JPS63245691A

JPS63245691A - ヒト免疫グロブリンＧＦｃ領域蛋白質およびその製造方法

Info

Publication number: JPS63245691A
Application number: JP7638587A
Authority: JP
Inventors: Tsukio Sakugi; 柵木　津希夫; Satoshi Nakamura; 聡中村; Kazuo Kitai; 北井　一男; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1987-03-31
Filing date: 1987-03-31
Publication date: 1988-10-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）産業上の利用分野　　　　　　　　　　　　　　
ｔｅｕ本発明はヒト免疫グロブリンＧＦＣ領域蛋白質、
　　　Ｌｙｓ該蛋白質をコニドするＤＮＡ断片を組み込
んだ組　　Ｎｅｔ換えプラスミド、および該プラスミド
を含む微生　　Ｐｈｅ物を用いたヒト免疫グロブリンＧ
Ｆｃ領域蛋白質の　　Ｐｒ。

製造法に関する。　　　　　　　　　　　　　　　　　
Ｓｅｒ本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドは　
　ＴｈｒＩＬＪＰＡＣ−ＩＬＪＢ生化学委員会（ＣＡＮ
＞で採　　Ｔｒｐ用された方法により略記するものとし
、たとえば　　Ｔｙｒ下記の略号を用いる。　　　　　
　　　　　　　　　　ＶａｔＬ−アラニンし−アルギニンＬ−アスパラギンＬ−アスパラギン酸Ｌ−システィンＬ−グルタミンＬ−グルタミン酸グリシンＬ−ヒスチジンし−イソロイシンし−ロイシンＬ−リジンＬ−メチオニンし−フェニルアラニンし−プロリンＬ−セリンＬ−スレオニンし−トリプトファンＬ−チロシンし−バリンまた、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示ず。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン（デオキシチミジ
ル酸を示す。）さらに、（８２Ｎ）−及び−（ＣＯＯＨ
）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボキ
シ末端側を示すものであり、（５′）−及び−（３°）
はそれぞれＤＮＡ配列の５°末端側及び３°末端側を示
すものである。

（２）発明の背景すべてのを推動物の体液中に存在し、抗原と特異的に結
合する能力を有する蛋白質が抗体であり、抗体蛋白と構
造的９機能的関連をもつ蛋白質を総称して免疫グロブリ
ンという。免疫グロブリン（以下ＩＯと略す）は、物理
化学的おるいは免疫学的な性状から、ＩＱＧ、　ＩＯＡ
、　ＩＯＭ、　Ｉ（ＩＩＥ、　ＩｇＤの５つのクラスに
分類される。

なかでもＩＯＣは細菌やウィルスに対する生体防御に重
要な役割を持っており、従来より、ヒトＩｇＧを多量に
含むγ−グロブリン画分はヒトの血液より分離され、そ
れを一部変性することにより重症患者のための免疫製剤
として用いられてきた。

しかしながら、これは原料を人血に依存しており、その
大量の安定した入手が困難であること、またそのために
均質で安全なものを常時骨にくいという難点があった。

そこでヒト抗体蛋白を遺伝子操作技術によって安定して
多量に産出することができれば、医薬品製造のために極
めて有利であることは論を待たない。

ヒトＩｇＧは２本のＨ＆１ｉ（ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ
）、と２本のＬ鎖（ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ）がジスル
フィド結合で結ばれた形態をしている。ヒト１０６分子
にパパインなどの蛋白分解酵素を作用させるとその分子
のほぼ中央で切断され、抗原結合活性のある断片（Ｆａ
ｂ領域蛋白質）と、抗原結合活性はなく条件により結晶
化しやすい断片（Ｆｃ領域蛋白質）とに分かれる。

Ｆａｂ領域蛋白質はＬ鎖全体とＨ鎮のアミノ基末端側の
半分を含み、１分子のＩｇＧから２分子のＦａｂ領域蛋
白質が生じる。一方、Ｈ鎖のカルボキシル基末端側の半
分であるＦＣ領域蛋白質は、切断部位からヒンジ（ｈ）
　、　ＣＩ＋２．　ＣＨ３の順序でのこれら３つの部位
より構成され、ヒンジ（ｈ）部位において２木の１がジ
スルフィド結合によって結ばれた形態をしている。そし
て、Ｆｃ領域蛋白質はエフェクター（ｅｆｆｅＣｔｅｒ
）機能を有している。

従来、γ−グロブリン製剤は、無（低）γ−グロブリン
血症への補充、ウィルス感染症の予防と治療投与等に適
用されてきた。近年、ｒ−グロブリン製剤が特発性血小
板減少性紫斑病（ＩＴＰ＞治療に有効であり［Ｐ、　Ｉ
ｍｂａｃｈら、　Ｌａｎｃｅｔ、　１゜１２２８（１９
８１）参照］、特にそのＦｃ領域が重要でおることが示
唆されている［朴ら、臨床免疫、　１５．７６（１９８
３）参照］。また、全身性エリテスト−デス（ＳＬＥ）
等における腎糸球体沈着免疫複合体が、ヒトＩｇＧ　Ｆ
ｃ領ｂＸ蛋白質の添加による融解したという報告もある
［河住ら、臨床免疫、貝、２４０（１９８４）参照］。

以上のように、ヒトＩ（ＩＧにおけるＦＣ領域蛋白質は
、前記ＩＴＰやＳＬＥのような自己免疫疾患の治療薬と
して用いることができる可能性があるが、作用機序など
を含めて不明な点が多く、また均質なＦＣ領域蛋白質を
多量に供給できないことが、実用化への障害の理由とな
っている。

一方、ヒトＩＱＧの）［は、更にγ１鎖、γ２鎖。

γ３鎖、γ４鎖の４種のり°ブクラスに細分される。

それらのうち、Ｔ２鎖及びγ４鎖についてはタラウィン
ケルら［０，ＫｒａＷｉｎｋｅｌら、　ＥＨＢＯＪ、、
１，４０３（１９８２）参照］が、γ１鎖についてはエ
リソンら［Ｊ、Ｗ、ＥＩＩｉｓｏｎら、　Ｎｕｃｌｅｌ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１０゜４０７１　（１９
８２）参照］が、それぞれ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の一
部について報告している。しかし、上記報告にはヒトＩ
ｇＧ蛋白を発現させるためのＤＮＡ断片としての記載は
ない。

（３）発明の目的そこで本発明の目的は、ヒトｌ１ｌＪＧのＦｃ領域にお
ける単量体蛋白質および二母体蛋白質を提供することに
ある。

本発明の他の目的は、ヒトＩｇＧのＦｃｌ域蛋白質をコ
ードするＤＮＡ断片およびその断片が組み込まれた組換
えプラスミドを提供することにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換され、目的とするヒトＩｇＧのＦｃ領域の蛋
白質を産生じ得る組換え微生物細胞およびその微生物細
胞を用いてヒトＩｇＧのＦｃ領域蛋白質をｒ！Ａ造する
方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成本発明者の研究によれば、前記本発明の目的は、添付第
１図に示されたアミノ酸配列の２番目（Ｔｈｒ）から２
２４番目（ＬｙＳ）までのポリペプチドを含み、ヒ１へ
由来の他の蛋白質を実質的に含まないヒト免疫グロブリ
ンＧのＦＣＣ領域層母体蛋白質よびその二量体蛋白質を
提供することによって達成され、また上記Ｆｃ領域蛋白
質をコードした遺伝子断片およびその断片が組み込まれ
た組換えプラスミドを提供することによって達成され、
更にかくして１ｑられた組換えプラスミドによって形質
転換された組換え微生物細胞およびその微生物細胞を用
いて目的とするヒト免疫グロブリンＧのＦｃ領域蛋白質
を産生ずる方法を提供することによって達成されること
がわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

なお本明細書および図面において、アミノ酸。

ペプチド、その他に関し略号で表示する場合、それらは
Ｉ　Ｕ　ＰＡＣ−Ｉ　ＬＪ　８　（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏ
ｎ　ｏｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕ
ｒｅ）による略号あるいは当該分野における慣用略号に
基づくものである。

先ず本発明によれば、第１図に示されたアミノ酸配列の
２番目（Ｔｈｒ）から２２４番目（Ｌｙｓ）までによっ
て表わされるポリペプチドを含み、ｅト由来の他の蛋白
質を実質的に含まないヒト免疫グロブリンＧＦｃ領域単
量体蛋白質が提供される。このポリペプチドとしては、
第１図に示されたアミノ酸配列の１番目（ＮＥＴ）から
２２４番目（Ｌｙｓ）までによって表わされるものであ
ることができる。さらに上記蛋白質は天然のグリコシル
化を伴わないものであることができる。

本発明のヒト免疫グロブリンＧＦＣ領域二母体蛋白質は
、前記した単量体蛋白質を自然に或いは人為的に会合さ
せたものであればよく、例えば−５−Ｓ−結合によって
会合されていてもよい。

