JPH0616709B2 - セロビオヒドロラーゼｉをコードする遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明はセルロースの分解及び変性に関し、特にこの
ために有用な酵素に関する。さらに詳しくは、この発明
は、セロビオヒドロラーゼＩをコードする遺伝子、並び
にそれを含有する発現ベクター及び宿主に関する。

（従来の技術） 世界の最も豊富な再生産可能な資源は、木材料及び草材
料の主要な構造成分であるセルロース、すなわちグルコ
ースの重合体である。このため、セルロースは、いわゆ
る廃棄物、例えば都市固形廃棄物、使用済紙製品、及び
農作物の副産物の大きな部分を成す。食料として直接使
用するために、又はエタノールのごとき有用な他の物質
の出発材料として使用するために、これらの廃棄物から
グルコースを得ることは有利であろう。セルロース出発
材料をグルコース最終生成物に転換するために、限られ
た技法が使用可能である。酸加水分解のごとき種々の非
酵素的方法が試みられているが、これらの方法は商業的
に競争できるだけの十分な特異性と生成物の純度に欠け
ている。

他の重要な方法は、天然由来のセルロース分解性酵素の
使用、又はこれらの酵素を有する微生物の直接的使用で
ある。利用し得る酵素活性レベルが容易に操作できない
因子によって制御されるため、これらの方法もまた経済
的欠点を有していた。

従って、セルロース生産性微生物の改良された菌株を開
発し、そして組換型のセルラーゼ遺伝子を、炭素源とし
てセルロースを利用することができない微生物に導入す
ることに興味が持たれる。特に、セルロース分解酵素遺
伝子を発酵微生物、例えばセルロースを加水分解してグ
ルコースのごとき基質を利用する能力を有しないが、卓
越した増殖及び生産性を有する発酵酵母に導入すること
が経済的に望ましいであろう。

典型的なセルラーゼ系は、セルロースの分解において協
働的に作用する３種類の主要なタイプの酵素を含む〔Gr
itzal,M.等，セルロースの加水分解：酵素的及び酸触媒
の機構（Hydrolysis of Cellulose:Mech.of Enzymatic
and Acid Catalysis），Brown,R.D.等編（1979），Am.C
hem.Soc.,ワシントンD.C.,237頁；Mandels M.等，プロ
セス・ビオケミストリー（Process Biochem.）（1978年
５月，７頁）〕。これらの酵素タイプはセロビオヒドォ
ラーゼ、エンドグルカナーゼ、及びβ−グルコシダーゼ
である。

セロビオヒドロラーゼ（CBH）はセルロース重合体の非
還元末端からセルロースを攻撃し、そして主生成物とし
てセロビオース（グルコースの二量体））を生成せしめ
る。２つのタイプのCBH酵素、すなわち、セロビオース
のみを生成せしめるセロビオヒドロラーゼ−Ｉ（CBH
Ｉ）、及びセロビオースとグルコースとの混合物を生成
せしるセロビオヒドロラーゼ−II（CBHII）が知られて
いる。CBH酵素はセルロース分解性非糸状細菌（nonfila
mentous bacteria）中には見出されておらず、従って菌
類（fungi）及び糸状細菌（filamentous bacheria）に
限られているようである。これらは高い基質特異性を有
し、そして高い基質親和性を有する。（誘導体にされた
形のセルロースはCBHによって広範囲には切断されな
い。） エンドグルカナーゼ（EG）はセルロース鎖中の内部グル
コシド結合を加水分解する。これらは菌類及び細菌に見
出され、そしてCBH酵素より広い基質特異性を有する。
これらは半無作為的にβ−グルコシド結合を攻撃し、そ
して誘導体にされたセルロース（例えば、カルボキシメ
チルセルロース）を基質として利用し、そして１，３−
β，Ｄ−結合及び１，６−β，Ｄ−結合を１，４−β，
Ｄ−結合と同様に加水分解するであろう。細菌及び菌類
から得られた若干の公知の形のＥＧ酵素が存在する。エ
ンドグルカナーゼ−Ｉ（EGＩ）は菌類トリコデルマ・リ
ーゼイ（Trichoderma reesei）において比較的高レベル
（細胞外蛋白質の５〜１０％）で生産され、この菌類に
おける第２のＥＧ活性を有するエンドグルカナーゼ−II
（EGII）は線状１，４−β，Ｄ−マンナンを攻撃して主
としてマンノビオースを生成せしることが示されてい
る。

β−グルコシダーゼは、CBHと同様に、グリコシドの非
還元末端を攻撃するが、可溶化されたセロ−オリゴサッ
カライド（鎖長６未満）にのみ作用してグルコース単位
を生成せしめる。従って、β−グルコシダーゼはCBH及
びＥＧのセロビオース生成物をグルコースに分解する。
全セルラーゼ系におけるβ−グルコシダーゼの存在は、
この酵素が最終生成物を供するためのみならず、ある種
のCBH及びＥＧはセロビオースによって阻害されるため
に、有意義である。従って、この生成物を涸渇させるた
めに追加の酵素を供することは、セルロースからグルコ
ースへの転換を助長する。

セルラーゼ系構成成分の上記の明確な反応特異性は、セ
ルロース性材料の制限された、そして限定された加水分
解を達成するために、複数の酵素を個別的に、又は選択
された組合わせにおいて使用することができることを示
唆している。限定された加水分解の目的は、セルロース
性材料の構造及び／又は機能的特性を所望のように変化
せしめることである。構造的変化の例には、鎖長、粘度
及びセルロース結合に影響を与える変化が含まれる。機
能的変化の例には、手ざわり、香り、及び材料に結合す
る水に影響を与える変化が含まれる。さらに、エンドグ
ルカナーゼは、その広い基質特異性の故に、他のβ−結
合重合体に作用する。この１つの例は、キシランに対す
るEGIの作用である。この発明を援護して行われた実験
において、ＥＧIIはβ−マンナンを転換して主としてマ
ンノビオースを生成せしめることが示された。このこと
はコーヒー工業において有意義である。なぜなら、β−
マンナンはコーヒー豆の外側を被覆する主たるポリサッ
カライドであり、そしてコーヒーの製造、特に凍結乾燥
コーヒーの製造において香味成分の抽出を妨害し、そし
て苦味を付与するからである。

セルラーゼ系の酵素は広く研究されており、そして確か
に、コード配列のクローニング及び発現を行うための試
みが行われている。例えば、Whitte,D.J等，ジーン「Ge
ne」（１９８２）１７：１３９；Cornet,P.等，FEBSミ
クロ．ビオレ．レターズ（FEBS Micro.Biol.Letters）
（１９８３）１６：１３７；Tuse,D.等，ゼネティック
・テクノロ・ニュース（Genetic Technol.News）（１９
８１）１１月，６頁；Abstract No. H１９ASM Annual M
eeting，１９８１年３月；Symposium ASM Annual Meeti
ng，１９８３年３月；Wilson,D.B.等，ビオ／テクノロ
ジー（BioTechnology）（１９８３）１：５９４；Teer
i,T.等，ビオ／テクノロジー（Bio／Technology）（１
９８３）１：６９６；及びCollmer,A.等，ビオ／テクノ
ロジー（Bio／Technology）（１９８３）１：５９４−
６０１を参照のこと。

先行する試みは、コード配列の入手源としてＴ．リーゼ
イを含む種々の細菌性及び菌類性入手源を用いている
が、分泌され、グリコシル化されており、そして生物学
的に活性な菌類性セルラーゼの酵母における発見を報告
したものはない。

（発明の概要） セロビオヒドロラーゼＩのコード配列が、この明細書に
開示する一般的方法により、中断されていない形で再構
成される。このような配列を適当な組換発現ベクターに
導入することによって、大量の又は増加した量のこれら
の酵素を、個別的に、又は組合わせて製造することがで
きる。これらの酵素の大量生産は、これらの酵素を溶解
された形で又は固定化された形で生体外において用いな
がら反応を行うことによてセルロースを加水分解するた
めにその活性を工業的に利用することを可能にする。こ
の方法に代えて、組換ベクターを適切な宿主生物に形質
転換し、この宿主生物を用いて所望の加水分解を行うこ
ともできる。生産された酵素は培地中に分泌されるのが
好ましい。

この発明の１つの観点に従えば、適当な菌類入手源、例
えT.リ-ゼイからセルラーゼ遺伝子が分離され、そしてそ
の配列が決定される。これらの配列及びこれらがもたら
す情報を用いて、成熟酵素に限定してコードするイント
ロン不含コード配列、又は所望により天然宿主からの分
泌のために機能するリーダー配列とリーディングフレー
ムが整合する成熟コード配列を構成することが可能であ
る。コード配列は、酵母のごとき異宿主において外来配
列の遺伝子発現を可能にする新規な発現ベクター中に置
かれる。この発現ベクターにより形質転換された宿主
は、セルラーゼを成熟した、グリコシル化された、機能
的に活性な形で生産し、そして分泌することができる。

