WO2008108116A1 - セルラーゼ酵素及びその製法 - Google Patents

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WO2008108116A1
WO2008108116A1 PCT/JP2008/051027 JP2008051027W WO2008108116A1 WO 2008108116 A1 WO2008108116 A1 WO 2008108116A1 JP 2008051027 W JP2008051027 W JP 2008051027W WO 2008108116 A1 WO2008108116 A1 WO 2008108116A1
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WO
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enzyme
cellulase
base sequence
dna
termite
Prior art date
Application number
PCT/JP2008/051027
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shigeharu Moriya
Toshiaki Kudo
Tetsushi Inoue
Nemuri Todaka
Katsuhiko Kitamoto
Manabu Arioka
Junichi Maruyama
Original Assignee
Riken
The University Of Tokyo
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)

Definitions

  • the present invention relates to a novel cellulase enzyme and a method for producing the same.
  • This enzyme is mainly derived from the intestinal symbiotic protists of termite insects. 'Background technology.
  • Cellulose is a high-molecular polysaccharide in which glucose is linked by 3-1, 4-darcoside bonds. Therefore, if it is fully hydrolyzed, glucose can be obtained and can be effectively used as a glucose supply source.
  • Cellulase is responsible for a series of reactions to efficiently decompose cellulose and extract energy from it. Many cellulases have been isolated from fungi, bacteria, etc., but cellulose is a difficult-to-decompose substance, and the degradation of cellulosic biomass by cellulase and its use have many problems until practical use. ing. Therefore, elucidating the properties of this enzyme and producing it efficiently are important themes related to the effective use of cellulase resources.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 disclose a cellulase that is not derived from a termite symbiotic protist, but is produced by two types of termites (Yamato termites, Takasago termites). 0, 0 0 0 to 5 0, 0 0
  • Patent Document 2 discloses a protein having cellulase activity derived from a symbiotic protozoan of the termite (S pirotrichony mp ha 1 eidyi), having a molecular weight of about 36 kDa, an optimum pH 6.0. , Vm ax 1 48.2 Unit Zmg, Km 1.9 mg Zm1.
  • Non-patent Document 2 lignocellulose is used for termite protozoa by comprehensive methods centered on detection of symbiotic bacteria, transcriptional control mechanism, molecular evolution of symbiotic OX ym 0 ndas, and EST analysis. We reported on the evolution of the 'decomposition' system (Non-patent Document 2).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 1 1-146 764
  • Patent Document 2 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 200 3-704 7 5
  • Non-Patent Document 1 Watanabe, H., Noda, H., Tokuda, G. and Lo., N. (1 9 98) Nature 3 94: 3 30-3 3 1
  • Non-Patent Document 2 Journal of the Extreme Environmental Microbiology (Japan) Vol. 4, No. 2, O— 1 3, P— 1 2 to P— 15, 5, 2005 Disclosure of the Invention
  • Termite symbiotic protists which use wood as their only nutrient source, can more efficiently infer cellulosic biomass, and thus more efficient cellular genes can be inferred. Very few.
  • an object of the present invention is to provide a novel cellulase from a symbiotic protist group derived from specific termites and cockroaches and DNA encoding the same.
  • Another object of the present invention is to provide an expression system for expressing a DNA encoding the cellulase, and a method for producing the cellulase using the expression system.
  • the present invention includes the following features.
  • the present invention relates to an intestine of an insect selected from the group consisting of a white termite, a large termite, a white termite, a white termite, and a cockroach A base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 140, and the base sequence and 90 ° /.
  • a cellulase enzyme containing an amino acid sequence encoded by a base sequence selected from the group consisting of the base sequences having the above identity, a mixture of two or more of the enzymes, or a processed product of the enzyme or mixture.
  • the processed product is an enzyme extract, a lyophilized product, a partially or completely purified product, or an immobilized product.
  • the cellulase enzyme is either a endoglucanase or a cephalohydrolase.
  • the present invention provides a DNA encoding a cellularase enzyme as defined above.
  • the DNA is selected from the group consisting of the base sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 140 and a base sequence having 90% identity or more with the base sequence DNA containing a base sequence.
  • the present invention provides a vector comprising one or more DNAs as defined above.
  • the vector further includes a profile motor that controls the expression of the DNA.
  • the present invention provides a transformed cell containing the vector defined above.
  • the transformed cell is a koji mold.
  • the gonococcus is Aspergillus oryzae.
  • the transformed cell defined above is cultured in a medium, and one or more cellulase enzyme proteins defined above are recovered from the cell or the medium in a single or mixed form.
  • intestinal symbiotic protist refers to a protozoan symbiotic in the intestine of a white-tailed termite, a white termite, a white-tailed termite, a long-tailed termite, or a cockroach.
  • identity refers to the match between two different amino acid sequences or base sequences when aligning the sequences with or without introducing a gap. It is a ratio (%) of the same number of amino acids (or the same number of bases) to the total number of amino acids (or the total number of bases).
  • BLAST for example, BLASTX, BLASTN, etc.
  • FASTA for example, FASTX
  • FASTX for example, Takagi
  • Toshihisa and Kanahisa edited by GenomeNet database, Kyoritsu Publishing (Tokyo, Japan), 1 1998.
  • processed product refers to any form of enzyme obtained in a process step for purification or processing of the enzyme of the present invention.
  • Fig. 1 shows the verification of novelty of the enzyme GHF 7 of the present invention based on a molecular phylogenetic tree.
  • Figure 2 shows the purification of GH F 7 endoglucanase (R s 20 3 8 B-1 1). One unit is the amount of enzyme that produces 1 mmo 1 reducing sugar (glucose equivalent) per minute.
  • Figure 3 shows the optimal pH and temperature profile of purified cellularase.
  • FIG. 4 shows the results of comparing the specific activity, optimum pH and temperature, Km, and Vmax of purified seno-relase (Host: Reticulermesssperatus) with known cellulases.
  • FIG. 5 shows the TLC results showing the degradation products of cellooligosaccharides by purified cellulase. The reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours.
  • G 1 to G 6 represent glucose, glucose, serotori, cerote tiger, cellopentaose, hexose, and G 2 + E, G 3 + E, G4 + E, G5 + E, G6 + E Indicates that each substrate is an enzyme.
  • FIG. 6 shows a cellular activity fraction profile of cellulase purification by HiT rap Pheny lse phai'o s FF from the culture supernatant of the cellulase-producing koji strain prepared in Example 5.
  • diamonds indicate cellulase activity
  • squares indicate absorbance at 280 nm (A 280)
  • triangles indicate ammonium sulfate concentration gradients.
  • Figure 7 shows the cellulo-oligosaccharides (G2 to G6 (see Fig. 5)) for the protein fraction with remarkable cellulase activity (Fig. 6) that was fractionated in Example 5 at a fraction of ammonium sulfate near 0.35M. Shows the TLC result of the degradation product when hydrolyzed at 37 ° C for 2 hours.
  • insects used as the source of the cellulase of the present invention are the lower termites, the termites, the termites, the insects, the termites, and the cockroaches that are their ancestors. These insects eat wood such as decayed fallen trees and dead branches, but the wood is saccharified and becomes a nutrient source due to the cellulase degradation activity of the symbiotic protists. Since most of the hydrolytic enzymes of the protists are saccharide hydrolases (glycosylhydrolase), it can be highly expected that the enzymes obtained from these organisms will be useful for saccharification of woody biomass.
  • the cellulase gene can be cloned and sequenced as follows.
  • RNA-DNA hybrid molecules are synthesized from the mRNA using oligo dT primer and reverse transcriptase. After that, the RNA strand is nicked with RNase, DNA synthesis is performed with DNA polymerase, the RNA fragment is replaced with the DNA fragment, and the DNA ligase is used to block the nick. Synthesize double-stranded cDNA.
  • the cDNA molecule thus obtained can then be end-extended with a terminal transferase, or c After a restriction enzyme site is bound to the end of the DNA molecule, it is inserted into a vector such as plasmid or phage, and the vector is amplified by transformation into bacteria such as Escherichia coli. Get a library.
  • the selection of clones from a library is, for example, after the formation of phage plaques-transferred to a cellulose filter to obtain a replica filter, then a radioactive label containing a sequence complementary to the target DNA, a fluorescent label, etc.
  • a library is prepared by hybridization using a probe or an expression vector, it is translated into a fusion with a ribolator protein such as / 3-galactosidase, and this is used with an antibody against the ribota protein or the target protein.
  • the target clone can be selected by detection by an immunological technique. This method is effective when the partial amino acid sequence of the target protein or a sequence highly homologous thereto is known in advance.
  • the DNA fragment After selecting the desired clone, insert the DNA fragment into an appropriate vector and amplify it, cleave it with restriction enzymes and exonuclease, recirculate with ligase, and use universal sequencing primer (USP).
  • USP universal sequencing primer
  • the single-stranded DNA is partially amplified with PCR using the USP primer, and then partially amplified in the same manner using the second primer for the sequence portion that overlaps the amplified product, and further amplified. Amplify using the third primer for the sequence that overlaps the product, and if necessary, perform PCR amplification with the 4th, 5th, etc. primers, sequence each amplified product, and then duplicate the sequence. Can be connected to determine the complete sequence.
  • the sequence of the protein of interest can be determined using a single-pass sequencing method (s i n g l e a s s ss e que nc e ng).
