JPH03501261A - セルロース結合融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 セルロース結合融合タンパク質 本発明の技術分野 本発明は、ポリサツカロイドマトリックスに結合可能なキメラポリペプチドを含 むポリペプチド組成物（セルロース結合融合タンパク質）および組換えＤＮＡ技 術を用いた該組成物の製造方法に関するものである。

本発明の技術的背景 微生物系における遺伝子発現よる外来タンパク質の生産は、大量に同一のタンパ ク質を得るうえで重要である。遺伝子組換えによって生産されるタンパク質（組 換えタンパク質：　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の精製およびそ の再生は発酵工程をデザインする際に考慮すべきものの中で重要課題である。組 換えタンパク質を単離する手段として伝統的なタンパク質精製手段のみならず、 融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ）を用いる方法がある。この融合 タンパク質はアフィニテイクロマトグラフィによって精製することが可能で、目 的とする融合タンパク質の構成成分はアフニテイマトリックスへのポリペプチド の共有結合にもとづく結合によって精製される。例えば、β−ガラクトシダーゼ と融合した目的とするタンパク質からなる融合タンパク質はｐ−アミン、フェニ ル、β−Ｄ−チオ、ガラクトシド−セファロースカラムによって精製することが できる。このような方法はウィルス抗原のような免疫原性ポリペプチドを精製す るのに用いられてきた。また、免疫グロブリンのＦｃ領域に対して特異的に結合 するスタフィロコッカス（ブドウ球菌）プロティンＡも、その特異的性質を利用 してアフィニテイ精製に用いることができる。

精製に加えて、融合したものから元の構成成分を回収することはしばしば必要と されることである。そこで、化学的および生物学的方法によって融合タンパク質 を分割し、その構成成分または断片に分けることが行なわれてきた。例えば、低 ｐＨ環境によって酸に不安定なアスパラチルプロリンによって連結された２つの 断片からなる融合タンパク質を分割することができる。この方法を用いることが できるのは主に目的とする断片が酸に対して不安定なものではない場合である。

また、インシュリンやソマトスフチンのようなホルモンから構成される融合タン パク質の場合は臭化シアンによって分割することが可能である。この臭化シアン はメチオニン残基のカルボキシル側に特異的に作用し、融合タンパク質を分割し て目的とするホルモンを離す。しかし、この方法は目的とするタンパク質がメチ オニン残基を含む場合には適当でない。

部位特異的なタンパク質加水分解による融合タンパク質の分割についても研究さ れてきた。例えば、ニワトリα、２コラーゲン前駈体リンカ−（ｃｈｉｃｋｅｎ 　ｐｒｏ　ａ　−２ｃｏｌｌａｇｅｎ　１ｉｎｋｅｒ）を挿入した融合タンパク 質は微生物由来の精製コラ−ゲナーゼによって特異的に分解され、その分解にと もなって構成成分が放出される。

組換えタンパク質の精製および回収のための他の方法として、タンパク質のカル ボキシル末端にポリアルギニン鎖を設ける方法もある。

アルギニン残基はタンパク質の全体的な塩基性（ｂａｓｅｉｃｉｔｙ）を増大さ せてイオン交換クロマトグラフィによる目的とするタンパク質の精製を可能にさ せるものである。カルボキシルペプチダーゼＢによるポリアルギニン末端の連続 的な切断によって目的とするタンパク質の回収が可能となり、また目的とするタ ンパク質のｐＩ値を減少させることによって塩基性コンタミからの精製を可能と する。

目的とするタンパク質の精製または固定のための安価で、かつ簡易な方法を開発 することは大変興味の持たれることである。セルロースのような炭水化物ポリマ ーは、大量入手可能で安価なものであり、さらに特異的に結合する酵素が豊富に 存在することが知られていることから、融合タンパク質の精製および（または） 固定化のための材料として好適である。そこで、酵素のようなものが結合する炭 水化物ポリマーからなる部位を少なくとも部分的に有する融合タンパク質を調製 することが注目されている。

関連文献 セルロースのｎ製に用いられるセルラーゼの親和性に関する文献：Ｂｏｙｅｒ　 ｅｔ　捗、　Ｂｉｏ＋ｅｃｈｎｏ１．　Ｂｉｏｅｎｇ、　（１９８７）　２９： 　１７６−ｌ７６−１７９Ｈａｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、 　（１９７ｇ）　１６９ニア１３−７３５Ｍａｒ’ｙａｎｏｖ　ｅ３　藝、　Ｂ ｉｏｋｈｉｍｉｙａ　（１９８４）　１９：　４０５−１０４Ｎｕｍｍｉ　ａｔ 　ａｌ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８］）　］　１６：　１３ ７−１４１ｖａｎ　ＴｉＪｂｅｕｒｇｈ　ｅｔ　ａｌ、、　ＦＥＢＳ　１ｅｔｔ ｅｒｓ　（１９８６）　２０４：　２２３−２２７アビセル（Ａｖｉｃｅｌ；　 微結晶セルロース）をネイティブな酵素を精製するのに用いることに関する文献 ： Ｇ１１ｋｅｓ　ａ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８４）　 ２５９：　１０４５５−１０４５９アビセル（Ａｖｉｃｅｌ；　微結晶セルロー ス）を組換え酵素を精製するのに用いることに関する文献： Ｏｗｏｌａｂｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏ＋、　（１９８８）　５４：　５１ｇ−５２３マルトースに結合する二価 性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）ハイブリッドタンパク質について記載した文献 ： エンドグルカンアーゼ（ＣｅｎＡ）についての特長が記載され、かつそれらの遺 伝子座およびｃｅｎＡの配列決定がされたことに関する文献：Ｗｏｎｇ　ｃｔ　 ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　（１９８６）　４４：　３１５−３２４推測されたアミノ 酸配列がそれらの酵素のドメイン構造を明らかにすることに関する文献： Ｗａｒｒｅｎ　ｅｔ　！！、、　ＰＲＯＴＥＩＮＳ：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　 Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（１９８U）　Ｌ：　３３５ −３４１ 他のセルラーゼにおいてもドメイン構造が調べられたことに関する文献：Ｔｅｔ Ｓ　ａ　ａｌ、、　Ｐｕｂ］ｊｅａｔｉｏｎｓ　（１９８７）　３８：　Ｔｅｃ ｈｎｉｃａｌ　ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　ＦｉｎｌａｎｄＴｅｅｒｉ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｇｅｎｅ　（１９８７）　５１：４３−５２加水分解による分割によって分 離したドメインによってドメイン構造についてのいくつかの知見が得られたこと を報告する文献：Ｌａｎｇｓｆｏｒｄ　ａ　ａｌ、、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｕｅｒｓ 　（１９８６）　２０４：　２２３−２２７Ｔｏｍｍｅ　ａ　！！、、　Ｅｕｒ 、　Ｊ、　Ｂｉｏｌｃｈｅｍ、　（１９８ｇ）　２匹＋５７５−５８１ｖａｎ　 Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（ １９８８）　１７０：　５７５−５８１ｖａｎ　Ｔｉ１反ｕｒｇｈ　ｅｔ　ａｌ 、、　ＦＥＢＳ　１ｅｔｔｅｒｓ　（１９８６）　２０４：　２２３−２２７Ｃ ，色眞培養液上清中に見いだされたセリンプロテアーゼに関する文献：Ｌａｎｇ ｓｆｏｒｄ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ＋、　（１９ ８４）　１３０：　１３６７−１３７６前記セリンプロテアーゼが基質結合した 組換え体ｏｅｎＡおよびＣｅｘを分割し、セルロースに対する親和性の著しい減 少を伴って触媒的に活性な断片（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ−ａｃｔｉｖｅ　 ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）を放出することに関する文献：Ｌａｎｇｓｆｏｒｄ　ａ　 ａｌ、、　ＥＲＢＳ　１ｅｔｔｅｒｓ　（１９８７）　２２５：　１６３−１６ ７残りの断片は両酵素の低電荷密度の変化領域（ｉｒｒｅｇｕｌａｒ　ｒｅｇｉ ｏｎｓ　ｏｆ　ｌｏｗ　ｃｈａｒｇｅｄｅｎｓｉｔｙ）に該当し、かつそれらの 酵素のセルロース結合ドメインをなすと考えられている。

本発明の要約 本発明の目的はポリサッカライドマトリックスに結合可能な融合タンパク質（セ ルロース結合融合タンパク質；　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆｕｓ ｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ）とそのための調製方法とを提供することである。本発 明にもとづくセルロース結合融合タンパク質（以下、融合タンパク質と呼ぶ）は ポリサツカロイドの基質結合領域から少なくともなるものである。融合タンパク 質は、目的とするポリペプチドをコードする遺伝子に連結（ｌｉｇａｔｅｄ）　 Ｌ−１かつポリサッカロイダーゼの基質結合領域をコードするＤＮＡ断片から少 なくともなるＤＮＡを宿主細胞に導入して形質転換させて調製される。これによ って得られた融合タンパク質はポリサツロイドーゼの基質からなる固形支持体（ ｓｏｌｉｄ　５ｕｐｐｏｎ）に容易に結合する。その組成物は種々の興味あるポ リペプチドのどれかを含むポリサン力ロイドマトリックスを調製するために用い られるか、あるいは融合タンパク質または興味あるポリペプチドの精製方法に用 いられる。

