KR100446273B1 - 고 시알산 함량의 인간 트롬보포이에틴을 정제하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 트롬보포이에틴을 발현하는 진핵세포를 혈청이 실질적으로 함유되지 않은 무혈청 배지에서 배양하여 인간 트롬보포이에틴 함유 배양물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 (a) 인간 트롬보포이에틴 함유 생물학적 유액을 친화성 크로마토그래피하는 단계, (b) 단계 (a)에서 생성된 용출액을 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 단계, (c) 단계 (b)에서 생성된 용출액을 역상 크로마토그래피하는 단계 및 (d) 단계 (c)에서 생성된 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 인간 트롬보포이에틴을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단계 (c)에서 생성된 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 충진하고 0.15M 내지 0.3M 염화나트륨 농도 구배에서 선택적으로 용출된 hTPO 수집하는 단계를 포함하는 정제 방법으로 수득된 시알산 함량이 높은 인간 TPO에 관한 것이다.

Description

고 시알산 함량의 인간 트롬보포이에틴을 정제하는 방법{Process for purifying human thrombopoietin with high content of sialic acid}

본 발명은 인간 트롬보포이에틴 (human thrombopoietin, hTPO) 함유 배양물의 생산 방법 및 hTPO의 정제 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 hTPO 함유 생물학적 유액으로부터 시알산 함량이 높은 hTPO (이하, 고 시알산 함량의 hTPO)을 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.

혈소판 생성인자 즉, 트롬보포이에틴(thrombopoietin, TPO)은 혈액의 혈소판 수를 조절하는 사이토카인(cytokine)으로 알려진 물질이다 (Lok 등, Nature, 369: 565-568 (1994); 및 De savage, F.J. 등, Nature, 369: 533-568 (1994)). TPO는 당단백질로서 간 또는 신장에서 생성되고 분비되어 거핵구 전구세포의 증식과 분화를 촉진시키고 거핵구 세포의 혈소판으로서의 성숙을 유도하는 기능을 갖고 있다.

현재까지 혈소판 감소증을 치료하는 데는 혈소판 수혈이 유일하게 사용되어 왔으나 혈소판 수혈에 필요한 수여자의 부족, 출혈 부작용, 각종 바이러스의 오염 및 혈소판의 항원성 등으로 어려움이 많았다. 혈소판 생성 인자인 TPO는 이러한 혈소판 수혈에 의한 부작용을 줄이면서 혈소판이 관여하는 각종 질환에 사용될 수있을 것으로 판단된다. hTPO는 1994년에 최초로 cDNA형태로 클로닝 되었으며 다수의 논문과 특허로 공지되어 있다 (Lok 등, Nature, 369: 565-568 (1994); De savage, F.J. 등, Nature, 369: 533-568 (1994); Miyazaki 등, Experimental hematol., 22: 828 (1994); 및 국제특허공개 제95/18858호). hTPO는 골수 세포 내에 존재하는 혈소판 전구 세포인 콜로니 형성 전구 세포들에 특이적으로 작용하여 혈소판의 전구 세포인 거핵구 세포 (megakaryocyte)의 증식 및 분화를 유도하여 궁극적으로 혈소판 수를 증가시켜 항암 치료시 유발되는 혈소판 감소증 (thrombocytopenia) 및 골수이식에 따른 혈소판 감소증, 기타 혈소판 감소증에 사용되는 유망한 단백질로서 임상실험에서 뚜렷한 혈소판 증가 효과와 아울러 부작용도 경미하여 우수한 신약으로 기대되고 있다 (Shinjo 등, Leukemia, 12: 195-300 (1998); 및 Martin 등, J. Pediatr. Hematol. Oncol., 20(1): 36-43 (1998)). 실제로, hTPO는 제넨텍사 (Genentech Inc.)가 제조하여 (국제특허공개 제95/18868호) 현재 파마샤 업존 (Pharmacia & Upjohn)과 함께 임상 3상을 진행 중이며 기린사 (Krin)도 임상을 진행중이다 (국제 특허공개 제WO95/21919호). 본 발명자들은 천연형 hTPO 보다 생체내 활성이 뛰어난 hTPO 유도체를 발명하였으며 (국제특허공개 제WO99/00347호) 이 물질은 우수한 혈소판 감소증 치료제로서 기대되고 있다.

hTPO는 유전자 재조합 방법을 이용하여 작제된 벡터를 진핵세포에 삽입하여 이로부터 목적하는 유용 단백질의 합성 및/또는 분비를 가능하게 함으로써 대량 생산이 가능해졌으며, 형질전환된 세포를 혈청 함유 배지에서 배양한 후 정제하여 의학 용도에 사용하고 있다. 그러나, 형질전환된 세포를 혈청 함유 배지를 사용하여배양하는 경우 동물 유래 인자로 인한 부작용의 우려가 높다.

현재, 의학적 사용에 적합하게 고도로 순수하고, 다른 미생물 또는 불순물로의 오염 염려가 없으며, 활성이 높은 hTPO의 제조/정제 방법이 절실히 요구되고 있다.

본 발명자들은 hTPO를 발현할 수 있는 발현벡터로 형질전환된 진핵세포를 혈청이 실질적으로 함유되지 않은 무혈청 배지 (serum-free medium)에서 배양함으로써 동물 유래 인자(바이러스 등)로 인한 부작용을 최소화하면서도 높은 발현 효율로 인간 트롬보포이에틴을 얻을 수 있다는 것을 알아내었다.

따라서, 본 발명의 목적은 hTPO를 발현할 수 있는 진핵세포를 무혈청 배지에서 배양하여 hTPO를 생성하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, hTPO 함유 생물학적 유액을 일련의 크로마토그래피 (친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피)에 적용함으로써 약제학적 사용에 적합한 고도로 순수한 형태의 hTPO를 정제하는데 성공하였다.