  • Colonies are randomly selected from the cDNA library prepared as described above, cultured in a bacterial selection medium (for example, LB medium containing antibiotics such as kanamycin), and plasmids using a commercially available plasmid purification system. After isolating
  • NC BI US; Gen Bank, Un i Gene, etc.
  • homology search programs such as A and B LA ST Perform homology analysis and annotation on the sequence of, and select a sequence that is presumed to correspond to the cellularase.
  • GEF 7 carbohydrate hydrolase family 7
  • the present invention includes a DNA encoding a cellulase enzyme comprising the base sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 140.
  • DNA encoding a cellulase enzyme comprising a base sequence having 90% or more identity with each base sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 140.
  • DNA encoding such a highly homologous cellulase enzyme can be obtained, for example, by natural mutation, such as sudden mutation or alternative splicing, or by artificial mutation, or It may be obtained as a cellulase gene homolog having a different sequence derived from a family or species or strain different from the above termites or cockroaches.
  • the mutation comprises nucleotide substitutions, deletions, insertions, additions, or a combination thereof.
  • the above mutant is a probe of DNA consisting of the base sequence shown in each of SEQ ID NOs: 1 to 140, its complementary sequence, or a fragment thereof (approximately 20 bases or more, preferably 30 bases or more if arranged) More preferably 50 bases or more, for example, 50 to 100 bases).
  • the stringent condition is, for example, that hybridization is performed at about 45 ° C, and then washing in 0.2 XSSC, 0.1% SDS, 50 to 65 ° C one or more times. Or after performing hybridization at 42 ° C in 6 XSSC and washing at 55 ° C in 0.1 XSSC, 0.1% SDS. Can do. It is also possible to add formamide to the buffer.
  • Hybridization conditions are also described, for example, in A usubel et al. (1990) Currrent Protocols Mo 1 ecu 1 ar Biology, John Wiley & Sons, Inc. (USA).
  • a cDNA and a cDNA primer from a biological sample expected to contain a mutant can be amplified by performing polymerase chain reaction (PCR) using 30 bases), and can be performed using techniques such as agarose gel electrophoresis or polyacrylamide gel electrophoresis. A can be purified.
  • PCR polymerase chain reaction
  • artificially introduced mutations include site-directed mutagenesis, a primer containing the mutation, and a vector containing each of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 140. Mutations can be introduced into the sequence, such as by patterning and performing a CRC.
  • the scope of the present invention is encoded by a base sequence selected from the group consisting of the base sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 140 and a base sequence having 90% or more identity to the base sequence.
  • a cellular enzyme comprising an amino acid sequence.
  • Each of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 140 represents a cellular gene sequence that begins with a start codon and ends with a stop codon, and each amino acid corresponds to the amino acid according to the genetic code in the genetic code table. Is replaced with the amino acid sequence corresponding to the base sequence shown in each SEQ ID NO. That is, the cellulase enzyme of the present invention is an enzyme having cellulolytic activity and includes an amino acid sequence corresponding to the base sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 140.
  • the cellular enzyme is endodalcanase (EG). Or cellobiohydrolase (CBH). .
  • Endoglucanase (EC 3.2.1.4) is a hydrolase that cleaves the / 3-1–4-Dalcoside bond of cellulose and the like in the end form, that is, from the inside of the molecule.
  • Cellohydrolase (EC 3. 2. 1. 9 1) is a hydrolase that generates cellobiose by cleaving the / 3-1—4, -dalcoside bond such as senorelose from either the reducing or non-reducing end. .
  • the sequence encoding CBH activity is SEQ ID NOs: 44 to 77, and the other sequences encode EG activity.
  • the enzyme containing the above mutation included in the cellulase enzyme of the present invention is an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 140, 80% or more, or 85% or more of the amino acid sequence, It preferably has 90% or more, preferably 93% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more, and cellulase activity.
  • Such mutations include one or more, preferably one or several amino acid deletions, substitutions, insertions, additions, or combinations thereof.
  • conservative substitution is preferable for amino acid substitution, but non-conservative substitution is allowed as long as cellulase activity is not impaired.
  • a conservative substitution is a substitution between amino acids with similar properties such as amino acid structure or charge or polarity (or hydrophobicity).
  • DNA encoding a cellulase enzyme comprising a base sequence represented by 40, or a base sequence having 80% or more, 85% or more, preferably 90% or more of each of the base sequences.
  • the DNA encoding the cellulase enzyme contained therein is inserted into an expression vector and used to transform or transfect competent cells. By performing 'fection', transformed cells can be obtained.
  • the above DNA is linked so that one or more cellulase genes of different sequences can be expressed, for example, two or more types, three or more types, four or more types, or five or more types, for example, in a tandem vector. It may be what you did.
  • Such an expression system containing DNA makes it possible to produce multiple cellulases at once.
  • the expression vector should contain a promoter, enhancer, replication origin, ribosome binding site or SD sequence, regulatory sequences such as terminators, antibiotic resistance gene sequences, selectable marker sequences such as auxotrophic complementary sequences, etc. Can do.
  • Such vectors can usually vary in type depending on the host cell to be transformed, but for example, vectors for prokaryotic organisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, and Syudomonas, yeast , Including vectors for eukaryotes such as fungi (for example, filamentous fungi, basidiomycetes), animal cells (for example, insect cells, mammalian cells, etc.), for example, plasmids, phages, viruses, etc. is there.
  • bacterial vectors include pET3, pETll (Stratagene), pMAL (New England Bio 1abs), and the like.
  • trp promoter, 1 ac promoter, P L promoter of all can be used as regulatory sequences of the promoter one such P R promoter.
  • yeast vectors include pYEU ra 3, YE pl 3, and YC p 50.
  • a promoter such as GAL 1 promoter, GAL 10 promoter, and glycolytic enzyme promoter can be used as a regulatory sequence.
  • fungal vectors such as Aspergillus include p NAN 8 1 4 2.
  • promoters such as the amylase gene promoter a my B and the darcoamylase gene g 1 a A can be used as regulatory sequences.
  • bacterial cells such as Escherichia coli, Shudomonas, Streptomyces, Bacillus subtilis, Streptococcus and Staphylococcus, Fungal cells such as yeast cells and Aspergillus, Dorosophyra S 2 and Subodoptera S f 9 Insect cells,
  • CHO cells CO S cells, He La cells, C 1 2 7 cells, 3 T 3 cells (including mutants lacking dihydrofolate reductase and thymidine kinase), BHK 2 1 Animal cells such as cells and HEK 293 cells can be used.
  • a host in which an endogenous gene that interferes with expression of target DNA and protein production is disrupted can be used. Gene disruption can be performed using, for example, the known antisense RNA method (a method in which DNA encoding RNA that is complementary to the mRNA of the target gene is introduced into the cell genome by homologous recombination). (E.g. C. He 1 eneand J. J. Toul me, BIO chem. Biophys.
  • Antisense molecules base pair with mRNA and prevent protein translation from mRNA.
  • preferred hosts are gonococci (for example, Aspergillus oryzae, etc.), gonococcal proteaase disruption strains and the like.
  • Transformation or transfection for example, calcium phosphate transfection, DEAE—dextran mediated transfection, microinjection, cationic lipid mediated transfection, electroporation, transduction, spheroplast Law, infection (viruses, phages, etc.).
  • the expression plasmid used as an example in the below-mentioned implementation column is an ⁇ -amylase promoter on the entry vector p DE STR 3 -R 4 by a recombination reaction using the Gateway system (Invitrogen). It was constructed each time by inserting the DNA in a form sandwiched between an amy moth and structural gene and a terminator of the amylase gene T-a my B sequence, and transforming gonococci using this DNA. An expression plasmid was constructed so that the protein was cleaved from amylase by adding a KRGGG sequence between the structural gene sequence and the DNA.
  • a host cell transformed with a vector capable of expressing DNA encoding the cellulase of the present invention can be cultured in an appropriate culture medium to express the DNA and produce cellularase.
  • a suitable medium is selected depending on the host, and a commercially available medium can be used as a natural medium or a synthetic medium, or it can be described in the literature. Therefore, a medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, serum, cytokines, vitamins, etc. may be prepared. If necessary, antibiotics such as tetracycline 'and ampicillin, and inducers such as isopropyl-1- ⁇ _D_thiogalatatopyranoside (IPTG) can be added to the medium.
  • IPTG isopropyl-1- ⁇ _D_thiogalatatopyranoside
  • Culturing can be carried out under aerobic or anaerobic conditions, usually at room temperature to 40 ° C. under conditions such as stirring, shaking, and standing.
  • a culture using Aspergillus oryzae as a host for example, add a nutrient medium containing 10 Om1 maltose or dextrin to a 50 Om1 'Erlenmeyer flask and inoculate the constructed Aspergillus strain here. . By culturing this at 30 ° C for 4 days, the expressed protein can be induced and released into the medium.
  • the cellulase protein of the present invention can be recovered from cultured transformed cells or culture media.
  • a eukaryotic cell When a eukaryotic cell is used as a host, a fusion DNA is prepared by ligating the DNA of the present invention with a DNA that encodes a signal sequence, and by transforming the cell, a extracellular DNA, that is, in a medium.
  • the target protein can be secreted.
  • a prokaryotic cell is used as a host, the target protein is usually accumulated in the cell. Therefore, the cell is destroyed by a technique that changes osmotic pressure, a mechanical technique (such as ultrasonic method), and the target is extracted from the extract. Protein can be recovered.
