JP2584186B2 - エンドグルカナーゼをコードする遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明はグルカナーゼをコード
する遺伝子、該遺伝子を含んで成る発現ベクター、及び
該発現ベクターにより形質転換された宿主に関する。

【０００２】

【従来の技術】世界の最も豊富な再生産可能な資源は、
木材料及び草材料の主要な構造成分であるセルロース、
すなわちグルコースの重合体である。このため、セルロ
ースは、いわゆる廃棄物、例えば都市固形廃棄物、使用
済紙製品、及び農作物の副産物の大きな部分を成す。

【０００３】食料として直接使用するために、又はエタ
ノールのごとき有用な他の物質の出発材料として使用す
るために、これらの廃棄物からグルコースを得ることは
有利であろう。セルロース出発材料をグルコース最終生
成物に転換するために、限られた技法が使用可能であ
る。酸加水分解のごとき種々の非酵素的方法が試みられ
ているが、これらの方法は商業的に競争できるだけの十
分な特異性と生成物の純度に欠けている。

【０００４】他の重要な方法は、天然由来のセルロース
分解性酵素の使用、又はこれらの酵素を有する微生物の
直接的使用である。利用し得る酵素活性レベルが容易に
操作できない因子によって制御されるため、これらの方
法もまた経済的欠点を有していた。

【０００５】従って、セルロース生産性微生物の改良さ
れた菌株を開発し、そして組換型のセルラーゼ遺伝子
を、炭素源としてセルロースを利用することができない
微生物に導入することに興味が持たれる。特に、セルロ
ース分解酵素遺伝子を発酵微生物、例えばセルロースを
加水分解してグルコースのごとき基質を利用する能力を
有しないが、卓越した増殖及び生産性を有する発酵酵母
に導入することが経済的に望ましいであろう。

【０００６】典型的なセルラーゼ系は、セルロースの分
解において協働的に作用する３種類の主要なタイプの酵
素を含む〔Gritzal,M.等、Hydrolysis of Cellulose ：
Mech. of Enzymatic and Acid Catalysis, Brown,R.D.
等編（１９７９）、Am.Chem.Soc., ワシントンＤ．
Ｃ．，２３７頁；Mandels M.等、Process Biochem.（１
９７８年５月、７頁）〕。これらの酵素タイプはセロビ
オヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、及びβ−グルコ
シダーゼである。

【０００７】セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）はセルロ
ース重合体の非還元末端からセルロースを攻撃し、そし
て主生成物としてセロビオース（グルコースの二量体）
を生成せしめる。２つのタイプのＣＢＨ酵素、すなわ
ち、セロビオースのみを生成せしめるセロビオヒドロラ
ーゼ−Ｉ（ＣＢＨＩ）、及びセロビオースとグルコース
との混合物を生成せしめるセロビオヒドロラーゼ−II
（ＣＢＨII）が知られている。

【０００８】ＣＢＨ酵素はセルロース分解性非糸状細菌
(non-filamentous bacteria) 中には見出されておら
ず、従って菌類(fungi) 及び糸状細菌 (filamentous ba
cteria) に限られているようである。これらは高い基質
特異性を有し、そして高い基質親和性を有する。（誘導
体にされた形のセルロースはＣＢＨによって広範囲には
切断されない。）

【０００９】エンドグルカナーゼ（ＥＧ）はセルロース
鎖中の内部グリコシド結合を加水分解する。これらは菌
類及び細菌に見出され、そしてＣＢＨ酵素より広い基質
特異性を有する。これらは半無作為的にβ−グルコシド
結合を攻撃し、そして誘導体にされたセルロース（例え
ば、カルボキシメチルセルロース）を基質として利用
し、そして１，３−β，Ｄ−結合及び１，６−β，Ｄ−
結合を１，４−β，Ｄ−結合と同様に加水分解するであ
ろう。

【００１０】細菌及び菌類から得られた若干の公知の形
のＥＧ酵素が存在する。エンドグルカナーゼ−Ｉ（ＥＧ
Ｉ）は菌類トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma re
esei）において比較的高レベル（細胞外蛋白質の５〜１
０％）で生産され、この菌類における第２のＥＧ活性を
有するエンドグルカナーゼ−II（ＥＧII）は線状１，４
−β，Ｄ−マンナンを攻撃して主としてマンノビオース
を生成せしめることが示されている。

【００１１】β−グルコシダーゼは、ＣＢＨと同様に、
グリコシドの非還元末端を攻撃するが、可溶化されたセ
ロ−オリゴサッカライド（鎖長６未満）にのみ作用して
グルコース単位を生成せしめる。従って、β−グルコシ
ダーゼはＣＢＨ及びＥＧのセロビオース生成物をグルコ
ースに分解する。全セルラーゼ系におけるβ−グルコシ
ダーゼの存在は、この酵素が最終生成物を供するための
みならず、ある種のＣＢＨ及びＥＧはセロビオースによ
って阻害されるために、有意義である。従って、この生
成物を涸渇させるために追加の酵素を供することは、セ
ルロースからグルコースへの転換を助長する。

【００１２】セルラーゼ系構成成分の上記の明確な反応
特異性は、セルロース性材料の制限された、そして限定
された加水分解を達成するために、複数の酵素を個別的
に、又は選択された組合わせにおいて使用することがで
きることを示唆している。限定された加水分解の目的
は、セルロース性材料の構造的及び／又は機能的特性を
所望のように変化せしめることである。構造的変化の例
には、鎖長、粘度及びセルロース結合に影響を与える変
化が含まれる。機能的変化の例には、手ざわり、香り、
及び材料に結合する水に影響を与える変化が含まれる。

【００１３】さらに、エンドグルカナーゼは、その広い
基質特異性の故に、他のβ−結合重合体に作用する。こ
の１つの例は、キシランに対するＥＧＩの作用である。
この発明を援護して行われた実験において、ＥＧIIはβ
−マンナンを転換して主としてマンノビオースを生成せ
しめることが示された。このことはコーヒー工業におい
て有意義である。なぜなら、β−マンナンはコーヒー豆
の外側を被覆する主たるポリサッカライドであり、そし
てコーヒーの製造、特に凍結乾燥コーヒーの製造におい
て香味成分の抽出を妨害し、そして苦味を付与するから
である。

【００１４】セルラーゼ系の酵素は広く研究されてお
り、そして確かに、コード配列のクローニング及び発現
を行うための試みが行われている。例えば、 Whitte,D.
J.等、Gene（１９８２）１７：１３９； Cornet,P.等、
FEBS Micro.Biol.Letters （１９８３）１６：１３７；
Tuse,D.等、Genetic Technol.News（１９８１）１１
月、６頁；Abstract No.Ｈ１９ＡＳＭ Annual Meeting,
１９８１年３月；Symposium ASM Annual Meeting，１９
８３年３月； Wilson,D.B.等、 Bio／Technology（１９
８３）１：５９４；Teeri,T.等、 Bio／Technology（１
９８３）１：６９６；及びCollmer,A.等、 Bio／Techno
logy（１９８３）１：５９４−６０１を参照のこと。

【００１５】先行する試みは、コード配列の入手源とし
てＴ．リーゼイを含む種々の細菌性及び菌類性入手源を
用いているが、分泌され、グリコシル化されており、そ
して生物学的に活性な菌類性セルラーゼの酵母における
発現を報告したものはない。

【００１６】

【発明の概要】この発明は、菌類に由来するセルラーゼ
に関連するセルラーゼ酵素の組換形を提供する。菌類由
来の種々のセルラーゼ酵素のコード配列が、この明細書
に開示する一般的方法により、中断されていない形で再
構成される。このような配列を適当な組換発現ベクター
に導入することによって、大量の又は増加した量のこれ
らの酵素を、個別的に、又は組合わせて製造することが
できる。

【００１７】これらの酵素の大量生産は、これらの酵素
を溶解された形で又は固定化された形で生体外において
用いながら反応を行うことによってセルロースを加水分
解するためにその活性を工業的に利用することを可能に
する。この方法に代えて、組換ベクターを適切な宿主生
物に形質転換し、この宿主生物を用いて所望の加水分解
を行うこともできる。生産された酵素は培地中に分泌さ
れるのが好ましい。

【００１８】この発明の１つの観点に従えば、適当な菌
類入手源、例えばＴ．リーゼイからセルラーゼ遺伝子が
分離され、そしてその配列が決定される。これらの配列
及びこれらがもたらす情報を用いて、成熟酵素に限定し
てコードするイントロン不含コード配列、又は所望によ
り天然宿主からの分泌のために機能するリーダー配列と
リーディングフレームが整合する成熟コード配列を構成
することが可能である。コード配列は、酵母のごとき異
宿主において外来性配列の遺伝子発現を可能にする新規
な発現ベクター中に置かれる。この発現ベクターにより
形質転換された宿主は、セルラーゼを成熟した、グリコ
シル化された、機能的に活性な形で生産し、そして分泌
することができる。

【００１９】この発明の他の特徴に従えば、宿主生物を
形質転換するために使用される組換ベクターは、効率的
なプロセシングのため及び酵母からのセルラーゼの分泌
のために酵母において機能することが示されるセルラー
ゼシグナル配列を含有する。これらの配列はまた、酵母
からの他の蛋白質の分泌のために、好ましくはその天然
宿主により通常に分泌される蛋白質の分泌のためにも使
用することができる。このような蛋白質の例にはアミラ
ーゼ、プロテアーゼ、インターフェロン、リンポカイ
ン、インシュリン、及びホルモン類が含まれる。

【００２０】この発明の他の観点においては、異る複数
のセルラーゼ酵素を所定の比率で生産する生物が、セル
ラーゼ酵素の１又は複数を不活性化し又は変形して該酵
素を所望の通りに強化し、又は酵素の生産を防止するた
めに操作される。例えば、ＣＢＨＩ酵素及びＣＢＨII酵
素の両者を生産する菌類において、ＣＢＨII遺伝子を不
活性化してＣＢＨＩセロビオヒドロラーゼのみを生産す
る生物を得ることができる。

【００２１】選択されたセルラーゼを不活性化する方法
は、一般に、この発明に従って構成された組換セルラー
ゼ遺伝子を不活性化し（例えば大セグメントの欠失によ
り）、そしてこの不活性化された遺伝子によりセルラー
ゼ生産生物を形質転換することが含まれる。不活性化さ
れた遺伝子とゲノム遺伝子との間の組換は選択されたゲ
ノム遺伝子の不活性化をもたらす。糸状菌類(filamento
us fungul organism)に適用されるこの方法の実施可能
性は、 Yelton,M.M.等、Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,（１
９８４）８０：１４７０に示されている。この発明のこ
れらの及び他の目的及び観点は、添付された図面と共に
以下の詳細な記載により明らかになるであろう。

【００２２】

【具体的な態様】Ａ ．定義 「セロビオヒドロラーゼ」、又は「エキソ−セロビオヒ
ドロラーゼ」又は「ＣＢＨ」なる語は、この明細書にお
いて使用される場合、セルロースをセルロース重合体鎖
の非還元末端からセロビオース単位に切断することがで
きる蛋白質について用いる。ＣＢＨ酵素は糸状細菌及び
菌類に存在することが知られているが、非糸状細菌にお
いてはまだ証明されていない。少なくとも２つの形のＣ
ＢＨ、すなわちセロビオースのみを生成せしめるＣＢＨ
Ｉ、及びセロビオースとグルコースの混合物を生成せし
めるＣＢＨIIがトリコデルマにおいて知られている。

【００２３】この明細書において示すＣＢＨＩ蛋白質は
４９６アミノ酸の配列を有し、そして１７アミノ酸のリ
ーダー配列により先行されている。このリーダー配列の
除去によって生成する成熟ＣＢＨＩは、約６６，０００
ドルトンの分子量を有する。天然形において生産された
場合、この蛋白質は主としてセリン及び／又はスレオニ
ンのＯＨへの結合を介してのある程度のグリコシル化を
示す (Gum,E.K.等、Biochem.Biophys.Acta（１９７６）
４４６：３７１）。

【００２４】「エンドグルカナーゼ」なる語は、セルロ
ースを内部グリコシル部位において切断することができ
る酵素について用いる。菌類、例えばＴ．リーゼイ、及
び他の適当な菌類に由来するＥＧＩ及びＥＧIIの両者を
含む多くの形のエンドグルカナーゼが知られている。

【００２５】この明細書において例示されるＥＧＩは、
成熟蛋白質であると考えられる４３７アミノ酸の配列を
有し、そして２２アミノ酸のリーダー配列に先行されて
いる。この４３７アミノ酸組成に基礎を置く分泌される
形のアミノ酸は約４６，０００ドルトンの分子量を有す
る。天然蛋白質は、天然宿主により生産された場合、あ
る程度のグリコシル化を含むことが知られている〔Shoe
maker,S.P.等、Biochem.Biophys.Acta（１９７８）５２
３：１４７〕。

【００２６】「β−グルコシダーゼ」は同様に定義され
る。これらの酵素は、菌類のセルラーゼ系、及び細菌の
系の部分を構成する。これらは、Ｔ．リーゼイにおいて
は、少なくとも２つの物質的形体、すなわちβ−グルコ
シダーゼ−Ｉ、及びβ−グルコシダーゼ−IIとして存在
することが知られている。これらの酵素は、可溶性オリ
ゴサッカライドからグルコースを生成せしめることによ
ってセルロース消化を完結する。この発明の組換β−グ
ルコシダーゼは、この活性及び特異性を有しそしてアミ
ノ酸配列が菌類性β−グルコシダーゼのそれと絶対的に
同一であるか否かは別にして実質上同等である蛋白質を
包含する。

【００２７】次のことは、上に定義した３タイプすべて
に適用される。すべての蛋白質は、それが調製される際
のpHに依存して潜在的に酸性塩又は塩基性塩である。蛋
白質のすべてのイオン化形が定義内に含まれる。さら
に、宿主系の性質に依存してグリコシル化、燐酸化、ア
セチル化等の翻訳後プロセシングにより分子にある種の
変更が加えられることが理解される。ポリペプチドのプ
ロセス形及び非プロセス形の両者がセルラーゼの定義に
含まれる。同様に、例えばスルフィドリル基の酸化のご
ときアミノ酸側鎖の偶然的な又は意図しない化学的変形
により構造変化が生ずるであろう。

【００２８】このように変形された蛋白質もなお、その
変形が酵素活性を破壊しない限り定義内に含まれる。最
後に、正確なアミノ酸配列内の小さな変更が、酵素活性
を破壊することなく行われることが期待される。このよ
うな変更には、配列内のアミノ酸の置き換え、及び１又
は複数のアミノ酸の付加と又は欠失が含まれ、そして酵
素活性が維持される限り、これらの変形もまた定義に含
まれる。なお特許請求の範囲に記載される「１もしくは
複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換」とは、出
願前周知技術である部位特定変異誘発法（例えば、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１０，ｐ
ｐ．６４８７）により得ることができる１又は数個の塩
基配列が付加、欠失又は置換された程度のものであっ
て、かつそこにコードされた蛋白質の性質・機能が失わ
れない範囲のものである。

【００２９】特に、２種類のセルラーゼ酵素は、配列間
の１：１の対応がおよそ存在する場合、「実質上同等」
のアミノ酸配列を有する。しかしながら、ＣＢＨ，ＥＧ
又はβ−グルコシダーゼ機能の喪失をもたらさない、１
又は複数のアミノ酸における小さな変更はこの定義内に
とどまるペプチドを生じさせると考えられる。特定の入
手源に「由来する」特定のセルラーゼは、その入手源に
より天然に生産されるアミノ酸配列に向けられる。

【００３０】以下の説明において、Ｔ．リーゼイＬ２７
由来のＥＧＩ又はＣＢＨＩに関連する完全ゲノム配列が
「コード配列」として使用される。これらのコード配列
は、リーダーペプチドをコードする前配列 (pre-sequen
ce）を含有する。これらの説明において、生産された蛋
白質の分泌を得るのが有利であろうから、前配列が維持
される。しかしながら、他の場合には、細胞から分泌さ
れない成熟蛋白質を生産するのが好ましい。

【００３１】このリーダー又はその部分を除去するため
にコード配列を変更するための手段、従って非分泌形の
成熟蛋白質の生産を行うための手段は、技術の範囲内で
ある。このような成熟蛋白質のほかに、この発明はさら
に、分泌され又は分泌されない融合形のセロビオヒドロ
ラーゼ、エンドグルカナーゼ又はβ−グルコシダーゼ、
並びに関連する製造手段及び材料に関する。

【００３２】下の説明において、「標的遺伝子」なる語
はＥＧＩ遺伝子又はＣＢＨＩ遺伝子について用いる。こ
れに関連して、この遺伝子の正確な性質がどうである
か、すなわちこれが成熟蛋白質、融合蛋白質又はリーダ
ー配列含有蛋白質のいずれをコードするかは明らかであ
り、そしてこれが前配列を含有するか否か、成熟蛋白質
又は融合蛋白質としてのその形に関係なく、そのように
称されるであろう。

【００３３】適当なセルラーゼ基質、例えばセルロース
の「処理」は、選択された基質の変形を生じさせるた
め、又は基質の加水分解（セルロースからグルコースへ
の完全加水分解、もしくは限定され制御された加水分解
／変形を含む）を行うために設計された加水分解的酵素
反応を含む。「制御配列」なる語は、特定の宿主におい
て特定のコード配列の発現を制御するＤＮＡ配列につい
て用いる。宿主の種類に応じて、これらには、プロモー
ター、オペレーター、リボゾーム結合部位、ターミネー
ター、エンハンサー、及びあるレベルの発現を行うのに
必要な他の配列が含まれる。「適切な」制御配列なる語
は、関連する特定の宿主に適合性の制御配列について用
いる。

【００３４】「シグナル配列」と称する制御配列の１つ
は、この明細書においては、蛋白質鎖の放出 (export)
を開始するために機能するアミノ酸の配列と定義され
る。シグナル配列は、生長しつつある蛋白質鎖の放出
(export) が開始された後、特定の部位において成熟蛋
白質から切断される。この用語はさらにリーダー配列又
はリーダーペプチドを含む。ここで、好ましい１つのシ
グナル配列は、表１に示されているＴ．リーゼイ由来の
ＣＢＨＩのための推定された配列である。他の１つは表
３に示されるＴ．リーゼイ由来のＥＧＩのためのそれで
ある。

【００３５】「機能的に連結された (operably linke
d)」なる語は、系の構成成分の活性が維持される態様に
おける遺伝子要素の、及び制御配列についての並置(jux
taposition) について用いる。特に、「制御配列に機能
的に連結されたコード配列」なる語は、コード配列が適
当な宿主中で発現されるような配置を意味する。与えら
れた制御配列は、その効率に関して極大化され得るであ
ろうが、「適切な制御配列に機能的に連結された」なる
語は、単に、ある有用なレベルの発現をもたらすために
十分な制御配列効率が用いられ得ることを意味する。

【００３６】「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、
及び「宿主細胞」なる語は相互交換可能に使用され、そ
して文脈からそうでないことが明らかでない限り、最も
一般的な場合を意味する。他のベクターの「誘導体」で
あるベクターは、「誘導体」ベクターの合成に導く一連
の段階において親ベクターが用いられたことを意味す
る。

【００３７】Ｂ．一般的記載 Ｂ．１ ．組換セルラーゼの製造 一般に、以下に説明する方法において、組換形セルラー
ゼ酵素の製造は次の段階を含む。 （１）成熟セルラーゼ蛋白質、融合形の蛋白質、又は切
除され得る形もしくは回収され得る形のリーダー配列に
より先行されている蛋白質のための、イントロンによっ
て中断されていないコード配列を得； （２）セルラーゼコード配列を、段階（１）に従ってイ
ントロンを除去する前又は除去した後に、複製可能な発
現ベクターの適切な制御配列と機能的に連結し； （３）こうして形成した発現ベクターを適切な宿主に形
質転換し；

【００３８】（４）形質転換された宿主を、組換セルラ
ーゼ酵素の生産を行うために好都合な条件下で培養し；
そして、 （５）場合によっては、培地又は細胞からセルラーゼを
回収する。セルロースの分解のためにセルラーゼ活性を
用いるためには、酵素の回収は実際に必要ないであろ
う。確かに、セルロースの分解のために組換セルラーゼ
を用いることに関するこの発明の方法の１つの態様にお
いては、セルロースが培養細胞にその場で加えられ、そ
してセルロースの分解のために増殖中の細胞培養物又は
休止細胞培養物が用いられるであろう。

【００３９】前記の各段階は種々の方法で行うことがで
きる。例えば、目的とするコード配列は、細胞メッセン
ジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から適切なｃＤＮＡを調製
し、そして該ｃＤＮＡを操作して完全配列を得ることに
よって得られる。この方法に代えて、後に記載するよう
な種々の方法に従ってゲノム断片を操作して同定された
イントロン領域を除去することができよう。配列の部分
が、公知の化学的合成技法の範囲に入る程十分に短い場
合には、このような配列は個々のヌクレオチド出発材料
から化学合成により調製することができる。確かに、こ
の方法によって得られる配列の長さは、オリゴヌクレオ
チド合成技術の今日の状況に全く依存する。