따라서, 본 발명의 또다른 목적은 hTPO가 함유된 생물학적 유액을 고도로 순수하게 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

치료제로 사용되는 많은 당단백질의 경우 대부분 당이 생체내 활성을 나타내는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Takeuchi 등, Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 86: 7819(1989)). 에리트로포이에틴의 경우 당의 가지 수와 구성성분, 특히 생체내 반감기 연장에 중요 역할을 하는 시알산의 함량 등이 중요하며, 재조합 당단백질을 제조하기 위한 숙주세포를 선택할 때 높은 생체내 활성을 가질 수 있는 당화 능력이 가장 우선적으로 고려되어야 하는 것으로 인식되고 있다. 고 시알산 함량의 당단백질을 정제하고자 시알산의 음전기적 성질을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 통해서 고 활성의 분획을 분리했다는 보고가 있다 (Glycoconj J.,13(6): 1013-20(1996)). 그러나, 트롬보포이에틴의 경우에는 시알산 함량과 생체내 활성과의 상관 관계에 대해 보고된 바 없었으며, 본 발명자들에 의해 본 발명의 크로마토그래피 방법을 이용하여 순수 정제된 시알산 함량이 상이한 hTPO를 사용하여 시알산 함량이 증가할수록 비례적으로 활성이 증가한다는 것을 알아내었다.

따라서, 본 발명의 또다른 목적은 상기한 정제 방법에 의해 생성된 높은 생체내 활성을 갖는 시알산 함량이 높은 hTPO를 제공하는 것이다.

발명의 요지

본 발명은 인간 트롬보포이에틴 (hTPO)을 발현하는 진핵세포를 3 내지 6.5% 혈청 함유 배지에서 배양하고 연속해서 0.5 내지 1.5% 혈청 함유 배지에서 배양한 후 혈청이 실질적으로 함유되지 않은 무혈청 배지에서 배양함으로써 hTPO 함유 배양물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법에서, 진핵세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포주 (CHO)가 바람직하게 사용되며, CHO dhfr-/pD40434 (KCTC 0630BP), CHO dhfr-/pD40449 (KCTC 0631BP)및 CHO dhfr-/pD40458 (KCTC 0632BP)로 이루어진 그룹중에서 선택되는 세포주가 특히 바람직하게 사용된다. 또한, 상기 방법에서, 0.5 내지 1.5% 혈청 함유 배지에 접종되는 세포의 농도는 1.0 x 10⁴내지 1.0 x 10⁶cell/ml이며, 보다 바람직하게는 1.5 x 10⁵cell/ml이다. 또한, 무혈청 배지에 부틸산 및 효모분해물이 첨가된 배지가 바람직하게 사용된다.

또한, 본 발명은 hTPO 함유 생물학적 유액을 (a) 친화성 크로마토그래피하는 단계, (b) 단계 (a)에서 생성된 용출액을 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 단계, (c) 단계 (b)에서 생성된 용출액을 역상 크로마토그래피하는 단계 및 (d) 단계 (c)에서 생성된 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계를 포함하여 hTPO를 정제하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법에서, 단계 (c)에서 생성된 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 충진하고 0.15M 내지 0.3M 염화나트륨 농도 구배에서 선택적으로 용출된 hTPO를 수집하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 정제 방법은 단계 (d)를 수행한 후 겔 여과 크로마토그래피하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하며, hTPO 함유 생물학적 유액은 hTPO를 발현하는 벡터로 형질전환된 진핵세포를 무혈청 배양배지에서 배양하여 얻은 배양물이 바람직하게 사용된다. 또한, 단계 (a)의 친화성 크로마토그래피는 1M 염화나트륨을 함유한 인산염 완충액으로 용출시키는 것이 바람직하며, 단계 (c)의 역상 크로마토그래피는 에탄올 구배를 사용하여 용출시키는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기한 정제 방법으로 정제된 hTPO 함유 분획에 관한 것이다.

도 1은 셀 팩토리 무혈청 배양과 일련의 크로마토그래피를 거쳐 hTPO를 정제하는 흐름도를 나타낸다.

도 2는 셀 팩토리 배양기내에서 무혈청 배양 공정 중의 hTPO 유도체의 발현량을 나타낸 것이다.

도 3은 hTPO 유도체의 정제도를 확인하기 위해 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 쿠마시 염색 및 웨스턴 블럿을 실시한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 역상 고속 액체 크로마토그래피 (reverse phased HPLC)로 정제된 hTPO 유도체가 순도 99%이상이라는 것을 검증한 것이다.

도 5는 겔 여과 고속 액체 크로마토그래피 (size exclusion HPLC)로 정제된 hTPO 유도체가 98% 이상의 단량체로 구성되어 있다는 것을 검증한 것이다.

도 6은 등전집속 (isoelectrofocusing) 분석을 통해 각 분획의 pI 값과 시알산 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 시알산 함량에 따른 hTPO 유도체의 생체내 활성을 나타낸 것이다.

도 8은 마우스를 이용하여 고 시알산 분획의 hTPO 유도체의 생체내 활성을나타낸 것이다.

도 9는 무혈청 배지에 첨가되는 다양한 성분들에 따른 hTPO 유도체의 발현율을 나타낸 것이다.

진핵세포에 의해 생성된 대부분의 세포 표면 및 분비 단백질은 하나 이상의 올리고당 그룹으로 수식된다. 이러한 수식을 당화라고 하며 폴리펩타이드 골격을 따라 특정 위치에서 발생하는데 보통 두 가지 유형으로 분류된다. 한 가지 유형은 O-연결된 올리고당이 세린(Ser) 또는 쓰레오닌(Thr) 잔기에 연결되는 O-연결형 당쇄화이고, 다른 한 가지 유형은 N-연결된 올리고당이 서열 Asn-X-Ser/Thr (여기서, X는 프롤린을 제외한 어떠한 아미노산도 가능하다)의 아스파라긴(Asn) 잔기에 연결되는 N-연결형 당쇄화이다. O-연결된 올리고당과 N-연결된 올리고당의 구조와 각 유형에서 발견되는 당 잔기는 상이하다. O-연결된 올리고당과 N-연결된 올리고당 모두에서 공통적으로 발견되는 당이 시알산이다. 시알산은 많은 당결합체의 필수 성분인 약 30개의 천연 산성 탄수화물 군의 일반명이다 (Society Transactions, 11, 270-271 (1983)). 가장 대표적인 시알산 형태는 N-아세틸뉴라민산이고 그 다음으로 대표적인 시알산 형태는 N-글리콜릴뉴라민산이다 (Schauer, Glycobiology, 1, 449-452 (1991)).