図の詳細な説明 第１図はＣｅｘ発現プラスミドｐｅＣ−１，１およびｐＵｃ１２−１．１ｃｅｘ の構成を示すものである。β−ラクタマーゼ（Ａｐ’）　、Ｃｅｘ　（クロスハ ツチスクエア）およびｌａｃ遺伝子のプロモーターをコードする遺伝子の機能的 位置関係は矢印で示しである。制限酵素による切断部位はそれぞれ　Ｂ　＝　Ｂ ａｒｎ）（Ｉ、　Ｅ　＝　ＥｃｏＲＩ、　Ｈ３＝　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、Ｓ　−Ｓ ａｌ　Ｉ　の略号で示す。

第２図はＲＢＳ、翻訳開始部位、さらにβＧａＪ＜ｘｇ発現プラスミドｐＵｃ１ ２−１．１　ｃｅｘ、ｐＵｃ１２−１．１　（７３７）およびｐＵｃ１２−１． １　（ＰＴＩＳ）の融合結合部のアミノ末端に関するＤＮＡ配列を示すものであ る。

第３図はｐＵＣＥＣ２の構成を示すものである。

第４図は（Ａ）　ｐｃＥｃ２および（Ｂ）　ｐＵｃＥｃ２における慝Ｚとｇ巴Ａ との融合部分の核酸およびアミノ酸配列を示すものである。

第５図はｐＥｏｌの構成を示すものである。

Ｓｐ　＝　シ也１、Ｓｓ＝ハイブリッドＳｍａ１％５ａ＝Ｓａｌｌ、　ＰＳ＝Ｐ ｓｔｌ、ＡＢＧ　＝β−ガラクトシダーゼ遺伝子Ｃｅｘエクソグルコナーゼ遺伝 子、５ＥＤ＝基質結合ドメイン、汀＝プロリン、スレオニンボックスハッチドボ ックスマルチプルクローニング部位。

第６図はｐＵｃ１２−１．１　ｃｅｘ　（ＦＴＩＳ）を直線状にして制限酵素に よる切断部位を表した概略説明図である。

第７図は（Ａ）融合酵素のフエドーバ７チ生産（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ　ｐｒｏｄ ｕｃｔｉｏｎ）　、精製および固定についての概略説明図、　（Ｂ）セルロース 様物質をグルコースに加水分解するための再利用可能なファーメンタ−・固定カ ラム（ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ−ｉｍｍｏｂ脂即ｏｎ　ｃ。

Ｉｕｍｎ）の概略説明図である。

実施態様の説明 融合タンパク質は幅広い分野に利用でき、例えばタンパク質の精製や固定化、さ らに固形診断剤（ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の調製方 法において融合タンパク質の利用がめられている。また、目的とする化合物をポ リサツカロイドに結合させるための手段として融合タンパク質を利用することも められている。そこで、本発明にもとづ〈実施態様においてはセルラーゼの基質 結合部分が少なくとも目的とするタンパク質に融合した融合タンパク質からなる 新規な組成物およびその調製方法を提供する。

少なくとも、目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片と連 結（ｌｉｇａｔｅｄ）させたポリサッカロイダーゼの基質結合領域をコードする 遺伝子を含むＤＮＡ断片とからなるＤＮＡを宿主細胞に導入する。そしてそれら の遺伝子を導入された宿主細胞を増殖させ、かつそれらの遺伝子を発現させるこ とによって、それの遺伝子にもとづく組成物、すなわち融合タンパク質の調製を おこなう。このような系に用いることが可能な宿主細胞は大腸菌なとの原核細胞 のみならず酵母などの真核細胞でもよい。　このようにして調製される融合タン パク質はその大部分が以下の式によって表すことが可能である。

ＳＢＲ−ＭＲ−Ｘ この式で、ＳＢＲは、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端領域であり、少なくとも ポリサッカロイダーゼの基質結合領域を含む１０ｇから１３４のアミノ酸からな るアミノ酸配列である。

凧は中間に位置する領域で、炭素数が２ないし３０またはアミノ酸が２ないし２ ０からなるＳＢＲとＸとを結合する部位である。この領域は融合タンパク質が特 異的に切断されるためのアミノ酸配列を含む部分で、そのアミノ配列はイムノグ ロブリンＡ１プロテアーゼような高特異性タンパク質分解酵素によって認識され る部位と一致する。

ＸはＮ−末端またはＣ０末端領域にあたる部分で、目的とするポリペプチド全体 あるいはその断片を含む。目的とするポリペプチドとしては、酵素、ホルモン、 イムノグロブリン、色素等が考えられる。

融合タンパク質の調製 セルロース遺伝子の単離方法は従来技術、すなわちゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮ Ａにもとづく方法、またはそれらの組み合わせを含む方法等によって行なった。

また、多くの遺伝子操作技術が知られており、それらの方法として例えば消化、 連結、制限、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける突然変異誘発、プライマー修復、リンカ −およびアダプターの利用などがある（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅ＋　ａ＋、、　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ盾秩@ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈｗｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　 １９８２）。

ゲノムＤＮＡを利用する方法は、本発明の実施に好適なセルラーゼ遺伝子を有す る生物からゲノムＤＮＡライブラリーを調製して行なう。例えば、そのようなセ ルによって切断する。得られた断片はベクターに組み込む。好ましいベクターと してはプラスミドｐＢＲ３３２があり、制限エンドヌクレアーゼＢａｍ　Ｈｌに よって切断して前記断片が挿入できるようにする。セルラーゼのアミノ酸配列を もとにして、前記断片を組み込まれたベクターを導入された宿主細胞が生産する セルラーゼ遺伝子に関係したｍＲＮＡまたはＤＮＡから調製されたｃＤＮＡまた はゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブをデザインすること ができる。

セルラーゼｃＤＮＡまたはその断片をハイブリダイゼーションのためのプローブ として用いることによって、他の微生物に存在する構造的に類似した遺伝子をク ローン化することができる。例えば、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　ｆｉ＋ｎｉの セルラーゼ遺伝子に関するヌクレオチド配列をもとにしてオリゴヌクレオチドプ ローブを調製し、このプローブによってセルラーゼ活性を有する生物から、その 活性に関係する遺伝子を単離することが可能である。そのようなプローブは実際 の配列よりも短いものだが、少なくとも１０塩基、好ましくは、１４塩基からな るヌクレオチド配列を有するものが考えられる。実際の遺伝子と同じぐらいまで 、あるいはそれより長いヌクレオチド配列も利用可能であり、好ましくは５００ 塩基、寄り好ましくは２５０塩基のヌクレオチド配列の長さのものを利用するこ とが可能である。もちろん、プローブはＲＮＡまたはＤＮＡのどちらでもよい。

プローブとして利用するに当たっては、プローブを標識（例えばＰ、狛、ビオチ ンまたはアビジンによる標識）シ、目的とする遺伝子を有する生物がら得た一重 鎖ＤＮＡまたはＲＮＡとともにインキュベートしてハイブリダイズさせる。ハイ ブリダイゼーションは一重鎖ＤＮＡと二重鎖（ハイブリッド）ＤＮＡ（またはＲ ＮＡ／ＤＮＡ）とを分離（普通はニトロセルロース紙による）したのち、プロー ブに付けられた標識によって検知することができる。なお、このようなハイブリ ダイゼーション方法は当業者にとっては既知のことである。

一般的にはプローブは同定を容易ならしめる検知可能な標識を付けて用いられる のだが、未標識のオリゴヌクレオチドも利用可能で、二重鎖ＤＮＡ　（またはＤ ＮＡ／ＲＮＡ）を直接的に検知する方法に利用できる。　したがって、　「オリ ゴヌクレオチドプローブ」という言葉の中には標識されたものと標識されないも のとが含まれる。

セルラーゼのセルロース結合ドメインを単離するために、いくつかの遺伝学的ア プローチを試みた。

ひとつの方法は制限方法を用いるもので、制限酵素によって遺伝子の一部分を切 り取り、そして遺伝子の一部分を欠失した遺伝子をベクターに挿入することによ って特定遺伝子由来の欠損タンパク質を得ることである。他の方法はエクソヌク レアーゼを用いるもので、例えばＢａ１３１のようなエクソヌクレアーゼを用い て遺伝子中に生じた制限酵素による切断欠失部分の内側から、あるいは３°末端 および５°末端の外側からヌクレオチドを取り除いて遺伝子の特定部分を欠失さ せる。