【００４０】セルラーゼ酵素に対応するコード配列をゲ
ノムライブラリーから再構成するために特に有用な方法
をこの明細書において証明する。セルラーゼ複合体の高
生産体、例えば誘導されたＴ．リーゼイＬ２７の核ＤＮ
Ａからファージ中に調製されたゲノムライブラリーは、
目的酵素すべてのコード配列を含有する。目的とする各
酵素について、精製された天然形を用いて抗体を得る。
この抗体を用いて、適切に免疫沈澱する蛋白質を試験管
内翻訳系において合成し得る濃縮されたｍＲＮＡ画分を
同定する。

【００４１】同定されたｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡプロ
ーブを生成せしめ、こんどはこのプローブを用いてライ
ブラリーから目的とする遺伝子又は遺伝子部分を同定す
る。プローブで同定された遺伝子において、さらに変形
を行うことができる。便利には、適当な制限部位が天然
に存在しない場合には、これをコード配列の末端に付加
して切出し可能な遺伝子セグメントを得、次にこれを適
切な制御配列に隣接して発現ベクター中に導入すること
ができる。

【００４２】この方法に代えて、遺伝子又はその部分を
すでに含有するベクターに制御配列を導入することもで
きる。制御配列、発現ベクター、及び形質転換方法は、
遺伝子の発現に使用される宿主細胞のタイプに依存す
る。一般に、現在のところ宿主として、原核生物細胞、
酵母細胞、又は哺乳動物細胞が有用である。適当な制御
配列及び技法は、下記に概略を記載するように、宿主の
選択に依存するであろう。

【００４３】Ｂ．１．ａ．制御配列 原核生物は、最もしばしばＥ．コリ（E.coli）の種々の
菌株によって代表される。しかしながら、他の微生物菌
株、例えばバシルス、例えばバシルス・ズブチリス（Ba
cillus subtilis）、シュードモナス（Pseudomonas )
の色々な種、又は他の細菌株を使用することもできる。
これらの原核生物系において、宿主と適合する菌株に由
来する複製部位及び制御配列を含有するプラスミドベク
ターが使用される。例えば、Ｅ．コリは、 Bolivar等、
Gene（１９７７）２：９５によってＥ．コリ種から得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２２の誘導体を用いて、典型的
に形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及び
テトラサイクリン耐性遺伝子を含有し、そしてこれらの
マーカーは所望のベクターの造成において維持され、又
は破壊される。

【００４４】リボゾーム結合部位配列と共に、場合によ
ってはオペレーターを伴う、転写開始のためのプロモー
ターを含有するものとしてこの明細書において定義され
る一般に使用される原核生物制御配列は、β−ラクタマ
ーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーター系及びラクトース
（ｌａｃ）プロモーター系〔 Chang等、Nature（１９７
７）１９８：１０５６〕、並びにトリプトファン（ｔｒ
ｐ）プロモーター系〔Goeddel等、Nucleic Acid Res.
（１９８０）８：４０５７〕のごとき一般に使用される
プロモーターを含有する。

【００４５】１９８４年２月８日に出願された米国特許
出願第５７８，１３３号に記載されているような、ポー
タブル制御カセットとして有用にされている、λ−由来
ＰＬプロモーター及びＮ−遺伝子リボゾーム結合部位
〔シマタケ等、Nature（１９８１）２９２：１２８〕が
他の１例である。しかしながら、原核生物に適合性の任
意の入手し得るプロモーター系を使用することができ
る。

【００４６】細菌のほかに、真核性微生物、例えば酵母
も宿主として使用することができる。パン酵母であるサ
ッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisi
ae）の実験室株が最も頻繁に使用されるが、他の多くの
菌株も一般に使用し得る。２ミクロン複製開始点を用い
るベクターが記載されている〔 Broach,J.R., Meth.En
z. （１９８３）１０１：３０７〕が、酵母での発現の
ために適当な他のプラスミドベクター〔例えば、Stinch
comb等、Nature（１９７９）２８２：３９；Tschempe
等、Gene（１９８０）１０：１５７；及び Clarke,L.
等、Meth.Enz. （１９８３）１０１：３００を参照のこ
と〕が知られている。

【００４７】酵母ベクターのための制御配列は、解糖系
酵素の合成のためのプロモーター〔Hess等、J.Adv.Enzy
me Reg. （１９６８）７：１４９； Holland等、Bioche
mistry（１９７８）１７：４９００〕を含む。当業界に
おいて知られている他のプロモーターは３−ホスホグリ
セレートキナーゼのためのプロモーター〔Hitzeman等、
J.Biol.Chem.（１９８０）２５５：２０７３〕、並びに
他の解糖系酵素、例えばグリセロアルデヒド−３−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベー
トデカルボキシダーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グル
コース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグ
リセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオース
ホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラ
ーゼ、及びグルコキナーゼのそれを包含する。

【００４８】増殖条件により制御される転写の追加の利
点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、
窒素代謝に関連する分解酵素、並びにマルトース及びガ
ラクトース利用のために必要な酵素のためのプロモータ
ー領域である（Holland 、前掲) 。

【００４９】ターミネーター配列がコード配列の３′末
端において望ましいことが示唆されている。このような
ターミネーターは、酵母由来遺伝子においてコード配列
に続く３′非翻訳領域中に見出される。記載されている
ベクターの多くは、エノラーゼ−Ｉ遺伝子含有プラスミ
ドｐｅｎｏ４６〔Holland,M.J.等、J.Biol.Chem.（１９
８１）２５６：１３８５〕由来の制御配列、又はＹＥｐ
１３から得られるＬＥＵ２遺伝子〔 Broach,J.等、Gene
（１９７９）８：１２１〕由来の制御配列を含有する
が、しかしながら、酵母適合性のプロモーター、複製開
始点及び他の制御配列を含有する任意のベクターを使用
することができる。

【００５０】多細胞生物由来の真核性宿主細胞培養物に
おいて、ポリペプチドをコードする遺伝子を発現せしめ
ることが可能なことも言うまでもない。例えば、Tissue
Cultures 、アカデミックプレス、Cruz及びPatterson
編（１９７３）を参照のこと。有用な宿主細胞系にはＶ
ＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞、並びにチャイニーズハムスタ
ー卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。

【００５１】これらの細胞のための発現ベクターには一
般に、哺乳動物細胞との適合性を有するプロモーター及
び制御配列、例えばシミアンウイルス (Simian Virus)
４０（ＳＶ４０）〔 Fiers等、Nature（１９７８）２７
３：１１３〕由来の一般に使用される初期及び後期プロ
モーター、又は他のウイルス性プロモーター、例えばポ
リオーマウイルス、アデノウイルス２、牛乳頭腫ウイル
ス、もしくは鳥類肉腫ウイルス由来のプロモーターが含
まれる。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的観点は、
１９８３年８月１６日に与えられたAxelの米国特許第
４，３９９，２１６号に記載されている。「エンハンサ
ー (enhancer) 」領域が発現の最適化において重要なこ
とが、今や明らかであり、この領域は一般に、プロモー
ター領域の上流に見出される配列である。必要であれ
ば、複製開始点がウイルスから得られるであろう。

【００５２】しかしながら、染色体への遺伝子組込み
は、真核生物におけるＤＮＡ複製の共通の機作であり、
従って独立して複製するベクターは必要でない。今や、
植物細胞も宿主として用いることが出来、そして植物細
胞に適合性の制御配列、例えばノパリン (nopaline) 合
成プロモーター、及びポリアデニル化シグナル配列〔 D
epicker,A.等、J.Mol.Appl.Gen. （１９８２）１：５６
１〕が使用可能である。

【００５３】Ｂ．１．ｂ．形質転換 使用する宿主細胞に依存して、形質転換は、その細胞に
適する標準的技法を用いて行う。Cohen,S.N., Proc.Nat
l.Acad.Sci.(USA)（１９７２）６９：２１１０により記
載された、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理法
が、原核生物細胞、又は実質的な細胞壁障壁を有する他
の細胞のために用いられる。

【００５４】ある種の植物細胞については、アグロバク
テリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumef
aciens) を用いる感染〔 Shaw,C.H.等、Gene（１９８
３）２３：３１５〕が用いられる。細胞壁を有しない哺
乳動物細胞については、Graham及びvan der Eb, Virolo
gy（１９７８）５２：５４６の燐酸カルシウム沈澱法が
好ましい。酵母への形質転換は Van Solingen,P.等、J.
Bact. （１９７７）１３０：９４６；及びHsiao,C.L.
等、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)（１９７９）７６：３８
２９の方法に従って行われる。

【００５５】要約すれば、ＹＥＰＤ富化培地（酵母エキ
ストラクト、ペプトン、及び４％グルコース）中に対数
中期まで増殖した酵母培養物を洗浄し、そしてソルビト
ール燐酸緩衝液中リゾチーム５０００（マイルスラボラ
トリーズ）を用いてプロトプラスト化する。プロトプラ
ストを洗浄し、１Ｍソルビトール含有６７％ＹＥＰＤ中
に室温にて１時間放置し、そしてペレット化し、そして
トリス−ソルビトール−塩化カルシウム緩衝液中に２×
１０⁹ プロトプラスト／mlに懸濁する。プロトプラスト
を、１００μｌの反応混合物中、形質転換用ＤＮＡ ５
〜１０μｇと混合し、次に１mlの４４％ＰＥＧを加え、
そしてこの混合物を室温にて４０分間放置する。この方
法の代りに、 Klebe等〔Gene（１９８３）２５：３３
３〕の方法を使用することもできる。

【００５６】Ｂ．１．ｃ．ベクターの構成 所望のコード配列及び制御配列を含有する適当なベクタ
ーの構成においては、当業界においてよく理解される標
準的連結（ligation) 技法及び制限(restriction) 技法
が用いられる。分離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、又
は合成されたオリゴデオキシリボヌクレオチドを切断
(cleave) し、接続 (tailor) され、そして所望の形に
再連結 (religate) する。

【００５７】部位特異的ＤＮＡ切断は、当業界において
一般に理解される条件のもとで適切な制限酵素（１種又
は複数種）を用いる処理によって行われ、この方法の詳
細は、これらの市販制限酵素の製造者により特定されて
いる。例えば、ニューイングランドビオラブス(New Eng
land Biolabs) の商品カタログを参照のこと。一般に、
約１μｇのプラスミド又はＤＮＡ配列を約２０μｌの緩
衝液中で１ユニットの酵素により切断する。

【００５８】この明細書に記載する例においては、ＤＮ
Ａ基質の完全な消化を保証するために過剰の制限酵素を
使用する。約３７℃における約１〜２時間のインキュベ
ーション時間が有効であるが、変法を用いることもでき
る。各インキュベーションの後、フェノール／クロロホ
ルムによる抽出によって蛋白質を除去し、そしてさらに
エーテル抽出することもでき、そしてエタノール沈澱に
より核酸を水相から取り出し、次にセファデックスＧ−
５０スピンカラムに通す。所望により、標準的方法を用
いながら、ポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル
により切断された断片のサイズ分離を行う。サイズ分離
の一般的記載はMethods in Enzymology（１９８０）６
５：４９９−５６０に見られる。

【００５９】制限切断された断片は、Ｅ．コリＤＮＡポ
リメラーゼＩの大断片（Klenow断片）による処理によっ
て、４種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェート
（ｄＮＴＰ）の存在下で、約１５〜２５分間のインキュ
ベーション時間、２０〜２５℃にて、５０mM Ｔｒｉｓ
−Ｃｌ（pH７．６，５０mM ＮａＣｌ，６mM ＭｇＣｌ
₂ ，６mM ＤＴＴ、及び５〜１０μＭ ｄＮＴＰ）中
で、平滑末端化することができる。Klenow断片は、５′
接着末端を満たす(fill inする）が、４種類のｄＮＴＰ
が存在しても３′単鎖を切り取る(chew backする) 。

【００６０】所望により、接着末端の種類により指令さ
れる限界内で選択された１種又は複数種のｄＮＴＰのみ
を供給することにより、選択的補修 (selective repai
r) を行うことができる。Klenow断片で処理した後、混
合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール
沈澱を行い、次にセファデックスＧ−５０スピンカラム
に通す。適当な条件下でＳ１ヌクレアーゼにより処理す
ることによって、任意の単鎖部分の加水分解を行う。

【００６１】合成オリゴヌクレオチドは、 Matteucciの
トリエステル法〔J.Am.Chem.Soc.（１９８１）１０３：
３１８５−３１９１〕、又は Caruthersのジメチルホス
ホラミド法（１９８３年１１月１５日に与えられた米国
特許第４，４１５，７３２号に記載されている）により
調製することができる。

【００６２】アニーリングに先立つ、又は放射性標識付
与（radio-labeling) のための、単鎖のキナーゼ処理
は、過剰のポリヌクレオチドキナーゼ、例えば５０mM
Ｔｒｉｓ〔pH７．６，１０mM ＭｇＣｌ₂ ，５mMジチオ
スレイトール、１〜２mM ＡＴＰ，１．７ｐモルγ３２
Ｐ−ＡＴＰ（２．９ mCi／ｍモル）、０．１mMスペルミ
ジン、及び０．１mM ＥＤＴＡ〕中１ｎモルの基質に対
して約１０ユニットのキナーゼを用いて達成される。

【００６３】連結 (ligation) は典型的には、１０〜３
０μｌの体積中で、次の条件及び温度のもとで行われ
る。２０mM Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，pH７．５，１０mM Ｍｇ
Ｃｌ₂，１０mM ＤＴＴ，３３μｇ／ml ＢＳＡ，１０m
M〜５０mM ＮａＣｌ、及び４０μＭ ＡＴＰ，０．０
１〜０．０２(Weiss) ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼ、０
℃（接着末端の連結のため）、又は１mM ＡＴＰ，０．
３〜０．６(Weiss) ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼ、１４
℃（平滑末端の連結のため）のいずれか。分子間「接着
末端」連結は通常３３〜１００μｇ／mlの全ＤＮＡ濃度
（５〜１００nM全最終濃度）において行われる。分子間
平滑末端連結（通常、１０〜３０モル倍の過剰のリンカ
ーを用いる）は典型的には約１μＭの全最終濃度におい
て行われる。

【００６４】「ベクター断片」を用いるベクターの造成
において、ベクター断片は一般に、５′燐酸を除去する
ため、及びベクターの再連結を防止するために、細菌ア
ルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理する。ＢＡＰ消
化は、典型的には、約８のpHにおいて、約１５０mM Ｔ
ｒｉｓ中で、Ｎａ⁺ 及びＭｇ⁺⁺の存在下で、ベクターμ
ｇ当り約１ユニットのＢＡＰを用いて、６０℃にて１時
間行う。核酸断片を回収するために、調製物をフェノー
ル／クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱を行
い、そしてセファデックスＧ−５０スピンカラムに適用
することによって脱塩する。この方法に代えて、不所望
の断片の追加の制限酵素消化により、二重消化されたベ
クターにおいて、再連結を防止することができる。

【００６５】Ｂ．１．ｄ．構成の確認 下記の構成において、プラスミド造成のための正しい連
結はまず、Ｅ．コリGenetic Stock Center, ＣＧＳＣ＃
６１３５から得られるＥ．コリＭＭ２９４株、又は他の
適当な宿主を連結混合物により形質転換することにより
確認される。形質転換に成功した細胞はアンピシリン、
テトラサイクリン又は他の抗生物質耐性により、又は当
業界において理解されるように、プラスミドの造成方法
に依存して他のマーカーを用いて選択する。

【００６６】次に、形質転換体からのプラスミドは、Cl
ewell,D.B.等、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)（１９６９）
６２：１１５９の方法に従って、そして場合によっては
次にクロラムフェニコール増幅〔Clewell,D.B., J.Bact
eriol.（１９７２）１１０：６６７〕することにより調
製する。分離されたＤＮＡは、制限処理し、そして／又
は Sanger,F.等、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)（１９７
７）７４：５４６３のジデオキシ法〔さらに、 Messing
等、Nucleic Acids Res. (１９８１）９：３０９に記載
されている〕、もしくは Maxam等、Methods in Enzymol
ogy （１９８０）６５：４９９の方法により配列決定す
る。

【００６７】Ｂ．１．ｅ．部位特定変異誘発（Site Spe
cific Mutagenesis ) オリゴヌクレオチド誘導変異は、所望の変異を代表する
限定された不一致（mismaching) のほかは変異を受ける
べき１本鎖ファージＤＮＡに相補的なプライマー合成オ
リゴヌクレオチドを用いて行う。簡単に記載すれば、プ
ライマーとして合成オリゴヌクレオチドを用いてファー
ジに相補的な鎖の合成を指令し、そして得られた二重鎖
ＤＮＡをファージ担持性宿主細菌に形質転換する。形質
転換された細菌の培養物を寒天にプレートし、ファージ
を含有する単一細胞からプラークを形成せしめる。

【００６８】理論的には、５０％の新コロニーが単鎖と
して変異形を有するファージを含有し、５０％がもとの
配列を有するであろう。得られたプラークを、完全に一
致するものとはハイブリド形成するが、もとの鎖を伴う
不一致のものとはハイブリド形成しない温度において、
キナーゼ処理された合成プライマーとハイブリド形成せ
しめる。次にプローブとハイブリド形成するプラークを
拾い上げ、培養し、そしてＤＮＡを回収する。部位特定
変異法の詳細は、後の具体的な例に記載する。

【００６９】Ｂ．１．ｆ．宿主の例 この発明において、クローニング及び発現のために使用
する宿主菌株は次の通りである。クローニング及び配列
決定のため、並びにほとんどの細菌プロモーターの制御
のもとでの造成物の発現のために、Ｅ．コリＭＭ２９４
株（前掲）、 Talmadge,K.等、Gene（１９８０）１２：
２３５； Meselson,M.等、Nature（１９６８）２１７：
１１００を宿主として使用した。

【００７０】Ｍ１３ファージ組換体のために、ファージ
感染に感受性のＥ．コリ株、例えばＥ．コリＫ１２／Ｄ
Ｇ９８株を使用する。ＤＧ９８株はＡＴＣＣに寄託され
ており、寄託番号３９７６８を有する。酵母での発現の
ために、Ｓ．セレビシエーの実験室株：ＡＴＣＣから得
られるＣ４６８（α，ｈｉｓ４^- ，ｌｅｕ２^- ，ｍａｌ
^- ）株（寄託番号２０，６９０）、及びニューヨーク，
ロチェスター大学，Fred Sherman教授から入手できるＳ
１７３−６Ｂ（ｔｒｐ１^- ，ｌｅｕ２^- ，ｕｒａ３^- ，
ｈｉｓ４^- ）株を用いる。

【００７１】Ｂ．２．組換酵素の用途 組換セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、及び
β−グルコシダーゼは、むろん、対応する酵素の天然形
と同じ用途に、そして同じ条件下で使用することができ
る。組換形は、単独で、又は制御された組合わせにおい
て比較的多量に得られ、そしてそれらの性質を強化する
ために、コード配列の遺伝的操作により、又は最適の翻
訳後プロセシング特性を有する宿主を選択することによ
り適当な変形が加えられるという利点を有する。組換酵
素は、新規な宿主において生産される場合、該宿主にお
いて新規な基質を利用し及び／又は変形する能力を付与
する。

【００７２】組換セルラーゼ酵素の各々は、生体外にお
いて、溶液として又は固定化された形で、セルロース、
又は問題の酵素にとって望ましいように又はそれと適合
するように変形された他の基質の完全加水分解又は制御
された加水分解においてその役割を演ずるように用いる
ことができる。この発明の酵素は、単独で、又は相互に
組合わせて、もしくは他の適当な触媒と組合わせて使用
することができる。不溶性のセルロース基質の効率的な
加水分解のためには、少なくとも１種類のエンドグルカ
ナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びβ−グルコシダー
ゼの組合せを用いるのが好ましい。再び、これらは溶解
した形又は固定化された形で用いることができ、あるい
は同一の又は異る形質転換宿主により得ることができ
る。

【００７３】例えば、セルロース複合体の各酵素の遺伝
子を含有する複数の発現プラスミドにより、又はこれら
の酵素の各々のための複数の発現モジュールを含有する
１種類の発現プラスミドにより酵素宿主を形質転換する
ことは、この発明の範囲である。最近、酵母の若干の種
が本来的にβ−グルコシダーゼを生産することが知られ
ており、そしてセルラーゼ複合体の他の酵素を本来的に
生産する他の種を見出すことが出来よう。このような宿
主菌株については、セルラーゼ複合体の欠けている構成
員を適当な発現ベクターの形で供給することだけが必要
であろう。

【００７４】さらに、この発明の組換酵素の用途は、セ
ルロースからのグルコースの製造に限定されない。コー
ヒー豆の障害ポリサッカライドを加水分解することによ
り凍結乾燥コーヒーの製造を促進するためにＥＧIIの特
異性が有利に使用されることはすでに述べた。ＣＢＨ
は、１，４−β，Ｄ−グルカン結合に対する高い特異性
を有するために、価値ある研究の道具であり、従って、
ポリサッカライド標品中のこの結合の存否を確認するた
めの手段を提供する。