  • the cellulase protein of the present invention can be purified using a known technique.
  • Such techniques include, for example, precipitation or fractionation with ammonium sulfate or ethanol, extraction with acid or organic solvents, ion or cation exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic interaction chromatography. Chromatography, affinity chromatography, nodroxyapatite chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis, etc. can be performed alone or in combination. .
  • the cellulase enzyme activity can be measured as follows. About endoglucanase, it can be measured by the following method. Add 1% carboxymethyl'cellulose (dissolved in 0.1 M acetic acid Na buffer pH 6.0) to the sample 100 1 and react at room temperature for 1 hour.
  • tetrazolimble was added to 1 00 0 1 in the reaction solution 2 60 ⁇
  • Cellohydrolase can be measured by using the same method using A Vice 1 1 1 instead of carboxymethyl cellulose as a substrate. .
  • the cellulase enzyme of the present invention can also take the form of various processed products.
  • processed products include, for example, enzyme extracts, lyophilized products, partially or completely purified products, and immobilized products. That is, during the purification process, an enzyme extract from an enzyme source, a partially or fully purified enzyme, an enzyme in the form of a freeze-dried enzyme, or a processing treatment, for example, by immobilizing the enzyme on a support Immobilized enzyme, etc.
  • Enzyme immobilization is performed by a carrier binding method, that is, a method in which an enzyme is bound to a water-insoluble carrier by covalent bonding or non-covalent bonding, a comprehensive method, that is, a method in which the enzyme is encapsulated in a fine lattice of a polymer gel, etc.
  • a carrier binding method that is, a method in which an enzyme is bound to a water-insoluble carrier by covalent bonding or non-covalent bonding
  • a comprehensive method that is, a method in which the enzyme is encapsulated in a fine lattice of a polymer gel, etc.
  • the carrier includes porous polymer, ion exchange resin, glass, mineral, metal (for example, iron oxide) and the like.
  • the polymer gel contains a polysaccharide (for example, carrageenan), a photocurable resin, and the like.
  • the cellulase of the present invention is selected from cellulases suitable for the purpose of use from among the large number of cellulases. It can be used as an enzyme source for the production of biopolymers, or as a main component or auxiliary component for detergents, textile processing preparations, feed additives, digestive agents, biopolymers and the like.
  • the method of combination is not particularly limited, but it is 2 or more, preferably 5 or more, and more preferably 10 or more.
  • a cDNA library was constructed using 2 to 3 / j g of mRNA prepared from each termite symbiotic protist group. Library construction is based on the method of Piero et al. For the termites (C arninci, P & Hayashizaki 'Y 1 9 9 9, Methods Enzymo 1 30 3: 1 9—44), and other termites (Ma 1- uyama, K. And S. S ugano 1 9 94, Genel 38 (l-2: 1 7 1— 1 74)). Subcloning into the plasmid was performed according to the instructions using SOL R strain E. coli and EXA ssist helper fuzzy (NoV agen).
  • the obtained Escherichia coli clone was cultured in LB medium and purified using Multiscreen FB (Nippon Millipore) according to the instructions.
  • Multiscreen FB Nippon Millipore
  • Homology about 80% or more in amino acid sequence
  • cellooligosaccharides 37 C when hydrolyzed for 2 hours, produced glucose and cellobiose as the main reactive products, and produced a small amount of cellotriose, with little activity to degrade cellobiose (Figure 5). ).
  • 1 unit (unit; U) is defined as the amount of enzyme that produces reducing sugar equivalent to 1 ⁇ 1 glucose per minute.
  • the enzyme of the present invention has a higher Vma X compared to other enzymes, higher reactivity, and Km shows a relatively low value that is almost the same as cellulase synthesized by termites themselves. Furthermore, Km is close to a known type of enzyme, and it can be seen that it has high affinity.
  • Atsey is using 1.0% (wt / vol) substrate for 60 minutes at 37, except for CMC.
  • 1 unit of polymer monohydrolysis is 1 ⁇ ol of reducing sugar per minute
  • the purified enzyme recognizes CMC as a substrate, does not act on a single crystalline cell mouth, has high endoglucanase activity, has low enzyme activity against xylan, It has properties such as high substrate specificity.
  • a portion of the plasmid containing a cellulase gene different from that in Example 5 except for the region encoding the ⁇ terminal signal sequence was amplified by PCR, and placed in-frame downstream of the hyalase promoter and the structural gene. It was connected to become. At that time, a KRGGG sequence for cleaving the fusion protein was inserted into the ligation part.
  • NS-t A p E (nia D—s C 1 ⁇ tpp A ⁇ pep E) (Takashi Nemoto, Taisuke Watanabe, Junichi Maruyama, Manabu Arioka, Katsuhiko Kitamoto, Production of chymosin by double-disrupted strain of Aspergillus oryzae protease ”Japan Biotechnological Society Abstracts (Japan), pi 3 1, (2006)).
  • the resulting culture supernatant of Aspergillus oryzae was concentrated by the ammonium sulfate precipitation method (SO% saturated ammonium sulfate), followed by Hi Trap D esalting and Hi Trap P he iota y 1 sepharose FF (GE healthcare) Therefore purified using.
  • H i Trap Phenylsepharose FF 50 mM sodium acetate (pH 6.0) buffer was used, and the protein was prepared by applying a gradient (concentration gradient) from 1.7 M to 0 M with ammonium sulfate. As a result, a protein fraction with remarkable cellulase activity was obtained in the fraction around 0.35M (Fig. 6).
  • endoglucanase has a resolution of only about 4 or 5 consecutive sugar chains, but from FIG. 5 and FIG. 7, the enzyme of the present invention has a general property even if it is an endodarcanase.
  • the possibility that the final product is cellobiose ⁇ glucose units is strongly suggested, and it can be seen that the efficiency of saccharification is very high and the labor can be saved.
  • the present inventors have found that there are 140 new types of symbiotic protists of four types of termite insects and one type of cockroach insect that decompose cellulosic biomass with high efficiency. By discovering cellulose, it became possible to decompose cellulose efficiently by combining those celluloses alone or in combination, and by using a koji mold expression system as an expression system, cellulase High expression became possible.
  • a suitable cellularase is selected from a large number of cellularases according to the purpose of use, either alone or in combination, as an enzyme source for advanced saccharification of woody biomass, alcohol production, biopolymer production, etc.
  • it can be used as a main component or an auxiliary component such as a detergent / fiber processing preparation, feed additive, digestive agent, biopolymer and the like.

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Abstract

　この発明は、ヤマトシロアリ、オオシロアリ、コウシュンシロアリ、ムカシシロアリ及びキゴキブリからなる群から選択される昆虫の腸内共生原生生物群由来であって、かつ、配列番号１～１４０に示される塩基配列及び該塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる群から選択される塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含むセルラーゼ酵素、又は該酵素の２以上の混合物、或いは該酵素又は混合物の処理物、該酵素をコードするＤＮＡ及び発現系、並びに、該酵素の製造方法を提供する。

Description

明 細 書 セルラ一ゼ酵素及びその製法 技術分野
本発明は、 新規のセルラーゼ酵素及びその製法に関する。 この酵素は、 主にシ ロアリ科昆虫の腸内共生原生生物群に由来する。 ' 背景技術 .
