JPS62201582A - 新規プラスミド、微生物細胞及びヒト免疫グロブリンＧ Ｆｃ領域蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）技術分野 本発明はヒト免疫グロブリンＧ（以下″ＩｇＧ”と略す
こともある）Ｆｃ領域蛋白質コードするＤＮＡ断片を有
する新規組換えプラスミド、該プラスミドにより形質転
換された新規組換え微生、物細胞、及び該微生物を用い
たヒ）ＩｇＧ　　Ｆｃ領域蛋白質の菌体外分泌による製
造方法に関する。

（２）発明の背景 すべてのを椎動物の体液中に存在し、抗原と特異的に結
合する能力を有する蛋白質が抗体であり、抗体蛋白質と
構造的、機能的関連をもつ蛋白質は総称して免疫グロブ
リンといわれている。免疫グロブリン（以下“Ｉｇ”と
略すことがある）は、物理化学的あるいは免疫学的な性
状から、ＩｇＧ、ＴｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ％　ＩｇＤの
５つのクラスに分類される。

なかでもＩｇＧは細菌やウィルスに対する生体防御に重
要な役割を持っており、従来より、ヒトＩｇＧを多量に
含むγ−グロブリン画分をヒトの血液より分離し、−都
度性することにより重症患者のための免疫製剤として用
いられてきた。しかしながら、これは原料を人血に依存
しており、その大量の安定した人手が困難であること、
またそのために均質で安全なものを常時得にくいという
難点があった。そこでヒト免疫グロブリンを遺伝子操作
技術によって産出することができれば、医薬品製造のた
めに極めて有利であることは論を待たない。

さて、ヒトＩｇＧは２本のＨ鎖（ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉ
ｎ）と２本のし鎖（ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ）がジスル
フィド結合で結ばれた形をとる。ヒト１５０分子にパパ
インなどの蛋白質分解酵素を作用させると分子中央で切
断され、抗原結合活性のある断片（Ｆａｂ領域蛋白質）
と、抗原結合活性はなく条件により結晶化しやすい断片
（ＦｃｊＪｒ域蛋白質）とに分かれる。

Ｆ　ａ　ｂ　領域蛋白質はＬ鎖全体とＨｔｌ’（のアミ
ノ末端側の半分を含み、１分子のＩｇＧから２分子のＦ
ａｂ領域蛋白質が生じる。一方、Ｈ鎖のカルボキシル末
端側の半分であるＦｃ領域蛋白質は、ヒンジ（ｈ）　、
ＣＩ＋　２、Ｃ，３０３つの部位より成り、ヒンジ部位
において２本の鎖がジスルフィド結合によって結ばれて
いる。そして、ＦｃｅＭ域蛋白質はエフェクター（ｅｆ
ｆｅｃｔｏｒ）機能を有している。

従来、Ｔ−グロブリン製剤は、無（低）γ−グロブリン
血症への補充、ウィルス感染症の予防と治療投与、等に
適用されてきた。近年、γ−グロブリン製剤が特発性血
小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）治療に有効でありＣＰ、　
Ｉｍｂａｃｈら、　Ｌａｎｃｅｔ、上。

１２２８（１９８１））　、特にそのＦｃ領域が重要で
あることが示唆されている〔朴ら、臨床免疫、１５　（
Ｓｕｐｐｌ、７　）　７６（，１９８３））。また、全
身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等における腎糸球体沈
着免疫複合体が、ヒ）ｒｇＧ　　Ｆｃ領域蛋白質の添加
により融解したという報告もある〔河住ら、臨床免疫、
■。

２４０（１９８４）　）。以上のように、Ｆｃ領域蛋白
質は、ＩＴＰやＳＬＥのような自己免疫疾患の治療薬と
して用いることができる可能性があるが、作用機序など
を含めて不明な点が多い。十分な量のＦＣ領域蛋白質を
供給できないことが、この理由の１つとなっている。

近年の遺伝子操作技術の発達により、種々の有用蛋白質
の微生物等を用いた生産が可能になった。

しかしながら、通常、有用蛋白質は主として菌体内に蓄
積されるものであり、所望の有用蛋白質を菌体外に分泌
する微生物は限られたものしか知られていない。有用蛋
白質を微生物菌体内に産生させた場合には菌体５体積を
越える生産量は期待できないが、菌体外に分泌させれば
有用蛋白質の、より多量の生産が可能になる。また、宿
主微生物に対してｔｏｘｉｃな有用蛋白質や、菌体内プ
ロテアーゼに高感受性な有用蛍白質の生産においても、
菌体外分泌が有利である。さらに、一般に分泌性蛋白質
の種類はそれほど多くないため、有用蛋白質を菌体外に
分泌させればその精製工程の簡略化が期待でき、工業的
にみてコストダウンがはかれる。

以上の理由により、所望の有用蛋白質を生産し、菌体外
に分泌するような微生物を任意に創製することができれ
ば、その産業上の利用性は極めて大きい。

一般に菌体外に分泌される蛋白質は、アミノ末端に２０
〜４０残基程度のアミノ酸からなるシグナルペプチドと
いわれるものがついた状態で産生され、細胞膜を透過し
分泌されるときにシグナルペプチダーゼという酵素によ
ってシグナル領域が切断されて、蛋白質が外に分泌され
る。この機構は基本的に高等生物でも微生物でも同様に
考えられ、オ来分泌されない蛋白質にシグナルペプチド
をつけてやることによって、細胞膜を透過させることも
可能なわけである。

大腸菌〔エシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃ。

１ｉ）は、その周囲を内膜・外膜という二つの膜で囲ま
れており、内膜と外膜との間にはべりブラズムと呼ばれ
る空間が存在する。従って、シグナルペプチドを用いる
ことにより内膜を通過した蛋白質は、外膜を通過できな
いためペリプラズムに蓄積してしまうことになるため、
大腸菌における本当の意味での菌体外分泌を考えた場合
、シグナルペプチドのみでは不充分である。

近年、本発明者らの一部は、プラスミドベクター　ｐ　
Ｍ　Ｂ　９　　（Ｒ，Ｌ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　ら、　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　　ｉｎ　
　ｔｈｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐ
ｒｅｓｓ＋ｏｎ＋　　ＩＣＮ　　−ＵＣＬＡ＋　　ｓｙ
ｍｐ、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｔｏｌ（ｅｄ、Ｄ、Ｐ、Ｎ
１ｅｒｌｉｃｈら）、Ｖ、　　４７１．八ｃａｄｅｍｉ
ｃ　　Ｐｒｅｓｓ　　Ｉｎｃ、、Ｎｅ５ｖ　　Ｙｏｒｋ
（１９７６）〕を用い、好アルカリ性バチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）隘１７０株（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−４６７）
由来の染色体ＤＮＡより、ペニシリナーゼ遺伝子の大腸
菌によるクローン化に成功した（Ｔ、　Ｋｕｄｏら、Ｊ
、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋　’１５６、９４９　（１９
８３）　）。

この際に、ペニシリナーゼ蛋白質の大腸菌菌体外への分
泌が見られ、ｐＭＢ９プラスミド上に存在するプロモー
ターを持たないＫｉｌ遺伝子を、好アルカリ性バチルス
Ｎ１１７０株由来のＤＮＡ断片中のベニシリナーゼ遺伝
子近傍に存在するプロモーター活性を有する領域（ＥＸ
プロモーター）により活性化させることにより、大腸菌
外膜の透過性が増大していることが明らかとなった〔堀
越。

現代化学、１７６．５６（１９８５）　）。

そこで、本発明者らは、この菌体外分泌に関する研究を
更に進めた結果、ヒ）ＩｇＧ、Ｆｃ領域蛋白質の菌体外
分泌発現に成功し、本発明を完成するに至ったものであ
る。

（３）発明の目的 本発明の目的は、ヒトＩｇＧＦｃ領域蛋白質をコードす
るＤＮＡを含むＤＮＡ断片及びその断片が組み込まれた
新規組換えプラスミドを提供することにある。

本発明の他の目的は、上記新規組換えプラスミドによっ
て形質転換され、目的とするヒトＩｇＧＦｃ領域蛋白質
を、菌体外に産生じ得る新規組換え微生物細胞を提供す
ることにある。本発明の更に他の目的は、該微生物細胞
を用いてヒトＩｇＧ　　Ｆｃ領域蛋白質を菌体外分泌生
産させる方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明により一層明らか
になるであろう。

（４）発明の構成 本発明者の研究によれば、前記本発明の目的は、ｉ）ヒ
ト免疫グロブリンＧＦｃ領域蛋白質をコードするＤＮＡ
領域、該蛋白質の発現調節を行なうプロモーター機能を
有するＤ　Ｎ　Ａ　ｅＸ域、及びシグナルペプチドをコ
ードする［）　Ｎ　Ａ　ｅＩ域を有するＤＮＡ断片、及
び、 ｉｉ　）実質的に菌体外分泌を促進する作用を宿主綿。

胞に与えるＤ　Ｎ　Ａ　％ｌ域、及び該ＤＮＡ領域の発
現調節を行なうプロモーター機能を有するＤ　Ｎ　Ａ　
’ｙｆＪ域、 を有するＤＮＡ断片を含むプラスミド、そのプラスミド
によって形質転換された微生物細胞及びその微生物細胞
を用いてヒト免疫グロブリンＧＦｃ領域蛋白質を菌体外
分泌生産させる方法を提供することによって達成される
ことがわかった。

以下、本発明について更に詳細に説明する。

（ヒト免疫グロブリンＧＦｃ領域遺伝子のクローン化） ヒ）ＩｇＧを産生ずる細胞、たとえばヒト骨髄腫細胞Ａ
ＲＨ７７株（Ｋ、Ｈ，Ｂｕｒｋら＋Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　
Ｒｅｓ、。

皿、２５０８（１９７８）　）を、適当な条件下、たと
えば３７℃、炭酸ガス濃度５％で培養増殖させ、得られ
た細胞を遠心分離によって集める。この細胞を、たとえ
ばラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような界面活性
剤存在下で、たとえばプロテアーゼにのような蛋白質分
解酵素を用いて溶解させる。さらに、たとえばフェノー
ルによる抽出によって除蛋白質を行ない、ヒト染色体Ｄ
ＮＡを得る。

こうして得られたＤＮＡを、例えばＥＣＯＲ１のような
制限酵素で切断し、適当なファージ・ベクター、たとえ
ばシャロン４八ベクター　（Ｐ、Ｒ，Ｂｌａｔｔｎｅｒ
ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９６．１６Ｈ１９７７））
と連結した後、イン・ビトロ・パッケージング（Ａ、Ｂ
ｅｃｋｅｒら。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔｌ　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪＳ
Ａ、　７２．５８１　（１９７５）　）を行ない、ヒト
の遺伝子ライブラリーを得る。ＥｃｏＲ■以外の制限酵
素を用いる場合や、クローニングサイトとしてＥｃｏＲ
Ｉをもたないような他のファージ・ベクターを使用する
場合には、適当なリンカ−ＤＮＡを用いれば遺伝子ライ
ブラリーの作成が可能になる。

この遺伝子ライブラリーのファージを、たとえばエシェ
リヒア・コリＬＥ３９２株（ＡＴＣＣ３３５７２）に感
染、プラークを形成させ、たとえばプラーク・ハイブリ
ダイゼーション法（Ｗ、Ｄ、Ｂｅｎｔｏｎら。

５ｃｉｅｎｃｅ　、　１９６　、１８０（１９７７）　
）によって目的クローンの選択を行なう。プローブとし
ては、たとえばニックトランスレーション法（Ｐ、１１
．Ｊ、Ｒｉｇｂｙ　ら。

Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、＋１１３．２３７（１９７７）
　）により３２ｐ標識を行なったヒト免疫グロブリンＨ
鎖Ｊ領域（Ｆａｂ領域の中の一部であり、抗原結合活性
を有する可変部とエフェクター機能を有する定常部との
境界に存在）遺伝子や、あるいはヒ）ＩｇＧ　　ＦＣＦ
ｌＩ域蛋白質のアミノ酸配列に対応すると考えられる塩
基配列をもつオリゴヌクレオチドを化学合成した後、こ
れを３２ｐ標識したものを用いることができる。

このプラーク・ハイブリダイゼーションによって陽性を
示したクローンの制限酵素切断点地図を作成し、ヒト染
色体由来のＤＮＡ断片を、たとえばｐＢ　Ｒ３２２（Ｆ
、Ｂｏｌｉｖａｒ　ら、　Ｇｅｎｅ、　　２．９５（１
９７７）〕のようなプラスミド・ベクターにサブクロー
ニングする。得られたサブクローンの挿入部分のＤＮＡ
塩基配列を、たとえばマキサム・ギルバート法（Ａ、Ｍ
、Ｍａｘａｍ　ら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
、、　６５＋４９９（１９８０）　）あるいはＭ１３フ
ァージを用いたジデオキシ・チェーン・ターミネーショ
ン法（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋　　９．３０９（１９８１）　）の
方法により決定し、ヒＩ−ＩｇＧ　　Ｆｃ領域遺伝子の
存在を確認する。第１図に、ヒ）ＩｇＧ　　Ｆｃ領域蛋
白質のアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡ塩基配
列の一例を示す。