このような遺伝子の欠失による方法によって得られた変異遺伝子由来の欠損タン パク質の基質結合能を調べることによって元のタンパク質の基質結合部位等を推 測することができる。

基質結合能、結合活性等を調べるための好適な基質としてはアビセル（Ａｖｉｃ ｅｌ）、コツトンファイバー、フィルターペーパー、クラフトまたはグラウンド ウッドバルブなどがある。

基質結合領域をコードするヌクレオチド配列をｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡとし て同定することができたら、このヌクレオチド配列を金種々の方法を用いて目的 とするポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列に融合させる。つぎに 、ポリサツカロイド結合をコードする断片と目的とするポリペプチドをコードす るＤＮＡとを連結させる。そして、種々の方法を用いて連結されたＤＮＡに含ま れる遺伝子をベクターを介して宿主細胞に導入し、この宿主細胞の翻訳系を利用 して発現させる。宿主細胞としては、例えば’Ｅｃｏｌｉなどの原核生物や、例 えばＳａｃｃｈａｒｏ−ｒｇ；；ｇ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅがなどの真核生物を 用いることができる。

用いる制限酵素に合わせてそのアミノ酸配列を変えた複数のポリペプチド断片の アミノ酸配列を持つ融合タンパク質を発現することのできるプラスミドの調製は 実施例のところで詳細に説明する。

ロモーター、ラムダレフトおよびライトプロモーター、叩およびｌａｃプロモー ター、工プロモーターなどを含む。転写調節領域は融合タンパク質の生産に関係 した遺伝子発現を調節する配列を含むもので、この遺伝子発現は成長培地中にお ける温度条件、栄養条件あるいは遺伝子産物の存在によって制御される。例えば 、融合タンパク質の生産に関連した遺伝子の発現はラムダファージのＰＬプロモ ーター、α−オペレーターおよび温度感受性リプレッサー含む調節領域を利用す ることによって、温度条件を変えることによって制御することができる。プロモ ーターの調節はレセプターとオペレーターとの相互作用によって達成される。

発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅ）は宿主細胞において プラスミドとして維持されるための複製系のなかに含まれるかあるいは含まれな いで、宿主ゲノムに挿入（ｉｎｔｅｇｒａｔｅ）される。宿主細胞に外来ＤＮＡ を導入する方法として、例えばリン酸カルシウム共沈殿法、ウィルスとその宿主 となる細胞との接触による感染、細胞へのマイクロインジェクションによるＤＮ Ａ導入などが知られている。融合遺伝子を適当な宿主細胞に導入すると、宿主細 胞は融合遺伝子を発現するために成長する。このことは、例えば、構造遺伝子を リーディングフレーム中に挿入し、このリーディングフレームから上流にはシグ ナル配列（セクレタリリーダー）を置く必要がある。実例として挙げられるセク レタリリーダーはベニシリナーゼ、イムノグロブリン、Ｔ細胞レセプター、外被 タンパク質などのセクレタリリーダーがある。適当なリーディングフレーム内で の融合によって、キメラペプチドを培地中に分泌させることが可能となる。

目的とする遺伝子産物が細胞外に分泌されずに宿主細胞中に残されている場合は 、細胞を飢餓状態にして溶菌して細胞外に出す。そして遺伝子産物をポリサカロ イド基質に結合させることによって単離および精製を行なう。

前記遺伝子産物が活性タンパク質である場合、その活性タンパク質の活性機能が 野生型のものと同等となるようにするためには野生型と同等の立体構造をとるよ うな形で生産、分泌される必要があろう。

前記の組換えによって得られた遺伝子産物はグリコジル化または非グリコジル化 されたものである。グリコジル化の度合は、部分的には遺伝子産物であるポリペ プチドのアミノ酸配列にもとづき、さらに宿主細胞の種類によって決まる。例え ば、Ｆ、、　ｃｏｌｉ細胞においてはグリコジル化されることなく非グリコジル 化遺伝子産物が得られ、昆虫細胞においては哺乳類細胞における場合よりもグリ コジル化の度合いが少ない。又、酵母の場合はグリコシレージョン過剰となる。

さらに、融合遺伝子から融合タンパク質を生産することに加えて、融合タンパク 質を化学合成することも可能である。すなわち、基質結合領域またはその集まっ たものを精製し、当業者において既知の方法によって目的とするポリペプチドに 化学的に結合させることができる。

融合タンパク質の利用 本発明にもとづく組成物の適用範囲は広範囲にわたる。例えば、インターロイキ ン２、第ＶＨＩ因子、リグニナーゼ、ＴＴ’Ａなどの生物学的系統を精製する際 に、該試料を含む組換えタンパク質を既知のタンパク質精製方法にもとづいてセ ルロースのポリサツカロイド結合領域に結合させたのち、組換えタンパク質のセ ルロース結合領域に存在するアミノ酸配列に特異的に作用するプロテアーゼを用 いてポリサツカロイド結合領域から離すして単離および精製することが可能であ る。

本発明にもとづく組成物はセルロース性支持体上に目的とするポリペプチドを固 定する手段として用いることができる。なぜなら、基質結合領域はセルロースに 強固にかつ特異的に吸着するからで、以下のような種々の利用法がある。

臨床検査のための固体状剤、例えば、酵素、抗体フラグメント、ペプチドホルモ ンなどの調製に利用することができる。

クリアランス値を減少させるために薬物を結合させるために利用することもでき 、そのような薬物としてインターロイキン２のようなポリペプチド、またセルロ ースは溶解可能なもの（例えば、カルボキシルメチルセルロース）または固体状 支持体（例えば、微結晶セルロース（アビセル））が考えられる。

薬物を運ぶために、その薬物を単独であるいは免疫原性を高めるためにアジュバ ントとともにカルボキシメチルセルロースに結合させることもできる。

色素の結合にも利用できる。すなわち、紙とか生地（ＭＢ）などのようなセルロ ース性表面に印刷あるいは塗装することに利用できる。

加水分解や相乗効果を与えるために利用することが可能で、例えば木材の加工の ためにリグニナーゼのような酵素を結合させたり、木材バルブを漂白するために ポルフィリンを結合させたりすることができる。

農業上の利用方法としては、例えば、ＢＴＩ−キシンや他の抗微生物剤を植物表 面に結合させることができる。また、窒素固定のために、板表面に窒素固定細菌 を結合させるの利用できる。さらに、肥料の放出や、抗菌剤の放出を維持するの に利用できる。海水のような高塩濃度条件下で表面が汚れるのを防ぐことにも利 用可能で、このような場合には淡水に移すことによって融合タンパク質を取り除 くことができよう。

セルロース支持体に結合させるポリペプチドはその使用方法や目的に合わせて標 識したり、あるいは未標識のまま使用することができる。標識物質としては、例 えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発色物質、粒子、酵素基質または補酵 素、酵素阻害剤、磁性粒子などがある。また、これらの標識物質をポリペプチド に結合させる方法も色々あり、例えば他のアミノ酸を保護した状態で、末端にあ るアミノ酸にピロレシンを形成させて。このピロレシンに種々の標識物質を結合 させることができる。

以下の実施例は本発明の限界を示すものではなく、具体的な説明を行なうための ものである。

略語について ｐＮＰＣ＝　ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ、七口ビオシド、ＨＰＡ＝アズール粉 末、 ｇＣｅｎ　ＡおよびｇＣｅｘ　＝　Ｃ，魚桓から得たＣｅｎＡおよびＣｅｘのグ リコジル化したものｎｇＣｅｎ　ＡおよびｎｇＣｅｘ　＝組換え旦胚也から得た Ｃｅｎ　ＡおよびＣｅｘのグリコジル化したもの、 円℃＝逆相クロマトグラフィ、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　＝ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動、ａ　−Ｐｒｏ／Ｔｈｒ　＝合成Ｐｒｏ／Ｔｈｒボックスに対するウサギ抗血 清、　ＰＭＳＦ　＝フェニルメチルサルホニルフルオライド。

提供を受けた生物学的系統 以下のものをアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ１所在地：米 国　２０８５２メリーランド州ロツクビル、バークローノド９４１１２３０１番 地）から提供していただいた。

プラスミドルＥＣ−１含有大腸菌（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＣ６００） 　：　１９ｇ６年３月２７日供託、ＡＴＣＯ承認番号第６７１２０号、 クローン化した９竪遺伝子を挿入したプラスミドルＣＥＣ−２含有大腸菌（Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｃ６００）の継代培養株：　１９８６年４月２ ３日供託、ＡＴ’αネ認番号第６７１０１号、クローン化した９竪遺伝子を挿入 したプラスミドｐＥＣ−１（ｐＵｃ１２−１．１ｃｅｘ）含有大腸菌（Ｅｓｃｈ ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏすＭＢ３）の継代培養株：　１９８６年４月２３日供託、 ＡＴＣ（１ｍ認番号第６７１０２号。