セルロースは、 グルコースが 3— 1 , 4—ダルコシド結合で連結した高分子多 糖である。 したがって、 これを加水分解十ればグルコースが得られ、 グルコース の供給源として有効に利用することができる。このセルロースを効率よく分解し、 そこからエネルギーを取り出すためめ一連の反応を司るのがセルラーゼである。 多数のセルラーゼが菌類や細菌などから単離されているが、 セルロースは難分 解性の物質であり、 セルラ一ゼによるセルロース系バイォマスの分解及びその利 用は実用化までに多くの問題を抱えている。 したがって、 この酵素の特性を解明 すること及びこの酵素を効率よく生産することは、 セルラーゼ資源の有効活用に 関わる重要なテーマである。
シロアリの腸内共生原生生物系は、 セルロース分解効率が非常に高いことが知 られていた。 しかし、 その共生原生生物群の難培養性のために解析が進んでいな かったが、 近年でさえ、 共生原生生物系及びそのセルラーゼに関する研究がわず かに行われているにすぎない。
例えば、 特許文献 1及び非特許文献 1には、 シロアリ共生原生生物系由来では ないが、 2種のシロアリ （ャマトシロアリ、 タカサゴシロアリ） が産生するセル ラーゼが開示されており、 そのセルラーゼは、 分子量 4 0 , 0 0 0〜 5 0 , 0 0
0、 熱安定性 6 0。C以下、 至適 p H 5 . 0〜 6 . 0、 及びカルボキシセルロース に対する比活性 7 0〜 1 3 0 0ユエッ ト / m gからなる特徴を有するものである, ここで、 1ユニッ ト （u n i t ) は、 1分あたり 1 ん;, m 0 1のグルコース相当の 還元糖を生成する酵素量を意味し、 以下同様に定義する。 特許文献 2には、 イエシロアリの共生原生動物 （S p i r o t r i c h o n y mp h a 1 e i d y i ) 由来のセル'ラーゼ活性を有する蛋白質が開示されてお り、 分子量約 3 6 k D a、 至適 p H 6. 0 , Vm a x 1 48. 2ユニッ ト Zm g、 Km 1. 9 m g Zm 1からなる特徴を有するものである。
さらにまた、 本発明者らは、 シロアリの原生生物について、 共生細菌の検出、 転写制御メ力二ズム、 共生生物 O X y m 0 n d a sの分子進化、 E S T解析を中 心とした網羅的手法によるリグノセルロース分解'系の進化に関する報告をした (非特許文献 2)。
特許 献 1 特開平 1 1一 46 764号公報
特許文献 2 特開 200 3— 704 7 5
非特許文献 1 W a t a n a b e， H.， N o d a， H. , T o k u d a , G. 及び L o., N. ( 1 9 98) N a t u r e 3 94 : 3 30 - 3 3 1
非特許文献 2 極限環境微生物学会誌 （日本） 4巻 2号、 O— 1 3、 P— 1 2〜P— 1 5、 200 5年 発明の開示
木材を唯一の栄養源とするシロアリの共生原生生物群は、 セルロース系バイオ マスを高効率に分解することから、 効率のよいセルラ一ゼ遺伝子をもっと推測さ れるが、 これまで、 その取得例は非常に少なかった。
このような状況のなかで、 本発明は、 特定のシロアリ及びゴキブリ由来の共生 原生生物群からの新規のセルラーゼ及びそれをコードする DN Aを提供すること を目的とする。
本発明はまた、 上記セルラーゼをコ一ドする DNAを発現するための発現系、 並びに該発現系を利用した上記セルラーゼの製造方法、 を提供することを目的と する。
発明の概要：
本発明は、 要約すると、 以下の特徴を含む。
本発明は、 第 1の態様において、 ャマトシロアリ、 ォオシロアリ、 コゥシユン シロアリ、 ムカシシロアリ及びキゴキブリからなる群から選択される昆虫の腸内 共生原生生物群由来であって、 かつ、.配列番号 1 〜 1 4 0に示される塩基配列及 び該塩基配列と 9 0 °/。以上の同一性を有する塩基配列からなる群から選択される 塩基配列によってコードされ.るアミノ酸配列を含むセルラーゼ酵素、 又は該酵素 の 2以上の混合物、 或いは該酵素又は混合物の処理物を提供する。
本発明の実施形態によれば、 上記処理物は、 酵素の抽出物、 凍結乾燥物、 部分 もしくは完全精製物、 又は固定化物である。
本発明の別の実施形態によれば、 上記セルラーゼ酵素は、 ェンドグルカナーゼ 又はセ口ビォヒ ドロラ一ゼのいずれかである。
本発明は、 第 2の態様において、 上記定義のセルラ一ゼ酵素をコードする D N Aを提供する。
本発明の実施形態によれば、 上記 D N Aは、 配列番号 1 〜 1 4 0に示される塩 基配列及び該塩基配列と 9 0 %以上の同一性を有する塩基配列からなる群から選 択される塩基配列を含む D N Aである。
本発明は、 第 3の態様において、 上記定義の 1つ又は複数の D N Aを含むべク タ一を提供する。
本発明の実施形態によれば、 上記べクターは、 上記 D N Aの発現を制御するプ 口モータ—をさらに含む。 本発明は、 第 4の態様において、 上記定義のベクターを含む形質転換細胞を提 供する。
本発明の実施形態によれば、 上記形質転換細胞は、 麹菌である。
本発明の別の実施形態によれば、 上記麹菌はァスペルギルス ·ォリゼである。 本発明は、 第 5の態様において、 上記定義の形質転換細胞を培地にて培養し、 該細胞又は該培地から、 上記定義の 1つ又は複数のセルラーゼ酵素蛋白質を単一 又は混合物形態で回収することを含む、 セルラーゼ酵素の製造方法を提供する。 定義：
本明細書中で使用する、 本発明に関わる用語は、 以下の意味を包含する。 本明細書中で使用する 「腸內共生原生生物」 なる用語は、 ャマトシロアリ、 ォ オシロアリ、 コゥシユンシロアリ、 ムカシシロアリ又はキゴキブリの腸管内に共 生する原生動物を指す。 本明細書中で使用する 「同一性」 なる用語は、 異なる 2つのアミノ酸配列又は 塩基配列間で、 ギヤップを導入するか又はギヤップを導入しないで配列を整列比 較したときの 2つの配列の一致度を表わし、一般に全ァミノ酸数（又は全塩基数） に対する同一アミノ酸数 （又は同一塩基数） の割合 （％) である。 通常、 同一性 のある配列の検索は、 B LAST (例えば B LASTX、 B LASTNなど）、 F AS TA、 FASTX、 TF AS TAなどの公知のプログラムを利用して行うこ とができる （例えば、 高木利久 ·金久實編，ゲノムネッ トのデータベース利用法， 共立出版 （東京、 日本） ， 1 9 98年）。
本明細齊中で使用する 「処理物」 なる用語は、 本発明の酵素の精製又は加工の ための処理工程で得られる任意の形態の酵素を指し、 処理物には、 精製工程の間 の、 酵素源からの酵素抽出物、 部分又は完全精製の酵素、 酵素の凍結乾燥物など の形態の酵素、 或いは、 加工処理、 例えば支持体に酵素を固定化して得られる固 定化酵素、 などが含まれる。 '
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2007-53122 号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 分子系統樹に基づいた、 本発明酵素 GHF 7の新規性の検証を示す。 図 2は、 GH F 7ェンドグルカナ一ゼ （R s 20 3 8 B— 1 1) の精製につい て示す。 1ュニッ トは、 1分あたり 1 mmo 1の還元糖 （グルコース等価物） を 生成する酵素量である。
図 3は、 精製セルラ一ゼの至適 p H及び温度のプロフィ一ルを示す。
図 4は、 精製セノレラーゼ (Ho s t ： R e t i c u l i t e r me s s p e r a t u s ) の比活性、 至適 pH及び温度、 Km及び Vma xを、 既知のセルラ ーゼと対比した結果を示す。
図 5は、 精製セルラーゼによるセロオリゴ糖の分解産物を示す TLCの結果を 示す。反応は、 3 7 °Cで 2時間行った。図中、 G 1〜G 6はそれぞれグルコース · セ口ビ才ース ' セロ トリ才一ス ' セロテ トラ才ース · セロペンタオース ' セ口へ キソースを表し、 また、 G 2 + E、 G 3 + E、 G4 + E、 G 5 + E、 G 6 +Eは それぞれの基質に酵素を加えたものであることを表す。
図 6は、 実施例 5で作製されたセルラーゼ生産麹菌株の培養上清からの H i T r a p P h e n y l s e p h a i' o s e F Fによるセルラ一ゼ精製のセル'ラ ーゼ活性分画プロフィールを示す。 図中、 菱形はセルラーゼ活性を示し、 四角は 280 nmでの吸光度 （A 280) を示し、 三角は硫安濃度勾配を示す。
図 7は、 実施例 5で分画された硫安 0. 35M付近の画分の顕著なセルラーゼ 活性のあるタンパグ質画分 （図 6) について、 セロオリゴ糖 （G 2〜G6 (図 5 参照）） を 37°C.、 2時間加水分解したときの分解産物の TLC結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
1. セルラーゼ遺伝子のクローニング及び配列決定