천연형 hTPO는 세포내에서 353개의 아미노산으로 구성된 전구체로서 발현된 후 21개 아미노산의 시그널 서열이 잘리면서 332개의 아미노산으로 구성된 활성형 단백질로 세포외로 분비되는 당단백질이다. hTPO 유도체는 천연형 hTPO와 상이한당화 패턴을 가질 수 있으며, 대표적인 예로는 hTPO를 코딩하는 cDNA에 있는 특정 염기를 치환시켜 아스파라긴-X-세린/쓰레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 아미노산이다)의 형태로 돌연변이시킴으로써 C-말단이 결실된 174개 아미노산으로 구성된 hTPO에 N-연결형 당쇄를 하나 이상 도입한 hTPO 유도체 (국제특허공개 제WO96/25498호), 완전한 천연형 hTPO에 당쇄를 추가로 도입하여 당쇄가 하나 추가된 hTPO 유도체 (박흥록 등, J. Biol. Chem., 273:256-261, 1998), 천연의 hTPO의 164번, 193번, 157번과 164번, 117번과 164번과 108번 아미노산을 아스파라긴으로 치환하여 N-연결형 당쇄를 도입한 hTPO 유도체 (대한민국 특허 공개 제2001-0078744호) 등을 들 수 있다.

본 발명자들은 hTPO를 발현하는 벡터로 형질전환된 진핵세포를 3 내지 6.5% 혈청 함유 배지에서 배양하고, 이어서 0.5 내지 1.5% 혈청 함유 배지에서 배양한 후 혈청이 실질적으로 함유되지 않은 배지에서 배양함으로써 혈청-유래 인자로 인한 오염 요소가 없는 hTPO 함유 배양액을 수득할 수 있었으며, hTPO의 발현 효율이 혈청 함유 배양 배지에서 보다 우수하였다. 종래의 저혈청 함유 배지를 사용한 배양의 경우 5% 이상의 혈청 함유 배지를 이용하였으나, 본 발명에서는 3 내지 6.5% 혈청 함유 배지에서 배양하고 이어서 0.5 내지 1.5% 혈청 함유 배양 배지를 사용하여 배양한 후 최종 배양 단계에서는 혈청이 실질적으로 함유되지 않은 무혈청 (serum-free) 배지를 사용하여 배양하였으며 다량의 hTPO를 혈청으로의 오염을 최소화하면서 생산할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 하나의 양태로서, hTPO을 발현하는 진핵세포를 3 내지6.5%, 바람직하게는 4 내지 6%, 보다 바람직하게는 5% 혈청 함유 배지에서 배양하고, 이어서 0.5 내지 1.5%, 바람직하게는 1% 혈청 함유 배지에서 배양한 후 혈청이 실질적으로 함유되지 않은 무혈청 배지에서 배양하여 hTPO 함유 배양물을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 배양 방법에서 hTPO을 발현하는 진핵세포는 적절한 영양물과 성장 인자를 함유한 배지에서 단층배양 또는 현탁 배양할 때 성장 및 생존할 수 있는 포유동물-유래된 세포주를 가리킨다. 특정 세포주를 위해 필요한 성장 인자는 예를 들면 문헌[Mammalian Cell Culture, Mather, J. P. ed., Plenum Press, N.Y. (1984) 및 Barnes and Sato, (1980) Cell, 22:649]에 기술된 바와 같이 과중한 실험부담 없이 경험으로 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 방법에 적합한 포유동물 숙주 세포로는 hTPO 유도체를 발현하는 형질전환 챠이니즈 햄스터 난소 세포주 (CHO), COS 세포주, 하이브리도마 세포, 예를 들어 마우스 하이브리도마 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, 293 세포, 마우스 L 세포 등을 예시할 수 있다. 특히, hTPO 유도체를 발현하는 CHO dhfr-/pD40434 (KCTC -630BP), CHO dhfr-/pD40449 (KCTC 0631BP), CHO dhfr-/pD40458 (KCTC 0632BP)가 바람직하게 사용될 수 있으며, 이중 CHO dhfr-/pD40458 (KCTC 0632BP)가 특히 바람직하다. 상기 배양 방법에서 0.5 내지 1.5% 혈청 함유 배지를 사용한 배양시, hTPO 발현 세포는 1 x 10⁴cell/ml 이상, 바람직하게는 1 x 10⁴cell/ml 내지 1 x 10⁶cell/ml, 보다 바람직하게는 1.5 x 10⁵cell/ml 의 농도로 접종될 수 있다.

하나의 구체적 실시로서, 본 발명은 hTPO 유도체를 발현하는 벡터로 형질전환된 챠이니즈 햄스터 난소 세포주(CHO dhfr-/pD40458)를 3 내지 6.5% 혈청 함유 배지에서 씨드 배양하여 회수하고, 이를 1 x 10⁴cell/ml 내지 1 x 10⁶cell/ml의 세포 농도로 0.5 내지 1.5% 혈청 함유 배지에 접종하여 배양한 후 이어서 무혈청 배지에서 배양하여 hTPO 유도체 함유 배양물을 생성하였다. 바람직하게는, 상기한 바와 같이 무혈청 배지에서 배양된 hTPO 유도체 함유 배양물의 배양 상등액을 본 발명의 hTPO 정제 방법에 hTPO 함유 생물학적 유액으로 사용할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "무혈청 배양 배지"는 포유동물 기원의 혈청(예: 태아 소 혈청(FBS))을 실질적으로 함유하지 않은 영양액을 가리킨다. 또한, 용어 "실질적으로 함유하지 않은"은 세포 배양 배지가 약 0.5% 미만의 혈청, 바람직하게는 약 0 내지 0.1% 혈청을 함유함을 의미한다. 상기한 바와 같이, 혈청이 실질적으로 함유되지 않은 무혈청 배지에서 hTPO를 발현하는 진핵세포를 배양함으로써 정제된 hTPO는 혈청 기원의 바이러스 등에 의한 부작용을 최소화시킬 수 있다. 세포의 성장을 위한 영양액은 전형적으로 탄수화물 형태(예, 글루코즈)의 에너지 원, 모든 필수 아미노산, 비타민 및/또는 기타 저농도로 요구되는 유기 화합물, 유리 지방산 및 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위의 아주 낮은 농도로 요구되는 유기 화합물 또는 천연 원소)를 함유할 수 있으며, 임의로 호르몬 및 기타 성장 인자(예, 인슐린, 트랜스페린 및 표피 성장 인자), 염 및 완충액 (예, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 뉴클레오사이드 및 염기 (예, 아데닌, 티미딘 및 하이폭산틴) 및 단백질 및 조직 가수분해물중에서 선택된 하나 이상의 성분으로 보충될 수 있다. 본 발명자는 무혈청 배지의 첨가물로서 비필수 아미노산, ZnSO4, 염화부틸산 및 효모분해물의 hTPO 발현 효율을 관측하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, 0.5mM의 염화부틸산이 1mM의 염화부틸산을 첨가한 경우 보다 발현 효율이 높았으며, 효모분해물을 첨가하는 경우가 비필수아미노산 + 부틸산 + 아연화합물을 첨가한 경우보다 월등히 높은 발현 효율을 나타내었다. 따라서, 본 발명자는 무혈청 배양 배지에 부틸산 및 효모분해물을 첨가하였으며, 그 결과 혈청이 함유된 배지를 사용하는 경우에 비해 발현량이 증가될 뿐만 아니라 배양물내의 혈청-유래의 불순물도 최소화할 수 있어 다음 단계의 정제 과정을 용이하게 수행할 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 hTPO을 함유하는 생물학적 유액을 일련의 크로마토그래프를 통해 고도로 순수한 형태의 hTPO를 정제할 수 있었다. 구체적으로, 본 발명자들은 hTPO 함유 생물학적 유액을 (a) 친화성 크로마토그래피하는 단계, (b) 단계 (a)에서 생성된 용출액을 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 단계, (c) 단계 (b)에서 생성된 용출액을 역상 크로마토그래피하는 단계 및 (d) 단계 (c)에서 생성된 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계를 통해 정제함으로써 고도로 순수한 형태의 hTPO가 수득될 수 있다는 것을 입증하였다. 특히, hTPO 함유 생물학적 유액을 (a) 친화성 크로마토그래피하는 단계, (b) 단계 (a)에서 생성된 용출액을 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 단계, (c) 단계 (b)에서 생성된 용출액을 역상 크로마토그래피하는 단계 및 (d) 단계 (c)에서 생성된 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 충진하고 0.15M 내지 0.3M 염화나트륨 농도 구배에서 선택적으로 용출된 hTPO를 수집하는 단계를 통해 정제함으로써 고도로 순수한 형태의 고 시알산 함량의 hTPO를 수득할 수 있다는 것을 입증하였다.