本発明によれば、さらに第１図に示されたアミノ酸配列
の２番目（Ｔｈｒ）から２２４番目（ＬＶＳ）までによ
って表わされるポリペプチドをコードしたＤＮＡを含む
遺伝子断片が提供される。またこの遺伝子断片は第１図
のＤＮＡ配列の８６番目（Ａ）から７５４番目（Ａ）ま
でによって表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一
本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡを含む断片であること
もできるし、さらに第１図のＤＮＡ配列の１番目（Ｃ）
から１６５番目（Ｃ）までによって表わされる一本＆［
ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮＡからなる二本ｌＤ
ＮＡを含む断片であることもできる。

本発明の組換えプラスミドにおいては、前記した蛋白を
コードするＤＮＡを含む遺伝子断片はその上流翻訳開始
コドンを有することもできるし、また下流方向に翻訳終
止コドンを有することもできる。またその遺伝子断片と
適当なプロモーターとを連結させて微生物細胞中でヒト
免疫グロブリンＧＦＣ領域蛋白質の発現を容易に可能な
らしめるようにプラスミド中に組み込むこともできる。

ざらに組換えプラスミドにおいては、前記遺伝子断片が
トリア１〜フアン・オペロン・プロモーターまたはｔａ
ｃプロモーターの下流に組み込まれていてもよい。

（ａ）ヒト染色体ＤＮＡおよび遺伝子ライブラリーの作
成：ヒトＩ（ＪＧを産生ずる細胞、たとえばヒト骨髄腫細胞
ＡＲＨ７７株［に、１１．Ｂｕｒｋら、　Ｊ、Ｃａｎｃ
ｅｒＲｅｓ、、　３８．２５０８（１９７８）参照］を
、適当な条件下、たとえば３７℃、炭酸ガス濃度５％で
培養増殖させ、１りられた細胞を遠心分離によって集め
る。

この細胞を、たとえばラウリル硫酸ナトリウム（ＳＯ８
）のような界面活性剤存在下で、たとえばプロテアーゼ
にのような蛋白質分解酵素を用いて溶解させる。さらに
、たとえばフェノールによる抽出によって除蛋白を行な
い、ヒト染色体ＤＮＡを得る。

こうして得られたＤＮＡを、たとえばＥｃｏ　ＲＩのよ
うな制限酵素で切断し、得られた断片を適当なファージ
・ベクター、たとえばシャロン（ＣｈａｒＯｎ）　４Ａ
ベクター［Ｆ、Ｒ，Ｂｌａｔｔｎｅｒら。

５ｃｉｅｎｃｅ、１９６．１６１（１９７７）参照］と
連結した後、インφビトロ・パッケジング［Ａ、　Ｂｅ
Ｃｋｅｒら。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
＾、　７２．５８１（１９７５）参照］を行ない、ヒト
の遺伝子ライブラリーを１りる。Ｅｃｏ　ＲＩ以外の制
限酵素を用いる場合□や、クローニング・サイトとして
Ｅｃｏ　ＲＩをもたないような他のファージ・ベクター
を使用する場合には、適当なリンカ−ＤＮＡを用いれば
遺伝子ライブラリーの作製が可能になる。

（ｂ）サブクローンの制限酵素切断地図の作製；この遺
伝子ライブラリーのファージを、たとえば大腸菌ＬＥ３
９２株（ＡＴＣＣ３３５７２）に感染、プラークを形成
させ、たとえばプラーク・ハイブリダイゼーション法［
Ｗ、　Ｄ、　Ｂｅｎｔｏｎら、　５ｃｔｅｎｃｅ。

１９６、１８０（１９７７）参照］によって目的クロー
ンの選択を行なう。プローグとしては、たとえばニック
トランスレーション法［Ｐ、詩、Ｊ、ｎｔｇｂｙら。

Ｊ、　）ｌｏｌ、　Ｂｉｏｌ、、１１３．２３７（１９
７７）参照］により３２Ｐ標識を行なったヒト免疫グロ
ブリンＨｆａＪ領域（Ｆａｂ領域の中の一部であり、抗
原結合活性を有する可変部とエフェクター機能を有する
定常部との境界に存在）遺伝子や、あるいはヒト１ｇＧ
　Ｆｃ領域蛋白質のアミノ酸配列に対応すると考えられ
る塩基配列をもつオリゴヌクレオチドを化学合成した後
、これを３２ｐ標識したものを用いることができる。

このプラーク・ハイブリダイゼーションによって陽性を
示したクローンの制限酵素切断点地図を作製し、ヒト染
色体由来のＤＮＡ断片を、たとえばＰＢＲ３２２［Ｆ、
Ｂｏｌｉｖａｒら、　Ｇｅｎｅ、　２゜９５（１９７７
）参照］のようなプラスミド・ベクターにりブ・クロー
ニングする。得られたサブクローンの挿入部分のＤＮＡ
塩基配列を、たとえばマキサム−ギルバート法［Ａ、　
Ｈ，Ｈａｘａｍら。

Ｈｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　６５．４９９（
１９８０）参照］必るいは）ｆ１３ファージを用いたジ
デオキシ・チェーン・ターミネーション法［Ｊ、　Ｍｅ
ｓｓ　ｉ　ｎｇら。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　９．３０９
（１９８１）参照］の方法により決定し、ヒトＩｇＧ　
Ｆｃ領域遺伝子の存在を確認する。

（ｃ）ＤＮＡ断片の作成；こうして得られたヒトＩＣＩＧ　ＦＣ領ｖｉｍ仏信子、
と１〜染色体由来のものであるから、実際にアミノ酸を
コードしないイン１〜ロン（１ｎｔｒｏ口）を含んでお
り、このままでは微生物中で発現させることはできない
。そこでこのＦｃ領域遺伝子を適当な制限酵素で切断し
、イントロンの部分を完全に除去する。この制限酵素切
断の際に、実際にアミノ酸をコードするエクソン（ｅｘ
ｏｎ）の部分も削られてしまうことがありうるが、その
場合には化学合成したオリゴヌクレオチドのジヨイント
を用いて削られた部分を修復させると共に、隣り合った
エクソン同志を連結させる。同時に、合成オリゴヌクレ
オチドを用いた同様な手法により、Ｆｃ領域遺伝子の３
末端に読みとりフレームを一致させるように翻訳終止コ
ドン（丁ＧＡ、　ＴへＧ、　ＴＡＡ）を２つ以上タンデ
ムに連結し、発現効率の向上をはかることもできる。こ
こで得られたイントロンを含まないＦｃ領域遺伝子は、
やはり合成オリゴヌクレオチドを用いた手法を用い、そ
の上流に読みとりフレームを一致させるように翻訳開始
コドンを付与することができる。さらにこのＦｃ領域遺
伝子は、適当なプロモーター、　ＳＤ　（シャイン・タ
ルガーノ）配列の下流につなぐことにより、発現型遺伝
子とすることができる。使用可能なプロモーターとして
、トリプトファン・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプ
ロモーター）、ラクトース・オペロン・プロモーター（
Ｉａｃプロモーター）、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロ
モーター、■ｐｐプロモーター等がめげられるが、とり
わけｔ叩プロモーターやｔａｃプロモーターが好適であ
る。Ｆｃ領域遺伝子を効率良く発現させるためには、プ
ロモーター、ＳＤ配列、翻訳開始コドン、翻訳終止コド
ンのすべてを連結したものが好ましく、プロモーター、
ＳＤ配列、翻訳開始コドン、　Ｆｃ領域遺伝子、翻訳終
止コドンが、この順で連結したものがとりわけ好ましい
。

（ｄ）組換えプラスミドおよび組換え微生物細胞の作成
；本発明の発現型ヒトＩｇＧ　Ｆｃ領域遺伝子を、適当な
プラスミド・ベクター、たとえばｐＢＲ３２２に挿入す
ることにより、発現型プラスミドが作製できる。発現型
プラスミドの例として、好ましくは、ｐＦＣ２０３，ｐ
Ｆｃ２０４．１）ＦＣ２０’３Ｓ、　Ｉ）ＦＣ２０３Ｐ
。

１）ＦＣ２１１，ｐＦＣ３６１，ｐＦＣ３６２，Ｉ）Ｆ
Ｃ２１１Ａ、　１）ＦＣ３６２Ａが用いられる。

ヒ１−Ｉ（ＩＧＦＣ領域遺伝子を発現させるための微生
物宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵母などがあげられ
るが、とりわけ大腸菌が好ましい。

上記のＦｃ領域発現型プラスミドは、たとえば公知の方
法［）１．　Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄら、　Ｇｅｎｅ、　
３．２７９（１９７８）参照］を用いて、微生物宿主、
たとえば大腸菌に導入することができる。

このようにして１７られた組換え微生物を、それ自体は
公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグルコ
ースとカザミノ酸を含むＨ９培地［Ｔ、Ｈａｎｉａｔｉ
ｓら編、　ＭＯＩｅＣＩＪｌａｒ　ｃｏｎ；ｎｇ、　　
Ｐ４４０（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９＆２）
参照］があげられ、発現型プラスミドの宿主内安定化の
ために、必要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加
するのが望ましい。