本発明のセルラーゼの供給源として使用された昆虫は、 下等シロアリであるャ マトシロアリ、 ォオシロアリ、 コゥシユンシロアリ及びムカシシロアリ、 並びに それらの祖先にあたるキゴキブリである。 これらの昆虫は、 腐朽した倒木、 枯れ 枝などの木質を食べるが、 共生する原生生物群がもつセルラーゼ分解活性のため に木質は糖化され栄養源となる。 原生生物群がもつ加水分解酵素の大部分が糖質 加水分解酵素 （g l y c o s y l h y d r o l a s e) であるために、 該生物 群から得られる酵素は木質バイォマスの糖化に有用であることが大いに期待でき る。
セルラーゼ遺伝子のクローニング及び配列決定は、 以下のようにして行うこと ができる。
先ず、 上記の各昆虫の腸管を取り出し、 破砕し、 100 X g程度の低速遠心で 原生生物画分を得る。 得られた画分から全 RNAを定法に従い単離し、 オリゴ d T結合カラムを用いて mRNAを得、 ついで mRNAから、 オリゴ dTプライマ ー及ぴ逆転写酵素を用いて RNA— DNAハイブリ ッド分子を合成したのち、 R N a s eにより RNA鎖にニックを尊入し、 DN Aポリメラ一ゼによりニックを 開始点として DN A合成を行い、 R N A断片を DN A断片に置き換え、 DNAリ ガーゼでニックを塞いで二本鎖 c DNAを合成する。 このようにして得られた c DNA分子はついで、 ターミナル'トランスフェラーゼで末端伸長するか、 或いは c DNA分子の末端に制限酵素部位を結合したのち、 プラスミ ド、 ファージなど のべクターに挿入し、 大腸菌などの細菌に形質転換によりべクターを導入して増 幅し、 これによつて c DNAライブラリーを得る。
ライブリ一からのクローンの選択は、 例えばファージプラークの形成後に-ト セルロースフィルターに転写してレプリカフィルターを得たのち、 目的 D N Aに 相補的な配列を含む放射性ラベル、 蛍光性ラベルな.どのラベルを有するプローブ を用いるハイブリダイゼーションにより、 或いは発現ベクターを用いてライブラ リーを作製したときには /3—ガラク トシダ一ゼなどのリボーター蛋白質との融合 体に翻訳 、 これをリボータ一蛋白質や目的蛋白質に対する抗体を用いて免疫学 的手法により、 検出することによって目的クローンを選択することができる。. こ の方法は、 目的蛋白質の部分ァミノ酸配列又はそれと相同性の高い配列が予め判 つている場合に有効である。 目的クローンを選択したのち、 DNA断片を適当な ク口一ユングベクターに挿入し増幅し、制限酵素、ェキソヌク レアーゼで切断し、 リガ一ゼで再び環化し、 ユニバーサルシ一クェンシングプライマー （U S P) を 用いて配列決定し、 重複した配列をつなぎ合わせて完全な配列を決定することが できる。 或いは、 U S Pプライマ一を用いて一本鎖 DNAを P CRで部分的に增 幅し、 さらに増幅産物と重複する配列部分に対する第 2のプライマーを用いて同 様に部分的に増幅し、 さらに増幅産物と重複する配列部分に対する第 3のプライ マーを用いて増幅し、 さらに必要ならば第 4、 第 5等のプライマーによる PCR 増幅を行ったのち、 それぞれの増幅産物を配列決定し、 重複した配列をつなぎ合 わせて完全な配列を決定することができる。
或いは、 代替的な配列決定法として、 シングルパス配列決定法 （ s i n g l e a s s s e q u e n c i n g) を用いて目的蛋白質の配列を決定することが できる。 上記のように作製した c DNAライブラリ一からランダムにコロニーを 選択し、 細菌用選択培地 （例えばカナマイシンなどの抗生物質を含む L B培地） で培養し、市販のプラスミ ド精製システムを利用してプラスミ ドを単離したのち、
5 ' 末端又は 3 ' 末端のシングルパス配列を決定し、 得られた配列を、 FAS T
A、 B LA S Tなどの相同性検索用プログラムを利用して NC B I (米国 ； G e n B a n k、 Un i G e n eなど） などの公共データベースにアクセスして既知 の配列に対するホモロジ一解析及びァノテ一ションを行い、 セルラ一ゼに相当す ると推定される配列を選択する。 さらに、 上記のように選択されたセルラーゼ遺 伝子ホモログの中から糖質加水分解酵素ファミ リー 7 (GHF 7) のエンドダル カナーゼに相当するものを選択し.、 部分配列の系統解析によって共通祖先を共有 すると考えられる配列 （アミノ酸配列で 80%以上の相同性） を選択する。 上記の手法により、 4種のシロアリ及び 1種のゴキブリの共生原生生物群由来 の 1 40種の新規セルラーゼ遺伝子を見出した。 具体的には、 糖質加水分解酵素 ファ ミ リ一 5 (GH F 5 ) について 43クローン （配列番号 1〜 43)、 GHF 7 のセロビォヒ ドロラ一ゼ（C B H)について 34クローン（配列番号 44〜 7 7 )、 GH F 7エンドグルカナーゼ （EG) について 3 8クローン （配列番号 7 8〜 1 1 5)、 GHF 4 5について 2 5クローン' （配列番号 1 1 6〜 1 40) を新規のセ ルラーゼ遺伝子として見出した。
したがって、 本発明は、 配列番号 1〜 1 40に示される塩基配列を含むセルラ ーゼ酵素をコードする DNAを包含する。
さらに、本発明の範囲には、配列番号 1〜 1 40に示される各塩基配列と 90% 以上の同一性を有する塩基配列を含むセルラーゼ酵素をコードする DNAも包含 する。 このような高相同性のセルラーゼ酵素をコードする DNAは、 例えば突然 変異や選択的スプライシングなどの自然の変異によつて又は人為的な変異によつ て得ることができるし、 或いは該 DNAは、 上記のシロアリ又はゴキブリ と異な る科又は種又は株に由来する異なる配列を'もつセルラ一ゼ遺伝子ホモログとして 得てもよい。 変異は、 ヌクレオチドの置換、 欠失、 挿入、 付加、 又はそれらの組 み合わせからなり、 配列番号 1〜 140の各塩基配列と 80 %以上、 8 5 %以上 又は 90 %以上、 好ましくは 9 3 %以上、 より好ましぐは 9 5 %以上、 さらに好 ましくは 98 %以上の配列同一性を有し、 かつ変異遺伝子の発現によって得られ る各蛋白質はセルラ一 活性を有しているべきである。
上記の変異体は、 配列番号 1〜 1 40の各々に示される塩基配列、 その相補的 配列、 又はその断片 らなる DNAをプローブ （ί列えば約 20塩基以上、 好まし くは 30塩基以上、 より好ましくは 50塩基以上、 例えば 50〜 1 00塩基） と して用いるス トリンジェント条件下でのハイプリダイゼーションによって分離又 は単離することができる。 ここで、 ス トリンジェント条件は、 例えば、 約 4 5°C でハイブリダィゼ一シヨンを行い、 ついで 0. 2 X S S C、 0. 1 %SD S中、 50〜 6 5°C 1回又は複数回の洗浄を行うカ 或いは、 6 X S S C中、 4 2°Cで ハイブリダィゼ一シヨ ンを行ったのち、 0. 1 X S S C、 0. 1 %SD S中、 5 5°Cで洗浄する、 などの条件をあげることができる。 また、 バッファにはホルム ァミ ドを添加することも可能である。 ハイブリダイゼーション条件は、 例えば A u s u b e l ら， （1 9 90) C u r r e n t P r o t o c o l s i n M o 1 e c u 1 a r B i o l o g y, J o h n W i l e y & S o n s , I n c . (米国） にも記載されている。
或いは、 変異体を含むと予想される生物サンプルからの c DN Aライブラリ.一 について、 配列番号 1〜1 40に示される塩基配列に基づいて作製したセンス及 びアンチセンスプライマ一 （通常 1 5〜30塩基） を用いるポリメラ一ゼ連鎖反 応 （PCR) を行うことによって、 目的の変異体 DN Aを増幅することができ、 さらにァガロースゲル電気泳動又はポリアクリルアミ ドゲル電気泳動などの技法 を用いて DN Aを精製することができる。
さらにまた、 人為的に変異を導入する方法には、 部位特異的突然変異誘発法、 変異を含むプライマ一を作製し、 配列番号 1〜 1 40に示される塩基配列の各々 を含むベクタ一を铸型にして P CRを行う方法、 などによって、 突然変異を該配 列に導入することができる。
さらにまた、 本発明の範囲には、 配列番号 1〜 1 40に示される塩基配列及び 該塩基配列と 90%以上の同一性を有する塩基配列からなる群から選択される塩 基配列によってコードされるァミノ酸配列を含むセルラ一ゼ酵素も包含される。 配列番号 1〜1 40によって表わされる塩基配列はいずれも、 開始コ ドンに始ま り終止コ ドンで終わるセルラ一ゼ遺伝子配列を表わしており、 遺伝暗号表の遺伝 暗号にしたがって各塩基を対応ァミノ酸に置き換えると、 各配列番号に示される 塩基配列に対応するアミノ酸配列となる。すなわち、本発明のセルラーゼ酵素は、 セルロース分解活性を有する酵素であり、 配列番号 1〜1 40に示される塩基配 列に対応するアミノ酸配列を含む。
さらにまた、 実施形態により、 セルラ一ゼ酵素は、 エンドダルカナーゼ （EG) 又はセロビォヒ ドロラーゼ （CBH) のいずれかである。 .