【００７５】確かに、ある状況においては、セロビオー
スの純粋な標品を特異的に得ることが望ましく、そして
このためにはＣＢＨＩが単独で有用であろう。ＣＢＨＩ
セロビオヒドロラーゼのみを生産するためにセルラーゼ
生産菌を操作する方法は、前に概略記載した。最後に、
工業的酵母菌株が、適当な優性選択マーカーを有するベ
クターを与えることによって簡単にセルラーゼ複合体の
１又は複数の構成成分について形質転換されるであろ
う。The Molecular Biology of Yeast, Cold Spring Ha
rbor Meeting, １９８３年８月１６〜２１日を参照のこ
と。

【００７６】Ｂ．３．組換遺伝子酵母ベクター 下に記載するように、この発明に従って造成された組換
ベクターは、分泌される、グリコシル化された、生物学
的に活性なセルラーゼの酵母中での効率的な生産をもた
らす。酵母における外来性組換セルラーゼの生産のため
に重要なベクターの構造的特徴は、（１）酵母プロモー
ター配列；（２）該プロモーターにリンクされたセルラ
ーゼ酵素シグナル配列；及び（３）生産されるべき成熟
セルラーゼのコード領域を含む。さらに、例示する組換
ベクターはセルラーゼコード領域の３′末端に酵母ター
ミネーターを含有する。

【００７７】この発明の観点に従えば、セルラーゼ遺伝
子を含有する酵母ベクターは、常用の組換技法により、
（１）上記の酵母プロモーター；（２）セルラーゼ酵素
シグナル配列；及び（３）該シグナル配列の３′末端又
は隣接するセルラーゼコード領域中に、外来性遺伝子を
導入することができるための適当な制限部位；を含有す
るように変形することができる。この外来性遺伝子は他
のセルラーゼ、又は関連性のない蛋白質、例えばアミラ
ーゼ、プロテアーゼ、ペプチドホルモン、又は外来性遺
伝子を好ましくは非中断形として得ることができる他の
多くのペプチドのいずれかをコードするであろう。

【００７８】下のＤ項は、酵母エノラーゼプロモータ
ー、ＣＢＨＩシグナル配列、Ｔ．リーゼイ由来成熟ＣＢ
ＨＩのコード配列及び酵母エノラーゼターミネーターを
含有するｐｅｎｏＣＢＨ５００．２０２と称する例示的
な酵母ベクターを説明する。このベクターは、公知の方
法に従って変形して、ＣＢＨＩコード配列の全部又は一
部分を外来性蛋白質コード配列で置き換えることができ
る。得られたベクターは、酵母における外来性蛋白質の
効率的なプロセシング及び分泌を可能にする。

【００７９】下記のＥ項は、酵母エノラーゼプロモータ
ー、ＥＧＩシグナル配列、Ｔ．リーゼイ由来成熟ＥＧＩ
のコード配列、及び上記のエノラーゼターミネーター配
列を含有するｐＪＶ１６０と称する例示的な酵母ベクタ
ーを説明する。類似の技法を用いることにより、このベ
クターを、酵母における外来性遺伝子生成物の効率的な
プロセシング及び分泌をもたらすために変形することが
できる。

【００８０】Ｃ．Ｔ．リーゼイＬ２７株由来ＥＧＩ及び
ＣＢＨＩのクローニング及び発現 後のＤ項及びＥ項において、この発明の具体例を記載す
る。この具体例においては、Ｔ．リーゼイＬ２７株から
分泌されるＣＢＨＩ及びＥＧＩをコードするそれぞれの
ＤＮＡ配列がクローニングされ、そして発現される。こ
れらの例示的具体例は、この発明を限定するものではな
く、むしろ一般的に、組換セルラーゼ酵素、及び酵母の
ごとき異宿主中でのグリコシル化された、成熟した、酵
素的に活性な菌類性セルラーゼ酵素の生産を可能にする
発現ベクターを得るための例示的で実施可能な方法を記
載するものである。

【００８１】簡単に、且つ要約して記載すれば、２つの
コード配列の好ましい分離源は、ＮＲＲＬに寄託され寄
託番号ＮＲＲＬ＃１５５３８が与えられているＴ．リー
ゼイＬ２７株である。この菌株は、セルラーゼ複合体の
高生産菌として、そしてＴ．リーゼイ由来のＥＧＩ及び
ＣＢＨＩ配列の部分がすでに公表されている（後で言及
する）ために選択した。

【００８２】イントロン不含コード配列を得るためのス
トラテジーは次の通りである。選択された菌類からセル
ロース誘導後にポリ−Ａ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離
し、そしてアガロースゲル電気泳動を用いてサイズ分画
した。誘導された細胞からのｍＲＮＡ画分を含有するゲ
ル（このものは、誘導されていない細胞において比較的
少量のみ存在する、又は存在しない多数のバンドを示し
た）をサイズに従ってスライスし、各スライスを目的と
するｍＲＮＡの存在について試験した。

【００８３】試験は、溶出されたｍＲＮＡを試験管内蛋
白質合成（翻訳）系に加え、そして全蛋白質、及び抗−
ＥＧＩ抗体又は抗−ＣＢＨＩ抗体の存在下で免疫沈澱す
るポリペプチドの両者をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気
泳動することによって合成された蛋白質を分析すること
により実施した。この方法により、各場合において所望
のメッセージが濃縮されているｍＲＮＡ画分を同定する
ことが可能であった。

【００８４】次に、同定されたｍＲＮＡを用いて単鎖コ
ピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得、これを放射性ラベルして
ゲノムライブラリーのプローブとして使用した。このｃ
ＤＮＡはまた、ＥＧＩ遺伝子又はＣＢＨＩ遺伝子のコー
ド配列を含有する断片を含むｃＤＮＡライブラリーを得
るためにも用いた。選択された菌類株からのゲノムＤＮ
Ａライブラリーはλ−ファージ中に調製した。菌類から
の全核ＤＮＡを、１又は複数の選択された制限酵素を用
いて部分消化し、そしてファージベクターに挿入した。
このファージライブラリーはこの菌類セルロース複合体
のすべての酵素をコードするコード配列を含有する。ク
ローニングされた断片は適切な濃縮されたｍＲＮＡ画分
から誘導されたｃＤＮＡを用いて検出した。

【００８５】ＣＢＨＩ又はＥＧＩに特異的なプローブに
相同のファージを同定し、そしてコード配列に対応する
Ｔ．リーゼイＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターに
サブクローニングした。完全ＥＧＩ配列を含有する４kb
ＨｉｎｄIII ゲノム断片、並びに一緒になって完全Ｃ
ＢＨＩ配列をコードする１．１６kb及び２．３kbの隣接
する２個のＨｉｎｄIII ゲノム断片をこの方法により得
た。

【００８６】さらに制限分析及び配列決定を行うことに
より、選択された断片のコード部分の配列を決定した。
遺伝子の配列により、ＣＢＨＩ遺伝子及びＥＧＩ遺伝子
の両方に２個ずつのイントロンを同定した。好ましくは
遺伝子をその発現ベクターに入れる前に、セルラーゼ遺
伝子イントロンを除去する。ＣＢＨＩについては、ｃＤ
ＮＡ断片置換により２個のイントロンを除去した。ＥＧ
Ｉについては、１つのイントロンを、ゲノムＤＮＡの部
分をｃＤＮＡライブラリーから得られたｃＤＮＡクロー
ンの対応する配列で置換することにより除去し、他方の
イントロンは、化学合成プライマーを用いる部位特定変
異誘発により除去した。

【００８７】イントロン不含ＣＢＨＩコード断片を用い
て、酵母を形質転換して機能的に活性なＣＢＨＩを分泌
せしめることができる発現ベクターの造成を行った。Ｅ
ＧＩについては、コード配列の末端を部位特定変異誘発
によって変形して所望の制限部位を挿入してＨｉｎｄII
I カセットとして使用し得る完全コード配列を作った。
このカセットを酵母中で機能し得る発現ベクターにクロ
ーニングし、そしてこれを用いて適当な酵母宿主を形質
転換し、ＥＧＩを生産することができる組換細胞を得
た。

【００８８】同様にして、ＥＧII，ＣＢＨII、並びにβ
−グルコシダーゼ−Ｉ及びβ−グルコシダーゼ−IIのた
めのイントロン不含コード配列を得、適当な宿主ベクタ
ーに導入し、そして所望の宿主、例えば酵母を形質転換
する。確かに、下に記載するのと同様にしてβ−グルコ
シダーゼIIに対する抗体標品を調製し、正しいｍＲＮＡ
画分を同定し、そしてこの酵素のためのｃＤＮＡプロブ
（単鎖）及びクローニングベクターｃＤＮＡライブラリ
ー（二重鎖）を調製した。

【００８９】Ｄ．組換ＣＢＨＩの調製 この項は、イントロン不含セロビオヒドロラーゼ−Ｉ
（ＣＢＨＩ）遺伝子、該遺伝子が組換ＤＮＡ技法によっ
て導入された発現ベクター、これらのベクターにより形
質転換された宿主、及びこうして調製されたＣＢＨＩに
ついて記載する。ＣＢＨＩ遺伝子を選択された菌類から
得る。この菌類は好ましくは、セルロースのごとき誘導
性炭素源に増殖した場合に誘導されたレベルの細胞外セ
ルラーゼ（ＣＢＨＩを含む）を生産することができるも
のである。

【００９０】Ｄ．１．ＣＢＨＩの菌類入手源の選択 この発明において使用するためのＣＢＨＩの菌類入手源
の選択に当っては、ＣＢＨＩ及び対応するｍＲＮＡが、
非誘導性炭素源に増殖した場合の実質上検出不可能な活
性レベルから、セルロースのごとき誘導性炭素源に増殖
した場合の容易に測定し得るレベルに誘導され得るよう
な生物を選択するのが有利である。好ましい菌類にはト
リコデルマ属の種が含まれ、そしてセルロースの存在下
に増殖した場合に誘導される全細胞外セルラーゼの約６
０％までも占める誘導性ＣＢＨＩ酵素を有するＴ．リー
ゼイが最も好ましい。

【００９１】Ｔ．リーゼイの追加の利点は、誘導性セル
ラーゼ系を構成する酵素が比較的よく研究されているこ
とである。特に、Ｔ．リーゼイＣＢＨＩ酵素のアミノ酸
配列の実質的な部分が報告されている〔Fagerstam,L
等、ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ．（１９８０）１１９：９７；
及びFagerstam,L.G., Doctoral Thesis, スゥエーデ
ン, アプサラ大学（１９８１）〕。

【００９２】効率的、且つ大量にＣＢＨＩのｍＲＮＡを
生産する微生物の能力は、コロニー選択技法により、好
ましくは微生物を変異源に暴露した後に、上昇したレベ
ルの１又は複数のセルラーゼを生産することができ、そ
して／又は最大に誘導されたレベルのセルラーゼを短縮
された発酵期間に生産することができる菌株を同定する
ことにより、さらに強化される。本発明の発明者の１人
(Shoemaker) はすでに、商業的に入手できる親株の場合
よりも高い誘導されたレベルのセルラーゼ酵素を生産す
ることができる一群のＴ．リーゼイ変異株を記載してい
る。

【００９３】さらに、後に記載するように、親株の場合
よりも短い酵素誘導期間の後に細胞外セルラーゼの最も
大きな増加が観察された。このタイプのＴ．リーゼイ変
異株を得るための方法の詳細な検討については、Shoema
ker,S.P.等、Trends in theBiology of Fermentation f
or Fuels and Chemicals, Hollaender等編、PlenumPub
lishing Corp.,ニューヨーク, ニューヨーク州（１９８
１）８９頁を参照のこと。

【００９４】ここで記載しようとすることは、Ｌ２７株
と命名された変異株と、この発明において使用するため
の好ましい候補としてのＬ２７株が選択された親株Quar
termaster No. ９４１４（ＱＭ９４１４）との比較特性
である。Ｔ．リーゼイＬ２７株は、ＮＲＲＬ＃１５５３
８としてＮＲＲＬ寄託機関に寄託されている。

【００９５】Ｌ２７株によって一層高いレベルの細胞外
セルラーゼが生産されることにより、この菌株がＱＭ９
４１４株よりも高レベルのセルラーゼｍＲＮＡを生産す
ることが示唆される。この２つの菌株における相対的な
セルラーゼｍＲＮＡレベルを決定するために、セルラー
ゼ誘導条件下で増殖したこれら２菌株のそれぞれに由来
する全ポリＡ ＲＮＡを分離し、そして無細胞蛋白質合
成系に加えてセルラーゼポリペプチドの合成を指令し
た。無細胞蛋白質合成を行うのに使用される一般的方法
は、後のＤ．３項において記載する。

【００９６】各無細胞合成実験において合成されたポリ
ペプチドを、ＣＢＨＩ，ＥＧＩ、又はβ−グルコシダー
ゼのいずれかに対する抗体と免疫沈澱せしめた。免疫沈
澱は、Ｃ．３項に言及したドデシル硫酸ナトリウム−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に
より常法通りに行った。ゲルの特異的蛋白質バンド領域
（示してない）における放射能の相対量により判定した
場合、Ｌ２７株は、三種類の酵素すべてについて高い試
験管内翻訳活性を示し、この菌株は検討された各セルラ
ーゼ成分について高い生体内レベルのｍＲＮＡを生産す
ることが示唆された。

【００９７】上記の実験において、細胞外セルラーゼの
最も大きな増加が観察された時点において、誘導された
培養物から全ポリＡ ＲＮＡを分離した。この誘導時間
はＬ２７株については約１８〜２０時間の間であり、Ｑ
Ｍ９４１４株については約２６〜２８時間の間であっ
た。従って、Ｌ２７株は、誘導されたセルラーゼｍＲＮ
Ａの生産のために相対的に短い時間でよいという追加の
利点をもたらす。ここで、セルラーゼの合成がグルコー
スにより制御される親株ＱＭ９４１４と異り、Ｌ２７株
はセルロース又はグルコースのいずれかに増殖した場合
に誘導されたセルロースレベルを示すことが注目され
る。

【００９８】Ｄ．２．ＣＢＨＩ蛋白質の精製及び抗ＣＢ
ＨＩ抗体の製造 この発明の特徴に従えば、ＣＢＨＩは、抗ＣＢＨＩ抗体
と免疫反応を行うポリペプチドの無細胞蛋白質合成系に
おける合成を指令するその能力によって同定される。抗
体は好ましくは、ＣＢＨＩｍＲＮＡの選択された菌類性
分離源から得られた精製されたＣＢＨＩ酵素に対して生
成せしめる。

【００９９】精製されたＣＢＨＩは、細胞外培養液から
蛋白質を精製するための標準的方法に従って得られる。
典型的には、純粋な酵素が得られるまで、ブロス又は濾
液を１回又は複数回のイオン交換クロマトグラフ段階に
よって画分し、必要であれば分子篩クロマトグラフ段階
により画分する。酵素は精製段階中において、後に記載
するような常用のセルラーゼ測定法、及びＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより測定することができる。

【０１００】例えば、Ｔ．リーゼイＬ２７株からのＣＢ
ＨＩを、ＦＭＣ Ｃｏｒｐ．（ロックフィールド，メリ
ーランド）から得られる８％のアビセル（Avicel) （微
細晶セルロース）に増殖した菌株の８日間培養物から精
製した。発酵液を０．４５ミクロンのマイクロポアフィ
ルターに通すことによって細胞性物質を除去し、次に透
析し、そしてアミコン限外濾過セル（レキシントン，マ
サチューセッツ）を用いて５０mM酢酸ナトリウム緩衝液
（pH５．５）中で濃縮した。

【０１０１】濃縮された細胞外濾液を、ファルマシアフ
ァインケミカルス（スウェーデン，ウプスラ）製ＤＥＡ
Ｅ−セファロースを用いる陰イオン交換クロマトグラフ
ィーにより画分した。カラムを、５０mM酢酸ナトリウム
緩衝液（pH５．０）中０〜３００mM塩化ナトリウムのグ
ラジェントにより溶出した。ＣＢＨＩは約２００mMＮａ
Ｃｌにおいてカラムから溶出した。

【０１０２】酵素を、５０mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH
６．０）中ＤＥＡＥ−セファロースを用いるイオン交換
クロマトグラフィーによりさらに精製した。ＣＢＨＩは
また、０〜３００mM塩化ナトリウムグラジェント中約２
００mM ＮａＣｌにおいてカラムから溶出した。カラム
溶出画分中のＣＢＨＩの存在は、５０mM酢酸ナトリウム
緩衝液（pH４．５）中に１％燐酸膨潤セルロース（ＰＳ
Ｃ）を含有する溶液中で前記画分を４５℃にて３０分間
インキュベートした後における還元糖の存在により同定
した。還元糖の同定は、セロビオースと同様、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により確認した。

【０１０３】エキソ−セロビオヒドロラーゼ測定の詳細
については、Shoemaker,S.P.等、Biochem, Biophys.Act
a （１９７８）５２３：１４７を参照のこと。２回クロ
マトグラフ処理したＣＢＨＩの純度は、垂直スラブ装置
中で不連続緩衝系の変法〔Laemmli,U.K.等、J.Mol.Bio
l. （１９７３）８０：５７５〕を用いて、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより分析した。電気泳動的に分離された蛋白質
はクマーシーブルー (Coomassie Blue) Ｒ２５０で染色
することにより検出した。ゲルは単一の染色バンドを示
し、酵素が実質上純粋であることが示された。この蛋白
質の見かけ分子量を、その移動速度を分子量既知のそれ
と比較することにより、約６６，０００ドルトンである
と算定した。

【０１０４】精製されたＬ２７ＣＢＨＩのアミノ酸組成
及び配列と、Ｔ．リーゼイＱＭ９４１４から得られたＣ
ＢＨＩ酵素のアミノ酸組成及び配列 (Fagerstam,L.等、
前掲；及びFagerstam,L.G.、前掲に開示される）とを比
較した。２つの酵素のアミノ酸組成を次のようにして比
較した。Ｌ２７株由来の精製されたＣＢＨＩを、 Watt,
K.W.等、Proc.Nat.Acad.Sci.USA （１９７８）７５：１
７３１に記載されているように、６mMグアニジン中ジチ
オスレイトール（０．０２mM）により還元し、そしてヨ
ウド〔¹⁴Ｃ〕酢酸でカルボキシメチル化した。還元され
そしてカルボキシメチル化されたＣＢＨＩのアミノ酸分
析は、４０μｇの蛋白質を５．７Ｎ ＨＣｌ中０．１％
フェノールにより、１０８℃にて２４，４８及び７２時
間、真空中で加水分解することにより行った。

【０１０５】加水分解物中のアミノ酸を、 Spinco mode
l １２１ ＭＢ Amino Acid Analyzer (Beckman Instru
ments, Inc. パロアルト, カリホルニア）を用いて定量
した。トリプトファンは、５．７Ｎ ＨＣｌ中１０％メ
ルカプト酢酸を用いる別の酸分解物から測定した。Ｌ２
７株ＣＢＨＩについて得られたアミノ酸組成は、Ｔ．リ
ーゼイＱＭ９４１４由来のＣＢＨＩの公表されているア
ミノ酸組成とほとんど同一であった。

【０１０６】成熟ＣＢＨＩ酵素の最初の３７Ｎ−端アミ
ノ酸を含む、Ｌ２７株酵素のＮ−端部分を配列決定し、
そしてＴ．リーゼイＱＭ９４１４由来のすでに配列決定
されたＣＢＨＩ蛋白質の対応する部分と比較した。精製
されたＬ２７株ＣＢＨＩ ４０〜５０ｎモルを用いる自
動アミノ酸配列決定を、スピンニング・カップ・シーケ
ンサー（コールドトラップを用いて変形したモデル８９
０ｃ， Beckman Instruments, Inc., パロアルト, カリ
ホルニア）を用いて実施した。

【０１０７】Ｔ．リーゼイＬ２７株ＣＢＨＩは、ピログ
ルタミル残基によりアミノ末端においてブロックされて
いる。 Podell,D.N.等、Biochem.Biophys.Res.Commun.
（１９７８）８１：１７６に記載されているように、牛
肝臓ピログルタメートペプチダーゼ(Boehringer Bioche
micals) を用いて蛋白質を処理することにより前記の残
基を除去す。ペプチダーゼ処理の後、酵素を濾過し、凍
結乾燥し、ジチオスレイトールで還元し、そしてヨウド
〔¹⁴Ｃ〕酢酸を用いてカルボキシメチル化し、そして配
列分析に直接使用した。

【０１０８】プローリン残基がアミノ末端であると決定
された場合、すべての新しく生成したアミノ末端をブロ
ックすることにより配列分析中のバックグラウンドの一
時的還元を達成した。シーケンサーからの分解生成物の
同定は完全に自動化されたＨＰＬＣ系のアミノ酸アナラ
イザー(Waters Associates) により行った。この方法に
より決定された部分配列は、３７アミノ酸中３６アミノ
酸において、Ｔ．リーゼイＱＭ９４１４由来の成熟ＣＢ
ＨＩの最初の３７アミノ酸の公表されている配列と同一
であり、アミノ酸組成データと相俟って、Ｌ２７株ＣＢ
ＨＩはＱＭ９４１４ＣＢＨＩと同一であるか、又はほと
んど同一であることが確認された。