こうして得られたヒトＩｇＧＦｃ９１域遺伝子は、ヒト
染色体のものであるから、実際にアミノ酸をコードしな
いイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）を含んでおり、このまま
では微生物中で発現させることはできない。そこでこの
Ｆｃを領域遺伝子を適当な制限酵素で切断し、イントロ
ンの部分を完全に除去する。この制限酵素切断の際に、
実際にアミノ酸をコードするエクソン（ｅｘｏｎ）の部
分も削られてしまうことがありうるが、その場合には化
学合成したオリゴヌクレオチドのジヨイントを用いて削
られた部分を修復させると共に、隣り合ったエクソン同
志を連結させる。同時に、合成オリゴヌクレオチドを用
いた同様な手法により、Ｆ　ＣｊＩ域遺伝子の３′末端
に読みとりフレームを一致させるように翻訳終止コドン
（ＴＧＡ、ＴＡＧ、ＴＡＡ）を２つ以上タンデムに連結
し、発現効率の向上をはかることもできる。ここで得ら
れたイントロンのないＦｃＳｉ域遺伝子は、やはり合成
オリゴヌクレオチドを用いた手法を用い、その上流に読
みとりフレームを一致させるように翻訳開始コドンを付
与することができる。さらにこのＦｃ領域遺伝子は、適
当なプロモーター、ＳＤ（シャイン・ダルガーノ）配列
の下流につなぐことにより、菌体内発現型遺伝子とする
ことができる。使用可能なプロモーターとして、トリプ
トファン・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモータ
ー）、ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプ
ロモーター）、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター
、ｒｒｒプロモーター等かあげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターやｔａｃプロモーターが好適であるａ　
Ｆ　ＣＳｆｆ域遺伝子を効率良（発現させるためには、
プロモーター、ＳＤ配列、翻訳開始コドン、翻訳終止コ
ドンのすべてを連結したものが好ましく、プロモーター
、ＳＤ配列、翻訳開始コドン、ＦｃＴｉ１域遺伝子及び
翻訳終止コドンが、この順序で連結したものがとりわけ
好ましい。

本発明の菌体内発現型ヒトＩ　、ｇ　Ｇ　　Ｆ　ｃ　領
域遺伝子を、適当なプラスミド・ベクター、たとえばｐ
ＢＲ３２２に挿入することにより、発現型プラスミドが
作成できる。菌体内発現型プラスミドとして、好ましく
は、ｐＦｃ２０３　、ｐＦｃ２１１　、ｐＦＣ３６１、
ｐ　Ｆ　Ｃ３６２が用いられる。

（好アルカリ性バチルス魚１７０株ベニシリナーゼ遺伝
子のクローン化） ペニシリナーゼ生産能を有する好アルカリ性バチルスＩ
’ｈ　１７０株（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−４６７）を適当な
条件下、たとえば３０℃で振とう培養し、得られた菌体
を遠心分離によって集める。この菌体から、公知の方法
、たとえばフェノール法によってＤＮＡを抽出し、染色
体ＤＮＡを得る。

こうして得られたＤＮＡを、たとえばＥｃｏＲＩのよう
な制限酵素で部分的に切断し、適当なプラスミドベクタ
ー、たとえばｐＭＢ９プラスミドのＥＣＯＲＩサイトへ
の挿入を行ない、好アルカリ性バチルス階１７０包体色
体ＤＮＡを組み込んだ組換えプラスミドを得る。この組
換えプラスミドを、たとえばエシェリヒア・コリＨＢ　
１０１株（ＡＴ　ＣＣ３３６９４）に公知の方法、たと
えばＣａＣｌ２法（Ｍ、Ｖ、Ｎｏｒｇａｒｄ　ら、　Ｇ
ｅｎｅ、、３．２７９（１９７Ｂ）　）を用いて導入、
アンピシリン及びテトラサイクリンに耐性の形質転換株
をスクリーニングすることにより、好アルカリ性バチル
スＮ１１７０株ペニシリナーゼ遺伝子及びペニシリナー
ゼの菌体外分泌生産に関与する情報を担うＤＮＡ領域を
有する組換えプラスミド、たとえばｐＥＡＰＩを得る。

得られた組換えプラスミドのＤＮＡ塩基配列を、たとえ
ば前記マキサム−ギルバート法あるいは前記Ｍ１３ファ
ージを用いたジデオキシ・チェーン・ターミネーション
法により決定し、ペニシリナーゼ遺伝子プロモーター領
域、シグナルペプチド領域、成熟ペプチド領域の構造、
さらにペニシリナーゼの菌体外分泌に関与する好アルカ
リ性バチルス階１７０株由来のＥｘプロモーター領域及
びｐＭＢ９プラスミド由来のＫｔｌ遺伝子の構造を明ら
かにする。第１図に、好アルカリ性バチルス阻１７０株
ベニシリナーゼ遺伝子プロモーター領域・シグナルペプ
チド領域のＤＮＡ塩基配列を示す。また、第２図にプラ
スミドｐＭＢ９由来のＫｉｌ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を
、第３図に好アルカリ性バチルス患１７０株由来のＥｘ
プロモーター領域のＤＮＡ塩基配列を、それぞれ示す。

さらに、シグナルペプチド領域及びＫｉｌ遺伝子につい
ては、対応するアミノ酸配列も合わせて示す。

このペニシリナーゼ遺伝子及びペニシリナーゼの菌体外
分泌生産に関与する情報を担うＤＮＡ領域を有する組換
えプラスミドを出発材料として、自然欠失を利用した方
法、あるいはＳｌ−ヌクレアーゼ、ＤＮＡ−ポリメラー
ゼ等の修飾酵素や合成オリゴヌクレオチドを用いる人為
的方法により、好アルカリ性バチルス１１ｈ１７０株由
来のＥｘプロモーター領域とプラスミドｐＭＢ９由来の
Ｋｉｌ遺伝子から成る菌体外分泌生産に関与する情報を
担うＤ　Ｎ　Ａ　ｖ４域全域、及びペニシリナーゼ遺伝
子の全域あるいは一部を含む、組換えプラスミドが得ら
れる。このようなプラスミドとして、好ましくはｐＥＡ
Ｐ３、ｐＥＡＰ６、ｐＥＡＰ７、ｐＥＡＰ７ΔＨ，ｐＥ
ＡＰ７ΔＣＣＨＳｐＥＡＰ７ΔＣＨ，ｐＥＡＰ８、ｐ３
２９ＥＸＫが用いられる。

また、上述のベニシリナーゼ遺伝子及びペニシリナーゼ
の菌体外分泌生産に関与する情報を担うＤＮＡ領域を有
する組換えプラスミドを、適当な制限酵素で切断し、ペ
ニシリナーゼ遺伝子プロモーター領域及びシグナルペプ
チド領域を含むＤＮＡ断片を得る。このＤＮＡ断片を、
必要なら適当な合成オリゴヌクレオチド・リンカ−を介
して、適当なプラスミドベクター、たとえばｐＣＭＩ（
Ｔ。

Ｊ、Ｃ１ｏｓｅとＲ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｇｅｎｅ、
　２０．３０５（１９８２））　　とｐ　ＣＭ　？　（
Ｔ、Ｊ、Ｃ１ｏｓｅとＲ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｇｅｎ
ｅ＋　２０＋３０５（１９８２）　）とのハイブリッド
・プラスミドｐｃＭ７１にクローン化し、ペニシリナー
ゼ遺伝子プロモーター領域及びシグナルペプチド領域を
有するプラスミドが得られる。ペニシリナーゼ遺伝子プ
ロモーター領域及びシグナルペプチド領域を有するプラ
スミドとして、好ましくはｐＰｓｌ、ｐＰｓ１ΔＨ，ｐ
３２９Ｐｓが用いられる。

（分泌型プラスミドの作成） 前に得られたヒ）ＩｇＧ　　Ｆｃ領域菌体内発現型プラ
スミド、たとえばｐ　Ｆ　Ｃ３６２を、適当な制限酵素
で切断することにより、菌体内発現のためのプロモータ
ー領域を削除し、その部分に適当なプロモーター領域及
びシグナルペプチド領域、たとえば好アルカリ性バチル
スＩｌｈ　１７０株ペニシリナーゼ遺伝子シグナルペプ
チド領域との連結用の合成オリゴヌクレオチド・ジヨイ
ントを挿入した形のプラスミドを得る。このようなプラ
スミドとして、好ましくはｐＳＥＣ−ＦＣ，ｐＳＥＣ−
ＦＣＣが用いられる。

次にこのプラスミドに、適当なプロモーター領域及びシ
グナルペプチド領域を有するプラスミドを適当な制限酵
素で切断することにより得られる適当なプロモーター領
域を有するＤＮＡ断片及びシグナルペプチド領域を有す
るＤＮＡ断片を挿入し、適当なプロモーター領域及びシ
グナルペプチド領域下流にヒ）ＩｇＧ　　Ｆｃ領域遺伝
子が連結した形のプラスミドが得られる。このようなプ
ロモーター領域・シグナルペプチド領域を有する遺伝子
としては、大腸菌β−ラクタマーゼ遺伝子、大腸菌アル
カリ性ホスファターゼ遺伝子、大腸菌リポプロティン遺
伝子、枯草菌ベニシリナーゼ遺伝子、枯草菌プロテアー
ゼ遺伝子、酵母α因子遺伝子、好アルカリ性バチルスＩ
ｌｈ　１７０株ペニシリナーゼ遺伝子、好アルカリ性エ
アロモナス（＾ｅｒｏｍｏｎａ　ｓ　）　Ｎｎ　２１２
株キシラナーゼ遺伝子、好アルカリ性バチルスＮＩＮ’
−４株セルラーゼ遺伝子、好アルカリ性バチルス１１ｈ
１１３９株セルラーゼ遺伝子等があげられるが、好まし
くは好アルカリ性バチルスＮ［Ｌ１７０株ペニシリナー
ゼ遺伝子が用いられる。適当なプロモーター領域、適当
なシグナルペプチド領域及びヒＦ　Ｉ　ｇ　Ｑ　　Ｆ　
Ｃ８Ｕ域遺伝子が、この順序に連結された形のプラスミ
ドが最も好ましく、このプラスミドを用いることにより
、ヒトＩｇＧ　　ＦＣ領域蛋白質のペリプラズムまでの
分泌が可能になる。このようなペリプラリズム分泌発現
型ブラスミドとして、好ましくはｐＰＳ−ＦＣが用いら
れる。

さらに前記の各種プラスミドを組み合わせることにより
、適当なプロモーター領域・シグナルペプチド領域下流
にヒＩ−ＩｇＧ　　ＦＣ領域遺伝子を連結したＤ　Ｎ　
Ａ　Ｓ、！域、及び好アルカリ性バチルス１１ｈ１７０
株由来のＥｘプロモーター領域とｐＭＢ９プラスミド由
来のＫ１）ｉｆｉ伝子から成る菌体外分泌生産に関与す
る情報を担うｏ　Ｎ　Ａ　６Ｈ域とを合わせ持つような
プラスミドが得られる。このプラスミドを用いることに
より、ヒトＩｇ　Ｇ　　Ｆｃ　ｇｌｌ域内白質菌体外分
泌が可能になる。このような菌体外分泌発現型プラスミ
ドとして、好ましくはｐＥＸＦＣＩＯｌｐＥＸＦＣｌｏ
ｏが用いられる。

なお、本発明において適当なプロモーター領域、シグナ
ルペプチド領域、ヒ）ＩｇＧ　　Ｆｃ領域遺伝子、Ｅｘ
プロモーター領域及びＫｉｌ遺伝子は、これらと生物学
的機能において同等なりＮＡ領領域すなわち該Ｄ　Ｎ　
Ａ　ｆＩｉ域に対してヌクレオチドの置換、ヌクレオチ
ドの欠失、ヌクレオチドの挿入及びヌクレオチド配列の
逆位その他の突然変異によって関連づけられているＤ　
Ｎ　Ａ　領域でもよいことはいうまでもない。

（ヒト免疫グロブリンＧＦｃｐＪ域蛋白質の生産）かく
して得られた、ヒトＩｇＧ　　ＦｃｆｉＩ域遺伝子菌体
内発現型プラスミド、ペリプラズム分泌発現型プラスミ
ド及び画体外分泌型プラスミドを常法により適当な宿主
に導入して組換え微生物を得、これを培養することによ
り、ヒトＩｇＧ　　Ｆｃ領域蛋白質を生産させることが
できる。このような宿主としてはエシェリヒア（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物を有利に使用する
ことができる。宿主としては、前記のエシェリヒア・コ
リＨ８１０１株、同０６００株、同ＤＰ−ｓｕｐＦ株、
同ｚ　１７７６株、同Ｌ２３９２株等、通常のこの種の
技術分野で用いられる微生物が有利に用いられる。なか
でも、エシェリヒア・コリＨ８１０１株及び同０６００
株がとりわけ好ましい。