エンドグルカナーゼ （EC 3. 2. 1. 4) は、 セルロース等の /3— 1， 4- ダルコシド結合をェンド型で、 すなわち分子内部から切断する加水分解酵素であ る。
セロビォヒ ドロラーゼ （E C 3. 2. 1. 9 1 ) は、 セノレロース等の /3— 1 , 4 -ダルコシド結合を還元末端又は非還元末端のいずれかから切断しセロビオー スを生成する加水分解酵素である。
配列番号 1〜 1 40のうち、 CB H活性をコードする配列は、 配列番号 44〜 7 7であり、 その他の配列は、 E G活性をコードしている。
本発明のセルラーゼ酵素に包含される上記変異を含む酵素は、 配列番号 1〜 1 40に示される塩基配列によってコードされるアミノ酸配列において、 該ァミノ 酸配列と 80 %以上、又は 8 5 %以上、好ましくは 90 %以上、好ましくは 9 3 % 以上、 より好ましくは 95 %以上、 さらに好ましくは 9 8 %以上の配列同一性を 有し、 かつセルラーゼ活性を有するものである。
このような変異は、 1又は複数、 好ましくは 1もしくは数個、 のアミノ酸の欠 失、 置換、 挿入、 付加、 又はこれらの組み合わせを含むものである。 とりわけ、 アミノ酸の置換は、 保存的置換が好ましいが、 セルラーゼ活性を損なわないなら ば非保存的置換も許容される。 保存的置換は、 アミノ酸の構造又は電荷又は極性 (もしくは疎水性） などの性質が類似したァミノ酸間の置換である。 例えば A r g、 L y s及び H i sの塩基性ァミノ酸間、 A s p及び G 1 uの酸性ァミノ酸間、 T r p、 P h e及び T y rの芳香族ァミノ酸間、 L e u、 I l e、 V a l、 A l a、 M e t、 P i- oなどの疎水性ァミノ酸間、 或いは、 S e r、 T h r、 G 1 ^ A s n、 G 1 nなどの極性ァミノ酸間でのァミノ酸置換を挙げることができる。 2. セルラーゼ発現系
上記 1に記載の方法でクロー-ングされかつ配列決定された、 配列番号 1〜 1
40によって表わされる塩基配列を含むセルラーゼ酵素をコ一ドする DNA、 或 いは該塩基配列の各々と 80 %以上、 又は 8 5 %以上、 好ましくは 90 %以上の 配列同一性を有する塩基配列を含むセルラーゼ酵素をコ一ドする DNAは、 発現 用ベクターに挿入し、 これを用いて、 コンビテント細胞に形質転換又はトランス フエクション'することによって、 形質転換細胞を得ることができる。 上記 DNAは、 異なる配列のセルラーゼ遺伝子を 1種類又は複数、 例えば 2種 類以上、 3種類以上、 4種類以上、 .或いは 5種類以上を例えばタンデムにべクタ 一に、 それぞれ発現可能なように連結したものであってもよい。 このような DN Aを含む発現系は、 複数のセルラーゼを一度に生成することを可能にする。
発現ベクターは、 プロモーター、 ェンハンサー、 複製開始点、 リボソーム結合 部位又は S D配列、 タ一ミネ一ターなどの制御配列、 抗生物質耐性遺伝子配列、 栄養要求性相補配列などの選択マーカー配列、 などを含むことができる。 このよ うなべクターは、 形質転換する宿主細胞に応じてその種類を通常変えることがで きるが、 該べクタ一には、 例えば大腸菌、 枯草菌、 シユードモナスなどの原核生 物用のベクター、 酵母、 菌類 （例えば糸状菌、.担子菌など）、 動物細胞 （例えば昆 虫細胞、 哺乳類細胞など） などの真核生物用のベクターなどを含み、 例えばブラ スミ ド、 ファージ、 ウィルスなどのベクタ一である。
これらのベクタ一は、 市販されているのでそれらを使用することができる。 例 えば、 細菌用べクターの例は、 p ET 3、 p ET l l (S t r a t a g e n e社 製）、 pMAL(N e w E n g l a n d B i o 1 a b s社）などが挙げられる。 また、 例えば t r pプロモーター、 1 a cプロモーター、 PLプロモータ一、 PR プロモーターなどのプロモータ一を調節配列として使用できる。 また、 酵母用べ クタ一の例は pYEU r a 3、YE p l 3、YC p 50などが挙げられる。また、 例えば G A L 1プロモーター、 GAL 1 0プロモーター、 解糖系酵素プロモータ 一などのプロモータ一を調節配列として使用できる。 さらにまた、 ァスペルギル スなどの真菌用べクタ一の例は、 p NAN 8 1 4 2などが挙げられる。 また、 例 えばアミラーゼ遺伝子プロモーター a my B、 ダルコアミラーゼ遺伝子 g 1 a A などのプロモーターを調節配列として使用できる。
宿主細胞としては、 大腸菌、 シュ一ドモナス、 ス トレプトミセス、 枯草菌、 ス トレプトコッカス、 スタフイロコッカスなどの細菌細胞、 酵母細胞、 ァスペルギ ルスなどの真菌細胞、 ドロソフイラ S 2、 スボドプテラ S f 9などの昆虫細胞、
CHO細胞、 CO S細胞、 H e L a細胞、 C 1 2 7細胞、 3 T 3細胞 （ジヒ ドロ 葉酸レダクタ一ゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、 BHK 2 1 細胞、 HEK 29 3細胞、 などの動物細胞などを使用できる。 宿主は、 必要に応 じて、 目的 DN Aの発現、 蛋白質生産を妨げる内因性遺伝子を破壊したものを使 用することができる。 遺伝子破壊は、 例えば公知のアンチセンス RN A法 （標的 遺伝子の m R N Aに対して相捕的な R N Aをコードする D N Aを細胞のゲノムに 相同組換え法によつて導入する方法）などを用いて行うことができる（例えば C . H e 1 e n e a n d J . J . T o u l me , B I O c h e m. B i o p h y s . A c t a ( 1 9 90) 1 04 9 : 9 9— 1 2 5)。 アンチセンス分子は mRN Aと塩基対を形成し、 mRN Aから蛋白質の翻訳を妨げる。 本発明の好適実施形 態によれば、 好ましい宿主は、 麹菌 （例えば、 ァスペルギルス ·ォリゼなど）、 麹 菌のプロテア一ゼ破壊株などである。
•形質転換又はトランスフエクシヨ ンは、 例えばリ ン酸カルシゥム トランスフエ クシヨ ン、 D E A E—デキス トラン媒介トランスフエクシヨン'、 マイクロインジ ェクシヨン、 カチオン性脂質媒介トランスフェクションヽ エレク トロポレーショ ン、 形質導入、 スフエロプラス ト法、 感染 （ウィルス、 ファージなど) などを含 む。
後述の実施 ί列で例示として使用した発現プラスミ ドは、 G a t e w a yシステ ム （インビト口ジェン社） を用いた組み換え反応により、 エントリーベクタ一 p DE STR 3 -R 4上に、 α—アミラ一ゼプロモータ一 a m y Βおよび構造遺伝 子と、 ひ一アミラーゼ遺伝子のターミネータ一 T— a my B配列に挟まれた形で 該 DNAを挿入し、 これを用いて麹菌を形質転換することによってその都度構築 した。 なお、 構造遺伝子配列と該 DN Aの間に KRGGG配列を加えることによ つて、 アミラーゼから該タンパク質が切断されるように発現プラスミ ドを構築し た。
3. セルラーゼの製造
本発明のセルラーゼをコ一ドする DNAを発現可能にしたべクターで形質転換 された宿主細胞は、 適当な培養培地中で培養され、 該 DNAを発現しセルラ一ゼ を産生することができる。
培地については、 宿主に応じて適する培地が選択され、 天然培地、 合成培地と して市販されている培地を使用することができるし、 或いは、 文献等の記載にし たがって炭素源、 窒素源、 無機塩類、 血清、 サイ トカイン類、 ビタミン類、 など を含む培地を作製してもよい。 培地には、 必要に応じて、 テトラサイクリン'、 ァ ンピシリンなどの抗生物質、ィソプロピル一 β _ D _チォガラタ トピラノシド（ I P T G ) などの誘導物質などを添加することができる。
培養は、 好気的又は嫌気的条件で、 攪拌、 振とう、 静置などの条件下で、 通常 室温〜 4 0 °Cの温度で行うことができる。
麹菌を宿主とする培養では、 例えば、 5 0 O m 1 'のエルレンマイヤ一フラスコ に 1 0 O m 1のマル トースまたはデキス トリンの入った栄養培地を加え、 ここへ 構築した麹菌株を植菌する。 これを 3 0 °Cで 4 日間培養することによって発現タ ンパク質を誘導し培地中に放出させることができる。
.本発明のセル'ラーゼ蛋白質は、 培養形質転換細胞又は培地から回収することが できる。 真核細胞を宿主とするときには、 本発明の D N Aにシグナル配列をコ一 ドする D N Aを連結した融合 D N Aを作製し、 これによって細胞を形質転換する ことによつて、細胞外、すなわち培地中に目的蛋白質を分泌させることができる。 一方、 原核細胞を宿主とするときには、 通常、 細胞内に目的蛋白質が蓄積される ので、 浸透圧を変化させる手法、 機械的手法 （超音波法など） などによって細胞 を破壊し、 抽出液から目的蛋白質を回収することができる。
本発明のセルラーゼ蛋白質の精製は、 公知の技法を用いて行うことができる。 そのような技法には、 例えば、 硫酸アンモ-ゥム又はエタノールによる沈殿又は 分画、 酸又は有機溶媒による抽出、 ァ-オン又はカチオン交換クロマトグラフィ 一、 ゲルろ過ク口マトグラフィー、 疎水性相互作用クロマトグラフィー、 ァフィ 二ティ一クロマトグラフィー、 ノヽイ ドロキシアパタイ トクロマトグラフィー、 逆 相高速液体ク口マトグラフィ一などのク口マトグラフィー、 ポリアクリルァミ ド ゲル電気泳動、 などを単独で、 或いは適宜組み合わせて行うことができる。
セルラーゼ酵素の活性測定（アツセィ）は、次のようにして行うことができる。 ェンドグルカナーゼについては、 以下の方法で測定を行うことができる。 タン パク標品 1 0 1に 1 %カルボキシメチル'セルロース （0 . 1 M酢酸 N aバッフ ァ p H 6 . 0に溶解） 2 5 0 μ 1 を加え、 室温で 1時間反応を行なう。 生成した 還元糖を測定するために、 反応液 2 6 0 μ 1 中 1 0 0 1にテトラゾリ ゥムブル 一試薬 l m l を加え、沸騰水中で 1 0分反応させた後、冷却して分光光度計（O. D. 66 0) で吸光値を測定する （J u e， C. K. a n d L i p k e , P. N. D e t e r m i n a t i o n o f r e d u c i n g s u g a r s i n t h e n a n o m o 1 e r a n g e w i t h t e t r a z o 1 i u m b l u e ''', J B i o c h e m B i o p h y s Me t h o d s , 1 1 , 1 0 9 - 1 1 5 ( 1 98 5))。
セロビォヒ ドロラーゼについては、 基質としてカルボキシメチルセルロースの 代わりに A V i c e 1 1 を用い、 同じ方法を用いることによって測定することが できる。 .