【０１０９】精製された蛋白質を、常法により抗ＣＢＨ
Ｉ抗体を生成せしめるために用いる。得られた抗体を、
エキソ−セロビオヒドロラーゼ酵素活性を中和する能
力、及び誘導されたセルラーゼ酵素の混合物からＣＢＨ
Ｉを特異的に免疫沈澱せしめる能力について試験する。
Ｔ．リーゼイＬ２７株由来の精製されたＣＢＨＩに対す
る抗体を調製するために、該精製された酵素をフロイン
ドのアジュバントと混合し、そして０．２〜０．４mlの
混合物をニュージーランドホワイトラビットに筋肉内注
射した。注射は、１０日毎に、抗体価が Ouchterlony,
O. Arkiv Kemi. （１９４９）１：４３の二重免疫拡散
法により検出されるまで反復した。

【０１１０】製造された抗−ＣＢＨＩ抗体は精製された
ＣＢＨＩのエキソ−セロビオヒドロラーゼ酵素活性を中
和することができた。 Ouchterlony免疫拡散分析は、上
記のＣＢＨＩ標品に対して調製された抗体がＣＢＨＩ酵
素及びＥＧＩ酵素の両者に対して免疫反応性であること
を示した。

【０１１１】Ｄ．３．ＣＢＨＩｍＲＮＡについて濃縮さ
れたｍＲＮＡの調製 ＣＢＨＩの好ましい分離源、例えばＴ．リーゼイＬ２７
株は、セルラーゼ誘導条件下で増殖した場合、非誘導培
養においては実質上検出することができないＣＢＨＩｍ
ＲＮＡを含有する。このｍＲＮＡは、無細胞蛋白質合成
系において、同じ微生物源から精製されたＣＢＨＩ蛋白
質に対して調製された抗体と免疫反応するポリペプチド
の合成を指令することができる。

【０１１２】ＣＢＨＩｍＲＮＡについて濃縮されたＲＮ
Ａ画分を得るために、誘導培養から分離された全ポリＡ
ＲＮＡを、例えばゲル電気泳動によりサイズ画分す
る。誘導された微生物源及び非誘導微生物源からのポリ
Ａ ＲＮＡを並行して画分し、これら２つのポリＡ Ｒ
ＮＡ標品のゲル電気泳動パターンを比較することができ
る。

【０１１３】ＣＢＨＩｍＲＮＡが最も濃縮されたｍＲＮ
Ａ画分を同定するために、画分されたポリＡ ＲＮＡの
種々のサイズ画分を、無細胞合成系において、抗−ＣＢ
ＨＩ抗血清と共に免疫沈澱し得るポリペプチドの合成を
指令するそれらの能力について試験する。説明により、
Ｔ．リーゼイＬ２７株由来のＣＢＨＩｍＲＮＡが濃縮さ
れたｍＲＮＡ画分を調製する方法を、ここに記載する。

【０１１４】アビセル(Avicel)（１８時間）又はグリセ
リン（４８時間）に増殖した対数中期のＴ．リーゼイＬ
２７株を収得し、そして液体窒素中で凍結した。グリセ
リンに増殖した培養物は４８時間の増殖期間中に測定し
得る細胞外ＣＢＨＩ活性を示さなかった。これらの培養
物から、 Chirgwin,J.M.等、Biochem.（１９７９）１
８：５２９４に記載されている方法の変法を用いて、全
細胞ＲＮＡを分離した。

【０１１５】簡単に記載すれば、凍結した細胞を、４．
７Ｍグアニジンチオシアナート及び１２mMアデノシン：
ＶＯＳＯ₄ 複合体（ＲＮアーゼ阻害剤）中でホモジナイ
ズした。ＲＮＡを超遠心分離によりＣｓＣｌクッション
を通してペレット化し、そしてオリゴｄＴクロマトグラ
フィーによりポリＡ ＲＮＡを分離した。誘導された培
養物及び非誘導培養物からのポリＡ ＲＮＡを、 Marin
e Colloids（ニューヨーク）から得られる標準Ｓｅａ
Ｋｅｍアガロースを用いて公知の方法に従って、メチル
水銀アガロースゲル上で画分した。

【０１１６】図１は、アビセル（レーン１）又はグリセ
リン（レーン２）に増殖したＴ．リーゼイＬ２７株由来
のポリＡ ＲＮＡの電気泳動パターンを示す。２つのゲ
ルパターンの比較により、誘導された培養物に特異的で
あるか、又はこれに高濃度で存在する複数のＲＮＡバン
ドが示される。２３Ｓ ＲＮＡに対応するＲＮＡサイズ
領域をこの図の左側に示す。

【０１１７】誘導されたＲＮＡを含有するゲルを、ゲル
の２３Ｓ ＲＮＡ領域から出発して低分子量ＲＮＡの方
向に向って（図におけるゲルの下方に向って）２mm間隔
で細断した。ゲルスライスからＲＮＡを遊離せしめるた
めに、各スライスを、０．１Ｍ ＮａＣｌ，０．０１Ｍ
ＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳを含有する０．０１ＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH７．５）中で９５℃にて５分
間溶融した。アガロースを遠心分離によりペレット化し
た。上清液をフェノール／クロロホルム抽出した後、エ
タノールによりＲＮＡを沈澱せしめ、そして水に溶解し
た。

【０１１８】ゲルスライスから得られた各ＲＮＡ画分の
少量を無細胞蛋白質合成系、詳しくは New England Nuc
lear Company（ボストン，マサチューセッツ）から入手
した、網状赤血球溶解物／メチオニンＬ−〔³⁵Ｓ〕−翻
訳系として販売された網状赤血球溶解物(reticulocyte
lysate) キットに加えた。 Pelham,R.B.等、Europ.J.Bi
ochem.（１９７９）６７：２４７は典型的な網状赤血球
溶解物系を記載している。

【０１１９】規定された反応時間の後、溶解物 (lysat
e) のアリコートを取り出し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により分析した。全溶解物、又は溶解物に抗−ＣＢＨＩ
抗体を加えることにより生成した免疫沈澱物を分析し
た。免疫反応生成物は本質上常法に従って沈澱せしめ
た。

【０１２０】得られたゲル電気泳動パターンを選択して
図２に示す。この図に示される１０００ドルトン単位の
分子量を、図中左のレーンのマーカー蛋白質の位置によ
り示す。誘導された全ポリＡ ＲＮＡを翻訳系に供給す
ることによって生成した全リゼート (lysate) 蛋白質の
電気泳動パターンをレーン１に示す。レーン２は、これ
らのペプチドと抗−ＣＢＨＩの免疫沈澱物の加水分解物
を用いた同様のパターンを示す。図から明らかな通り、
レーン２のパターンは、ＣＢＨＩの予想される見かけ分
子量である約６６，０００ドルトンの分子量範囲におけ
る単一の比較的広いバンドから成る。

【０１２１】前に記載したように、Ｔ．リーゼイＣＢＨ
Ｉに対して調製された抗体はＴ．リーゼイＥＧＩと交差
反応を行うから、レーン２中の広い６６，０００分子量
バンドの少なくとも一部分はエンドグルカナーゼポリペ
プチドの合成によるものである可能性が生ずる。精製さ
れたＥＧＩは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した場合、
ＣＢＨＩから区別され、そして低い分子量を示す蛋白質
バンドを与えるという事実は、この可能性に反対する。

【０１２２】また、ＣＢＨＩ酵素は、ポリＡ ＲＮＡが
分離された時点において菌類培養物中で誘導される全セ
ルラーゼの約６０％を占めるから、ＣＢＨＩポリペプチ
ド合成は、翻訳系において生ずる全ペプチド合成の大部
分を占めることが期待される。これに対して、ＥＧＩは
全セルラーゼの約５％を占めるに過ぎない。

【０１２３】逐次的ゲルスライスから得られたサイズ画
分されたＲＮＡを用いて、翻訳系において放射性ポリペ
プチドの合成を指令した。ゲルスライス＃９（２３Ｓ
ＲＮＡバンドにおける最初のゲル切断点から約１８mmに
位置するスライス）は、レーン３に見られる全翻訳系生
成ポリペプチドパターンを与えた。このパターンは４
６，０００〜６７，０００ドルトンの分子量範囲に複数
の蛋白質の集中を有する。抗−ＣＢＨＩ抗体を加えるこ
とによって生成した免疫沈澱物により生ずる同様のパタ
ーンをレーン４に示す。このレーンはＣＢＨＩの分子量
範囲に単一の広い蛋白質バンドを示す。

【０１２４】ゲルスライス＃１０からのＲＮＡは、次に
小さいサイズ範囲の画分されたポリＡ ＲＮＡを含有
し、翻訳系において、レーン５に見られるポリペプチド
の合成を指令する。免疫沈澱物の加水分解物の同様の分
析をレーン６に示す。ＣＢＨＩの分子量範囲における免
疫沈澱物の濃度が相対的に高いことから、ゲルスライス
＃１０は、ゲルスライス＃９に比べて、ＣＢＨＩｍＲＮ
Ａに関してより高度に濃縮されていることが示される。

【０１２５】ゲルスライス＃１１からのＲＮＡにより生
成された同様のポリペプチドパターンをレーン７及び８
に示す。レーン７は全リゼートポリペプチドを示し、レ
ーン８は抗−ＣＢＨＩ抗体の存在下で免疫沈澱するポリ
ペプチドを示す。これから明らかなように、レーン８に
おける６６，０００ドルトンの分子量バンドの濃度はレ
ーン４におけるそれに匹敵し、そしてレーン６に見られ
るそれよりも明らかに低い。この比較から、ゲルスライ
ス＃１０をＣＢＨＩｍＲＮＡが最も濃縮されているゲル
スライスであると同定し、そしてそれ故に、ＣＢＨＩプ
ローブ及びＣＢＨＩｃＤＮＡの調製のために後に記載す
る方法においてＣＢＨＩｍＲＮＡ源として使用した。

【０１２６】レーン６に見られる６６，０００ドルトン
の分子量範囲における比較的広いバンドが誘導されたＣ
ＢＨＩｍＲＮＡの生成物を示すことを確認するために、
翻訳系に、非誘導Ｔ．リーゼイ培養物（グリセリンの存
在下で増殖したもの）由来のポリＡ ＲＮＡの匹敵する
サイズのｍＲＮＡ画分を加えた。非誘導ポリＡ ＲＮＡ
をゲル電気泳動により画分した後、ゲルの２３Ｓ領域か
ら下１０番目のゲルスライスから溶出されたＲＮＡを翻
訳系に加えた。

【０１２７】翻訳系からの全翻訳ポリペプチド及び免疫
沈澱したペプチドを、それぞれレーン９及び１０に示
す。明らかな通り、レーン９は６６，０００分子量範囲
に非常に少量の新たに合成された蛋白質を含有し、そし
てレーン１０は抗−ＣＢＨＩ抗体の存在下で免疫沈澱す
る新たに合成された蛋白質を実質上示さない。このこと
は、抗−ＣＢＨＩと免疫的に反応する新たに合成された
ポリペプチドのすべてではないにしてもほとんどが、誘
導されたＣＢＨＩｍＲＮＡの指令のもとに生産されるこ
とを確認するものである。

【０１２８】Ｄ．４．ＣＢＨＩｃＤＮＡプローブの調製 上記のようにして得られた濃縮されたＣＢＨＩｍＲＮＡ
画分は、選択された微生物の、ＣＢＨＩ遺伝子の領域を
含有するゲノム消化断片の同定においてプローブとして
使用するための放射性ラベルされた単鎖ＣＢＨＩｃＤＮ
Ａを合成するための鋳型 (template) を提供する。

【０１２９】ｍＲＮＡから放射性ラベルされた単鎖ｃＤ
ＮＡを調製する方法はよく知られている。 Payvar,F.
等、J.Biol.Chem.（１９７９）２５４：７６３６に記載
されている一般的方法を用いて、Ｔ．リーゼイＬ２７株
ＣＢＨＩ濃縮ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。簡単に
記載すれば、濃縮されたｍＲＮＡを１０mM水酸化メチル
水銀で前処理してＲＮＡを変性し、そして放射性ラベル
したヌクレオチド類、プライマーとしてのオリゴｄＴ、
及びＲＮＡアーゼ阻害剤としての２mMアデノシン：ＶＯ
ＳＯ₄ を含有する反応混合物に導入した。

【０１３０】ｃＤＮＡ合成に続き、ポリＡ ＲＮＡをＮ
ａＯＨで処理することにより破壊し、そしてｃＤＮＡを
ゲル電気泳動によりサイズ分析して完全な長さのｃＤＮ
Ａが合成されていることを確認した。ｃＤＮＡ画分の典
型的なゲル電気泳動パターンは、ｃＤＮＡの調製に使用
した濃縮されたｍＲＮＡ画分のサイズ範囲におよそ対応
して、１．６〜１．８キロベース（kb）領域に顕著な主
要バンドを示した。

【０１３１】ＣＢＨＩプローブも公知の方法に従って、
ＣＢＨＩｍＲＮＡ断片を放射性ラベルすることにより調
製することができる。この方法に代えて、成熟ＣＢＨＩ
蛋白質の短セグメントの公知のアミノ酸配列に対応する
コード配列を有するように造成された合成ポリヌクレオ
チドもまた、この発明において使用するための適当なＣ
ＢＨＩプローブを提供する。

【０１３２】Ｄ．５．ＣＢＨＩ遺伝子領域を含有するゲ
ノムＤＮＡクローンの調製 選択された微生物から分離された全ゲノムＤＮＡを１種
又は複数種のエンドヌクレアーゼで処理して、クローニ
ングすることができるゲノム断片を生成せしめ、そして
上記のｃＤＮＡ ＣＢＨＩプローブとハイブリド形成す
る能力によりＣＢＨＩ遺伝子領域を含有するものとして
同定する。ＣＢＨＩ遺伝子領域を含有するとして同定さ
れたクローンはゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
に使用される遺伝子材料を提供し、そして遺伝子の選択
された領域を含有するクローンは下記の方法に従ってイ
ントロン不含ＣＢＨＩ遺伝子を造成する場合に使用する
ことができる。

【０１３３】Ｔ．リーゼイＬ２７ＤＮＡの完全ライブラ
リーをλＬ４７．１中に造成した。ファージＤＮＡを分
離し、そして次のようにしてスタファー断片 (stuffer
fragment) からクローニングアームを精製することによ
りλファージベクターを調製した。全ファージＤＮＡか
ら出発し、「接着末端」条件下でｃｏｓ部位を一緒に連
結した。

【０１３４】連結の効率はアガロースゲル分析により約
８０〜９０％であると決定された。連結されたファージ
ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断した。ＢａｍＨ
Ｉ消化により連結されたアームからスタファー断片が放
出され、他方ＳａｌＩはスタファー断片を２回以上切断
し、ＢａｍＨＩ消化アームからの一層容易な分離を保証
する。ＢａｍＨＩ消化アームをＣｓＣｌ速度沈降勾配法
によりスタファー断片から精製した。

【０１３５】Ｔ．リーゼイゲノムＤＮＡをＳａｕ３Ａに
より部分消化し、そしてＮａＣｌ速度勾配によりサイズ
画分し、そして１５〜２０kbの範囲の分子を含有する画
分を選択した。この画分の断片をベクターのＢａｍＨＩ
アームと１：１のモル比、２００μｇ／mlの全ＤＮＡ濃
度において混合し、そして４０℃にて一夜、２０μｌの
体積中の０．２ WeissユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結した。

【０１３６】連結混合物の０．５μｇを、Hohn,B. Meth
ods in Enzymology （１９７９）６８：２９９−３０９
に記載されているように凍結したパッケージ成分を用い
て、試験管内においてλヘッドにパッケージし、そして
得られたファージをＥ．コリＭＭ２９４株上にプレート
した。この方法により約１．７×１０⁴ ファージのライ
ブラリーが得られ、これはすべてのシングルコピー遺伝
子が代表される０．９９＋の可能性を与えた。

【０１３７】こうして得られたＴ．リーゼイゲノムライ
ブラリーを、前記のようにして調製した放射性ラベルさ
れたＣＢＨＩｃＤＮＡを用いて検出した。試験した約６
０，０００ファージの内５４ファージがｃＤＮＡプロー
ブとハイブリド形成した。間違った陽性反応物を除去す
るため、ｃＤＮＡと最も強力にハイブリド形成する２３
クローンをさらに精製し、そして２種類の異るプローブ
により検出した。一方のプローブは「誘導された」培養
物由来のｍＲＮＡから調製したものであり、そして他方
のプローブはＣＢＨＩｍＲＮＡを欠く「非誘導」培養物
由来のｍＲＮＡから調製したものである。

【０１３８】選択された２３ゲノムライブラリークロー
ンの内２２クローンが「誘導された」ｃＤＮＡプローブ
とハイブリド形成するが、「非誘導」ｃＤＮＡとはハイ
ブリド形成しなかった。選択された２２クローン中の１
５クローンの制限分析により幾つかの重複が示され、Ｃ
ＢＨＩ遺伝子ライブラリーは６個の特異クローンに減少
した。

【０１３９】６クローン中、λ−ＣＢＨ−４と命名され
た１クローンはＣＢＨＩゲノムコード配列のすべてを含
有すると推定され、これを用いて遺伝子サブフラグメン
トクローンを生成せしめた。実験的には、λ−ＣＢＨ−
４をＨｉｎｄIII により完全消化し、そして生成した消
化断片をＨｉｎｄIII 消化したＥ．コリプラスミドｐＢ
Ｒ３２２中に連結した。

【０１４０】組換形で消化ＣＢＨＩ断片を含有するプラ
スミドをアンピシリン耐性（ｐＢＲ３２２ベクター上に
担持されている）により選択し、そしてテトラサイクリ
ン耐性遺伝子の不活性化を導く外来性ＤＮＡの挿入によ
りもたらされるテトラサイクリン感受性についてスクリ
ーニングした。ＣＢＨＩ遺伝子の５′領域を含む１．１
６kb断片、又は遺伝子の３′領域を含む２．３kb断片の
いずれかを含有するサブクローンを選択した。これら２
つのクローンをそれぞれｐＣＢＨ１５７、及びｐＣＢＨ
１６４と命名し、それぞれ図３のＡ及び図３のＢに示
す。

【０１４１】ｐＣＢＨ１５７はＴ．リーゼイＬ２７株由
来の成熟ＣＢＨＩ蛋白質の最初の２７８アミノ酸のため
のコード領域を含有する。図３のＡに示すｐＣＢＨ１５
７の太線部分は完全１．１６kb ＤＮＡ断片を示し、該
断片の一部分にそって内側を伸びる線分は５′側ＣＢＨ
Ｉ遺伝子領域を示す。λ−ＣＢＨ−４由来の２．３kb
ＨｉｎｄIII 断片を含有するｐＣＢＨ１６４は、成熟Ｃ
ＢＨＩ蛋白質のアミノ酸２７９〜４９６の最後の２１８
アミノ酸をコードするＣＢＨＩゲノム遺伝子の領域を含
む。図３のＢの太線部分は２．３kbＤＮＡ断片を示し、
そして内側の線分はＣＢＨＩゲノム遺伝子のコード領域
を示す。

【０１４２】図３のＡ及び図３のＢはまた、ＣＢＨＩ遺
伝子領域内の幾つかの制限酵素部位を示す。これは常用
の制限酵素部位分析によって決定したものである。ｐＣ
ＢＨ１５７及びｐＣＢＨ１６４を、セルロース誘導Ｔ．
リーゼイＬ２７培養物から得られた全ポリＡ ＲＮＡ標
品からＣＢＨＩｍＲＮＡを「釣り上げる (fish out) 」
能力について試験した。発表されている方法〔Harpold.
M.H.等、Nucleic Acids Res.（１９７８）５：２０３
９〕に従って各クローンをニトロセルロースフィルター
に結合せしめ、そして誘導されたＴ．リーゼイＬ２７由
来の全ポリＡ ＲＮＡを、相補配列のハイブリド形成を
許容する条件下でフィルターに加えた。強く洗浄するこ
とによって非結合（非特異的）ｍＲＮＡを除去し、フィ
ルターに結合したプラスミドと特異的にハイブリド形成
するｍＲＮＡを溶出した。

【０１４３】各フィルターについて、結合ＲＮＡ画分及
び非結合ＲＮＡ画分を前記の無細胞蛋白質合成系におい
て翻訳した。２つのサンプルから翻訳された全蛋白質
を、抗−ＣＢＨＩ抗体とスタフィロコッカス・アウレウ
ス（Staphylococcus aureus）の細胞との混合物により
沈澱せしめた。翻訳された全蛋白質を、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ上で、そして前記の免疫沈澱物の分析により分析し
た。プラスミドｐＣＢＨ１６４及びｐＣＢＨ１５７の両
者は、抗−ＣＢＨＩ抗体と免疫的に反応する蛋白質の合
成を指令することができるＲＮＡと結合した。