따라서, 본 발명은 또다른 양태로서, hTPO 함유 생물학적 유액을 (a) 친화성 크로마토그래피하는 단계, (b) 단계 (a)에서 생성된 용출액을 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 단계, (c) 단계 (b)에서 생성된 용출액을 역상 크로마토그래피하는 단계 및 (d) 단계 (c)에서 생성된 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계를 포함하여 hTPO를 정제하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 단계 (c)에서 생성된 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 충진하고 0.15M 내지 0.3M 염화나트륨 농도 구배에서 선택적으로 용출된 hTPO를 수집하는 단계를 포함하여 고 시알산 함량의 hTPO를 정제하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 정제 방법은 음이온 교환 크로마토그래피의 용출액을 겔 여과 크로마토그래피하여 응집체를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 배양/정제 방법에서 TPO는 hTPO로서, 천연형 hTPO 및 hTPO 유도체를 포함하며, hTPO 유도체는 천연형 hTPO와 유사하거나 우수한 생물학적 활성을 갖는다. 상기한 hTPO 유도체는 천연형 hTPO 아미노산 서열의 치환, 삽입, 결실된 변이체를 포함하며, 천연형 hTPO와 상이한 당화 패턴을 가질 수 있으며, 상술한 바와 같이 당쇄가 추가되거나 새로운 위치가 당화되는 hTPO 유도체를 예시할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "생물학적 유액"은 세포, 세포 구성요소 또는 세포 산물을 함유하거나 그로부터 유래된 모든 유액을 가리키며, 이들로 한정하는 것은 아니지만, 세포 배양물, 세포배양 상등액, 세포 용해물, 세포추출물, 조직추출물, 혈액, 혈장, 혈청, 밀크, 뇨, 이들의 분획 등을 포함한다. 본 발명의 hTPO 정제방법에는 hTPO를 함유하는 한 상기한 바와 같은 다양한 형태의 생물학적 유액이 정제를 위한 출발물질로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기한 바와 같이 무혈청 배양 방법으로 수득된 배양물의 배양 상등액을 사용한다.

상기한 정제 방법에서, 친화성 크로마토그래피는 비공유결합의 가역적 방식에 의한 생체분자간의 특이적 상호작용을 포함한다. 즉, 이 방법의 원리는 물리화학적 특성의 차를 이용하는 것이 아니라 결합 시스템의 특이성을 이용하는 것으로 리간드라고 하는 특이적 결합 파트너가 일반적으로 불용성 매트릭스 (예, 다공성 유리, 아가로즈, 실리카, 셀룰로즈, 덱스트란 겔)에 공유결합되고 성분들의 혼합물이 접촉하게 되는 것이다. 바람직한 친화성 크로마토그래피는 염료-리간드 크로마토그래피이며, 예로는 CM Affi-Gel Blue 겔 또는 DEAE Affi-Gel Blue 겔 (Bio-Rad Laboratories), MIMETIC Red, Blue, Orange, Yellow 또는 Green (Affinity Chromatography Ltd, Freeport, Great Britain)을 들 수 있다. 특히 바람직한 것은 CM Affi-Gel Blue 겔이다. 이것은 CM Bio-Gel A 겔에 공유결합된 시바크론 블루 F3GA 염료를 함유할 수 있다. CM Bio-Gel A 겔은 카르복시-말단 아가로즈 겔이며, 이 지지체는 아미노 말단 리간드, 단백질 또는 스페이서 아암을 결합시키는데 사용된다. 편리하게는, 용출물을 로딩하기 전에 친화성 크로마토그래피 컬럼을 중성 pH의 수성 완충액, 바람직하게는 약 pH 7.2의 인산염 완충액으로 평형시킨다. 용출은 수성 완충액, 바람직하게는 약 pH 7.2의 인산염 완충액을 사용하여 공지 방법에 따라 실시한다. 인산염 완충액은 바람직하게는 1M 염화나트륨이 포함된 완충액이다. 이와 같은 완충액을 사용하여 용출시키는 경우 용출액을 2차 컬럼인 소수성 상호작용 크로마토그래피에 추가의 처리 없이 그대로 적용할 수 있다. 친화성 크로마토그래피를 1차 컬럼으로 적용시킴으로써 배양액의 배지 성분들 (phenol red 등)을 효과적으로 제거할 수 있다.