宿主細胞として用いる大腸菌株Ｃ６００（典Ｊ、（ロ）孟、白旦、≧、体ｙａお よび吏匹）およびプラスミド円■８５７およびｐｃＰ３はエリックレモー（Ｅｒ ｉｋ　Ｒｅｍａｕ＋）がら入手した。また、これらの細菌およびプスミドについ ては「遺伝子（Ｇｅｎｅ）　Ｊ（１９８３年発行・第２２巻、第１０３−１１３ 頁）に記載されている。

Ｂ１組換えＤＮＡ技術 ＤＮＡの調製および酵素反応に関してはコールドスプリングハーバ−研究所が出 版したマ０ユアル（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ戟A　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｉａｂｏ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｍ Ｙ、）にもとづいた。

制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ■（クレノーフラグメント）、Ｔ ４ＤＮＡリガーゼおよび簡易翻訳開始部位（ＦｎＳ；　ｐｏｒｔａｂｌｅ　ｔｒ ａｎｓｌａｔｉｏｎ　１ｎｉｔｉａｔｉｏｎ　５ｉｔｅ）はファルマシア（Ｐｈ ａｒｍａｓｉａ　Ｉｎｃ、）製品を購入した。

ラムダファージの左方向プロモーター（ＰＬ）を持つプラスミドをラムダファー ジのｄ８５７遺伝子を持つ株へ導入して遺伝子発現（細菌性形質転換：　ｂａｃ ｔｅｒｉａｌｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）させる方法は以下の点を除いて前 記マニュアルに記載された方法にもとづいた。すなわち、本実施例では細菌細胞 に３４°Ｃ１２分の熱刺激（ビートシコック）を与え、ＬＢ培地で１時間インキ ュベートしたのち選択培地上に移した。

Ｃ８細菌の増殖と誘導 細菌はＬＢ培地（前記マニュアル参照のこと）に０．４％グルコース、５０μｍ ／ｍｌカナマイシンおよび７５　ｐ　ｍ／ｍｌアンピシリンを加えてオートクレ ーブした後、該培地において細菌を増殖させる。この増殖は３０’　Ｃで行ない 、吸光度が６００ｎｍにおいて０．３の値になるまで増殖させる。増殖後、培地 上の増殖した菌株を部分して一方は３０°Ｃ（非誘導）で増殖を行ない、他方は ４１°Ｃ（誘導）で増殖させた。

Ｄ、　ｃｅｘ遺伝子の単離 Ｃ，魚眞から竺遺伝子を単離する方法は米国特許出願第８５９，０４２号（１９ ８６年５月２日出願）にもとづいて行なった。詳細は該特許出願を参照するとよ い。

Ｅ、プラスミドの構成 １・区亙ｎ士柘竺 、Ｃ，圏由来ＤＮＡ断片（６，６ｋｂｐ、の長さ）上にクローン化された竺遺伝 子を、旦ａｍＨＩによって切り取り、かつプラスミドｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１ 部位に挿入してｐＥｃ−１プラスミドを形成する。

竺遺伝子の位置はｐＥＣ−１，１プラスミドとなる２、５６ｋｂｐからなるＢａ ｍ　ＨＴ　−Ｓａｌ　Ｔ　ＤＮＡ断片に対する欠失地図作成によって決定するこ とができる（第１図）。

ｐＵｃ１２−１．１竺プラスミドは第１図に示すように、ｐＥＣ−１，１から単 離した２、５６ｋｂｐ断片をｐＵｃ１２プラスミド上のＥ−ｃｏｌｉラクトース オペロン（ＩａｃＺｐｌｏ）のプロモーター・オペレーター領域から反対側下流 に位置するところに挿入して得られた（Ｇｅｎｅ　（１９８２）　１９：２５９ −２６８）　、　ｐＥＣ−］プラスミドについてはホＲＢＳ、転写開始部位およ びβＧａｌ−Ｅｘｇ発現プラスミドｐＵｃ１２−１．１ｃｅｘ（７）融合結合部 アミノ末端のＤＮＡ塩基配列は第２図に示した。

２・匹Ｎ月誌工η刀 ｐＵｃ１２−１．１（７３７）を構成するために、５゛末端側塩基配列の未翻訳 部分、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）および竺遺伝子の翻訳開始コドンを除去し 、プロモーター・オペレーター領域およびＴＦ−ｃｏｌｉラクトースオペロンの アミノ酸末端（βＧａ１）を挿入し、つづいてＦｒ１ＳのＲＢＳ−ＡＴＧと置き 換えた。

第一段階は、プラスミドｐＵｃ１２−１．１ｃｅｘをｑＩおよびＢａｍ　ＨＩに よって切断して生じた付着端（ｓｔａｇｅｒｅｄ　ｅｎｄｓ）をＤＮＡポリメラ ーゼＩ（クレノー酵素）によって修復した。そしてプラスミドＤＮＡを希釈条件 下で連結してｐＬＩｃ１２−１．１（７３力を得た。

この操作によって、 （ｉ）　Ｃｅｘリーダー配列のコドン２とｐＵｃ＋２によってコードされたβＧ ａＪａフラグメントのコドン】１との間におけるフレーム内融合（ｉｎ−ｆｒａ ｍｅ　ｆｕｓｉｏｎ）　；（ｉｉ）ｑｌ切断部位の再生；および （ｉｉｊ）　Ｂａｍ　Ｈ１切断部位と竺遺伝子翻訳開始コドンとの置換が行なわ れた。ｐＵＣ１２−１，１（７３７）のβＧｉｐ−Ｃｅｘ融合領域の塩基配列お よびその配列から考えられるアミノ酸配列を第２図に示した。

３・匹１ｃ１２ユユヱ■ユ ｐＵｃ１２−１．１（ＰＴＩＳ）を得るためにｐＵｃ１２−１．１（７３７）を 奥をＲ１および御二Ｈ１によって切断し、ＥｃｏＲＩ付着端およびＢａｍ　ＨＩ 付着端を有する１７ｂｐのＦＴＩＳを挿入した。これによって、ＰＩＴＳのイニ シエタ−ＡＴＯに対するｃｅｘリーダー配列第２コドンのフレーム内融合が行な われた（第２図参照）。

菖】 ん偵ＴＫｔＧＡＡＡＡＡＴｒＡＧ ＡＱフコ１フ ＲＢＳ，転写開始部位、βＧａｌ−Ｅｘｇ発現プラスミドの融合結合部アミン末 端のＤＮＡ塩基配列。プラスミドｐＵｃ１２−１．１ｃｅｘは未融合の竺遺伝子 産物をコードする。プラスミドｐＵｃ１２−１．１ｃｅｘにおける天然竺遺伝子 産物のコドンはリーダー配列の開始部位Ａπ遷−４１とし、成熟したＥｘｇの第 １コドンを＋１として番号が付けられた。βＣａｌ−Ｅｘｇ融合遺伝子における 第１　ｃｅｘコドンはもとの位置番号である。想定されるアミノ酸配列はＤＮＡ 塩基配列の上に一文字で表した。βＧａｌ由来のヌクレオチドおよびアミノ酸に は下線を引いた。まれに現われるアミノ酸はＩａｃ遺伝子由来ではなく、ｐＵｃ １２の結合領域から由来するものである。

ａ”ｘ遺伝子のアミン末端におけるＳｑ　Ｉ，　Ａｖａ　ＩＩおよび’ＥｃｏＲ ＩＩの制限部位をｐＵｃ１２におけるβｃａｌの７ミノ末端に対するモ遺伝子の 融合に用いた。

Ｅｘｇ活性は細胞タンパク質全体の重さくｍｇ）に対する単位時間（分）当たり のｐ．ニトロフェニルの放出量（ｎｇ）によって表した。

て行い、必要に応じて１．５％（Ｗ／Ｖ）寒天によって培養液を固化させた。さ らにこの培養液にアンピシリンを終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように添加し た。ＣｅｘＡ活性は１、０％（ＷＮ）寒天および１．０％（Ｗ／Ｖ）カルボキシ メチルセルロース（ＣＭＣ）含有ＬＢ培地上のコロニー増殖後、コンゴ赤によっ て染色することによって検知した。液体培養は容量が５０または２５０ｍ１のエ ーレンマイヤーフラスコに１０または５０ｍ１の培養液を加えて、振どう式ウォ ーターバス（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　Ｇｙｒｏｔｏｒｙ　ｗａｔｅｒ　ｂ ａ山）により２００ｒｐｍで振とうさせておこなった。