このようにして得られた組換え微生物を、それ自体は公
知の方法で培養する。培地としては、ヒトＩｇＧ　　Ｆ
ｃ領域蛋白質の生産に適した培地であって、かつ宿主微
生物の生育に適した培地を用い得るが、たとえばＭ９培
地（ＴｌＭａｎｉａｔｉｓら編、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｐ４４０（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ　１９８２））　、Ｌ　Ｂ培地（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら４ｇ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｆｎｇ＋　
Ｐ４４０（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８２）
）　、Ｂ　Ｐ　Ｂ培地（Ｄｉｆｃｏ製）　、Ｎｕｔｒｉ
ｅｎｔ寒天培地等を基本培地として調製したものを用い
ればよい。その他、必要に応じて、炭素源窒素源の他に
アミノ酸、ビタミン等の栄養素を添加してもよいし、発
現型プラスミドの宿主的安定化のために適当量の抗生物
質等を添加してもよい。

培養は、ｐＨ１温度、酸素供給量を目的の組換え微生物
に適した条件で行なう。菌体内発現型プラスミドを有す
る組換え微生物の培養においては、プロモーターを効率
良く機能させる目的で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトシド等の薬剤を加えることもできる。菌体外分泌
発現型プラスミドを有する組換え微生物の培養において
は、該微生物が生育してその菌体量が最大に達したとき
、即ち対数増殖後期から培地中にＦｃ領域蛋白質が生成
、蓄積するまでの時間中、同一培地で培養をそのまま１
！続するのがよい。たとえばエシェリヒア属の微生物の
前記国体量が最大に達したときから培地中にＦｃｊｉｌ
域蛋白質の生成、蓄積が停止すまでの時間は、はぼ１２
〜４８時間の範囲である。なお、ｐＨ条件は特に影響さ
れないが、ｐ　Ｈ５〜８の範囲、特にｐＨ７が適当であ
る。また、ペリプラズム分泌発現型プラスミドを有する
組換え微生物の培養についても、菌体外分泌型プラスミ
ドを有する組換え微生物と同様な方法で行なうことがで
きる。

培養後、たとえばオスモチインク・ショック法（Ｃ，Ｋ
ａｔｏら、Ｅ、Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、。

■、　３３９（１９８３）　）を用いて、培養物を菌体
内画分、ペリプラズム画分及び菌体外画分に分画する。

各両分におけるヒトＩｇＧ　　Ｆｃ領域蛋白質の有無は
、たとえば市販のウザギ抗ヒ）ＩｇＧ−ＦＣ成分抗血清
及び酵素標識抗つサギＩｇ抗体を用いたエンザイム・イ
ムノアッセイ　（Ｅ　Ｉ　Ａ）により確認できる。

本発明において、アミノ酸、ペプチド、核酸、その他に
関し略号で表示する場合、それらはｒＵＰＡＣ−Ｉ　Ｕ
Ｂ生化学命名委員会（ＣＢＮ）による略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づいて表示され、例えば下記
の略号が使用される。

なお、アミノ酸などに関し光学異性体がある得る場合は
、特に明示しなければＬ体を示すものとする。

Ｃｙｓニジスティン Ｍｅｔ：メチオニン Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ　：リジン Ａｌｇ：アルギニン Ｈｉｓ　：ヒスチジン Ｐｈｅ　：フェニールアラニン Ｔｙｒ：チロシン ’Ｉ”ｒｐ：　トリプトファン Ｐｒｏニブロリン Ａｓｎ：アスパラギン Ｇｉｎ：グルタミン Ｇｕｙ　ニゲリシン Ａｌａ：アラニン Ｖａ　１　：バリン Ｌｅｕ　：ロイシン １１ｅ：イソロイシン Ｓｅｒ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン ＤＮＡ　：デオキシリボ核酸 Ａ　：アデニン Ｔ　：チミン Ｇ　ニゲアニン Ｃ：シトシン ＥＤＴＡ　：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ　ニドデシル硫酸ナトリウム 以下実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが、
本発明は何らこれにより限定されるものではない。

実施例１　（ヒト染色体ＤＮＡ０単離）ヒト骨髄腫細胞
ＡＲＨ７７株３Ｘ１０′１個をガラス棒でつぶし、２％
　ＳＤＳ存在下、プロテアーゼＫ（シグマ）で処理した
後、ＴＥバッファー〔１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣ
ｌ　（ｐＨ８，０）、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）で飽和した
フェノールを加えた。遠心分離により水相とフェノール
相を分離しくフェノール抽出）、水相をＴＥバッファー
（２０ｍ　Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ　　ＨＣｊ！（ｐＨ７，５
）、１００ｍＭ　　ＮａＣ１５ｍＭ　　ＥＤＴＡ）に対
して透析した。リボヌクレアーゼＡ（シグマ）処理をし
、再度フェノール抽出を行なった後、ＴＥバッファーに
対して透析し、ヒト染色体ＤＮＡ約１．２ｍｇを取得し
た。（Ｎ。

Ｂ１１ｎら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
、　　３．２３０３（１９７６）参照〕。

実施例２（ヒト遺伝子ライブラリーの作成）実施例１で
得られたヒト染色体ＤＮＡ１５０μｇを後述する実施例
４に示した方法に準じて制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（宝酒
造）で部分分解した後、蔗糖密度勾配遠心〔蔗糖１０〜
４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）、２８０００ｒｐｍＸ１５時間
、２０℃〕を行ない、１５Ｋｂｐ〜２３Ｋｂｐに相当す
るＤＮＡ断片４．３　μｇを得た。次にこのＤＮＡ断片
０．８ｇｇとシャロン４Ａベクターとの連結を行い、シ
ャロン４Ａベクターの右のアームと左のアームの間にヒ
ト由来のＤＮＡが挿入されたハイブリッドＤＮＡを得た
。連結にはＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ベセスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ）を用い、連結反応は６６ｍＭ　　Ｔ
　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣｊ２　（ｐＨ７，６）−６，６ｍ
Ｍ　　ＭｇＣ４２ｇ　　１０ｍＭ　ジチオスレイトール
−１ｍＭ　　ＡＴＰ水溶液中で、１１℃、１２時間行な
った。得られたハイブリッドＤＮＡについて、イン・ビ
トロ・パッケージングを行ない、ヒト遺伝子ライブラリ
ー（１，８ｘ　１０６ＰＦＵ／μｇ、ヒト染色体ＤＮＡ
の９９％以上を含む）とした。

実施例３　（ヒト免疫グロブリンＧ遺伝子のスクリーニ
ング） 前記実施例２で得られたヒト由来のＤＮＡを含むシャロ
ン４Ａフアージの集合（遺伝子ライブラリー）をエシェ
リヒア・コリＬＥ３９２株に感染させ、プラークを形成
させた。ヒト抗体遺伝子を含むクローンは、プラーク・
ハイブリダイゼーション法により、（：ｌ！ｐ）−標識
ヒト免疫グロブリンＧＨ鎖Ｊ遺伝子で選択した。ヒトＩ
ｇＧ遺伝子を含むシャロン４ＡフアージからのＤＮＡの
調製は、Ｔｈｏｍａｓらの方法（Ｍ、Ｔｈｏｍａｓら、
　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、＋旦、　３１５（１９７４）
参照〕により行なった。

実施例４（制限酵素切断地図の作成） 実施例３で得られたヒ）ＩｇＧ遺伝子を含むシャロン４
Ａ　　ＤＮＡＩμｇを制限酵素切断用バッファー（ＥＣ
ＯＲＩ、ＨｐａＩ、Ｈｉｎｆｌ、Ｔａｑｌ、Ｘｂａ　Ｉ
、ＸｈｏＩ切断では５０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ
２　（ｐＨ７，４）　　１００　ｍＭ　　ＮａＣＩｔ　
　１０ｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ水溶液を、ＡｃｃＩＩ
、Ｂａｍ　　Ｈｌ、、Ｃ１ａ　Ｉ、）（ｉｎｄＩ［ｒ、
Ｐｓｔｌ、Ｒｓａ　１．．５ａｕ３ＡＩ切断では１０ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　−６０ｍＭ
　　ＮａＣｊ２−７ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　！水溶液
を、Ｂａ１ｌ、Ｂｓ　ｔＮｌ、ＮａｅＩ、５ｓｔＩＩ切
断では１０ｍＭ、、Ｔ　ｒ　１ｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，
４）−１０ｍＭ　　Ｍｇ５Ｏｎ　−１ｍＭ　　ジチオス
レイトール水溶液を、そしてＳｍａＩ切断では１０ｍＭ
　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　　（ｐＨ８，０）　　２０
ｍＭ　　ＫＣｌ　７ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ　−７ｍＭ２−
メルカプトエタノール水溶液を、それぞれ用いた。〕２
０μｌに溶解させ、制限酵素（Ｂｓ　ｔＮｌ、、Ｃｊ！
ａ　Ｉ、ＮａｅＩはニュー・イングランド・バイオラブ
ズ製、５ｓｔＩＩはペセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ製、Ｒｓａｌ、５ａｕ３ＡＩ、ＴａｑＩはニラポン・
ジーン製、それ以外は宝酒造製を用いた。）２〜４ユニ
ツトを添加して、３７℃、１時間以上切断を行なった。

制限酵素ＢｓｔＮＩ及びＴａｑＩによる切断は、６０℃
で１時間以上切断を行なった。なお、二種類の制限酵素
による切断を行なう場合には、まず低塩濃度で作用する
制限酵素で処理し、次に所定濃度まで塩濃度を上げてか
ら、より高塩濃度で作用する制限酵素で処理した。

制限酵素による切断後、４μｌの０．２５％ブロモフェ
ノールブルー−５０％グリセロール水溶液を加え、アガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％〜２．５％）を
行なった。アガロースはシグマ社のタイプ■電気泳動用
を使用した。電気泳動バッファーとして、４０ｍＭ　　
Ｔ　ｒ　ｉ　５−ＣＨ，Ｃ００Ｈ（ｐＨ８，０）−４ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ水溶液を用いた。

厚さ２鶴の垂直ゲルにて、６〜９ｖ／ｃ１１１の電圧で
１．５〜３時間電気泳動を行なった。この電気泳動の際
、ＤＮＡ断片の分子量マーカーとして、λファージのＤ
ＮＡを制限酵素）（ｉｎｄＩ［ｒで切断したもの（ベー
リンガー・マンハイム）を用いた。電気泳動終了後、ア
ガロースゲル中のＤＮＡを２μｇ　／　ｍ　１エチジウ
ムブロマイド水溶液で染色し、このゲルに対して長波長
紫外線を照射して、切断パターンの観察を行なった。各
種制限酵素単独による切断、及び二種の制限酵素の組合
せによる切断、これらの切断パターンを解析することに
より、第４図（Ａ）に示すような核制限酵素切断点の相
対位置関係を決定した。第４図（Ａ）はＩｇＧ遺伝子を
含むヒト染色体ＤＮＡの制限酵素切断点地図を示す。

実施例５　（ヒト免疫グロブリンＧ遺伝子断片のサブク
ローニング） ヒトＩｇＧ遺伝子を含むシャロン４Ａ　　ＤＮＡ３μｇ
を実施例４の方法に準じて制限酵素Ｈｉｎｄ■で切断し
、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を行な
った。ヒトＩｇＧＦｃ？Ｉｉ域遺伝子を含む約８．２　
ＫｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを切出し、その
アガロースゲル断片を３倍量（ｖｏｌ　／ｗｔ）の８　
Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１０ａ水溶液に溶解させた。Ｃｈｅｎら
のグラスフィルター法（Ｃ，Ｗ、Ｃｈｅｎら、　Ａｎａ
ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１０１．３３９（１９８０）
　）により、約８．２　ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロー
スゲルにより回収した。一方、大腸菌用プラスミドｐＢ
Ｒ３２２１μｇを実施例４に準じて制限酵素Ｈｉｎｄｌ
ｎで切断したものに対して、アルカリ性ホスファターゼ
（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ７５）　　（宝酒造）を０．５ユニ
ット加えて、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、
反応液中のアルカリ性ホスファターゼを失活・除去する
ために、フェノール抽出を３回繰返した。このようにし
て得られたｐＢＲ３２２のＨｉｎｄｌＩ［−アルカリ性
ホスファターゼ処理液を、ゲルより回収した約８．２　
Ｋｂｐ　　Ｈｉｎｄ　ｍ断片水溶液と混ぜ、エタノール
沈澱の後、連結反応用バッファー（実施例２を参照）５
０μｌに溶解させる。２ユニツトの７４−ＤＮＡリガー
ゼを加え、１１℃、１２時間反応させて、連結反応を行
なった。