본 발명에서 소수성 상호작용 크로마토그래피는 시판되고 있는 여러 종류의 매트릭스에 결합된 소수성, 적합하게는 방향족 또는 지방족의 전하를 띄지 않는 리간드를 갖는 겔에서 실시된다. 전하를 띄지 않는 리간드가 형성되도록 통상의 결합 기술에 의해 리간드를 매트릭스에 결합할 수 있다. 이러한 기술로 가장 적합한 예가 글리시딜-에테르 결합 방법이다. 다른 기술로는 아가로즈 매트릭스를 수중에서 글리시독시프로필트리메톡시 실란으로 활성화시킨 다음 알코올중에서 리간드를 고정하는 것이다. 또 다른 기술로는 아가로즈 매트릭스를 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르와 같은 비스-에폭사이드로 활성화한 다음 아미노알킬 또는 알킬 머캅탄과 같은 리간드에 결합시키는 것이다. 이용될 수 있는 또 다른 기술은 1,1-카르보닐디이미다졸 활성화 및 디비닐설폰 활성화이다. 상기 모든 기술로부터 얻은 겔은 전체 pH 범위에서 전하를 띄지 않는다. 지방족 리간드는 예를 들면, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸과 같은 직쇄 알킬이거나, 이소- 또는 네오알킬과 같은 측쇄알킬이거나, 올리고에틸렌 글리콜일 수 있다. 방향족 리간드는 바람직하게는 페닐이다. 매트릭스는 여러 강친수성 매트릭스중에서 선택될 수 있으며, 예를 들면 Sepharose®와 같은 아가로즈 매트릭스, TSK-GEL과 같은 유기 고분자 매트릭스,고다공성 유기 고분자 매트릭스가 있다. 바람직한 매트릭스는 아가로즈 매트릭스이다. 적합한 아가로즈 매트릭스는 Amersham Biosciences (Uppsala, Sweden)의 세파로즈 매트릭스, Bio-Rad Laboratories (Brussels, Belgium)의 Bio-Gel A, Kem-En-Tec A/S (Copenhagen, Denmark)의 Minileak®이다. 바람직하게는, 매트릭스는 교차 연결되어 고속 유동을 허용함으로써 고 생산능을 제공하는 것이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 Amersham Biosciences의 페닐 세파로즈 6 FF 겔 또는 부틸 세파로즈 4 FF 겔에서 실시한다. 일반적으로, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 실시하기에 앞서 분획의 전도성을 높이기 위해 분획에 염을 첨가할 수 있다. 그런 다음 낮은 이온 세기의 완충액을 사용하여 매질로부터 용출한다. 본 발명의 실시에서 소수성 상호작용 크로마토그래피는 전단계의 친화성 크로마토그래피의 용출액을 전처리 없이 그대로 로딩할 수 있으며, hTPO는 수지에 붙고 불순물은 그대로 컬럼을 통화하거나 세척 단계에서 제거되므로 많은 불순물을 효과적으로 제거할 수 있다.

본 발명에서 역상 크로마토그래피는 소수성에 따라 성분들을 분리하는 것으로 극성의 이동상과 비극성의 화학적으로 결합된 고정상을 이용한다. 바람직한 역상 매질은 C4 수지 (Amersham Biosciences), 다공성 수지 Oligo R2® 및 Oligo R3® (PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, MA)을 포함한다. 전형적인 용매 시스템은 물-에탄올, 물-아세토니트릴, 물-테트라하이드로푸란, 헥실렌 글리콜 등의 혼합물을 포함하며, 용출은 그러한 용매 시스템의 적당한 농도 구배로 공지 방법에 따라 수행한다. 바람직하게는, 용출된 분획은 즉시 인산염 완충액으로 희석하여 단백질의 변성을 방지한다. 구체적 양태로서, 본 발명의 정제 방법은 바람직하게는 역상 크로마토그래피에 C4 역상 수지를 사용한다. 특히 바람직하게는, 용매 시스템으로서 물-에탄올 혼합물의 구배를 이용한다. 본 발명의 실시에서 에탄올 농도 구배를 사용하여 역상 크로마토그래피한 용출액은 전단계의 소수성 상호작용 크로마토그래피한 용출액에 포함되어 있던 불순물을 완전히 제거함으로써 hTPO의 순도는 98% 이상이다.

본 발명에서 음이온 교환 크로마토그래피는 일반적으로 3급 또는 4급 아민 그룹 (예, 디에틸아미노에틸, 트리에틸아미노에틸, 벤조릴화된 디에틸아미노에틸)으로 유도체화된 불용성의 입자성 지지체를 포함하는 매질을 사용하여 실시한다. 적합한 지지체는 셀룰로즈, 아가로즈, 덱스트란, 폴리스티렌 비드 등을 포함한다. 트리에틸아미노에틸 그룹으로 유도체화된 지지체가 바람직하다. 적합한 음이온 교환 매질은 Q Sepharose® (Amersham Biosciences), Macro-Prep® Q (Bio-Rad Laboratories), Q-HyperD® (BioSepra, Inc., Marborough, MA), Fractogel EMD-TMAE 650 (Merck) 등을 포함한다. 음이온 교환 컬럼은 용출물을 로딩하기 전에 편리하게는 pH 6.0-8.0의 수성 완충액으로 평형시킬 수 있다. 용출은 수성 완충액, 바람직하게는 약 pH 6.5 내지 4.5의 아세테이트 완충액을 사용하여 공지 방법에 따라 수행할 수 있다. 달리는, 인산나트륨 완충액을 사용하여 농도 구배에 따라 용출할 수 있다. 바람직하게는, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 붙은 hTPO를 염화나트륨 농도 구배를 이용하여 시알산 함량에 따라 hTPO를 분획 용출시킨다. 0.5M 이하, 바람직하게는 0.3M 이하의 염화나트륨 구배를 사용할 수 있다. 염화나트륨 구배의 농도가 높을수록 시알산 함량이 높은 hTPO가 용출되었으며, 염화나트륨 구배 농도에 따른 용출된 분획중의 hTPO의 시알산 함량이 도 6에 나타나 있다. 0.15M 내지 0.3M 염화나트륨 농도 구배에서 용출된 분획에 시알산 함량이 높은 hTPO가 함유되었다. 본 발명자들은 상기한 바와 같이 정제된 hTPO를 등전집속분석에 의해 N-아세틸뉴라믹산 (N-acetylneuraminic acid) 및 N-글리코뉴라믹산 (N-glyconeuraminic acid)를 정량 및 정성 분석하여 시알산 함량을 측정하였으며, 또한 시알산 함량에 따른 생체내 활성을 측정하여 시알산 함량이 증가할수록 생체내 혈소판이 증가한다는 것을 확인하였다 (실시예 5, 도 7).