培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば振と
うによる通気、ｍ拌を°加えながら、３７℃で２〜３６
時間行なう。また、培養開始時または培養中に、プロモ
ーターを効率よく機能させる目的で、３．β−インドー
ルアクリル酸（ｔｒｐプロモーターの場合）、イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラク（〜シト（ｔａｃプロモータ
ーの場合）などの薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により細胞を破砕し、遠心分離により組換え微
生物細胞のライゼートを得る。ライゼート中のヒトＩｇ
Ｇ　Ｆｃ領域蛋白質の量は、たとえば市販のウサギ抗ヒ
トＩｇＧ−ＦＣ成分、抗血清および酵素標識抗つサギＩ
Ｑ抗体を用いたエンザイム・イムノアッセイ（ＥＩＡ）
により測定することができる。

このう・イゼートからのヒトＩｇＧ　Ｆｃ領域蛋白質の
精製は、公知の通常知られている蛋白質の分離・精製法
に従えばよいが、抗ヒトＩｇＧ−ＦＣフラグメント抗体
を用いたアフィニティーカラム・クロマトグラフィーが
とりわけ有利である。かくして得られた精製Ｆｃ領域蛋
白質のうち単量体のものについては、たとえばチャンス
らの方法［Ｒ，Ｅ、ＣｈａｎＣｅら、　Ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ　：第７回米国ペプチドシンポジウムＰｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇｓ　　（Ｄ、１１．ＲｉｃｈおよびＥ、Ｇｒｏｓ
ｓ　ｌｉ）　、　７２１−７２８．Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、。

Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ、（１９８１）参照］を用い
ることにより、天然の免疫グロブリンと同様゛に２本の
ポリペプチドがジスルフィド結合を介して連結された形
の２ｍ体とすることができる。

以下実施例を掲げて、本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実・施例１（ヒト染色体ＤＮＡの単離）ヒト骨髄腫細胞
ＡＲＨ７７株３ｘｉｏｓ個をガラス棒でつぶし、２％Ｓ
ＥＳ存在下、プロテアーゼＫ（シグマ）で処理した後、
１０ｍＨＴｒｉｓ　−ＨＣｆｌ　（ｐＨ８，０）−ＩＩ
ＩＩＨＥＤＴＡ水溶液で飽和したフェノールを加えた。

遠心分離により水相とフェノール相を分離しくフェノー
ル抽出）、水相を２０ｍ１４’ＴｒｉＳ　−ＨＣｆｆｌ
（１）１１７．５）−１００ｍＨＮａ（ｌｆｆｌ−５ｍ
ＨＥ　ＤＴＡ水溶液に対して透析した。リボヌクレアー
ゼＡ（シグマ＞ｒｅ理をし、再度フェノール抽出を行な
った後、１０ｍＨ丁ｒｉＳ−ＨＣｕ　（１）８８．０）
−１ｍ）ｆＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ水溶液に対して透析し、ヒト
染色体ＤＮＡ的１．２ｍｇを取得した［Ｎ、Ｂ１１ｎら
、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　　３．
２３０３（１９７６）参照］。

実施例２（ヒト遺伝子ライブラリーの作成）実施例１で
得られたヒト染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　１５０μｇを後述する
実施例４に湿した方法に準じて制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩ　
（宝酒造）で部分分解した後、蔗糖密度勾配遠心［蔗糖
１０〜４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）　、　２８０００ｒｐｍ
×１５時間、２０℃］を行ない、１５にｂｐ〜２３にｂ
ｐに相当するＤＮＡ断片４．３μＱを得た。次にこのＤ
ＮＡ断片０．８μｇとシャロン４Ａベクターとの連結を
行ない、シャロン４Ａベクターの右のアームと左のアー
ムの間にヒト由来のＤＮＡが挿入されたハイブリッドＤ
ＮＡを得た。連結にはＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ）を用い、連結反応は６６
ｍＨＴｒｉｓ　−Ｈ（ｌｆｆｌ　（１）Ｂ７、６）　−
６゜６ｍ）ｌ　ＨＱ　　Ｈ（Ｊα２−１０ｍＭジチオス
レイトール−１ｍＨＡＴＰ水溶液中で１１℃、１２時間
行なった。得られたハイブリッドＤＮＡについて、□イ
ン・ごトロ・パッケージングを行ない、ヒト遺伝子ライ
ブラリー（１，８ｘ１０６　ＰＦＵ／μｇ、ヒト染色体
ＤＮＡの９９％以上を含む）とした。

実施例３（ヒト免疫グロブリンＧＷ伝子のスクリーニン
グ）前記実施例２で１ｑられたヒト由来のＤＮＡを含むシャ
ロン４Ａフアージの集合（遺伝子ライブラリー）を大腸
菌ＬＥ３９２株に感染させ、プラークを形成させた。ヒ
ト抗体遺伝子を含むクローンは、プラーク・ハイブリダ
イゼーション法により、［３２Ｐ］−標識ヒト抗体Ｈ鎖
Ｊ遺伝子で選択した。

ヒト抗体遺伝子を含むシャロン４ＡフアージからのＤＮ
Ａの調製は、Ｔｈｏｍａｓらの方法［Ｈ，Ｔｈｏｍａｓ
ら。

Ｊ、）ｆｏｌ、　Ｂｉｏｌ、、　９１．３１５（１９７
４）参照］により行なった。

実施例４（制限酵素切断点地図の作成）実施例３で１９
られたヒト免疫グロブリン遺伝子を含むシャロン４Ａ　
　ＤＮＡ１μｇを制限酵素切断用バッフ？　　［Ｅｃｏ
　Ｒ１，ＴｑＱ　１．　Ｘｂａ　１．ＸｈＯ工切断では
５０ｍＨＴｒｉｓ　−ＨＣＲ（ｐＨ７，４）　−１０Ｏ
ｎ＋ＨＮａ（Ｊ−１０ｍＨＭｇＳ　０４水溶液を、Ｂａ
ｍＨｌ、ＣＪ２ａＩ、　Ｈｉｎｄｌｌｌ、　Ｐｓｔ　Ｉ
、　Ｒｓａ　Ｉ、Ｓａｗ３ＡＩ切断では１０ｍＨ丁ｒｉ
ｓ　　−ＨＣＱ　　（ｔ）８７．５）−６０ｍ）ｉ　　
　Ｎａ（ｕ−７ｍＨＨＱＣｆｌｚ水溶液を、Ｂａｌ　Ｉ
、ＢｓｔＮ　］：、ＮａｅＩ、５ｓｔｌＩ切断では１０
ｍＨＴｒｉｓ　−Ｈ（ｌｆｆｌ　（ＤＨ７，４）−１０
ｍＭＨｇＳＯ４−１１１１１８ｇＳＯ４−１ｍＨジチオ
スレイトール水溶液を、そしてＳｍａ　Ｉ切断では１０
ｍＨＴｒｉｓ−ｔ−ＩＣｆｆｌ　（１）１１８．０）−
２０ｍＨＫＣＪ２−７ｍｌ　　Ｈ（ＪＣ！１．ｚ　−７
ｆｆｌＨ２−メルカプトエタノール水溶液を、それぞれ
用いた。］２０μｌに溶解さけ、制限酵素（ＢｓｔＮ工
。

ｃ＋ａ　ｌ、Ｎａｅ■はニュー・イングランド・バイオ
ラブズ製、　ＳＳｔ　Ｉ［はベセスダ・リサーチ・ラボ
ラトリーズ製、　Ｒｓａ　Ｉ、５ａｕ３Ａ１．ＴＱＱＩ
はニラポン・ジーン製、それ以外は宝酒造製を用いた。

）２〜４ユニツトを添加して、３７℃、１時間以上切断
を行なった。制限酵素８ｓｔＮ　■およびＴａＱ　Ｉに
よる切断は、６０″Ｃで１時間状切断を行なった。なお
、二種類の制限酵素による切断を行なう場合には、まず
低塩濃度で作用する制限酵素で処理し、次に所定′ａ度
まで塩ｇｔ度を上げてから、より高塩濃度で作用する制
限酵素で処理した。

制限酵素による切断層、４μｌの０．２５％ブロモフェ
ノールブルー・５０％グリセロール水溶液を加え、アガ
ロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８〜２．５％）を行
なった。アガロースはシグマ社のタイプ■電気泳動用を
使用した。電気泳動バッファーとして、４０ｍ）ｆ　Ｔ
ｒｉｓ　−Ｃｌ−１：＋Ｃ０ＯＨ（ｐＦＩａ、ｏ）　−
’ｌｎ＋ＨＥＤＴＡ水溶液を用いた。厚さ２ｍｌＴｌの
垂直ゲルにて、６〜９　Ｖ／ｃｍの電圧で、１．５〜３
時間電気泳動を行なった。この電気泳動の際、ＤＮＡ断
片の分子量マーカーとして、λファージのＤＮＡを制限
酵素１１ｉｎｄｌｌで切断したもの（ベーリンガー・マ
ンハイム）を用いた。電気泳動終了後、アガロースゲル
中のＤＮＡを２μｇ／ｒｒＩｉエチジウムブロマイド水
溶液で染色し、このゲルに対して長波長紫外線を照射し
て、切断パターンの観察を行なった。各種制限酵素単独
による切断、および二種の制限酵素の組合せによる切断
、これらの切断パターンを解析することにより、第２図
（Ａ）に示すような各制限酵素切断点の相対位置、関係
を決定した。第２図（Ａ）は免疫グロブリンＧ遺伝子を
含むヒト染色体ＤＮＡの制限酵素切断点地図を示す。

