JP2000503206A

JP2000503206A - 成長因子―多糖結合融合タンパクを使用して細胞増殖を調節する組成物および方法

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Publication number: JP2000503206A
Application number: JP9525554A
Authority: JP
Inventors: キルバーン，ダグラス・ジー; ハンフリーズ，キース・アール; ドーニー，ジェイムズ・ジー; ジャーヴィス，エリック; アリモンティ，ジュディ
Original assignee: ユニヴァーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア
Priority date: 1996-01-16
Filing date: 1997-01-16
Publication date: 2000-03-21
Also published as: IL125267A0; CA2243300A1; NZ325182A; EP0874906A1; WO1997026358A1; AU1364097A; US5874308A

Abstract

(57)【要約】成長因子依存細胞のin vitro拡大の方法および組成物を提供する。拡大は、Ｓ１因子などの成長因子とポリサッカライダーゼ結合領域とを含む成長因子複合体の使用によって遂行される。この複合体は、細胞用成長チャンバ内で、基質結合領域をポリサッカライダーゼの基質に結合させることによって固定される。

Description

【発明の詳細な説明】成長因子−多糖結合融合タンパクを使用して細胞増殖を調節する組成物および方法緒言技術分野本発明は、ポリサッカライダーゼ由来の成長因子および結合ドメインを含む融合タンパクを使用して細胞増殖を調節する組成物および方法に関する。本発明は、造血成長因子Ｓ１因子（ＳＬＦ）（hematopoietic growth factor steel fact or）と、ＳＣＦと、細胞セルラーゼ由来の結合ドメインとを含む融合タンパクを in vitroでの骨髄細胞の増殖刺激に使用することによって具体化される。背景技術バイオプロセスエンジニアリングの主な目的は、最大細胞密度および特定の細胞由来の生成物回収に必要な環境条件を提供する細胞培養方法の開発である。in vivoでは、様々な標的細胞の成長因子が細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と関連している場合が多い。主要な細胞外マトリックス成分はプロテオグリカン類で、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸という４種の主要な形がある。これのＥＣＭタンパクの結合タンパクは主としてプロテオグリカン上のグリコサミノグリカンの形によって決定される。これらの分子は、成長因子をタンパク分解的分解から保護するようであり、ＥＭＣ中の成長因子の重要な貯蔵所であると考えられる。プロテオグリカン類は豊富で且つ遍在する組織成分であり、アフィニティを有する細胞内成長因子の大部分を捕捉する公算が高い。拡散性因子と非拡散性マトリックスシグナルの複合作用は、生物体内に広く分布するサイトカインに対する細胞の限局応答に重要な機序であろうとされている。塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびインターロイキン−３（ＩＬ−３）は、ＥＣＭのプロテオグリカン類に結合したとき機能することが証明されている。 in vitroでの培養に特に興味深いのは、造血系の細胞である。in vitroでの骨髄細胞の培養や拡大には、放射線照射した予備形成ストロマ細胞支持細胞層を使用することが必要である。Dexter et al.((1993)Nature，360:709-710)は、この技術で、造血を再生することができる細胞増殖が維持されることを照射マウスで証明した。この初期の試験以来、培地に添加されるサイトカイン類の様々な組み合わせによって、培養中のヒト造血を維持するためのストローマ層が効果的に補充されると報告されてきた。１例として、成長因子依存性ＩＬ−３細胞株およびＧＭ−ＣＳＦ細胞株の場合、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦの固定に市販の人工ＥＣＭが使用されてきた。固定されたヘパリン硫酸を使用してマトリゲル(Matrige l)を補充することができる。さらに、数種の因子または因子の組合せを互いに置換して、類似した標的細胞受容体を得ることができる。１例として、支持細胞層の代わりにＳ１因子（steel factor：ＳＬＦ）、ＳＣＦまたは顆粒球コロニー刺激因子Ｇ−ＣＳＦプラスＩＬ−３を使用してＬＴＣ−ＩＣの維持を支援することができるが、比較的高濃度の因子が必要である。しかし、ＩＬ−３受容体の表面発現は、高濃度のＩＬ−３に応答してダウンレギュレートされる。一般に、Ｇ− ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を単独で、あるいは組み合わせて産生するようにトランスフェクトされた工作ストロマ細胞は、ＬＴＣ−ＩＣ培養の維持を有意に増強することも証明されている。一部の進行した癌患者では、養子免疫療法用Ｔ細胞のin vitro拡大により腫瘍が緩解した。この技術を用いて、癌患者からＴ細胞を取出し、培養で拡大させる。いったん十分な数の細胞が産生されたら、患者に導入し直す。in vitroで活性Ｔ細胞を拡大するのに対する主な障害は、従来の組織培養法を使用した培養の処理が複雑で高価なことであった。さらに、高濃度のＩＬ−２などの成長因子をＩＬ −２依存性細胞に加えるとき、ＩＬ−２濃度が上昇するに連れて細胞表面上のＩＬ−２受容体はダウンレギュレートを受ける。この問題を和らげるために、ＣＴＬＬ細胞のＩＬ−２依存性増殖増進にリポソームが使用されてきた。２０ｎＭの脂質をリコンビナントヒトIL-2と一緒に使用すると細胞増殖が大いに増進し、増殖は低用量のＩＬ−２で最も顕著であった。ＩＬ−２飽和用量で、リポソームは有意な作用を示さなかった。さらに、120nMより高い脂質濃度では、増殖を阻害することがわかった。ex vivo拡大技術用の別の造血細胞はＴリンパ球を必要とする。養子免疫療法のためのリンフォカイン活性化キラーＴ細胞を拡大するための透析灌流バイオリアクターも使用されてきた。還流バイオリアクターまたは標準組織培養プレートで産生された細胞では、倍加時間、表面分子表現型および細胞溶解活性は類似していた。ＳＬＦならびに多数の他の成長因子は、非特異的にプラスチックに吸着したとき、接着因子の役割をすることができ、原始前駆細胞の増殖を刺激すると報告されている（Long et al．(1992)J.Clill.Invest.90:251-255）。しかし、このような固定方法では、成長因子が正しい配向で存在することが保証されない。極性アフィニティタグは正しい配向での接着を容易にするが、ヘキサヒスチジン(Smi th et al.(1988).Biol.Chem.263:7211-7215)，ストレプトアビジンStreptavidin (Kasher et al.(1986)Mol．Cell.Biol.6:3117-3127)，またはＧＳＴ(Smith and Johnson(1988)Gene 67:3140)など、一般に使用されるアフィニティタグは、そのほとんどがin vitro培養条件に抵触する可能性のあるマトリックスに依存する。したがって、幹細胞および他の因子に依存性の細胞群を連続的に拡大する、体内に治療的に再注入するための細胞をin vitro培養するシステムを開発することは興味深い。特に興味深いのは、関心事の各細胞形に合せて調整された成長因子混合物を調製する必要性をなくすために、またシステムを使用する経費を低減するために、単一の回収可能な成長因子を使用するシステムを開発することである。関連文献成長因子が吸着されるか共有結合で付着された、表面加水分解ポリ（メチルメタクリレート）フィルム(Ito et al.,(1992)Biomaterials 13:789-794)、またはガラスビーズ（Ito et al.(1992)Biotechnology and Bioengineering 40:1271 -1276)などの人工マトリックスが、成長している細胞の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のin vitroでの補充に使用されてきた。固定されたインスリン(Liu et al .(1992)Biomaterials 13:50-58)、トランスフェリン(Liu et al.(1993)Internat ionalＪ.Biological Macromolecules 12:449-453)、およびインスリン、トランスフェリンおよびコラーゲン（Ito et al.(1991)Biomaterials 12:449-453）を使用して、様々な程度の成功をおさめてきた。米国特許第５，３４０，７３１号、米国特許第５，２０２，２４７号および米国特許第５，１３７，８１９号には、セルロースおよび1,4-β−グリカン結合ドメインに関連した組成物および方法が記載されている。セルロース結合ドメインタンパク（「スカフォールドタンパク」）について記載されているＰＣＴ出願PC T/US94/04132号も参照されたい。発明の概要本発明は、固定された成長因子を使用して、成長因子依存細胞を分離する、および／または成長因子依存細胞の増殖を刺激もしくは阻害する方法および組成物を提供する。組成物は、細胞表面結合タンパクおよびポリサッカライダーゼ由来の基質結合領域および結合タンパクに結合するリガンドを含む成長因子複合物を含む。基質結合領域は、ポリサッカライダーゼの加水分解活性が実質的に欠如していることが好ましい。成長因子依存細胞のin vitro拡大の方法も提供する。この方法は、成長因子の細胞表面受容体を含む細胞を成長因子複合体と接触させて成長させることを含む。成長因子依存細胞が多い細胞個体群を得るために、複数の細胞を成長因子複合体に接触させた後、細胞表面受容体が欠如しているあらゆる細胞を除去する。場合に応じて、細胞を複合体または基質からはずすことができる。場合に応じて創傷カバーに結合させた成長因子複合体と創傷を接触させることにより、成長因子複合体を使用して創傷治癒を亢進することができる。図面の簡単な説明図１は、セルロース結合ドメインの共通配列を示す図である。C.fimiセルラーゼ（CenAおよびCex）のセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）のアミノ酸配列、およびMbCelA(Microbiospora bisporaのエンドグルカナーゼ）、ClfX（翻訳されたCe llulomonas flavigena遺伝子フラグメントのオープンリーディングフレームの一部）、Pfegl（Pseudomonas fluorescens var.cellulosaのエンドグルカナーゼ）、およびBfeglI（Butyivibria fibrisolvensのエンドグルカナーゼ）の推定的結合ドメイン。アミノ酸残基を、１文字コードで示す。肉太の大文字はCenA配列との相同を示し、単純な大文字は他の６つの配列内のみに現れる相同を示す。小文字は相同性が存在しないことを示す。＊は成熟酵素のアミノ末端を示す。＊＊＊は、相応するＤＮＡ配列の停止コドンの出現から推理されるカルボキシ末端を示す。−は、配列を改良するために残されたギャップを示す。数字は、それぞれのラインの開始および末端の残基を指す。CenA残基、Cex残基、およびPfxynA残基は、リーダーペプチド処理の部位が決定されていないため、未処理ポリペプチドの開始から番号をつけた。ClfXには、C.flavigena遺伝子フラグメントオープンリーディングフレームの開始から番号を付けた。図２は、ＳＬＦ-ＣＢＤ融合タンパクおよびコントロールを示す図である。ネズミＳ１因子(murine steel factor)（図２Ａ）の細胞外ドメインを使用して、エキソグルカナーゼCex（図２Ｂ）の触媒ドメインを置き換え、融合タンパクSLF -CBD(図２Ｃ）を作った。ネズミＳ１因子のリコンビナント細胞外ドメインを陽性コントロールとして使用し（図２Ｄ）、ＣＢＤ_cexを陰性コントロールとして使用した（図示せず）。＊融合接合部の細部。下線をつけたアミノ酸は、天然のＳＬＦ配列である。図３は、大腸菌(Escherichia coli)におけるＳＬＦ-ＣＢＤ融合タンパクの高レベル発現に使用された発現ベクターの起源であるpTugA発現ベクターのグラフによる表現である。pTugAを使用すると、高レベル誘導転写、ＲＮＡ翻訳増進、ポータビリティ、多数のコピー、安定性および融通性が得られる。pTugベクターは、コピー数を増大するためにｐＵＣ13由来の変異体ｐＭＢｌori(Minton et al .Focus(1988)10:56)、LacIqにより強く抑制される、強くかつ高度に誘導可能な（ＩＰＴＧにより）tacプロモータ（Ｐ_tac）を含む。Ｐ_tacとlacIqの一定の比率を維持し、Ｅ.coli宿主と関係なく十分なレベルのリプレッサーを確保するために、lacIq対立遺伝子がpTugベクターに組込まれる。gene 10翻訳エンハンサー（ Olins et al.Gene(1988)73:227）もpTUgに組込まれる。Ｅ.Coli上清からリコンビナントポリペプチドを回収できるように、C.fimiのエンドグルカナーゼＡ（Ce nA）をベクターに組込んだ。図３Ａは、NcoI−HindIII領域のヌクレオチドおよびコード化されたアミノ酸配列、ならびに遺伝子１０翻訳エンハンサー（「ｇ１０」）およびCenAリーダー配列（「リーダー」）を含む、NcoI部位の上流領域のヌクレオチド配列を示す図である。図３Ｂは、pTugAベクター地図を示す図である。図４は、pTugASのグラフによる表現である。図４Ａは、SacI−HindIII領域のヌクレオチドおよびコード化されたアミノ酸配列、ならびにSacI部位の上流領域のヌクレオチド配列を示す図である。図４Ｂは、pTugASベクター地図を示す図である。図５は、pTugE07K3の構築を示す図である。アンピシリン耐性の選択的マーカーの代わりにカナマイシン耐性の選択的マーカーを担持するpTugAの誘導体 pTugKを、NcoIで完全に消化した。付着末端をEscherichia coli ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）で修復し、平滑末端制限部位を作製した。一部変更したpTugKベクターをHindIIIで完全に消化し、４．２kbpフラグメントを分離した。ｐＴＺＥ07（Ong et al.Biotechnol.Bioeng.(1993)42:401-409）をBamH Iで完全に消化し、付着末端をEscherichia coli ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）で修復し、平滑末端制限部位を作製した。一部変更したｐＴＺＥ07をHindIIIで完全に消化し、２．１kbpフラグメントを分離した。４．２kbp フラグメントおよび２．１kbpフラグメントを連結してpTugE07K3とした。図６は、pTugKN1の構築を示す図である。pTugE07K3をNheIおよびHindIIIで完全に消化し、ＣＢＤ_Cexを含む１．８kbpフラグメントおよび４．５kbpフラグメントを分離した。、オリゴヌクレオチド５'-ＴＴＡＣＣＴＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣＣＣＧＡＴＣＧＧＧＧＡＧＧＧＡＡＣＧ-３'を使用して、ＣＢＤ_N1をコード化している遺伝子フラグメントの５'末端および３'末端に、適当な制限部位をcb dN1の５'末端におけるサイレント突然変異として、ＰＣＲを使用して導入した。オリゴヌクレオチド５'−ＡＧＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴ−ＡＧＡＧＣＴＣＧＡＣＣＴＣＧＧＡＧＴＣ-３'を使用して、cbdN1の３'末端にHindIII部位を導入した。このプライマーには、翻訳停止コドンも含まれていた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物（総体積５０μl）は、５０ｍＭトリス-HCl緩衝液、 pH ８．