エシェリヒア・コリＣ６００株（ＡＴＣＣ３３５２５）
の形質転換は、通常のＣａＣ１ｚ法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎ。

ｒｇａｒｄ　らの方法、前記）の改良法で行なった。す
なわち、５ｍｊｔのＬ培地（１％　トリプトン、０゜５
％　酵母エキス、０．５％　ＮａＣ１，ｐＨ７，２）に
大腸菌Ｃ６００株の１８時間培養基を接種し、菌体を含
む培養液の６００ｎ＋ｗにおける濃度（ＯＤ、。。）０
．３まで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・バッ
フｙ　−（０，Ｉ　Ｍ　　ＮａＣｆ、５ｍＭ　　ＭｇＣ
ｌ１ｔ　、５ｍＭ　　Ｔｒ　ｔ　５−ＨＣｌ（ｐＨ７，
６，０℃）〕中で２回洗い、２　ｍ　ｌの冷やしたカル
シウム・バッフｙ　−［１００ｍＭ　　Ｃａ　Ｃ１，，
２５０ｍＭ　　ＫＣＩ、５ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ　、５ｍ
Ｍ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　（ｐＨ７，６，０℃）〕
中に再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。次に菌体を
この容量の１／１０にカルシウム・バッファーの中で濃
縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２　：　１　　（ｖｏｌ
、：ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分間、０℃
で保った後、１ｍ７！のＬＢＧ培地（１％　トリプトン
、０．５％酵母エキス、１％　ＮａＣＪ！、０．０８％
　グルコース、ｐＨ７，２）を添加し、３７℃で１時間
振とう培養する。培養液を、選択培地（アンピシリン３
０μｇ　／　ｍ　ｌを含むし培地プレート）に１００μ
ｍ／プレートの割合で接種する。プレートを３７℃で１
晩培養して、形質転換株を生育させる。得られたアンピ
シリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いてＤＮＡ
を調製し、アガロースゲル電気泳動により、目的のサブ
クローンｐＴＪＩＢ（約１２．６Ｋｂｐ）を確認した。

　　、 前記実施例４の方法により作成した、このサブクローン
の制限酵素切断点地図を第４図（Ｂ）に示した。この第
４図（Ｂ）においてＰｓｔｌ　−（３１からＨｉｎｄｌ
ｌ［−（３）の間に、Ｐｓｔｌサイトが３〜４個存在す
ることは確認したが、その位置についての確認は行なっ
ていない。

さらに、前記プラスミドｐＴＪ　Ｉ　ＢのＰｓｔｌ（２
）　　　Ｐｓｔｌ−（３）のＤＮＡ断片（約１．７Ｋｂ
ｐ）を、ｐＴＪＩＢの場合とほぼ同様の手法により、プ
ラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔｌサイトに挿入し、プラ
スミドｐＴＪ５　（約６．　Ｉ　Ｋ　ｂｐ）を作成した
。目的のクローンは、テトラサイクリン耐性の形質転換
株の中から選択した。得られたサブクローンの制限酵素
切断点地図を、第４図（Ｃ）に示した。

実施例６　（ヒト免疫グロブリンＧＦｃｊｌ域遺伝子Ｄ
ＮＡ塩基配列の決定） ヒｌ”１ｇＧＦｃ領域遺伝子のＤＮＡ塩基配列は、マキ
サム・ギルバート法により決定した。

たとえば、前記実施例５において作成されたサブクロー
ンｐＴＪ５　　ＤＮＡ約５０μｇを実施例４の方法に準
じてＳｍａ　Ｉで切断する。得られたＤＮＡ断片をアル
カリ性ホスファターゼで脱ホスホリル化し、ポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｐ　−Ｌバイオケミカルズ）５ユニツ
トを用いて（１３２Ｐ）　−ＡＴＰで標識した。ポリヌ
クレオチドキナーゼ反応は５０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−
ＨＣｊ？　（ｐＨ９，５）−１０ｍＭ　　Ｍｇ　Ｃｆｚ
　−５ｍＭ　　ジチオスレイトール水溶液中で行ない〔
γ−３２Ｐ）　−ＡＴＰはアマージャム製を１００ｐＣ
ｉ分用いた。ｚｚｐ標、ＪＤＮＡ断片をＰｓｔｌで切断
した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５
％）により目的のＤＮＡ断片を分離し、後述の実施例７
の方法に従ってゲルからの抽出を行なった。得られた３
２ｐ標識−Ｓｍａｌ−ＰｓｔＩ断片について、各塩基特
異的な部分分解反応を行ない、７Ｍ尿素を含むポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度８％〜２３％）で分
離した。２〜７日間、−８０℃でオートラジオグラフィ
ーを行なった後、分解パターンの解析を行ない、Ｆｃ領
域遺伝子の塩基配列決定のための資料とした。

一方、ｐＴＪ　５をＰｓｔｌで切断した場合には、３′
末端標識キツト（アマ−ジャム）を用いて、〔α−”Ｐ
）−ｄｄＡＴＰによる標識を行なった。

この３ｔｐ標識ＤＮＡ断片をＳｍａ　Ｉで切断した後、
目的のＤＮＡ断片のポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ゲル濃度５％）による分離・回収を行なった。得られた
３２Ｐ標識−ＰｓｔＩ−−３ｍａＩ断片についても、上
記手順に従って解析を行ない、Ｆｃ領域遺伝子の塩基配
列決定のための資料とした。

実施例７（Ｆｃ領域ＣＨ３部位遺伝子のクローニング） 実施例５で得られたプラスミドｐＴ”、Ｊ　５を、実施
例４の方法に準じて制限酵素ｐｓｔｒを切断した後、ア
ガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を行ない、
Ｆｃ領域遺伝子を含む約１．７　ＫｂｐのＤ　Ｎ　Ａ　
ｔｔｌｉ片を実施例５の方法でゲルより回収した。得ら
れたＤ　Ｎ　Ａ　ＩｔＪｉ片を、実施例４の方法で制限
酵素Ｎａｅｒで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動くゲル濃度５％）を行なった。Ｃｏ３部位遺伝子を含
む約０．６　ＫｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを
切断し、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破砕
した後、２〜５ｍｌの溶出用バッフｙ−（５００ｍＭ　
　ＮＨ４０Ａｃ、１ｍＭＥＤＴＡ、　　０．１％　Ｓ　
Ｄ　Ｓ　（ｐ　Ｈ７，５））を加え、３７℃で一晩振と
うした。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回
収を行なった。ざらに得られたＤＮＡ断片を、実施例４
の方法で制限酵素ＲｓａＩで切断し、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、Ｃイ３部位を含
む約３１０ｂｐのＤＮＡ断片を、上記と同様な方法によ
り、ポリアクリルアミドゲルから回収した。

こうして得られたＣＨ３部位遺伝子を含む約３１０ｂｐ
のＲｓａＩ　　　ＮａｅｌのＤＮＡ断片を、実施例５の
方法に準じてプラスミドｐＢＲ３２２のＢａ１ｒサイト
に挿入し、Ｃｏ３部位遺伝子の読みとり方向がプラスミ
ドｐ　Ｂ　Ｒ３２２中のテトラサイクリン耐性遺伝子の
読みとり方向と一致する方向（第５図において時計まわ
りの方向）に挿入されたプラスミドｐＦｃ７０（約４．
７　Ｋｂｐ）を作成した。

ｐＦｃ７０作成の方法を第５図に示した。

実施例８（ＦＣｉＪ域ＣＨ２部位遺伝子とＣｕ３部位遺
伝子の連結） 実施例７で得られた、Ｆ　ｃ　％−ｑ域遺伝子を含む約
１．７ＫｂｐのＤＮ、Ａｆｔ！７片を、実施例４の方法
に準じて制限酵素５ａｕ３ＡＩ及びＴａｑｌで切断し、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後
、ＣＨ２部位遺伝子を含む約２４０ｂρのＤＮＡ断片約
゛０．５μｇを、実施例７の方法に準じて、ポリアクリ
ルアミドゲルから回収した。

Ｃｕ２部位とＣＨ３部位の連結部分に相当する、第６図
記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌクレオチドを、
上の鎖と下の鎖とに分けて化学合成した。オリゴヌクレ
オチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライド・バイ
オシステムズ、モデル３８０Ａ）を用いて、ホスフォア
ミダイト法により行なった。合成オリゴヌクレオチドの
精製は、アプライド・バイオシステムズ社のマニュアル
に準じて行なった。すなわら、合成オリゴヌクレオチド
を含むアンモニア水溶液を５５℃で一晩保つことにより
、ＤＮＡ塩恭の保護基をはずし、セファデックスＧ−５
０フアイン・ゲル（ファルマシア）を用いたゲル濾過に
よって、高分子量の合成オリゴヌクレオチド画分を分取
する。ついで、７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ゲル濃度２０％）の後、紫外線シャドウィン
グ法により泳動パターンの観察を行ない、目的とする大
きさのバンド部分を切出して、実施例７の方法に準じて
合成オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲルより
回収した。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液を
ゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかけるこ
とにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。な
お、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはか
った。このようにして得られた合成オリゴヌクレオチド
精製物０．１〜１．０μｇを、実施例６の方法に阜じて
、１ｍＭ　　ＡＴＰ存在下でポリヌクレオチドキナーゼ
反応を行ない、５′末端側をリン酸化する。５′末端を
リン酸化した、上の鎖と下の鎖に相当する２本の合成オ
リゴヌクレオチドを混合し、その水溶液温度を７０°Ｃ
から室温まで徐々に冷却することにより、アニーリング
を行なった。以上のようにして、ＣＨ２部位とＣＨ３部
位との連結部分に相当するＴａ　ｑ　Ｉ−３ｍａ　ｒの
ＤＮＡ断片（約６８ｂｐ）を取得した。

一方、前記実施例７で作成したプラスミドｐＦＣ７０Ｄ
ＮＡ約５μｇを、実施例４記載の制限酵素Ｓｍａ　Ｉ切
断用バッファーに溶解し、２〜５ユニツトのＳｍａｌを
加えて２０℃で１５〜４５分反応させて部分分解を行な
う。フェノール抽出によりＳｍａＪを失活させた後、実
施例４の方法に準じて、制限酵素１３ａｍＨＩによる切
断を行なう。アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８
％）の後、ＣＨ３部位遺伝子とベクターの大部分を含む
第６図記載のＢａｍＨＩ−Ｓｍａ　Ｉ　−（１）のＤＮ
Ａ断片（約３．６．　Ｋｂｐ）を、実施例５の方法に準
じてアガロースゲルより回収した。

以上のようにして得られた、Ｃｌ４２部位遺伝子を含む
５ａｕ３ＡＩ　　　ＴａｑｌのＤＮＡ断片、Ｃｕ２部位
とＣＨ３部位の連結部分に相当するＴａ　ｑ　Ｉ−Ｓｍ
ａ　ＩのＤＮＡ断片、そしてＣ２，３部位とベクタ一部
分を含むＢａｍＨＩ　　（Ｓａｕ３Ａ　１）　　　　Ｓ
ｍａ　Ｉ　−（１）のＤＮＡ断片を混合し、実施例５の
方法に準じて、Ｃｌ　２部位遺伝子とＣＨ３部位遺伝子
がイントロンを介さずに連結された遺伝子を含むプラス
ミドｐＦＣ７７（約３．９　Ｋｂｐ）を作成した。第６
図にｐＦＣ７７の作成方法を示した。

実施例９（Ｆｃ領域遺伝子とｔｒｐプロモーターとの連
結） 実施例８で得られたプラスミドｐＦＣ７７を、実施例４
の方法に準じて制限酵素５ｓｔｎ及びＰｓｔｌで切断し
、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度　０．８１％）の
後、ｃ、２部位遺伝子の後半部分、Ｃイ３部位遺伝子全
域及びベクターの一部を含む、第７図記載の５ｓｔＩｒ
　　　ＰｓｔｌのＤＮＡ断片（約２．７　Ｋ　ｂｐ）を
、実施例５の方法に準じてアガロースゲルより回収した
。

次に、実施例７で得られたＦｃＪ域遺伝子を含む約１．
７　ＫｂｐのＤＮＡ断片を、実施例４の方法に準じて制
限酵素ＢｓｔＮＩ及び３ｓｔＩＩで切断し、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、Ｃｇ２部
位遺伝子の前半部分を含む約１７１ｂｐのＢ　ｓ　ｔ　
Ｎ　Ｉ　　（５）　　　Ｓ　ｓ　ｔ　ＩｆのＤＮＡ断片
を、実施例７の方法に準じて、ポリアクリルアミドゲル
から回収した。