実施例５（ヒト免疫グロブリンＧ遺伝子断片のサブクロ
ーニング）ヒト免疫グロブリンＧ遺伝子を含むシャロン４Ａ　　Ｄ
ＮＡ３μｇを実施例４の方法に準じて制限醪累旧ｎｃｌ
Ｉ［Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０
．８％）を行なった。ヒトＩｇＧ　Ｆｃ領域遺伝子を含
む約８．２にｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを切
出し、そのアガロースゲル断片を３倍ＦＡ　（ｖｏｌ／
ｖｔ）のａＭ　　ＮａＣｌｌ０ｚ水溶液に溶解さぜた。

チェノらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ、　Ｃｈｅｎら
。

Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０１．３３９（１９
８０）］により、約８．２１（ｂｐのＤＮＡ断片をアガ
ロースゲルにより回収した。一方、大腸菌用プラスミド
ｐＢＲ３２２１μｇを実施例４に準じて制限酵素ＩＩ　
ｉ　ｎｄ　ｍで切断したものに対して、アルカリ性ホス
ファターゼ（Ｅ、ｃｏｌ　１ｃ７５）（宝酒造）を０．
５ユニット加えて、５℃で１時間反応させた。反応終了
後、反応液中のアルカリ性ホスファターゼを失活・除去
するために、フェノール抽出を３回繰返した。このよう
にして得られた１）ＢＲ３２２の旧ｎｄｌｌｌ−アルカ
リ性ホスファターゼ処理液を、ゲルより回収した約８．
２にｂｐ　１ｌｉｎｄ　Ｉ［Ｉ断片水溶液と混ぜ、エタ
ノール沈澱の後、連結反応用バッファー（実施例２を参
照）５０μｍに溶解させる。２ユニツトのＴ４−ＤＮＡ
リガーゼを加え、１１℃、１２時間反応させて、連結を
行なった。

大腸菌Ｃ６Ｃ６００ｒ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）の形
質転換は、通常のＣａＣｆｆ１ｚ法（Ｈ，Ｖ、　Ｎｏｒ
ｇａｒｄらの方法）の改良法で行なった。すなわち、５
ＩｎｉのＬ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス
、０．５％ＮａＣＱ、　１）Ｈ７，２）に大腸菌Ｃ６０
０ｒ−ト株の１８時間培養基を接種し、菌体を含む培養
液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ６００）０．３まで
成育させる。菌体を詰めたいマグネシウム・バッフｙ　
−［０，ＩＨＮａＣｕ−５ｍｌ　　）ｆ（ＩＣＱｚ　−
５ｍｌ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ（１２（１）ｔ１７．６　、０
℃）］中で２回洗い、２ｄの冷やしたカルシウム・バッ
ファー［１００ｍＭＣａＣｆ２ｚ　−２５０ｍＨＫＧ　
　５ｍｌ　　ＨｇＣ２ｚ　　　５ｍ）ｌＴｒｉｓ−１−
１０２（ｐＨ７，６、０℃）１中に再ａ濁させ、０℃で
２５分間放置する。次に菌体をこの容量の１／１゜にカ
ルシウム・バッファーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水
溶液と２　：　１　（ｖｏｌ、：ｖｏｌ、）混合スル。

この混合物を６０分間、０℃で保った接、１ｍｌのＬＢ
Ｇ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス。

１％ＮａＣｌ２．０．０８％グルコース、　ｐＨ７，２
）を添加し、３７℃で１時間振とう培養する。培養液を
、選択培地（アンピシリン３０μ（１／ｍｌを含むし培
地プレート）に１００μｉ／プレートの割合で接種する
。プレートを３７℃で１晩培養して、形質転換株を成育
させる。（ｑられたアンピシリン耐性のコロニーより、
公知の方法を用いてＤＮＡを調製し、アガロースゲル電
気泳動により、目的のり−ブクローン吋ＪＩＢ　　（約
１２．６にｂｐ）を確認した。

前記実施例４の方法（より作製した、このザブクローン
の制限酵素切断点地図を第２図（Ｂ）に示した。この第
２図（Ｂ）においてＰｓｔ　Ｉ−（３）から旧ｎｄｌ−
（３）のあぢあに、Ｐｓｔ　Ｉす°イトが３〜４個存在
することは確認したが、その位置についての確認は行な
っていない。

ざらに、前記プラスミドＤＴＪ　Ｉ　ＢのＰｓｔ　Ｉ−
（２）ＨＰｓｔ　Ｉ−（３）のＤＮＡ断片（約１．１に
ｂｐ）を、ｐＴＪＩＢの場合とほぼ同様の手法により、
プラスミドｐＢＲ３２２のＰＳｔＩ＃ｊイトに挿入し、
プラスミドｐＴＪ５　（約６．１にｂｐ）を作製した。

目的のクローンは、テトラサイタリン耐性の形質転換株
の中から選択した。得られたサブクローンの制限酵素切
断点地図を、第２図（Ｃ）に示した。

実施例６　（ＤＮＡ塩基配列の決定）ヒト免疫グロブリンＧＦＣ＠域遺伝子の塩基配列は、マ
キサム・ギルバート法により決定した。

たとえば、前記実施例５において作製されたサブクロー
ンｐＴＪ５　　Ｄ　Ｎ　Ａ約５０μＱを実施例４の方法
に準じてＳｍａ　Ｉで切断する。得られたＤＮＡ断片を
アルカリ性ホスファターゼで脱ホスホリル化し、ポリヌ
クレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ）５ユニ
ツトを用いて［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで標識した。ポリヌ
クレオチドキナーゼ反応は５０ｍＨＴｒｉｓ−１−１（
ｕ（１）Ｈ９，５）−１０ｍＨＨＱＣ！！ｚ　−５ｍ）
ｌジチオスレイＩ・−ル水溶液中で行ない［γ−３２Ｐ
］ＡＴＰはアマージャム製を１００μＣｉ分用いた。

３２ｐ標識ＤＮＡ断片をＰｓｔ　工で切断した後、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）により目
的のＤＮＡ断片を分離し、ゲルからの抽出を行なった。

得られた３２Ｐ標識−Ｓｍａ　Ｉ／Ｐｓｔ　Ｉ断片につ
いて、各塩基特異的な部分分解反応を行ない、７Ｍ尿素
を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度８％
〜２３％）で分離した。２〜７日間、−８０℃でオート
ラジオグラフィーを行なった後、分解パターンの解析を
行ない、Ｆｃ領域遺伝子の塩基配列決定のための資料と
した。

一方、Ｉ）ＴＪ５をＰＳｔ　工で切断した場合には、３
°末端標識キツト（アマ−ジャム）を用いて、［α−３
２Ｐ］ｄｄ＾ＴＰによる標識を行なった。この３２Ｐ−
標識ＤＮＡ断片をＳｍａ　Ｉで切断した後、目的のＤＮ
Ａ断片のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５
％）による分離・回収を行なった。得られた３２Ｐ−標
識−Ｐｓｔ　Ｉ／Ｓｍａ　Ｉ断片に就イテも、上記手順
に従って解析を行ない、ＦＣ領域遺伝子の塩基配列決定
のための資料とした。

実施例７［発現型プラスミドの作１！（Ｃｔ１３部位遺
伝子のクローニング）］実施例５で１ｑられたプラスミド９丁Ｊ５を、実施例４
の方法に準じて制限酵素Ｐｓｔ　Ｉで切断した後、アガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を行ない、Ｆ
Ｃ領域遺伝子を含む約１．７にｂｐのＤＮＡ断片を実施
例５の方法でゲルより回収した。得られたＤＮＡ断片を
、実施例４の方法で制限酵素Ｎａｅ　Ｉで切断し、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ゲル＆ｉ度５％）を行な
った。Ｃ１１３部位遺伝子を含む約０．６にｂｏのＤＮ
Ａの部分に相当するバンドを切断し、そのポリアクリル
アミドゲル断片を細かく破砕した後、２〜５ｒＩＩｉの
溶出用バッファー［５００ｍ）ＩＮ１１４０Ａｃ−１ｍ
ＨＥＤＴＡ−０，１％Ｓ　Ｄ　Ｓ　（１）ｔ１７．５）
１を加え、３７℃で一晩振とうした。遠心分離により、
目的のＤＮＡを含む水相の回収を行なった。

