− ８０°Ｃて凍結乾燥し、そして１００μｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中に溶解した。

トリプトファン、チロシン等のカルボキシ末端側でペプチド結合を切断するために、上記画分に５．５　ｎｇ　［５００μｇ／−リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）］のキモトリプシン（Ｓｉｇｍａ、　Ｃ−３１４２）を添加し、混合物を３７°Ｃで４時間インキュベートした。

得られたペプチド断片混合物を、表７に示したのと同じ条件下でオクタデシルシラノール（ＯＤＳ）カラムを使って逆相分配クロマトグラフィーにより分画した。

上記で得られたペプチド断片のアミノ酸配列分析は４７７Ａ型プロテインシークエンサーを使って行い、そしてアミノ酸分析はＰＴＣアミノ酸分析法（Ｒ，Ｌ、　Ｈｅ１ｎｒｉｋｓｏｎ、　Ｓ、Ｃ，Ｍｅｒｅｄｉｃｈ、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｔ、Ｅ、　Ｈｕｇｌｉｉ！、　２７３頁、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８９）によって行った。

アミノ末端にアミノ酸番号１４６のリジンを有するペプチドは、ＣＩ８カラムでは２４〜４０分に溶出されると予想された。

アミノ酸配列分析とアミノ酸分析の結果は、３つの異なる軽鎖カルボキシ末端アミノ酸、即ちリジン（アミノ酸番号１５０）　、リジン（アミノ酸番号１５１）およびアルギニン（アミノ酸番号１５２）の存在を示した。

キモトリプシンはアミノ酸番号１４９．１５０．１５１．１５２および１５３の間の結合を切断する活性を持たないので、上記のように生成された活性プロティンＣの軽鎖のカルボキシ末端はリジン（アミノ酸番号１５０）、リジン（アミノ酸番号１５１）およびアルギニン（アミノ酸番号１５２）であると結論づけられた。

アミノ酸配列分析における第一残基リジンの回収率からまたはアミノ酸分析における各アミノ酸の含量から、軽鎖の　１４６−１５０ペプチドの量（ピコモル）を決定した。同様にして軽鎖の１４６−１５１ペプチドおよび１４６−１５２ペプチドの量の決定した。ペプチド１４６−１５０対１４６−１５１対１４６−１５２のモル比（ＡＰＣ”’／ＡＰＣ”’／ＡＰＣ”）は１：２：２であることがわかった。

上記から、本発明の特定の態様を例示の目的で記載してきたか、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を行い得ることは明らかであろう。従って、本発明は添付の請求の範囲による以外には限定されない。