ブロマイド勾配下における遠心によって収集した。制限エンドヌクレアーゼによ る消化、断片の連結（リゲーション）およびＥ　ｃｏｌｉの形質転換（ｔｒａｎ ｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は記載通りに行なった。

Ｃ０他の方法 フレンチプレスによって細胞を破壊することによって抽出物を調製した。細胞の 表層を被う内膜と外膜との間（ペリプラズム）に存在する酵素を浸透圧ショック によって放出させた。培養液上清は遠心によって得た。すべての酵素は３０’　 Ｃでアッセイした。Ｅ　ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩ／ｐＵｃ１８−１．６　ＣｅｎＡ からのエンドグルカナーゼは陰イオン交換クロマトグラフィー（モノＱレシン（ ＭｏｎｏＱ　ｒｅｓｉｎ）上で、２０ｍＭピペラジン中に０　−　０．１　Ｍ　 ＮａＯの勾配、ｐＨ　９．８の条件下で行なった）によって分離した後、免疫吸 着クロマトグラフィーによって精製した。アミノ酸配列は気相アミノ酸配列分析 装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｅｍｓ社製、４７０Ａ　ｇａｓｐｈａｓｅ 　５ｅｑｕｅｎａｔｏｒ）によるエドマン分解にもとづく方法によって自動測定 した。

１１日出願）にもとづいた。

Ｅ、プラスミドの構成 第３図はｐＵｃＥｃ２の構成の概略説明図である。ｐｃＥＣ２にある６−Ｏｋｂ からなるｇ、工ｍ１ＤＮＡ挿入断片から１．６ｋｂからなるＳｓｔ　Ｉ断片を精 製し、ｐＵｃ］８のＳｓｔ　１部位に挿入してｐＵＣＥＣ２を形成した。　第４ 図はその概略説明図で、　（Ａ）はｐｃＵｃ２を示し、（Ｂ）はｐＵｃＥｃ２の １ａｃＺとＣｅｎＡとの融合部分の塩基配列およびそれにもとづくアミノ酸配列 を表したものである。第４図（Ａ）において、細線の部分はｐＢＲ３２２由来Ｄ ＮＡを示し、箱状部分は９．ニ由来ＤＮＡを示す。斜線の部分はＣｅｎＡをコー ドする配列を有する部分で、横方向に延びた矢印は転写方向を示す。矢印Ｓがｃ ｅｘｓＢＤ遺伝子断片とアゲロバクチリアの　−ガラクトシダーゼ遺伝子（ａｂ ）とを含む発現カセットの構成ならびに融合タンパク質の特性Ａ１発現カセット の構成 第５図はｐＥｏｌの構成を示す概略説明図である。プラスミドｐＵｃ］２−１． １ｃｅｘ（ＰＴＩＳ）をＩＱ７１ｂｐ）を単離した。このＤＮＡ断片は１５１５ ｂｐにある挿入断片のＰｓｔ　Ｉ部位からベクターのＰｓｔ　Ｉ部位の部分に一 致する。そこで、このＰｓｔ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片をジ恵Ｉによる完全消化に よって３つの断片（５５ｂｐ、　７２ｂｐおよび９４４ｂｐ）にした。このうち もっとも大きいシ也Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片を単離した。

っぎに、大きい鮎黒遺伝子断片（Ｐｓｔ　Ｉ−５１±■）および小さいｃｚｘｓ ＢＤ断片（油■−Ｐｓｔ　Ｉ）　（第５図参照）を同一フレーム上で連結して、 目的とするプラスミド構成（約４９５４ｂｐ）、すなわちｐＥｏｌにした。ｐＨ ０１プラスミドは２２５４ｂｐからなるベクターで、このベクターに挿入されて いるμ５ＢＤ−４挿入断片は２２５４ｂｐである。ｐＥｐｒｏ　１にコードされ た融合タンパク質はアビセルに対する結合能および元のＡｂｇと比較した触媒活 性によって特徴づけられる。触媒活性による融合タンパク質の特性分析はカイネ ティックス（例えばに、、値や■−値）を調べることや融合タンパク質の基質特 異性を調べることによって行なった。酵素活性は、時間、温度、ｐＨ、イオン強 度および緩衝液に関する標準的な測定条件下において一定濃度のセロビオースか ら生産できるグルコース量によって決定した。このグルコース濃度はグルコース アナライザー（ペックマン社製）による測定結果をもとにした。

この装置による分析は、グルコースからグルコン酸に変換される際の酸素消費量 を酸素電極によって測定することにもとづいて行なわれるもので、この酸素消費 量は既知の濃度のグルコースを含む標準液の酸素消費量と正比例の関係にあるの で、この関係を利用してグルコース濃度を決定することができる。

また、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって融合タンパク質の分子量を調べた。すなわち、 精製された融合タンパク質をＣ，止桓から得たプロテアーゼによって２なレルそ れ以上のタンパク質断片にしたあと５ＤＳ−ＰＡＧＥに流し、ＭＵＧ　（４−ｍ ｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−８−Ｄ−ｇＩｕｃｏｓｉｄｅ）あるいは Ｘ−ｇｌｕ　（５−ｂｒｏｍｏ−４ｃｈ１ｏｒｏ−３−４ｎｄｏｌｙｌ−λ−Ｄ −ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉр■jのよう な蛍光グルコシド誘導体を用いてザイモグラム（量比の検討）を行なうことによ って調べた。なお、これによって他の小さな活性酵素断片の形成およびにその分 子量を決定することも可能である。

セルラーゼのセルロースに対する吸着は不溶性セルローズ基質の加水分解に必要 とされる第１段階と考えられる。酵素の種類、濃度、組み合わせおよびその比、 温度、ｐＨ，緩衝液のイオン強度などの因子がどのようにセルラーゼの吸着力イ ネティックスおよびセルロースの分解速度に対して影響を及ぼすかについて知る ために、いくつかの微生物のセルラーゼについて、その酵素のセルロースへの結 合が調べられてきた（Ｇｈｏｓｅ　＆　Ｂ１５ａｒｉｚ　１９７９；　Ｍｏ１ｏ ｎｅｙ　＆　Ｃｏｕｇｈｌａｎ、　１９１１１３；　Ｏｏ唐■奄高＝@ｇ４．］ ９８３； Ｒｙｕ　ａ！、、＋９８４ＨＡｎ−ｅ　ａ　ａ］、、　＋９８７；　Ｗｉｌｌｉ ａｍｓｏｎ　＆　Ｓｔｕａｅｒｋｒｇｅ、　］９１？７）。

セルロース基質に対する融合酵素の結合能は吸着平衡定数（Ｋａ）をめることに よって調べた。すでにセルロースへのセルラーゼの吸着はラングミュアの吸着等 温式（Ｌａｎｇｕｍｕｉｒ、　１９１６）に従うことが知られている。

Ｃｂ＝　（Ｃｍａｘ−Ｋａ−Ｃｆ）　／　（１＋Ｋａ−Ｃｆ）　（１）ｃｂは反 応が平衡状態に達した際のセルロース単位重量当たりの結合酵素量を示し、Ｃｆ は結合していない酵素量、Ｃｍａｘは酵素の最大吸着量、そしてＫａは吸着平衡 定数を示す。　等式（１）からより利用価値の高い等式（２）が導きだせる。

この等式（２）はプロットしやすいことから等式（１）に比べてｈやＣｍａｘを 容易にめることができる。

（α／Ｃｂ）　＝　（Ｃｆ／Ｃｍａｘ）　＋　（１／（Ｋａ−Ｃｍａｘ））　（ ２）等式（２）は等式ｙ＝ｍｘ＋ｂによって与えられる直線を得るためにＣｆに 対してＣｆ／Ｃｂをプロットするのに用いられる。傾き（ｍ）は１／（Ｋａ−Ｃ ｍａｘ）によって与えられる。Ｋａおよび０頭としてめられた値は重要なもので 、それらの値によって基質に対する酵素の吸着親和性や吸着剤単位表面当たりの 吸着部位数がそれぞれわかる。特にＫａ値が必要で、それによってセルラーゼに 対する融合酵素の吸着に関する化学的および物理的パラメーターを比較検討する ことができる。

アビセルに対する酵素の結合能は、実験系に加えられた酵素の活性濃度に対する 結合にあずかった酵素、上清中に含まれる結合にあずからなった酵素および蒸留 水中に洗い流された結合酵素のそれぞれの百分率によって表した。種々の酵素濃 度で行なわれるセルロース基質に対する酵素の吸着プロセスにおけるカイネテイ ックスに関する調査は異なるｐＨ，温度および緩衝液のイオン強度条件下におけ るに値の決定を含むものである。固定化融合タンパク質の安定性（操作時および 貯蔵時）はバッチまたはカラムに存在するアビセルに対する酵素の結合と時間経 過にともなって起こる酵素反応とによって決定した。単位時間当たりの回収グル コース量、融合タンパク質の活性濃度および洗い流されたタンパク質量を固定化 方法の安定性を示す指標とした。