本発明のセルラーゼ酵素はまた、 種々の処理物の形態をとることができる。 .こ のような処理物には、 例えば酵素の抽出物、 凍結乾燥物、 部分又は完全精製物、 固定化物などが含まれる。すなわち、精製工程の間の、酵素源からの酵素抽出物、 部分又は完全精製の酵素、 酵素の凍結乾燥物などの形態の酵素、 或いは、 加工処 理、 例えば支持体に酵素を固定化して得られる固定化酵素、 などが含まれる。 酵素の固定化は、 担体結合法、 すなわち水不溶性の担体に酵素を共有結合又は 非共有結合によって結合させる方法、 包括法、 すなわち高分子ゲルの微細な格子 の中に酵素を包み込む方法、 などを含む (例えば、 福井三郎編、 酵素工学、 東京 化学同人 （東京、 日本）、 1 98 1年）。 担体は、 多孔性ポリマー、 イオン交換樹 脂、 ガラス、 鉱物、 金属 （例えば酸化鉄など） などを含む。 また、 高分子ゲルは、 多糖類 （例えばカラギーナンなど）、 光硬化性樹脂などを含む。 これらの担体や高 分子ゲルに固定化された酵素は、 力ラムなどに充填して、 連続的セルロース分解 などに使用することができる。
本発明のセルラ一ゼは、 その多数のセルラ一ゼの中から、 使用目的に応じて適 するセルラーゼを選択し、 単独で又は、 酵素混合物として組み合わせて、 木質バ ィォマスの高度糖化、 アルコール生産、 バイオポリマーの製造などの酵素源とし て、 或いは洗剤 ·繊維加工用製剤、 飼料添加剤、 消化剤、 バイオボリマーのなど の主成分又は補助成分として、 利用することができる。 組み合わせ方は、 特に限 定されないが、 2種類以上、 好ましくは 5種類以上、 さらに好ましくは 1 0種類 以上などである。 実施例
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、 本発明はそれらの実施例によ つて制限されないものとする。
<実施例 1 > m R N Aの単離
ャマトシロアリ .ォオシ口ァリ ' コゥシユンシロァリ ' ムカシシロアリ ' キゴ キブリ腸管を摘出し.、それぞれ S o l u t i o n U(T r a g e r 1 9 34, B i o l o g i c a l B u l l e t i n, V 0 I 6 6 : 1 8 2 - 1 90) 中で 破砕し、 1 00ミク口ンナイ口ンメッシュで濾過した。 得られた懸濁液を 1 00 X g、 3分間ゆるやかに遠心することによって原生生物画分を得た。 更に Sひ 1 u t i o n Uで 3回洗浄し、 R N A抽出のための原生生物画分を得た。 mRN Aの単離は O l i g o _ d T 30 < S u p e r™> (日本口シュ） を用いて指示 書通りに行い、 各宿主シロアリ由来の原生生物群より mRN Aを得た。
<実施例 2〉 c D N Aライブラリ一の構築
各シロアリ共生原生生物群より調製した mRN Aを 2〜 3 /j g用いて、 c DN Aライブラリ一の構築を行った。 ライブラリ一構築はャマトシロアリに関しては P i e r oらの方法によって 亍ぃ （ C a r n i n c i , P & H a y a s h i z a k i 'Y 1 9 9 9, Me t h o d s E n z y m o 1 30 3 : 1 9— 44)、 その他のシロアリ由来のものに関しては菅野らの方法によって行った （Ma 1- u y a m a , K . a n d S . S u g a n o 1 9 94, G e n e l 38 ( l— 2ノ ： 1 7 1— 1 74)。ャマトシロアリの c DNAライブラリーに関しては SOL R株 大腸菌と E X A s s i s tヘルパーファ一ジ （N o V a g e n) を用いて指示書 通りにプラスミ ドへのサブクロ一ユングを行った。
<実施例 3 >配列の解析
得られた大腸菌クローンは L B培地中で培養し、 マルチスクリーン F B (日本 ミ リポア）を用いて指示書通りに精製した。精製したプラスミ ド DNAを用いて、 ャマトシロアリ、 ォオシロアリ、 コゥシユンシロアリ、 ムカシシロアリ、 キゴキ プリそれぞれの共生原生生物群由来のライブラリークローンをそれぞれ 9 1 7、
9 20、 1 056、 1 0 2 3、 9 2 1クローンずつ、 B i g d y e t e r m i n a t o r c y c l e s e q u e n c i n g k i t v 3. 1および自動 シーケンサ A B 1 3 7 0 0、 3 1 0 0または 3 1 3 0 (A p p l i e d B i o s y s t e rn s ) を用いて定法通りに配列決定した。 配列決定には M4プライマ 一 （配列番号 1 4 1 : 5 ' — GT T T T C C C A GT C AC G AC—
3 ') を用レヽて、 5 末 ί耑の s i n g l e p a s s s e q u e n c eを、 定し た。 得られた配列は F A S T Xにより公共データベースに蓄積されている既知配 列に対するホモロジ一解析を行い（DN A d a t a b a s e J a p a n)、 ァ ノテーションを行った。 得られたァノテ一シ ョンの中からセルラ一ゼに相当する ものを選択した。
<実施例 4 >セルラーゼ配列の解析
.得られたセルラーゼ遺伝子ホモ口グのうち、. 糖質加水分解酵素ファミ リ一 7の ェンドグルカナーゼに相当するものを選択し、 部分配列の系統解析によつて共通 祖先を共有すると考えられる配列 （相同性 =アミノ酸配列で 8 0 %程度以上） に ついて、 GH F 5については全 4 3クローン （配列番号 1〜4 3)、 GH F 7 C B Hについては全 3 4クローン （配列番号 4 4〜7 7)、 GH F 7 E Gについては全 3 8クローン（配列番号 7 8〜 1 1 5)、GH F 4 5については全 2 5クローン'（配 列番号 1 1 6〜 1 4 0) の全長配列を決定した。
得られた配列を用いて最尤ー距離行列法で系統関係を解析したところ、 これら のシロアリ共生原生生物由来の配列は独立した系統群を形成し、 GH F 7 (図 1)、 GH F 4 5においては既知の同等酵素遺伝子とはサブフアミ リーレベルで異なる 新規の酵素であることが示された。 この結果はまた、 これらの遺伝子が単一の祖 先配列に由来する同族遺伝子であることを示していたので、 この内の GH F 7 E Gの 1クローン （R s 2 0 3 8 B _ l l ) を代表として用いて麹菌 （ァスペルギ ルス .ォリゼ） における発現プラスミ ドを構築した。
<実施例 5 >セルラーゼの麹菌での発現と精製
セルラーゼ遺伝子を含むプラスミ ドから、 N末端シグナル配列をコードする領 域を除いた部分を P C Rにより増幅し、ひ-ァミラ一ゼプロモーターおよび構造遺 伝子の下流に i n— f r a m eになるように連結した。 その際、 連結部分には融 合タンパク質切断のための K R G G G配列を挿入した。 作製したプラスミ ドを麹 菌プロテアーゼ二重破壊株 N S— t A p E (n i a D— s C— Δ ΐ ρ ρΑ 厶 p e p E) (根本 崇、 渡辺 泰祐、 丸山 潤一、 有岡 学、 北本 勝ひこ、 「麹菌のプ 口テアーゼ遺伝子 2重破壊株によるキモシンの生産」 日本生物工学会講演要旨集
(日本）、 pi 3 1、 （ 2006)) に形質転換し、 セルラーゼ生産株を取得した。 得られた麹菌の培養上清を硫安沈殿法 （80%飽和硫安） により濃縮後、 H i T r a p D e s a 1 t i n gおよび H i T r a p DEAE (GE h e a 1 t h c a r e) を指示書に従って用いて精製した。 H i ' T r a p D E A Eによる精製 には 50mM T r i s—HC l ( p H 8. 0 ) バッファを用い、 N a C 1によ つて 0 mMから 500 mMまでのグラジェントをかけることによってタンパク質 の分離を試みたところ、 1 30 mM付近のフラクションに S D S— P AG E上で 分子量約 4 5 k D aの単一バンドとして観測されるセルラーゼ活性のある精製タ ンパクを得た （図 2 )。 エドマン分解法によるアミノ末端配列の解析の結果、 精製 された酵素は麹菌に導入した発現プラスミ ドに由来することが確かめられた。 このタンパク質についてカルボキシメチルセルロースを基質としてセルラーゼ 活性を測定 （反応条件：クェン酸ーリン酸バッファ、 p H 6. 5、 反応時間 5分で 活性測定；温度安定性は 30分間の処理後 3 7 °C、 5分で活性測定） したところ、 至適 p Hは 6. 5 (図 3A)、 至適温度は 4 5 °C (図 3 B)、 温度安定性 40。C以 下 （図 3 C )、 K mは 1. 9 7 m g / 1、 V m a xは 76 9. 6 u n i t / m gタンパク （図 4) であった。 また、 セロオリゴ糖を 3 7。C、 2時間加水分解し たとき、 最終生産物としてグルコースとセロビオースを主要な反応性生物として 生成し、 および少量のセロ トリオ一スを生成し、 セロビオースを分解する活性は ほとんどなかった （図 5)。 ここで、 1 u n i t (ユニッ ト ； U) は、 1分あた り 1 μηιο 1のグルコース相当の還元糖を生成する酵素量として定義する。
図 4から、 本発明の酵素は、 その Vm a Xが他の酵素と比較して高く、 反応性 はより高いこと、 Kmはシロアリ 自身が合成するセルラーゼとほぼ同等で比較的 低い値を示すこと、 さらに Kmは既知タイプの酵素に近い値で親和性が高い酵素 であること、 などが判る。
さらにまた、 種々の基質、 すなわちカルボキシメチルセルロース （CMC)、 ァ ビセル （ A V i c e 1 )、 カードラン （ C u r d 1 a n )、 3種のキシラン （ X y l a n)) に対するセルラーゼ活性を測定し、 その結果を表 1に示した。 表 1 精製セルラ一ゼの様々な基質に対する活性
基質 結合の種類 比活性
(U/ragタンパク
質）
CMC , β- 1, 4 603 ± 23
Avicel β- 1, 4 0.12 土 0.003
Cur lan β- 1, 3 0.02 ± 0.003
Xylan (ブナノキ材） (3-1, 4 0.31 0.009
Xylan (力ン.バ材） β-ι, 4 0.40 土 0. on
Xylan (ォ一ト.スペル' β- 1, 4 1.6 土 0.050
h) .