【０１４４】Ｄ．６．ゲノム配列の決定 配列情報を得るために、上記の方法により得られたゲノ
ムＣＢＨＩ遺伝子のサブクローンを、１種又は複数種の
エンドヌクレアーゼ消化することによりさらに細断し、
ヌクレオチドの配列決定に適する長さのサブクローン断
片を生成せしめた。

【０１４５】遺伝子の５′側部分を含有するサブクロー
ンｐＣＢＨ１５７をＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩの両者
を用いて実質上完全に消化し、図３のＡから予想できる
ように、約６００ベースペア（bp）及び約５００bpの２
つの遺伝子領域断片を得た。この２断片をＭ１３バクテ
リオファージベクターＭ１３ｍｐ８及びＭ１３ｍｐ９に
それぞれサブクローニングした。他のＨｉｎｄIII 断片
サブクローンｐＣＢＨ１６４をＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄII
I 、及びＨｉｎｃIIにより消化した。生成した断片をベ
クターＭ１３ｍｐ８にサブクローニングした。

【０１４６】ベクターＭ１３ｍｐ８及びＭ１３ｍｐ９に
サブクローニングしたＣＢＨＩゲノム領域断片を、 San
ger,F.等、Nat.Acad.Sci.USA（１９７７）７４：５４６
３、及びMessing,J.等、Nucleic Acids Res.（１９８
１）９：３０９に記載されているジデオキシ鎖ターミネ
ーション法により配列決定した。配列の部分は Maxam-G
ilbert配列決定法〔Maxam,A.M.等、Proc.Nat.Acad.Sci.
USA （１９７７）７４：５６０〕により確認した。Ｔ．
リーゼイＬ２７株由来の１．１６kb ＨｉｎｄIII 断片
中の５′ＨｉｎｄIII 部位から２．３kb断片中のＣＢＨ
Ｉ遺伝子の３′末端におけるストップコドンの後約３０
６ヌクレオチドまで伸びる完全遺伝子配列を表１〜表９
に示す。

【０１４７】得られたヌクレオチド配列を、コンピュー
ターにプログラムされたマッチング操作により、Fagers
tam,L.等、前掲、及びFagerstam,L.G.、前掲によるＴ．
リーゼイＣＢＨＩの公知のアミノ酸配列と比較した。マ
ッチング操作により、所与のアミノ酸配列に対応するコ
ドンについての３種類の可能なリーディングフレームの
それぞれにおいてヌクレオチド配列を試験した。マッチ
ング操作は、ＣＢＨＩ遺伝子のコード領域とＴ．リーゼ
イＱＭ９４１４由来のＣＢＨＩの公知のアミノ酸配列の
領域との間にほぼ完全な対応をもたらした。

【０１４８】このマッチングは、後で検討するように、
正しいリーディングフレーム、開始コドン及び終止コド
ン、並びに遺伝子中の２個のイントロンの同定を可能に
した。表１はさらに、遺伝子の部分をコードするリーダ
ー配列に対応するアミノ酸を示す。（リーダー配列アミ
ノ酸はアンダーラインが付してある。）この明細書にお
いて言及する選択された制限エンドヌクレアーゼの認識
配列を表中にアンダーラインを付して示す。非翻訳イン
トロンのオーバーラインを付した部分は、他の遺伝子に
おいて報告されているイントロンの配列に類似すると認
識される部分を示す。

【０１４９】

【表１】

【０１５０】

【表２】

【０１５１】

【表３】

【０１５２】

【表４】

【０１５３】

【表５】

【０１５４】

【表６】

【０１５５】

【表７】

【０１５６】

【表８】

【０１５７】

【表９】

【０１５８】上記の表１において、ＡＴＧ開始コドンは
ｐＣＢＨ１５７中の挿入された配列の５′末端から数え
てヌクレオチド２１０−２１２に位置する。ヌクレオチ
ド２６１−２６３のコドンは成熟ＣＢＨＩ蛋白質中のＮ
−末端グルタミン（ピログルタミン）アミノ酸に対応す
る。ヌクレオチド２１０と２６０の間のコドンはおそら
く、１７アミノ酸から成る疎水性ペプチドリーダー配列
をコードし、このアミノ酸配列は対応するコード配列に
より決定され、表中にアンダーラインを付して示す。ヌ
クレオチド２６１〜６７１のコドンは成熟ＣＢＨＩ酵素
の最初の１３７アミノ酸をコードする。

【０１５９】成熟ＣＢＨＩ蛋白質中のアミノ酸１３７及
び１３８をコードするコード領域間に、この明細書にお
いてＣＢＨＩ遺伝子中の第１イントロン又は上流イント
ロンとして同定される６７bp領域が存在する。このイン
トロンは７bp ＡＧＣＴＧＡＣ配列（表１中オーバーラ
インで示されている）を含有し、この配列は酵母からの
アクチン遺伝子のイントロン配列〔 Langford,C.J.等、
Cell（１９８３）３３：５１９〕中、及びアスペルギル
ス・アワモリ (Aspergillus awamori ）由来のグルコ
アミラーゼ遺伝子中の３個のイントロン中の７−ｍｅｒ
と類似し、そしてニューロスポーラ・クラッサ（Neuros
pora crassa）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ遺
伝子中のイントロン配列〔 Kinnaird,J.等、Gene（１９
８２）２０：３８７〕、及びＡ．アワモリグルコアミラ
ーゼ遺伝子中のイントロンの１つと同一である。

【０１６０】この配列は、ｍＲＮＡ転写物からイントロ
ンをスプライシングするために必要なシグナルを提供す
るようである。さらに、このイントロンは、ドナー共通
配列ＴＡＡＧＴＧ、及びアクセプター共通配列ＴＴＴＡ
ＡＧＧ（表中オーバーラインで示してある）を含有し、
これらはMount,S.M., Nucleic Acid Res．（１９８２）
１０：４５９により揚げられたドナー部位共通配列及び
アクセプター部位共通配列と同一である。

【０１６１】アミノ酸１３８（システイン）からアミノ
酸３６９（アスパラギン酸）までは、ヌクレオチド７３
９−１４３４の間にわたる非中断蛋白質コード領域によ
りコードされる。アミノ酸３６９及び３７０をコードす
るコドン間の遺伝子領域は６３非コードヌクレオチドを
含有し、これはゲノムＣＢＨＩ遺伝子中で第２イントロ
ンすなわち下流イントロンを構成する。この第２イント
ロンもまた、酵母イントロンに特異的な７bp配列ＡＧＣ
ＴＧＡＣ、並びにドナー共通配列ＧＴＧＡＧＴ及びアク
セプター共通配列ＴＴＡＣＡＧを含有し、これらは酵母
遺伝子（Mount,S.M.、前掲）におけるイントロン−エク
ソン接続部における公知のドナー部位配列及びアクセプ
ター部位配列と同一である。

【０１６２】第２イントロンの後に、成熟ＣＢＨＩ蛋白
質のアミノ酸３７０−４９６をコードする非中断１２７
コドン領域が続く。このＣ−末端アミノ酸はロイシン
（ヌクレオチド１８７６−１８７８によりコードされ
る）である。遺伝子の３′コード領域における終止コド
ンの下流にあるヌクレオチド１８７９−２２２１は、表
示されているようにＳｍａＩ部位及びＨｉｎｃII部位を
含有する。

【０１６３】表１〜表９中の遺伝子の蛋白質コード部分
中のヌクレオチドの配列は、示されたアミノ酸の配列を
コードする１つのコドン配列を構成する。コドンの多く
は、そのコドンにより特定されるアミノ酸を変えること
なく、一般に第３ヌクレオチド部分においてヌクレオチ
ド配列を変えられ得る。遺伝子中に単一ヌクレオチド変
異すなわち点変異（point mutation) を生じさせる方法
は当業者に知られている。この明細書において定義する
「コドン配列」なる語は、特定のアミノ酸配列をコード
するすべてのヌクレオチド配列を包含し、表１に示され
るヌクレオチド配列をそこに示されたアミノ酸配列をコ
ードする多くのコドン配列の１つである。

【０１６４】遺伝子のコドン配列を保存するヌクレオチ
ド置換に加えて、この発明は、上に検討したように、コ
ードされたＣＢＨＩ酵素中の「中立的な」又は非臨界的
なアミノ酸変化を導く、遺伝子中のヌクレオチドの変化
を予想する。特に蛋白質アミノ酸配列中の進化的変化に
ついての研究から、蛋白質の機能的特性を有意に変化せ
しめることなく、蛋白質中に中立的なアミノ酸変化が生
じうることが知られている。

【０１６５】小さなコドン変化を実験的に生じさせるた
めに多くの方法を用いることができ、この方法には、点
変異又は欠失変異を生じさせるために遺伝子を変異源処
理する方法；遺伝子を選択的に開裂し、次に選択された
ヌクレオチドを除去又は付加し、そして次に遺伝子を連
結する方法；及び常用のオリゴヌクレオチド変異誘発法
が含まれる。このようにして変異を受けたＣＢＨＩ遺伝
子は酵素的に活性なＣＢＨＩ酵素をコードし、そしてし
ばしば、その比活性が、変異を受けていないＣＢＨＩ酵
素と比べて実質上変化していない酵素をコードするであ
ろう。

【０１６６】この発明は、そのコドン配列がＣＢＨＩ酵
素中のこのような中立的なアミノ酸変化をコードする遺
伝子、及びそのコドン配列が変異を受けていない成熟Ｃ
ＢＨＩのアミノ酸配列と厳格な１：１コドン対応を有す
る遺伝子を包含する。この明細書における定義におい
て、そのコドン配列が成熟ＣＢＨＩと「実質的な」１：
１対応を有する遺伝子には、厳格な対応を有する遺伝
子、及び中立的な又は小さなコドン変化を有し、ＣＢＨ
Ｉ（エキソ−セロビオヒドロラーゼ）酵素活性を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子の両者が包含される
〔Shoeker,S.P.等、Biochem. Biophys. Acta（１９７
３）５２３：１４７参照のこと〕。

【０１６７】図４は、前記の配列データから構成され
た、Ｔ．リーゼイＬ２７株からのゲノムＣＢＨＩ遺伝子
の地図を示す。この地図は、幾つかの制限エンドヌクレ
アーゼ部位と関連させて、特に前記の１．１６kb及び
２．３kb ＨｉｎｄIII 遺伝子断片を規定するＨｉｎｄ
III 部位と関連させて、遺伝子の蛋白質コード領域を示
す。この地図からわかるように、遺伝子中の上流イント
ロンは１．１６kb ＨｉｎｄIII 断片の中央領域に位置
し、そして下流イントロンは２．３kb断片の中央の蛋白
質コード領域に位置する。

【０１６８】ここに記載した例においては、Ｔ．リーゼ
イＬ２７株ＣＢＨＩ遺伝子中の上流イントロン及び下流
イントロンの存在及び位置を、配列決定されたゲノム遺
伝子とコードされた蛋白質のアミノ酸配列とを比較する
ことによって決定した。この方法は高い精度をもってイ
ントロンを規定するために使用することができる方法の
１つである。この方法に代えて、遺伝子イントロンの長
さ及び位置を、ゲノムＣＢＨＩ遺伝子のヌクレオチド配
列と、この明細書に記載した一般的方法に従って調製さ
れそして配列決定された完全な長さのＣＢＨＩｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列を比較することによっても決定する
ことができる。

【０１６９】また、ヌクレオチド配列のみからゲノム遺
伝子イントロンの存在及び位置を同定することもでき
る。前に検討したように、Ｔ．リーゼイＬ２７株ＣＢＨ
Ｉ遺伝子中の両イントロンは、酵母イントロンに特徴的
な７bp配列を含有し、従ってイントロンを予備的に同定
するための手段を提供している。同様に、イントロンの
ドナー領域及びアクセプターエンド領域は、すでに掲げ
られている幾つかの共通配列の１つと一致する特徴的な
共通配列によって同定することができよう。この発明
は、イントロンの同定をアミノ酸−コドンマッチング法
に関連して説明したが、ヌクレオチド配列から遺伝子イ
ントロンの存在及び位置を決定するためのここに記載し
た他の２つの方法もこの発明の方法に含まれる。

【０１７０】Ｄ．７．遺伝子からのイントロン配列の除
去 この項は、イントロン不含ＣＢＨＩ遺伝子を造成する方
法を記載する。この方法はまず、適当なクローニングベ
クターに、５′遺伝子末端からゲノムＣＢＨＩ遺伝子中
の５′末端イントロンの下流の選択された制限エンドヌ
クレアーゼ部位に伸びる５′ゲノムＣＢＨＩ遺伝子断片
を得ることを含む。一般に、ＣＢＨＩ遺伝子領域を含有
するゲノムＤＮＡ消化クローンを調製するためにＤ．５
項に前記した方法が、この５′ゲノム遺伝子断片を調製
するために適用され得る。

【０１７１】特に、この明細書に説明する有利な方法
は、完全なＣＢＨＩ遺伝子を含有する１又は複数の断片
を生成せしめる条件下で、選択された制限エンドヌクレ
アーゼによりゲノムＤＮＡを処理する第１段階を含む。
次に、この完全遺伝子断片をさらに消化して、２又はそ
れより多くの遺伝子サブフラグメントを生成せしめる。
このサブフラグメントには、例えば前記のＴ．リーゼイ
Ｌ２７株からの１．１６kb ５′ＣＢＨＩ遺伝子断片が
包含される。

【０１７２】第２段階は、１又は複数のＣＢＨＩｃＤＮ
Ａコード配列断片を組換形として得ることを含み、この
ｃＤＮＡコード配列は、非中断蛋白質コード遺伝子領域
を得るために、ゲノム遺伝子断片の対応するイントロン
含有領域と共にスプライシングすることができ又はそれ
と置き換えることができるものである。ｃＤＮＡ遺伝子
断片は常法に従って、好ましくは濃縮されたＣＢＨＩｍ
ＲＮＡから単鎖ｃＤＮＡを生成せしめ、そしてこの単鎖
ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを形成することによって造
成される。

【０１７３】濃縮されたＣＢＨＩｍＲＮＡを得るための
一般的方法はＤ．３項に前記した方法に従う。濃縮され
たｍＲＮＡは、逆転写酵素の存在下でオリゴｄＴと反応
した場合、やはり前記の方法に従って、ｃＤＮＡ鎖を合
成するための鋳型として機能する。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ
ハイブリド中のｍＲＮＡをＮａＯＨで処理することによ
って加水分解し、単鎖ｃＤＮＡは保存する。

【０１７４】このｃＤＮＡは、Maniatis等、Molecular
Cloning-a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor La
boratory, Cold Spring Harbor，ニューヨーク（１９８
２）２３５−２３８頁に記載されている方法に従って
Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩにより第２のｃＤＮＡを
合成する反応を開始し、そしてこの合成のための鋳型と
して機能し、「ヘアーピン」二重鎖ＤＮＡをもたらす。
第２のｃＤＮＡ鎖の合成の後、ヌクレアーゼＳＩで処理
することによりヘアーピンループを除去し、そして種々
のデュプレックスｃＤＮＡを選択することができる。

【０１７５】Ｔ．リーゼイＬ２７株ＣＢＨＩｍＲＮＡを
コピーすることにより得られる二重鎖ｃＤＮＡを上記の
方法によって得、そして標準的方法に従ってｐＵＣ８ベ
クターにクローニングした。クローンを、ＣＢＨＩゲノ
ムＤＮＡの領域を含有する前記のｐＣＢＨ１５７クロー
ン又はｐＣＢＨ１６４クローンの１つとハイブリド形成
する能力により同定した。選択されたｃＤＮＡ断片クロ
ーンの１つをｐ８０５と命名し、図６に示す。図中に太
線で示されている、ｐ８０５中のｃＤＮＡ断片は、遺伝
子の５′末端からＮｃｏＩ部位を越えて下流に伸びる。
このＮｃｏＩ部位は図示されているように、ゲノム遺伝
子中第１イントロンすなわち上流イントロンの下流側に
位置する。

【０１７６】ｐ４１７及びｐ２４７と同定された２つの
他のｃＤＮＡクローンを図７に示す。図から明らかなよ
うに、ｐ２４７中のｃＤＮＡ断片はｃＤＮＡの３′末端
からＢｓｔＥII部位を越えて上流に伸びる。ｐ４１７中
のｃＤＮＡ断片は、上記のＢｓｔＥII部位において断片
２４７と重なり、そしてＣＢＨＩ遺伝子中の内部Ｈｉｎ
ｄIII 部位を越えてそれから上流に伸びる。上記の３種
類のｃＤＮＡ断片の長さ及び相対的位置を、常用の制限
エンドヌクレアーゼ地図の作成によって決定した。

【０１７７】イントロン不含ＣＢＨＩ遺伝子を造成する
ために、上流イントロンを含有するゲノムＤＮＡの部分
を５′ゲノム断片から切り取り、そして切り取られたイ
ントロン含有領域に対応するｃＤＮＡ領域を挿入した。
次に、このイントロン不含５′遺伝子断片を、選択され
た制限エンドヌクレアーゼ部位において、この部位から
遺伝子の３′末端に伸びる３′末端ｃＤＮＡ断片に連結
した。

【０１７８】後の説明において、イントロン不含５′遺
伝子断片は、ベクターが適当な宿主に導入された場合に
この断片の発現を可能にする制御配列に隣接して適当な
発現ベクターにクローニングした。次に、遺伝子の残り
の３′ｃＤＮＡ部分を発現ベクターに導入し、遺伝子発
現のためのベクター中に配置されそして方向付けられた
完全な長さのイントロン不含ＣＢＨＩ遺伝子を生成せし
めた。

【０１７９】Ｄ．７．ａ．ｐＣＢＨ５の造成／上流イン
トロンの除去 図６はＴ．リーゼイＬ２７株ゲノムＤＮＡ由来の１．１
６kb ＨｉｎｄIII 断片を含有するプラスミドｐＣＢＨ
１５７を示す。この断片は図３のＡにも示されている。
前記の遺伝子ヌクレオチド配列データから、１．１６kb
断片が遺伝子中の第１ＡＴＧ開始シグナルにおける翻訳
の開始点への１１bp５′側にユニークＳａｃII認識部位
を、そして遺伝子断片中上流イントロンへの３２bp３′
側にユニークＮｃｏＩ切断部位を含有することが知られ
る。これは図示されている通りである。

【０１８０】約８００bpの５′端ｃＤＮＡ断片を含有す
るプラスミドｐ８０５もまた、図６に示すように、上記
のユニークＳａｃII部位及びＮｃｏＩ部位を含有する。
プラスミドｐＣＢＨ１５７及びｐ８０５のそれぞれをＳ
ａｃII及びＮｃｏＩにより処理し、プラスミドｐＣＢＨ
１５７から上流イントロンを含有する５７３bp断片を放
出せしめ、そしてプラスミドｐ８０５から対応するイン
トロン不含５０６bp断片を放出せしめた。ｐ８０５から
のイントロン不含ＳａｃII／ＮｃｏＩ断片を消化された
ｐＣＢＨ１５７プラスミド中に連結し、ｐＣＢＨ５と称
する新しいプラスミドを形成した。このプラスミドは、
上流イントロンが除去された１．１６kbＨｉｎｄIII 断
片から成るキメラ性ゲノム／ｃＤＮＡ遺伝子断片を含有
する。

【０１８１】Ｄ．７．ｂ．ｐＣＢＨ３の造成／下流イン
トロンの除去 ３′イントロン不含遺伝子断片の造成を検討しよう。図
７に関して、プラスミドｐ２４７は、遺伝子のＴＡＡ終
止コドンへ７７bp離れた位置にＳｍａＩ部位、ゲノム遺
伝子中の下流イントロンへ約１３８ヌクレオチドだけ
３′の位置にユニークＢｓｔＥII部位、及びｃＤＮＡコ
ード配列に関して５′側であるプラスミドのポリリンカ
ー領域にユニークＳａｌＩ部位を含有する。

【０１８２】プラスミドｐ４１７はやはり図７に示され
ており、ｐ２４７と同様であるがＣＢＨコード配列中に
ＢｓｔＥII部位を含有し、そしてＣＢＨＩコード配列内
でＨｉｎｄIII 認識部位を越えてさらに５′方向に伸
び、そしてＢｓｔＥII部位の上流約６００bpにユニーク
ＳａｌＩ部位を含む。

【０１８３】遺伝子の終止コドンの下流末端から中間Ｈ
ｉｎｄIII 部位を越して上流に伸びる３′ｃＤＮＡ遺伝
子クローンを造成するために、プラスミドｐ２４７及び
ｐ４１７のそれぞれをＢｓｔＥII、そして次にＳａｌＩ
により完全消化した。ｐ４１７からの小さい方の６００
bp ＢｓｔＥII／ＳａｌＩ ＤＮＡ断片を精製し、そし
てＢｓｔＥII／ＳａｌＩｐ２４７ベクター断片と連結し
た。図に示すプラスミドｐＣＢＨ３は、ｃＤＮＡの３′
末端から遺伝子中の中間ＨｉｎｄIII 部位に伸びるｃＤ
ＮＡ断片を有する目的とする組換体であると同定され
た。