ｇ６　Ｂ　ば：　８七　＝テ　８き　ｇ寝瓢　５ビｎヒ１−　Ｌ）−（ψ　口く　トド　閂トド　くくＬｌ）−１ＣＪ−ロー　ロｅ　（Ｊ　Ｌ　ＣＪ　Ｃ（ＪΦ ８；　＝；　讐ｙ　３；　ば＝　３５　；＝ＯＬ　ｕｌｌＪ　（Ｊ−ロｅｌ’ｌ　Ｃ）　Ｌ）　＞　ＣＪ　Ｌ／ｌ　ＬＪ　ｌ／１（Ｊｊ　＋ｊ　＋−−市　ＯＬ　ドロー　く・−く・−＜１−　１−Ｉ　Ｃｊ＞　（Ｊ（１”ＩＬＩＬ）　（Ｊ：　（Ｊ：Φ−Ｑ（ロコ　（ＪＯ＋　ロー　−フ　Ｃ為＋弓　ＣＪＩ１：（Ｆ− （φ　＜−１Ｉ＋ａＪ　■−ロ＞　（）−ＬＩロ　ロく　Ｑ＝　リー　ロＣＱフ　（ＪＯ’ｌ　（Ｊ％−ロＣｊ）−ｔ　Ｌ）（ＬＩ　ＣＪ）　ｌ−１／ＩＩ−ル　ロー　ｚａ、＋　ｕ＋ｌｃｊ　−１−二　トΦ　く・−ｗ−（Ｊく　（ψ　０口（ｊ　ヒ−Ｌ）−ＣＪ　！Φフ　く■　ＯＣコ　ＵΦ　Ｑ市　トφ　ロユ（Ｆ −ｃｊμ　ｎく−　←−Ｑ−ロ＞　ローφロ　（（＋”）■ロ　く−ロく　ヒＱ　トドΦｅ　Ｌｌ　＋／ｌ　ト（Ｌ）　＞　ＣＪ　ｐ−ＣＪ　＞　（Ｊ　’：Ｌ３δ　≦つ　３国　８；　＄；　呂；ｇ５Ｌｌ＞ＯＬ）勺　Ｑψ　０勺　ロー　ロフ　ＯＱコ（ｊｐ−−（Ｊ、−＜−（Ｊ　−）−（Ｌｌ　＜−０１−ＯＪＣりＣｊ　−ロく　Ｑ＝　ロ（（：ｉ：　Ｃり　Ｌ：ｌ　ぐＱ−Ｑつ　Ｃ口　Ｃ０ヒ ψ　ＣＪＯＩ−ト　Ｕ−υ−＜−（Ｊ−■≧　ＣＪＩ−Ｃり４　（−０く　Ｃ口　（Ｊ　Ｃ−１−ＣＪ　Ｌｌ　ｌ　■ロ　トド０じＣＯ−〇−〇］　ロー　Ｃ１（ｊユ　Ｑσ冗已；　≧ご　ロ；　ロヨ　８Ｇ　雷＝占　８３１−ｅ：　Ｃｊ　：Ｉ　Ｃｊ　ｐ−（ｊ　ａＪ　Ｃ！！　＞　ＣＪ　ｌ−Ｌ）　Ｌ≦ギ　５５　眺；　ミ字　８；　躍メ　オｙＱフ　（０’ｌ　（Ｊ　Ｏ（Ｊ　（ＣＮ−Ｓ−Ｃ３ −ｕ−口３　８之　８上　３；　冒躍ｙ　＄；　口；ＦＩＧ。２要　約　書ヒト活性プロティンＣの生物活性を有するタンパク質か提供される。該タンパク質は哺乳動物宿主細胞ＤＮＡ中に組み込むことかできるプラスミドによりトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞により生産される。血漿プロティンＣまたは組換えプロティンＣを活性化してヒト活性プロティンＣの活性を実質的に有するタンパク質を生せしめる方法も提供される。ここで、前記活性プロティンＣの軽鎖は１５０．１５１または１５２アミノ酸残基を含む。ヒト活性プロティン０１ ′６、活性プロティンＣ１６１および／または活性プロティン０１″２を含有する組成物も提供される。精製された活性プロティンＣ中のプロティンＣのそれらの形態の比を決定する方法も開示される。