さらに、プロモーターとＦｃ領域遺伝子との連結部分に
相当する、第７図記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴ
ヌクレオチド（約３９ｂｐ）を、実施例８の方法に準じ
て作成した。このＣ１ａ■−ＢＳｔＮＩ−（５１のＤＮ
Ａ断片中には、ｔｒｐプロモーターとの連結のための制
限酵素Ｃｊ！ａＩサイト、ＡＴＧという塩基配列で表わ
される翻訳開始コドン、ｈ部位遺伝子及びＣ）Ｉ２部位
遺伝子の一部が連続して含まれており、このＤＮＡ断片
を用いることにより、イントロンのないＦｃ領域（ｈ−
Ｃｕ２Ｃｕ３部位）遺伝子をトリプトファン・オペロン
・ＳＤ配列下流に適当な距離をへだてて連結することが
可能になった。

一方、ｔｒｐプロモーターを含むプラスミドｐＹＳ３１
Ｎ（約４．７　Ｋｂｐ）を、実施例４の方法に準じて制
限酵素ｐｓＬＩ及びＣ／ａＩで切断し、アガロースゲル
電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、ｔｒｐプロモータ
ー及びベクターの一部を含む。

第７図記載のＰｓｔＩ　　　Ｃ１ａｌのＤＮＡ断片（約
１．Ｉ　Ｋｂｐ）を、実施例５の方法によりアガロース
ゲルより回収した。

以上のようにして得られた、Ｃｕ２部位後半とＣＨ３部
位遺伝子とベクターの一部を含む５ｓｔＵ−ＰｓｔＩの
ＤＮＡ断片、ＣＨ２部位遺伝子前半部分を含むＢｓｔＮ
Ｉ　−（５１５ｓｔｌｌのＤＮＡ断片、プロモーターと
Ｆｃ領域遺伝子との連結部分に相当するＣｍ！ａｌ　　
　ＢｓｔＮＩ　−（５）のＤＮＡ断片、そしてｔｒｐプ
ロモーターとベクターの一部を含むＰ　ｓ　ｔ　Ｉ　−
Ｃ１ａ　ＩのＤＮＡ断片を混合し、実施例５の方法に準
じて、Ｆ　Ｃ％ｌ域（ｈ−ＣＨ２−Ｃ）１３部位）遺伝
子発現型プラスミドｐ　Ｆ　Ｃ２０３（約４．ＯＫｂｐ
）を作成した。第７図にｐ　Ｆ　Ｃ２０３の作成方法を
示した。

実施例１０（Ｆｃ領域遺伝子翻訳柊終止ドンのタンデム
化） 実施例９で得られたＦ　ＣＳＩ域遺伝子発現型プラスミ
ドｐ　Ｆ　Ｃ２０３を、実施例８に記載の方法に準じて
、制限酵素Ｓｍａ　Ｉで部分分解した後、制限酵素Ｐｓ
ｔＩによる完全分解を行なう。アガロースゲル電気泳動
くゲル濃度０．８％）の後、Ｆｃ領域遺伝子の大部分と
ベクターの一部を含む第８図記載のＳｍａ　Ｉ　−（２
）　　　Ｐｓ　ｔ　ＩのＤＮＡ断片（約１．８　Ｋ　ｂ
ｐ）を、実施例５の方法に準じてアガロースゲルより回
収した。

また、ＣＨ３部位遺伝子後部と翻訳終止コドンに相当す
る、第８図記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌクレ
オチド（約１７ｂｐ）を、実施例８の方法に準じて作成
した。このＳｍａＩ　−（２１ＢａｍＨＩのＤＮＡ断片
中には、Ｃｕ３部位遺伝子の一部、ＴＡＡＴＡＧという
塩基配列で表わされるタンデム化翻訳終止コドン及びベ
クターとの連結のための制限酵素３ａｍＨＩサイトが含
まれており、このＤＮＡ断片を用いることによりＦｃ領
域遺伝子の翻訳終止コドンのタンデム化が可能になった
。

一方、プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２を、実施例４の方法
に準じて制限酵素Ｐｓｔｌ及び１３ａｍＨＩで切断、ア
ガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、ベク
ターの大部分を含む、第８図記載のＢａｍＨＩ−Ｐｓｔ
ＩのＤＮＡ断片（約３．２　Ｋｂｐ）を、実施例５の方
法に準じてアガロースゲルより回収した。

以上のようにして得られた、Ｆｃ領域遺伝子の大部分と
ベクターの一部を含むＳ　ｍ　ａ　［−（２１＝−Ｐｓ
ｔＩのＤＮＡ断片、Ｃ１１３部位遺伝子後部とタンデム
化翻訳終止コドンを含むＳｍａ）−（２１ＢａｍＨ１の
ＤＮＡ断片、そしてベクターの大部分を含むＢａｍＨＩ
　　　ＰｓｔＩのＤＮＡ断片を混合し、実施例５の方法
に準じて、タンデム化翻訳終止コドンを有するＦｃ領域
遺伝子発現型プラスミドｐ　Ｆ　Ｃ２１１（約５．、Ｏ
ＫｂＰ）を作成した。

第８図にｐ　Ｆ　Ｃ２１１の作成方法を示した。

実施例１１（Ｆｃ領域遺伝子とｔａｃプロモーターとの
連結） 実施例９で得られたＦｃｊｉ域遺伝子発現型プラスミド
ｐ　Ｆ　Ｃ２０３を、実施例４の方法に準じて制限酵素
Ｃｊ！ａＩで切断し、ポリメラーゼ用バッフｙ−（５０
ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩＩ　　（ｐＨ７，２）、
１０ｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ　、０．１ｍＭ　　ジチ
オスレイトール、５０μｇ　／　ｍ　ｌ　　ウシ血清ア
ルブミン〕４０μｌに溶解し、０．２５ｍＭのｄＧＴＰ
及び０．２５ｍＭのｄＣＴＰ存在下で、２ユニツトのＤ
ＮＡポリメラーゼＩ・ラージ・フラグメント（ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ）を加える。３７℃で３０
分間反応させて、末端の平滑化をはかる。次にこのＤＮ
Ａ断片を、実施例４の方法に準じて制限酵素Ｐｓｔｌで
切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）
の後、Ｆｃ領域遺伝子全域とベクターの大部分を含む、
第９図記載の約２．８　ＫｂｐのＤＮＡ断片を、アガロ
ースゲルより回収した。

次に、ｔａｃプロモーターを含むプラスミドｐＤＲ５４
０（約４．ＯＫｂｐ、　ファルマシア）ＤＮＡを、実施
例４の方法に準じて制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、つい
で上記の方法に準じて、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ
、ｄＣＴＰ存在下、ＤＮＡポリメラーゼ■・ラージ・フ
ラグメント処理により、末端の平滑化を行なう。次にこ
のＤＮＡ断片を、実施例４の方法に阜じて制限酵素Ｐｓ
ｔｌで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．
８％）の後、ｔａｃプロモーターとベクターの一部を含
む、第９図記載の約１．Ｉ　ＫｂｐのＤＮＡ断片を、ア
ガロースゲルより回収した。

以上のようにして得られた、Ｆｃ領域遺伝子全域とベク
ターの大部分を含む約２．８　ＫｂｐのＤＮＡ断片と、
ｔａｃプロモーターとベクターの一部を含む約１．１　
ＫｂｐのＤＮＡとを混合し、実施例５の方法に準じて、
ｔａｃプロモーターの下流にＦｃ領域遺伝子が連結した
形の発現型プラスミドｐＦＣ３６１（約３．９　Ｋｂｐ
）を作成した。第９図にｐＦＣ３６１の作成方法を示し
た。

上記により得られたＦｃｎＭ域遺伝子発現型プラスミド
ｐＦｃ３６１ＤＮＡを、実施例４の方法に準じて制限酵
素Ｓｓ　ｔＩＩ及びＰｓｔｌで切断し、アガロースゲル
電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、ベクターの一部、
ｔａｃプロモーター及びＦＣ領域遺伝子前半部分を含む
、第９図記載の５ｓｔｌｌ−ＰｓｔＩのＤＮＡ断片（約
１．３　Ｋｂｐ）を、実施例５の方法によりアガロース
ゲルより回収した。

また、実施例１０により得られたタンデム化翻訳終止コ
ドンを有するＦＣＣ領域遺伝子発現型プラスミドルＦｃ
２１１ＤＮを、実施例４の方法に準じて制限酵素５ｓｔ
ＩＩ及びＰｓｔＴで切断した後、上記と同じ手法により
、Ｆｃ領域遺伝子後半部分、タンデム化翻訳終止コドン
及びベクターの大部分を含む、第９図記載のＰｓｔｌ　
　　５ｓｔｌｌのＤＮＡ断片（約３．６　Ｋｂｐ）を得
た。

かくして得られた、ベクターの一部、ｔａｃプロモータ
ー及びＦＣ領域遺伝子前半部分を含む５ｓｔＵ　　　Ｐ
ｓｔｌのＤＮＡ断片と、ＦＣＮＣ退域子後半部分、タン
デム化翻訳終止コドン及びベクターの大部分を含むＰｓ
ｔｌ　　　５ｓｔＩＩのＤＮＡ断片とを混合し、実施例
５の方法に準じて、ｔａｃプロモーターの下流にＦｃ領
域遺伝子が連結され、なおかつタンデム化翻訳終止コド
ンを有する形の発現型プラスミドｐ　Ｆ　Ｃ３６２（約
４．９　Ｋｂｐ）を作成した。第９図にｐＦＣ３６２の
作成方法を示した。

実施例１２（好アルカリ性バチルスＮ１１１７０株染色
体ＤＮＡの調製） ペニシリナーゼを菌体外に生成、蓄積する能力を有する
好アルカリ性のバチルスＮ１１１７０株（ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−４６７）を培地（（ｇ／ｌ）：グリセロール　２
．０、酵母エキス　５．０、ポリペプトン５．０　、Ｋ
ｚ　ＨＰｏ、　　１．０　、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，
２をＮ　ａ　ＨＣＯｓ　　１０でｐＨ９，０に調整した
もの〕中、３０℃で１５時間振盪培養を行ない、対数増
殖後期の菌体を集菌後、フェノール法によるＤＮＡ抽出
法によって染色体ＤＮＡを抽出、精製し、染色体ＤＮＡ
５ｍｇを得た。

実施例１３（好アルカリ性バチルスＩｌｈ　１７０株染
包体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入） 実施例１２で得られた染色体ＤＮＡ１０μｇをとり、実
施例４の方法に準じて、制限酵素Ｅｃ　ｏＲＩを加え、
３７℃で反応させて部分的に切断した。一方、ベクター
として用いるテトラサイクリン抵抗性（Ｔｅｔ’）のｐ
ＭＢ９プラスミドＤＮＡ　（ベセスダ・リサーチ・ラボ
ラトリーズ）を制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に切断して６
５℃、５分の熱処理後、前者と混合し、実施例２の方法
に従って７４−ＤＮＡリガーゼによって１０℃、２４時
間Ｄ　Ｎ　Ａ　鎖の連結反応を行ない、６５℃、５分の
熱処理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて染色体
ＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡを沈澱、採取した
。

実施例１４（好アルカリ性バチルス魚１７０株ペニシリ
ナーゼ遺伝子のクローン化） 実施例１３で得られた好アルカリ性バチルスＮｏ。

１７０株染包体ＤＮＡを有するプラスミドを、通常のＣ
ａＣｌ２法（Ｍ、Ｖ、Ｎｏｒｇａｒｄらの方法、前記）
により、エシェリヒア・コリ８８１０１株に導入シた。

これらの形質転換株の中からアンピシリン及びテトラサ
イクリンに耐性の株をスクリーニングし、好アルカリ性
バチルス魚１７０株ペニシリナーゼ遺伝子を有するクロ
ーンを選択した。この菌体を培養した後第１０図のよう
に処理することにより、ベニシリナーゼ遺伝子を含む４
．５　Ｋｂｐの挿入を有する組換えプラスミドｐＥＡＰ
１が得られた。さらに、実施例４の方法に準じて制限酵
素切断点地図を作成した。第１１図にｐＥＡＰｌの制限
酵素切断点地図を示す。

実施例１５（好アルカリ性バチルスＩＶｈ１７０株染色
体ＤＮＡを有するプラスミドのＤＮＡ塩 基配列の決定） 好アルカリ性バチルス階１７０株の染色体ＤＮＡを含む
プラスミドのＤＮＡ塩基配列の決定は、Ｍ１３シークエ
ンシング・キット（アマ−ジャム）を用い、Ｍ１３ファ
ージによるジデオキシ・チェーン・ターミネーション法
により行なった。第１図に好アルカリ性バチルスＮａ　
１７０株ベニシリナーゼ遺伝子プラスミド領域・シグナ
ル領域のＤＮＡ塩基配列を、第２図にプラスミドｐＭＢ
９由来のＫｉＩ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を、そして第３
図に好アルカリ性バチルスＮ１１１７０株染色体ＤＮＡ
由来のＥｘプロモーターのＤＮＡ塩基配列を、それぞれ
示した。