この発明の他の特徴に従えば、宿主生物を形質転換する
ために使用される組換ベクターは、効率的なプロセシン
グのため及び酵母からのセルラーゼの分泌のために酵母
において機能することが示されるセルラーゼシグナル配
列を含有する。これらの配列はまた、酵母からの他の蛋
白質の分泌のために、好ましくはその天然宿主により通
常に分泌される蛋白質の分泌のためにも使用することが
できる。このような蛋白質の例にはアミラーゼ、プロテ
アーゼ、インターフェロン、リンポカイン、インシュリ
ン、及びホルモン類が含まれる。

この発明の他の観点においては、異る複数のセルラーゼ
酵素を所定の比率で生産する生物が、セルラーゼ酵素の
１又は複数を不活性化し又は変形して該酵素を所望の通
りに強化し、又は酵素の生産を防止するために操作され
る。例えば、CBHＩ酵素及びCBHII酵素の両者を生産する
菌類において、CBHII遺伝子を不活性化してCBHＩセロビ
オヒドロラーゼのみを生産する生物を得ることができ
る。選択されたセルラーゼを不活性化する方法は、一般
に、この発明に従って構成された組換セルラーゼ遺伝子
を不活性化し（例えば大セグメントの欠失により）、そ
してこの不活性化された遺伝子によりセルラーゼ生産生
物を形質転換することが含まれる。不活性化された遺伝
子とゲノム遺伝子との間の組換は選択されたゲノム遺伝
子の不活性化をもたらす。糸状菌類（filamentous fung
ul organism）に適用されるこの方法の実施可能性は、Y
elton,M.M.等，プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブサイエンス，米国（Proc.Nat.Acad.
Sci.,USA），（１９８４）８０：１４７０に示されてい
る。

この発明のこれらの及び他の目的及び観点は、添付され
た図面と共に以下の詳細な記載により明らかになるであ
ろう。

（具体的な態様） Ａ．定義 「セロビオヒドロラーゼ」、又は「エキソ−セロビオヒ
ドロラーゼ」又は「CBH」なる語は、この明細書におい
て使用される場合、セルロースをセルロース重合体鎖の
の非還元末端からセロビオース単位に切断することがで
きる蛋白質について用いる。CBH酵素は糸状細菌及び菌
類に存在することが知られているが、非糸状細菌におい
てはまだ証明されていない。少なくとも２つの形のCB
H、すなわちセロビオースのみを生成せしめるCBHＩ、及
びセロビオースとグルコースの混合物を生成せしめるCB
HIIがトリコデルマにおいて知られている。

この明細書において示すCBHＩ蛋白質は４９６アミノ酸
の配列を有し、そして１７アミノ酸のリーダー配列によ
り先行されている。このリーダー配列の除去によって生
成する成熟CBHＩは、約66,000ドルトンの分子量を有す
る。天然形において生産された場合、この蛋白質は主と
してセリン及び／又はスレオニンのOHへの結合を介して
のある程度のグリコシル化を示す（Gum,E.K.等，ビオケ
ミカ・ビオフィジカ・アクタ（Biochem.Biopheys.Act
a）（１９７６）４４６：３７１）。

「エンドグルカナーゼ」なる語は、セルロースを内部グ
リコシル部位において切断することができる酵素につい
て用いる。菌類、例えばＴ．リーゼイ、及び他の適当な
菌類に由来するＥＧＩ及びＥＧIIの両者を含む多くの形
のエンドグルカナーゼが知られている。

この明細書において例示されるＥＧＩは、成熟蛋白質で
あると考えられる４３７アミノ酸の配列を有し、そして
２２アミノ酸のリーダー配列に先行されている。この４
３７アミノ酸組成に基礎を置く分泌される形のアミノ酸
は約46,000ドルトンの分子量を有する。天然蛋白質は、
天然宿主により生産れた場合、ある程度のグリコシル化
を含むことが知られている〔Shoemaker,S.P.等，ビオケ
ミカ・ビオフィジカ・アクタ（Biochem.Biopheys.Act
a）（１９７８）５２３：１４７〕。

「β−グルコシダーゼ」は同様に定義される。これらの
酵素は、菌類のセルラーゼ系、及び細菌の系の部分を構
成する。これらは、Ｔ．リーゼイにおいては、少なくと
も２つの物質的形体、すなわちβ−グルコシダーゼ−
Ｉ、及びβ−グルコシダーゼ−IIとして存在することが
知られている。これらの酵素は、可溶性オゴサッカライ
ドからグルコースを生成せしめることによってセルロー
ス消化を完結する。この発明の組換β−グルコシダーゼ
は、この活性及び特異性を有しそしてアミノ酸配列が菌
類性β−グルコシダーゼのそれと絶対に同一であるか否
かは別にして実質上同等である蛋白質を包含する。

次のことは、上に定義した３タイプすべてに適用され
る。

すべての蛋白質は、それが調製される際のpHに依存して
潜在的に酸性塩又は塩基性塩である。蛋白質のすべての
イオン化形が定義内に含まれる。さらに、宿主系の性質
に依存してグリコシル化、燐酸化、アセチル化等の翻訳
後プロセシングにより分子にある種の変更が加えられる
ことが理解される。ポリペプチドのプロセス形及び非プ
ロセス系の両者がセルラーゼの定義に含まれる。同様
に、例えばスルフィドリル基の酸化のごときアミノ酸側
鎖の偶然的な又は意図しない化学的変形により構造変化
が生ずるであろう。このように変形された蛋白質もな
お、その変形が酵素活性を破壊しない限り定義内に含ま
れる。最後に、正確なアミノ酸配列内の小さな変更が、
酵素活性を破壊することなく行われることが期待され
る。このような変更には、配列内のアミノ酸の置き換
え、及び１又は複数のアミノ酸の付加と又は欠失が含ま
れ、そして酵素活性が維持される限り、これらの変形も
また定義に含まれる。ここで、アミノ酸の付加、欠失又
は置換は出願前周知技術である部位特定変異誘発（例え
ば、Nucleic Acid Research,Vol.10,No.20, p6487〜650
0,1982を参照のこと）により実施することができ、アミ
ノ酸の付加、欠失又は置換に関し、１又は複数のアミノ
酸とは、部位特定変異誘発法により付加、欠失又は置換
できる程度の数のアミノ酸を意味する。なお、部位特定
変異誘発の具体的な方法はこの明細書中B.l.e.項（第41
頁〜第42頁）に記載されている。

特に、２種類のセルラーゼ酵素は、配列間の１：１の対
応がおよそ存在する場合、「実質上同等」のアミノ酸配
列を有する。しかしながら、CBH、ＥＧ又はβ−グルコ
シダーゼ機能の喪失をもたらない、１又は複数のアミノ
酸における小さな変更はこの定義内にとどまるペプチド
を生じさせると考えられる。

特定の入手源に「由来する」特定のセルラーゼは、その
入手源により天然に生産されるアミノ酸配列に向けられ
る。

以下の説明において、Ｔ．リーゼイＬ２７由来のＥＧＩ
又はCBHＩに関連する完全ゲノム配列が「コード配列」
として使用される。これらのコード配列は、リーダーペ
プチドをコードする前配列（pre-sequence）を含有す
る。これらの説明において、生産された蛋白質の分泌を
得るのが有利であろうから、前配列が維持される。しか
しながら、他の場合には、細胞から分泌されない成熟蛋
白質を生産するのが好ましい。このリーダー又はその部
分を除去するためにコード配列を変更するための手段、
従って非分泌形の成熟蛋白質の生産を行うための手段
は、技術の範囲内である。このような成熟蛋白質のほか
に、この発明はさらに、分泌され又は分泌されない融合
形のセロビオヒドラーゼ、エンドグルカナーゼ又はβ−
グルコシダーゼ、並びに関連する製造手段及び料に関す
る。

下の説明において、「標的遺伝子」なる語はＥＧＩ蛋白
質又はCBHＩ遺伝子について用いる。これに関連して、
この遺伝子の正確な性質がどうであるか、すなわちこれ
が成熟蛋白質、融合蛋白質又はリーダー配列含有蛋白質
のいずれをコードするかは明らかであり、そしてこれが
前配列を含有するか否か、成熟蛋白質又は融合蛋白質と
してのその形に関係なく、そのように称されるであろ
う。

適当なセルラーゼ基質、例えばセルロースの「処理」
は、選択された基質の変形を生じさせるため、又は基質
の加水分解（セルロースからグルコースへの完全加水分
解、もしくは限定され制御された加水分解／変形を含
む）を行うために設計された加水分解的酵素反応を含
む。

「制御配列」なる語は、特定の宿主において特定のコー
ド配列の発現を制御するDNA配列について用いる。宿主
の種類に応じて、これらには、プロモーター、オペレー
ター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハン
サー、及びあるレベルの発現を行うのに必要な他の配列
が含まれる。「適切な」制御配列なる語は、関連する特
定の宿主に適合性の制御配列について用いる。

「シグナル配列」と称する制御配列の１つは、この明細
書においては、蛋白質鎖の放出（export）を開始するた
めに機能するアミノ酸の配列と定義される。シグナル配
列は、生長しつつある蛋白質鎖の放出（export）が開始
された後、特定の部位において成熟蛋白質から切断され
る。この用語はさらにリーダー配列又はリーダーペプチ
ドを含む。ここでで、好ましい１つのシグナル配列は、
第１表に示されているＴ．リーゼイ由来のCBHＩのため
の推定された配列である。他の１つは第３表に示される
Ｔ．リーゼイ由来のＥＧＩのたのそれである。