３中に１０〜１０0ngの鋳型ＤＮＡ（pTZ-JC3）(Coutinho et al.Mol.Mic robiol.(1992)6：1243-1252)、２５〜５０pmole（３００ng）のプライマー、２ｍＭ MgCl₂、６％ジメチルスルホキシド、０．２ｍＭ２'-デオキシヌクレオチド５'-トリホスフェートおよび１単位のTaq ＤＮＡポリメラーゼが含まれていた。連続２８サイクルを次の通りに実施した。９４℃で１５秒間の変性、５７℃で１．４分間のアニーリングおよび７２℃で１．５分間のプライマー延長。このようにして得られたcbdN1 ＰＣＲフラグメントをNheIおよびHindIIIで完全に消化し、０．５kbpフラグメントを沈降によって精製した。４．５kbpフラグメントと０．５kbpフラグメントを連結してpTugKN1とした。図７は、pTugKN1ベクターを示す図である。pTugKN1ベクターは、アンピシリン耐性の選択的マーカー（β−ラクラマーゼコード化配列）を、カナマイシン耐性の選択的マーカーと置き換えることによってpTugAベクターから誘導される。C.f imiのエンドグルカナーゼＡ（CenA）リーダーペプチドをコード化している配列を、C.fimiのエキソグルカナーゼ（Cex）のリーダーペプチドのコード化配列と置き換えた（Ong et al.Biotechnol.Bioeng.(1993)42:401-409）．図８は、ＳＬＦ-ＣＢＤ融合タンパクの精製を示す図である。ＳＬＦ-ＣＢＤは、その２種のアフィニティタグのいずれかを使用して精製することができる。図８Ａは、セルロースによるＳＬＦ-ＣＢＤの精製を示す図であり、レーン１はマーカー、レーン２は、コンディションド成長培地、レーン３はAvicel ５mgに吸収することによってコンディションド成長培地５mlから回収された融合タンパク、レーン４は細胞周辺抽出物、レーン５はAvicel ５mgにより細胞周辺抽出物１m lから直接抽出された融合タンパクである。図８Ｂはヘキサヒスチジンタグを使用したニッケルセファロースによるＳＬＦ-ＣＢＤの精製を示す図であり、レース１はマーカー、レーン２は融合タンパク溶離ピークである。図９は、ＳＬＦ-ＣＢＤのＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を示す図である。精製融合タンパクの同一性をウエスタンブロット分析で確認した。図９ＡはＳＬＦ-ＣＢＤのＳＤＳ-ＰＡＧＥ（クマシーブルー染色）を示す図であり、レーン１はマーカー、レーン２は予め染色したマーカー、レーン３は精製ＳＬＦ-ＣＢＤ１μｇ、レーン４は因子Ｘａで切断したＳＬＦ-ＣＢＤ２０ng（ゲル上では見えない）、レーン５はリコンビナントコントロールＳＬＦ１０ng（ゲル上では見えない、暗いバンドはＢＳＡである）、レーン６はＣＮＤ_cex ５００ng、レーン７はベクターのみの細胞抽出物（陰性コントロール）である。図９Ｂは、抗ＳＬＦポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットを示す図である（レーン呼称は図９Ａと同じであった）。図９Ｃは抗ＣＢＤポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットを示す図である（レーン呼称は図９Ａと同じであった）。図１０は、溶液中のタンパクの活性および活性の中和を示すである。固定されたマトリックの非存在下における融合タンパクおよびコントロールタンパクの増殖活性を分析した（ＭＴＴアッセイ）（図１０Ａ）。０．６nM ＳＬＦ-ＣＢＤの活性を抗ＳＬＦ中和ポリクローナル抗体で中和した（図１０Ｂ）。ベースラインＭＴＴ活性である０．２吸光度単位を減算した。図１１は、ＳＬＦ-ＣＢＤ活性をＢＭＣＣ濃度の関数として示す図であり、ＢＭＣＣ濃度は変化させ、ＳＬＦ/ＣＢＤ濃度は１３０ｐＭ（図１１Ａ）か１５００ｐＭ（図１１Ｂ）で一定に保った。図１２はＳＬＦ-ＣＢＤの活性をＢＭＣＣ濃度の関数として示す図である。各ウェルに加えたＳＬＦ-ＣＢＤの濃度は変化させ、ＢＭＣＣ濃度は指示された濃度で一定に保った。図１２Ａは１μgl/ml ＢＭＣＣを含む、または含まないＳＬＦを示す図である。図１２Ｂは１μg/lm ＢＭＣＣまたは１４μg/ml ＢＭＣＣのいずれかを含む、または含まないＳＬＦ-ＣＢＤを示す図である。図１３は、マトリックスに結合したタンパクとマトリックスに結合していないタンパクとの分離を示す図である。様々な量のＳＬＦ-ＣＢＤを１μg/mlのＢＭＣＣに結合させた。マトリックスを溶液から遠心分離で除去し、新鮮な培地に再懸濁した。マトリックスに結合したタンパクの量を決定するために、最初の培地および再懸濁したＢＭＣＣの活性を分析した。ＳＬＦを使用した場合、活性の大部分は上清中にあり（図１３Ａ）、ＳＬＦ-ＣＢＤを使用した場合、活性の大部分はＢＭＣＣと関連していた（図１３Ｂ）。ＳＬＦ/ＣＢＤのセルロースアフィニティタグを因子ＸａでＳＬＦから切断したとき、活性はもはやＢＭＣＣと関連していなかった（図１３Ｃ）。図１４は、再生セルロースに結合したＳＬＦ-ＣＢＤの活性を示す図である。セルロース被覆微量滴定プレートにＳＬＦ-ＣＢＤを結合させ、上清を各ウェルから除去し、培地を補充した。細胞をプレートに加え、各ウェルに結合したままの活性を前述の通りに分析した（図１４Ａ）。上述の通りにセルロース被覆微量滴定ウェルにＳＬＦ-ＣＢＤを結合させ、ウェルを連続３回の細胞培養に使用した。３回使用後の培養のＭＴＴアッセイで、増殖活性の損失が全くないことがわかる（図１４Ｂ）。第３サイクルまで細胞を加えなかったこと以外は、同様にコントロールプレートを処理した。図１５は、セルロースに結合したＳＣＦ-ＣＢＤに応答して増強したネズミ骨髄細胞の増殖を示す図である。図１５Ａは、セルロースの存在下（ｂおよびｄ）またはセルロースの非存在下（ａおよびｃ）で、ＳＣＦ（ａおよびｂ）またはＳＣＦ-ＣＢＤ（ｃおよびｄ）を含有する液体培養中に５日間維持したとき、一次ネズミ骨髄細胞によって形成されたコロニーの数を示す。並行シリーズの培養は、さらに、ＩＬ３を含んでいた（詰った棒）。図１５Ｂは、液体培養をプレートに移した後のコロニーサイズを示し、目盛りの棒は１ｍｍを表す。プレートの写真は、セルロースを含むＳＣＦ-ＣＢＤによって刺激された細胞によって形成された大コロニーを示す（プレーティング）。図１６は、ＰＢＤ_N1の陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。部分的に精製したＰＢＤ_N1（２００ml中に１５０ng）を、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０で平衡化した陰イオン交換カラム（MonoQ）に充填した（１ml/分）。ｐＨ６．０の緩衝液２００mlでカラムを洗浄した後、塩勾配（６００ml、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ 6．０中０〜１Ｍ NaCl）を使用して、結合タンパクを回収した（８ml分画）。ＰＢＤ_N1が、カラムから３００ｍＭ塩中に回収された（ピーク１）。汚染タンパクはよりしっかり結合していたため、より高濃度の塩に回収された（ピーク２）。図１７は、培養上清から精製中のＰＢＤ_N1のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示す図である。pTugKN1を含むJM101の培養上清（誘導）（レーン２）、全培養懸濁液（細胞およびブロス）（レーン３）、培養上清中のタンパクを結合した後のAvicel分画（レーン４）、上清をAvicelに結合した後のフロースルー分画（レーン５）、Ｈ２０でAvicelから溶離した分画（レーン６）、およびMonoQ精製後のＰＢＤ_N1 （レーン７）を、１２．５％アクリルアミドを含むゲルで分析した。分子質量標準（レーン１）は表示通りである、図１８は、ＰＢＤ（ＰＢＤ_N1およびＰＢＤ_N1N2）解析用のアフィニティ電気泳動ゲルを示す図である。精製ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（レーン１）、ＰＢＤ_NI（レーン２）およびＰＢＤＮＩ（レーン３）の可溶性オリゴ糖への結合を、１３％アクリルアミドを含む未変性ゲルで分析した。オリゴ糖非存在下（−）のゲルの移動と比較して、多糖（０．１w/vヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）またはオオムギグルカン）存在下（＋）でのゲルの減速は結合を示す。キシランを非結合多糖として使用する。各タンパク５μｇを各ゲルに負荷した。図１８Ａは、オオムギβ−グルカンの存在下（＋）と非存在下（−）での結合を比較する。図１８Ｂは樺のキシランの存在下（＋）と非存在下（−）での結合を比較する。図１９は、ｐＨ７、３５℃の５０ｍＭリン酸緩衝液中、ＣＢＤ_N1へのヒドロキエチルセルロースの結合に関する等温滴定微量熱量測定データを示す図である。図２０は、ｐＨ７、３５℃の５０ｍＭリン酸緩衝液中、ヒドロキシエチルセルロースとPluronlc P105の混合物に関する予備相平衡データを示す図である。図２１は、pTZ-JC13の構築に使用されるベクターを示す図である（図２１Ｃ）。図２１Ａは、ＰＢＤ_N1をコード化しているフラグメントを得るために使用した、全CenCをコード化している遺伝子フラグメントを含むpTZ-JC2を示す。図２１Ｂは、CenAコードフラグメントを得るために使用したベクターpUC18- 1.6 cenAΔＰＴを示す。図２２は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を使用した、CenAおよびＰＢＤ_N1-CenA融合タンパクからのタンパク分解生成物の分析結果を示す図である。各ポリペプチド８ μｇを、C.fimlプロテアーゼを０単位（レーン５および９）、０．１単位（レーン４および８）、０．５単位（レーン３および７）または１．０単位（レーン２および６）を含むリン酸緩衝液、ｐＨ７．０（５０ｍＭ）５０pl中、３０℃で３時間インキュベートした。１２．５％アクリルアミドを含有するゲルで反応生成物を分析した。分子質量マーカー（レーン１）は表示の通りである。Ｐ３０は、セルロース結合ドメインをタンパク分解的に除去した後の、CenAの触媒ドメインに相応する(Gilkes et al.,J.Biol.Chem(1988)263:10401-10407)。図２３は、セルロースへの分画吸収によってCenAとＰＢＤ_N1-CenAを分離した後、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を使用して未吸収ポリペプチドを分析した結果を示す図である。図２３Ａは、ポリペプチド２５μｇ（レーン２および３）、１００μ ｇ（レーン４および５）、または２５０μｇ（レーン６および７）を含み、細菌の微晶質セルロース（bacterail microcrystalline cellulose：ＢＭＣＣ）を含む場合と（＋）ポリペプチドとＢＭＣＣを含まない場合の（−）、緩衝液の部分標本をインキュベートした結果を示す図である。図２３Ｂは、リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）とのＢＭＣＣインキュベーション混合物（＋）由来の未吸収分画を含有する上清をインキュベートした結果を示す図である。ＰＡＳＣを加えない（−）コントロール試料を用いた結果も示す。図２４は、２種の脱着可能な標識組成物およびセルロース基質から成長因子複合体を酵素的にはずす手段を示す図である。矢印は成長因子部分を示し、アウトライン型の箱は特定のプロテアーゼのプロテアーゼ切断部位を示し、平行線を施した箱セルロース結合ドメインを示す。詳細な実施態様の説明本発明は、成長因子依存細胞、特に幹細胞やＴ−リンパ球など、造血系細胞を ex vivo培養するための方法および組成物を提供する。この組成物には、成長因子受容体および／または成長因子受容体含有細胞の分離、および自然治癒にも、用途がある。この組成物は、成長因子および多糖基質に結合することができるアミノ酸配列を含むキメラ分子を含む。成長因子は、成長因子の結合する対象である細胞表面受容体を有する関心事の標的細胞の増殖または分化を刺激もしくは調節することができる因子、一般にポリペプチドを意味する。関心事の標的細胞は、成長因子による刺激に応答して増殖および／または分化する任意の細胞である。アミノ酸配列は一般に高いアフィニティで、β−グリカン、特にセルロースやキチンをはじめとするβ-1,4-グリカン類など、オリゴ糖ポリマーに結合する。使用に際して、可溶性であっても不溶性であってもよい多糖基質上にキメラ分子を固定し、成長因子依存細胞をキメラ分子と接触させて成長させる。この方法は、幹細胞や巨核球などの造血細胞、他の骨髄細胞や血球、神経細胞、およびＴ細胞を含め、成長因子依存細胞のin vitro培養に有用である。固定された成長因子を使用すると、非固定成長因子ならびに成長因子、および細胞の成長、分化、および増殖を調節する他の生物学的分子の固定に現在使用されている方法に勝る長所が幾つかある。たとえば、固定された成長因子は、細胞増殖に連続した限局的刺激を与えることができる。細胞に吸収され、消費される非固定成長因子と違って、固定された成長因子は、細胞に消費されない基質に結合したままであり、したがって、別の細胞の成長を依然として刺激することができる。このことは、長期細胞増殖を可能にするために成長培地を連続的に加えて除去する灌流培養に特に有用である。さらに、固定された成長因子は、可溶性バージョンの成長因子より活性な場合が多い。本発明が提供する別の長所を以下に示す。セルロースおよびカラス麦やオオムギから得られるような他のβ−グルカン類など、炭水化物ポリマーを含むオリゴ糖ポリマーは、豊富であり且つ安価である。さらに、様々なタンパクが炭水化物ポリマーや他のオリゴ糖に特異的に結合するため、本発明の多糖結合タンパク（ＰＢＰ）源として使用することができる。１例として、融合タンパクを固定する手段として、炭水化物に結合するタンパクの炭水化物ポリマー結合タンパクを含む融合タンパクを調製することができる。それ故、ＰＢＰを使用すると、成長因子または関連部分を多糖に結合することができるＰＢＰに付けることによって、任意の成長因子または関連部分を固定する一般的な手段が得られる。ＰＢＰをオリゴ糖ポリマーに選択的に結合させことは、広く様々な化合物の精製および／または固定に特に適している。本発明は、成長因子依存細胞が多い細胞個体群を得る方法も提供する。この方法は、たとえば、幹細胞（多能性幹細胞を含む）や他の比較的珍しい細胞型の精製製剤を得るのに有用である。この方法は、複数の細胞を細胞因子複合体と接触させ、細胞表面受容体が欠如しているあらゆる細胞を除去することを含む。関心事の成長因子の受容体を有する細胞は成長因子複合体に特異的に結合するが、他の成長因子非依存細胞は、さほどの量が成長因子複合体に結合しない。結合した細胞は、成長因子複合体に依然として結合している間、使用することができ、あるいは、成長因子複合体から細胞を溶離して、成長因子依存細胞の精製製剤を得ることができる。場合によっては、応答細胞の増殖を優先的に増進する成長因子複合体による特異的成長刺激によって濃厚化することができる。本願明細書に記載の成長因子は、創傷の治癒亢進に使用することもできる。この場合、創傷治癒に関与する細胞の増殖を刺激し、且つ／またはこのような細胞が走化性を示す薬剤を含む成長因子複合体と創傷を接触させることによって行われる。場合に応じて、成長因子複合体は、創傷カバー、好ましくはスポンジや綿の包帯など、不溶性セルロースマトリックスを含むカバーに結合している。本発明は、次式：ＰＢＰ-ＭＲ-Ｘ（１）を有するものを含むことができる新規ポリペプチド組成物を提供する。式中、ＰＢＰはポリサッカライダーゼまたは多糖基質に結合してポリサッカライダーゼの基質に高アフィニティ結合を提供する他のタンパクの基質結合領域のアミノ酸の連続配列と見なされ、場合に応じて、ポリサッカライダーゼ活性の実質的欠如は、多糖を結合するのに必要な配列中のアミノ酸の最小数と少なくとも同じぐらいである。ＭＲは中央領域であって、炭素原子が２〜３０個の短い連結基の結合であってもよく、または炭素原子を約２〜約２０個有してもよい。この領域は、成長因子複合体を含む融合タンパクの特異的切断を提供するアミノ酸配列、通常はIgA1プロテアーゼまたは因子Ｘａなど特異性の高いタンパク分解酵素によって認識されるものに相応する配列を含むことができる。Ｘは、任意の成長因子であってもよく、または細胞表面受容体に結合することによって、細胞増殖または活性化を刺激または抑制する他の部分であってもよい。