実施例１６（好アルカリ性バチルスＮａ１７０株染色体
ＤＮＡを有する各種プラスミド誘導体 の作成） 前記実施例１４で得られたエシェリヒア・コリＨＢＩＯ
Ｉ（ｐ　ＥＡＰ　１）株を継代していく中で、ペニシリ
ナーゼ活性の増強（ｐＥＡＰｌの約３倍）された変異体
〔アンピシリン耐性（Ａｐ’）、テトラサイクリン感受
性（ＴｅｔＳ））を得た。この変異株から第１Ｏ図の方
法によりプラスミドを調製したところ、ベニシリナーゼ
の構造遺伝子の上流約４Ｋｂρが脱落したプラスミドｐ
ＥＡＰ３　（約５゜８　Ｋｂｐ）が得られた。第１２図
にｐＥＡＰ３の制限酵素切断点地図を示す。

こうして得られたｐＥＡＰ３プラスミド１μｇを実施例
４の方法に準じて制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ［［ｒ
を加えて、３７℃、２時間反応させて切断した。次に実
施例１１の方法に準じてＤＮＡポリメラーゼ■ラージ・
フラグメントを加えて、室温で３０分間反応させ、ＤＮ
Ａ切断面を平滑末端とし、ついで、実施例２の方法に準
じてＴ４−ＤＮＡリガーゼによって、室温、２４時間Ｄ
ＮＡ鎖の連結反応を行い、６５℃、５分間の熱処理後、
反応液に２倍容のエタノールを加えてプラスミドＤＮＡ
を沈澱、採取した。得られたプラスミドＤＮＡを実施例
１４と同様にエシェリヒア・コリＨ８１０１株に導入形
質転換し、アンピシリン耐性形質転換株から第１Ｏ図の
方法によりプラスミドを分離精製し、約１、ＯＫｂｐの
ＥｃｏＲＩ　　　ＨｉｎｄｌｌＩＤＮＡ断片の脱落した
プラスミドｐＥＡＰ６　　（約４．８　Ｋｂｐ）を得た
。第１２図にｐＥＡＰ６の作成方法を示した。

次に、プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２９（約４．１５Ｋｂｐ
）　　（Ｌ。

Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ　ら、　Ｇｅｎｅ、　１７．７
９（１９８２））　　ＤＮＡ切断面ｇを、実施例４の方
法に準じて制限酵素Ａｃｃ■で切断した後、アガロース
ゲル電気泳動（ゲル濃度１．５％）を行ない、エレクト
ロエリューション法ＣＰ、Ｊ、Ｇｒｅｅｎｅら、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
”ｖｏｌ、７．Ｍａｒｃｅｌｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、１９７
４．Ｐ、８７）を用いて、クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含むＡＣＣＩ
Ｉ−ＡｃｃＵのＤＮＡ断片（１，３Ｋｂｐ）を回収した
。また先に得られたプラスミドｐＥＡＰ６を実施例４の
方法に準じて制限酵素Ｓｍａ　Ｉで切断して後、上記の
ＡｃｃＵ−ＡｃｃＵのＤＮＡ断片と混合し、実施例２の
方法に準じてＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。

上記と同様にして、エシェリヒア・コリＨ８１０１株に
導入形質転換し、クロラムフェニコール及びアンピシリ
ン耐性形質転換株からプラスミドを分離精製し、プラス
ミド１）ＥＡＰ６にＣＡＴ遺伝子が第１２図において反
時計まわりの向きに挿入された形のプラスミドｐＥＡＰ
７　（約６．Ｉ　Ｋｂｐ）を作成した。第１２図にｐＥ
ＡＰｌの作成方法を示した。

こうして得られたプラスミドｐＥＡＰ７を実施例４の方
法に準じて制限酵素１（ｉｎｄｌｌ［で切断し、実施例
１１の方法に準じてＤＮＡポリメラーゼ■ラージ・フラ
グメントにより末端を平滑化した。実施例２の方法に準
じＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて自己連結反応を行ない
、上記と同様にして、プラスミドｐＥＡＰ７のＨｉｎｄ
Ｉ［［サイトを欠失させた形のプラスミドｐＥＡＰ７Δ
Ｈ（約６．Ｉ　Ｋｂｐ）を作成した。第１３図にｐＥＡ
Ｐ７ΔＨの作成方法を示す。

さらにプラスミドｐＥＡＰ７ΔＨを、実施例４の方法に
準じて制限酵素Ｃｊ２ａＩで切断し、実施例１１の方法
に準じてＤＮＡポリメラーゼＩ・ラージ・フラグメント
により末端を平滑化する。実施例２の方法に準じＴ４−
ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応を行ない、上記と同様
にしてエシェリヒア・コリＨ８１０１株に導入形質転換
し、クロラムフェニコール耐性・アンピシリン惑受性の
形質転換株からプラスミドを分離精製し、プラスミドｐ
ＥＡＰ７ΔＨ中に２ケ所存在するＣｊ２ａＩサイトを両
方共欠失させた形のプラスミドｐＥＡＰ７ΔＣＣＨ（約
６．　Ｉ　Ｋ　ｂｐ）を作成した。第１３図にｐＥＡＰ
ＴΔＣＣＨの作成方法を示す。

得られたプラスミドｐＥＡＰ７ΔＣＣＨを、実施例４の
方法に準じて制限酵素１（ｉｎｃＩＩで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、ベニシリ
ナーゼ遺伝子（一部欠失）を含まない約３．８　Ｋｂｐ
のＨｉ　ｎ　ｃ　ＩＩ　−Ｈｉ　ｎ　ｃ　ＩＩのＤＮＡ
断片をエレクトロエリューション法より回収する。一方
、上述のプラスミドｐＥＡＰ７も同様にして制限酵素）
（ｉｎｃＩＩ切断、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度
０．８％）を行ない、ペニシリナーゼ遺伝子を含む約２
．３　ＫｂｐのＨｉｎｃＩＩ−ＨｉｎｃＩＩのＤＮＡ断
片を回収する。これら２種のＤＮＡ断片を、実施例２の
方法に準じてＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、上
記と同様にしてエシェリヒア・コリＨＢＩＯＩ株に導入
形質転換し、クロラムフェニコール及びアンピシリンに
耐性の形質転換株の中からプラスミドを分離精製し、プ
ラスミドｐＥＡＰ７ΔＣＨ（約６．１　Ｋｂｐ）を作成
した。第１３図にｐＥＡＰ７ΔＣＨの作成方法を示す。

こうして得られたプラスミドｐＥＡＰ７ΔＣＨを、実施
例４の方法に準じて制限酵素Ｈｐａｌで切断した後、末
端をリン酸化した５ａｌｌｌリンカ−（宝酒造）と混合
し、実施例２の方法に準じてＴ４−ＤＮＡリガーゼを用
いて連結反応を行なう。

エタノール沈澱の後、実施例４の方法に準じて制限酵素
Ｃ１！ａｌ及び５ａｊ！Ｉで切断、アガロースゲル電気
泳動（ゲル濃度０．８％）を行ない、ペニシリナーゼ遺
伝子後半部、Ｅｘプロモーター領域及びベクターの大部
分を含む４．５　ＫｂｐのＣｊ！ａＩ−３ａ　ｊ！　Ｉ
のＤＮＡＩｒ片をエレクトロエリューション法により回
収する。一方、後述の実施例１６で得られたプラスミド
ｐ３２９ＰＳを同様にして制限酵素Ｃβａｌ及び５ａｉ
ｌで切断、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
５％）を行ない、ペニシリナーゼ遺伝子プロモーター領
域及びシグナルペプチド領域を含む約２００ｂｐの５ａ
ｊ２Ｉ−Ｃ１ａ　ＩのＤＮＡ断片をエレクトロエリュー
ション法により回収する。こうして得られた２種のＤＮ
Ａ断片を混合し、実施例２の方法に準じてＴ４−ＤＮＡ
リガーゼで連結後、上記と同様にしてエシェリヒア・コ
リＨＢ　１０１株に導入形質転換し、クロラムフェニコ
ール耐性の形質転換株の中からプラスミドを分離精製し
、分泌プラスミドベクターｐ　ＥＡＰ　８　　（４，７
Ｋｂｐ）を作成した。第１４図にｐＥＡＰ８の作成方法
を示す。

先に作成したプラスミドｐＥＡＰ６を実施例４の方法に
準じて制限酵素Ｈｉｎｆ　■で切断し、アガロースゲル
電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、好アルカリ性バチ
ルスｒｌｋＬ１７０株染色体ＤＮＡ由来Ｅｘプロモータ
ー領域とプラスミドｐＭＢ９由来Ｋｉｌ遺伝子から成る
菌体外分泌生産に関与する領域を含む約０．９５Ｋｂｐ
のＨｉｎｆＩ　　　Ｈｔｎｆ■のＤＮＡ断片を、エレク
トロエリューション法により回収する。このＤＮＡ断片
について、実施例１１の方法に準じてＤＮＡポリメラー
ゼＩ・ラージ・フラグメントを用いた末端の平滑化を行
ない、実施例２の方法に準じて末端をリン酸化したＥｃ
ｏＲＩリンカ−（宝酒造）とＴ４−ＤＮＡリガーゼによ
って連結する。エタノール沈澱の後、実施例４の方法に
準じて制限酵素ＥＣ０ＲＩで切断、アガロースゲル電気
泳動（ゲル濃度０．８％）・エレクトロエリューション
法によって末端にＥｃ。

Ｒ１サイトを有するＥｃｏＲＩ　　　ＥｃｏＲＩのＤＮ
Ａ断片（約０．９５　Ｋ　ｂｐ）を回収する。次に、プ
ラスミドｐＢＲ３２９を、実施例４の方法に準じて制限
酵素ＥＣ０ＲＩで切断し、上記約０．９５ＫｂｐのＥｃ
ｏＲＩ　　　ＥｃｏＲＩのＤＮＡ断片と混合、実施例２
の方法に準じてＴ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を
行なった。上記と同様にエシェリヒア・コリＨＢＩＯＩ
株に導入形質転換し、アンピシリン及びテトラサイクリ
ン耐性の形質転換株よりプラスミドを分離精製し、多コ
ピー型分泌プラスミドベクターｐ３２９ＥＸＫ（約５．
Ｉ　Ｋｂｐ）を作成した。第１５図にｐ３２９ＥＸＫの
作成方法を示す。

実施例１７（好アルカリ性菌ペニシリナーゼ遺伝子プロ
モーター領域・シグナル領域を有 するプラスミドの作成） ＣＡＴ遺伝子誘導体を含むプラスミドｐｃＭ１（約４．
Ｉ　Ｋｂｐファルマシア）を実施例４の方法に準じて制
限酵素ＥＣＯＲＩ及び５ａｉｌで切断し、アガロースゲ
ル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例１５の方
法に準じて約０．５ｂｐのＣＡＴ遺伝子の後半部分を含
むＥｃｏＲＴ　　　５ａｌＩのＤＮＡ断片を回収する。

さらに、ＣＡ　Ｔ’遺伝子ｇＲ体を含むプラスミドｐｃ
Ｍ？　（約４．Ｉ　Ｋｂｐ、ファルマシア）を上記と同
様にして、制限酵素ＥＣ０ＲＩ及び５ａｊ２Ｉで切断し
、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、
ＣＡＴ遺伝子前半部分とベクターの大部分から成る約３
．　Ｉ　Ｋ　ｂｐのＥｃｏＲＩ　　　５ａＪＩのＤＮＡ
断片を回収する。これらのＤＮＡ断片を混合し、実施例
２の方法に準じてＴ４−ＤＮＡリガーゼで連結し、実施
例１６の方法に準じてＣＡＴ遺伝子誘導体を含む新規プ
ラスミドｐｃＭ７１（約３．６　Ｋ　ｂｐ）を作成した
。第１６図にｐｃＭ７１の作成方法を示す。