さらに１ワられたＤＮＡ断片を、実施例４の方法で制限
酵素Ｒｓａ　■で切断し、ポリアクリルアミド電気泳動
（ゲルｆ１度５％）の後、Ｄ１１３部位を含む約３１０
ｂｐのＤＮＡ断片を、上記と同様な方法により、ポリア
クリルアミドゲルから回収した。

こうして１８られだ０１１３部位遺伝子を含む約３１０
ｂｐのＲ３ａ　ｌ８Ｎａｅ　ＩのＤＮＡ断片を、実施例
５の方法にほぼ準じてプラスミドｐＢＲ３２２のＢａｌ
　Ｉす゛イ１〜に挿入し、ＣＨ３部位遺伝子の読みとり
方向がプラスミドｐＢＲ３２２中のテトラサイクリン耐
性遺伝子の読みより方向と一致する方法（第３図におい
て時計まわりの方向）に挿入されたプラスミドｐＦＣ７
０（約４．７Ｋｂｐ）を作製した。１）ＦＣ７０作製の
方法を第３図に示した。

実施例８［発現型プラスミドの作製（ＣＨ２部位遺伝子
とＣ８３部位遺伝子の連結）Ｊ実施例７で１ｑられた、Ｆｃ領域遺伝子を含む約１、７
ＫｂｐのＤＮＡ断片を、実施例４の方法に準じて制限酵
素５ａｕ３Ａ　ＩおよびＴａｑ　ｌで切断し、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、Ｃ１１
２部位遺伝子を含む約２４０ｂｐのＤＮＡ断片約０．５
μｇを、実施例７の方法に準じて、ポリアクリルアミド
ゲルから回収した。

Ｃ１１２部位と０１１３部位の連結部分に相当する、第
４図記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌクレオチド
を、上の鎖と下の鎖とに分けて化学合成した。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成ｌａ（アプライド
・バイオシステムズ、モデル３８０＾）を用いて、ホス
フｔアミダイド法により行なった。合成オリゴヌクレオ
チドの精製は、アプライド・バイオシステムズ社のマニ
ュアルに準じて行なった。すなわち、合成オリゴヌクレ
オチドを含むアンモニア水溶液を５５℃で一晩保つこと
により、ＤＮＡ塩基の保護基をはずし、セフ１デックス
Ｇ−５０フアイン・ゲル（ファルマシア）を用いたゲル
）濾過によって、高分子量の合成オリゴヌクレオチド画
分を分取する。ついで、７Ｍ尿素を含むポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ゲル濃度２０％）の後、紫外線シャ
ドウィング法により泳動パターンの観察を行ない、目的
とする大きさのバンド部分を切出して、実施例７の方法
に準じて合成オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミド
ゲルより回収した。最後に合成オリゴヌクレオチドを含
む溶液をゲル）濾過カラム（セファデックスＧ−５０）
にかけることにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品
を得た。なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の
向上をはかった。このようにして得られた合成オリゴヌ
クレオチド精製物０．１〜１．０μｇを、実施例６の方
法に準じて、１ｍＨＡＴＰ存在下でポリヌクレオチドキ
ナーゼ反応を行ない、５゛末端側をリン酸化する。５°
末端をリン酸化した、上の鎖と下の鎖に相当する２本の
合成オリゴヌクレオチドを混合し、その水溶液温度を７
０’Ｃから室温まで徐々に冷却することにより、アニー
リングを行なった。以上のようにして、Ｃ１１２部位と
Ｃ１１３部位との連結部分に相当するＴａｑ■＋Ｓｍａ
工のＤＮＡ断片（約６８ｂｔ））を取得シタ。

一方、前記実施例７で作製したプラスミドｐＦｃ７０　
　Ｄ　Ｎ　Ａ約５μｑを、実施例４記載の制限酵素Ｓｍ
ａ　Ｉ切断用バッファーに溶解し、２〜５ユニツ１〜の
Ｓｍａ　Ｉを加えて２０℃で１５〜４５分反応させて部
分分解を行なう。フェノール抽出によりｓｍａ王を失活
させた後、実施例４の方法に準じて、制限酵素Ｂａｍｔ
ｌ　Ｉによる切断を行なう。アガロースゲル電気泳動（
ゲル濃度０．８％）の後、Ｃ１１３部位遺伝子とベクタ
ーの大部分を含む第４図記載のＢａｍｆｌ：［＋Ｓｍａ
　ニー（１）のＤＮＡ断片（約３．６Ｋｂｌ））を、実
施例５の方法に準じてアガロースゲルより回収した。

以上のようにして得られた、ＣＨ２部位遺伝子を含む５
ａｕ３Ａ　Ｉ−＋Ｔａｑ　工のＤＮＡ断片、Ｃ１１２部
位とＣＨ３部位の連結部分に相当するＴａｑ　ｌ→Ｓｍ
ａ　工のＤＮＡ断片、そしてＣＨ３部位とベクタ一部分
を含むＢａｍＨＩ　（Ｓａｕ３Ａ　Ｉ）　＋Ｓｍａ　Ｉ
−（１）のＤＮＡ断片を混合し、実施例５の方法にほぼ
準じて、Ｃ１１２部位遺伝子とＣ１１３部位遺伝子がイ
ントロンを介さずに連結された遺伝子を含むプラスミド
１）Ｆｅ１２（約３．９にｂｐ）を作製した。第４図に
ｐＦＣ７７の作製方法を示した。

実施例９［発現型プラスミドの作製（Ｆｃ領域遺伝子と
プロモーターとの連結）１実施例８で得られたプラスミドｐＦＣ７７を、実施例４
の方法に準じて制限酵素Ｓｓｔ　ＩＩおよびＰｓｔ　工
で切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％
）の後、ＣＨ２部位遺伝子の後半部分、ＣＨ３部位遺伝
子全域及びベクターの一部を含む、第５図記載のＳｓｔ
　ＩＩ＜−＋Ｐｓｔ　ＩのＤＮＡ断片（約２．７にｂｐ
）を、実施例５の方法に準じてアガロースゲルより回収
した。

次に、実施例７で得られたＥＣ領域遺伝子を含む約１．
７にｂｐのＤＮＡ断片を、実施例４の方法に準じて制限
酵素ＢｓｔＮ　Ｉ及びＳｓｔ　ＩＩで切断し、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、ＣＨ２
部位遺伝子の前半部分を含む約１７１ｂｐのＢｓｔＮ　
Ｉ　−（５）→Ｓｓｔ　ＩＩのＤＮＡ断片を、実施例７
の方法に準じて、・ポリアクリルアミドゲルから回収し
た。

さらに、プロモーターとＥＣ領域遺伝子との連結部分に
相当する、第５図記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴ
ヌクレオチド（約３９ｂｐ）を、実施例８の方法に準じ
て作製した。このＣ１ａ　ＩＨＢｓｔＮＩ−（５）のＤ
ＮＡ断片中には、ｔｒｐプロモーターとの連結のための
制限酵素Ｃ１ａ　Ｉサイト、ＡＴＧという塩基配列で表
わされる翻訳開始コドン、【）部位遺伝子及びＣＨ２部
位遺伝子の一部が連続して含まれており、このＤＮＡ断
片を用いることにより、イントロンのないＥＣ領域（ｈ
−ＣＨ２−ＣＨ３部位）遺伝子をトリプトファン・オペ
ロン・ＳＤ配列下流に適当な距離をへだでて連結するこ
とが可能になった。

一方、ｔｒｐプロモーターを含むプラスミドｐＹｓ３１
Ｎ　（約４．７にｂｐ）を、実施例４の方法に準じて制
限酵素Ｐｓｔ　工及びＣｌａ　Ｉで切断し、アガロース
ゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、ｔｒｐプロモ
ーター及びベクターの一部を含む、第５図記載のＰｓｔ
　ｌ４−）Ｃ１ａ　ＩのＤＮＡ断片（約１．１にｂｐ）
を、実施例５の方法によりアガロースゲルより回収した
。

以上のようにして得られた、ｃ］１２部位後半と０１１
３部位遺伝子とベクターの一部を含む３５ｉ　Ｉ［＜−
＋Ｐｓｔ　ＩのＤＮＡ断片、０１１２部位遺伝子前半部
分を含むＢｓｔＮＩ−（５）　＜−＋Ｓｓｔ　ＩＩのＤ
ＮＡ断片、プロモ−ターとＥＣ領域遺伝子との連結部分
に相当するＣ１ａ　ＩＨＢｓｔＮＩ−（５）のＤＮＡ断
片、そしてｔｒｐプロモーターとベクターの一部を含む
ＰＳｔ工４→Ｃｌａ　工のＤＮＡ断片を混合し、実施例
５の方法（はぼ準じて、［Ｃ領域（ｈ　−（ｊ１２−　
ＣＨ３部位）遺伝子発現型プラスミドｐＦｃ２０３　（
約４．０Ｋｂｐ）を作製した。第５図にｐＦｃ２０３の
作製方法を示した。