Ｘは、関心事のポリペプチドの全配列まで具有するとみなされる。Ｘは、細胞増殖に対して望ましい作用を発揮するのに必要なポリペプチドの部分のみを有する。Ｘは、たとえば、サイトカイン、リンホカイン、または他の成長因子であってもよい。たとえば、適当な成長因子としては、Ｓ１因子、インターロイキン− ２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−１１、マスト細胞成長因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、または表皮成長因子などがある。Ｘは部分の化学量論ではなく、部分のみを示し、不定であってもよい。ＰＢＰ-ＭＲ-Ｘは、分離されたＸの受容体Ｒ、またはＲを含む細胞に結合していてもよく、その組成物は、式：ＰＢＰ-ＭＲ-Ｘ:Ｒ（２）を有し、式中、Ｒは細胞表面上に存在し、且つ相応するリガンド（Ｘ）に接触すると、Ｒに特異的に結合する任意の部分であってもよい。ＲおよびＸは、特異的結合対の、それぞれ第１メンバーおよび第２メンバーである。一般に、ＸとＲとの間の相互作用は、静電気、水素結合、極性／非極性相互作用等々、非共有結合である。Ｒは、たとえば、成長因子受容体、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリン、またはＭＨＣポリペプチドであってもよい。特異的結合対の第１メンバーの第２メンバーへの特異的結合は一般にアフィニティが高く、すなわち、Ｒが成長因子受容体のとき、およそ１０^-8〜１０^-11Ｍ程度である。本発明で使用される特異的結合対の特徴は、第１メンバーと第２メンバーとの相互作用が、直接または間接に、第１メンバーが存在する細胞に影響を及ぼすことである。たとえば、第２メンバーが成長因子であり、その相応する受容体が第１メンバーである結合対の相互作用は、細胞を増殖させることができる。このような増殖誘導成長因子の例は、Ｓ１因子、上皮成長因子、神経成長因子、脳由来神経親和性因子、エリトロポイエチン、ＧＭ-ＣＳＦ、インターロイキン類（ＩＬ-2およびＩＬ-3などを含む）、等々である。他の特異的結合対のメンバーとの相互作用は、細胞の活性化または不活化を引起こす可能性があり、細胞を分化させることができる。たとえば、適切なＭＨＣポリペプチドはＴ細胞受容体と相互に反応して、Ｔ細胞群のクローンエネルギーを誘導することができる。他の結合対は、細胞移動を支配する走化性シグナルの役割をする。好中球や線維芽細胞に対する血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、Ｔリンパ球（特に活性化ＣＤ４⁺Ｔリンパ球）に対するＩＬ-２、Ｔ細胞（ＣＤ４⁺とＣＤ８⁺の両者）ならびに未活性化Ｔ細胞に対するインスリンを含め、幾つかの成長因子に対して、それぞれの標的細胞が走行性を示すことが判明している。この特徴は、創傷治癒で活用されてきた。走化性部分の他の例には、インテグリン類、ＬＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ− ３、Ｈ−ＣＡＭ、ＥＬＡＭ−１、および他の相応する受容体またはリガンドなど、細胞接着受容体が含まれる。特異的結合対のいずれかまたは両者は、ポリペプチドおよび／または炭水化物を含んでもよい。本発明に有用な炭水化物には、シアリル-Lewis^x（SLe^x）および細胞接着およびシグナル送信に関与する他の炭水化物部分など、リガンドに特異的に結合するものが含まれる。たとえば、ポリサッカライダーゼ基質結合領域に結合したSLe^xのリガンドを含む複合体（ＥＬＡＭ-1など）は、細胞表面上でSL e^xを示す細胞の精製、およびSLe^x含有オリゴ糖およびそのようなオリゴ糖が結合しているタンパクの精製にも有用である。あるいは、SLe^xなどの炭水化物リガンドは、ポリサッカライダーゼ基質結合領域に完全に結合することができ、このような複合体は、SLe^xを結合するリガンドを細胞表面に示す細胞を引き付けるのに有用である。これらの複合体を創傷カバーなどの多糖担体に固定すると、たとえば、感染との戦いに関与する細胞を創傷に向ける方法を提供する。成長因子複合体は天然の成長因子または他の細胞調節因子全体を含む必要はない。複合体は、所望の生物学的活性を保持する分子の一部分を含むだけで十分である。たとえば、ポリペプチド成長因子の場合、未変性の、天然の成長因子内に存在する貫膜ドメインを含まない成長因子複合体の構築に有利である。このような貫膜ドメインの同定は、貫膜領域または他の望ましくない領域が欠如した、切られた成長因子分子を得る方法であるため、当業者に周知である。Ｓ１因子の場合、たとえば、アミノ酸１８９個の細胞外領域は、細胞増殖の刺激にとって特に興味深い。このように、アミノ酸２５個のシグナルペプチド、アミノ酸２３個の疎水性膜アンカー、アミノ酸３６個の細胞質ドメインをコード化する部分をＳ１因子遺伝子(steel factor gene)から削除することにより、Ｓ１因子複合体を構築することができる(Huang et al.(1990)Cell 63:225-233;Flanagan et al. (1990)Cell 63:185-194,およびMartin et al.(1990)Cell 63:203-211）。幾つかの用途で、二機能複合体が使用される。二機能複合体は、ＰＢＰに付いた１種より多い成長因子、通常は２種の成長因子を含む。この複合体は、特異的結合対の第１の第２メンバーに加えて、結合対の第２の第２メンバーを含む。第２の第２メンバーは一般に第１の第２メンバーと異なる成長因子である。第１のメンバーと第２のメンバーは両者ともＰＢＰに付いている。このような二機能成長因子複合体は、Ｓ１因子および１種以上の成長因子、好ましくはＩＬ−３、ＩＬ−１１、ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＥＰＯなど、Ｓ１因子が相乗的に作用する成長因子が結合しているＰＢＰである。ＰＢＰは、ポリサッカライダーゼの基質結合領域（ＳＢＤ、本願明細書では多糖結合ドメイン（ＰＢＤ）とも呼ぶ）由来のアミノ酸配列を含む。多糖結合ペプチドは、オリゴ糖ポリマーに結合する任意のアミノ酸配列を含んでもよく、たとえば、ＰＢＰはポリサッカライダーゼのＳＢＤ、多糖結合タンパクの結合ドメインまたは多糖に結合することができるようにデザインされ、工作されたタンパクに由来してもよい。ＰＢＰは、天然であっても合成であってもよい。ＰＢＰまたはＳＢＤを得ることが可能な適当なポリサッカライダーゼには、β-14-グルカナーゼが含まれる。好ましい実施態様で、セルラーゼのＰＢＰまたはＳＢＤが使用される。一般に、このアミノ酸配列はポリサッカライダーゼの加水分解活性が実質的に欠如しているが、基質結合活性は保持している。このアミノ酸配列は、好ましくは未変性ポリサッカライダーゼの加水分解活性の約１０％未満、さらに好ましくは約５％未満、最も好ましくは未変性ポリサッカライダーゼの加水分解活性の約１％未満の加水分解活性を有する。ＰＢＰは、本発明で用途を見つけることができるオリゴ糖に結合する酵素を含め、様々な起源から得ることができる。下表５は、可溶性グルカン類に対してアフィニティを有する（∝:、β、および／または混合連結）すべての結合ドメインを含む、１種以上の可溶性／不溶性多糖類に結合する結合ドメインの一覧表である。C.fimiのエンドグルカナーゼCenCのＮ１セルロース結合ドメインは、可溶性セロサッカライドを結合することが判明している唯一のタンパクであり、且つ可溶性多糖類を結合することが判明している一組のタンパクの１つである。また、表１〜４は、推定されるβ-1,3-グルカン結合ドメインを含むタンパク（表１）、連鎖球菌のグルカン結合反復を含むタンパク（Cplスーパーファミリ）（表２）、キチン結合ドメインを含む酵素（表３）、およびデンプン結合ドメイン（表４)の例の一覧表である。Clostlridium cellulovoransによって産生されるようなセルロース結合ドメインタンパクを含むスカフォールドタンパク（Shoseyov e t al.,ＰＣＴ/ＵＳ94/04312)も、ＰＢＰの調製に使用することができる。Tricho derma種などを含め、若干の真菌もポリサッカライダーゼを産生し、それからＰＢＰを分離することができる。表１推定されるβ-1,3-グルカン結合ドメインを含むタンパクの概観表２連鎖球菌グルカン結合反復を含むタンパク（Cplスーパーファミリー)の概観興味深い結合特性および特異性を有する新規ＰＢＰを、ＮＭＲ分光学(Zhu et al.Biochemistry(1995)34:,Gehring et al.Biochemistry(1991)30:5524- 5531)、ＵＶ差分光学（Belshaw et al.Eur.J.Biochem.(1993)211:717-724）、蛍光（滴定）分光学（Miller et al.J.Biol.Chem.(1983)258:13665-13672）、ＵＶまたは蛍光ストップトフロー分析（De Boeck et al.Eur.J.Biochem.(1985)149:1 41-415）などの分光学的（滴定）方法、固定された単糖類またはオリゴ糖を用いたアフィニティ電気泳動法（Mimura et al.J.chromatography(1992)597:345-350 ）やアフィニティクロマトグラフィなどのアフィニティ法、濁度測定分析や比濁法を含む沈降分析または凝集分析（Knibbs etal.J.Biol.Chem.(1993)14940-1494 7)、競合阻害アッセイ（定量的IC50測定を含むか含まない）、および示差走査熱量分析法や等温滴定を含む様々な生理学的方法または生理化学的方法（Sigurskj old et al.J.Biol.Chem.(1992)267:8371-8376; Sigurskjold et al.Eur.J.Biol(1994)225:133-14）またはオリゴ糖の存在下または非存在下で熱ＣＤまたは蛍光分光学を使用した比較タンパク安定性アッセイ（溶融）などを含め、様々な方法で同定し、スクリーニングすることができる。一般に、固定された成長因子の構築に使用する場合、ＰＢＰをオリゴ糖に結合するＫ_aは、少なくとも弱い抗体−抗原抽出、すなわち、≧１０³、好ましくは１０⁴、最も好ましくは１０⁶の範囲である。ＰＢＰのオリゴ糖への結合が発熱反応または吸熱反応であれば、その時は、結合は低温でそれぞれ増加または低減し、固定化工程の温度調節手段となる。個々の用途に最も適当な多糖結合部分がいったん同定されると、適当な多糖結合部分をコード化しているＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を宿主細胞にトランスフォームすることによってＰＢＰを調製することができる。熟語「多糖結合ペプチド」は、少なくともポリサッカライダーゼまたは多糖結合タンパクの多糖結合部分の機能部分を含むアミノ酸配列を意味する。「機能部分」は、関心事のオリゴ糖ポリマーに結合するアミノ酸配列を意味する。関心事のタンパクをコード化しているＤＮＡをＰＢＰＤＮＡ配列に連結することが好ましい。式（１）による組成物をコード化している融合遺伝子、またはＰＢＰＤＮＡ配列のみが、真核細胞または原核細胞のいずれかの宿主細胞で発現する。要望に応じて、ＰＢＰのみを調製する場合、発現し、分離した多糖結合ペプチドを関心事の化合物、すなわち、成長因子あるいは細胞増殖または細胞活性化を刺激または阻害する他の部分に結合させることができる。セルロース遺伝子や、多糖結合結合タンパクの遺伝子など、ポリサッカライダーゼ遺伝子の分離に使用する技術は、合成、ゲノムＤＮＡからの分離、ｃＤＮＡからの調製、またはそれらの組合せなど、当該技術上周知である。（米国特許第５，１３７，８１９号、第５，２０２，２４７号、および５，３４０，７３１号を参照されたい）。可溶性オリゴ糖に結合する幾つかのポリペプチド結合ドメインの配列が判明している。（図１を参照）。様々なポリサッカライダーゼおよび多糖結合タンパクのＤＮＡコーディングを判明している。様々な遺伝子操作技術が周知であり、制限、消化、切除、連結、in vitro 突然変異誘発、プライマー修復、リンカーまたはアダプターの使用等々がある。（Sambrook et al., Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sprlng Harbor,New York，1989を参照されたい）。ポリサッカライダーゼのアミノ酸配列をポリサッカライダーゼ遺伝子またはポリペプチド結合タンパク遺伝子のドナー細胞として使用して、関心事の細胞のｍＲＮＡまたはＤＮＡから調製したｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニング用プローブをデザインすることができる。ポリサッカライダーゼｃＤＮＡまたは結合タンパクｃＤＮＡまたはそのフラグメントをハイブリッド形成プローブとして使用して、他の微生物に存在する構造的に関連した遺伝子を容易にクローニングすることができる。特に期待されるのは、ポリサッカライダーゼの触媒ドメインまたは結合ドメインが不連続な、微生物から得ることができる遺伝子のヌクレオチド配列に基づいたオリゴ糖を使用するが、他の多糖結合タンパクも使用することができる、ポリサッカライダーゼ活性を発現する微生物の遺伝子の分離である。（たとえば、Shoseyev．et al.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.(ＵＳＡ)(1992 )89:3483-3487を参照のこと）。ポリサッカライダーゼまたは多糖結合タンパクの結合ドメインの共通配列を使用して開発されたプローブは特に興味深い。今までに特性化されたC.fimiのβ-1 ,4-グルカナーゼは、エンドグルカナーゼＡ、Ｂ、ＣおよびＤ（それぞれ、CenA 、CenB、CenCおよびCenD）、およびエキソセロビオヒドロラーゼＡおよびＢ（それぞれ、CbhAおよびCbhB）、およびキシラナーゼＡおよびＤ（それぞれ、CexおよびXylD）である。（Wong et al.(1986)Gene.44:315:Meinkeet al.(1991)J.Bac teriol.,173:308;Coutinho et al.,(1991)Mol.Microbiol.5:1221;Meinke et al. ,(1993)Bacreriol,175：1910;Meinke et al.,(1994)Mol.Microbiol.,12:413:She n et al.Biochem.J.,印刷中：O'Neill et al.,(1986)Gene, 44:325:およびMillward-Sadier et al.,(1994)Mol.Microbiol.,111:375を参照のこと）。すべて、複雑さの程度が様々な調節タンパクである（図１）が、互いに独立に機能することができる触媒ドメイン（ＣＤ）およびセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）という共通の特徴が２点ある。（Millward-Sadler et al.(1994)Mo l.Microbiol.,11:375;Gilkes et al.,(1988)J.Biol.Chem.,263:10401:Meinke et al.,(1991)J.Bacteriol.,173:7126;およびCoutinho et al.,(1992)Mol.Microbi ol.,6:1242を参照のこと）。上記酵素のうち４つ、すなわちCenB、CenD、CbhAおよびCbhBの場合、フィブロネクチンIII型(Fn3)反復によってＣ末端ＣＢＤとＮ末端ＣＤが分離される。酵素のＣＤは、グリコシドヒドロラーゼファミリーのうちの６つから生じる（Henrissat(1991)Biochem.J.,280:309:およびHenrissat et a l.,(1993)Biochem.J.,293:781を参照のこと）。上記酵素はすべて、Ｎ−末端ＣＢＤまたはＣ−末端ＣＢＤを有する。（Tomme et al.,Adv.Microb.Physiol.印刷中、を参照のこと）。CenCは、そのＮ−末端にファミリーIV由来の縦列ＣＢＤを有する。CenBおよびXylDは、それぞれファミリーIIIおよびIIに由来する第２の内部ＣＢＤを有する。CexおよびXylDは明らかにキシリナーゼであるが、Cexは、 XylDと違って、セルロースに対する活性が低い。それにも拘わらず、幾つかの他の細菌キシリナーゼと同様（Gilbert et al.,(19 93)J.Gen.Microbiol.,139:187を参照のこと）、CexおよびXylDはＣＢＤを有する。