基質との結合に関与する特異的ＳＢＤペプチドを同定するのに、いくつかの遺伝 学的アプローチを試みることは可能である。その一つの方法として、遺伝子のあ る部分を制限酵素によって取り除き、残された部分を繋ぎ合わせて特定の遺伝子 断片に関連した欠陥を持つタンパク質をコードする変異遺伝子を得る方法がある 。他の方法としては、エクソヌクレアーゼ（例えば亜３１）によってＤＮＡの５ ゛および３°の両末端外側からあるいは遺伝子の制限酵素によって切断されて生 じたギャップ内側から計画的にヌクレオチドを取り除く方法がある。これらの遺 伝子欠失方法は、野生型タンパク質よりも短く、かつ野生型が持つ本来の機能と は異なる機能を有すると思われる欠損タンパク質をコードする変異遺伝子を作り 出すことが最終目的である。欠損タンパク質のｅ１能は、特定のペプチド断片そ れ自体の除去あるいはあるアミノ酸の欠失の結果によって生じた修飾タンパク質 の形態変化にもとづくものと考えられる。

Ａ、　ＸｍａＴＩＩ制限酵素を用いた欠失第６図に示したｐＵｃ１２−１．１ｃ ｅｘ（Ｐｕｓ）プラスミドは関連した制限部位および太き５８０ヌクレオチドと の間にある遺伝子部分を除去すると、得られた欠損タンパク質はアビセルに結合 できなかった。この結果はＳａｌ１部位（＋９６２ヌクレオチド）から終止コド ン（２１８９ヌクレオチドの所にあるＴＧＡ）に到るまでの配列によってコード さレルペプチドが酵素の結合に重要な領域であることを証明するものではない。

欠失開始の部分よりも直前にある領域がセルラーゼの結合に重要な部分であな要 因はベクターの欠失Ｃｅｘとβ、ガラクトシダーゼとによって形成される融合タ ンパク質である。

アミノ酸の平均分子量を１１０と仮定すると、Ｓａｌ　Ｉによる欠失突然変異体 において欠失されたペプチドは約８ｋＤ（キロダルトン）の大きさとなる。この 予想される大きさは、タンパク質加水分解的に切断したエクソグルカナーゼから なる試料によってＦＰＬＣ（ファルマシア社製）により精製され、かつアビセル に強固に結合することができるペプチドの大きさに大変よく一致していた。この ことは、特異的ＳＢＤペプチドが明らかにこの８ｋＤに含まれることを強く示唆 している。プロテナーゼ切断部位かどうかを正確に米櫃めるためにＦＰＬＣによ って精製された約８ｋＤからなるペプチドのＮ−末端の配列を調べた。その結果 、アミノ酸切断部位は汀ボックスの端（最後のスレオニンとセリンとの間）から 始まることがわかった。このアミノ酸配列をもとにして、計算によってめらたＳ ＢＤペプチドの大きさは１１．３ｋＤであった。ＦＰＬＣＪ製ＳＢＤペプチドの 大きさとアミノ酸切断部位から予想される計算上の大きさとの不一致はポリアク リルアミドゲルにおいてペプチドの移動が正常に行なわれないことが原因として 考えられる。

さらに、基質結合部に含まれるアミノ酸配列を調べるために、ＸｍａｌＨにおっ て部分消化下（第６図）。大きさが５１０７ｂｐに一致する線状の断片を単離し 、その断片の両端を連結してＥ　ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩに導入した。なお、この 断片には１８７３ヌクレオチドと２０７４ヌクレオチドとの間の遺伝子部分が欠 失しており、その結果、欠損タンパク質が生産された。そこで、この欠損タンパ ク質のアビセルに対する結合親和性について調べ、かつ野生型の竺タンパク質と 比較した。

なしに、はぼ同時に分解していく高特異性のヌクレアーゼである。この酵素は０ イオンの存在を必要とするので、この酵素による欠失の程度を反応溶液に二価イ オンのキレート剤であり　ＥＧＴＡを加えることによってコントロールすること ができ、またモニターすることも可能である（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａ＋、 、　１９８２）。

μ−遺伝子を亜３１による消化処理にかけるまえに、以下の領域を含むループア ウト断片を合成した。すなわち、その領域とは（１）欠失が開始される制限部位 （ベクターのみにあり、かつ９．印可遺伝子挿入断片の数ヌクレオチドはど下流 にあるＸｂａｌ認識切断部位）、（２）ベクターおよび挿入断片のどちらにも存 在しない第２制限部位（舛巴■）、および （３）すべての３つのリーディングフレームにある終止コドンを含むヌクレオチ ド配列である。

まずはじめに、ループアウト断片は挿入断片を含むＭ１３ｓｓＤＮＡテンプレー トとアニーリングさせた。この断片はｄ（Ａ、　Ｔ、　ａ、　ｃ）三リン酸、ク レノーポリメラーゼ、リガーゼを加えて延長した。その後、この断片をＥ、ｃｏ ｌｉ　ＪＭＩＯＩに導入し、プラークハイブリダイゼーションによって標識ルー プアウトプライマーと雑種形成するものをスクリーニングした。ＤＮＡの複製型 をＥ、　ｃｏｌｉ形質転換株から単離した。まず、二重鎖ＤＮＡをＸｂａ　Ｉで 切断して線状のＤＮＡにし、それをＮｅｏ　Ｉで切断した。一端が詑巴１部位に よって切断されたＣ、　丑虱ＤＮＡ含有スタッファーＤＮＡ断片を線状のＤＮＡ に連結してＮｃｏ１部位を再生させた。このように構成されたものを両端（スタ ッファ−ＤＮＡ内および竺遺伝子挿入断片内で）からほぼ同じ速度で消化するこ とが可能な匡３１によって消化した。この消化によって反応試料の部分を取り除 き、ＥＧＴＡを含むＤＮＡ緩衝液に入れてＢａｌ　３１による消化を停止させた 。スタツツファーＤＮＡは不活性化されたＢａ１３１消化ＤＮＡ混合物にＮｃｏ ｌを加えることによって取り除いた。このＤＮＡはクレノーポリメラーゼ処理し 、アガロースゲルによって分画し、さらにｐＵｃ１２に連結して二重鎖閉環状Ｄ ＮＡとした。この二重鎖閉環状ＤＮＡを含む溶液を数μｍはど取って、挿入断片 の長さにおけるわずがな違い端に欠失のある突然変異体ファミリーをスクリーニ ングするために、８ｋｄ　ＳＢＤに対する抗体を用いて欠失の認められるクロー ンを同定した。

異なる欠失突然変異体によって産生される欠損タンパク質の前記アビセルへの結 合能および触媒活性について検討した。

実施例５ アビセルに固定された　、グルコシダーゼ融合タンパク質を用いたセロビオース からのグルコースの生産 第７図はβ−グルコシダーゼ融合タンパク質を利用する概略説明図をである。

ここでは得られたセロビオース混合物をエンドグルヵナーゼーエクングルヵナー ゼ混合溶液とともにβ−グルコシダーゼを固定したアビセルカラムに連続して流 す方法を用いた。

分解されるべきセルロース原料を含む溶液にエンドグルカナーゼとエクソグルカ ナーゼとを適当な比率で発酵槽に加えた。

つぎに一定時間酵素反応させて、溶液中にセルビオースを産生かせた。その後、 この溶液を７ビセルカラムに流し、エンドグルカナーゼとエンドグルカナーゼと を吸着させ、かつ濃縮した。セロビオースを含む流出液をβ−グルコシダーゼ融 合タンパク質を固定した第２のカラムに流し、該融合タンパク質によってセルビ オースをグルコース単位にまで加水分解した。エンドグルカナーゼとエクソグル カナーゼとを最初のカラムにおいて蒸留水を流すことによって流出させて再生し た。両方のカラムは精製および酵素による変換に数回再利用することが可能であ る。

実施例６ （２）仏−アルカリホスフ７ターゼ融合タンパク質発現カセットの調製Ｔｎ　白 Ａは旦５とのシグナル配列欠損アルカリホスファターゼ遺伝子（’　可巴Ａ）を 含むトランスポゾンＴｎ５の誘導体である。リーディングフレーム内にある発現 遺伝子への転移による挿入はｐｈｏＡ融合タ融合タンパクリだすことができる。