따라서, 본 발명은 하나의 추가 양태로서, hTPO 함유 생물학적 유액을 (a) 친화성 크로마토그래피하는 단계, (b) 단계 (a)에서 생성된 용출액을 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 단계, (c) 단계 (b)에서 생성된 용출액을 역상 크로마토그래피하는 단계 및 (d) 단계 (c)에서 생성된 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 충진하고 0.15M 내지 0.3M 염화나트륨 농도 구배에서 선택적으로 용출된 hTPO를 수집하는 단계를 포함하는 방법으로 정제된, 고 시알산 함량의 hTPO 함유 분획을 제공한다.

본원에 사용된 용어 "고 시알산 함량의 hTPO"는 상기한 바와 같은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 0.15 내지 0.3M의 염화나트륨 구배에서 용출되고 pI가 4.0 이하인 hTPO를 의미한다.

상기한 일련의 크로마토그래피를 통해 정제된 hTPO는 겔 여과 크로마토그래피를 통해 추가로 정제될 수 있으며, 이로써 음이온 교환 크로마토그래피로부터의용출물중의 응집체를 제거할 수 있다. 겔 여과의 바람직한 매질은 아가로즈, 폴리아크릴아미드 또는 기타 고분자의 교차-연결된 비드를 포함하며, 바람직하게는 Amersham Biosciences의 세파크릴 (예, Sephacryl® S-200 HR 또는 S-300 HR), 세파덱스 (예, Sephadex G50) 또는 수퍼덱스 (예, Superdex® 200PG 또는 Superdex 75)을 들 수 있다. TOSO Haas GmbH (Stuttgart, Germany)의 겔 여과 매질 (예, TSK Toyopearl HW55) 또는 기타 제조업체에서 시판하고 있는 유사한 겔 등이 사용될 수 있다. 용출은 수성 완충액을 사용하여 공지 방법에 따라 수행하며, TPO의 특성에 유해한 영향을 미치는 성분들을 용출하는 것으로 알려진 기타 통상의 용출 완충액이 사용될 수 있다. 구체적 양태로서, 본 발명의 정제 방법은 바람직하게는 겔 여과 크로마토그래피에 수퍼덱스 200PG를 사용한다.

상기한 바와 같은 일련의 크로마토그래피를 통해 정제된 hTPO는 역상 고속 액체 크로마토그래피 및 겔 여과 고속 액체 크로마토그래피 결과, 98% 이상의 고순도를 나타내었다 (실시예 3).

본 발명은 이하 실시예를 통해 좀더 구체적으로 설명될 것이다. 이러한 실시예는 단지 본 발명이 좀더 이해될 수 있도록 예시적으로 제시되는 것이므로, 이들 실시예로서 본 발명의 범위를 한정해서는 안될 것이다.

<실시예1> 셀 팩토리 배양기를 이용한 무혈청 대량배양

157번 및 164번 아미노산을 아스파라긴으로 치환하여 N-당쇄를 도입한 hTPO 유도체를 대량 생산하기 위한 무혈청 셀 팩토리 배양을 씨드 배양 단계와 본 배양 단계로 나누어 수행하였다. 씨드 배양에서는 액체 질소 탱크에 보관되어 있는 제조용 세포은행 (Working Cell Bank)에서 인간 트롬보포이에틴 유도체 생산 세포주 (CHO dhfr-/pD40458) (KCTC 0632BP) 5개 바이알 (1x10⁷cell/ml)을 꺼내어 씨드 배양 배지 (5% 혈청 함유, DMEM/F12 배지, Gibco-BRL Co.)로 1회 세척하였다. 메토트렉세이트 (methotrexate, Sigma사)를 함유한 씨드 배양 배지를 30ml씩 5개의 175㎠ T-플라스크 (Nalge Nunc International Corp., Naperville, IL)에 넣고 세척한 세포를 접종하였다. CO₂배양기 (37℃, 5% CO₂의 조건)에서 준포화 (sub-confluency) 상태까지 배양한 다음, 175㎠ T-플라스크를 0.25% 트립신-EDTA 용액으로 처리하여 세포들을 회수하였다. 1개의 175㎠ T-플라스크에서 회수한 세포들을 신선한 메토트렉세이트가 포함된 씨드 배양 배지가 30ml씩 들어있는 4개의 새로운 175㎠ T-플라스크에 나누어 접종한 후 상기와 동일한 조건에서 한번 더 준포화 상태까지 배양한 다음 회수한 세포들을 신선한 씨드 배양 배지가 2L씩 들어있는 3개의 10단 셀 팩토리(Nunc Cell Factory of Nalge Nunc International Corp., Naperville, IL)에 나누어 접종하였다.

3개의 10단 셀 팩토리에서 회수한 세포들을 신선한 본 배양 배지 (1% 혈청함유, DMEM/F12 배지, Gibco-BRL Co., Gaithersburg, MD) 40L가 들어있는 Media bag (Stedim Inc., Concord, CA)에 넣고 골고루 섞어준 후 5개의 40단 셀 팩토리에1.5 x 10⁵cell/ml로 접종하였다. 72시간 배양 후 PBS로 1회 씻어주고 0.5mM 부틸산, Yeastolate (Gibco-BRL Co.), 각종 아미노산이 첨가된 무 혈청 배지 DMEM/F12로 교체한 후 CO₂배양기 (37℃, 5% CO₂의 조건)에서 120시간 동안 배양하였다. 상기의 여러 첨가물이 들어간 무혈청 (serum-free) 배양방법으로 배양 시 배양일에 따른 hTPO 유도체 생산 세포주의 발현량을 도 2에 나타내었다. 발현량은 무혈청 배지로 교체한 후 5일째에 최대였으며(20mg/L), 이는 10% 혈청이 함유된 배지에서 확인된 발현량 (10mg/L)과 비교할 때 약 2배 증가한 것이다.