C.fimiは、恐らく他のβ-1,4-グリカナーゼを産生する。関連細菌によって同様の系が作られる（Wilson(1992)Crit.Rev.Biotechnol.,12:45:およびHazlewood et al.,(1992)J.Appl.Bacrerjol.,K72:244を参照のこと）。非関連細菌もグリカナーゼを産生する；たとえば、Clostridium thermocellumは２０種以上のβ-1 .4-グルカナーゼを産生する（Beguin et al.,(1992)ＦＥＭＳMicrobiol.Lett.,1 00:523を参照のこと）。固相回収系の場合、不溶性多糖類に結合するＣＢＤは特に有用である。成長因子複合体の相分離精製で使用する場合、特に有用なＣＢＤは、可溶性セロサッカライドに結合することが判明している唯一のタンパクであり、且つ任意の可溶性多糖類に結合する一組のタンパクである、C.fimiエンドグルカナーゼＣＮｌの結合ドメインである。図１に示した適当な結合ドメインの例は、多糖類に結合する様々な酵素の結合ドメインの配列を示し、酵素のほとんどまたは全ての間で保存されるアミノ酸残基を同定する。この情報を使用し、当業者に周知の方法を使用して、適当なオリゴヌクレオチドプローブを得ることができる。このプローブは、全配列よりかなり短くてもよいが、少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１４ヌクレオチドの長さでなければならない。さらに長い、遺伝子の全長まで、好ましくは５００ヌクレオチド未満、さらに好ましくは２５０ヌクレオチド未満の長さのオリゴヌクレオチドが有用である。ＲＮＡプローブまたはＤＮＡプローブを使用することができる。使用に際して、一般に、検出可能な方式、たとえば、³²Ｐ、³Ｈ、ビオチン、またはアビジンでプローブを標識し、遺伝子の探索を行う生物の１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡとインキュベートする。ハイブリッド未形成プローブをハイブリッド形成プローブと分離した後、標識を使用してハイブリッド形成を検出する。一般に、ハイブリッド形成プローブは、ニトロセルロース紙などの固体担体上に固定される。オリゴヌクレオチドと一緒に使用するのに適したハイブリッド化技術は、当業者に周知である。通常、プローブは容易に同定することができる検出可能標識と一緒に使用されるが、未標識オリゴヌクレオチドも、標識プローブの前駆体としても、二本鎖ＤＮＡ（またはＤＮＡ／ＲＮＡ）の直接検出を提供する方法で使用する場合にも、有用である。したがって、用語「オリゴヌクレオチドプローブ」は、標識型と未標識型の両者を指す。一般に、関心事の生物の核酸を精査することによって同定された結合ドメインは、結合領域またはプローブを得た領域と少なくとも約４０％の同一性を示し（同類置換の許容量、より良い配列のためのギャップなどを適宜含む）、Ｋ_a≧ １０³Ｍ^-1で可溶性β-1,4-グルカンと結合する。さらに好ましくは、結合ドメインは、プローブを得るために使用した結合領域と少なくとも約６０％同じであり、最も好ましくは少なくとも約７０％同じである。同一性の割合は、ポリサッカライダーゼ結合ドメインの間に保存されるアミノ酸より高くなる。PC/Gene（Int elliGenetics,Inc.）のプログラムを使用して、アミノ酸配列比較の分析を行うことができる。多様な配列および系統樹作成にＰＣＬＵＳＴＡＬを使用することができる。多糖に結合する酵素または群酵素からポリサッカライダーゼまたは多糖結合ドメインのＰＢＰを分離するために、幾つかの遺伝学的アプローチを使用することができる。１つの方法は、制限酵素を使用して、ＰＢＰ以外のタンパクの一部をコードする遺伝子のタンパクを除去する。残りの遺伝子フラグメントをフレーム内で融合し、切れたタンパクをコード化する突然変異遺伝子を得る。別の方法は、Bal31などのエキソヌクレアーゼを使用して、ＤＮＡの５'末端または３'末端から外的に、または制限された遺伝子内のギャップから内的に、ヌクレオチドを計画的に削除することを含む。この遺伝子削除方法を使用すると、短縮されたタンパク分子をコード化している突然変異遺伝子が生じるため、その基質結合力または多糖結合力を評価することができる。結合力の評価に適した基質は、上表１〜５に記載の酵素の基質、ならびに下表６に記載の炭水化物である。同様に、成長因子あるいは細胞増殖、活性化、または分化を調節する他の部分をコードする遺伝子を一部変更して、貫膜ドメインなど、所望の生物学的活性を遂行するのに不可欠ではない因子のタンパクのコード領域を除去することができ、成長因子複合体をコード化するキメラ遺伝子を構築するとき、削除することが好ましい。切れた遺伝子にコード化されたタンパクの、所望の生物学的活性を遂行する能力を試験する。多糖結合領域および成長因子部分をコード化しているヌクレオチド配列がいったん同定されたら、そのヌクレオチド配列をｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡのいずれかとして様々な方法で操作し、発現生成物が上記式（１）で表される構造を有する組成物を調製することができる。多糖結合領域をコードするヌクレオチド配列は、成長因子をコード化しているＤＮＡ配列に融合することが可能である。成分ポリペプチドの三次元構造を保持することは非常に好ましい。フラグメントの起源および所望のポリペプチドの長さに応じて、１つ以上の制限部位を、キメラポリペプチドの構築に使用される合成遺伝子の設計に盛り込むことができる。可能であれば、制限部位は、ポリペプチドのアミノ酸配列を未変化のままでおく。しかし、新しい制限部位を組込むと、タンパクの活性を変えずに、変化したアミノ酸配列を生じる可能性がある。通常、発現カセットの構築中に、様々なＤＮＡのフラグメントが適当なクローニングベクターでクローニングされるが、このクローニングベクターを使用するとＤＮＡの増幅、ＤＮＡの一部変更あるいは配列、リンカー等々の連結または除去による操作が可能になる。通常、ベクターは少なくとも比較的多いコピー数で、細菌内で複製することができる。pBR322、pTZ、pUCなどのベクターを含め、多数のベクターを、グラム陰性菌、特にＥ.coliでのクローニングに利用することができる。クローニングベクターは、宿主細胞内で機能することができる効率のよいシステムを具有することを特徴とする。一般に、クローニングベクターは少なくとも１個の独特の制限部位、通常は、複数の制限部位を具有し、多様な制限部位を含んでもよい。さらに、クローニングベクターは、形質転換体を選択することができる１種以上のマ一カーを具有してもよい。通常、マーカーは、抗生物質、重金属、諸トキシン等々の細胞毒性の薬剤に対する耐性、宿主を栄養要求性にさせる突然変異の相補性、またはファージに対する免疫を提供する。ベクターおよびカセットの適当な制限、および適宜、末端の一部変更によって、平滑末端を準備するための突出部における噛み戻しまたは充填によって、リンカーを加えることによって、テーリングによって、ベクターを発現カセットまたはその成分に連結するための相補的末端が提供される。カセット開発におけるＤＮＡの各操作後、プラスミドを分離し、要望に応じて、適当な配列が得られたことを保証するために、個々のカセット成分の配列に関して分析する。操作の性質に応じて、適宜、所望のフラグメントをプラスミドから切り取って異なるベクターに導入するか、またはプラスミドを制限して発現カセット成分を操作する。場合によっては、異なる複製システムを要する異なる宿主で複製することができるシャトルベクターを使用する。これは、２種類の宿主で機能することができるマーカーをさらに必要とする場合も、必要としない場合もある。このようなマーカーが必要な場合、必要に応じて、カセット含有プラスミド、２種の複製システムおよびマーカーを一方の宿主から他方に移動させることができるように、マーカーをベクターに含めることができる。選択のため、任意の有用なマーカーを使用することが可能である。適当な選択可能マーカーには、アンピシリン、ヒグロマイシンＢ、Ｇ４１８、および／またはネオマイシン等々に対する耐性を与える遺伝子が含まれる。しかし、選択用マーカーは便宜上極めて好ましいものの、形質転換細胞をスクリーニングするための他の手順も当業者に周知であり、たとえば、形質転換細胞が作る特異的な生成物によって、形質転換細胞をスクリーニングしたり、免疫法または酵素法で所望の生成物の合成を決定することが可能である。成長因子複合体をコード化しているＤＮＡを様々な方法で操作して発現させる。たとえば、ＰＢＰおよび成長因子部分をコードする遺伝子を、所望の宿主生物内で操作できる適当な転写シグナルおよび／または翻訳シグナルに、操作できるように連結する。適当な宿主生物としては、Ｅ.coli、Streptomyces.および Bacillusを含む原核生物や、酵母Saccharomyces（特に、Ｓ.cerevisiae）やPich ia pastorisなどの真核生物などの微生物がある。哺乳類や他の高等な真核細胞も成長因子複合体の発現に有用である。細菌の場合、具体的な転写調節領域またはプロモータとしては、lacプロモータ、trpプロモータ、Tacプロモータ（trpプロモータおよびlacプロモータのハイブリッドである）、λ左プロモータおよび λ右プロモータ等々がある。転写調節領域はさらに、たとえば、成長倍地中の栄養または発現生成物の有無、温度等々によって、調節すべき融合遺伝子が発現する時間を与える調節配列を含む。たとえば、バクテリオファージλＰＬプロモータ、バクテリオファージλＯＬオペレータおよび温度感受性レプレッサーを含む調節配列を使用して、温度により融合遺伝子の発現を調節することができる。プロモータの調節は、レプレッサーとオペレータとの相互作用によって行われる。好ましいプロモータは強力なグルコース−レプレッション非感受性Tacプロモータである。Graham et al.,(1995)Gene 158:51-54には、高レベル発現ベクターの例が記載されている。酵母で異種タンパクを合成する方法は周知である。Methods in YeastGenetics .Sherman et al.((1982)Cold Spring Harbor Laboratory Press)は、酵母で成長因子複合体を産生させるために利用できる様々な方法を記載したよく知られている著作である。通常、酵母での発現に適したベクターは、要望に応じて、3-ホスホグリセレートキナーゼや他の解糖酵素を含む諸プロモータ、複製起点、終結配列等々などの発現調節配列を有する。適当なベクターは、文献に記載されている（たとえば、Botstein et al.(1979)Gene8:17-24:Broach et al.(1979)Gene8:12 1-133を参照のこと）。様々な真核宿主細胞に使用するのに適した発現バクターは、生物学的試薬の製造業者数社により製造されている（たとえば、Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA;Clontech Laboratories,Palo Alto,CA;Promega Corporation.Madison ＷＩの製品カタログを参照のこと）。成長遺伝子複合体を発現することができる多数の適当な哺乳類宿主細胞系が当該技術で開発されており、ＨＥＫ293、ＢＨＫ21およびＣＨＯ細胞系、ならびにＣＯＳ細胞系、HeLa細胞、骨髄腫細胞系Jurkat細胞等々、様々なヒト細胞系などがある。上記細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター（たとえば、ＣＭＶプロモータ、ＨＳＶ tk（チミジンキナーゼ）プロモータまたはpgk（ホスホグルセレートキナーゼ）プロモータ）、エンハンサー（Queen et al.(1986)Immuno l.Rev.89:49）、およびリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（たとえば、ＳＶ40ラージＴ Ag poly Ａ付加部位）などの必要な情報処理部位、および転写ターミネータ配列などの発現調節配列を含んでもよい。昆虫の細胞は、成長因子複合体の発現に有用な別の真核系である。昆虫細胞での成長因子複合体の発現に適当なベクターは通常、ＳＦ9バキュロウイルスから誘導される。適当な昆虫細胞系としては、カ幼虫、カイコ、アワヨトウ幼虫、シミおよびSchneider細胞系などのDrosophia細胞系（Schneider(1987)Emnbryol.Exp. Morphol,27:353-365を参照のこと）。発現カセットは、適当な細胞宿主のエピソーム維持用複製系内に含まれてもよく、ベクターを宿主ゲノム内に統合することができる、複製系無しで提供されてもよい。トランスフォーメーション、リン酸カルシウム沈降ＤＮＡの使用、細胞をウイルスと接触させることによるトランスフェクション、細胞へのＤＮＡマイクロインジェクション等々、周知の技術によってＤＮＡを宿主細胞に導入することができる。成長因子複合体をコード化しているＤＮＡを適当な宿主にいったん導入すると、宿主を成長させて複合体を発現させることができる。組換え生成物は、グリコシル化されていることもグリコシル化されていないこともあり、野生型または他のグリコシル化を有する。グリコシル化の量は、個々のペプチドの配列、ならびにペプチドが産生される生物にある程度左右される。それ故、Ｅ.coli細胞で生成物が発すると、未グリコシル化生成物が生じ、昆虫で生成物が発現すると、一般に、哺乳類細胞における生成物の発現より少ないグリコシル化を生じる。酵母で発現すると、超グリコシル化が生じる。成長因子複合体の分離では、生成物が宿主細胞に保持される場合、当業者に周知の方法を使用して、細胞を収穫し、溶解し、生成物を分離する。場合によっては、リーディングフレームの上流およびリーディングフレーム内のシグナル配列（分泌リーダー）に、成長因子複合体を分泌させる、構造遺伝子を付けることが望ましい。具体的な分泌リーダーとしては、ペニシリナーゼ、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体、外膜タンパク等々の各分泌リーダーなどがある。適当なリーディングフレーム内の融合によって、成長因子複合体を培地中または細菌の細胞周辺腔に分泌することができる。Ｅ.coliなどの細菌の発現系では、かなりの部分が細胞外媒体内に漏れる（Ong et al.,Biotech.Bioeng.(1993)42:401）。生成物が分泌される場合、当業者に周知の手順を使用して、栄養培地を回収し、生成物を分離することができる。活性タンパクを産生するためには、タンパクを再生させることが必要である。好ましい実施態様で、成長因子複合体をアフィニティクロマトグラフィーで精製する。基質結合領域を、適当な基質、または使用すする成長因子複合体に組込まれる異なるアフィニティタグに結合させる。たとえば、ヘキサヒスチジン、ストレプトアビジン、またはＧＳＴなどのアフィニティタグを含むように成長因子複合体を構築することができ、このようなアフィニティタグは、たとえば、それぞれ、ニッケル−セファロース、ビオチン、およびグルタチオンなどを使用するアフィニティ精製に有用である。一般に、本発明の成長因子複合体はポリサッカライダーゼ結合ペプチドの基質上に固定される。「固定」は、成長因子複合体が、可溶性または不溶性のいずれかの、適当な基質に結合されることを意味し、たとえば、セルロース、β-1,4- グリコシド結合によって結合したＤ-グルコピラノース単位から成る多糖類およびそのエステル類、たとえば、酢酸セルロースなどの不溶性多糖類、反復主鎖単位がβ-1,4-Ｄ-キシロピラノースであるキシラン、β-1,4-結合Ｎ-アセチル、2- アミノ-2-デオキシ-β-Ｄ-グルコピラノース単位から成る点でセルロースに似ているキチンなどがある。他の有用なオリゴ糖としては、デンプンなど、α-1,4- グリカンなどがある。上記のような、多糖類に結合することができる酵素は、このような基質に結合することができるアミノ酸配列の起源として、本発明で興味深い。基質は、微晶質セルロース、綿、紙、中空セルロース繊維、微小担体（たとえば、Cellsnow^TM、Kirin Brewing Co.,日本）スポンジ創傷カバー等々の形が有用である。一般に、複合体は成長因子複合体と接触して配置される細胞によって吸収されたり消費されたりしない。