また、プロモーターと０１１２部位遺伝子との連結部位
に相当する、第６図記載の塩基配列を有する２重鎖オリ
ボヌクレオチドを用いることにより、上記とほぼ同じ方
法で、ＥＣ領域（ＣＪＩ２−ＣＨ３部位）遺伝子発現型
プラスミドｐＦｃ２０４　（約３．９Ｋｂｐ）を作製し
た。第６図にｐＦｃ２０４の作製方法を示した。

実施例１０［発現型；プラスミドの改造（ＳＤ配列の翻
訳開始コドンとの距離の改変）］前記実施例９で得られ
たＦｃｌ域遺伝子発現型プラスミドｐＦｃ２０３　　Ｄ
　Ｎ　Ａ約３μｇを、実施例４の方法に準じて制限酵素
Ｄｌａ　Ｉで切断した後、ポリメラーゼ用バッフ？　　
［５０１１１８ＴｒｉＳ　　ＨＣｊ２（１）Ｈ７，２）
−１０ｍ）ｌ　　Ｈ（ｌｓＯ４−０，１１１１ＨＤＴＴ
−５０γ／１１ｆＢｓＡ］４０μｌに溶解し、０．２５
ｍＭのｄＣＴＰ及び００２５１ＩＩＨのｄＧＴＰ存在下
で、２ユニツトのＤＮＡポリメラーゼエ・ラージφフラ
グメント（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）を加
えた。３７℃で３０分間反応させて、末端の平滑化をは
かる。フェノール抽出によりＤＮＡポリメラーゼエ・ラ
ージ・フラグメントを失活させた後、実施例２に記載の
方法に準じて自己連結反応を行ない、実施例５の方法に
準じてｒｃＨ域遺伝子発現型プラスミドｐＦｃ２０３Ｐ
を作製した。このｐＦｃ２０３Ｐにおいては、ＳＤ配列
と翻訳開始コドンとの距離が、ｐＦｃ２０３よりも２ｂ
ｌ）長くなっている。第７図にｐＦｃ２０３Ｐの作製方
法と、翻訳開始コドン上流域のＤＮＡ塩基配列を示した
。

次に、実施例９で作製したＦｃ領域遺伝子発現型プラス
ミドｐＦｃ２０３　　ＤＮＡ約３μＱを、実施例４の方
法に準じて制限酵素Ｃｌａ　■で切断した後、Ｓ＝１ヌ
クレアーゼ用バッフｙｙ　−［３０ｍＭ　　Ｎａ０Ａｃ
　−５０ｍＭ　　Ｎａα−１１１）ｆ　　ＺｎＳＯ４−
５％グリセロール（９１４，６）１４０μｌに溶解し、
Ｓ−１ヌクレアーゼ（ベセスタ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ）２５ユ二ットを加え、３７℃、　３０分間の反応
により末端の平滑化を８１つだ。フェノール抽出により
Ｓ−１ヌクレアーゼを失活させた後、上記と同様な方法
により、Ｆｃ領域遺伝子発現型プラスミドｐＦｃ２０３
ｓを作製した。このｐＦｃ２０３ｓにおいては、ＳＤ配
列と翻訳開始コドンとの距離が、ｐＦｃ２０３よりも２
ｂｌ）短くなっている。第７図にｐＦｃ２０３ｓの作製
方法と、翻訳開始コドン上流域のＤＮＡ塩基配列を示し
た。

実施例］１［発現型プラスミドの改造（翻訳終止コドン
のタンデム化月実施例９で得られたＦＣ領域道伝子発現型プラスミドｐ
Ｆｃ２０３を、実施例８に記載の方法にほぼ準じて、制
限酵素Ｓｍａ　■で部分分解した後、制限酵素ＰＳｔ　
工による完全分解を行なう。アガロースゲル電気泳動く
ゲル濃度０．８％〉の後、ＥＣ領域遺伝子の大部分とベ
クターの一部を含む第８図記載のＳｍａ　Ｉ−（２）　
＋Ｐｓｔ　ＩのＤＮＡ断片（約１．８Ｋｂｐ）を、実施
例５の方法に準じてアガロースゲルより回収した。

また、Ｃｔ１３部位遺伝子後部と翻訳終止コドンに相当
する、第８図記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌク
レオチド（約１７ｂｐ）を、実施例８の方法に準じて作
製した。このＳｍａ　Ｉ　−（２）　４−＋８ａｍＨ１
のＤＮＡ断片中には、０１１３部位遺伝子の一部、ＴＡ
Ａ丁ＡＧという塩基配列で表わされるタンデム化翻訳終
止コドン及びベクターとの連結のための制限酵素Ｂａｍ
ｔｌ　Ｉサイトが含まれており、このＤＮＡ断片を用い
ることによりＥＣ領域遺伝子の翻訳終止コドンのタンデ
ム化が可能になった。

一方、プラスミドｐＢＲ３２２を、実施例４の方法に準
じて制限酵素ｐｓｔ　１及びＢａｍＨ：［で切断、アガ
ロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、ベクタ
ーの大部分を含む、第８図記載のＢａｍＨ■←ｐｓｔ工
のＤＮＡ断片（約３．２Ｋｂｐ）を、実施例５の方法に
よりアガロースゲルより回収した。

以上のようにして１ｑられた、Ｆｃ領域遺伝子の大部分
とベクターの一部を含むＳｍａ　Ｉ　−（２）　ＨＰｓ
ｔ■のＤＮＡ断片、ＣＨ３部位遺伝子後部とタンデム化
翻訳終止コドンを含むＳｍａ　Ｉ−（２）　＜−＋Ｂａ
ｍＨＩのＤＮＡ断片、そしてベクターの大部分を含むＢ
ａｍｔｌ工←ｐｓｔ　１のＤＮＡ断片を混合し、実施例
５の方法にほぼ準じて、タンデム化翻訳終止コドンを有
するＦｃ領域遺伝子発現型プラスミドｐＦｃ２１１　（
約５．０Ｋｂｐ）を作製した。第８図にｐＦｃ２１１の
作製方法を示した。

実施例１２［発現型プラスミドの改１（ｔａＣプロモー
ターとの連結）］実施例９で得られたＦＣＣ領域遺伝子発現型プラスミド
ルＦｃ２０を、実施例４の方法に準じて制限酵素Ｃｌａ
　Ｉで切断し、ついで実施例１０の方法に準じて、ｄＣ
ＴＰ及びｄＧＴＰ存在下、ＤＮＡポリメラーゼ■・ラー
ジ・フラグメント処理により、末端の平滑化を行なう。

次にこのＤＮＡ断片を、実施例４の方法に準じて制限酵
素ＰＳｔ　Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル
濃度０．８％）の後、ＥＣ領域遺伝子全域とベクターの
大部分を含む、第９図記載の約２．８にｂｐのＤＮＡ断
片を、アガロースゲルより回収した。

次に、ｔａｃプロモーターを含むプラスミドｐＤＲ５４
０（約４．０Ｋｂｐ、ファルマシア＞ＤＮＡを、実施例
４の方法に準じて制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、ついで
実施例１０の方法に準じて、ｄＧＴＰ、　ｄＡＴＰ。

ｄＴＴＰ、　ｄＣＴＰ存在下、ＤＮＡポリメラーゼ■・
ラージ・フラグメント処理により、末端の平滑化を行な
う。次にこのＤＮＡ断片を、実施例４の方法に準じて制
限酵素ｐｓｔ　１で切断し、アガロースゲル電気泳動（
ゲル濃度０．８％）の後、ｔａｃプロモーターとベクタ
ーの一部を含む、第９図記載の約１．１にｂｐのＤＮＡ
断片を、アガロースゲルより回収した。

以上のようにして（ｑられた、Ｆｃ領域遺伝子全域とベ
クターの大部分を含む約２，８にｂｐのＤＮＡ断片と、
ｔａｃプロモーターとベクターの一部を含む約１．１に
ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、実施例５の方法にほぼ準
じて、ｔａｃプロモーターの下流にＦｃ領域遺伝子が連
結した形の発現型プラスミドｐＦｃ３６１（約３．９に
ｂｌ））を作製した。第９図に１）ＦＣ３６１の作製方
法を示した。

上記により得られたＦｃ領域遺伝子発現型プラスミドｐ
Ｆｃ３６１　　Ｄ　Ｎ　Ａを、実施例４の方法に準じて
制限酵素ｓｓｔ　ｎ及びＰＳｔ　Ｉで切断し、アガロー
スゲル電気泳動（ゲルＩａ度０．８％）の後、ベクター
の一部、ｔａｃプロモーター及びＦＣ領域遺伝子前半部
分を含む、第９図記載のＳｓｔ　ｆｆ＜−＋Ｐｓｔ　Ｉ
のＤＮＡ断片（約１．３Ｋｂｌ））を、実施例５の方法
によりアガロースゲルより回収した。

また、実施例１１により１ワられたタンデム化翻訳終止
コドンを有するＦｃ領域遺伝子発現型プラスミドｐＦｃ
２１１　　Ｄ　Ｎ　Ａを、実施例４の方法に準じて制限
酵素ＳＳｔ　Ｉ及びＰＳｔ　Ｉで切断した後、上記と同
じ手法により、Ｆｃ領域遺伝子後半部分、タンデム化翻
訳終止コドン及びベクターの大部分を含む、第９図記載
のＰｓｔ　ＩＨ３ｓｔ　ＩＩのＤＮＡ断片（約３．６に
ｂｐ）を１ｑだ。