【０１８４】Ｄ．８．細菌宿主のための発現ベクターの
造成 ｐＣＢＨ５及びｐＣＢＨ３からのＣＢＨＩ遺伝子断片
を、選択されたＥ．コリ／Ｓ．セレビシエーシャトルベ
クター中に、ｔｒｐプロモーターの制御下にＣＢＨＩ遺
伝子の発現を許容するように調整された位置及び方向に
クローニングした。宿主ベクターは、図５に示す通りの
ｐＤＧ１５１と命名された１１．１２kbシャトルベクタ
ーであり、１９８４年５月１１日にＡＴＣＣに寄託さ
れ、寄託番号３９６８６が与えられた。

【０１８５】このプラスミドは、カナマイシン、ネオマ
イシン、Ｇ４１８、及び他の抗生物質に対する抗生物質
耐性を付与する酵素をコードする変形されたアミノグリ
コシドホスホトランスフェラーゼＡＰＨ−Ｉ遺伝子を含
有する。このプラスミドの配列は次の通りである。 １．コーディネート０−１．５４は、ｐｅｎｏ４６から
誘導されたＥＮＯ１遺伝子の１．５４kb ＨｉｎｄIII
／ＥｃｏＲＩ ３′非翻ターミネーター配列である〔Ho
lland,M.J.等、J.Biol.Chem.（１９８１）２５６：１３
８５〕。

【０１８６】２．コーディネート１．５４−２．７５
は、変形されたＡＰＨ−Ｉ遺伝子を含有する（これは、
The Molecular Biology of Yeast, Cold Spring Harbor
Meeting, １９８３年８月１６〜２１日に詳細に記載さ
れている）。 ３．コーディネート２．７５−２．８５は、逆向きのポ
リリンカーの反復に挾まれた重複ｌａｃオペレーター配
列を含んで成る配列を含有する。変形されたＡＰＨ−Ｉ
のＡＴＧ開始コドン（２．７５における）に直接先行す
るこの配列は次の通りである。

【０１８７】

【表１０】

【０１８８】４．コーディネート２．８５−２．９５
は、ｔｒｐプロモーター−オペレーターを含有する１０
７bpの５′−ＥｃｏＲＩ（修復された）／ＢａｍＨＩ−
３′断片である。 ５．コーディネート２．９５−３．０４は、ＳｐｈＩ
（修復）部位及びＳａｌＩ部位間に９０bp ｐＢＲ３２
２断片を含有する。 ６．コーディネート３．０４−５．２５は酵母由来ＬＥ
Ｕ２遺伝子のコピーである。これは、ＸｈｏＩ／Ｓａｌ
Ｉ消化物としてＹＥｐ１３から得られた〔Broach,J等、
Gene（１９７９）８：１２１〕。

【０１８９】７．コーディネート５．２５−８．９７中
のミクロンプラスミドレプリコンは、ｐＤＢ２４８〔Be
ach,D.等、Nature（１９８１）２９０：１４０〕をＥｃ
ｏＲＩ（修復）及びＳａｌＩで消化し、そしてレプリコ
ンを含む２．７kb ＤＮＡ断片を分離することにより得
られる。適切なＳａｌＩ部位の存在は Beachの開示から
は推定できなかった。しかしながら、ｐＤＢ２４８は、
前記の Beachの文献に示されたＬＥＵ２領域１２μＰｓ
ｔＩティリング部位から約５０bp下流にＳａｌＩ部位を
含有することが示された。

【０１９０】８．コーディネート８．９７−１１．１２
は、Ａｍｐ^R 及びＥ．コリ複製開始点を提供するｐＢＲ
３２２のＴｔｈｌｌｌＩ（修復）／ＥｃｏＲＩ消化断片
を含有する。図８は、ｐＣＢＨ５由来のイントロン不含
５′端遺伝子断片をｐＤＧ１５１に挿入する方法を示
す。プラスミドｐＣＢＨ５をＳａｃIIで完全消化し、そ
して３′突出２塩基接着末端をｄＣＴＰの存在下でＥ．
コリＤＮＡポリメラーゼＩ（ＰｏｌＩ）（Klenow）によ
り修復した。ＰｏｌＩを不活性化した後、ＤＮＡ基質を
ＨｉｎｄIII で完全消化し、そして８９５bp ＳａｃII
（修復）／ＨｉｎｄIII断片を精製した。

【０１９１】図５に示す拡大した遺伝子領域に関し、プ
ラスミドｐＤＧ１５１をＸｍａＩにより完全消化し、２
つの隣接するＸｍａＩ部位間に重複する合成ｌａｃオペ
レーター断片を含有する６２bp ＤＮＡ断片を放出せし
めた。５′突出４塩基接着末端をｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ
の存在下でＰｏｌＩにより修復した。ＰｏｌＩを不活性
化した後、平滑末端ＤＮＡをＨｉｎｄIII により完全消
化した。１１．１２kbベクターＤＮＡ断片中の修復され
たＸｍａＩ部位は、Ｅ．コリｔｒｐプロモーター及びリ
ーダーペプチドリボゾーム結合部位の１８ヌクレオチド
３′側にあり、そして接着ＨｉｎｄIII 部位は変形され
たＡＰＨ−Ｉ遺伝子の開始コドンに直接先行する。

【０１９２】ｐＤＧ１５１ＤＮＡ断片（１．５μｇ）及
び精製されたｐＣＢＨ５ＤＮＡ断片（０．２４μｇ）
を、ml当り約６０μｇの全ＤＮＡ濃度において、接着末
端条件のもとで連結した。連結されたＤＮＡ断片を２０
μｇ／mlに稀釈し、そして分子内環化に好都合な平滑末
端条件下で連結を継続した。Ｅ．コリＫ１２／ＧＭ１１
９株を、連結されたＤＮＡ １５０ngを用いてアンピシ
リン耐性に形質転換し、そして非−構成的 (non-consti
tutive）Ｌａｃ⁺ コロニーを、目的とする１１．９４kb
プラスミドｐｔｒｐＣＢＨ５の存在についてスクリーニ
ングした。

【０１９３】図８に示すプラスミドｐｔｒｐＣＢＨ５
は、修復されたｐＤＧ１５１ＸｍａＩ部位に新しいユニ
ークＸｍａＩ認識部位を有する目的とする挿入部を含有
する。図８に示されるプラスミド構成は制限酵素地図の
作成により確認した。Ｅ．コリＫ１２／ＧＭ１１９中の
プラスミドｐｔｒｐＣＢＨ５はシタス・マスター・カル
チュアー・コレクション(Cetus Master Culture Collec
tion；ＣＭＣＣ）に寄託され、ＣＭＣＣ寄託＃１８４２
の番号を有する。このプラスミドはNorthern Regional
Research Laboratory （ＮＲＲＬ），ペオリア，イリノ
イに寄託され、そして番号ＮＲＲＬ＃Ｂ１５５７４を有
する。

【０１９４】Ｄ．８．ａ．ｐｔｒｐＣＢＨ８の造成 ｐＣＢＨ３からの３′ｃＤＮＡ遺伝子断片をｐｔｒｐＣ
ＢＨ５中にサブクローニングする方法を図９に示す。プ
ラスミドｐＣＢＨ３をＨｉｎｄIII により完全消化し、
ＣＢＨＩ遺伝子の中間ＨｉｎｄIII 部位からＳｍａＩ部
位に隣接する遺伝子の３′末端を越えて伸び３′Ｈｉｎ
ｄIII に至るｐＵＣ８からの配列を含む、約８００bpの
３′ＣＢＨＩコード断片を放出せしめた。プラスミドｐ
ｔｒｐＣＢＨ５もＨｉｎｄIII で消化し、ＡＰＨ−Ｉ遺
伝子における開始コドンに直接先行するＨｉｎｄIII 部
位においてベクターを線状にした。

【０１９５】精製されたｐＣＢＨ３／ＨｉｎｄIII 断片
（０．２μｇ）を接着末端条件下でｐｔｒｐＣＢＨ５／
ＨｉｎｄIII 断片（１．６μｇ）と連結した。Ｅ．コリ
Ｋ１２／ＭＭ２９４株をアンピシリン耐性に形質転換
し、そしてコロニーを目的とするプラスミドの存在につ
いてスクリーニングした。ｐｔｒｐＣＢＨ８と称する新
プラスミドの造成を図９に示す。ＨｉｎｄIII ，Ｂａｍ
ＨＩ及びＥｃｏＲＩによる制限地図の作成により表示さ
れた構成が確認された。プラスミドｐｔｒｐＣＢＨ８
は、ＣＢＨＩコード配列を挾んで２個のＸｍａＩ／Ｓｍ
ａＩ部位を含有する。

【０１９６】いずれかの酵素でｐｔｒｐＣＢＨ８を消化
することにより１．６３kbのＤＮＡＣＢＨＩ遺伝子断片
を生成し、この断片は、コード領域の５′末端に約１２
bp及びコード領域の３′末端に約８０bpを伴う完全ＣＢ
ＨＩコード領域を含有する。Ｅ．コリＫ１２／ＭＭ２９
４中のプラスミドｐｔｒｐＣＢＨ８はＣＭＣＣ＃１８４
１と称され、そしてＮＲＲＬに寄託され、番号ＮＲＲＬ
＃Ｂ１５５７３を有する。

【０１９７】Ｄ．８．ｂ．ｐｔｒｐＣＢＨ８１の造成 ｐＣＢＨ３からの３′ＣＢＨＩｃＤＮＡ断片をｐｔｒｐ
ＣＢＨ５に挿入する方法は次の通りである。ｐＣＢＨ３
をＳｍａＩ及びＨｉｎｄIII で処理し、中間ＨｉｎｄII
I 部位から下流のＣＢＨＩ遺伝子の完全コード配列を含
有する７３４bp断片を放出せしめた。シャトルベクター
ｐｔｒｐＣＢＨ５（Ｅ．コリＫ１２ｄａｍ^-1宿主である
ＧＭ１１９中に調製）をエンドヌクレアーゼＳｔｕＩ及
びＨｉｎｄIII により次々に処理し、ＨｉｎｄIII ／Ｓ
ｔｕＩベクター断片を放出せしめた。

【０１９８】ｐＣＨ３からの精製したＣＢＨ３ＳｍＩ／
ＨｉｎｄIII 断片を、ｐｔｒｐＣＢＨ５ＳｔｕＩ／Ｈｉ
ｎｄIII 断片と、接着末端条件下で、そして次に平滑末
端条件下で連結した。Ｅ．コリＫ１２／ＭＭ２９４をア
ンピシリン耐性に形質転換し、そして目的とするプラス
ミドの存在についてコロニーをスクリーニングした。ｐ
ｔｒｐＣＢＨ８１と称する新プラスミドの構成を図１０
に示す。Ｅ．コリＫ１２／ＭＭ２９４中のプラスミドｐ
ｔｒｐＣＢＨ８１はＣＭＣＣ＃１８４３として同定さ
れ、そしてＮＲＲＬに寄託され番号ＮＲＲＬ＃Ｂ１５５
７５を有する。

【０１９９】図１０に示すように、ＳｍａＩ／ＳｔｕＩ
融合は新ベクター中にＳｍａＩ部位を再生しない。従っ
てｐｔｒｐＣＢＨ８１プラスミドは、ＣＢＨＩイントロ
ン不含遺伝子の開始（メチオニン）コドンに１２bp先行
し、そしてｔｒｐリーダーリボゾーム結合部位の１６bp
後にユニークＳｍａＩ／ＸｍａＩ部位を有する。

【０２００】Ｄ．８．ｃ．ｐｔｒｐＣＢＨ８２の造成 Ｄ．８．ａ．及びＤ．８．ｂ．項に前記したプラスミド
ｐｔｒｐＣＢＨ８、及びｐｔｒｐＣＢＨ８１をさらに変
形して、ｔｒｐリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）と目的と
するＣＢＨＩコード配列のＡＴＧ開始コドンとの間の間
隔を短縮した。後で詳細に記載するように、ｐｔｒｐＣ
ＢＨ８中のＲＢＳとＡＴＣ開始コドンとの間の介在配列
の２３ヌクレオチドを７ヌクレオチド断片によって置き
換え、そして得られた変形された断片をｐｔｒｐＣＢＨ
８１の対応部分と置換した。変形された配列はさらに、
この領域に最初に含まれていたＢａｍＨＩ部位及びＸｍ
ａＩ部位に代る重複するＣｌａＩ認識部位及びＡｈａII
I 認識部位を含有する。置換方法は図１１と関連させて
下に記載する。

【０２０１】Ｄ．８．ｃ．１．プレ−ＡＴＧ配列の変形 ＳａｌＩ／ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片をｐｔｒｐＣＢＨ８か
ら、これらの酵素を用いる二重消化により切り出した。
この断片は、ｐＤＧ１５１ｔｒｐプロモーター（図５）
の５′側のＳａｌＩ部位からＣＢＨ遺伝子（図７）の
３′側に隣接するＰｓｔＩ部位まで伸びる。この断片を
アガロースゲル電気泳動により分離し、そして電気溶出
により分離した。

【０２０２】バクテリオファージＭ１３ｍｐ１０ｗＤＮ
ＡをＳａｌＩで処理し、次にＰｓｔＩで消化してＳａｌ
Ｉ／ＰｓｔＩファージ断片を放出せしめた。バクテリオ
ファージＭ１３ｍｐ１０ｗは部位変異誘発に使用される
タイプの常用のファージであり、匹敵するタイプのファ
ージが New England Biolabs（ベバリンマサチューセッ
ツ）から入手可能である。ＳａｌＩ／ＰｓｔＩ断片をア
ガロースゲル電気泳動により分離し、そして電気溶出に
より回収した。

【０２０３】上記のようにして調製したｐｔｒｐＣＢＨ
８及びＭ１３ｍｐ１０ｗのＳａｌＩ／ＰｓｔＩ断片を標
準的条件下で連結し、そして凍結したコンピテントＥ．
コリＫ１２／ＤＧ９８株に形質転換した。細胞を、５×
１０^-4Ｍイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）
(Sigma Chem；セントルイス，ミズリーから入手され
る）及び４０μｇ／mlのＸ−ｇａｌを含有する培地上に
プレートした。非α−補完白色プラーク（１６／４０
５，４％）を新鮮な培地に拾い上げた。ミニカルチュア
ーを期待されるサイズ（９kb）の組換単鎖ファージＤＮ
Ａについてスクリーニングした。Ａ６と称する目的とす
る組換ファージの構造を制限分析を用いて確認した。

【０２０４】次の配列、 ５′−CAACCTCCGATACATTTTAAATCGATACCCTTTTTAC −３′ を有する化学合成した純粋なオリゴデオキシヌクレオチ
ドを、 Maxam及びGilbert 〔Maxam,A.等、Methods in E
nzymology （１９８０）６８：５２１，AcademicPres
s〕の方法の変法に従って放射性ラベルした。簡単に記
載すれば、 New England Nuclearから得た³²Ｐ−ＡＴＰ
８７ｐモル（２９００Ci／ｍモル）を乾燥し、そして
４０mM Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，pH７．６，１０mM ＭｇＣｌ
₂ ，５mM ＤＴＴ，０．１mMスペルミジン、及び０．１
mM ＥＤＴＡを含有する溶液全容３０μｌ中で５０ｐモ
ルのオリゴマー及び１２ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼと混合した。

【０２０５】この混合物を３７℃にて１時間インキュベ
ートし、さらに１２Ｕのキナーゼを加え、そしてさらに
１時間反応を継続した。粗生成物を、１mmの１６％アク
リルアミドゲルを用いて、冷却しながら５００Ｖにて３
０分間電気泳動を行うＰＡＧＥにより精製した。最も遅
く泳動するバンドを切り取り、破砕し、そして１００℃
にて１０分間加熱した後に０．５mlずつのハイブリド形
成緩衝液を用いて２回溶出した。

【０２０６】溶液の比活性は５．３×１０⁶dpm／pm（７
５％導入）であった。組換Ｍ１３ｍｐ１０ｗバクテリオ
ファージＡ６をＥ．コリＫ１２／ＤＧ９８株中に調製
し、そして単鎖ファージＤＮＡを精製した。１ｐモルの
単鎖ファージＤＮＡ及び１０ｐモルの合成ヌクレオチド
プライマー（キナーゼ処理していない）を、２０mM Ｔ
ｒｉｓ−Ｃｌ，pH８，２０mM ＭｇＣｌ₂ ，１００mM
ＮａＣｌ，２０mM ２−メルカプトエタノールから成る
液１５μｌ中で、６７℃にて１分間、そして次に３７℃
にて３０分間加熱することによりアニーリングした。

【０２０７】次にアニーリングしたＤＮＡをＤＮＡポリ
メラーゼＩ（Klenow）及び５００μＭ ｄＮＴＰと共に
０℃にして３０分間インキュベートし、そして次に３７
℃にした。アリコート（０．０５又は０．２５ｐモル）
を、５分、２０分、及び４５分後に取り出し、Ｅ．コリ
Ｋ１２／ＭＭ２９４に形質転換し、そしてＥ．コリＫ１
２／ＤＧ９８株と共にプレートした。

【０２０８】このプレートを４℃に冷却し、そして Bio
dyneから得られるＰａｌＩ膜を用いてプラークを取り上
げた（第１の濾紙においては１〜２分間、第２の濾紙に
ついては１０分間以上）。濾紙を２．５Ｍ ＮａＣｌ，
０．５Ｍ ＮａＯＨ中で変性した（５分間）。変性媒体
を３Ｍ酢酸ナトリウムによりpH５．５に中和し、濾紙を
真空中で１時間８０℃にて加熱し、そして次に６×ＳＳ
Ｃ，５× Denhart溶液、０．１％ＳＤＳ、５０μｇ／ml
酵母ｔ−ＲＮＡ中で５４．４℃にて２時間前ハイブリド
形成した。

【０２０９】次に濾紙を、６．５×１０⁶cpm／１．２５
ｐモルのキナーゼ処理した合成オリゴヌクレオチド
（２．５ml／濾紙）を用いて５０．５℃にて一夜プロー
ブ処理し、６×ＳＳＣ中で４０℃にて５分間ずつ２回洗
浄し、そして６×ＳＳＣ中で５０．５℃で５分間洗浄
し、そして−８０℃にて一夜オートラジオグラフ処理し
た。

【０２１０】前記合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチ
ド１−１５はＣＢＨＩ遺伝子の５′末端に相補的であ
り、そしてヌクレオチド２３−３７はｐｔｒｐＣＢＨ８
中のＳ／Ｄ配列と隣接するＢａｍＨＩ部位との間のコン
トロール領域に相補的である。図１１の拡大された部分
からわかる通り、目的とする組換ファージ〔ｐｔｒｐＣ
ＢＨ８１の末端相同 (end-homologous) 部分がオリゴヌ
クレオチドプライマーで置換されている〕はＢａｍＨＩ
部位及びＸｍａＩ部位を喪失し、そしてオリゴヌクレオ
チドの中央部分に由来するＣｌａＩ部位及びＡｈａIII
部位を獲得している。さらに詳しくは、図の下部拡大部
分に示されているように、変形されたファージはＣＢＨ
遺伝子のＡＴＧ開始コドンに直接隣接してＴＴＴＡＡＡ
からなるＡｈａIII 認識部位を含有する。

【０２１１】候補プラークを取り上げ、Ｅ．コリＫ１２
／ＤＧ９８株に感染せしめた後、複製形（ＲＦ）ＤＮＡ
を、新しいＣｌａＩ及びＡｈａIII 認識部位の獲得、並
びにＸｍａＩ認識部位の喪失について試験する。適切な
分析結果を示す１つの候補をｍｐ１０ｗ５Ａと命名し
た。

【０２１２】Ｄ．８．ｃ．２．ｐｔｒｐＣＢＨ８１への
置き換え プラスミドｐｔｒｐＣＢＨ８１、及びｍｐ１０ｗ５Ａ
ＲＦ−ＤＮＡのそれぞれを、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩを
用いて完全消化し、そして消化物を標準的条件下で連結
した。連結混合物をＸｍａＩにより消化することにより
不所望の連結混合物を不活性化し、そしてこれを用いて
Ｅ．コリＫ１２／ＭＭ２９４をＡｍｐ^Rに形質転換し
た。

【０２１３】候補プラスミドを制限分析により分析し
た。これは、ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ消化により１．２６
kb ＤＮＡ断片を；ＣｌａＩ／ＢａｍＨＩ消化により
１．０７kb ＤＮＡ断片を；そしてＢａｍＨＩ／Ａｈａ
III 消化により１．０７kb ＤＮＡを放出するものであ
る。図１１においてｐｔｒｐＣＢＨ８２として示す正し
い構成が配列決定により確認された。

【０２１４】Ｄ．９．ＣＢＨＩをコードする酵母発現プ
ラスミドの造成 ｐＤＧ１５１から誘導されたＤ．８項の細菌／酵母複製
プラスミドのベクター骨格の特徴を維持しながらＥＮＯ
１プロモーターの制御のもとにＣＢＨＩコード配列を配
置して幾つかのプラスミドを造成した。ｐｅｎｏＣＢＨ
５００・２０２と称する、これらのベクターの内の１つ
の造成を図１２に示す。