複合体の結合タンパク部分の基質上に固定された成長因子複合体は、成長因子依存細胞、特に幹細胞ならびに巨核球やＴリンパ球などの造血系細胞のex vivo 培養に用途がある。たとえば、この方法は、前ＣＦＵ−Ｓ、ＢＦＵ−Ｅ、ＭＫ，ＣＦＵ−ＭＫ，ＧＥＭＭおよびＧＭなど、骨髄成分の培養に有用である。この方法は、固定された成長因子複合体に接触して成長因子に応答する細胞を成長させることを含む。好ましい実施態様で、成長因子複合体はポリサッカライダーゼの基質、たとえば、β-1,4-グリカンや本願明細書に記載の他の多糖上に固定されている。基質は、場合に応じて、固体担体に可逆的または不可逆的に結合していてもよく、基質自体が固体担体を含んでもよい（たとえば、綿繊維、紙、セルロース中空繊維、成長チャンバ、微小担体など）。固定された因子は一般に細胞培養によって消費されないため、因子は細胞増殖、活性化、および／または分化に連続した限局的刺激を与えることができる。細胞培養は、培養プレート、成長チャンバ等々、特に長期細胞増殖および／または細胞増殖の大規模拡大を可能にするために成長培地を連続的に加えて除去する灌流培養であってもよい。灌流培養で培養することができる細胞としては、特異的エフェクターＴ細胞、骨髄または血液から得られる幹細胞、巨核球または他の造血細胞等々がある。成長因子は、ＰＢＰの基質を含む生体外用具、たとえば、濾紙や中空繊維、および成長因子依存細胞のex vivo拡大に使用される用具に、ＰＢＰによって結合していてもよい。たとえば、特定の成長因子依存細胞型の拡大、活性化、または分化を必要とする患者の血液を、成長因子複合体を構築するために基質結合ドメインを獲得したポリサッカライダーゼの基質を含む固体担体上に成長因子複合体が固定されている生体外用具を通過させてもよい。１つの実施態様で、成長因子複合体は、生体外用具内に存在する中空繊維などのセルロースマトリックスに結合している。したがって、繊維を通過する成長因子依存細胞は、細胞の増殖、活性化または分化を刺激する固定された成長因子部分と接触する。この方法が有用な例は、癌患者の血液を、インターロイキン２を含む成長因子複合体が結合している多糖を含有する生体外用具を通過させることによる抗腫瘍Ｔ細胞の活性化である。特許請求した方法は、神経細胞など、因子の特定の局所濃度または勾配を必要とする因子依存細胞の培養にも有用である。勾配は、当業者に周知の方法で発生させる。たとえば、フロー技術を使用し、多糖マトリックスをＰＢＰ成長因子複合体溶液と接触させることによって勾配を発生させることができる。マトリックの近位領域は、流れから最大量の複合体を吸収する。成長因子複合体を使用して、特定の成長因子あるいは増殖または分化に関する他の部分に依存する細胞が多い細胞群を獲得することができる。成長因子の細胞表面受容体を担持する細胞を、基質結合ドメインの起源であるポリサッカライダーゼの基質上に固定されている成長因子複合体と接触させる。不溶性基質を使用する場合、固定された成長因子依存細胞から望ましくない細胞を洗浄によって除去する。適当なオリゴ糖基質上に固定された細胞は、たとえば、相分離系、特に水性２相抽出系を使用して、他の非結合細胞と分離することができる。一般に、相分離系は、成分を混合したとき、相分離系の成分が不相溶性であることによって生じる２相を含む。系の１成分は相形成オリゴ糖ポリマーであり、第２の成分は第２のポリマーなど、相形成オリゴ糖ポリマーと不相溶性である相誘導性薬剤であるか、または相分離を誘導することができるほど高い濃度で存在する強力な電解質、特に、硫酸塩やクエン酸塩などの塩類である。生育可能な細胞を精製するため、相分離条件は細胞生育能に適合しなければならない。伝統的なデキストラン／ＰＥＧ系に類似した特性を有するが、それより低価格の分配系を形成することができるポリマー対の例は、デキストラン／ＰＥＧ系と同様、炭水化物とポリ（オキシ−エーテル）の不相溶性に基づいたものを含め、多い（Skuse et al.,(1992 )Enzyme Microb.Technol.14:785を参照のこと）。例としては、ヒドロキシプロピルスターチ（Tjerneld et al.,(1986)Enzyme Microb.Technol.8:417）、マルトデキストリン（Szlag et al.(1990)ＡＣＳ Symposium Series 419:38-52）、ヒドロキシプロピルセルロース（Skuse et al.前出）、およびカルボキシメチルセルロース（Albertsson(1971)Partition of Cell Partides and Macromolecule s,Wiley Intersclence）などがあり、全て、ＰＥＧを含む分離系の形成に使用して成功をおさめている。系を展開するために、それより高い濃度で安定な２相分配系が形成されるポリマー総濃度、言い換えればポリマーと他の相誘導剤の濃度を決定するためのHaynes et al.((1989)Fluid Phase Equilibria 53:436)の手順を使用して、第１成分と第２成分を組合せた相平衡データが得られている。一般に、中性のｐＨ、約１０^-3Ｍ〜約１Ｍの中間イオン強度緩衝液中で、ＰＢＰ複合体を相形成オリゴ糖に結合させることができる。相分離系の成分に応じて、約４ ℃から少なくとも７０℃の温度で結合を行うことができる。結合は実質的に瞬間的であり、温度は重要ではない。ＰＢＰ複合体を相形成オリゴ糖にいったん結合させると、ＰＢＰ複合体はその相に分配される。使用する際に、多糖結合ペプチドによって可溶性オリゴ糖に結合された細胞をすでに混合されている相分配系に加えるか、または成分のいずれかに、一般にオリゴ糖ポリマーの乾燥型（たとえば、凍結乾燥）に、組成物を加えてもよく、その結果、この乾燥型は再水和され、その後で他の成分を加えることができる。複合体結合がオリゴ糖ポリマー相に分配されるほど十分な時間の後、この相を分離する。系のｐＨおよびポリマー濃度を調節し、分配電界質を加えることによって、多糖の多い相に汚染物質タンパクが分配（非アフィニティ）されるのを最小限に抑える。最適操作条件下で、２種の水層を多段接触を行うと、標的組成物の完全精製または部分的（ではあるが十分な）精製のいずれかを行うことができる。下表６は、他のポリマーまたは強電解質のいずれかと水性２相系を形成することが判明しているオリゴ糖の一部の一覧表である。２相系を形成する他の多糖類としては、低分子量セロサッカライド類の混合物、キトサンおよび他のキチン誘導体、水溶性グルカン類（重合度＞３のα、β、および／または混合連結）、改質グルカン類、および／または誘導グルカン類、オオムギβ−グルカンやカラスムギβ−グルカンなどの穀類β−グルカン類、ならびにマンナン、グルコマンナンおよびキシログルカンなどがある。若干の用途では、固定された細胞を濃縮工程後に放出することが望ましい。幾つかの方法を使用して、固定された成長因子複合体および／または付着細胞を多糖基質ポリマーからはずすことができる。たとえば、ＰＢＰ化合物はオリゴ糖ポリマーに特異的に且つ強く結合するが、低イオン強度溶液（水など）、または撹乱塩（chaotropic salt）の高ｐＨ溶液で容易にはずすことができる。上記方法は、付着細胞および／または受容体一と緒に、オリゴ糖ポリマーから複合体全体を放出することができる。脱着の温度は重要ではなく、一般に１０℃〜４０℃の範囲であるが、環境温、すなわち、約２０℃が一般に好ましい。生育可能な細胞が望ましい場合、生理学的に適合する条件を使用する。たとえば、低イオン強度、撹乱塩を含まない生理的ｐＨ溶液を使用して、基質から細胞を放出することができる。成長因子複合体に付着した細胞の生育能が重要でなければ、たとえば、成長因子そのものの受容体または成長因子受容体対を精製する場合、この脱着工程にｐＨ９．５の炭酸塩緩衝液または６ＭグアニジンHClを使用することができる。希水酸化ナトリウム（約０．１Ｍ）を使用することができる場合もある。ＰＢＰが水で脱着されるように、要望によっては脱着されないように、その付着特性を変えるために、ＰＢＰの性質を一部変更することができる。脱着媒体をマトリックスに適用すると、オリゴ糖ポリマーから複合体が放出される。ＰＢＰ複合体を基質から放出した後、ＰＢＰ複合体と関連細胞との分離に、様々な技術を使用することができる。たとえば、ＰＢＰ複合体が存在しないように多糖表面を上述の脱着溶液で洗浄することができる。次に、脱着溶液のイオン強度またはｐＨを変えたり、イオン交換媒体または第２の多糖マトリックでＰＢＰ複合体を再吸着したりすることによって、ＰＢＰ複合体を脱着溶液から分離する。あるいは、プロテイナーゼＫやトリプシンなどの非特異的一般プロテアーゼか、特異的プロテアーゼのいずれかを使用するタンパク分解によって成長因子複合体を切断することにより、多糖基質上に固定された細胞または他のリガンドを基質から放出することができる。非特異的プロテアーゼを使用してＰＢＰ複合体のＰＢＰ部分を完全に分解することができ、それ故、ＰＢＰ部分がオリゴ糖ポリマーから放出される。たとえば、約３７℃で、濃度約５０μg/mlのプロテイナーゼＫで約２０分間処理することによって、放出を行うことができる。Die et al.(1 991)Bio/Technology,9:1096-1099。特異的プロテアーゼを使用して、結合した化合物および／または細胞を、化合物および／または細胞が結合している多糖基質から放出させることもできる。たとえば、成長因子部分とＰＢＰとの間にプロテアーゼ認識部位またはキメラ切断部位を含めることができる。ＰＢＰはオリゴ糖ポリマーに結合したままである。認識部位の例としては、コラーゲナーゼ、トロンビン、エンテロキナーゼ、およびそれぞれの酵素で特異的に切断される因子Ｘ_aなどがある。因子Ｘ_aおよび因子Ｘ_a−ＣＢＤ融合タンパクの適当な発現システムが開発されている（Assouline et al.(1993)Protein Eng.,7:787を参照のこと）。２つのＳ１因子の未変性アイソマーの１つ（ＫＬ−１）は、その細胞外ドメイン内にプロテアーゼ切断部分を含み（Huang et al.(1992)Mol．Cell.Biol .3:349-352;Pandiella et al.(1992)J.Biol.Chem.267:24028-24033）、それ故、プロテアーゼによってこの部位を切断することは、成長因子複合体のＳ１因子部分をＰＢＰから放出させる手段である。たとえば、低ｐＨまたは臭化シアンに感受性のキメラ切断部位を使用することも可能である。ＰＢは細胞をオリゴ糖ポリマーに付着させることができる手段であり、その細胞は、後ではずすことができる。切断を使用する場合、多糖結合領域と成長因子部分との間に存在する配列に特異的なプロテアーゼを使用して、ＰＢＰはオリゴ糖ポリマーに結合したまま、成長因子部分および付着したリガンドおよび／または細胞を多糖結合領域から容易に切断することができる。プロテアーゼは、成長因子部分をＰＢＰから切断した後、その除去が容易な形で提供されることが好ましい。１例として、切断プロテアーゼを切断酵素複合体として調製することができ、この場合、プロテアーゼは、関心事のポリペプチドに結合している第１多糖結合部分とは異なる基質特異性を有し、且つ／または異なる結合特性を有する、第２の多糖結合部分に結合している（Assoluline et al.(1993)前出、Assoluline et al.(1995)Biotechnol.Pro g.11:45-49）。このように、関心事のリコンビナントタンパクから結合ドメインを溶液中で切断し、その後、第１多糖結合部分は結合しない多糖基質に結合させることによって切断酵素複合体を除去する。あるいは、第１多糖結合部位が結合しない多糖マトリックスに、切断酵素複合体を固定することができる（Assoulin e et al.(1993)前出、Assouline et al.(1995)前出を参照のこと）。精製した細胞または成長因子部分を多糖ポリマーから放出させ、ポリマーに結合したままの汚染ＰＢＰをなくす。成長因子依存細胞型および／または受容体を濃縮する方法は、バッチ方式、または細胞懸濁液をカラム内を通過させることによって、実施することができる。たとえば、アフィニティクロマトグラフィカラムまたは他の適当な精製システム内に含まれる多糖マトリックスに、成長因子複合体を結合させることができる。リガンドが成長因子複合体に結合することが可能なイオン条件下で、細胞結合するリガンドを含め、成長因子部分に結合するリガンドを含む試料混合物と、複合体を接触させる。マトリックスで洗浄することによって、未結合分子および／または細胞を除去する。結合分子を溶離する緩衝液でマトリックスを洗浄することによって、結合分子および／または細胞を分離する。創傷を成長因子複合体、通常は、複合体の結合する対象である多糖基質、たとえば、包帯の綿などに結合する成長因子複合体と接触させることによって、成長因子複合体を創傷治癒増進に使用することができる。特許請求した方法で使用する成長因子部分は、創傷治癒に関与する細胞が走化性を示すものである。あるいは、成長因子は、創傷治癒に関与する細胞の増殖を刺激したり、瘢痕組織形成を妨げたり最小限に抑えたりする細胞の増殖を阻害したりすることができる。成長因子複合体は、創傷部位への細胞移動および／または標的細胞成長の調節を増進するのに有効な量で、創傷部位に投与される。他の治療的摘要としては、神経再生亢進などがある。たとえば、脳由来神経親和性因子および／または神経成長因子を含む複合体を、複合体の多糖結合ペプチド部分によって、膜などの多糖基質上に固定させ、傷害や病気によって損傷した神経組織に適用する（たとえば、米国特許第５，２２９，５００号を参照のこと）。損傷した神経付近に、神経が完全に、または部分的に再生するのに十分な期間、固定された複合体を置く。以下の実施例は、例証の目的で提供するものであって、本発明の範囲を制限するためではない。実施例略語ｐＮＰＣ＝ｐ-ニトロフェニル-β-セロビオシドＨＰＡ＝ハイド粉末axure（hide powder axure） gCenAおよびgCex＝Ｃ.fimi由来のCenAおよびCexのグリコシル化形 ngCenAおよびngCex＝リコビナントＥ.coli由来のCenAおよびCexのグリコシル化形。ＲＰＣ＝逆相クロマトグラフィーＳＤＳ-ＰＡＧＥ＝ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動 a-Pro/Thr＝合成CexPro/Thrボックスに対するウサギ抗血清ＰＭＳＦ＝フッ化フェニル−メチルスルホニル生物学的培養寄託 American Type Collection(ＡＴＣＣ)．12301 Park Lawn Drive,Rockville,Me ryland 20852に以下の寄託が行われている。Escherichia coli Ｃ600内のプラスミドpcEC-2上のクローン化遺伝子CenAの誘導体は、１９８６年４月２３日に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号第67101号を与えられた。プラスミドpEC-1上のクローン化遺伝子Cexの誘導体は、１９８６年５月２７日に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号第67120号を与えられた。Ｅ.coli ＪＭ83.pUC12-1.1cexは、１９８６年４月２３日に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号第67102号を与えられた。pTugA（受託番号第Ｌ 24193号）、pTugAS（受託番号第Ｌ24367号）、Ｃ.fimi CenA（受託番号第Ｍ15823号）およびＣ.fimi CenC（受託番号第Ｘ57858号）の全ヌクレオチド配列は、GenBankに寄託されている。実施例１Ｓ１因子およびセルラーゼ結合ドメインをコード化している融合遺伝子の構築融合タンパクＳＬＦ-ＣＢＤは、ＳＬＦ-ＣＢＤ融合タンパク（図２Ｃ）と呼ばれる、Ｓ１因子（steel factor：ＳＬＦ）とCexのセルロース結合ドメインとの間で融合を作るためのCellulomonas fimiエキソグルカナーゼCexのセルロース結合ドメインに結合したＳ１因子（図２Ａ）の細胞外ドメインを含む。天然のCex 酵素の場合、一連の反復するプロリン−トレオニン単位から成るＰＴリンカーで、触媒ドメインと結合ドメインとを分離させる。このリンカーを、ＳＬＦ-ＣＢＤ構築物中でインキュベートし、２つのドメインを分離した。ＣＢＤの除去を容易にするために、必要に応じて、因子Ｘａタンパク分解切断部位を、ＰＴリンカーより上流の２つのドメインの間に導入した。セルロース（Greenwood et al.