「機能的に連結された（operably linked）」なる語
は、系の構成成分の活性が維持される態様における遺伝
子要素の、及び制御配列についての並置（juxtapositio
n）について用いる。特に、「制御配列に機能的に連結
されたコード配列」なる語は、コード配列が適当な宿主
中で発現されるような配置を意味する。与えられた制御
配列は、その効率に関して極大化され得るであろうが、
「適切な制御配列に機能的に連結された」なる語は、単
に、ある有用なレベルの発現をもたらすために十分な制
御配列効率が用いられ得ることを意味する。

「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、及び「宿主細
胞」なる語は相互交換可能に使用され、そして文脈から
そうでないことが明らかでない限り、最の一般的な場合
を意味する。

他のベクターの「誘導体」であるベクターは、「誘導
体」ベクターの合成に導く一連の段階において親ベクタ
ーが用いられたことを意味する。

Ｂ．一般的記載 B.1. 組換セルラーゼの製造 一般に、以下に説明する方法において、組換形セルラー
ゼ酵素の製造は次の段階を含む。

(1) 成熟セルラーゼ蛋白質、融合形の蛋白質、又は切
除され得る形もしくは回収され得る形のリーダー配列に
より先行されている蛋白質のための、イントロンによっ
て中断されていないコード配列を得； (2) セルラーゼコード配列を、段階(1)に従ってイント
ロを除去する前又は除去した後に、複製可能な発現ベク
ターの適切な制御配列と機能的に連結し； (3) こうして形成した発現ベクターを適切な宿主に形
質転換し； (4) 形質転換された宿主を、組換セルラーゼ酵素の生
産を行うために好都合な条件下で培養し；そして、 (5) 場合によっては、培地又は細胞からセルラーゼを
回収する。セルロースの分解のためにセルラーゼ活性を
用いるためには、酵素の回収は実際に必要ないであろ
う。確かに、セルロースの分解のために組換セルラーゼ
を用いることに関するこの発明の方法の１つの態様にお
いては、セルロースが培養細胞にその場で加えられ、そ
してセルロースの分解のために増殖中の細胞培養物又は
休止細胞培養物が用いられるであろう。

前記の各段階は種々の方法で行うことができる。例え
ば、目的とするコード配列は、細胞メッセンジャーRNA
（mRNA）から適切なcDNAを調製し、そして該cDNAを操作
して完全配列を得ることによって得られる。この方法に
代えて、後に記載するような種々の方法に従ってゲノム
断片を操作して同定されたイントロン領域を除去するこ
とができよう。配列の部分が、公知の化学的合成技法の
範囲に入る程十分に短い場合には、このような配列は個
々のヌクレオチド出発材料から化学合成により調製する
ことができる。確かに、この方法によって得られる配列
の長さは、オリゴヌクレオチド合成技術の今日の状況に
全く依存する。

セルラーゼ酵素に対応するコード配列をゲノムライブラ
リーから再構成するために特に有用な方法をこの明細書
において説明する。セルラーゼ複合体の高生産体、例え
ば誘導されたＴ．リーゼイＬ２７の核DNAからファージ
中に調製されたゲノムライブラリーは、目的酵素すべて
のコード配列を含有する。目的とする各酵素について、
精製された天然形を用いて抗体を得る。この抗体を用い
て、適切に免疫沈澱する蛋白質を試験管内翻訳系におい
て合成し得る濃縮されたmRNA画分を同定する。同定され
たmRNAを用いてcDNAプローブを生成せしめ、こんどはこ
のプローブを用いてライブラリーから目的とする遺伝子
又は遺伝子部分を同定する。プローブで同定された遺伝
子において、さらに変形を行うことがでできる。便利に
は、適当な制限部位が天然に存在しない場合には、これ
をコード配列の末端に付加して切出し可能な遺伝子セグ
メントを得、次にこれを適切な制御配列に隣接して発現
ベクター中に導入することができる。この方法に代え
て、遺伝子又はその部分をすでに含有するベクターに制
御配列を導入することもできる。制御配列、発現ベクタ
ー、及び形質転換方法は、遺伝子の発現に使用される宿
主細胞のタイプに依存する。一般に、現在のところ宿主
として、原核生物細胞、酵母細胞、又は哺乳動物細胞が
有用である。適当な制御配列及び技法は、下記に概略を
記載するように、宿主の選択に依存するであろう。

B.1.a. 制御配列 原核生物は、最もしばしばE.コリ（（E.coli）の種々の
菌株によって代表される。しかしながら、他の微生物菌
株、例えばバシルス、例えばバシルス・ズブチリス（Ba
cillus subtilis）、シュードモナス（Pseudomonas）の
色々な種、又は他の細菌株を使用することもできる。こ
れらの原核生物系において、宿主と適合する菌株に由来
する複製部位及び制御配列を含有するプラスミドベクタ
ーが使用される。例えば、E.コリは、Bolivar等，ジー
ン「Gene」（１９７７）２：９５によってE.コリ種から
得られたプラスミドpBR322の誘導体を用いて、典型的に
形質転換される。pBR322は、アンピシリン及びテトラサ
イクリン耐性遺伝子を含有し、そしてこれらのマーカー
は所望のベクターの造成において維持され、又は破壊さ
れる。リボゾーム結合部位配列と共に、場合によっては
オペレーターを伴う、転写開始のためのプロモーターを
含有するものとしてこの明細書において定義される一般
に使用される原核生物制御配列は、β−ラクタマーゼ
（ペニシリナーゼ）プロモーター系及びラクトース（la
c）プロモーター系〔Chang等，ネイチャー（Nature）
（１９７７）１９８：１０５６〕、並びにトリプトファ
ン（trp）プロモーター系〔Goeddel等，ニュークレイッ
ク・アシド・リサーチ（Nucleic Acids Res・）．（１９
８０）８：４０５７〕のごとき一般に使用されるプロモ
ーターを含有する。１９８４年２月８日に出願された米
国特許出願第578,133号に記載されているような、ポー
タブル制御カセットとして有用にされている、λ−由来
ＰＬプロモーター及びＮ−遺伝子リボゾーム結合部位
〔シマタケ等，ネイチヤー（Nature）（１９８１）２９
２：１２８〕が他の１例である。しかしながら、原核生
物に適合性の任意の手入し得るプロモーター系を使用す
ることができる。

細菌のほかに、真核生微生物、例えば酵母も宿主として
使用することができる。パン酵母であるサッカロミセス
・セレビシエー（Sacharomyces cerevisiae）の実験室
株が最も頻繁に使用されるが、他の多くの菌株も一般に
使用し得る。２ミクロン複製開始点を用いるベクターが
記載されている〔Broach,J.R.,メソド・イン・エンチモ
ロジー（Meth.Enz.）（１９８３）１０１：３０７〕
が、酵母での発現のために適当な他のプラスミドベクタ
ー〔例えば、Stinchcomb等，ネイチヤー（Nature）
（（１９７９）２８２：３９； Tschempe等，ジーン「Gene」（１９８０）１０：１５
７；及びClarke,L.等，メソド・イン・エンチモロジー
（Meth.Enz.）（１９８３）１０１：３００を参照のこ
と〕が知られている。酵母ベクターのための制御配列
は、解糖系酵母の合成のためのプロモーター〔Hess等，
Ｊ．アドバ．エンチム．レグ（J.Adv.Enzyme Reg.）
（１９６８）７：１４９；Holland等，ビオケミストリ
ー（Biochemistry）（１９７８）１７：４９００〕を含
む。当業界において知られている他のプロモーターは３
−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター
〔Hitzeman等，ジャーナル・オブ・ビオロジカル・ケミ
ストリー（J.Biol.Chem.）（１９８０）２５５：２０７
３〕、並びに他の解糖系酵素、例えばグリセロアルデヒ
ド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナー
ゼ、ピルベートデカルボキシダーゼ、ホスホフラクトキ
ナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、
３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナー
ゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグル
コースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのそれを包含
する。増殖条件により制御される転写の追加の利点を有
する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ
２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代
謝に関連する分解酵素、並びにマルトース及びガラクト
ース利用のために必要な酵素のためのプロモーター領域
である（Holland，前掲）。

ターミネーター配列がコード配列の３′末端において望
ましいことが示唆されている。このようなターミネータ
ーは、酵母由来遺伝子においてコード配列に続く３′非
翻訳領域中に見出される。記載されているベクターの多
くは、エノラーゼ−Ｉ遺伝子含有プラスミミドpeno46
〔Holland,M.J.等，ジャーナル・オブ・ビオロジカル・
ケミストリー（J.Biol.Chem.）（１９８１）２５６：１
３５８〕由来の制御配列、又はYEp13から得られるLEU2
遺伝子〔Broach,J.等，ジーン「Gene」（１９７９）
８：１２１〕由来の制御配列を含有するが、しかしなが
ら、酵母適合性のプロモーター、複製開始点及び他の制
御配列を含有する任意のベクターを使用することができ
る。