<실시예2> hTPO 유도체의 순수정제

(a) 친화성 크로마토그래피

CM Affi-Gel Blue 수지 (Bio-Rad Laboratories) 1L를 VS 150/500 칼럼 (Millipore, Bellerica, MA)에 충진시킨 후 완충액 A (10 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 7.2) 10L로 충분히 세척하였다. 실시예 1에서 얻은 배양 상등액 40L를 130 ml/min의 속도로 칼럼을 통과하게 하였고, 280 nm에서 UV로 모니터링 하였다. 배양 상등액을 다 흘린 다음 완충액 B (10 mM 인산나트륨, 2M 요소, pH7.2)로 UV 수치가 기저 수준이 될 때까지 씻어준 다음 완충액 C (10 mM 인산나트륨, 2M 요소, 1M 염화나트륨, pH 7.2)로 TPO를 포함한 수지에 붙은 단백질들을 용출시켰다.

(b) 소수성 상호작용 크로마토그래피

페닐 세파로즈 FF 수지 (Amersham Biosciences) 800 ml을 VS90/500칼럼에 충진시킨 후 2L의 완충액 C (10 mM 인산나트륨, 2M 요소, 1M 염화나트륨, pH 7.2)로 충분히 씻어주었다. CM Affi-Gel Blue 단계에서 얻은 용출 분획을 43 ml/min의 속도로 칼럼에 적용하였고 280 nm에서 UV로 모니터링하였다. 분획을 다 흘린 다음 완충액 C (10 mM 인산나트륨, 2M 요소, 1M 염화나트륨, pH 7.2)로 UV 수치가 기저 수준이 될 때까지 씻어준 다음 완충액 B (10 mM 인산나트륨, 2M 요소, pH7.2)로 TPO를 포함한 수지에 붙은 단백질들을 용출시킨 후 이 분획에 EtOH를 20% 첨가하여 다음 단계인 C4 역상 컬럼 크로마토그래피 (C4 reversed phased column chromatography)에 적용하였다.

(c) 역상 크로마토그래피

15um 크기의 C4 역상 수지 (Amersharm Pharmacia사) 23 ml을 TR10/300 컬럼 (Amersham Biosciences)에 충진시키고, pH 6.0의 50mM 인산나트륨, 20% 에탄올로 세척하여 평형화시킨 후, 7 ml/min의 속도로 페닐 세파로즈 단계에서 얻은 용출 분획 (20% EtOH 첨가)을 주입하였다. pH 6.0의 50mM 인산나트륨, 40% 에탄올 완충액으로 컬럼을 씻어주고 40%에서 80% 에탄올의 농도 구배에 의해 단백질을 용출시켰다. hTPO 유도체는 약 70% 에탄올의 농도 구배에서 대부분 용출되었다. C4 역상 크로마토그래피에서 용출된 분획은 곧바로 10mM 인산나트륨 완충액으로 10배 희석하여 유기용매에 의한 단백질 변성을 방지하였다.

(d) 음이온 교환 크로마토그래피

역상 크로마토그래피 단계에서 용출된 분획을 시알산 함량에 따라 분별하기 위해 음이온 교환 크로마토그래피 Q 컬럼 (Amersharm Biosciences)에 10ml/min의 속도로 주입하였다. 10mM 인산나트륨 완충액으로 충분히 씻은 후, 0 내지 0.3M 염화나트륨 구배의 10mM 인산나트륨 완충액을 적용하여 용출하였다. 이때 시알산 함량이 적은 hTPO는 0.15M 이하의 염화나트륨을 이용한 분획에서 용출되고, 반면 시알산 함량이 많은 hTPO 유도체는 0.15 내지 0.3M 염화나트륨 완충액에서 용출되었다.

(e) 겔 여과 크로마토그래피

음이온 교환 크로마토그래피에서 용출된 고 시알산 함량의 hTPO를 겔 여과 크로마토그래피에 적용하여 응집체 (aggregates)를 제거하고 최종 의약품 원료의 포뮬레이션 완충액인 TNT (10mM 트리스, 150mM 염화나트륨, 0.01% 트윈20) 완충액으로 교체하였다. 컬럼 XK50/100 (Amersharm Biosciences)에 겔 여과 수지 수퍼덱스 200PG (Superdex 200PG, Amersharm Biosciences) 1.4L를 충진시키고 0.5N NaOH 와 0.5N HCl로 세척한 후 TNT 완충액 7L를 하루동안 흘려주어 수지에 엔도톡신이 존재하지 않도록 조절하였다. 용출액을 8ml/min의 속도로 컬럼에 주입하고 분획 수집기 (fraction collector, Amersham Biosciences)로 컬럼을 통과한 단백질을 수집하였다. 단량체만 포함하는 분획들을 모아 0.22um 필터로 여과한 후 동결건조바이알에 분주하고 장기간 보존을 위해 동결건조시켰다.

<실시예3> 검정

각 단계의 크로마토그래피에서 용출된 용출액은 환원 조건하에서 16% 폴리아크릴아미드 겔 (Invitrogen사) 상에서 전기영동 후, 쿠마시 염색과 웨스턴 블랏 방법으로 분석하였다. 이의 결과는 도 3에 나타나 있다. 최종 정제된 정제 산물은 역상 고속액체 크로마토그래피 (reverse phased HPLC)로 순도가 99% 이상임을 확인하였고 (도 4 참조), 겔 여과 고속액체 크로마토그래피 (size exclusion HPLC)를 통해 단량체가 98% 이상임이 증명되었다 (도 5 참조).