(1 990)Cell63:203-211）かニッケル−セファロース（Laemmli(1970)Nature 227:68 0-685）のいずれかをマトリックスとして使用して精製できるように、ヘキサヒスチジンアフィニティタグを、タンパクのアミノ末端に加えた。Cexシグナルペプチドを除去して適切に処理したとき、ＳＬＦ-ＣＢＤの予期される分子量は３４．１kDaである。酵素および緩衝液は、ＧＩＢＣＯＢＲＬ(Grand Island,ＮＹ )から購入した。全ての遺伝子操作は、Escherichia coli(Ｅ.coli)菌株ＤＨ5a(H anahan(1983)J.Mol.Biol.166:557-580)内で実施した。ＳＬＦ-ＣＢＤ融合タンパクをコード化している遺伝子を、以下の通りに構築した。位置指定突然変異誘発（Zoller and Smith(1982)Nucleic Acids Res．10: 6478-6500）を使用して、セルラーゼCexのシグナルペプチドのコード配列(O'Nei llet al.(1986)Gene 44:331-335)を発現プラスミドpTUG ＡＳ（図３）に導入した。 NheI制限部位が後続するヘキサヒスチジンアフィニティタグのコード配列を、Ce xシグナル配列コード領域の３'末端でフレームに導入した。このようにして得られたフラグンメントを、NcoI−HindIIIフラグメントとして、非発現プラスミドp SL1180（Pharmacia Ltd.,Piscataway,ＮＪ）にサブクローニングした。 XbaI制限部位を遺伝子フラグメントの５'末端に導入し、StuIおよびHindIII部位を遺伝子の３'末端に導入するために、ネズミＳ１因子の細胞外ドメインをコード化する遺伝子フラグメント（Anderson et al.(1990)Cell 63:235-243;GenBank 受託番号第Ｍ38436号）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で一部変更した（Kau fman and Evans(1990)BioTechniques 9:304-306）。この生成物を、ＱＩＡＥＸゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ Ltd.,Chatsworth,ＣＡ）を使用してアガロースゲルから精製し、Cexシグナルペプチド含有プラスミドをNheIおよびHindIIIで切断した後、Cexシグナルペプチドより下流に挿入した。遺伝子の９０％以上を含む２つの独特な制限部位の間で、元のＳＬＦ遺伝子のＤＮＡをＰＣＲ生成物と交換し、残りのベクター接合部位とフランジングＤＮＡの配列を決定した。Cexのセルロース結合ドメインをコード化している遺伝子配列、ならびにそのプロリン −トレオニンリンカーを、プラスミドpUC12-1.1 Cex(ＰＴＩＳ)からStuI-HindII Iフラグメントを切除し（米国特許第５，３４０，７３１号を参照のこと）、Ｓ１因子細胞外ドメインをコード化している遺伝子より下流のフレームに挿入した。構築物全体をNcoI-HindIIIフラグメントとしてpSLI1180から切除し、カセットを挿入することによってカナマイシン耐性を含むように予め一部変更してあった高発現レベルプラスミドpTug ＡＳに挿入した。このプラスミドをpSLF/CBD 1.0. と呼んだ。実施例２ＳＬＦ-ＣＢＤの発現および精製発現用に、プラスミドpSLF/CBD 1.0をＥ.coli ＪＭ101(Yanisch-Perron et al . (1985)Gene33：103-119)にトランスフォームした。幾つかのコロニーをプレートからこすり取り、これを使用して、５０mg/mlのカナマイシンが入っている５ml のTeriffic Broth試験管(Tartof and Hobbs,Bethesda Res.Lab.Focus9:12)に接種した。この試験管を振盪しながら、３７℃で４時間インキュベートし、これを使用して、同じ培地５００mlが入っているフラスコ４個に０．２容量％で接種した。細胞培養光学濃度（ＯＤ₅₀）が到達するまで、このフラスコを２５０rpmで振盪しながら３７℃でインキュベートした。０．１ｍＭＩＰＴＧを加え、１００ rpmでさらに８時間振盪しながら３０℃に変えることによって細胞を誘導した。細胞を収穫し、低浸透圧ショック（Neu and Heppel(1965)J.Biol.Chem.240:3685 -3692）で細胞周辺タンパクを分離した。Avicel微晶質セルロース（ＦＭＣ Inte rnational Cork,Ireland）５mgを、培養上清１０mlまたは細胞周辺抽出物１mlのいずれかに加え、その後、遠心分離で除去した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ装填緩衝液をA vivelに加え、これを２分間煮沸し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析用ゲルに直接装填した（Laemmli.前出）（図８ａ）。細胞周辺抽出物を、５０ｍＭトリス塩基(Boehringer-Mannheim. Indianapolis,ＩＮ)を使用してｐＨ８．０に緩衝化し、１０kDaポアサイズ膜による限外濾過で２mlに濃縮した。His-Bind樹脂(Novagen Inc.,Madison,ＷＩ,cat .no.69670)を詰めた２０mlカラムを使用し、１００ｍＭ〜２００ｍＭのイミダゾールでタンパクを溶離する金属キレートアフィニティクロマトグラフィー(ＭＣＡＣ)(Hochuli(1990)Genetic Engineering,Principles and Practice,Vol.12(Ｊ .Setlow.Ed.),pp.87-98,Plenum.ＮＹ)を使用して、試料を精製した。ピーク分画をプールし、溶離緩衝液をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と交換し、濾過を使用して試料を再度濃縮した。最終試料の純度をＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析で評価し、タンパク濃度を２８０ｎｍの波長における吸光度(Scopes(1974)Anal.Biochem.59:277 -282)、およびBradford法(Bradford(1976)Anal.Biochem.72:248-254)で測定した。試料の体積を減らすために最初の沈降工程を加えたこと以外は同じ方式で、培養上清に放出されたＳＬＦ-ＣＢＤを精製した。上清を０℃に冷却し、1 ＮＮＨ₄ＯＨを加えることによりｐＨを６．０５（融合タンパクの予期される等電点に維持しながら、８０％（w/v）飽和硫酸アンモニウムにした。沈降したタンパクを、１００００で遠心分離して回収し、ＭＣＡＣ装填緩衝液に再懸濁した。タンパクをＳＤＳ-ＰＡＧＥと抗ネズミＳ１因子ポリクローナル中和抗体(Ｒ＆Ｄ systems,Minneapolis,ＭＮ.cat.no.ＡＢ-455-ＮＡ)または抗-ＣＢＤ抗体のいずれかを使用したウエスタンブロッティング(Burnette(1981)Anal.Biochem.112: 195-203)の両者で分析した。ｐＴＫ-ＳＬＦ-ＣＢＤでトランスフォームしたＥ.coli ＪＭ101(Ong et al.(1 993)Biotechnol.Bioeng.42:401 409)の培養では、細胞周辺にも培養上清にもＳＬＦ-ＣＢＤ融合タンパクが存在しており、Avicel（図８Ａ参照）に結合させることによっていずれかの起源から回収することが可能である。Avicelを用いたアフィニティクロマトグラフィでＳＬＦ-ＣＢＤを精製することができるが、融合タンパクのセルロースへの結合は強力であり、逆転は困難である。精製用アミノ末端ヒスチジンアフィニティタグを使用する方が簡便であった。ニッケル−セファロース樹脂を詰めたカラムを使用した高速液体クロマトグラフィで細胞周辺のＳＬＦ-ＣＢＤを直接精製した（図８Ｂ）。タンパクは、１００〜２００ｍＭのイミダゾール濃度で、このカラムから単一ピークとして溶離した。コンディションド成長培地中のＳＬＦ-ＣＢＤは、限外濾過で初期量を減らした後、同じ方式で精製した。周辺細胞から最終収量０．７mg／Ｌの精製タンパクが得られ、上清から１．８mg/Ｌが得られた。このタンパクのアミノ末端配列分析で、シグナルペプチドが除去されていたことが確認され、ウエスタンブロッティングおよびＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析でタンパクの同一性が確認された（図９）。実施例３固定されたＳＬＦ-ＣＢＤを使用した細胞増殖の刺激細菌の微晶質セルロースをGilkes et al.(1992)Ｊ,Biol.Chem.276:6743-6749) に記載の通りに調製し、様々な濃度でハイブリドーマ無血清培地(Ｈ-ＳＦＭ)(ＧＩＢＣＯＢＲＬ，Grand Island,ＮＹ,Cat.No.12045-019)に懸濁した。精製ＳＬＦ-ＣＢＤの試料をＨ-ＳＨＭ中で希釈した。タンパク被験試料２０μ lを、滅菌９６ウェル組織培養プレート(Costar Corp.,Cambridge,ＭＡ,Cat.No. 3595)のウェルに入れた。ＢＭＣＣを使用する実験では、Ｈ-ＳＭＦ中ＢＭＣＣ懸濁液５０μlを各ウェルに加え、ＢＭＣＣを使用しない実験では、Ｈ-ＳＦＭ５０ μlのみを加えた。ＳＬＦ-ＣＢＤとＢＭＣＣを一緒に、３７℃、５％ＣＯ₂で１２時間インキュベートした後、密集の１日後まで成長させてから５×１０^-5細胞／mlの濃度でＨ-ＳＭＦに懸濁しておいたB6SUtA細胞(Greenberger et al.(1983) Proc.Nat'l Acad.Sci.ＵＳＡ 80:2931-2935)１００μlを加え、最終アッセイ量１７０μlとした。次に、培養を３７℃、５％ＣＯ₂で４８時間インキュベートし、細胞増殖を測定した。血球計での直接計数、またはＭＴＴアッセイ((Denizot and Lang(1 986)Ｊ.Immunol.Meth.89:271-277)のいずれかで測定した。リコンビナントＳ１因子(Ｒ＆Ｄ systems,Minneapolis,ＭＮ，Cat.No.455-ＭＣ)を陽性コントロールとして使用しリコンビナントＣＢＤを陰性コントロールとして使用した。因子Ｘａを使用する実験では、B6SUtA1細胞を加える前に、１２時間インキュベーション工程中に因子Ｘａ(Boehringer-Mannheim,Indianapolis,ＩＮ,Cat.No. 1179 888)２．５ngを試験ウェルに加えたこと以外は、前記の通りにアッセイを実施した。 GraFitバージョン3.0統計解析プログラム(Erithacus Software Ltd.,Staines, Ｕ.Ｋ.)の非線形回帰分析を使用し、２回繰り返して回帰曲線を当てはめて、データの統計解析を実施した。ＭＴＴ試験およびＳＬＦ依存性骨髄細胞株B6SUtA1を使用して、非固定ＳＬＦ- ＣＢＤ融合タンパクの活性を、アフィニティタグのないコントロールＳＬＦ(図１０Ａ）と比較した。タンパクの活性は類似しており、コントロールＳＬＦの非活性に基づいて予期される範囲内であった。ＳＬＦ-ＣＢＤの活性を、抗-ＳＬＦ中和ポリクローナル抗体（図１０Ｂ）で中和した。ＣＢＤのみでは、B6SUtA1細胞の増殖を刺激しなかった（データ表示せず）。ＢＭＣＣ存在下での生物学的活性細菌の微晶質セルロース（bacterial microcrystalline cellulose:ＢＭＣＣ) はAcetobacter xylium(ＡＴＣＣ 23769)により産生されるセルロースの高結晶質形である。調製後、ＢＭＣＣは、急速に沈降しない高表面積微細懸濁液を形成し、したがって、容易に希釈して所望の最終濃度を得ることができる。ＢＭＣＣの広い濃度範囲におよぶ、ＢＭＣＣの連続希釈液を調製し、その各濃度を、一定量のＳＬＦ-ＣＢＤを使用して試験した。１３０ｐＭのＳＬＦ-ＣＢＤの場合、約１μg/mlのＢＭＣＣ濃度で最大活性が認められ（図１１Ａ）。ＳＬＦ -ＣＢＤ濃度が１５００ｐＭに上昇すると活性が増大し、ピークが右に移動し（図１１Ｂ）たため、この系では、ＳＬＦ-ＣＢＤとＢＭＣＣの両者の濃度がBrSUt A1細胞の増殖応答に影響を与えることがわかり、ＢＭＣＣ上のＳＬＦ-ＣＢＤ最適表面濃度が必要なことが示唆された。一定量のＢＭＣＣに結合したＳＬＦ-ＣＢＤの影響１μg／mlまたは１４μg／mlの一定のＢＭＣＣ濃度を使用して、利用できるＢＭＣＣ表面の量を一定に保ち、ＳＬＦ濃度を変化させ逆の一連の実験を実施した。無アフィニティタグコントロールＳＬＦによって生じる活性は、ＢＭＣＣの存在による影響を受けなかったが（図12Ａ)、ＳＬＦ-ＣＢＤはＢＭＣＣの非存在下よりＢＭＣＣの存在下で明らかに活性が高く、総細胞増殖の増加、およびそのＥＤ₅₀値（最大応答の半分を引起こすのに要するタンパク濃度）の低下の両者が認められた（図１２Ｂ）。ＳＬＦ-ＣＢＤの分布を決定するために、遊離ＳＬＦ-ＣＢＤおよび結合ＳＬＦ -ＣＢＤを別々に試験した（図１３Ａ−１３Ｃ）．無タグＳＬＦコントロールの場合、活性の大部分は上清にあった（図１３Ａ）。ＳＬＦ-ＣＢＤでは逆で、活性の大部分はＢＭＣＣ粒子と関連していた（図１３Ｂ）。この試験から、使用したＳＬＦ-ＣＢＤの最高濃度でも、ＢＭＣＣ１μg／mlの結合能力を超えないことがわかった。ＳＬＦとＣＢＤの間に導入された因子Ｘａ部位で融合タンパクを切断するために因子Ｘａを加えることによって、ＢＭＣＣに結合したＳＬＦ-ＣＢＤを放出することが可能である。この処理後、活性の大部分が上清中に認められた（図１３Ｃ）。以上の結果から、可溶性形の融合タンパクによって生じる最高細胞密度は確かにコントロールタンパクによって生じるものほど高くないが、ＥＤ₅₀値は同じであったことがわかる。しかし、ＳＬＦ-ＣＢＤ融合タンパクをセルロース上に固定した場合、溶液中のＳＬＦ-ＣＢＤより有意に強力であり、有意に高い最大増殖応答を引起こし、より高い非活性を示した。この作用は、アフィニティタグがなく、固定することができないコントロールタンパクでは認められなかった。固定されたＳＬＦ-ＣＢＤの高い増殖活性がＢＭＣＣ濃度依存性であることは注目に値する。一定のＳＬＦ-ＣＢＤ濃度で、増殖応答はＢＭＣＣ濃度が上昇するにつれて最大値まで増大し、より高いＢＭＣＣ濃度で低減した。この実験でＳＬＦ-ＣＢＤの濃度が上昇すると、最大値はより高いＢＭＣＣ濃度に移動した（図１１Ｂ）。恐らく、非常に低いＢＭＣＣ濃度では最大表面積が制限され、非常に高いＢＭＣＣ濃度では、制限されるのはＳ１因子であり、ＢＭＣＣ表面上のＳＬＦ-ＣＢＤ密度が低減する。ＳＬＦ-ＣＢＤ濃度が上昇するとこの作用を弱め、ＳＬＦ-ＣＢＤの表面濃度が高くなる。特定のＳ１因子分子の表面濃度は、B6SUt A細胞の刺激に対して劇的な影響を与える。ＳＬＦ-ＣＢＤ濃度が１３０ｐＭの場合、ＢＭＣＣを加えると１μg/mlで最大になり、１５００ｐＭのＳＬＦ-ＣＢＤ濃度では、４．４μg/mlまで右に移動し、刺激レベルが上昇した（図１１）。明らかに、この培養の刺激レベルは、ＳＬＦの表面温度とセルロース表面の量の両者による影響を受ける。Gilkes et al,前出が報告したＢＭＣＣ粒子の寸法に基づけば、利用できる表面積は、ＢＭＣＣ μg当たり１．２２cm²である。両レベルのＢＭＣＣとも、表面上のＳＬＦ-ＣＢＤの密度は約４×１０¹⁰分子／cm²となるであろう。ＭＯ7e細胞と同様に、細胞直径を１０ｍｍ、且つ３５，０００c-kit受容体／細胞（Turner et al.(1995)Blood 85:2052- 2058）と仮定すると、細胞表面上の受容体密度は１．１×１０¹⁰受容体／cm²になるであろう。これらの推定値に基づけば、固定化マトリックを加えた影響は、ＳＬＦ-ＣＢＤ相対密度が細胞膜上のc-kit受容体の密度の４倍のときに最大であった。筆者らは、ＳＬＦ-ＣＢＤを上昇させ、表面積を１μg/ml（１．２２cm²/ml）で一定に保った影響も分析した。この場合、ＳＬＦ-ＣＢＤ密度７×１０¹¹分子／cm²に等しいＳＬＦ-ＣＢＤ濃度約２０００ｐＭのとき、最大刺激活性が確認された。この数値は、筆者らが細胞表面上の受容体密度に使用した推定値の約６０倍である。総合すると、ＳＬＦの密度が細胞表面上の受容体密度の約４倍のとき、刺激の閾値が存在することが、以上の結果から示唆される。ＳＬＦ表面密度が細胞膜上の受容体密度より３０〜６０倍高いとき、刺激活性が上昇し、ＳＬＦ濃度はその最大値に到達する。実施例４再生されたセルロース表面に固定されたときのＳＬＦ-ＣＢＤ生理学的活性の持続性酢酸セルロース（Kodak Inc.）