【０２１５】プラスミドｐＰＭ１４をＥＮＯ１プロモー
ターの分離源として使用した。ｐＰＭ１４は、エノラー
ゼ−Ｉ翻訳開始部位に先行する７２３bpからエノラーゼ
ＡＴＧ開始コドンのヌクレオチド−２にわたる断片を含
有するｐｅｎｏ４６〔Holland,M.J.等、J.Biol.Chem.
（１９８１）２５６：１３８５〕からの７２２bp Ｅｃ
ｏＲＩ／ＨｉｎｄIII 断片を含有するｐＢＲ３２２の誘
導体である。ｐＰＭ１４をＥｃｏＲＩで消化し、ｄＡＴ
Ｐ及びｄＴＴＰの存在下でKlenowで処理し、そして次に
ＨｉｎｄIII で処理してＥｃｏＲＩ（平滑）／Ｈｉｎｄ
III ＥＮＯ１プロモーター含有断片を得た。

【０２１６】プラスミドｐｔｒｐＣＢＨ８１をＳａｌＩ
で消化し、４種類すべてのｄＮＴＰの存在下でKlenowで
処理し、そして次にＨｉｎｄIII で完全消化した。前記
において調製した断片を等モル比において接着末端条件
下で連結し、次に平滑末端連結し、そして連結生成物を
ＮｒｕＩ及びＳｍａＩで処理して不所望の連結生成物を
不活性化した。連結混合物を用いてＥ．コリＫ１２／Ｍ
Ｍ２９４をＡｍｐ^R に形質転換し、そして形質転換体
を、ｐｅｎｏＣＢＨ２４と称する目的の１１．３２kbプ
ラスミドの存在についてスクリーニングした。制限分析
により正しい構成を確認した。

【０２１７】図１２に関し、ｐｔｒｐＣＢＨ８２をＡｈ
ａIII で消化し、そしてＣＢＨＩをコードする２．２kb
ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製し
た。この操作により切断される２つのＡｈａIII 部位
は、（１）すぐに前に記載したように、ＣＢＨＩ遺伝子
の５′末端に隣接して導入したＡｈａIII 部位、及び

【０２１８】（２）ｐｔｒｐＣＢＨ８１及びｐｔｒｐＣ
ＢＨ８２中のＣＢＨＩ遺伝子の３′末端に接するｐＤＧ
１５１ベクター領域に含まれるＡｈａIII 部位である。
次にこの断片をＢａｍＨＩで消化して２つのサブフラグ
メント、すなわち５′ＣＢＨＩ配列をコードする１０６
８bp ＡｈａIII ／ＢａｍＨＩ断片、及び３′ＣＢＨＩ
配列をコードし、さらに細菌ＤＮＡ及び３′非翻訳ＥＮ
Ｏ１配列の広がりを含有する１．１３kb ＢａｍＨＩ／
ＡｈａIII 断片を得る。

【０２１９】プラスミドｐｅｎｏＣＢＨ２４をＨｉｎｄ
III で消化し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理し、そして次に
ＢａｍＨＩで消化した。前記の断片及びｐｅｎｏＣＢＨ
２４からのベクターＤＮＡ断片を２：１のモル比で接着
末端条件下で連結し、そして次に平滑末端条件下で連結
した。この連結混合物を用いてＥ．コリＫ１２／ＭＭ２
９４株をＡｍｐ^R に形質転換し、そして好結果の形質転
換体を、５′ＣＢＨＩ配列を含有する目的の１２．２kb
プラスミドについてスクリーニングした。ＥｃｏＲＩ消
化において２．０５kb断片を放出し、そしてＨａｅIII
消化において２００bp断片を放出することにより同定さ
れた好結果の候補をｐｅｎｏＣＢＨ５００Ｘと命名し
た。ここでＸは後で特定する標識番号である。プラスミ
ドを、成熟ＣＢＨＩコード配列のヌクレオチド３１−４
８に相補的な内部オクタマープライマーを用いて、ジデ
オキシＤＮＡ配列分析によりさらに分析した。プラスミ
ドｐｅｎｏＣＢＨ５００．２０２は次の配列、

【０２２０】

【表１１】 をコードし、ＨｉｎｄIII 接着末端の正確な除去及びＡ
ｈａIII ／ＣＢＨＩ ＤＮＡ断片への融合が示された。
プラスミドｐｅｎｏＣＢＨ５００．１０８、及びｐｅｎ
ｏＣＢＨ５００．１５０は次の同じＤＮＡ配列、

【０２２１】

【表１２】 をコードし、１個のＡ／Ｔ塩基対がＳ１ヌクレアーゼ処
理中に除去されたことが示された。プラスミドｐｅｎｏ
ＣＢＨ５００．２１２は次の配列、

【０２２２】

【表１３】 をコードし、２個のＡ／Ｔ塩基対、及び１個のＣ／Ｇ塩
基対がＥＮＯ１プロモーター断片から除去されたことが
示された。

【０２２３】Ｄ．１０．酵母におけるクローニングされ
たＣＢＨＩ遺伝子の発現 酵母Ｓ．セレビシエーＳ１７３−６Ｂ株をｐｅｎｏＣＢ
Ｈ５００．２０２により形質転換し、そしてＬＥＵ⁺ 形
質転換体について選択した。好結果の形質転換体コロニ
ーを培養し、そして最少培地に炭素源としてグルコース
を用いて１０ｌの発酵槽中で増殖せしめた。培養物は光
学濃度（ＯＤ₆₈₀)１０まで増殖した。発酵槽の内容物を
濾過し、液体画分を濃縮し、そして水に対して透析し
た。

【０２２４】得られた約１０ｌの培地を５００mlに減少
せしめ、そしてＤ．２に前記した方法に従って、ＤＥＡ
Ｅセファロースカラムに適用することによりさらに精製
した。５００mgの蛋白質をカラムに適用し、約４３７mg
を非吸着画分中に回収し、そして約１００mg、すなわち
１８％をＣＢＨＩに対応する単一ピークとして溶出し
た。

【０２２５】Ｄ．１０．ｃ．酵母において組換法により
生産されたＣＢＨＩの特徴付け 分泌され精製されたＣＢＨＩ（組換ＣＢＨＩ）を特徴付
け、そしてＤ．２項に前記した方法に従って分離された
天然Ｔ．リーゼイＣＢＨＩと比較した。結果を後記の表
１４に要約する。組換ＣＢＨＩ及び天然ＣＢＨＩのウエ
スタンブロット分析を標準的方法に従って行った。図１
３中のレーン１及び３は、それぞれ天然ＣＢＨＩ及び組
換ＣＢＨＩのゲルパターンを示す。表２に示すように、
ブロット分析により、天然ＣＢＨＩの見かけ分子量は約
６０ｋドルトンであり、そして組換ＣＢＨＩのこれは約
１００ｋドルトン〜２００ｋドルトンの間であることが
示された。

【０２２６】２種類の酵素をグリコシダーゼエンド−Ｈ
で処理した。このグリコシダーゼは、蛋白質のＮ−結合
グリコシル残基を脱グリコシル化する。脱グリコシル化
処理した天然蛋白質及び組換蛋白質を上記のようにウエ
スタンブロット分析により試験した。結果をそれぞれ図
１３中のレーン２及びレーン４に示す。

【０２２７】この図から明らかなように、脱グリコシル
化された両蛋白質はおよそ同じ分子量を有し、組換ＣＢ
ＨＩは、天然ＣＢＨＩと異り、大きなＮ−結合残基によ
って高度にグリコシル化されていることが示された。こ
れに対して天然ＣＢＨＩは、表２に示すように主として
Ｏ−結合残基を含有することが知られる。グリコシル化
された組換ＣＢＨＩの見かけ分子量が非常に大きいの
は、Ｎ−結合糖残基が、天然酵素中のＯ−結合グリコシ
ル化における部位当り１〜２糖残基と比べて長いためで
ある。

【０２２８】精製された天然酵素及び組換酵素のＣＢＨ
Ｉ活性を常法に従って、燐酸膨潤セルロースからのセロ
ビオースの生成について測定した。表２からわかるよう
に、Lowryの蛋白質測定に基いて、天然ＣＢＨＩは約
０．５７ユニット／mgの比活性を有し、組換ＣＢＨＩの
それは０．３４ユニット／mgであった。蛋白質のアミノ
酸組成に基いて、組換ＣＢＨＩについての一層高い比活
性値（０．４６ユニット／mg）が算出された。明らかな
ように、この発明の組換ＣＢＨＩは、Ｔ．リーゼイ由来
の天然ＣＢＨＩとほとんど同じ比活性を有する。

【０２２９】

【表１４】

【０２３０】組換ＣＢＨＩの同一性を確認するために、
Ｄ．２項に前記した方法を用いて、アミノ末端断片（残
基１〜３７）及び中間断片（残基２２５〜２５１）のア
ミノ酸配列を決定した。２つの配列はそれぞれ、アミノ
酸組成において天然ＣＢＨＩの対応断片と同一であっ
た。興味あることに、組換蛋白質は成熟天然ＣＢＨＩと
同じアミノ末端ピログルタミンを含有し、（１）リーダ
ーポリペプチドの除去、及び（２）アミノ末端グルタミ
ン残基の環化を含む同じプロセシンが組換酵素において
生ずることが示された。

【０２３１】要約すれば、ＣＢＨセルラーゼをコードす
る遺伝子がクローニングされ、そして酵母において発現
された。そして、適当な制御配列を用いることにより種
々の宿主において発現するために改造することができ
る。組換ＣＢＨが入手できることは、セルロース廃棄物
の一層効果的な利用、及び最終的にはグルコース及びエ
タノールを包含する有用な誘導体への該廃棄物の転換及
びセルロース材料の特定の変性のための転換の可能性を
提供する。

【０２３２】ＣＢＨ遺伝子の造成及び発現を酵母におい
て発現されるＴ．リーゼイ遺伝子に関連させて説明した
が、この明細書に記載した技法は他のＣＢＨ遺伝子、例
えば種々の菌類由来のＣＢＨＩ遺伝子の造成に適用し得
ることが理解される。この明細書に説明した発現ベクタ
ーの、他の蛋白質の発現への一般的適用は前記のＢ．３
項に検討されている。

【０２３３】Ｅ．組換ＥＧＩの製造 この項は組換ＥＧＩ遺伝子、及び酵母におけるその発現
を説明する。例として、ＥＧＩコード配列をＨｉｎｄII
I カセットとして造成し、そして酵母エノラーゼ制限配
列に機能的に結合するように酵母発現ベクターに連結し
た。

【０２３４】Ｅ．１．ＥＧＩについて濃縮されたｍＲＮ
Ａの調製及びｃＤＮＡの合成 セルロース誘導Ｔ．リーゼイＬ２７株からポリ−Ａ Ｒ
ＮＡを得、そしてＤ．３に前記したのと実質上同様にし
てアガロース電気泳動により画分した。標準的方法に従
って精製ＥＧＩを用いてＥＧＩに対して特異的な抗体を
調製した。簡単に記載すれば、Shoemaker,S.等、Biotec
hnology （１９８３年１０月）６８７に記載されている
方法によって得た精製ＥＧＩをフロインドのアジュバン
トと混合し、そして０．２〜０．４mlの混合物をニュー
ジランドホワイトラビットに筋肉内注射した。抗体価が
Ouchterlony,O., Arkiv Kemi（１９４９）１：４３の二
重免疫拡散法により検出できるようになるまで１０日１
２１回注射を反復した。

【０２３５】正しいｍＲＮＡ画分を証明するため、少量
ずつの各ＲＮＡ画分を、 New England Nuclear Compan
y, ボストン, マチサューセッツから網状赤血球溶解物
／メチオニンＬ−（３５Ｓ）−翻訳系として販売されて
いる無細胞蛋白質合成系に加えた。この系により合成さ
れたＥＧＩの存否を、合成された全蛋白質のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ及び抗−ＥＧＩ抗体と免疫沈殿しそして次に解離
された翻訳系由来蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認
した。

【０２３６】Ｅ．２．ｃＤＮＡプローブの調製 無細胞合成系において高レベルのＥＧＩを合成したｍＲ
ＮＡ画分を選択し、そしてこれを用いてＤ．４項に前記
したのと実質上同様にして単鎖コピーＤＮＡを生成せし
めた。単鎖ＤＮＡをゲル電気泳動によりサイズ分析し、
期待されるｃＤＮＡサイズに対応する主要バンドを観察
した。

【０２３７】Ｅ．３．二重鎖ｃＤＮＡライブラリーの調
製 Ｅ．１項で調製したｍＲＮＡ画分を用いて、Maniatis
等、Molecular Cloning-A Laboratory Manual （１９８
２） Cold Spring Harbor Laboratory, コールドスプリ
ングハーバー, ニューヨーク、２３５−２３８頁の方法
に従ってｃＤＮＡライブラリーを作成した。こうして得
た二重鎖ｃＤＮＡを次に、標準的方法に従ってｐＵＣ−
８クローニングベクター中にクローニングし、そしてＥ
ＧＩをコードすることが知られている４kb ＨｉｎｄII
I ゲノム断片（前記）を用いて検出した。

【０２３８】プローブとハイブリド形成する３つのｃＤ
ＮＡクローン、すなわちｐｃＥＧ１０，ｐｃＥＧ９、及
びｐｃＥＧ１を選択してさらに検討した。これらを、制
限分析及びジデオキシ法を用いるｃＤＮＡ領域の配列決
定により分析した。ｐｃＥＧ１０は配列の３′領域をコ
ードし、そしてｐｃＥＧ１は５′部分をコードすること
が見出された。

【０２３９】Ｅ．４．ＥＧＩ遺伝子の調製及び配列決定 Ｔ．リーゼイＬ２７株からのλ−ファージ中のゲノムラ
イブラリーを、Shoemaker,S.等、BioTechnology （１９
８３年１０月）６９１−６９６頁に記載されている方法
（この記載を引用によりこの明細書に組み入れる）、及
びさらにＤ．５項に前記した方法により調製した。

【０２４０】このλ−ゲノムライブラリーを、Shoemake
r,S.等（前掲）に記載されているようにして、但しプロ
ーブとしてＥ．２項において調製した単鎖ｃＤＮＡを使
用してスクリーニングした。陽性反応を示すファージか
らの１つの断片をｐＵＣ８にサブクローニングし、ｐＵ
Ｃ８−ｈを得た。このベクターは、全ＥＧＩ遺伝子にわ
たる４kb ＨｉｎｄIII 断片を含有する。

【０２４１】この断片中のコード配列の位置を、制限分
析、並びに５′末端合成オリゴヌクレオチド及び３′末
端ｃＤＮＡプローブへのハイブリド形成により決定し
た。ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩと共にＫｐｎＩ，ＳｓｔＩ，
ＸｂａＩ及びＳｐｈＩを用いて消化し、そしてプローブ
として成熟ＥＧＩ配列のアミノ酸残基１６−２０に対応
し、４ヌクレオチドのあいまいさ(ambiguity) を有する
１６ｍｅｒを用いて、サザンブロット分析〔 Southern,
J.Mol.Biol.（１９７５）９８：５０３〕に付した。そ
の結果、遺伝子の主要部分がＫｐｎＩ部位及びＳｓｔＩ
部位の間に位置することが示された。ｐＵＣ８−ｈゲノ
ムＤＮＡの制限地図を図１４のＡに示す。

【０２４２】さらに、４kb ＨｉｎｄIII 配列の部分と
ＥＧＩコード配列との同一性を制限／選択実験によって
確認した。４kb断片を、Harpold,M.H.等、Nucleic Acid
Res．（１９７８）５：２０３９の方法に従ってニトロ
セルロース濾紙に結合せしめた。誘導された培養物由来
の全ｍＲＮＡを濾紙に加え、そして結合したｍＲＮＡを
強力な条件下で洗浄することにより非結合ｍＲＮＡから
分離した。次に濾紙に結合したｍＲＮＡを溶出した。

【０２４３】各濾紙について、結合ｍＲＮＡ画分及び非
結合ｍＲＮＡ画分を無細胞蛋白質合成系において翻訳
し、そして合成された蛋白質を抗−ＥＧＩ抗体及びスタ
フィロコッカス・アウレウス細胞の混合物を用いて沈殿
せしめた。免疫沈殿物からの蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
に付した。実験結果を図１５に示す。図中のレーン１は
並行して泳動した幾つかの分子量マーカーを示す。レー
ン２は無細胞合成系中で生産された全ポリＡ−ＲＮＡ翻
訳生成物のゲルである。全翻訳生成物の抗−ＥＧＩ免疫
沈殿をレーン３に示す。分子量においてＥＧＩに対応す
る単一バンドを示す。

【０２４４】プローブとハイブリド形成するポリＡ−Ｒ
ＮＡの翻訳生成物のゲルパターンをレーン４に示す。こ
のレーンはＥＧＩの分子量に相当する主たるバンドを示
す。レーン４の材料は、抗−ＥＧＩ抗体により免疫沈殿
した後、レーン５に示されるＥＧＩについて期待される
分子量を有する単一バンドをもたらす。レーン６及び７
はそれぞれ、４kb ＨｉｎｄIII 断片とハイブリド形成
しなかったポリＡ−ＲＮＡより指令された翻訳生成物の
すべて、及び抗−ＥＧＩ免疫沈殿物を示す。図から明ら
かな通り、４kb ＨｉｎｄIII 断片を含有する濾紙に結
合したｍＲＮＡのみが、抗−ＥＧＩにより免疫沈殿する
蛋白質の合成を指令することができた。

【０２４５】次に、ＥＧＩ遺伝子の完全コード配列を標
準的制限法及び配列決定法を用いて得た。結果を後の表
３に示す。配列決定された断片は１６９７ヌクレオチド
を含有し、この配列は成熟蛋白質の４３７アミノ酸残基
のコード配列に先行する２２アミノ酸リーダー配列のた
めの６６ヌクレオチドを包含する。ＤＮＡ配列はさら
に、ヌクレオチド位置８９３〜９６２、及び１５５３〜
１６０９に２個のイントロンを含有する。

【０２４６】イントロンの位置は、このコード配列をｃ
ＤＮＡｐｃＥＧ１０及びｐｃＥＧ１の同様の配列決定に
より得られた配列と比較することにより、そして公知の
アミノ酸配列（表に示してある）と比較することにより
推定した。リーダーペプチド（アミノ酸１−２２）に対
応するコード配列はＥＧＩの分泌を開始するためのシグ
ナル配列を提供し、そしてこの明細書においてＥＧＩシ
グナル配列と称する。表３のアミノ酸配列は、連続した
形でＥＧＩのポリペプチド配列である。

【０２４７】

【表１５】

【０２４８】

【表１６】

【０２４９】

【表１７】

【０２５０】

【表１８】

【０２５１】

【表１９】

【０２５２】Ｅ．５．インターフェロン不含ＥＧＩコー
ド配列の造成 Ｅ．４項からのプラスミドｐＵＣ８−ｈをＳｐｈＩで消
化し、そしてＳｐｈＩ断片をアガロースゲル上で精製し
た。分離された断片を、標準的方法に従ってＳｐｈＩ消
化Ｍ１８ｍｐ８にクローニングした。連結されたファー
ジをコンピテントＥ．コリＤＧ９８株に形質転換し、そ
して細胞を、ＩＰＴＧ（５×１０^-4Ｍ）の存在下Ｘ−ｇ
ａｌ（４０mg／ml）を含有するプレート上にプレートし
た。非α−補完白色プラークを、期待される１０．３kb
サイズの組換単鎖ファージＤＮＡについてスクリーニン
グした。ＪＶ８２．２と称する目的とする組換ファージ
の構造を制限分析を用いて確認した。この構成を図１４
フレームＢに示す。このベクターをφ８２．２と命名す
る。

【０２５３】下流イントロンの除去はゲノムクローンの
３′部分を、濃縮されたｍＲＮＡから調製されたｃＤＮ
Ａクローンの対応部分で置き換えることにより行い、そ
して制限分析により特徴付けた。具体的には、ＪＶ８
２．２をＰｓｔＩで完全消化し、そしてこの消化物をｐ
ｃＥＧ１０からのＰｓｔＩ消化断片と連結し、図１４の
コードフレームＣ中に示されるＪＶ１０４．３４（φ１
０４．３４）を得る。ｐｃＥＧ１０からのＰｓｔＩ断片
は、下流イントロンを含有する部分を含むゲノムクロー
ン中のコード領域に対応するコード領域を含む。すなわ
ちＪＶ１０４．３４は下流イントロンが除去されたＥＧ
Ｉ遺伝子の完全コード配列を含む。

【０２５４】上流イントロンを除去するために、部位特
定変異誘発を用いた。第１上流イントロンを含む配列に
相補的であるがイントロン配列を欠いているオリゴヌク
レオチドプライマーを合成した。このプライマー配列： ５′−GGCAGCGGCTACCAAAAGCTACTACGGCCCCGGAGA−３′ を有する。組換えＭ１３ｍｐ１９バクテリオファージＪ
Ｖ１０４．３４をＥ．コリＫ１２／ＤＧ９８株中に調製
し、そして常法に従って単鎖ファージを精製した。