多細胞生物由来の真核性宿主細胞培養物において、ポリ
ペプチドをコードする遺伝子を発現せしめることが可能
なことも言うまでもない。例えば、ティシュカルチュア
ーズ（Tissue Cultures），アカデックプレス、Cruz及
びPatterson編（１９７３）を参照のこと。有用な宿主
細胞系にはVERO及びHeLa細胞、並びにチャイニーズハム
スター卵巣（CHO）細胞が含まれる。これらの細胞のた
めの発現ベクターには一般に、哺乳動物細胞との適合性
を有するプロモーター及び制御配列、例えばシミアンウ
イルス（Simian Virus）４０（ＳＶ４０）〔Fiers等，
ネイチヤー（Nature）（１９７８）２７３：１１３〕由
来の一般に使用される初期及び後期プロモーター、又は
他のウイルス性プロモーター、例えばポリオーマウイル
ス、アデノウイルス２、牛乳頭腫ウイルス、もしくは鳥
類肉腫ウイルス由来のプロモーターが含まれる。哺乳動
物細胞宿主系形質転換の一般的観点は、１９８３年８月
１６日に与えられたたAxelの米国特許第4,399,216号に
記載されている。「エンハンサー（enhancer）」領域が
発現の最適化において重要なことが、今や明らかであ
り、この領域は一般に、プロモーター領域の上流に見出
される配列である。必要であれば、複製開始点がウイル
スから得られるであろう。しかしながら、染色体への遺
伝子組込みは、真核生物におけるDNA複製の共通の機作
であり、従って独立して複製するベクターは必要でな
い。今や、植物細胞も宿主として用いることが出来、そ
して植物細胞に適合性の制御配列、例えばノパリン（no
paline）合成プロモーター、及びポリアデニル化シグナ
ル配列〔Depicker,A.等，ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・アンド・アプライド・ゼネティクス（（J.Mol.Ap
pl.Gen.）（１９８２）１：５６１〕が使用可能であ
る。

B.1.b. 形質転換 使用する宿主細胞に依存して、形質転換は、その細胞に
適する標準的技法を用いて行う。Cohen,S.N.,プロシー
ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシス（米国）（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）（１９
７２）６９：２１１０により記載された、塩化カルシウ
ムを用いるカルシウム処理法が、原核生物細胞、又は実
質的な細胞壁障壁を有する他の細胞のために用いられ
る。ある種の植物細胞については、アグロバクテリウム
・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）
を用いる感染〔Shaw,C.H.等，ジーン「Gene」（１９８
３）２３：３１５〕が用いられる。細胞壁を有しない哺
乳動物細胞については、Graham及びvan der Eb,Virolog
y（１９７８）５２：５４６の燐酸カルシウム沈澱法が
好ましい。酵母への形質転換はVan Solingen,P.等，ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bact.）（１９
７７）１３０：９４６；及びHsiao,C.L.等，プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシス（米国）（Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)（１９７
９）７６：３８２９の方法に従って行われる。要約すれ
ば、YEPD富化培地（酵母エキストラクト、ペプトン、及
び４％グルコース）中に対数中期まで増殖した酵母培養
物を洗浄し、そしてソルビトール燐酸緩衝液中リゾチー
ム５０００（マイルスラボラトリーズ）を用いてプロト
プラスト化する。プロトプラストを洗浄し、１Ｍソルビ
トール含有６７％YEPD中に室温にて１時間放置し、そし
てペレット化し、そしてトリス−ソルビトール−塩化カ
ルシウム緩衝液中に２×１０^９プロトプラスト／mlに懸
濁する。プロトプラストを、１００μの反応混合物
中、形質転換用DNA5〜１０μｇと混合し、次に１mlの４
４％PEGを加え、そしてこの混合物を室温にて４０分間
放置する。この方法の代りに、Klebe等〔〔ジーン「Gen
e」（１９８３）２５：３３３〕の方法を使用すること
もできる。

B.1.c. ベクターの構成 所望のコード配列及び制御配列を含有する適当なベクタ
ーの構成においては、当業界においてよく理解される標
準的連結（ligation）技法及び制限（restriction）技
法が用いられる。分離されたプラスド、DNA配列、又は
合成されたオリゴデオキシリボヌクレオチドを切断（cl
eave）し、接続（tailor）され、そして所望の形に再連
結（religate）する。

部位特異的DNA切断は、当業界において一般に理解され
る条件のもとで適切な制限酵素（１種又は複数種）を用
いる処理によって行われ、この方法の詳細は、これらの
市販制限酵素の製造者により特定されている。例えば、
ニューイングランド ビオラブス（New England Biolab
s）の商品カタログを参照のこと。一般に、約１μｇの
プラスミド又はDNA配列を約２０μの緩衝液中で１ユ
ニットの酵素により切断する。この明細書に記載する例
においては、DNA基質の完全な消化を保証するために過
剰の制限酵素を使用する。約３７℃における約１〜２時
間のインキュベーション時間が有効でであるが、変法を
用いることもできる。各インキュベーションの後、フェ
ノール／クロロホルムによる出によって蛋白質を除去
し、そしてさらにエーテル抽出することもでき、そして
エタノール沈澱により核酸を水相から取り出し、次にセ
ファデックスＧ−５０スピンカラムに通す。所望によ
り、標準的方法を用いながら、ポリアクリルアミドゲル
又はアガロースゲルにより切断された断片のサイズ分離
を行う。サイズ分離の一般的記載はメソド・イン・エン
チモロジー（Methods in Enzymology）（１９８０）６
５：４９９−５６０に見られる。

制限切断された断片は、E.コリDNAポリメラーゼＩの大
断片（Klenow断片）による処理によって、４種類のデオ
キシヌクレオチドトリホスフェート（dNTP）の存在下
で、約１５〜２５分間のインキュベーション時間、２０
〜２５℃にて、５０mM Tris-Cl（（pH7.6，５０mM NaC
l，６mM MgCl₂，６mM DTT，及び５〜１０μＭ dNTP）
中で、平滑末端化することができる。Klenow断片は、
５′接着末端を満たす（fill inする）が、４種類のdNT
Pが存在しても３′単鎖を切り取る（chew backする）。
所望により、接着末端の種類により指令される限界内で
選択された１種又は複数種のdNTPのみを供給することに
より、選択的補修（selective repair）を行うことがで
きる。Klenow断片で処理した後、混合物をフェノール／
クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱を行い、次にセ
ファデックスＧ−５０スピンカラムに通す。適当な条件
下でＳ１ヌクレアーゼにより処理することによって、任
意の単鎖部分の加水分解を行う。

合成オリゴヌクレオチドは、Matteucciのトリエステル
法〔ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソシシ
エティー（J.Am.Chem.Soc.）（１９８１）１０３：３１
８５−３１９１〕、又はCaruthersのジメチルホスホラ
ミド法（１９８３年１１月１５日に与えられた米国特許
第4,415,732号に記載されている）により調製すること
ができる。

アニーリングに先立つ、又は放射性標識付与（radio-la
beling）のための、単鎖のキナーゼ処理は、過剰のポリ
ヌクレオチドキナーゼ、例えば５０mM Tris〔pH7.6 １
０mM MgCl₂、５mMジチオスレイトール、１〜２mM ATP、
1.7ｐモルγ３２Ｐ−ATP(2.9mCi/mモル）、0.1mMスペル
ミジン、及び0.1mM EDTA〕中１ｎモルの基質に対して約
１０ユニットのキナーゼを用いて達成される。

連結（ligation）は典型的には、１０〜３０μの体積
中で、次の条件及び温度のもとで行われる。２０mM Tri
s-Cl、pH7.5、１０mM MgCl₂、１０mM DTT、３３μｇ／m
BSA、１０mM〜５０mM NaCl、及び４０μM ATP、0.01
〜0.02（Weiss）ユニットＴ４ DNAリガーゼ、０℃（接
着末端の連結のため）、又は１mM ATP、0.3〜0.6（Weis
s）ユニットＴ４DNAリガーゼ、１４℃（平滑末端の連結
のため）のいずれか。分子間「接着末端」連結は通常３
３〜１００μｇ／mlの全DNA濃度（５〜１００nM全最終
濃度）において行われる。分子間平滑末端連結（通常、
１０〜３０モル倍の過剰のリンカーを用いる）は典型的
には約１μＭの全最終濃度において行われる。

「ベクター断片」を用いるベクターの造成において、ベ
クター断片は一般に、５′燐酸を除去するため、及びベ
クターの再連結を防止するために、細菌アルカリホスフ
ァターゼ（BAP）で処理する。BAP消化は、典型的には、
約８のpHにおいて、約１５０mM Tris中で、Na⁺及びMg⁺⁺
の存在下で、ベクターμｇ当り約１ユニットのBAPを用
いて、６０℃にて１時間行う。核酸断片を回収するため
に、調製物をフェノール／クロロホルムで抽出し、そし
てエタノール沈澱を行い、そしてセファデックスＧ−５
０スピンカラムに適用することによって脱塩する。この
方法に代えて、不所望の断片の追加の制限酵素消化によ
り、二重消化されたベクターにおいて、再連結を防止す
ることができる。