前記実施例１６で得られたプラスミドｐＥＡＰ３を実施
例４の方法に準じて制限酵素Ｒｓａｌで切断し、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）後、実施例
１６の方法に準じてペニシリナーゼ遺伝子プロモーター
領域及びシグナル領域を含むＲｓａＩ　　　ＲｓａＩの
ＤＮＡ断片（約２００ｂｐ）を回収する。このＲｓａｌ
　　　ＲｓａＩのＤＮＡ断片を末端をリン酸化したＨｉ
ｎｄｌＩ［リンカ−（宝酒造）と混合、実施例２の方法
に準じてＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、実
施例４の方法に準じて制限酵素）（ｉｎｄＩＩ［で切断
する。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後
、実施例１５の方法に準じて末端がＨｉｎｄｌＩ［サイ
トに変換されたベニシリナーゼ遺伝子プロモーター領域
及びシグナルペプチド領域を含むＤＮＡ断片（約２１０
ｂｐ）を回収する。一方、プラスミドｐｃＭ７１を実施
例４の方法に準じて制限゛酵素ＨｉｎｄＴＩＩで切断し
、上記のベニジリナーゼ遺伝子プロモーター領域及びシ
グナルペプチド領域を含むＨｉｎｄＩＩＩ　　　Ｈｉｎ
ｄｌｌｌのＤＮＡ断片と混合し、実施例２の方法に準じ
てＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、実施例１６
の方法に準じてアンピシリン耐性、クロラムフェニコー
ルを耐性の形質転換株よりプラスミドｐＰｓ１　　（約
３．７Ｋｂｐ）を分離・精製した。このプラスミドｐＰ
ｓ１においては、ペニシリナーゼ遺伝子プロモーター領
域及びシグナルペプチド領域が、ＣＡＴ遺伝子の上流に
同じ読み取り方向で挿入された構造を有している。第１
７図にｐＰｓｌの作成方法を示した。

こうして得られたプラスミドｐＰｓ１を実施例４の方法
に準じて制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍで部分分解し、アガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、上記と
同様にして２ケ所存在する）ｒｉｎｄ■サイトのうち１
ケ所のみが切断されたＨ４ｎｄｍ　　　ＨｉｎｄＩＩ［
のＤＮＡ断片（約３．７　Ｋｂｐ）を回収する。このＨ
ｉｎｄｎＩ　　　ＨｉｎｄＩ［［のＤＮＡ断片を実施例
１１の方法に準じてＤＮＡポリメラーゼ■・ラージ・フ
ラグメントを用いて末端を平滑化した後、実施例２の方
法に準じてＴ４−ＤＮＡリガーゼによって自己閉環させ
る。このようにして上記方法に準じて、プラスミドｐＰ
Ｓｌ中の′ベニシリナーゼ遺伝子プロモーター領域上流
に存在するｌ（ｉ　ｎｄＩ［［サイトを欠失させた形の
プラスミドｐＰｓ１ΔＨ（約３．７　Ｋｂｐ）をを作成
した。

第１８図にｐＰｓｌΔＨの作成方法を示す。

さらにプラスミドｐＰｓ１Δ■］を実施例４の方法に準
じて制限酵素Ｃ１ａＩで切断した後、末端をリン酸化し
た５ａｊ２Ｉリンカ−（宝酒造）と混合し、実施例２の
方法に準じてＴ　４−　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼを用い
て連結反応を行なう。エタノール沈澱の後、実施例４の
方法に準じて制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ■及び５ａｊｉ！Ｉ
で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
５％）を行ない、ペニジリナーゼ遺伝子プロモーター領
域及びシグナルペプチド領域を含む約２１０ｂｐのＳａ
／！Ｔ　　　Ｈ４ｎｄ■のＤＮＡ断片をエレクトロエリ
ューション法により回収する。一方、プラスミドｐＢＲ
３２９も同様にして制限酵素ＨｉｎｄｌｌＩ及び５ａｆ
Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８
％）を行ない、ベクターの大部分を含む約３．６　Ｋｂ
ｐのＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ　　　Ｓ　ａ　Ｉ　ＩのＤＮＡ断
片を回収する。

こうして得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、実施例
２の方法に準じてＴ４−ＤＮＡリガーゼで連結した後、
上記方法に準じて、プラスミドｐ３２９ＰＳを作成した
。第１８図にｐ３２９Ｐｓの作成方法を示す。

実施例１８（Ｆｃ領域遺伝子ペリプラズム分泌発現型プ
ラスミドの作成） 実施例１１で作成したＦＣＣ領域遺伝子菌体内発現型プ
ラスミドルＦ　Ｃ３６２を、実施例４の方法に準じて制
限酵素Ｓ−ｓ　ｔ　ＩＩ及びＥｃｏＲｒで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、ｔａｃ
プロモーター領域・ｈ部位遺伝子・Ｃ１１２部位遺伝子
の前半部分を含む約０．４　ＫｂｐのＥｃ。

ＲＩ　　　Ｓｓ、ｔｌｌのＤＮＡ断片と、ベクターの大
部分・ＣＨ２部位遺伝子後半部分・ｃ、３部位遺伝子を
含む約４．５　ＫｂｐのＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　←→Ｓ　ｓ
　ｔ　ＩＩのＤＮＡ断片とを、実施例５の方法に準じて
ゲルより回収する。このうちのｔａｃプロモーター領域
・ｈ部位遺伝子・ＣＨ２部位遺伝子前半部位を有するＥ
　ｃ　ｏ　ＲＩ　−３ｓ　ｔ　ＩＩのＤＮＡ断片を、実
施例４の方法により制限酵素Ｂｓ　ｔＮＩで切断し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、
Ｃ，２部位遺伝子の一部を含む約１７ｔｂｐのＢｓｔＮ
Ｉ　　　５ｓｔＩｒのＤＮＡ断片を、実施例７の方法に
準じてゲルより回収する。さらに、ペニシリナーゼ遺伝
子プロモーター領域・シグナルペプチド領域とＦｃ領域
遺伝子との連結部分に相当する。第１９図記載の塩基配
列を有する２本鎖オリゴヌクレオチド（約５１ｂｐ）を
、実施例８の方法に準じて作成した。ごのＥ　ｃ　ｏ　
ＲＩ　−ＢｓｔＮｒのＤＮＡ断片中には、後のサブクロ
ーニングに必要な制限酵素Ｓａβｌサイト、ペニシリナ
ーゼ逍伝子シグナルペプチド領域遺伝子との連結のため
の制限酵素）１　ｉ　ｎ　ｄ　ｍサイト、アミノ酸セリ
ンをコードするＴＣＡのコドン、ｈ部位遺伝子及びＣ１
１２部位遺伝子の一部が含まれている。

このＤＮＡ断片を用いることにより、大腸菌内で正しく
シグナルペプチドが切断され、ＦＣ領域蛋白質のアミノ
末端にアミノ酸セリンが１細糸分についた形の蛋白質の
産生が期待できる。以上のようにして得られた、ベクタ
ーの大部分・０□２部位遺伝子後半部分・ＣＭ３部位遺
伝子を含むＥｃｏＲＩ　　　５ｓｔｌＩのＤＮＡ断片、
Ｃ工２部位の遺伝子の一部を含むＢｓｔＮＩ　　　Ｓｓ
ｔ■のＤＮＡ断片、及びペニシリナーゼ遺伝子シグナル
ペプチド領域とＦｃ領域遺伝子との連結部分に相当する
Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　−Ｂ　ｓ　ｔ　Ｎ　ＩのＤＮＡ断片
とを混合し、実施例５の方法に準じて、プラスミドｐＳ
ＥＣ−ＦＣ（約４．７　Ｋｂｐ）を作成した。第１９図
にｐＳＥＣ−ＦＣを示す。

こうして得られたプラスミドｐＳＥＣ−ＦＣを、実施例
４の方法に準じて制限酵素Ｈ４ｎｄＩＩＩで切断する。

一方、実施例１７で得られたベニシリナーゼ遺伝子プロ
モーター領域・シグナルペプチド領域を含むプラスミド
ｐＰｓ１を、実施例４の方法に準じて制限酵素Ｈｉｎｄ
Ｉ［ｒで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲ
ル濃度５％）の後、ペニシリナーゼ遺伝子プロモーター
領域・シグナル領域を含むＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ　−Ｈｉ　
ｎ　ｄ　Ｉ［ＩのＤＮＡ断片（約２１０ｂρ）をエレク
トロエリューション法により回収する。このＤＮＡ断片
を先に調製したプラスミドｐＳＥＣ−ＦＣの制限酵素Ｈ
ｉｎｄｌ［切断物と混合し、実施例１７の方法に準じて
、Ｆｃ領域遺伝子ペリプラズム分泌発現型プラスミドｐ
ＰＳ−ＦＣを作成した。第２０図にｐ　ＰＳ−ＦＣの作
成方法を示した。

実施例１９（Ｆｃ領域遺伝子菌体外分泌発現型プラスミ
ドの作成） 実施例１８で作成したプラスミドｐ　５ＥＣ−ＦＣを、
実施例４の方法に準じて制限酵素［（ａｍＨＩで切断し
、実施例８の方法に準じて作成した制限酵素ＣＩｔａｒ
サイトを含む第１９図記載の塩基配列を有する２本鎖オ
リゴヌクレオチド（約１４ｂｐ）　と混合し、実施例２
の方法に準じてＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応
を行なう。実施例１６の方法に準じて、プラスミドｐＳ
ＥＣ−ＦＣ中に存在する制限酵素Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩサイ
トを制限酵素ＣＩ！ａ■サイトに変換した形のプラスミ
ドｐＳＥＣ−ＦＣＣ（約４．７　Ｋｂｐ）を作成した。

第１９図にプラスミドｐＳＥＣ−ＦＣＣの作成方法を示
す。　このようにして得られたプラスミドｐＳＥＣ−Ｆ
ＣＣを実施例４の方法に準じて制限酵素Ｈｉ　ｎｄＩ［
及びＣｊ！ａｌで切断、アガロースゲル電気泳動（ゲル
濃度０．８％）の後、Ｆｃ領域遺伝子を含む約０゜７Ｋ
ｂｐのＨｉｎｄＩ［ｌ　　　Ｃｊ！ａｌのＤＮＡ断片を
上記と同様に回収する。一方、実施例１６で作成した分
泌プラスミドベクターｐＥＡＰ８を実施例４の方法に準
じて制限酵素ＨｉｎｄＩ［及びＣ１ａＴで切断、アガロ
ースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、プラスミ
ドｐＥＡＰ８の大部分を有するＣｌ１ａＩ　　　Ｈｉｎ
ｄＩ［ｒのＤＮＡ断片（約４．７Ｋｂｐ）を上記と同様
に回収する。これら２種のＤＮＡ断片を混合、実施例２
の方法に準じてＴ４−Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｉ、！ガーゼで連結
させ、実施例１６の方法に準じてＦｃ領域遺伝子菌体外
分泌発現型プラスミドｐＥＸＦＣ１０（約５．６　Ｋｂ
ｐ）を作成した。第２１図にｐＥＸＦＣｌｏの作成方法
を示す。

一方、実施例１８で得られたＦｃ領域遺伝子ペリプラズ
ム分泌発現型プラスミドｐＰＳ−ＦＣを実施例４の方法
に準じて制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌ！Ｉで切断、ア
ガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、ペニ
シリナーゼ遺伝子プロモーター領域・シグナルペプチド
領域及びＦＣ領域遺伝子を含む約０，９　ＫｂｐのＳ　
ａ　１１−Ｂ　ａ　ｍＨＩのＤＮＡ断片をエレクトロエ
リューション法により回収する。また、実施例１６で得
られた多コピー型分泌プラスミドベクターｐ３２９ＥＸ
Ｋを実施例４の方法に準じて制限酵素ｆ３　ａ　ｍ　Ｈ
Ｉ及び５ａｊ２Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動（
ゲル濃度０．８％）の後、上記と同様にしてプラスミド
ｐ３２９　ＥＸＫの大部分を含む約４．８　ＫｂｐのＢ
　ａ　ｍ　Ｈ１−８ａｌ■のＤＮＡ断片を回収する。こ
れら２種のＤＮＡ断片を実施例２の方法に準じてＴ４−
ＤＮＡリガーゼで連結し、実施例１６の方法に準じてＦ
Ｃ領域遺伝子菌体外分泌発現型プラスミドｐＥＸＦＣ１
００（約５．７　Ｋｂｐ）を作成した。第２２図にｐＥ
ＸＦＣｌｏｏの作成方法を示す。

実施例２０（Ｆｃ領域蛋白質の分泌発現確認）前記実施
例１１で得られたＦｃ領域遺伝子菌体内発現型プラスミ
ドｐＦＣ３６２を有するエシェリヒア・コリＣ６００株
、実施例１８で得られたＦＣ領域遺伝子ペリプラズム分
分泌用現型ラスミドｐＰＳ−ＦＣを有するエシェリヒア
・３９８８１０１株、及び実施例１９で得られたＦｃ領
域遺伝子菌体外分泌発現型プラスミドｐＥＸＦＣ１０又
はｐＥＸＦＣｌｏｏを有するエシェリヒア・３９８８１
０１株を、最終濃度３０μ／　ｍ　ｌのアンピシリンを
含むＬＢＧＧ培地〔１％　ドリブン、０．５％　酵母エ
キス、１％　ＮａＣ１，０，１％　グルコース、０．２
％グリセロール（ｐＨ７，２））に接種し、３７℃で２
４時間振とう培養を行なう。ただし、プラスミドｐＥＸ
ＦＣＩＯを有するエシェリヒア・３９８８１０１株の場
合には、アンピシリンのかわりに最終濃度２０μｇ　／
　ｍ　ＩＩのクロラムフェニコールを用いた。培養終了
後、オスモチインク・ショック法（Ｃ，Ｋａｔ。