かくして得られた、ベクターの一部、ｔａｃプロモータ
ー及びＦＣ領域遺伝子前半部分を含むｓｓｔ　ｎ→Ｐｓ
ｔ　ＩのＤＮＡ断片と、Ｆｃ領域遺伝子後半部分、タン
デム化翻訳終止コドン及びベクターの大部分を含むＰＳ
ｔ　Ｉ←Ｓｓｔ　ＩＩのＤＮＡ断片とを混合し、実施例
５の方法にほぼ準じて、ｔａｃプロモーターの下流にＦ
Ｃ領域遺伝子が連結され、なおかつタンデム化翻訳終止
コドンを有する形の発現型プラスミドｐＦＣａ６２　（
約４，９にｂｐ）を作製した。第９図にｐＦｃ３６２の
作製方法を示した。

上記実施例により得られたＦＣ領域還伝子発現型プラス
ミドｐＦＣａ６２のＤＮＡ塩基配列の一部を、第１図に
示した。８６番目から７５４番目のＤＮＡ塩基配列で示
されるポリヌクレオチドは、アミノ酸配列２番目から２
２４番目で表わされるポリペプチド、すなわちヒトＩＯ
Ｇ　ＦＣ領域蛋白質をコードしていた。

実施例１３（Ｆｃ領域遺伝子の発現確認）前記実施例９
．１０．１１及び１２で得られたＦｃ領域遺伝子発現型
プラスミドを有する大腸菌Ｃ６Ｃ６００ｒ−株を、３０
〜５０／ｌ　／ｌｄのアンプシリン０．２％のグリコー
ス及び２ｍ（Ｊ／Ｉｒｄｌのカザミノ酸を含むＭ９培地
［０，６％Ｎａ２　ＨＰＯ４−０，３％Ｋｌ（ｚＰｏ４
−０．０５％ＮａＣＱ−０，１％ＮＨ４ＣＲ水溶液（ｐ
Ｈ７，４）をオートクレーブ滅菌した後に、別途にオー
１〜クレープ滅菌したＨｇＳＯ４水溶液及びＣａα２水
溶液をそれぞれＲ終濃度２１１１）ｆ及び０．１１１１
）１になるように加える。］または３０〜５０μａ／ｒ
ｄのアンピシリンを会むＬ培地に接種し、ＯＤ　６００
が０．１に達するまで、３７℃で撮どう培養を行なう。

次いで、ｔｒｐプロモーター使用の場合には最終濃度５
０μ（］　／Ｉｎ１の３−β−インドールアクリル酸（
シグマ）を、ｔａｃプロモーター使用の場合には最終濃
度５ｍ）ｆのイソプロピル−β、Ｄ−チオガラクトシド
（シグマ）を、それぞれ培養液中に添加し、ざらにＯＤ
　６００が０．５に到達するまで、３７℃で振とう培養
を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
　−（１５０ｍＨＮａ０２を含む２０ｍＨ＋ノン酸バッ
フ？−，Ｉ）８７．４）を用いて菌体の洗浄を行なった
。洗浄後の菌体をＰＢＳバッファーに懸濁させ、超音波
発生装置（久保田、２００　Ｍ型）を用いて菌体を破壊
した後、遠心分離により菌体残渣の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートに対して、丁ｒｉＳ−Ｈαバ
ッファー　（ｐＨ６，８）、ＳＤＳ、２−メルカプトエ
タノール、グリセロールを、それぞれ最終濃度ｅｏｍＨ
，２％、４％、１０％になるように加え、５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動［、鈴木９Ｍ伝、３１．４
３（１９７乙）月を行なった。分離用ゲルは１２．５％
とし、泳動バッファーは５ＤＳ−Ｔｒｉｓ−グリシン系
［（Ｊ、に、Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２２
７．６８０（１９７０）］を用いた。電気泳動終了後、
ゲル中の蛋白質を、２５ｍＨＴｒｉｓ−１９２ｍＨグル
シン（ｐＨ８，３）−２０％メタノールのバッファー中
で、電気泳動的にニトロセルロース・フィルターに吸着
させ、ウェスタン・プロッティングを行なった。

蛋白質を吸着させたニトロセルロース・フィルターを５
％ウシ血清アルブミンを含むＰ８Ｓバッファー中に６０
分間浸した俊、−次抗体としてウリ・ギ抗ヒトＩｇＧ−
Ｆｃ成分抗血清（カッベル）を用いた間接法で、ペルオ
キシダーゼ標識抗体を用いたイミュン・プロット・アッ
セイ・キット（バイオ・ラット）により、ヒト免疫グロ
ブリンＧＦｃ領域蛋白質を特異的に染色した。結果の一
部を複写して第１０図に示した。この際に、後記参考側
記載の方法により調製した既知」の天然力ヒト免疫グロ
ブリンＧＦＣ領域蛋白質も同一の５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲルで電気泳動等を行ない、既知量のＦＣ領域蛋
白質のバンドの濃さとの比較により、大腸菌におけるＦ
ｃ領域蛋白質産生遇を決定した。

各種Ｆｃ領域遺伝子発現型プラスミドを有する大腸菌Ｃ
６Ｃ６００ｒ−株のＦｃ領域蛋白質の産生量を、第１表
に示した。

第１表＊二Ｍ９培地＊＊：Ｌ培地第１表記載のＦｃ領域遺伝子発現型プラスミドｐＦＣ３
６２を有する大腸菌Ｃ６Ｃ６００ｒ−下部について、そ
の培地・培養条件等の検討を行なったところ、Ｆｃ領域
蛋白質の産生量は１１培養あたり１５ｍａにまで向上し
た。この産生量は大腸菌仝菌体蛋白の１０％にも及び、
大腸菌細胞１個あたり約３０万分子のヒト免疫グロブリ
ンＧＦＣ領域蛋白質が生産されていることになる。

また、天然型Ｆｃ領域蛋白質にくらべ大腸菌産生Ｆｃ領
域蛋白質の分子量が約５０００ダルトン小さいという第
１０図の結果から考えて、大腸菌産生ＦＣ領域蛋白質に
は糖鎖の付加がおこっていないものと思われる。

実施例１４（大腸菌産生ＦＣ領域蛋白質の精製）３ｍの
活性型アフィニティー支持体アフイ・ゲル１０（バイオ
・ラット）と６．２ｍｇのアフィニティー精製ヒツジ抗
ヒｌ−ＩｇＧ−Ｆｃ成分抗体（カッペル）とを、０．１
ＨＭＯＰＳハッ７；＝　　（１）１１７．５　、　牛丼
化学薬品）中でカップリングさせて、大腸菌産生Ｆｃ領
域蛋白質精製用アフィニティー・カラムを作製した。４
℃で２時間カップリングを行なったところ、用いたヒツ
ジ抗ヒトＩｇＧ　−Ｆｃ成分抗体の約４０％が支持体上
に固定化された。

前記実施例１３で調製した大腸菌ライゼートを上記のア
フィニティー・カラムに通し、ＦＣ＠域蛋白質のみを特
異的にカラムに吸着させた。カラムをＰＢＳバッファー
及び５００ｍ）ｆ　　ＮａＣ２を含む２０ＩＩＩＭリン
酸バッフｙ−（ｐＨ７、４）で充分洗郡した後、０．１
Ｍグリシン−Ｈαバッフ−ｙ　−（ｐＨ１２，３）を用
いて、Ｆｃ領域蛋白質を溶出させた。溶出したＦＣ領域
蛋白質を水に対して透析し、凍結乾燥した後に、実施例
１３の方法に準じて５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳
動（ゲル濃度１２．５％）を行なった。電気泳動終了後
、ゲル中の蛋白質のバンドを銀染色試薬（第一化学薬品
）を用いて染色したところ、高純度の大腸菌産生ＦＣ領
域蛋白質が得られたことが確認できた。

実施例１５［発現型プラスミドの改造（タミネーターの
付与とコピー数制御領域の除去用ｔｒｐプロモーターを
含むプラスミドｐＹ３３１Ｎ　５μＱを、実施例４の方
法に準じて制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩで部分分解した後、ざ
らに制限酵素ｔｌｉｎｄｌＩＩで切断し、アガロースゲ
ル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例５の方法
に準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２，７　Ｋｂｐ
のＤＮＡ断片［Ｐｖｕ　ＩＩ　（２）　＋＋１１ｉｎｄ
ｌｌｌｌをアガロースゲルより回収した。