アツセィは、 CMCを除いて、 37で 60分間 1.0%(wt/vol)基質を
用いて行った。
ポリマ一加水分解の 1ュニットは、 1分あたりに還元糖 1誦 ol
を遊離させる酵素活性を表わす。 表 1から、 精製した酵素は、 CMCを基質として認識すること、 結晶性セル口 一スには単体では作用せず、 ェンドグルカナ一ゼ活性が高いこと、 キシランに对 する酵素活性も低く、 セルロースに対する基質特異性が高いこと、 などの性質を もつ。
<実施 ί列 6 >セルラーゼの麹菌での発現と精製
実施例 5とは異なるセルラ一ゼ遺伝子を含むプラスミ ドから、 Ν末端シグナル 配列をコードする領域を除いた部分を P C Rにより増幅し、ひ -ァミラ一ゼプロモ —ターおよび構造遺伝子の下流に i n— f r a m eになるように連結した。 その 際、 連結部分には融合タンパク質切断のための KRGGG配列を挿入した。 作製 したプラスミ ドを麹菌プロテアーゼ二重破壊株 N S _ t A p E (n i a D— s C一 Δ t p p A Δ p e p E) (根本 崇、 渡辺 泰祐、 丸山 潤一、 有岡 学、 北 本 勝ひこ、 「麹菌のプロテアーゼ遺伝子 2重破壊株によるキモシンの生産」 日本 生物工学会講演要旨集 （日本）、 pi 3 1、 (2006)) に形質転換し、 セルラー ゼ生産株を取得した。 得られた麹菌の培養上清を硫安沈殿法 （S O%飽和硫安） により濃縮後、 H i T r a p D e s a l t i n gおよび H i T r a p P h e ιι y 1 s e p h a r o s e F F ( G E h e a l t h c a r e) 指不書に 従って用いて精製した。 H i T r a p P h e n y l s e p h a r o s e F F による精製には 50 mM 酢酸ナトリ ウム （pH6. 0) バッファを用い、 硫安 によって 1. 7 Mから 0Mまでのグラジェント （濃度勾配） を力 けることによつ てタンパク質の分離を試みたところ、 0. 3 5M付近の画分に顕著なセルラーゼ 活性のあるタンパク質画分を得た （図 6)。 このタンパク質についてセロオリゴ糖 を 3 7°C、 2時間加水分解したとき、 最終生産物としてグルコースとセロビオー スを主要な反応生成物として生成し、 セロビオースをさらに分解する活性はほと んどなかった （図 7)。
一般的にェンドグルカナーゼは、 4又は 5連続の糖鎖程度までしか分解能がな いが、 図 5および図 7から本発明の酵素は、 エンドダルカナ一ゼであっても、 ,一 般的性質として最終生産物がセロビオース · グルコース単位である可能性が強く 示唆され、糖化における効率が非常に高く工程の省力化が計れることなどが判る。 上記実施例に示されるように、 本発明者らは、 セルロース系バイオマスを高効 率に分解する 4種類のシロアリ科昆虫及び 1種類のゴキブリ昆虫の共生原生生物 群が保有する 1 40種類の新規セルロースを見出したことにより、 それらのセル' ロースを単独又は組み合わせることによって、 セルロースを高効率的に分解する ことが可能になったし、 また、 発現系として麹菌発現系を使用することによって セルラーゼの高発現が可能になった。
産業上の利用可能性
本発明により、 多数のセルラ一ゼの中から、 使用目的に応じて適するセルラー ゼを選択し、 単独で又は組み合わせて、 木質バイオマスの高度糖化、 アルコール 生産、バイオポリマーの製造などの酵素源として、或いは洗剤 ·繊維加工用製剤、 飼料添加剤、 消化剤、 バイオポリマーのなどの主成分又は補助成分として、 利用 することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . ャマ トシロアリ、 ォオシロアリ、 コゥシユンシロアリ、 ムカシシロアリ 及びキゴキブリからなる群から選択される昆虫の腸内共生原生生物群由来であつ て、 かつ、 配列番号 1 〜 1 4 0に示される塩基配列及び該塩基配列と 9 0 %以上 の同一性を有する塩基配列からなる群から選択される塩基配列によってコードさ れるアミノ酸配列を含むセルラ一ゼ酵素、 又は該酵素の 2以上の混合物、 或いは 該酵素又は混合物の処理物。
2 . 処理物が、 酵素の抽出物、 凍結乾燥物、 部分もしくは完全精製物、 又は 固定化物である、 請求項 1に記載の酵素、 その混合物又はその処理物。
3 . セルラーゼ酵素がエンドグルカナ一ゼ又はセロビォヒ ドロラ一ゼのいず れかである、 請求項 1に記載の酵素、 その混合物又はその処理物。
4 . 請求項 1に記載のセルラーゼ酵素をコードする D N A。
5 . 配列番号 1 〜 1 4 0に示される塩基配列及び該塩基配列と 9 0 %以上の 同一性を有する塩基配列からなる群から選択される塩基配列を含む、 請求項 4に 記載の D N A。
6 . 請求項 4に記載の 1つ又は複数の D N Aを含むベクタ一。
7 . D N Aの発現を制御するプロモーターをさらに含む、 請求項 6に記載の ベ々 々―
8 . 請求項 6に記載のベタターを含む形質転換細胞。
9 . 麹菌である、 請求項 8に記載の形質転換細胞。
1 0 . 麹菌がァスペルギルス ·ォリゼである、 請求項 9に記載の形質転換細 胞。
1 1 . 請求項 8に記載の形質転換細胞を培地にて培養し、 該細胞又は該培地 から請求項 1に記載の 1つ又は複数のセルラ一ゼ酵素蛋白質を単一又は混合物形 態で回収することを含む、 セルラーゼ酵素の製造方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011078262A1 (ja) * 2009-12-22 2011-06-30 株式会社豊田中央研究所 キシロースイソメラーゼ及びその利用
KR101102010B1 (ko) 2009-07-01 2012-01-04 한국생명공학연구원 신규 미생물 정읍피아 내장산에시스 및 상기 미생물 유래의 셀룰로오스 유전자
WO2016076282A1 (ja) * 2014-11-12 2016-05-19 国立研究開発法人理化学研究所 セルラーゼ賦活剤及びそれを用いたリグノセルロース系バイオマス糖化方法
WO2019044887A1 (ja) * 2017-08-30 2019-03-07 国立研究開発法人理化学研究所 新規β－グルコシダーゼ、これを含む酵素組成物およびこれらを用いた糖液の製造方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003070475A (ja) * 2001-09-03 2003-03-11 Japan Science & Technology Corp シロアリ共生原生動物由来のセルラーゼ遺伝子

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003070475A (ja) * 2001-09-03 2003-03-11 Japan Science & Technology Corp シロアリ共生原生動物由来のセルラーゼ遺伝子

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TODAKA N. ET AL.: "Shiroari Chonai Kyosei Gensei Seibutsu Cellulase no Kojikin ni yoru Seisan to sono Kosogakuteki Kaiseki", JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY 2007 NENDO (HEISEI 19 NENDO) TAIKAI KOEN YOSHISHU, 5 March 2007 (2007-03-05), pages 61 + ABSTR. NO. 2A15A12 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101102010B1 (ko) 2009-07-01 2012-01-04 한국생명공학연구원 신규 미생물 정읍피아 내장산에시스 및 상기 미생물 유래의 셀룰로오스 유전자
WO2011078262A1 (ja) * 2009-12-22 2011-06-30 株式会社豊田中央研究所 キシロースイソメラーゼ及びその利用
JP2011147445A (ja) * 2009-12-22 2011-08-04 Toyota Central R&D Labs Inc キシロースイソメラーゼ及びその利用
CN102791858A (zh) * 2009-12-22 2012-11-21 株式会社丰田中央研究所 木糖异构酶及其利用
US8772012B2 (en) 2009-12-22 2014-07-08 Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho Xylose isomerase and use thereof
CN102791858B (zh) * 2009-12-22 2014-11-26 株式会社丰田中央研究所 木糖异构酶及其利用
WO2016076282A1 (ja) * 2014-11-12 2016-05-19 国立研究開発法人理化学研究所 セルラーゼ賦活剤及びそれを用いたリグノセルロース系バイオマス糖化方法
WO2019044887A1 (ja) * 2017-08-30 2019-03-07 国立研究開発法人理化学研究所 新規β－グルコシダーゼ、これを含む酵素組成物およびこれらを用いた糖液の製造方法

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