国際調査報告国際調査報告ＵＳ　９１００９１２

Claims

【特許請求の範囲】

１．重鎖および軽鎖を有する活性ヒトプロテインＣであって、前記軽鎖がアミノ酸番号１のアラニンからアミノ酸番号１５０のリジンまでの図１のアミノ酸配列；アミノ酸番号１のアラニンからアミノ酸番号１５１のリジンまでの図１のアミノ酸配列；およびアミノ酸番号１のアラニンからアミノ酸番号１５２のアルギニンまでのの図１のアミノ酸配列から成る群から選択されたアミノ酸配列から本質的に成る、活性ヒトプロテインＣ。
２．組換えプロテインＣを活性化することにより生産される、請求項１に記載の活性ヒトプロテインＣ。
３．血漿プロテインＣを活性化することにより生産される、請求項１に記載の活性ヒトプロテインＣ。
４．前記プロテインＣが組換え活性プロテインＣである、請求項１に記載の活性ヒトプロテインＣ。
５．活性ヒトプロテインＣの第一形態、活性ヒトプロテインＣの第二形感および／または活性ヒトプロテインＣの第三形態を含んで成る組成物であって、前記第一形態がアミノ酸番号１のアラニンからアミノ酸番号１５０のリジンまでの図１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖にジスルフィド結合した重鎖を含んで成り；前記第二形態がアミノ酸番号１のアラニンからアミノ酸番号１５１のリジンまでの図１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖にジスルフィド結合した重鎖を含んで成り；そして前記第三形態がアミノ酸番号１のアラニンからアミノ酸番号１５２のアルギニンまでの図１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖にジスルフィド結合した重鎖を含んで成ることを特徴とする組成物。
６．前記第一形態対前記第二または第三形態の比が約１：１０〜約１０：１である、請求項５に記載の組成物。
７．前記第一形態対前記第二または第三形態の比が１：５〜５：１である、請求項５に記載の組成物。
８．前記第一形態対前記第三形態の比が約１：３である、請求項５に記載の組成物。
９．前記第一形態対前記第二形態の比が約３：１である、請求項５に記載の組成物。
１０．前記比が、（ａ）軽鎖と重鎖とを分離し；（ｂ）分離した軽鎖を断片化してポリペプチドを生成せしめ；（ｃ）該ポリペプチドを分画し；（ｄ）分画したポリペプチドを配列決定し；そして（ｅ）前記第一形態対前記第二形態のモル比を算出することを含んで成る方法により決定される、請求項５〜９のいずれか一項に記載の組成物。
１１．前記分離段階が、−ＳＨ基を生成するための重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合の還元、およびその後のジスルフィド化を防ぐための前記−ＳＨ基の修飾を含んで成る、請求項１０に記載の組成物。
１２．前記断片化段階が、エンドブロテイナーゼＡｓｐ−Ｎによるタンパク質分解、次いで場合によりペプチドの分離後のキモトリプシンによるタンパク質分解を含んで成る、請求項１０に記載の組成物。
１３．前記分画段階が高性能液体クロマトグラフィーを含んで成る、請求項１０に記載の組成物。
１４．前記第一、第二および第三形態が組換えヒトプロテインＣに由来する、請求項５に記載の組成物。
１５．前記第一、第二および／または第三形態が組換え活性ヒトプロテインＣの形態である、請求項５に記載の組成物。
１６．前記第一、第二および／または第三形態が活性血漿プロテインＣに由来する、請求項５に記載の組成物。
１７．ヒトプロテインＣからヒト活性プロテインＣ１５０、ヒト活性プロテインＣ１５１およびヒト活性プロテインＣ１５２を含んで成る組成物を製造する方法であって、（ａ）ヒトプロテインＣを濃縮し；（ｂ）濃縮したプロテインＣの塩濃度を低下させて減塩溶液を生成せしめ；（ｃ）前記減塩溶液をトロンビンに暴露してプロテインＣを活性化し；（ｄ）段階（Ｃ）の生成物をイオン交換クロマトグラフィーにかけることにより活性プロテインＣをトロンビンから精製し、精製された活性プロテインＣを含む１または複数の画分を得；そして（ｅ）精製された活性プロテインＣを含む画分を収集し、ここで前記精製された活性プロテインＣは活性プロテインＣ１５０、活性プロテインＣ１５１および活性プロテインＣ１５２から本質的に成る、段階を含んで成る方法。
１８．前記暴露段階が、重量で１：１〜２００：１のプロテインＣ対トロンビンの比を与えるように前記減塩溶液をトロンビンと混合することを含んで成る、請求項１７に記載の方法。
１９．前記比が約２０：１である、請求項１８に記載の方法。
２０．前記ヒトプロテインＣが約２．０〜２．５ｍｇ／ｍｌに濃縮される、請求項１７に記載の方法。
２１．前記精製段階がカチオン交換クロマトグラフィーの後にアニオン交換クロマトグラフィーを含んで成る、請求項１７に記載の方法。
２２．前記トロンビンが１０％未満のウシβ−またはγ−トロンビンを含むウシ γ−トロンビンである、請求項１７に記載の方法。
２３．前記ヒトプロテインＣが血漿プロテインＣである、請求項１７に記載の方法。