B.1.d. 構成の確認 下記の構成において、プラスミド造成のための正しい連
結はまず、E.コリGenetic Stock Center，CGSC＃６１３
５から得られるE.コリMM294株、又は他の適当な宿主を
連結混合物により形質転換することにより確認される。
形質転換に成功した細胞はアンピシリン、テトラサイク
リン又は他の抗生物質耐性により、又は当業界において
理解されるように、プラスムドの造成方法に依存して他
のマーカーを用いて選択する。次に、形質転換体からの
プラスドは、Clewell，D.B.等，プロシーディングス．
オブ．ナショナルアカデミー・オブ・サイエンシス（米
国）（Proc.Nac.Acad.Sci.USA）（１９６９）６２：１
１５９の方法に従って、そして場合によっては次にクロ
ラムフェニコール増幅〔Clewell,D.B.，ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）（１９７２）１
１０：６６７〕することにより調製する。分離されたDN
Aは、制限処理し、そして／又はSanger,F.等，プロシー
ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシス（米国）（Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)（１９
７７）７４：５４６３のジデオキシ法〔さらに、Messin
g等，ニュークレイック・アシド・リサーチ（Nucleic A
cids Res.）（１９８１）９：３０９に記載されてい
る〕、もしくはMaxam等，メソド・イン・エンチモロジ
ー（Methods in Enzymology）（１９８０）６５：４９
９の方法により配列決定する。

B.1.e. 部位特定変異誘発（Site Specific Mutagenesi
s） オリゴヌクレオチド誘導変異は、所望の変異を代表する
限定された不一致（mismaching）のほかは変異を受ける
べき１本鎖ファージDNAに相補的なプライマー合成オリ
ゴヌクレオチドを用いて行う。簡単に記載すれば、プラ
イマーとして合成オリゴヌクレオチドを用いてファージ
に相補的な鎖の合成を指令し、そして得られた二重鎖DN
Aをファージ担持性宿主細菌に形質転換する。形質転換
された細菌の培養物を寒天にプレートし、ファージを含
有する単一細胞からプラークを形成せしめる。

理論的には、５０％の新コロニーが単鎖として変異形を
有するファージを含有し、５０％がもとの配列を有する
であろう。得られたプラークを、完全に一致するものと
はハイブリド形成するが、もとの鎖を伴う不一致のもの
とはハイブリド形成しない温度において、キナーゼ処理
された合成プリイマーとハイブリド形成せしめる。次に
プローブとハイブリド形成するプラークを拾いげ、培養
し、そしてDNAを回収する。部位特定変異法の詳細は、
後の具体的な例に記載する。

B.1.f. 宿主の例 この発明において、クローニング及び発現のために使用
する宿主菌株は次の通りである。

クローニング及び配列決定のため、並びにほとんどの細
菌プロモーターの制御のもとでの造成物の発現のため
に、E.コリMM294株（前掲）、Talmadge,K.等，ジーン
「Gene」（１９８０）１２：２３５；Meshlson,M.等，
ネイチャー（Nature）（１９６８）２１７：１１００を
宿主として使用した。

Ｍ１３ファージ組換体のために、ファージ感染に感受性
のE.コリ株、例えばE.コリＫ／１２／DG98株を使用す
る。DG98株はATCCに寄託されており、寄託番号３９７６
８を有する。

酵母での発現のために、Ｓ．セレビシエーの実験室株：
ATCCから得られるＣ４６８（α，his4^-,leu2^-,mal^-）株
（寄託番号20,690）、及びニューヨーク、ロチェスター
大学、Hred Sherman教授から入手できるＳ１７３−６Ｂ
（trp1^-,leu2^-,ura3^-,his4^-）株を用いる。

B.2. 組換酵素の用途 組換セロビオヒドラーゼ、エンドグルカナーゼ、及びβ
−グルコシダーゼは、むろん、対応する酵素の天然形と
同じ用途に、そして同じ条件下で使用することができ
る。組換形は、単独で、又は制御された組合わせにおい
ては比較的多量に得られ、そしてそれらの性質を強化す
るために、コード配列の遺伝的操作により、又は最適の
翻訳後プロセシング特性を有する宿主を選択することに
より適当な変形が加えられるという利点を有する。組換
酵素は、新規な宿主において生産される場合、該宿にお
いて新な基質を利用し及び／又は変形する能力を付与す
る。

組換セルラーゼ酵素の各々は、生体外において、溶液と
して又は固定化された形で、セルロース、又は問題の酵
素にとって望ましいように又はそれと適合するように変
形された他の基質の完全加水分解又は制御された加水分
解においてその役割を演ずるように用いることができ
る。

この発明の酵素は、単独で、又は相互に組合わせて、も
しくは他の適当な触媒と組合わせて使用することができ
る。不溶性のセルロース基質の効率的な加水分解のため
には、少なくとも１種類のエンドグルカナーゼ、セロビ
オヒドラーゼ、及びβ−グルコシダーゼの組合せを用い
るのが好ましい。再び、これらは溶解した形又は固定化
された形で用いることができ、あるいは同一の又は異る
形質転換宿主により得ることができる。例えば、セルロ
ース複合体の各酵素の遺伝子を含有する複数の発現プラ
スミドにより、又はこれらの酵素の各々のための複数の
発現モジュールを含有する１種類の発現プラスミドによ
り酵素宿主を形質転換することは、この発明の範囲であ
る。最近、酵母の若干の種が本来的にβ−グルコシダー
ゼを生産することが知られており、そしてセルラーゼ複
合体の他の酵素を本来的に生産する他の種を見出すこと
が出来よう。このような宿主菌株については、セルラー
ゼ複合体の欠けている構成員を適当な発現ベクターの形
で供給することだけが必要であろう。

さらに、この発明の組換酵素の用途は、セルロースから
のグルコースの製造に限定されない。コーヒー豆の障害
ポリサッカライドを加水分解することにより凍結乾燥コ
ーヒーの製造を促進するためにＥＧIIの特異性が有利に
使用されることはすでに述べた。CBHは、１，４−β，
Ｄ−グルカン結合に対する高い特異性を有するために、
価値ある研究の道具であり、従って、ポリサッカライド
標品中のこの結合の存否を確認するための手段を提供す
る。確かに、ある状況においては、セロビオースの純粋
な標品を特異的に得ることが望ましく、そしてこのため
にはCBHIが単独で有用であろう。CBHIセロビオヒドラー
ゼのみを生産するためにセルラーゼ生産菌を操作する方
法は、前に概略記載した。最後に、工業的酵母菌株が、
適当な優性選択マーカーを有するベクターを与えること
によって簡単にセルラーゼ複合体の１又は複数の構成成
分について形質転換されるであろう。ザ・モレキュラー
・バイオロン・オブ・イースト（The Molecular Biolog
y of Yeast），Cold Spring Harbor Meeting，１９８３
年８月１６〜２１日を参照のこと。

B.3. 組換遺伝子酵母ベクター 下に記載するように、この発明に従って造成された組換
ベクターは、分泌される、グリコシル化された、生物学
的に活性なセルラーゼの酵母中での効率的な生産をもた
らす。酵母における外来性組換セルラーゼの生産のため
に重要なベクターの構造的特徴は、(1)酵母プロモータ
ー配列；(2)該プロモーターにリンクされたセルラーゼ
酵素シグナル配列；及び(3)生産されるべき成熟セルラ
ーゼのコード領域を含む。さらに、例示する組換ベクタ
ーはセルラーゼコー領域の３′末端に酵母ターミネータ
ーを含有する。

この発明の観点に従えば、セルラーゼ遺伝子を含有する
酵母ベクターは、常用の組換技法により、(1)上記の酵
母プロモーター；(2)セルラーゼ酵素シグナル配列；及
び(3)該シグナル配列の３′末端又は隣接するセルラー
ゼコード領域中に、外来性遺伝子を導入することができ
るための適当な制限部位；を含有するように変形するこ
とができる。この外来性遺伝子は他のセルラーゼ、又は
関連性のない蛋白質、例えばアミラーゼ、プロテアー
ゼ、ペプチドホルモン、又は外来性遺伝子を好ましくは
非中断形として得ることができる他の多くのペプチドの
いずれかをコードするであろう。

下のＤ項は、酵母エノラーゼプロモーター、CBHＩシグ
ナル配列、T.リーゼイ由来成熟CBHＩのコード配列及び
酵母エノラーゼターミネーターを含有するpenoCBH500.2
02と称する例示的な酵母ベクターを説明する。このベク
ターは、公知の方法に従って変形して、CBHIコード配列
の全部又は一部分を外来性蛋白質コード配列で置き換え
ることができる。得られたベクターは、酵母における外
来性蛋白質の効率的なプロセシング及び分泌を可能にす
る。

下記のＥ項は、酵母エノラーゼプロモーター、EGIシグ
ナル配列、T.リーゼイ由来成熟EGIのコード配列、及び
上記のエノラーゼターネーター配列を含有するpJV160と
称する例示的な酵母ベクターを説明する。類似の技法を
用いることにより、このベクターを、酵母における外来
性遺伝子生成物の効率的なプロセシング及び分泌をもた
らすために変形することができる。