ら、前出）により、培養物を、菌体外画分、ペリプラズ
ム画分、菌体内画分に分画する。すなわち、遠心分離に
よって菌体を分離した培養上清を菌体外画分とする。次
に菌体を生理食塩水で洗浄した後、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
を含む２５％シー１ｔＰ！水溶液に＝、’ＩＢさせて、
３７℃で１０分間振とうする。遠心分離によって菌体を
集めた後、菌体を氷冷した水に懸濁させ、４℃で１０分
間振とうする。この懸濁液に等量の０．１Ｍリン酸バッ
ファー（ｐＨ７，０）を加えた後、遠心分離を行ない、
菌体と分離′した上清部分をペリプラズム画分とする。

さらに、この菌体を０．０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ
７，０）に懸濁させ、超音波により菌体を破壊する。遠
心分離によって菌体残渣を除去した上清部分を菌体内画
分とした。

得られた両両分のサンプルは、アセトン乾燥を行なった
後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！バッフｙ−（ｐＨ６゜８）、Ｓ
ＤＳ、２−メルカプトエタノール、グリセロールを、そ
れぞれ最終濃度６０ｍＭ、２％、４％、１０％になるよ
うに加えて、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
〔鉛末、遺伝、姓、４３　（１９７７）〕を行なった。

分離用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファーは５ＤＳ
−Ｔｒｉｓ−グリシン系ＣＵ、に、　Ｌａｅｍｍ目、Ｎ
ａｔｕｒｅ、、２２７　、６８０（１９７０）　）を用
いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質を、２５ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ　−１９２ｍＭ　　グリシン（ｐ　Ｈ８，３
）　−２０％　メタノールのバッファー中で、電気泳動
的にニトロセルロース・フィルターに吸着させ、ウェス
タン・プロッティングを行なった。蛋白質を吸着すせた
ニトロセルロース・フィルターを３％ゼラチンを含むＴ
ＢＳバッフｙ−（２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ１（ｐ
　Ｈ７，５）、５００ｍＭ　ＮａＣ１”Ｊ中に６０分間
浸した後、−次抗体としてウサギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ成
分抗血清（カッペル）を用いた間接法で、ベルオキシダ
ーセ標識抗体を用いたイミュン・プロット・アッセイ・
キット（バイオ・ラツ１：）により、ヒトＩｇＧ　　Ｆ
ｃ領域蛋白質を特異的に染色した。結果の一部を複写し
て第２３図に示した。この際に、後記参考側記載の方法
により調製した既知・量の天然型ヒト免疫ＩｇＧ　　Ｆ
ｃ領域蛋白質も同一の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
で電気泳動等を行なった。

第２３図より、ＦＣＣ領域遺伝子菌体内発現型プラスミ
ドルＦ　Ｃ３６２を有するエシェリヒア・コリＣ６００
株の場合には、Ｆｃ領域蛋白質は菌体内画分にのみ局在
しているのに対して、ペリプラズム分泌発現型プラスミ
ドｐＰＳ−ＦＣを有するエシェリヒア・コリＨ８１０１
株の場合にはべりプラズムまで、菌体外分泌発現型プラ
スミドｐＥＸＦＣ１０またはｐＥＸＦＣｌｏｏを有する
エシェリヒア・コリＨ８１０１株の場合には菌体外画分
にまで、それぞれＦｃ　８１域蛋白質が分泌されている
ことがわかる。また、天然型Ｆｃ１Ｊｆ域蛋白質に（ら
べて大腸菌産生Ｆｃ領域蛋白質の分子量が約５０００ダ
ルトン程度小さいという第２３図の結果から考えて、大
腸菌産生Ｆｃ領域蛋白質には糖鎖の付加がおこっておら
ず、シグナルペプチドは除去されているものと思われる
。

参考例（天然型ヒト免疫グロブリンＧ　　ＦＣ領域蛋白
質の調製） ０．３ｇのヒトＩｇＧ（シグマ）　、１７．５ｍｇのシ
スティン、７．５ｍｇのＥＤＴＡ・２ＮａをＰ　Ｂ　Ｓ
　バッフｙ　　　（１００ｍＭ　　リン酸バッフｙ−（
ｐＨ７，４）、１４０ｍＭ　　ＮａＣｊ２）に溶解し、
１５０／Ｊｇのパパイン（シグマ、タイプ■）を添加し
て、３７℃で７時間放置する。パパイン処理後のＩｇＧ
を、ＰＢＳバッファーで平衡化したセファデックスＧ−
２００スーパー・ファイン・ゲル（ファルマシア）を用
いたゲル濾過カラムにかけ、パパイン処理によって生成
したＦｃ領域蛋白質及びＦａｂ領域蛋白質を、未反応の
ＩｇＧと分離した。得られたＦＣ領域蛋白質とＦａｂ領
域蛋白質とを含む溶液を水に対して透析し、凍結乾燥に
よって濃縮した後、ＤＥ５２・ＤＥＡＥセルロース（ワ
ットマン）を用いたイオン交換カラムにかけた。カラム
を１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７，４）で洗浄し、
Ｆａｂ領域蛋白質を完全に溶出させた後、ＮａＣ１１濃
度をＯｍＭから３５０ｍＭまで直線的に変化させた１０
ｍＭ　リン酸バッフブー（ｐＨ７，４）用いて、Ｆｃ領
域蛋白質を溶出させた。上記と同様にして透析、凍結乾
燥を行ない、天然型ヒ）ＩｇＧＦｃｊＪ域蛋白質を取得
した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒ）ＩｇＧ　　Ｆｃ領域遺伝子ペリプラズム
分泌発現型プラスミドｐ　ＰＳ−ＦＣのＤＮＡ塩基配列
の一部と、それに対応する好アルカリ性バチルス患１７
０株ペニシリナーゼ・シグナルペプチドとＦ　ｃ　％ｆ
Ｊ域蛋肉蛋白質ミノ酸配列を示したものである。 第２図は、プラスミドｐＭＢｅ中に存在するＫ１）ｉｊ
ｌ伝子のＤＮＡ塩基配列を示したちのでる。 第３図は、好アルカリ性バチルスｌ１ｈ１７０株染色体
ＤＮＡ中に存在するＥｘプロモーター領域のＤＮＡ塩基
配列を示したものである。 第４図は、ヒト’ＩｇＧｉｊｉ伝子を含むファージ・ク
ローンの制限酵素切断点地図とＦｃ領域遺伝子を含むサ
ブクローンの制限酵素切断点地図とを示したものである
。 第５図は、Ｃ）＋３部位遺伝子を含むプラスミドｐＦｃ
７０の作成方法を示したものであり、第６図はＣイ２Ｃ
ｏ３部位遺伝子を含むプラスミドｐＦＣ７７の作成方法
を示したものである。 第７図、第８図、第９図はそれぞれＦｃ領域遺伝子菌体
内発現型プラスミドｐＦｃ２０３、ｐＦＣ２１１、ｐ　
ＦＣ３２９の作成方法を示したものである。 第１０図は、プラスミドＤＮＡの大腸菌からの分離・精
製方法を示したものである。 第１１図は、好アルカリ性バチルスＮｏ、　１７０ペニ
シリナーゼ遺伝子のクローン化の方法を示したものであ
る。 第１２図、第１３図、第１４図、第１５図は、菌体外分
泌生産に関与する情報を担うＤＮＡ領域を含むプラスミ
ドｐＥＡＰ３、ｐ　ＥＡＰ　６、ｐＥＡＰ７、ｐＥＡＰ
７ΔＨ，ｐＥＡＰ７ΔＣＣＨ，ｐＥＡＰ。 ７ΔＣＨＳｐＥＡＰ８、ｐ３２９ＥＸＫの作成方法を示
したものである。 第１６図は、クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ構造遺伝子を含むプラスミドｐＣＭ７１の作成
方法を示したものである。 第１７図、第１８図は、ペニシリナーゼ遺伝子プロモー
ター領域・シグナルペプチド領域を含むプラスミドｐＰ
ｓ１、ｐＰｓ１ΔＨ，Ｉ）３２９ＰＳの作成方法を示し
たものである。 第１９図は、シグナルペプチド領域遺伝子との連結用ジ
ヨイントを有するＦＣ領域遺伝子を含むプラスミドｐＳ
ＥＣ−ＦＣ，ｐＳＥＣ−ＦＣＣの作成方法を示したもの
である。 第２０図は、Ｆｃ領域遺伝子ペリプラズム分泌発現型プ
ラスミドｐＰＳ−ＦＣの作成方法を示したものである。 第２１図、第２２図は、Ｆｃ領域遺伝子菌外分泌発現型
プラスミドｐＥＸＦＣ１０、ｐＥＸＦＣｌｏｏの作成方
法を示したものである。 第２３図は、Ｆｃ領域蛋白質の分泌確認結果を示したも
のである。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｉ）ヒト免疫グロブリンＧ　Ｆｃ領域蛋白質をコ
   ードするＤＮＡ領域、該蛋白質の発現調節を行なうプロ
   モーター機能を有するＤＮＡ領域及びシグナルペプチド
   をコードするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ断片、及び ｉｉ）菌体外分泌を促進する作用を宿主細胞に与えるＤ
   ＮＡ領域及び該ＤＮＡ領域の発現調節を行なうプロモー
   ター機能を有するＤＮＡ領域を有するＤＮＡ断片、 を含むプラスミド。
2. （２）ヒト免疫グロブリンＧ　Ｆｃ領域蛋白質をコード
   するＤＮＡ領域が、第１図に示されたアミノ酸配列の３
   ２番目（Ｔｈｒ）から２５４番目（Ｌｙｓ）までによっ
   て示されたポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を少な
   くとも含むことを特徴とする第１項記載のプラスミド。
3. （３）第１項ｉ）におけるプロモーター機能を有するＤ
   ＮＡ領域が、好アルカリ性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
   ）Ｎｏ．１７０株の染色体ＤＮＡ由来であることを特徴
   とする第１項記載のプラスミド。
4. （４）シグナルペプチドをコードするＤＮＡ領域が、好
   アルカリ性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｎｏ．１７０
   株の染色体ＤＮＡ由来であることを特徴とする第１項記
   載のプラスミド。
5. （５）実質的に菌体外分泌を促進する作用を宿主細胞に
   与えるＤＮＡ領域が、プラスミドｐＭＢ９由来であるこ
   とを特徴とする第１項記載のプラスミド。
6. （６）第１項ｉｉ）におけるプロモーター機能を有する
   ＤＮＡ領域が、好アルカリ性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
   ｓ）Ｎｏ．１７０株の染色体ＤＮＡ由来であることを特
   徴とする第１項記載のプラスミド。
7. （７）プラスミドｐＥＸＦＣ１０である第１項記載のプ
   ラスミド。
8. （８）プラスミドｐＥＸＦＣ１００である第１項記載の
   プラスミド。
9. （９）ｉ）ヒト免疫グロブリンＧ　Ｆｃ領域蛋白質をコ
   ードするＤＮＡ領域、該蛋白質の発現調節を行なうプロ
   モーター機能を有するＤＮＡ領域及びシグナルペプチド
   をコードするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ断片、及び ｉｉ）菌体外分泌を促進する作用を宿主細胞に与えるＤ
   ＮＡ領域及び該ＤＮＡ領域の発現調節を行なうプロモー
   ター機能を有するＤＮＡ領域を有するＤＮＡ断片、 を含む、プラスミドによって形質転換された組換え微生
   物細胞。
10. （１０）該微生物細胞がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉ
    ｃｈｉａ）属に属することを特徴とする第９項記載の微
    生物細胞。
11. （１１）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
    ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株であることを
    特徴とする第９項記載の微生物細胞。
12. （１２）　ｉ）ヒト免疫グロブリンＧ　Ｆｃ領域蛋白質
    をコードするＤＮＡ領域、該蛋白質の発現調節を行なう
    プロモーター機能を有するＤＮＡ領域及びシグナルペプ
    チドをコードするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ断片、及び ｉｉ）菌体外分泌を促進する作用を宿主細胞に与えるＤ
    ＮＡ領域及び該ＤＮＡ領域の発現調節を行なうプロモー
    ター機能を有するＤＮＡ領域を有するＤＮＡ断片、 を含むプラスミドによって形質転換された組換え微生物
    を、菌体外にヒト免疫グロブリンＧ　Ｆｃ領域蛋白質が
    生成・蓄積するまで培養を行ない、培養物からヒト免疫
    グロブリンＧ　Ｆｃ領域蛋白質を採取することを特徴と
    するヒト免疫グロブリンＧ　Ｆｃ領域蛋白質の製造法。
13. （１３）該微生物がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
    ｉａ）属に属することを特徴とする第１２項記載の製造
    法。
14. （１４）該微生物がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
    ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株であることを特徴
    とする第１２項記載の製造法。