<실시예 4> hTPO 유도체의 등전집속분석 및 시알산 측정

실시예 2에서 순수 정제한 시료 6ug을 취하여 IEF 겔 (pH3-7, Invitrogen)에 로딩하고 100V에서 1시간, 200V에서 30분, 500V에서 15분간 전개한 후 겔을 꺼내 고정액 속에서 30분간 방치하고 쿠마시 염색으로 염색함으로서 등전집속분석을 실시하였다. 등전집속분석 결과 Q 컬럼에서 염화나트륨 농도 구배에 따라 염농도가 높을수록 용출된 분획의 pI값이 낮아짐을 알 수 있었다 (도 6A). 시알산 분석을 위해서는 우선 0.4 내지 0.6nmol의 건조된 시료에 0.4ml의 0.1N HCl을 넣어 1시간 동안 80℃에서 시알산을 가수분해하였다. 스피드 백(Speed Vac)에서 반응액을건조시키고 다시 증류수에 녹여 재 건조한 시료 중 일부를 Bio-LC DX-300 (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA)에 주입하여 분석하였다. 컬럼은 직경 4mm, 길이 250mm의 CarboPac PA1 컬럼을 이용하였고 150mM 염화아세트산을 함유하고 있는 100mM NaOH로 분석하였다. 유속은 1ml/min이었고 표준물질로는 당단백질에서 발견되는 N-아세틸뉴라믹산 (N-acetylneuraminic acid)와 N-글리코뉴라믹산 (N-glyconeuraminic acid)를 사용하여 정성 및 정량 분석을 실시하였다. 이의 결과가 도 6B에 나타나 있다. 물질의 pI값이 낮을수록 비례적으로 시알산 함량이 높으며, 이는 시알산 함량이 당단백질의 pI값에 많은 영향을 미치고 있음을 나타낸다.

<실시예 5> hTPO 유도체의 생체내 (in vivo) 활성 검증

생체내 활성시험은 동물세포에서 발현된 hTPO 유도체를 투여한 마우스로부터의 혈소판 수를 측정하는 방법으로 수행하였다. 동물은 암컷 Balb/c 마우스를 7 주령으로 구입하여(Charles River사, 일본) 항온(24 ± 1 ℃), 항습(55%), 조명시간 12시간(오전7시 - 오후 7시)으로 설정된 동물실에서 1주간 정도 사육 순화 후 사용하였다. 시험기간 중에도 동물은 동일 사육실에서 사육하였다. 1군에 5마리가 되도록 체중을 지표로 한 층별 무작위 추출에 의해 마우스를 군 분리하고, 각각 hTPO 유도체 투여군, 약제를 투여하지 않는 무처리 군으로 설정하였다.

실시예 2의 Q 컬럼에서 상이한 염농도에 따라 분획하여 시알산 함량이 상이한 hTPO 유도체를 수득하였으며, 이의 시알산 함량에 따른 hTPO 유도체의 생체내활성을 비교하기 위해서 10mg/kg 의 농도로 1회 단독 피하투여 하였고 채혈은 투여 시작일을 0일째로 하여 5일차에 시행하였다. 에테르 마취 하에 마우스의 복부하대정맥으로부터 전혈을 채취하고 EDTA 처리 튜브에 옮긴 다음 말초혈중의 혈소판 수를 자동혈구 계측기 (Cell dyne, 에보트사)를 사용하여 측정하였다. 결과는 평균 ± 표준오차로 나타내었고 시알산 함량이 높을수록 생체내에서 혈소판을 증가시키는 약효는 비례적으로 높음을 알 수 있었다 (도 7A). 동일한 시험 방법으로 0 내지 0.3M 염화나트륨 농도 구배에서 분리한 hTPO 유도체와 0.15 내지 0.3M 염화나트륨 농도 구배에서 용출한 고 시알산 함유 hTPO 유도체간의 생체내 활성을 비교하였을 때 (도 7B), 상기 2가지 용출액간의 생체내 활성은 유의적인 차이를 나타내었다.

고 시알산을 함유하는 hTPO 유도체 분획의 투여 농도에 따른 활성을 측정하기 위해 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280 mg/kg 의 일정한 농도로 1회 단독 피하 투여하였고 시험 방법은 상기와 동일하게 수행하였다. 투여 농도에 따른 혈소판 수치의 변화를 도 8에 나타내었다. HTPO 유도체는 혈소판수의 증가를 자극하여 8일차에 최대 혈소판 수를 나타내었으며, 농도 의존적으로 혈소판 수치를 증가시켰다.

본 발명에 따른 무혈청 배양 방법으로 hTPO를 생산할 수 있으며, 이를 본 발명의 일련의 크로마토그래피를 적용한 정제 과정을 분리하여 높은 활성을 나타내는고 시알산 함량의 고 순도 hTPO를 얻을 수 있다. 이러한 고시알산 함량의 고 순도 hTPO는 의학적으로 매우 유용하다.

Claims (13)

1. 인간 트롬보포이에틴 (hTPO)을 발현하는 진핵세포를 3 내지 6.5% 혈청 함유 배지에서 배양하고, 연속해서 0.5 내지 1.5% 혈청 함유 배지에서 배양한 후, 0 내지 0.5% 미만의 혈청을 함유하는 배지에서 배양함으로써 hTPO 함유 배양물을 생산하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 진핵세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포주 (CHO)인 방법.
3. 제2항에 있어서, CHO 세포주가 CHO dhfr-/pD40434 (KCTC 0630BP), CHO dhfr-/pD40449 (KCTC 0631BP) 및 CHO dhfr-/pD40458 (KCTC 0632BP)로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
4. 제1항에 있어서, 0.5 내지 1.5% 혈청 함유 배지에 접종되는 세포의 농도가 1.0 x 10⁴cell/ml 내지 1.0 x 10⁶cell/ml 인 방법.
5. 제4항에 있어서, 접종되는 세포의 농도가 1.5 x 10⁵cell/ml인 방법.
6. 제1항에 있어서, 0 내지 0.5% 미만의 혈청을 함유하는 배지에 부틸산 및 효모분해물이 첨가되는 방법.
7. (a) hTPO 함유 생물학적 유액을 친화성 크로마토그래피하는 단계, (b) 단계 (a)에서 생성된 용출액을 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 단계, (c) 단계 (b)에서 생성된 용출액을 역상 크로마토그래피하는 단계 및 (d) 단계 (c)에서 생성된 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계를 포함하여 hTPO를 정제하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 단계 (c)에서 생성된 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 충진하고 0.15 내지 0.3M 염화나트륨 구배에서 선택적으로 용출된 hTPO를 수집하는 단계를 포함하는 방법.
9. 제7항에 있어서, 단계 (d)를 수행한 후 겔 여과 크로마토그래피하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
10. 제7항에 있어서, hTPO 함유 생물학적 유액이 제1항의 방법으로 생산한 배양물의 배양 상등액인 방법.
11. 제7항에 있어서, 단계 (a)의 친화성 크로마토그래피에서 1M 염화나트륨을 함유한 인산염 완충액으로 용출시키는 방법.
12. 제7항에 있어서, 단계 (c)의 역상 크로마토그래피에서 에탄올 구배를 사용하여 용출시키는 방법.
13. 삭제