C.T.リ-ゼイL27株由来EGI及びCBHＩのクローニング及び発
現 後のＤ項及びＥ項において、この発明の具体例を記載す
る。この具体例においては、T.リーゼイＬ２７株から分
泌されるCBHＩ及びＥＧＩをコードするそれぞれのDNA配
列がクローニングされ、そして発現される。これらの例
示的具体例は、この発明を限定するものではなく、むし
ろ一般的に、組換セルラーゼ酵素、及び酵素のごとき異
宿主中でのグリコシル化された、成熟した、酵素的に活
性な菌類性セルラーゼ酵素の生産を可能にする発現ベク
ターを得るための例示的で実施可能な方法を記載するも
のである。

簡単に、且つ要約して記載すれば、２つのコード配列の
好ましい分離源は、Ｔ．リーゼイＬ２７株である。この
菌株は、セルラーゼ複合体の高生産菌として、そして
Ｔ．リーゼイ由来のEGＩ及びCBHＩ配列の部分がすでに
公表されている（後で言及する）ために選択した。

イントロン不含コード配列を得るためのストラテジーは
次の通りである。選択された菌類からセルロース誘導後
にポリ−Ａ RNA（mRNA）を分離し、そしてアガローズ
ゲル電気泳動を用いてサイズ分画した。誘導された細胞
からのmRNA画分を含有するゲル（このものは、誘導され
ていない細胞において比較的少量のみ存在する、又は存
在しない多数のバンドを示した）をサイズに従ってスラ
イスし、各スライスを目的とするmRNAの存在について試
験した。試験は、溶出されたmRNAを試験管内蛋白質合成
（翻訳）系に加え、そして全蛋白質、及び抗−EGＩ抗体
又は抗−CBHＩ抗体の存在下で免疫沈澱するポリペプチ
ドの両者をSDS−PAGEを用いて電気泳動することによっ
て合成された蛋白質を分析することにより実施した。こ
の方法により、各場合において所望のメッセージが濃縮
されているmRNA画分を同定することが可能であった。

次に、同定されたmRNAを用いて単鎖コピーDNA(cDNA)を
得、これを放射性ラベルしてゲノムライブラリーのプロ
ーブとして使用した。このcDNAはまた、EGＩ遺伝子又は
CBHＩ遺伝子のコード配列を含有する断片を含む。cDNA
ライブラリーを得るためにも用いた。

選択された菌類株からのゲノムDNAライブラリーはλ−
ファージ中に調製した。菌類からの全核DNAを、１又は
複数の選択された制限酵素を用いて部分消化し、そして
ファージベクターに挿入した。このファージライブリー
はこの菌類セルロース複合体のすべての酵素をコードす
るコード配列を含有する。クローニングされた断片は適
切な濃縮されたmRNA画分から誘導されたcDNAを用いて検
出した。CBHＩ又はEGＩに特異的なプローブに相同のフ
ァージを同定し、そしてコード配列に対応するＴ．リー
ゼイDNA断片を適当なプラスミドベクターにサブクロー
ニングした。完全EGＩ配列を含有する４kbHind IIIゲノ
ム断片、並びに一緒になって完全CBHＩ配列をコードす
る1.16kb及び2.3kbの隣接する２個のHind IIIゲノム断
片をこの方法により得た。

さらに制限分析及び配列決定を行うことにより、選択さ
れた断片のコード部分の配列を決定した。遺伝子の配列
により、CBHＩ遺伝子及びEGＩ遺伝子の両方に２個ずつ
のイントロンを同定した。好ましくは遺伝子をその発現
ベクターに入れる前に、セルラーゼ遺伝子イントロンを
除去する。

CBHＩについては、cDNA断片置換により２個のイントロ
ンを除去した。EGＩについては、１つのイントロンを、
ゲノムDNAの部分をcDNAライブラリーから得られたcDNA
クローンの対応する配列で置換することにより除去し、
他方のイントロンは、化学合成プライマーを用いる部位
特定変異誘発により除去した。

イントロン不含CBHＩコード断片を用いて、酵母を形質
転換して機能的に活性なCBHＩを分泌せしめることがで
きる発現ベクターの造成を行った。EGＩについては、コ
ード配列の末端を部位特定変異誘発によって変形して所
望の制限部位を挿入してHind IIIカセットとして使用し
得る完全コード配列を作った。このカセットを酵母中で
機能し得る発現ベクターにクローニングし、そしてこれ
を用いて適当な酵母宿主を形質転換し、EGＩを生産する
ことができる細換細胞を得た。

同様にして、EG II、CBH II、並びにβ−グルコシダー
ゼ−Ｉ及びβ−グルコシダーゼ−IIのためのイントロン
不含コード配列を得、適当な宿主ベクターに導入し、そ
して所望の宿主、例えば酵母を形質転換する。確かに、
下に記載するのと同様にしてβ−グルコシダーゼIIに対
する抗体標品を調製し、正しいmRNA画分を同定し、そし
てこの酵素のためのcDNAプロブ（単鎖）及びクローニン
グベクターcDNAライブラリー（二重鎖）を調製した。

Ｄ．組換CBHＩの調製 この項は、イントロン不含セロビオヒドロラーゼ−Ｉ
（CBHＩ）遺伝子、該遺伝子が組換DNA枝法によって導入
された発現ベクター、これらのベクターにより形質転換
された宿主、及びこうして調製さたCBHＩについて記載
する。CBHＩ遺伝子を選択されれた菌類から得る。この
菌類は好ましくは、セルロースのごとき誘導性炭素源に
増殖した場合に誘導されたレベルの細胞外セルラーゼ
（CBHＩを含む）を生産することができるものである。

Ｄ．１．CBHＩの菌類入手源の選択 この発明において使用するためのCBHＩの菌類入手源の
選択に当っては、CBHＩ及び対応するmRNAが、非誘導性
炭素源に増殖した場合の実質上検出不可能な活性レベル
から、セルロースのごとき誘導性炭素源に増殖した場合
の容易に測定し得るレベルに誘導され得るような生物を
選択するのが有利である。好ましい菌類にはトリコデル
マ属の種が含まれ、そしてセルロースの存在下に増殖し
た場合に誘導される全細胞外セルラーゼの約６０％まで
も占める誘導性CBHＩ酵素を有するＴ．リーゼイが最も
好ましい。Ｔ．リーゼイの追加の利点は、誘導性セルラ
ーゼ系を構成する酵素が比較的よく研究されていること
である。特に、Ｔ．リーゼイCBHＩ酵素のアミノ酸配列
の実質的な部分が報告されている〔Fagerstam，Ｌ等，F
EBSレター（FEBS LETT.）（１９８０）１１９：９７；
及びFagerstam，Ｌ．Ｇ．，ドクトラル・セシス（Docto
ral Thesis），スゥエーデン，アプサラ大学（１９８
１）〕。

効率的、且つ大量にCBHＩのmRNAを生産する微生物の能
力は、コロニー選択枝法により、好ましくは微生物を変
異源に暴露した後に、上昇したレベルの１又は複数のセ
ルラーゼを生産することができ、そして／又は最大に誘
導されたレベルのセルラーゼを短縮された発酵期間に生
産することができる菌株を同定することにより、さらに
強化される。本発明の発明者の１人（Shoemaker）はす
でに、商業的に入手できる親株の場合よりも高い誘導さ
れたレベルのセルラーゼ酵素を生産することができる一
群のＴ．リーゼイ変異株を記載している。さらに、後に
記載するように、親株の場合よりも短い酵素誘導期間の
後に細胞外セルラーゼの最も大きな増加が観察された。
このタイプのＴ．リーゼイ変異株を得るための方法の詳
細な検討については、Shoemaker，Ｓ．Ｐ．等，トレン
ド・イン・ザ・バイオロジー・オブ・ファーメンテーシ
ョン・フォア・フュールス・アンド・ケミカルス（Tren
ds in the Biology of Fermentation for Fuels and Ch
emicalg），Hollaender等編，Plenum Publishing Corp
・，ニューヨーク，ニューヨーク州（１９８１）８９頁
を参照のこと。ここで記載しようとすることは、Ｌ２７
株と命名された変異株と、この発明において使用するた
めの好ましい候補としてのＬ２７株が選択された親株Qu
artermasterNo.９４１４（ＱＭ９４１４）との比較特性
である。

Ｌ２７株によって一層高いレベルの細胞外セルラーゼが
生産されることにより、この菌株がＱＭ９４１４株より
も高レベルのセルラーゼmRNAを生産することが示唆され
る。この２つの菌株における相対的なセルラーゼmRNAレ
ベルを決定するために、セルラーゼ誘導条件下で増殖し
たこれら２菌株のそれぞれに由来する全ポリＡ RNAを
分離し、そして無細胞蛋白質合成系に加えてセルラーゼ
ポリペプチドの合成を指令した。無細胞蛋白質合成を行
うのに使用される一般的方法は、後のＤ．３項において
記載する。各無細胞合成実験において合成されたポリペ
プチドを、CBHＩ、EGＩ、又はβ−グルコシダーゼのい
ずれかに対する抗体と免疫沈澱せしめた。免疫沈澱は、
C.3.項に言及したドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）により常法通りに
行った。ゲルの特異的蛋白質バンド領域（示してない）
における放射能の相対量により判定した場合、Ｌ２７株
は、３種類の酵素すべてについて高い試験管内翻管訳活
性を示し、この菌株は検討された各セルラーゼ成分につ
いて高い生体内レベルのmRNAを生産することが示唆され
た。