もし、標的遺伝子がタンパク質エクスポートシグナルを含む場合、標的遺伝子は 融合タンパク質の分泌に関与することができる。この融合タンパク質の分泌はア ルカリホスファターゼによって検知することがき、この酵素の活性は、酵素がペ リプラズムに位置するときだけ認められた。ＴｎＰ！！！２Ａはマルチプルクロ ーニング部位を有するプラスミドにおいてＣ−、ｆｉｍｉ　ｃｅｎＡと融合した 白人遺伝子を作るのに用いられる。目的とするタンパク質をコードする遺伝子は マルチプルクローニング部位にクローンすること力呵能で、かつ融合タンパク質 として発現させることができた。この遺伝子産物はアビセルのようなセルロース カラムへの結合によって精製することができ、Ｃ，印可プロテアーゼによってｃ ｅｎＡ融合パートナ−を切断することができた。

Ａ、遺伝子融合の調製とその解析 Ｔｎｐ：Ａの転位よる突然変異誘発はｃｅｎＡとの遺伝子融合を行なう際に利用 される。ｃｅｎＡを含むプラスミドはｐＵｃＥｃ２、ｐＴＺ１８Ｕにクローン化 された１、６ｋｂ　５ｓｔＩｃｅｎＡ断片、ｐＵｃ］ｓの多８！能性誘導体であ る（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅ＋　ａｔ、、　Ｇｅｎｅ　（１９８５） 　３３：　】０３−１１９）。ｐＴＺ１８ＵはＵ、　Ｓ、バイオケミカルズ社が ら入手可能である。

ｓ　Ｒｅｓ、　（１９８２）　ＩＯ＋６４８７−６５００　およびＺｏｌｌｅｒ 　ａ　ａｌ、、　ＭｅＭｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏ！、（１９ｇR）　１００：４６ ８−５ ００）はｃｅｎＡ遺伝子のカルボキシル末端部分を欠失させることおよびｐＴ２ １８０のＰｒｏ−Ｔｈｒボックスとマルチプルクローニング部位とを並べて置く ことに利用される。

スクリーニング方法として、プローブとして変異オリゴヌクレオチドを用いたド ツトプロットハイブリダイゼーションや制限酵素による分析がある。鎖伸張停止 方法によるＤＮＡの塩基配列決定を、欠失領域の配列を確かめるために行なった （Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　、前掲）。

転位はトランスポゾン、λＴｎ白Ａ−１、を含む欠損ラムダファージをＥ　ｃｏ ｌｉ　ＣＣ１１８（ｐＵＣＥＣ２）に感染させて行なった（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ ｇ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ、　（１９８７）　１９５：２ｇX− ２９７）。Ｅ　ｃｏｌｉ　ＣＣ１１ｇは白人遺伝子に欠失部分が存在する。ｃｅ ｎＡと同一フレームでその分泌が促進される。カナマイシン（トランスポゾン由 来）およびアンピシリン抵抗性によって選択されたコロニーをインジコ系基質で ある５−ブロモ４．クロロ−３−ヨードイルホスフェ−）　（ＸＰ）に対するア ルカリホスファターゼ活性によってスクリーニングした。ｐ：Ａ”コロニーから 得たプラスミドＤＮＡは再びＥ−ｃｏｌｉに導入され、上記のように選択および スクリーニングされる。ｐ：Ａ＋コロニーはカルボキシメチルセルロース（ＣＭ Ｃ）プレート上におけるエンドグルカナーゼ活性をコンゴレッドによる染色によ り調べることによってスクリーニングする（Ｇｉｌｋｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂ ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１９８４）　２：２５９−２６３）　。表現型 としてｐ：Ａ”、９四゛、そしてア■ ピシリンおよびカナマイシン耐性であることが要求される。

プラスミドＤＮＡをｐ：Ａ’、且狙゛コロニーから単離し、制限酵素によって消 化してからアガロースゲル電気泳動にかけた。５５個のコロニーをスクリーニン グした結果、３４個のコロニーにおいて正しい方向にあるｃｅｎＡに挿入された Ｔｎ可巴Ａ挿入。それらのクローンのうちのいくつがはずれてた位置に挿入が起 こっており、その可能性は融合のタンパク質産物をみれば明らかである。Ｃｅｎ Ａ−ＰｈｏＡ融合タ融合タンパ上質ロースに対する結合を調べてみると、融合タ ンパク質は５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）および０．５Ｍ　ＮａＣｌによ る洗浄にもかかわらず、濾紙に結合していた。

引き続いて行なわれる実験のために、セルロースに結合した融合タンパク質を選 択した。Ｔｎ可巴Ａの正確な挿入位置を知るために鎖伸張停止方法によるＤＮＡ 塩基配列の決定を行なった。アビセルへの結合を促進させ、かつアビセルからの 流出を起こさせる緩衝液の状態は実施例３において述べたのでそれを参照された い、このプロテアーゼによる分解によって生じた断片を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび Ｐ！！！２Ａザイモグラムまたはウェスタンイムノプロット、またはゲル濾過ク ロマトグラフィーによって分析した。基質結合断片をＳＤＳに溶解し、プローブ としてＰｒｏ−Ｔｈｒボックスに対する抗血清を用いて５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび ウェスタンイムノプロットによって分析した（Ｌａｎｇｓｆｏｒｄ　ａ　ａｌ、 、　ＦＥＢＳ　１ｅｔｔｅｒｓ　（１９８７）　２２５：１６３−１６７）。

Ｂ、融合タンパク質の精製 融合タンパク質を含む蚤５曵抽出物をアビセルマトリックスへの融合タンパク質 の結合を促進させる！衝液とともにアビイセルカラムにのせる。非特異的な結合 タンパク質を緩衝液で洗い流したのち、Ｃ，ｆｉｍ＋プロテアーゼをカラムにの せ、緩衝液で洗った。集められた分画についてアルカリホスホターゼ活性を調べ 、酵素活性がピークに達した分画をイオン交換またはゲル濾過クロマトグラフィ によって精製した。プロテアーゼ濃度および流速のような精製条件はアルカリホ スホターゼ活性が最も良く再現されるように色々と変えた。

実施例７ 薬物誘導に対するＣｅｌｌｕｌｏｍｏａｓ　ｆｉｍｉセルロース結合ドメインの 利用Ａ、溶解性／持続性　インターロイキン２Ｃ，’　生垣のセルロース結合領 域に連結したインターロイキン２　（ＩＬ−２）を含む融合タンパク質は、少な くともｃｅｘＡまたはＣｅＸセルロース結合領域をコードするＤＮλ頃基配列と 、１．２またはその機能性部分をコードする遺伝子とからなる融合遺伝子の調製 とその融合遺伝子をＥ　ｃｏｎのような発現宿主へ導入することとによって上記 方法により調製した。融合タンパク質はセルロース（アビセルまたはコツトン） によるアフィニティクロマトグラフィによって精製した。蒸留水を流すことによ って融合タンパク質を流出させた後、この融合タンパク質を可溶性（カルボキシ ルメチル）または不溶性（アビセル）セルロースに結合させた。それらの結合物 をマウス（ｉ、ｐ、）に注射し、腹腔内液を採取してＩＬ−２のクリアランス力 イネテイックスを決定した。その結果、結合物は循環によってＬ−２のクリアラ ンス速度を減少させることがわかった。

Ｂ、免疫原性／アジュバント活性 前記のようにして調製され、がっＣ，止可セルラーゼのセルローズ結合領域に結 合しているＬ−２およびアルカリホスファターゼを含む２つの融合タンパク質は 、それぞれの融合タンパク質のセルロース結合領域によって同じセルローズ結合 領域に結合にした。ここでは、可溶性（例えば、カルボキシルメチル）および不 溶性（アビセル）セルロースマトリックスを用いて、混合マトリックス（Ｌ−２ −ＣＢＲ＋セルロース＋ＣＢＲ−アルカリホスファターゼ）を作製し、それをマ ウスに注射した。１〜２週間後に免疫応答（’１ｔ（ＩＩ胞増殖およびアルカリ ホスファターゼ抗体濃度）について調べた。そして、同量のアルカリホスファタ ーゼ−ＣＢＲを注射した際の同免疫応答と比較した。さらに、ＨｒＶ　ｇｐ　１ ２０−ＣＢＲおよびさε空凹ニーＣＢＲをアルカリホスファターゼと誼き換えて 同様の系で実験した。その結果、抗原に非常に近接したＬ−２の組み合わせは抗 原に対する免疫応答増幅に利用できることかわかった。

以上説明したように、本発明の組成物は目的とするペプチドに結合するポリサカ ロイドのポリサカロイド結合ドメインを含むものである。また、本発明の組成物 は可溶性または不溶性のポリサツカロイドマトリックスに対する種々のリガンド として利用できる。このようなマトリックスへの結合は薬輸送システム、発酵槽 などに利用することができ、またリガンドの精製または単離手段としても利用で き、リガンドとマトリックスとの結合は特異的なプロテアーゼ処理によって切断 することができるのでリガンドを回収することができる。