次に第１１図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例８の方法に準じて、合成・精製した。得ら
れた２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μｇ
について、実施例８の方法に準じて、末端のリン酸化を
行ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片［Ｐｖｕ　ＩＩ　（２）　ＨＨｉｎｄＩ
［Ｉ］と混合し、エタノール沈澱の後、実施例２の方法
に準じて、Ｔ４−　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼによる連結反応
を行なった。反応終了後、実施例５の方法に準じて大腸
菌Ｃ６Ｃ６００ｒ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｐ＾へ４１（約２．７Ｋｂρ）を有する
クローンを選択した。このようなプラスミドは、プラス
ミドｐＹｓ３１Ｎからコピー数制御領域を除去し、ｔｒ
ｐプロモーター下流に存在するクローニング・サイトの
下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａターミネータ−を付与した形の
、多コピー・高効率発現ベクターであり、第１１図にそ
の作製方法を示した。

上記で１ｑられたプラスミドｐＡＡ４１を、実施例４の
方法に準じて制限酵素１１ｉｎｄＩ［Ｉで切断した後、
実施例１０の方法に準じてｄ＾ＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄ
ＧＴＰ及びｄＴＴＰ存在下でＤＮＡポリメラーゼエ・ラ
ージ・フラグメントを作用させ′、末端を平滑化する。

ついで、実施例４の方法に準じて制限酵素ｐｖｕ　１　
（宝酒造）で切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃
度０．８％）の後、ベクターの大部分を含む約１゜・１
にｂｐのＤＮＡ断片を、アガロースゲルより回収した。

一方、実施例１１で得られたＦＣ領ｔｊｌ！遺伝子発現
型プラスミドｐＦｃ２１１を、実施例４の方法に準じて
制限酵素Ｂａ１ｌｌｌ　Ｉで切断した後、上記と同様に
ＤＮＡポリメラーゼエ・フラグメントを用いて末端の平
滑化をはかる。ついで、実施例４の方法に準じて制限酵
素Ｐｖｕ　Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル
濃度０．８％）の後、ｔｒｐプロモーター。

Ｆｃ領域道伝子全域及びベクターの一部を含む約１．７
にｂｐのＤＮＡ断片を、アガロースゲルより回収した。

以上のようにして得られた、ベクターの大部分を含む約
１，７にｂＤのＤＮＡ断片と、ｔｒｐプロモーター、Ｆ
Ｃ領域遺伝子全域及びベクターの一部を含む約１．７に
ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、実施例５の方法にほぼ準
じて、発現型プラスミドｐＦｃ２１１Ａ　　（約３．４
にｂｐ）を作製した。第１２図にＥ）ＦＣ２１１Ａの作
製方法を示した。

また、発現型プラスミドｐＦｃ２１１のかわりに発現型
プラスミドｐＦＣ３６２を出発材料として、上記とほぼ
同様な手法を用いることによって、発現型プラスミドｐ
ＦＣ３６２Ａ　　（約３．３にｂｐ）を作製した。第１
２図にｐＦＣ３６２Ａの作製方法を示した。

以上で得られた発現型プラスミドＩ）ＦＣ２１１Ａ及び
ｐＦＣ３６２Ａを有する大腸菌Ｃ６Ｃ６００ｒ−株につ
いて、実施例１３と同様な方法により、ＦＣ領域蛋白質
産生ｍを決定したところ、発現型プラスミドｐＦｃ２１
１＾を有する大腸菌におけるＦｃ＠域蛋白質の産生量は
、発現型プラスミドＩ）ＦＣ２１１の場合の４倍程度、
また発現型プラスミド１）ＦＣ３６２Ａを有する大腸菌
におけるＦＣ領域蛋白質の産生量は、発現型プラスミド
ｐＦＣ３６２の場合の３倍程度に、それぞれ増加してお
り、発現ベクター１）ＡＡ４１の有用性が示された。

参考例（天然型ヒト免疫グロブリンＱ　Ｆｃｐ域蛋白質
の調製）０．３（Ｊのヒト免疫グロブリンＧ（シグマ）　、　１
７．５ｍｇのシスティン、　ｒ、ｓｍｇのＥＤＴＡ−２
ＮａをＰＢＳバッファー（実施例１３を参照）に溶解し
、１５０μｑのパパイン（シグマ、タイプＩＶ）を添加
して、３７℃で７時間放置する。パパイン処理後の１１
１１Ｇを、ＰＢＳバッファーで平衡化したセファデック
スＧ　−２００スーパー・ファイン・ゲル（ファルマシ
ア）を用いたゲルリン濾過カラムにかけ、パパイン処理
によって生成したＦｃ領域蛋白質及びＦａｂ領域蛋白質
を、未反応のＩＯＧと分離した。得られたＦＣ領域蛋白
質とＦａｂ領域蛋白質とを含む溶液を水（対して透析し
、凍結乾燥によって濃縮した後、ＤＥ５２・ＤＥＡＥ・
セルロース（ワットマン）を用いたイオン交換カラムに
かけた。カラムを１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７，
４）で洗浄し、Ｆａｂ領域蛋白質を完全に溶出させた後
、ＮａＣ！！１５度をＯｍＨから３５０ｍＭまで直線的
に変化させた１　０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７，４
）を用いて、ＦＣ領域蛋白質を溶出させた。

上記と同様にして透析、凍結乾燥を行ない、天然型ヒト
免疫グロブリンＧＦｃ領域蛋白質を取得した。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト免疫グロブリンＧＦｃ領域遺伝子発現型プ
ラスミドｐＦＣａ６２のＤＮＡ塩基配列の一部と、それ
に対応するＦＣ領域蛋白質のアミノ酸配列を示したもの
である。第２図は、ヒト免疫グロブリンＧ遺伝子を含む
クローンの制限酵素切断点地図と、ＦＣ領域遺伝子を含
むサブ・クローンの制限酵素切断点地図を示したもので
ある。第３図はＣ１１３部位遺伝子を含むプラスミドｐ
Ｆｃ７０の作製方法を示したものであり、第４図はＣＨ
２−Ｃｌ３部位遺伝子を含むプラスミドｐＦＣ７７の作
製方法を示したものである。第５図及び第６図はそれぞ
れＥＣＣ領域遺伝子発現型プラスミドルＦｃ２０及びｐ
Ｆｃ２０４の作製方法を示したものであり、第７図はＦ
ｃ領域発現型プラスミドｐＦｃ２０３ｓ及びｐＦｃ２０
３Ｐの作製方法を示したものである。第８図はＦＣＣ領
域発現型プラスミドルＦｃ２１の作製方法を示したもの
でおり、第９図は「Ｃ領域発現型プラスミドルＦｃ３６
１及びｐＦＣ３６２の作製方法を示したものである。第
１０図はＦｃ領域還伝子の発現確認結果を示したもので
おる。第１１図は発現ベクターｐＡＡ４１の作製方法を
示したものであり、第１２図はＦｃ領域発現型プラスミ
ドｐＦｃ２１１＾及びｐＦｃ３６２Ａの作製方法を示し
たものである。笛３図 ↓ＰツｔｘＱ】　ｕつＰｖｕｌＬ（す

Claims

【特許請求の範囲】１、第１図に示されたアミノ酸配列の２番目（Ｔｈｒ）
から２２４番目（Ｌｙｓ）までによって表わされるポリ
ペプチドを含み、ヒト由来の他の蛋白質を実質的に含ま
ないヒト免疫グロブリンＧＦｃ領域単量体蛋白質。２、該蛋白が第１図に示されたアミノ酸配列の１番目（
ＭＥＴ）から２２４番目（Ｌｙｓ）までによって表わさ
れるポリペプチドを含む第１項記載の単量体蛋白質。３、天然のグリコシル化を伴わない第１項または第２項
記載の単量体蛋白質。４、第１高、第２項または第３項記載のいずれかの単量
体蛋白質を会合させることにより得られたヒト免疫グロ
ブリンＧＦｃ領域二量体蛋白質。５、微生物細胞によって生産された第１項、第２項、第
３項または第４項記載のいずれかの蛋白質。６、第１図に示されたアミノ酸配列の２番目（Ｔｈｒ）
から２２４番目（Ｌｙｓ）までによって表わされるポリ
ペプチドをコードしたＤＮＡを含む遺伝子断片。７、第１図のＤＮＡ配列の８６番目（Ａ）から７５４番
目（Ａ）までによって表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに
相補的な一本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡを含む第６
項記載の遺伝子断片。８、第１図のＤＮＡ配列の１番目（Ｃ）から７６５番目
（Ｃ）までによって表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相
補的な一本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡを含む第６項
記載の遺伝子断片。９、第１項、第２項または第３項記載のいずれかのヒト
免疫グロブリンＧＦｃ領域蛋白質をコードしたＤＮＡを
含む遺伝子断片を組み込んだ組換えプラスミド。１０、第９項記載の組換えプラスミドによって形質転換
された組換え微生物細胞。１１、該微生物細胞が大腸菌である第１０項記載の組換
え微生物細胞。１２、第１０項記載の組換え微生物細胞を培養し、培養
物中にヒト免疫グロブリンＧＦｃ領域蛋白質を生成蓄積
せしめ、得られた培養物からヒト免疫グロブリンＧＦｃ
領域蛋白質を分離することを特徴とする、ヒト免疫グロ
ブリンＧＦｃ領域蛋白質の製造方法。