【０２５５】単鎖ファージをＤＮＡ合成のためのプライ
マーとして用いて、標準的方法に従ってプライマーとし
て合成オリゴマーを用いる部位特定変異誘発を行った。
プローブとして放射ラベルしたオリゴマーを用いるスク
リーニングにより得られた好結果のバクテリオファージ
候補ＪＶ１２９．３（φ１２９．３）を図１４のフレー
ムＤに示す。ＪＶ１２９．３は適切なリーディングフレ
ーム中に完全な非中断ＥＧＩコード配列を含有する。

【０２５６】イントロン不含遺伝子をさらに精巧にし、
図１４フレームＥ及びＦに示すように、コード配列の直
接上流及び下流にＨｉｎｄIII 部位を設けてＨｉｎｄII
I カセットとして操作できるようにした。上流Ｈｉｎｄ
III 部位を設けるために、コード配列の直接上流の配列
に相補的であるが、ＡＴＧ翻訳開始コドンの５′に隣接
してＨｉｎｄIII 部位を形成するために６個のミスマッ
チを有する合成オリゴヌクレオチド：

【０２５７】 ５′−CTTAGTCCTTCTTGAAGCTTTAAAATGGCGCCCT−３′ を使用して、上記の部位特定変異誘発により天然上流配
列を置き換えた。得られたファージをＨｉｎｄIII を用
いてさらに処理し、そして再連結して新しい５′近くの
ＨｉｎｄIII と図１４フレームＡ〜Ｄに示す上流部位と
の間のＤＮＡ部分を除去し、ＪＶ１３４．１（図１４中
フレームＥのφ１３４．１）を得た。

【０２５８】同様にして、部位特定変異誘発法において
合成ヌクレオチド： ５′−AATGCCTTTAGAAGCTTGACTTGCCT−３′ を使用してＥＧＩ遺伝子を含有するＭ１３ベクターを、
ＨｉｎｄIII カセットＪＶ１３９．２（図１４中フレー
ムＦ，φ１３９．２）として造成した。

【０２５９】Ｅ．６．ＥＧＩコード配列を含有する発現
ベクターの造成 エノラーゼ−１プロモーター及びエノラーゼ−１ターミ
ネーターの制御のもとにＥＧＩ配列を含有する酵母にお
いて有用な発現ベクターを、酵母宿主ベクターｐＭＡＣ
１０１のＨｉｎｄIII 部位にＨｉｎｄIII カセットを連
結することにより造成した。

【０２６０】ｐＭＡＣ１０１は変形された酵母エノラー
ゼ−１（ＥＮＯ１）プロモーター配列及び酵母エノラー
ゼ−１（ＥＮＯ１）ターミネーター配列の間に設けられ
たＨｉｎｄ切断部位を含有する１０．２kbベクターであ
る。このベクターはさらに、酵母ＬＥＵ２遺伝子、酵母
２μ複製開始点、並びにｐＢＲ３２２の複製開始点及び
Ａｍｐ^R 部分を含有する。ｐＭＡＣ１０１は、下に記載
するように、ベクターｐＪＶ１６０から、該ベクター中
のＨｉｎｄIII 遺伝子カセットを除去することにより容
易に得られる。

【０２６１】酵母におけるＥＧＩのための発現ベクター
ｐＪＶ１６０を造成するために、ｐＭＡＣ１０１をＨｉ
ｎｄIII により完全消化し、そして複製形（ＲＦ）のＪ
Ｖ１３９．２から切り出されたＨｉｎｄIII カセットに
連結した。連結混合物を使用して酵母Ｃ４６８株を形質
転換した。好結果の形質転換体をＬＥＵ⁺ について選択
し、そして陽性の候補を、下記のようにカルボキシメチ
ルセルロース（ＣＭＣ）の上層を透明にする能力により
測定した。（セルラーゼの複合体酵素の内エンドグルカ
ナーゼのみがカルボキシメチルセルロースを加水分解す
るために適当な特異性を有する。セロビオヒドロラーゼ
はセルラーゼ自体に特異的であり、ＣＭＣを加水分解し
ない。）

【０２６２】Ｅ．７．酵母におけるＥＧＩの発現の確認 ＬＥＵ２⁺ について選択した後、３種類の好結果の形質
転換体を、Teather,R.等、Appld.Envir.Micro.（１９８
２）４３：７７７の方法に実質上従って、ＥＧＩの生成
について測定した。コロニーを最少培地上に３０℃にて
増殖せしめ、そして０．５％ＣＭＣ，１５mM ＮａＯＡ
ｃ，pH４．５、及び１０mMナトリウムアジドを含有する
上層寒天（０．８％）で覆った。次にプレートを３７℃
にて４時間インキュベートした。ＣＭＣの透明化を可視
化するために、プレートを１mg／mlのコンゴーレッドに
より１５分間処理し、そして１Ｍ ＮａＣｌで５分間処
理し、次に１Ｍ ＨＣｌで５分間処理した。

【０２６３】分泌される機能的に活性なＥＧＩを生産す
る３種類の酵素形質転換体の能力を試験するために、３
種類の形質転換体のそれぞれ、及びｐＭＡＣ１０１で形
質転換された酵母（対照）の培養上清液を調製した。上
清サンプル（１倍、又は２０倍に濃縮したもの）をＣＭ
Ｃプレート上にスポットし、そして上記のようにしてＥ
ＧＩ活性について測定した。

【０２６４】結果を図１６に示す。スポット１〜４は、
３種類のＥＧＩ（１−３）及び対照（４）の１倍濃度の
結果であり、スポット５〜８は対応する２０倍濃度の結
果である。図から明らかなように、すべてのＥＧＩ形質
転換体は活性なＥＧＩを分泌したが対照形質転換体は分
泌しなかった。スポット９はＴ．リーゼイ由来の天然Ｅ
ＧＩにより形成されたものである。

【０２６５】ＥＧＩの発現の証明はまた、ウエスタンブ
ロット法によっても行った。３種類の酵母培養物からの
前記の測定によってＥＧＩ活性を示す濃縮された培養上
清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動し、ニトロセルロースに
移し、そして抗−ＥＧＩ抗体を用いて検出し、次に ¹²⁵
Ｉで放射性ラベルしたｓｔａｐｈＡ蛋白質で処理した。

【０２６６】図１７中レーン１はＴ．リーゼイ由来の天
然の精製されたＥＧＩを示す。レーン２，３，４は３種
類のＥＧＩ酵母形質転換体のそれぞれの上清液のゲルパ
ターンである。図から明らかな通り、ＥＧＩ形質転換体
のそれぞれは天然ＥＧＩの分子量よりは幾分高い分子量
を有するポリペプチドを分泌する。このバンドは、ｐＭ
ＡＣ１０１を用いて形質転換した酵母からの上清液中に
は見出されなかった。ＥＧＩの分子量が高いのはおそら
く、ＣＢＨＩについてすでに記載したのと同様に、翻訳
後プロセシングにおいて天然ＥＧＩと異るためであろ
う。

【０２６７】酵母におけるＥＧＩの好結果の発現のため
に使用される方法は、ベクター制御配列における適当な
変形により、細菌宿主及び酵母宿主を含む種々の宿主に
おいて発現を達成するために適用することができる。Ｃ
ＢＨＩの場合と同様に、この発明の方法は、Ｔ．リーゼ
イ由来のＥＧIIを含む他の種々のエンドグルカナーゼの
遺伝のクローニング、及び発現を得るために使用するこ
とができる。

【０２６８】特に組換ＣＢＨＩと相俟って、組換ＥＧＩ
が入手可能であることは、セルロース生成物の一層効率
的な使用、セルロースの有用な誘導体への転換、及び／
又はセルロース材料の選択的変性の可能性を提供する。
ＣＢＨＩ，ＥＧＩ、及び場合によってβ−グルコシダー
ゼを含むセルロース分解系は、個々の分離された組換酵
素から、又はセルラーゼの組合せを含有する多宿主系を
使用することにより構成することができる。

【０２６９】前記のＡＴＣＣ及びＮＲＲＬへの寄託に加
えて、下記の微生物が、特許手続上の微生物の寄託の国
際的承認に関するブタペスト条約に基いてアメリカン・
タイプ・カルチュア・コレクション，１２３０１ パー
クラウンドライブ，ロックベレ，メリーランド，米国
（ＡＴＣＣ）に寄託され、維持されており、そしてブタ
ペスト条約に基いて入手可能である。これらの菌株の入
手可能性を、いずれかの国の特許法に基いてその政府の
権威の下に認められた権利に反してこの発明を実施する
ことの承諾であると解してはならない。

【０２７０】寄託には下記のＡＴＣＣ寄託番号、及びMa
ster Culture Collection of CetusCorporationの番号
が与えられた。

【表２０】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はセルラーゼ誘導炭素源の存在下（レーン
１）又は非存在下（レーン２）で増殖したＴ．リーゼイ
から分離されたポリＡ ＲＮＡのゲル電気泳動パターン
を示す。

【図２】図２は、無細胞合成系で生産されたポリペプチ
ドのゲル電気泳動パターンを示し、この系には（ａ）セ
ルラーゼ誘導条件下で増殖したＴ．リーゼイから得られ
た全ポリＡ ＲＮＡ（レーン１及び２）、（ｂ）全誘導
ポリＡ ＲＮＡの３つの異るサイズの画分（レーン３〜
８）、又は（ｃ）セルラーゼ非誘導条件下で増殖した
Ｔ．リーゼイの細胞から得られたポリＡ ＲＮＡのサイ
ズ画分（レーン９及び１０）が加えられ、この図におい
て奇数番号のゲルパターンは種々のＲＮＡサンプルの指
令のもとに合成された全ポリペプチドを示し、そして偶
数番号のゲルパターンは抗−ＣＢＨＩ抗体の存在下で免
疫沈殿する対応するペプチドを示す。

【図３】図３のＡは、Ｔ．リーゼイＬ２７株ゲノムＤＮ
Ａからの１．１６kb ＨｉｎｄIII 断片を含有するｐＣ
ＢＨ１５７と称するベクターの地図であり；図３のＢ
は、同じゲノムＤＮＡからの上記１．１６kb断片に隣接
する２．３kb ＨｉｎｄIII 断片を含有するｐＣＢＨ１
６４と称するベクターの地図を示す図である。

【図４】図４は、Ｔ．リーゼイＬ２７株からの隣接する
２個のＨｉｎｄIII ゲノム消化断片であって一緒になっ
てＣＢＨＩ遺伝子を含有するものの地図を示す図であ
る。

【図５】図５は、この発明の１つの態様において使用す
るＥ．コリ／Ｓ．セレビシエーシャトルベクターの地図
を示す図である。

【図６】図６は、この発明の１つの態様に従ってＣＢＨ
Ｉ遺伝子のイントロン不含５′端部分を造成する段階を
示す図である。

【図７】図７は、この発明の態様に従ってイントロン不
含ＣＢＨＩ遺伝子の３′端部分を造成する段階を示す図
である。

【図８】図８は、ｐＤＧ１５１（図５）及びｐＣＢＨ５
（図６）からのｐｔｒｐＣＢＨ５と称するベクターの造
成を示す図である。

【図９】図９は、ｐｔｒｐＣＢＨ５（図８）及びｐＣＢ
Ｈ３（図７）からの、完全な長さのイントロン不含ＣＢ
ＨＩ遺伝子を含有するｐｔｒｐＣＢＨ８と称するベクタ
ーの造成を示す図である。

【図１０】図１０は、ｐｔｒｐＣＢＨ５及びｐＣＢＨ５
からの、完全な長さを有するイントロン不含ＣＢＨＩ遺
伝子を含有するｐｔｒｐＣＢＨ８１と称するベクターの
造成を示す図である。

【図１１】図１１は、Ｅ．コリ中でのＣＢＨＩの発現に
適するベクターｐｔｒｐＣＢＨ８２の構成を示す図であ
る。

【図１２】図１２は、酵母中でのＣＢＨＩの発現に適す
るベクターｐｅｎｏ５００．２０２の造成を示す図であ
る。

【図１３】図１３は、天然ＣＢＨＩ及び組換ＣＢＨＩの
ウエスタンブロット分析の結果を示す図である。

【図１４】図１４は、フレームＡにおいてｐＵＣ８−ｈ
のＥＧＩコード部分の制限地図を、フレームＢ〜ＤにＥ
ＧＩのイントロン不含コード配列を造成するまでの一連
の段階を、そしてフレームＥ及びＦにＥＧＩコード配列
の直接上流及び下流にＨｉｎｄIII 部位を設けるための
段階を示す図である。

【図１５】図１５は、Ｔ．リーゼイからの４kb Ｈｉｎ
ｄIII 断片の、ＥＧＩ合成を指令することができるｍＲ
ＮＡを分離する能力を試験するハイブリド形成実験の結
果を示す図である。

【図１６】図１６は、ｐＪＶ１６０により形質転換され
たコロニーの、ＣＭＣを加水分解する能力を示す図であ
る。

【図１７】図１７は、ｐＪＶ１６０で形質転換された酵
母及び対照ベクターで形質転換された酵母の培養上清液
において行われたウエスタンブロットのラジオオートグ
ラム図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:885） (72)発明者 マイケル アラン イニス アメリカ合衆国，カリフォルニア 94602，オークランド，カールセン ス トリート 3133 (72)発明者 ジャネル バン アースデル アメリカ合衆国，カリフォルニア 94803，エル ソブランテ，サン パブ ロ ダム ロード 4172エー (72)発明者 シャーリー イー ウォク アメリカ合衆国，カリフォルニア 94583，サン ラモン，ロモンド サー クル 611 (72)発明者 マーサ ベイリー ラドナー アメリカ合衆国，カリフォルニア 94804，リッチモンド，バレット アベ ニュ 2800 (72)発明者 ビッキー シュウェイカート アメリカ合衆国，カリフォルニア 94707，ケンシングトン，バリィ ロー ド 1513

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エンドグルカナーゼをもたらす次のアミ
   ノ酸配列： Y-Gln Gln Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val His Pro Lys Leu Thr Thr Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Val Ala Gln Asp Thr Ser Val Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His Asp Ala Asn Tyr Asn Ser Cys Thr Val Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr Leu Cys Pro Asp Glu Ala Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe Ile Glu Gly Val Asp Tyr Ala Ala Ser Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr Met Asn Gln Tyr Met Pro Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Val Ser Pro Arg Leu Tyr Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Val Met Leu Lys Leu Asn Gly Gln Glu Leu Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Ala Leu Pro Cys Gly Glu Asn Gly Ser Leu Tyr Leu Ser Gln Met Asp Glu Asn Gly Gly Ala Asn Gln Tyr Asn Thr Ala Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Pro Val Gln Thr Trp Arg Asn Gly Thr Leu Asn Thr Ser His Gln Gly Phe Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Leu Glu Gly Asn Ser Arg Ala Asn Ala Leu Thr Pro His Ser Cys Thr Ala Thr Ala Cys Asp Ser Ala Gly Cys Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Thr Lys Ser Tyr Tyr Gly Pro Gly Asp Thr Val Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr Ile Ile Thr Gln Phe Asn Thr Asp Asn Gly Ser Pro Ser Gly Asn Leu Val Ser Ile Thr Arg Lys Tyr Gln Gln Asn Gly Val Asp Ile Pro Ser Ala Gln Pro Gly Gly Asp Thr Ile Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala Tyr Gly Gly Leu Ala Thr Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met Val Leu Val Phe Ser Ile Trp Asn Asp Asn Ser Gln Tyr Met Asn Trp Leu Asp Ser Gly Asn Ala Gly Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser Asn Ile Leu Ala Asn Asn Pro Asn Thr His Val Val Phe Ser Asn Ile Arg Trp Gly Asp Ile Gly Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Arg Arg Ser Ser Thr Thr Ser Ser Ser Pro Ser Cys Thr Gln Thr His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Cys Lys Thr Cys Thr Ser Gly Thr Thr Cys Gln Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu （配列中、Ｙは存在しないか、又は次のアミノ酸配列： Met Ala Pro Ser Val Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ile Ala Arg Leu Val Ala Ala を有するリーダー配列を示す）、又は 該アミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が
   付加、欠失もしくは置換されており且つエンドグルカナ
   ーゼの酵素活性をもたらすアミノ酸配列、をコードして
   いる塩基配列を含んで成るＤＮＡ。
2. 【請求項２】 イントロンを含有している特許請求の範
   囲第１項に記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 イントロンを含有することなく前記アミ
   ノ酸配列をコードしている特許請求の範囲第１項に記載
   のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 エンドグルカナーゼをもたらす次のアミ
   ノ酸配列： Y-Gln Gln Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val His Pro Lys Leu Thr Thr Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Val Ala Gln Asp Thr Ser Val Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His Asp Ala Asn Tyr Asn Ser Cys Thr Val Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr Leu Cys Pro Asp Glu Ala Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe Ile Glu Gly Val Asp Tyr Ala Ala Ser Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr Met Asn Gln Tyr Met Pro Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Val Ser Pro Arg Leu Tyr Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Val Met Leu Lys Leu Asn Gly Gln Glu Leu Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Ala Leu Pro Cys Gly Glu Asn Gly Ser Leu Tyr Leu Ser Gln Met Asp Glu Asn Gly Gly Ala Asn Gln Tyr Asn Thr Ala Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Pro Val Gln Thr Trp Arg Asn Gly Thr Leu Asn Thr Ser His Gln Gly Phe Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Leu Glu Gly Asn Ser Arg Ala Asn Ala Leu Thr Pro His Ser Cys Thr Ala Thr Ala Cys Asp Ser Ala Gly Cys Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Thr Lys Ser Tyr Tyr Gly Pro Gly Asp Thr Val Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr Ile Ile Thr Gln Phe Asn Thr Asp Asn Gly Ser Pro Ser Gly Asn Leu Val Ser Ile Thr Arg Lys Tyr Gln Gln Asn Gly Val Asp Ile Pro Ser Ala Gln Pro Gly Gly Asp Thr Ile Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala Tyr Gly Gly Leu Ala Thr Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met Val Leu Val Phe Ser Ile Trp Asn Asp Asn Ser Gln Tyr Met Asn Trp Leu Asp Ser Gly Asn Ala Gly Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser Asn Ile Leu Ala Asn Asn Pro Asn Thr His Val Val Phe Ser Asn Ile Arg Trp Gly Asp Ile Gly Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Arg Arg Ser Ser Thr Thr Ser Ser Ser Pro Ser Cys Thr Gln Thr His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Cys Lys Thr Cys Thr Ser Gly Thr Thr Cys Gln Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu （配列中、Ｙは存在しないか、又は次のアミノ酸配列： Met Ala Pro Ser Val Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ile Ala Arg Leu Val Ala Ala を有するリーダー配列を示す）、 又は該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸
   が付加、欠失もしくは置換されており且つエンドグルカ
   ナーゼの酵素活性をもたらすアミノ酸配列、をコードし
   ている塩基配列を含んで成る発現ベクター。
5. 【請求項５】 エンドグルカナーゼをもたらす次のアミ
   ノ酸配列： Y-Gln Gln Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val His Pro Lys Leu Thr Thr Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Val Ala Gln Asp Thr Ser Val Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His Asp Ala Asn Tyr Asn Ser Cys Thr Val Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr Leu Cys Pro Asp Glu Ala Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe Ile Glu Gly Val Asp Tyr Ala Ala Ser Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr Met Asn Gln Tyr Met Pro Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Val Ser Pro Arg Leu Tyr Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Val Met Leu Lys Leu Asn Gly Gln Glu Leu Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Ala Leu Pro Cys Gly Glu Asn Gly Ser Leu Tyr Leu Ser Gln Met Asp Glu Asn Gly Gly Ala Asn Gln Tyr Asn Thr Ala Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Pro Val Gln Thr Trp Arg Asn Gly Thr Leu Asn Thr Ser His Gln Gly Phe Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Leu Glu Gly Asn Ser Arg Ala Asn Ala Leu Thr Pro His Ser Cys Thr Ala Thr Ala Cys Asp Ser Ala Gly Cys Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Thr Lys Ser Tyr Tyr Gly Pro Gly Asp Thr Val Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr Ile Ile Thr Gln Phe Asn Thr Asp Asn Gly Ser Pro Ser Gly Asn Leu Val Ser Ile Thr Arg Lys Tyr Gln Gln Asn Gly Val Asp Ile Pro Ser Ala Gln Pro Gly Gly Asp Thr Ile Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala Tyr Gly Gly Leu Ala Thr Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met Val Leu Val Phe Ser Ile Trp Asn Asp Asn Ser Gln Tyr Met Asn Trp Leu Asp Ser Gly Asn Ala Gly Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser Asn Ile Leu Ala Asn Asn Pro Asn Thr His Val Val Phe Ser Asn Ile Arg Trp Gly Asp Ile Gly Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Arg Arg Ser Ser Thr Thr Ser Ser Ser Pro Ser Cys Thr Gln Thr His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Cys Lys Thr Cys Thr Ser Gly Thr Thr Cys Gln Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu （配列中、Ｙは存在しないか、又は次のアミノ酸配列： Met Ala Pro Ser Val Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ile Ala Arg Leu Val Ala Ala を有するリーダー配列を示す）、 又は該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸
   が付加、欠失もしくは置換されており且つエンドグルカ
   ナーゼの酵素活性をもたらすアミノ酸配列、をコードし
   ている塩基配列を含んで成る発現ベクターにより形質転
   換された酵母。