上記の実験において、細胞外セルラーゼの最も大きな増
加が観察された時点において、誘導された増養物から全
ポリA RBAを分離した。この誘導時間はＬ２７株につい
ては約１８〜２０時間の間であり、ＱＭ９４１４株につ
いては約２６〜２８時間の間であった。従って、Ｌ２７
株は、誘導されたセルラーゼmRNAの生産のために相対的
に短い時間でよいという追加の利点をもたらす。ここ
で、セルラーゼの合成がグルコースにより制御される親
株ＱＭ９４１４と異り、Ｌ２７株はセルロース又はグル
コースのいずれかに増殖した場合に誘導されたセルロー
スレベルを示すことが注目される。

D.2. CBHＩ蛋白質の精製及び抗CBHＩ抗体の製造 この発明の特徴に従えば、CBHＩは、抗CBHＩ抗体と免疫
反応を行うポポリペプチドの無細胞蛋白質合成系におけ
る合成を指令するその能力によって同定される。抗体は
好ましくは、CBH I mRNAの選択された菌類性分離源から
得られた精製されたCBHＩ酵素に対して生成せしめる。

精製されたCBHＩは、細胞外培養液から蛋白質を精製す
るための標準的方法に従って得られる。

典型的には、純粋な酵素が得られるまで、ブロス又は
液を１回又は複数回のイオン交換クロマトグラフ段階に
よって画分し、必要であれば分子篩クロマトグラフ段階
により画分する。酵素は精製段階中において、後に記載
するような常用のセルラーゼ測定法、及びSDS−PAGEに
より測定することができる。

例えば、T.リーゼイＬ２７株からのCBHＩを、FMC Cor
p．（ロックフイールド，メリーランド）から得られる
８％のアビセル（Avicel）（微細晶セルロース）に増殖
した菌殖した菌株の８日間培養物から精製した。発酵液
を0.４５ミクロンのマイクロポアフィルターに通すこと
によって細胞性物質を除去し、次に透析し、そしてアミ
コン限外過セル（レキシントン，マサチューセッツ）
を用いて５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）中で
濃縮した。濃縮された細胞外液を、フアルマシアファ
インケミカルス（スウェーデン，ウプラス）製DEAE−セ
ファロースを用いる陰イオン交換クロマトグラフィーに
より画分した。カラムを、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝
液（pH5.0）中０〜300ｍＭ塩化ナトリウムのグラジェン
トにより溶出した。CBHＩ約２００ｍＭNaClにおいてカ
ラムから溶出した。

酵素を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）中DEA
E−セファロースを用いるイオン交換グロマトグラフィ
ーによりさらに精製した。

CBHＩはまた、０〜３００ｍＭ塩化ナトリウムグラジェ
ント中約２００ｍＭNaClにおいてカラムから溶出した。
カラム溶出画分中のCBHＩの存在は、５０ｍＭ酢酸ナト
リウム緩衝液（pH4.5）中に１％燐酸膨潤セルロース（P
SC）を含有する溶液中で前記画分を４５℃にて３０分間
インキュベートした後における還元糖の存在により同定
した。還元糖の同定は、セロビオースと同様、高速液体
クロマトグラフィー（HPLC）により確認した。エキソ−
セロビオヒドロラーゼ測定の詳細については、Shoemake
r，Ｓ．Ｐ．等，ビオケミカ・ビオフィジカ・アクタ（B
iochem.Biopheys.Acta）（１９７８）５２３：１４７を
参照のこと。

２回クロマトグラフ処理したCBHＩの純度は、垂直スラ
ブ装置中で不連続緩衝系の変法〔Laemmli，Ｕ．Ｋ．
等，ジヤーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Ｊ．Mol.Biol.）（１９７３）８０：５７５〕を用い
て、SDS−PAGEにより分析した。電気泳動的に分離され
た蛋白質はクマーシーブルー（Coomassie Blue）Ｒ２５
０で染色することにより検出した。ゲルは単一の染色バ
ンドを示し、酵素が実質純粋であることが示された。こ
の蛋白質の見かけ分子量を、その移動速度を分子量既知
のそと比較することにより、約66,０００ドルトンであ
ると算定した。

精製されたＬ２７CBHＩのアミノ酸組成及び配列と、T.
リーゼイＱＭ９４１４から得られたCBHＩ酵素のアミノ
酸組成及び配列（Fagerstam,Ｌ．等，前掲；及びFagers
tam，Ｌ．Ｇ．，前掲に開示される）とを比較した。

２つの酵素のアミノ酸組成を次のようにして比較した。
Ｌ２７株由来の精製されたCBHＩを、Watt，Ｋ．Ｗ．
等，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブサイエンス，米国（Proc.Nat.Acad.Sci.,USA）
（１９７８）７５：１７３１に記載されているように、
６ｍＭグアニジン中ジチオスレイトール（0.０２ｍＭ）
により還元し、そしてヨウド〔¹⁴Ｃ〕酢酸でカルボキシ
メチル化した。還元されそしてカルボキシメチル化され
たCBHＩのアミノ酸分析は、４０μｇの蛋白質を5.７ＮH
Cl中0.１フェノールにより、１０８℃にて２４，４８及
び７２時間、真空中で加水分解することにより行った。
加水分解物中のアミノ酸を、Spinco model１２１MB Ami
no Acid Analyzer（Beckman Instruments,Inc．パロア
ルト，カリホルニア）を用いて定量した。トリプトファ
ンは、5.７ＮHCl中１０％メルカプト酢酸を用いる別の
酸分解物から測定した。Ｌ２７株CBHＩについて得られ
たアミノ酸組成は、T.リーゼイQM９４１４由来のCBHＩ
の公表されているアミノ酸組成とほとんど同一であっ
た。

成熟CBHＩ酵素の最初の３７Ｎ−端アミノ酸を含む、Ｌ
２７株酵素のＮ−端部分を配列決定し、そしてT.リーゼ
イＱＭ９４１４由来のすでに配列決定されたCBHＩ蛋白
質の対応する部分と比較した。精製されたＬ２７株CBH
Ｉ４０〜５０ｎモルを用いる自動アミノ酸配列決定を、
スピンニング・カップ・シーケンサー（コールドトラッ
プを用いて変形したモデル８９０ｃ，Beckman Instru-m
ents,Inc.，パロアルト，カリホルニア）を用いて実施
した。T.リーゼイＬ２７株CBHＩは、ピログルタミル残
基によりアミノ末端においてブロックされている。Pode
ll，Ｄ．Ｎ．等，ビオケミカル・アンド・ビオフィジカ
ル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem.Biophy
s.Res.Commun.）（１９７８）８１：１７６に記載され
ているように、牛肝臓ピログルタメートペプチダーゼ
（Boehringer Bioche-micals）を用いて蛋白質を処理す
ることにより前記の残基を除去す。ペプチダーゼ処理の
後、酵素を過し、凍結乾燥し、ジチオスレイトールで
還元し、そしてヨウド〔¹⁴Ｃ〕酢酸を用いてカルボキシ
メチル化し、そして配列分析に直接使用した。ブローリ
ン残基がアミノ末端であると決定された場合、すべての
新しく生成したアミノ末端をブロックすることにより配
列分析中のバックグラウンドの一時的還元を達成した。
シーケンサーからの分解生成物の同定は完全に自動化さ
れたHPLC系のアミノ酸アナライザー（Waters Associate
s）により行った。

この方法により決定された部分配分配列は、３７アミノ
酸中３６アミノ酸において、T.リーゼイＱＭ９４１４由
来の成熟CBHＩの最初の３７アミノ酸の公表されている
配列と同一であり、アミノ酸組成データと相俟って、Ｌ
２７株CBHＩはQM９４１４CBHＩと同一であるか、又はほ
とんど同一であることが確認された。

精製された蛋白質を、常法により抗CBHＩ抗体を生成せ
しめるために用いる。得られた抗体を、エキソーセロビ
オヒドロラーゼ酵素活性を中和する能力、及び誘導され
たセルラーゼ酵素の混合物からCBHＩを特異的に免疫沈
澱せしめる能力について試験する。

T.リーゼイＬ２７株由来の精製されたCBHＩに対する抗
体を調製するために、該精製された酵素をフロインドの
アジュバントと混合し、そして0.２〜0.４ｍの混合物
をニュージーランドホワイトラビットに筋肉内注射し
た。注射は、１０日毎に、抗体価がOuchterlony，Ｏ．
アーキブ・ケミ（Arkiv Kemi.）（１９４９）１：４３
の二重免疫拡散法により検出されるまで反復した。

製造された抗−CBHＩ抗体は精製されたCBHＩのエキソ−
セロビオヒドロラーゼ酵素活性を中和することができ
た。Ouchterlony免疫拡散分析は、上記のCBHＩ標品に対
して調製された抗体がCBHＩ酵素及びEGＩ酵素の両者に
対して免疫反応性であることを示した。