２４．前記ヒトプロテインＣが組換えプロテインＣである、請求項１７に記載の方法。
２５．前記組換えプロテインＣが、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養して軽鎖と活性化ペプチドとの接合部に配列Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４（ここでＲ１〜Ｒ４の各々はリジン残基またはアルギニン残基である）を有するプロテインＣ前駆体を発現せしめることにより生産される、請求項２４に記載の方法。
２６．前記細胞がＢＨＫ細胞または２９３細胞である、請求項２５に記載の方法。
２７．前記細胞がビタミンＫ含有培地中で培養される、請求項２５に記載の方法。
２８．前記細胞が本質的に無血清である培地中で培養される、請求項２５に記載の方法。
２９．前記組成物が約１：１０〜約１０：１の活性プロテインＣ１５０対活性プロテインＣ１５１比を含んで成る、請求項１７に記載の方法。
３０．前記組成物が約１：５〜５：１の活性プロテインＣ１５０対活性プロテインＣ１５１または活性プロテインＣ１５２の比を含んで成る、請求項１７に記載の方法。
３１．前記組成物が約１：３の活性プロテインＣ１５０対活性プロテインＣ１５２の比および／または約３：１の活性プロテインＣ１５０対活性プロテインＣ１５１の比を含んで成る、請求項１７に記載の方法。
３２．生理学的に許容される担体または希釈剤と活性血漿プロテインＣとを含有する医薬組成物であって、前記活性ヒトプロテインＣは重鎖と軽鎖を有し、前記軽鎖がアミノ酸番号１のアラニンからアミノ酸番号１５０のリジンまでの図１のアミノ酸配列から本質的に成る、医薬組成物。
３３．生理学的に許容される担体または希釈剤と活性血漿および／または組換えプロテインＣとを含有する医薬組成物であって、前記活性血漿および／または組換えプロテインＣは重鎖と軽鎖を有し、前記軽鎖がアミノ酸番号１のアラニンからアミノ酸番号１５０のリジンまでの図１のアミノ酸配列から本質的に成る、医薬組成物。
３４．生理学的に許容される担体または希釈剤と活性ヒトプロテインＣとを含有する医薬組成物であって、前記活性ヒトプロテインＣは重鎖と軽鎖を有し、前記軽鎖がアミノ酸番号１のアラニンからアミノ酸番号１５１のリジンまでの図１のアミノ酸配列から本質的に成る、医薬組成物。
３５．生理学的に許容される担体または希釈剤と活性血漿プロテインＣとを含有する医薬組成物であって、前記活性ヒトプロテインＣは重鎖と軽鎖を有し、前記軽鎖がアミノ酸番号１のアラニンからアミノ酸番号１５２のアルギニンまでの図１のアミノ酸配列から本質的に成る、医薬組成物。
３６．生理学的に許容される担体または希釈剤と活性血漿および／または組換えプロテインＣとを含有する医薬組成物であって、前記活性血漿および／または組換えプロテインＣは重鎖と軽鎖を有し、前記軽鎖がアミノ酸番号１のアラニンからアミノ酸番号１５２のアルギニンまでの図１のアミノ酸配列から本質的に成る、医薬組成物。
３７．生理学的に許容される担体または希釈剤と、約１：１０〜約１０：１の比の活性プロテインＣ１５０、活性プロテインＣ１５１および／または活性プロテインＣ１５２とを含んで成る医薬組成物。
３８．前記比が約１：５〜５：１の範囲内である、請求項３７の医薬組成物。
３９．活性プロテインＣ１５０対活性プロテインＣ１５１の比が約３：１であり、そして／または活性プロテインＣ１５０対活性プロテインＣ１５２の比が約１：３である、請求項３７の医薬組成物。
４０．生理学的に許容される担体または希釈剤並びに活性プロテインＣ１５１および活性プロテインＣ１５２を含んで成る医薬組成物。
４１．精製された活性プロテインＣ中の活性プロテインＣ１５０、活性プロテインＣ１５１および活性プロテインＣ１５２の比を決定する方法であって、（ａ）活性プロテインＣの重鎖と軽鎖を信合するジスルフィド結合を−ＳＨ基に還元し；（ｂ）更なるジスルフィド化を防ぐために前記−ＳＨ基を修飾し；（ｃ）軽鎖を重鎖から分離し；（ｄ）軽鎖を断片化し；（ｅ）断片化した軽鎖を分画し；（ｆ）分画した軽鎖を配列決定し；そして（ｇ）活性プロテインＣ１５０、活性プロテインＣ１５１および活性プロテインＣ１５２のモル比を算出する、ことを含んで成る方法。
４２．前記還元段階が活性プロテインＣを６Ｍグアニジン−ＨＣＩ，ｐＨ８中でジチオトレイトールで処理することを含んで成る、請求項４１の方法。
４３．前記修飾段階がｐＨ４〜ｐＨ６において−ＳＨ基をモノヨード酢酸で処理することを含んで成る、請求項４１の方法。
４４．前記分離段階が逆相分配クロマトグラフィーを含んで成る、請求項４１の方法。
４５．前記断片化段階がエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎによるタンパク質分解を含んで成る、請求項４１の方法。
４６．前記断片化段階がペプチドの分離後のキモトリプシンによるタンパク質分解を更に含んで成る、請求項４４の方法。
４７．前記分画段階が高性能液体クロマトグラフィーを含んで成る、請求項４１の方法。