この明細書に示したすべての出版物および特許出願は本発明の内容に対する従来 技術のレベルを示したものである。すべての出版物および特許出願はあたかも個 々の出版物または特許出願が特別に、かつ個々に引用されているかのようにして 本願明細書に引用された。以上、添付した請求の範囲に開示された本発明の目的 から外れることな〈実施態様にもとづいて本発明の新規性および進歩性を開示し た。

−図面の浄書（内容：二″！：更なし）ＦＩＧ、　４Ａ ＦＩＧ、　４Ｂ ＴＭＩＴＮＳＳＳＬＭＳ ↓ ＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＴＣＣ ，、。

ル巳ゼＩ仁−一一 手続補正書坊式） 平成２年１２月１９日 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＧＢ　８９１００７１８ ２、発明の名称 セルロース結合融合タン７くり質 ３、補正をする者 国際調査報告 一１轡峠１１ＭＩムーーー・１−ＩＩ・　ＰＣＴ／ＧＢ　８９１００７１８１１ 審＋ｅｎｍｍシー１１−噸＾帥−暴０−１・ＰＣＴ／ＧＢ８９１００７１８国際 調査報告

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．融合タンパク質を含むポリサッカロイドマトリックスを得るための方法にお いて、該方法はポリペプチドとポリサッカロイダーゼとの基質結合領域を少なく とも含む融合タンパク質の調製と、前記基質結合領域と前記ポリサッカロイドマ トリックスとが結合可能な条件下における前記融合タンパク質と前記ポリサカラ イダーゼの基質からなるポリサカロイドマトリックスとの接触とからなることを 特徴とするセルロース結合融合タンパク質の合成方法およびその方法によって合 成されるセルロース結合融合タンパク質。
2. ２．請求の範囲第１項にもとづく方法において、前記調製は５′末端から−３′ 末端方向の翻訳、翻訳開始調節部位、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡ塩 基配列および翻訳と転写の終止部位からなるＤＮＡ構成を含む宿主細胞の増殖を 含み、かつ該宿主細胞において前記融合タンパク質の発現を前記翻訳開始部位お よび翻訳と転写の終止部位によって調節することと、前記融合タンパク質の単離 とからなることを特徴とするセルロース結合融合タンパク質の合成方法およびそ の方法によって合成されるセルロース結合融合タンパク質。
3. ３．請求の範囲第２項にもとづく方法において、前記融合タンパク質の単離は前 記融合タンパク質と前記ポリサッカロイダーゼの基質からなるマトリックスとを 接触させることを含むことを特徴とするセルロース結合融合タンパク質の合成方 法およびその方法によって合成されるセルロース結合融合タンパク質。
4. ４．請求の範囲第１項にもとづく方法において、前記ポリサカロイダーゼはセル ロースであることを特徴とするセルロース結合融合タンパク質の合成方法および その方法によって合成されるセルロース結合融合タンパク質。
5. ５．請求の範囲第４項にもとづく方法において、前記セルロースはＣｅｌｌｕｌ ｏｍｏｎａｓｆｉｍｉから得ることが可能であることを特徴とするセルロース結 合融合タンパク質の合成方法およびその方法によって合成されるセルロース結合 融合タンパク質。
6. ６．請求の範囲第４項にもとづく方法において、前記セルロースはエンドグルカ ナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）またはセロビオハイドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３ ．２．１．９１）であることを特徴とするセルロース結合融合タンパク質の合成 方法およびその方法によって合成されるセルロース結合融合タンパク質。
7. ７．請求の範囲第７項にもとづく方法において、前記ポリサッカロイドマトリッ クスは不溶性のセルロースであることを特徴とするセルロース結合融合タンパク 質の合成方法およびその方法によって合成されるセルロース結合融合タンパク質
8. ８．請求の範囲第７項にもとづく方法において、前記不溶性セルロースは微結晶 性セルロース、リグノセルロース性物質または綿であることを特徴とするセルロ ース結合融合タンパク質の合成方法およびその方法によって合成されるセルロー ス結合融合タンパク質。
9. ９．請求の範囲第８項にもとづく方法において、前記リグノセルロース性物質は 木材、木材バルブまたは植物組織からなることを特徴とするセルロース結合融合 タンパク質の合成方法およびその方法によって合成されるセルロース結合融合タ ンパク質。
10. １０．請求の範囲第４項にもとづく方法において、前記ポリサッカロイドマトリ ックスは可溶性のポリサッヵロイドであることを特徴とするセルロース結合融合 タンパク質の合成方法およびその方法によって合成されるセルロース結合融合タ ンパク質。
11. １１．請求の範囲第１０項にもとづく方法において、前記可溶性ポリサッカロイ ドはカルボキシメチルセルロースであることを特徴とするセルロース結合融合タ ンパク質の合成方法およびその方法によって合成されるセルロース結合融合タン パク質。
12. １２．ポリペプチドの固定にアフィニティマトリックスを用いる方法において、 前記ポリペプチドとポリサッカロイダーゼの少なくとも基質結合領域とからなる 融合タンパク質の調製と、前記融合タンパク質と前記ポリサカロイダーゼの基質 からなるアフィニティマトリックスとの接触とからなることを特徴とするセルロ ース結合融合タンパク質の合成方法およびその方法によって合成されるセルロー ス結合融合タンパク質。
13. １３．請求の範囲第１２項にもとづく方法において、前記ポロサカロイダーゼは セルラーゼからなることを特徴とするセルロース結合融合タンパク質の合成方法 およびその方法によって合成されるセルロース結合融合タンパク質。
14. １４．請求の範囲第１２項にもとづく方法において、前記ポロペプチドはβ−グ ルコシダーゼまたはインターロイキン−２であることを特徴とするセルロース結 合融合タンパク質の合成方法およびその方法によって合成されるセルロース結合 融合タンパク質。
15. １５．ポリペプチドの精製にアフィニティマトリックスを用いる方法において、 該方法はポリペプチドとポリサッカロイダーゼの少なくとも基質結合領域とから なる融合タンパク質の調製と、前記基質結合領域と前記アフィニティマトリック スとが結合可能な条件下における前記融合タンパク質と前記ポリサカロイダーゼ の基質からなるアフィニティマトリックスとの接触とからなることを特徴とする セルロース結合融合タンパク質の合成方法およびその方法によって合成されるセ ルロース結合融合タンパク質。
16. １６．請求の範囲第１５項にもとづく方法において、前記ポリサカロイダーゼは セルラーゼであることを特徴とするセルロース結合融合タンパク質の合成方法お よびその方法によって合成されるセルロース結合融合タンパク質。
17. １７．請求の範囲第１６項にもとづく方法において、前記セルラーゼはＣｅｌｌ ｕｌｏｍｏｎａｓｆｉｍｉから得ることが可能であることを特徴とするセルロー ス結合融合タンパク質の合成方法およびその方法によって合成されるセルロース 結合融合タンパク質。
18. １８．請求の範囲第１７項にもとづく方法において、前記酵素はＣｅｌｌｕｌｏ ｍｏｎａｓｆｉｍｉのセリンプロテアーゼであることを特徴とするセルロース結 合融合タンパク質の合成方法およびその方法によって合成されるセルロース結合 融合タンパク質。
19. １９．請求の範囲第１５項にもとづく方法において、前記アフィニティマトリッ クスは微結晶セルロースであることを特徴とするセルロース結合融合タンパク質 の合成方法およびその方法によって合成されるセルロース結合融合タンパク質。
20. ２０．請求の範囲第１５項にもとづく方法において、前記ポリペプチドはアリカ リホスファターゼであることを特徴とするセルロース結合融合タンパク質の合成 方法およびその方法によって合成されるセルロース結合融合タンパク質。
21. ２１．ポリペプチドは前記基質結合領域と結合するポリペプチドとは異なるポリ ペプチドとポリサカロイダーゼの少なくとも基質綜合領域とからなるハイブリッ ドタンパク質からなるポイサッカロイドマトリックスを用いることを特徴とする セルロース結合融合タンパク質の合成方法およびその方法によって合成されるセ ルロース結合融合タンパク質。
22. ２２．ポリサッカロイドはセルロースであることを特徴とする請求の範囲第２１ 項にもとづくポリサッカロイドマトリックス。
23. ２３．少なくとも２種類の互いに異なるハイブリッドタンパク質からなり、かつ 該ハイリッドタンパク質は少なくともセルロースとインターロイキン２との基質 結合領域またはβ−グルコシダーゼからなるセルロースマトリックスを用いるこ とを特徴とするセルロース結合融合タンパク質の合成方法およびその方法によっ て合成されるセルロース結合融合タンパク質。
24. ２４．少なくともセルラーゼとアルカリホスファターゼとの基質結合領域または β−グルコシダーゼからなるハイブリッドタンパク質からなるセルロースマトリ ックスを用いることを特徴とするセルロース結合融合タンパク質の合成方法およ びその方法によって合成されるセルロース結合融合タンパク質。