１gを酢酸９９mlに加えることにより、酢酸セルロースの１％（w/v）溶液を調製した。この溶液１００μlを、上で使用した標準９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに加え、酢酸を蒸発させた。５０ｍＭＮａＯＨ１００μlを各ウェルに加え、２０分間放置して、セルロース表面を再生させた。ＮａＯＨを注ぎ出し、ウェルをＰＢＳで３回すすいだ。７０％（v/v ）エタノール３００μlを各ウェルに加え、プレートの蓋を元に戻し、滅菌工程と同様に、エタノールを蒸発させた。ＢＭＣＣの代わりに酢酸セルロース由来の表面を使用してＳＬＦ/ＣＢＤを固定したこと以外は、前述の通りに活性試験を実施した。タンパク試験試料２０μ lをセルロース被覆ウェルに入れた。Ｈ-ＳＦＭ５０μlをウェルに加え、１２時間インキュベートした後、B6SUtA細胞１００μlを加えて、標準最終体積１７０ μlとした。４８時間培養した後、ＭＴＴ試験を使用し、データポイント４重に収集して活性を測定した。コントロール群の細胞を、セルロース被覆プレートのウェル４個の各々および非被覆プレートのウェル４個の各々に加えた。この細胞を４８時間インキュベートした後計数し、表面が何らかの毒性を示すかどうかを決定した。上述の通りにセルロース被覆プレートにＳＬＦ-ＣＢＤを装填し、前記の通りにB6SUtA細胞を加えた。標準的な４８時間インキュベート期間の後、ＭＴＴ試験で活性を測定するために細胞を別のプレートに移し、古いプレートを温Ｈ-ＳＦＭ１５０μlで洗浄した。洗浄後、新たなB6SUtA試験細胞１７０μlを各ウェルに加え、４８時間インキュベーション期間を繰り返した。表面を細胞培養に計３回使用するために、全手順を繰り返した。別の実験で、ＳＬＦ-ＣＢＤをセルロース被覆プレートに結合させ、このウェルのＨ-ＳＦＭ上清を、細胞を加えずに４８時間毎に交換した。上清を３回交換した後、細胞をＳＬＦ/ＣＢＤ被覆表面に加え、４８時間インキュベートした後、ＭＴＴアッセイを実施した。無タグＳＬＦをコントロールとして使用した。１組のコントロール実験で、前記と同様、セルロース被覆組織培養ウェルにＳＬＦを加え、表面に新たな細胞を３回播種し、増殖を測定した。別の一連のコントロール実験で、セルロース被覆されていない組織培養プレートにＳＬＦ/ＣＢＤタンパクを加えた。この表面に細胞を３回接種し、活性を測定した。ＳＬＦ-ＣＢＤは、微量滴定プレートの底に適用された再構成セルロース表面にも結合した。この系で、セルロース表面からの細胞分離が容易になり、表面を連続数回の細胞培養に再使用することが可能であった。プレートに結合した活性または上清に残存する活性の分析で、実質的にすべてのＳＬＦ-ＣＢＤが結合していることがわかった（図１４Ａ）。同じ表面を繰り返し使用すると、３回の細胞成長中に、増殖活性の損失がないことがわかった（図１４Ｂ）。第３サイクルまで細胞を加えなかったこと以外は同様に処理した別のプレートから、同様の結果が得られた（図１４Ｂ）。ＳＬＦ-ＣＢＤ被覆プレートを繰り返し使用することが可能であったため、固定されたＳ１因子は細胞により消費されないことは明白である。対照的に、可溶性Ｓ１因子は細胞に吸収されて消費されるが、これは、刺激の持続期間を調節するホメオスタシス機構である公算が高い（Miyazawa et al.(1995)Blood 85:641- 649）。それ故、ＳＬＦを固定すると、成長因子の消費によるダウンレグレーションを防止することになるであろう。実施例５再生セルロース表面に固定されたＳＣＦ-ＣＢＤネズミ細胞増殖およびヒト細胞増殖の刺激 British Columbia Cnacer Reserch Centerの動物施設で生まれて飼育された８週齢の（Ｃ57ＢＬ/6Ｊ x Ｃ3Ｈ/HeJ）Ｆ1マウスの大腿から骨髄細胞を吸引した。ＳＣＦまたはＳＣＦ-ＣＢＤを含有し、且つ１μg/mlのＢＭＣＣを含有するまたは含有しない培地１mlに、細胞を最終濃度１×１０^-3細胞／mlで加えた。ネズミＩＬ3（５ng/ml）を並行試験培養に加えた。培養を３７℃/５％ＣＯ₂で５日間維持し、２回計数し、０．９％メチルセルロースを含有するMethocult ＧＦＭ3434培地（StemCell Technologies）で１：１０に希釈した。希釈した各培養１mlを35ｍｍのプレート２枚の各々に移し、１４日間インキュベートした後、標準的基準に従って、コロニーを評点化した。プレート２枚の各一対のコロニー計数を合わせ、１本の棒としてグラフにプロットした（図１５Ａ）。さらに１４日間インキュベートした後、プレートを写真撮影した（図１５Ｂ）。セルロース濃度を一定に保ち、ＳＣＦ濃度およびＳＣＦ-ＣＢＤ濃度を１５００Ｍから１０，０００ｐＭまで変化させた。ヒト細胞株ＭＯ7eおよびＴＦ−１を用いた実験を実施した。半最大応答（ＥＤ₅₀ ）（表７）を用量応答曲線（図４Ａ）から算出した。ＳＣＦ依存性骨髄細胞株B6SUtAの場合、ＣＢＤ単独ではB6SUtA細胞の増殖を刺激しなかった（データ表示せず）。セルロースの存在は、無アフィニティタグコントロールＳＣＦにより生じる活性に有意な影響を及ぼさなかった（表７）。しかし、半最大応答の低下（ＥＤ₅₀値の低下）に必要なタンパク濃度の低下によって実証された通り、３種の細胞系全てで、セルロース存在下のＳＣＦ-ＣＢＤはセルロース非存在下よりも明らかに活性であった。ＩＬ３はコロニーのサイズに影響を及ぼさなかった。実施例６ＣＢＤ_N1の分離 Escherishia coli ＪＭ101（SupE,thin-1，Δ（tac-proＡＢ）、（FtraD36,pr oAB,taclqZΔＭ15）（Yanish-Perron et al.(1985)Gene33:103-119）をプラスミドの維持用およびリコンビナントタンパクの産生用の宿主菌株として使用した。培養を、３０℃、液体トリプトン−酵母抽出物−リン酸培地（ＴＹＰ）中または Luriaブロス（カナマイシン（１００g/ml）を加えたＬＢ寒天）上で成長させた。 pTugKN1（図７参照）を担持するＥ.coli菌株ＪＭ101の一晩培養を、１００μ ｇカナマイシン／ｍｌを加えたＴＹＰで５００倍希釈し、光学濃度２．０〜３．０まで３０℃で増殖させた。イソプロピル-1-チオ−β-Ｄ-ガラクトピラノシド（ＰＴＧ）を最終濃度０．１ｍＭまで加え、細菌を３０℃でさらに１８時間インキュベートすることによってＰＢＤ_N1産生を誘導した。１３０００×ｇで１０分間遠心分離（４℃）することにより培養上清を清澄化させ、細胞を捨てた。セルロースによるアフィニティクロマトグラフィを使用して、以下のようにＰＢＤ_N1を精製した。ＰＢＤ_N1を結合させるために時々攪拌しながら、清澄化した培養上清を微晶質セルロース（Avicel）（５０mg、Ｌ−１）とインキュベートした（4℃）。Bushnerロート上のガラスフィルター（Whatman ＧＦ/Ａ）で、セルロース上清を濾過し、５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ 7.0中１Ｍ NaClで簡単に洗浄した。２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ 6．０で平衡化した陰イオン交換カラム（ MonoQ）に、結合したＰＢＤ_N1を充填し、流速１ml／分で操作した。タンパクはカラムにしっかり結合し、これを塩勾配（０〜１Ｎ NaCl、ｐＨ６．０）ではずした（図１６参照）。ＰＢＤ_N1を３００ｍＭの塩で回収した（図１５、ピーク１）。よりしっかり結合した汚染タンパクを、より高濃度の塩ではずした（図１６、ピーク２）。図１７は、精製中のＰＢＤ_N1のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示す図である。実施例７ＣＢＤ_N1およびＣＢＤ_N1N2に結合しているＨＥＣ、オオムギ−β−グルカンおよびキシランのアフィニティ電気泳動による分析アフィニティ電気泳動（Mimura et al.(1992)Ｊ.Chromatography597:345-350 ）を使用して、ＨＥＣおよびオオムギβ−グルカンなどＤＰ≧１５の、ＣＢＤ_N1 およびＣＢＤ_N1N2の可溶性多糖類への結合を同定し、評価した。オリジナルの連続的ディスク電位泳動法を不連続法と置き換えた。１種は多糖を含み（０．１％ w/v）、１種をリガンドを含まない、２種の未変性ゲルをBioRad電気泳動システムの同一プレート内に互いに隣接させて準備した。これによって、可溶性多糖の存在下または非存在下での分析は実質的に同一条件で実施されることが保証され、したがって観察された作用（結合性グルカンの存在下における減速）は変則的な電気泳動適移動の結果ではないことが保証される。各ゲルにおける陰性コントロールとしてＢＳＡを使用した。タンパク（各５mg）をゲルに負荷した。電気泳動は、４℃、ｐＨ８．２〜８．８の未変性条件下で２〜３時間行われた。ＣＢＤ_N ₁ およびＣＢＤ_N1N2はＨＥＣおよびオオムギβ−グルカンと相互に強く作用し、結果として、これらのオリゴ糖を含む（＋）ゲルにおける移動は、β−グルカンが存在しない（−）ゲルにおける移動に比べて、ひどく遅れる（図１８Ａおよび１８Ｂを参照のこと）。ＣＢＤ_N1およびＣＢＤ_N1N2はキシランに対してアフイニティを示さず、このグリカンの非存在下での移動に比べて、存在下でのゲルにおける移動の遅れは全く観察されない（図１８Ｃ参照）。Ｎ１およびＮ２は、それぞれＣＢＤ_N1およびＣＢＤ_N1N2を指す。実施例８ＣＢＤ_N1およびＣＢＤ_N1-融合タンパクに対するオリゴ糖結合定数の等温滴定微量熱量測定アフィニティ分配系に適した一組のリガンドを同定する目的で、微量熱量測定法を使用して、広範囲の水溶性オリゴ糖に対するＣＢＤ_N1の結合熱力学を測定した。データを下表８に示す。図１９は、Calorimetry Sciences Corp.モデル４２ＩＴＣを用いて測定した、５０ｍＭＰＢＳ中３５℃、ｐＨ７でヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）に結合しているＣＰＤ_N1の可逆的結合−等温データを示す。ＣＰＤ_N1はＨＥＣに強く結合し、その平衡結合定数は弱い抗体−抗原相互作用の範囲である。上記条件で、ＣＰＤ_N1に結合しているオオムギβ−グルカン結合はさらに強い（Ｋａ=８５，５００Ｍ^-1）。両オリゴ糖とも、ＣＰＤ_N1結合は、アフィニティ分配系で現在使用されているほぼ全てのＰＥＧを基礎とするアフィニティリガンド（たとえば、シバクロンブルー-ＰＥＧ、Procionレッド、ジニトロフェニル-ＰＥＧ、二酢酸-ＰＥＧ）と同等またはそれ以上に固い。この比較的高い結合アフィニティと、１つのオリゴ糖鎖が複数のＣＰＤ_N1融合タンパクに結合する能力とを組合せると、このアフィニティ分配系では能力も選択性もともに高くなることが示唆される。Ｎ1結合熱力学を下表８にまとめて示す。ＣＰＤ_N1のＨＥＣおよび β-グルカンへの結合は、両者とも猛烈な発熱反応であり、結合は低温で亢進するため、分配工程で温度低下を使用することができ、溶離工程で温度上昇を使用することができる。実施例９ＨＥＣとPluronicP105の混合物の相平衡分析３５℃、ｐＨ７の５０ｍＭＰＢＳ中、ＨＥＣとPluronlc Ｐ105（ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）コポリマー）の混合物にHayn esら(Fluld Equilibria(1989)53:463)の手順を使用して相平衡データを得た。図２０に示すように、安定な２相分配系が形成された。Pluronlc P105が約３％（w t/wt）より高くＨＥＣが％である任意の総ポリマー濃度で、かなり広範囲の２相組成物およびアフィニティ分配に有用な長さの平衡連絡線が得られる。実施例１０オリゴ糖ポリマーのＣＢＤ_N1に適した溶離条件の等温滴定微量熱量測定法平衡解離定数を温度、塩濃度およびタイプ、ならびにエチレングリコールや尿素などの補助溶剤の濃度の関数として測定することによって適当な溶離条件を決定するために、ＰＢＯ_N1-炭水化物複合物の好都合な水素結合構造を中断させるように設計されたＩＴＣも使用する。実施例１０ cen ＣＣＢＤ遺伝子フラグメントとＣ.fimiエンドヌクレアーゼＡ（cenＡ）遺伝子フラグメントの融合を含む発現ベクターの構築および融合タンパクの特性化ベクターの構築プラスミドｐＴＺ−ＪＣ２（図２１Ａを参照）をSmaIおよびHindIIIで完全に消化した。３．９kbpのフラグメントが回収された。プラスミドｐＵＣ18-1.6 ce nΔＰＴ（図２１Ｂを参照）をHpaIおよびHindIIIで完全に消化し、１．１kbpのフラグメントを回収した。３．９kbpのフラグメントと１．１kbpのフラグメントを連結するとｐＴＺ-ＪＣ13が得られた（図２１Ｃを参照）。Ｅ.coli ＪＭl01のトランスフォームに、このベクターを使用する。融合タンパクの酵素的特性化ｐＴＺ-ＪＣ13によりコード化された発現生成物（融合タンパク）の、Avicel 細菌の微晶質セルロース（ＢＭＣＣ）およびリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）に対する触媒活性を、もとのCenＡとその分離された触媒ドメインｐ３０とを比較して、特性化する。一定のアッセイ条件で、一定量の基質から生成した可溶性還元糖の量から比活性を決定する。還元糖を熱量測定法で測定し、グルコース標準を使用して決定する。クームスブリリアントブルーＧ-250の結合によってポリペプチド濃度を決定する（Gilkes et al,(1988)J.Biol.Chem.263: 10401-10407）。タンパク分解的分解に対する融合タンパクの感受性の評価融合タンパクを使用する際に考慮すべき重要なことは、タンパク分解的分解に対する耐性を含め、様々な条件化でのポリペプチドの安定性である。リンカー配列の非存在下におけるタンパク分解的分解に対する融合タンパクの感受性を、Ｃ .fimiプロテアーゼで評価した。Ｃ.fimiプロテアーゼによる融合タンパクの切断をＳＤＳ-ＰＡＧＥでモニタリングした（図２２を参照）。CenＡの安定性を基準にして、融合タンパクの安定性を比較した。結果を最適化するために、プロテアーゼ濃度およびタンパク分解条件を変えた。融合タンパクの結合特性の評価：分画吸収分析異なるセルロース異形仮像に関してＰＢＤ融合タンパクのアフィニティを明確にするために、様々なセルロースマトリックスへの結合を、結合分画のＳＤＳ- ＰＡＧＥ分析で簡単に評価することができる。この分析から、ＰＢＤ_N1は非晶質セルロース（ＰＡＳＣ）に結合するが、結晶質セルロース（bacterial microcry stallinecellulose: ＢＭＣＣ）に結合しないことがわかった。これに引き換え、ＣＢＣＤCenＡは両セルロース性材料に対してアフィニティを有する。このように結合特性が異なると、他者の存在下で１成分を選択的に除去することができる。第１工程で、ＢＭＣＣを加えてCenAを除去す。次に、第１工程後に溶液中に残ったＰＢＤ融合タンパクを、ＰＡＳＣに吸収させることによって除去した（図２３を参照）。セルロース濃度を基準にした様々なタンパク成分の濃度を、アッセイ中に広く変化させ、セルロースの未飽和、セルロースの飽和、セルロースの過飽和の影響を評価した。この異なる成分の選択的除去または結合、融合タンパクの処理および精製に使用する上で、重要な意味を有する。ＰＢＤを融合タンパクからタンパク分解的に除去し、ＣＢＤ-プロテアーゼを使用して多糖に結合させ、関心事の化合物を遊離させることができる。セルロース（たとえば、ＢＭＣＣ）への結合によってプロテアーゼを除去すると、純粋な化合物が残る。実施例１１オリゴ糖−ポリマーを基礎とするアフィニティ相分配を使用した Vero 細胞の分離に介在する二官能融合タンパクの生産および特性細菌菌株、細胞株および成長条件化学薬品はＨＰＬＣ分析用グレードであった。リコンビナントＤＮＡ実験は、アンピシリン(Boehringer Mannheim GmbH,Mannheim,Germany)を１００μg/mlで加えたＬＢ培地中、３７℃で成長させたE.coli ＪＭ101で実施した。高レベル発現試験および大規模タンパク生産は、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を加えたＴＹＰ培地（１リットル当たりトリプトン１６ｇ、酵母抽出物１６ｇ、NaCl ５ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ２．５ｇ）中、３７℃で成長させたE．coli Ｒ1360で実施した。細菌の培地成分はDifco Laboratories(Detroit,MI)のものであった。シェーカーフラスコ培養のシェーカー速度を２５０rpmに設定した。０．１５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド(IPTG,Sigma Chemical Co.,St.Louis,ＭＯ)で培養を誘導した。接着試験に使用したVero(アフリカミドリサル、腎−ＡＴＣＣＣＣＬ81)細胞は、３７℃、５％ＣＯ₂で、Ｔフラスコ内の、１０％ＮＣＳ( Gibco ＢＲＬ)を加えたＤＭＥＭ培地またはＤＭＥＭ/Ｆ12培地で維持した。リコンビナントＤＮＡ技術リコンビナントＤＮＡ作業はすべて前述の通りに実施した(Sambrook(1989)前出）。アルカリ溶解法で二本鎖ＤＮＡを調製した。ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離した。大きいＤＮＡフラグメントを、GeneClean^TM(Bi o101m La Jolla，ＣＡ)を使用して単離した。小さいＤＮＡフラグメント（１００bp未満）を、液体窒素法で単離した。すべてのトランスフォーメーションに凍結有能Ｅ.coli細胞を使用した。ＡＢＩ３８０ＡＤＮＡシンセサイザー(Applie dBiosystems,Foster City，ＣＡ)でオリゴデオキシヌクレオチドを合成し、Ｃ18 カートリッジクロマトグラフィで精製した。オリゴヌクレオチドのアニーリングをシークエンス緩衝液（４０ｍＭトリス−HClまたはｐＨ７．５、２０ｍＭ MgCl₂ 、５０ｍＭ NaCl）中、７４℃で１０分間実施し、続いて４℃でゆっくり冷却した。一部変更したＴ７ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ジデオキシ鎖末端法でＤＮＡの配列決定を行った(Sanger et al.,Proc.Nat'l Acad,Sci.USA（1977）74:5 463-5467)。ポリペプチド分析ドデシル硫酸ナトリムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）でポリペプチドを分析した。ゲルをクームスブリリアントブルーR250(BioRad, Richmond，ＣＡ)で染色し、ImageQuant^TMソフトウェアを備えた走査濃度計（Com puting Densitometer,Molecular Dynamics.Sunnyvale,ＣＡ）を使用してバンドを定量した。純粋なＣＢＰ_N1／ＲＧＤ標準を各組のゲルと共にインキュベートした。純粋なＣＢＤ/ＲＧＤで決定された減光係数(Scopes（1974）Anal.Biochem.5 9:277-282)を使用して、ＣＢＰ_N1／ＲＧＤの純調製品の濃度を280nmの吸光度で決定した。ウサギ抗CenＡ血清を一次抗体として使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Glbco ＢＲＬ）に結合したヤギ抗ウサギ血清複を二次抗体として使用して、ウエスタンブロットを実施した。オリゴ糖結合アッセイこれを、実施例８に記載の通りに実施した。ＣＢＰ_N1/ＲＧＤの大規模生産および精製ＣＢＰ_N1のコード配列を、R1360/pTZ18U-ＣＢＤ/ＲＧＤ構築における Cellulomonas fimiエンドヌクレアーゼＡ(CenＡ)のセルラーゼ結合ドメイン（ＣＢＤ）のコード配列と置き換えること以外はWierzba et al.Biotechnol.AndBoie ng．(1995)47: 147-154に記載の通りにＣＢＰ_N1を生産する。構築物を含むＥ.co liを、３７℃、１２リットルの発酵槽(Chemap ＡＧ,Volketswil, Switzerlamd)内、アンピシリン（１００μg/ml）およびＩＰＴＧ（０．１５ｍＭ）を加えたＴＹＰ培地中で成長させる。３１，０００ｇで遠心分離することにより、細胞を培地から分離する(Sharples-Stokes Division,Pennwalt Corp.,Warmi nster,ＰＡ)。実施例８に記載のＨＥＣとPluronic P105の混合物を使用するアフィニティー相分配を使用して、培地中および細胞分画中のＣＢＤ_N1／ＲＧＤを別々に精製した。細胞屑を除去するために、培地をＧＦ/Ｃグラスファイバーフィルター(Whatman International,Maidstone,ＵＫ)を通過させて濾過する。相分離系に培地を加える。ＶＢＤ_N1融合物をＨＥＣに結合させることによって分離が大幅に増強されるという重要な違いがある他の水性２相配分系の方法論（たとえば、Joshi et al.，Bioseparations,（1990）11:31）に従う。（最も大規模の分配系で使用される）商業的Graesser型接触器またはミキサー−沈殿装置(Haynes,Ph .Ｄ.Thesis,University of California,Berkeley(1991))のいずれかで、培養上清または細胞抽出物由来のＣＢＤ_N1融合タンパクのアフィニティ抽出が行われることがある。生成物の戻し抽出のため、ＣＢＤ_N1融合タンパクを含有し、炭水化物の多い抽出物相を第２のミキサー−沈殿装置にポンピングし、ポリ（オキシ− エーテル）の多い相を不相溶性塩で除去し、アフィニティ接触器にリサイクルする（Haynes et al.,AIChE J.,（1991）37: 140）。結合した標的タンパクを含み、炭水化物の多い抽出物相に、塩（通常は硫酸塩またはクエン酸塩）を十分に加えると、相が分離する(Walter et al.,Partjtioning in AqueousTwo-Phase Syst ems,Academic Press(1985)を参照のこと）。相分離に必要な２Ｍおよびそれより高い塩濃度は、リガンド−タンパク複合体の解離、それゆえ生成物回収の簡単な手段につながる場合が多い。ＣＢＤ_N1とＨＥＣとの間の猛烈な発熱結合は、温度を適度に上昇させるか、または水素結合破壊性補助溶剤を添加するかのいずれかによって解離を行えることを示す。ダイアフィルトレーションまたは他の脱塩方法論で余分な塩を除去する。懸濁液を、４℃で一晩、穏やかに攪拌する。溶離物を濃縮し、１ｋＤカットオフ膜を使用する限外濾過でdH₂O と交換する（５０ｎＭＧｄｍＣ１未満まで）（Amnicon Division,Ｗ.Ｒ.Grace & Co.,Bevely,ＭＡ）。ＣＢＤ_N1／ＲＧＤ溶液（５〜１２mg/mL)を濾過滅菌し（０．２μｍ)、−２０℃で保存する。 E.coli細胞を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．Ｏ）で洗浄し、３ｍＭＥＤＴＡを加えた同緩衝液１５０ｍＬに再懸濁し、フレンチプレス細胞（ＳＬＭInstruments,Urbana,IL）５０ｍＬで破壊した。フェニルメチルスルホニルフルオリド（１ｍＭ）およびペプスタチンＡ（１μｍ）を細胞抽出物に加えて、タンパク分解を最小限に抑える。４℃、１７，４００ｇで３０分間遠心分離することにより、細胞屑を除去する。硫酸ストレプトマイシン(Sigma)を上清に加える（１．５w/v）。４℃で一晩インキュベートした後、４℃、１７，４００ｇで３０分間遠心分離することにより、沈殿を回収する。上清をアフィニティ分配系に加え、培養ブロスに関して上述した通り、ＣＢＤ_N1/ＲＧＤを精製する。細胞分離アッセイトリプシンおよびＥＤＴＡで細胞を培養皿からはずし、０．０１％大豆トリプシンインヒビター(Sigma)を含むＤＭＥＭ培地で１回洗浄し、インヒビターを含まないＤＭＥＭ培地で２回洗浄する。合計４×１０⁶の洗浄細胞に、無血清培地中のＣＢＤ_N1を加える。３７℃で１時間インキュベートした後、ＣＢＤ_N1／ＲＧＤ結合した細胞をアフィニティ相分配系に加える。ＨＥＣ相を分離した後、トリプシンを加えて細胞をＨＥＣから遊離させ、遠心分離で細胞を回収する。トリパンブルー除外を使用して、細胞の生育能を評価した。上述の結果は、Ｓ１因子細胞外ドメインおよびセルラーゼ多糖結合ペプチド（ＳＬＦ-ＣＢＤ）から成る成長因子複合体の構築および精製を示す。ＳＬＦ-ＣＢＤは、微晶質セルロースに結合させると、非固定Ｓ１因子より大幅にＳ１因子応答性細胞の増殖を刺激する。固定されたＳＬＦ-ＣＢＤは、非固定Ｓ１因子と比較して、より高い比活性とより高い最大増殖応答の両者を示す。セルロース表面に結合したＳＬＦ-ＣＢＤは、成長刺激活性を喪失せずに、数回再使用することができる。本願明細書に記載のすべての出版物および特許出願は、本発明が属する当該技術における熟練者の技術水準を示すものである。すべての出版物および特許出願を、個々の出版物および特許出願を具体的且つ個別に引用して本願明細書の一部とするように指定されているかのように、引用することにより本願明細書の一部をなすものとする。本発明を十分に説明したので、当該技術における普通のの技術者には、添付の請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変更および修飾を行えることが明白であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハンフリーズ，キース・アールカナダ国、ヴイ５ピー３シー９ブリティッシュ・コロンビア、ヴァンクーヴァー、ボーデン・ストリート 7625 (72)発明者ドーニー，ジェイムズ・ジーカナダ国、ヴイ６アール２ジェイ３ブリティッシュ・コロンビア、ヴァンクーヴァー、ウェスト・テンス・アヴェニュー 4691―＃202 (72)発明者ジャーヴィス，エリックカナダ国、ヴイ６ティー２シー８ブリティッシュ・コロンビア、ヴァンクーヴァー、モンゴメリー・ロード 5617 (72)発明者アリモンティ，ジュディカナダ国、ヴイ６エム４エイ６ブリティッシュ・コロンビア、ヴァンクーヴァー、ヴァイン・ストリート 6020―＃312

Claims

【特許請求の範囲】１．特異的結合対の第１メンバーと、ポリサッカライダーゼ由来の基質結合領域を含むアミノ酸配列と前記特異的結合対の第２メンバーとを含む複合体であって、前記アミノ酸配列は前記ポリサッカライダーゼの加水分解活性が実質的に欠如しており、前記特異的結合対の前記第１メンバーは成長因子受容体であることを特徴とする複合体と、を含む組成物。２．前記ポリサッカライダーゼがβ-1,4-グルカナーゼである、請求項１に記載の組成物。３．前記β-1,4-グルカナーゼがセルラーゼであることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。４．前記セルラーゼがCellulomonas fimi（セルロモナス・フィミ）から得られることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。５．前記アミノ酸配列が前記ポリサッカライダーゼの基質に結合していることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。６．前記基質が不溶性であることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。７．前記成長因子受容体がサイトカインの受容体またはリンホカインの受容体であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。８．前記成長因子受容体がＳ１因子、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、マスト細胞成長因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、および上皮成長因子の受容体から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。９．特異的結合対の第１メンバーと、ポリサッカライダーゼ由来の基質結合領域を含むアミノ酸配列と前記特異的結合対の第２メンバーとを含む複合体であって、前記アミノ酸配列は前記ポリサッカライダーゼの加水分解活性が実質的に欠如しており、前記特異的結合対の前記第１メンバーはＭＨＣポリペプチド、Ｔ細胞受容体、c-kit遺伝子生成物、およびイムノグロブリンから成る群から選択されることを特徴とする複合体と、を含む組成物。１０．前記成長因子受容体が幹細胞、キラーＴ細胞、巨核球および線維芽細胞から成る群から選択された細胞に由来することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。１１．前記第１メンバーがin vitroで成長させた細胞の表面上の成長因子受容体であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。１２．ポリサッカライダーゼ由来の基質結合領域を含むアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は前記ポリサッカライダーゼの加水分解活性が実質的に欠如しており、第１成長因子および第２成長因子に結合していることを特徴とし、前記第１成長因子と第２成長因子は異なることを特徴とするアミノ酸を含む二官能組成物。１３．前記第１成長因子はＳ１因子であり、前記第２成長因子がインターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、マスト細胞成長因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、および上皮成長因子の受容体から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。１４．成長因子依存細胞のin vitro拡大の方法であって、前記成長因子および前記ポリサッカライダーゼの基質上に固定されたポリサッカライダーゼ由来の基質結合領域を含むアミノ酸配列を含む組成物と接触させて前記細胞を成長させることを含み、前記アミノ酸配列は前記ポリサッカライダーゼの加水分解活性が実質的に欠如していることを特徴とし、前記細胞は前記成長因子に対して成長応答性であることを特徴とする前記方法。１５．前記細胞は造血細胞であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。１６．前記細胞は多能性であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。１７．前記細胞は幹細胞であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。１８．前記細胞は巨核球であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。１９．前記細胞は骨髄または血液に由来することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。２０．前記アミノ酸配列は生体外用具内に含まれている多糖マトリックスに結合していることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。２１．Ｓ１因子依存細胞のin vitro拡大の方法であって、Ｓ１因子および前記ポリサッカライダーゼの基質上に固定されたポリサッカライダーゼ由来の基質結合領域を含むアミノ酸配列を含む組成物と接触させて前記細胞を成長させることを含み、前記アミノ酸配列は前記ポリサッカライダーゼの加水分解活性が実質的に欠如していることを特徴とする前記方法。２２．成長因子受容体を有する細胞の多い細胞個体群を得る方法であって、前記成長因子の細胞表面受容体を有する複数の細胞を、前記成長因子および前記ポリサッカライダーゼの基質に結合しているポリサッカライダーゼ由来の基質結合領域を含むアミノ酸配列を含む組成物と接触させることと、前記細胞表面受容体が欠如しているあらゆる細胞を除去し、それによって成長因子受容体を有する細胞の多い細胞個体群を得ることとを含む前記方法。２３．前記基質が微小担体の形をとることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。２４．前記アミノ酸配列が固体担体と関連した多糖マトリックスに結合していることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。２５．前記基質が酢酸セルロースであることを特徴とする、請求項１４または２２に記載の方法。２６．前記基質が微晶質セルロースの形をとることを特徴とする、請求項１４または２２に記載の方法。２７．前記基質が膜であることを特徴とする、請求項１４または２２に記載の方法。