D.3.CBHＩmRNAについて濃縮されたmRNAの調製 CBHＩの好ましい分離源、例えばT.リーゼイＬ２７株
は、セルラーゼ誘導条件下で増殖した場合、非誘導培養
において実質上検出することができないCBHＩmRNAを含
有する。このmRNAは、無細胞蛋白質合成系において、同
じ微生物源から精製されたCBHＩ蛋白質に対して調製さ
れた抗体と免疫反応するポリペプチドの合成を指令する
ことができる。CBHＩmRNAについて濃縮されたRNA画分を
得るために、誘導培養から分離された全ポリＡRNAを、
例えばゲル電気泳動によりサイズ画分する。誘導された
微生物源及び非誘導微生物源からのポリＡRNAを並行し
て画分し、これら２つのポリＡRNA標品のゲル電気泳動
パターンを比較することができる。

CBHＩmRNAが最も濃縮されたmRNA画分を同定するため
に、画分されたＡRNAの種々のサイズ画分を、無細胞合
成系において、抗−CBHＩ抗血清と共に免疫沈澱し得る
ポリペプチドの合成を指令するそれらの能力について試
験する。説明により、T.リーゼイＬ２７株由来のCBHＩm
RNAが濃縮されたmRNA画分を調製する方法を、ここに記
載する。

アビセル（Avicel）（１８時間）又はグリセリン（４８
時間）に増殖した対数中期のT.リーゼイＬ２７株を収得
し、そして液体窒素中で凍結した。グリセリンに増殖し
た培養物は４８時間の増殖期間中に測定し得る細胞外CB
HＩ活性を示さなかった。これらの培養物から、Chirgwi
n,J.M.等，ビオケミストリー（Biochem.）（１９７９）
１８：５２９４に記載されている方法の変法を用いて、
全細胞RNAを分離した。簡単に記載すれば、凍結した細
胞を、4.７Ｍグアニジンチオシアナート及び１２ｍＭア
デノシン：VOSO₄複合体（RNアーゼ阻害剤）中でホモジ
ナイズした。RNAを超遠心分離によりCsClクッションを
通してペレット化し、そしてオリゴdTクロマトグラフィ
ーによりポリＡRNAを分離した。誘導された培養物及び
非誘導培養物からのポリＡRNAを、Marine Colloids（ニ
ューヨーク）から得られる標準Sea Kemアガロースを用
いて公知の方法に従って、メチル水銀アガロースゲル上
で画分した。第１図は、アビセル（レーン１）又はグリ
セリン（レーン２）に増殖したT.リーゼイＬ２７株由来
のポリＡRNAの電気泳動パターンを示す。２つのゲルパ
ターンの比較により、誘導された培養物に特異的である
か、又はこれに高濃度で存在する複数のRNAバンドが示
される。２３ＳRNAに対応するRNAサイズ領域をこの図の
左側に示す。

誘導されたRNAを含有するゲルを、ゲルの２３ＳRNA領域
から出発して低分子量RNAの方向に向って（図における
ゲルの下方に向って）２mm間隔で細断した。ゲルスライ
スからRNAを遊離せしめるために、各スライスを、0.１
ＭNaCl，0.０１ＭEDTA及び0.２％SDSを含有する0.０１
ＭTris−HCl緩衝液（pH7.5）中で９５℃にて５分間溶融
した。アガロースを遠心分離によりペレット化した。上
清液をフェノール／クロロホルム抽出した後、エタノー
ルによりRNAを沈澱せしめ、そして水に溶解した。

ゲルスライスから得られた各RNA画分の少量を無細胞蛋
白質合成系、詳しくはNew England Nuclear Company
（ボストン，マサチューセッツ）から入手した、網状赤
血球溶解物／メチオニンＬ−〔³⁵Ｓ〕−翻訳系として販
売された網状赤血球溶解物（reticulocyte lysate）キ
ットに加えた。Pelham，Ｒ．Ｂ．等，ヨーロピアン・ジ
ャーナル・オブ・バイオケミストリー（Europ.J.Bioche
m.）（１９７９）６７：２４７は典型的な網状赤血球溶
解物系を記載している。規定された反応時間の後、溶解
物（lysate）のアリコートを取り出し、そしてSDS−PAG
Eにより分析した。全溶解物、又は溶解物に抗−CBHＩ抗
体を加えることにより生成した免疫沈澱物を分析した。
免疫反応生成物は本質上常法に従って沈澱せしめた。

得られたゲル電気泳動パターンを選択して第２図に示
す。この図に示される１０００ドルトン単位の分子量
を、図中左のレーンのマーカー蛋白質の位置により示
す。誘導された全ポリＡRNAを翻訳系に供給することに
よって生成した全リゼート（lysate）蛋白質の電気泳動
パターンをレーン１に示す。レーン２は、これらのペプ
チドと抗−CBHＩの免疫沈澱物の加水分解物を用いた同
様のパターンを示す。図から明らかな通り、レーン２の
パターンは、CBHＩの予想される見かけ分子量である約6
6,０００ドルトンの分子量範囲における単一の比較的広
いバンドから成る。

前に記載したように、T.リーゼイCBHＩに対して調製さ
れた抗体はT.リーゼイEGＩと交差反応を行うから、レー
ン２中の広い66,０００分子量バンドの少なくとも一部
分はエンドグルカナーゼポリペプチドの合成によるもの
である可能性が生ずる。精製されたEGＩは、SDS−PAGE
により分析した場合、CBHＩから区別され、そして低い
分子量を示す蛋白質バンドを与えるという事実は、この
可能性に反対する。また、CBHＩ酵素は、ポリＡRNAが分
離された時点において菌類培養物中で誘導される全セル
ラーゼの約６０％を占めるから、CBHＩポリペプチド合
成は、翻訳系において生ずる全ペプチド合成の大部分を
占めることが期待される。これに対して、EGＩは全セル
ラーゼの約５％を占めるに過ぎない。

逐次的ゲルライスから得られたサイズ画分されたRNAを
用いて、翻訳系において放射性ポリペプチドの合成を指
令した。ゲルスライス＃９（２３ＳRNAバンドにおける
最初のゲル切断点から約１８mmに位置するスライス）
は、レーン３に見られる全翻訳系生成ポリペプチドパタ
ーンを与えた。このパターンは46,０００〜67,０００ド
ルトンの分子量範囲に複数の蛋白質の集中を有する。抗
−CBHＩ抗体を加えることによって生成した免疫沈澱物
により生ずる同様のパターンをレーン４に示す。このレ
ーンはCBHＩの分子量範囲に単一の広い蛋白質バンドを
示す。

ゲルスライス＃１０からのRNAは、次に小さいサイズ範
囲の画分されたポリＡRNAを含有し、翻訳系において、
レーン５に見られるポリペプチドの合成を指令する。免
疫沈澱物の加水分解物の同様の分析をレーン６に示す。
CBHＩの分子量範囲における免疫沈澱物の濃度が相対的
に高いことから、ゲルスライス＃１０は、ゲルスライス
＃９に比べて、CBHＩmRNAに関してより高度に濃縮され
ていることが示される。

ゲルスライス＃１１からのRNAにより生成された同様の
ポリペプチドパターンをレーン７及び８に示す。レーン
７は全リゼートポリペプチドを示し、レーン８は抗−CB
HＩ抗体の存在下で免疫沈澱するポリペプチドを示す。
これから明らかなように、レーン８における66,０００
ドルトンの分子量バンドの濃度はレーン４におけるそれ
に匹敵し、そしてレーン６に見られるそれよりも明らか
に低い。この比較から、ゲルスライス＃１０をCBHＩmRN
Aが最も濃縮されているゲルスライスであると同定し、
そしてそ故に、CBHＩプローブ及びCBHＩcDNAの調製のた
めに後に記載する方法においてCBHＩmRNA源として使用
した。

レーン６に見られる66,０００ドルトンの分子量範囲に
おける比較的広いバンドが誘導されたCBHＩmRNAの生成
物を示すことを確認するために、翻訳系に、非誘導T.リ
ーゼイ培養物（グリセリンの存在下で増殖したもの）由
来のポリＡRNAの匹敵するサイズのmRNA画分を加えた。
非誘導ポリＡRNAをゲル電気泳動により画分した後、ゲ
ルの２３Ｓ領域から下１０番目のゲルスライスから溶出
されたRNAを翻訳系に加えた。翻訳系からの全翻訳ポリ
ペプチド及び免疫沈澱したペプチドを、それぞれレーン
９及び１０に示す。明らかな通り、レーン９は66,００
０分子量範囲に非常に少量の新たに合成された蛋白質を
含有し、そしてレーン１０は抗−CBHＩ抗体の存在下で
免疫沈澱する新たに合成された蛋白質を実質上示さな
い。このことは、抗−CBHＩと免疫的に反応する新たに
合成されたポリペプチドのすべてではないにしてもほと
んどが、誘導されたCBHＩmRNAの指令のもとに生産され
ることを確認するものである。

D.4.CBHＩcDNAプローブの調製 上記のようにして得られた濃縮されたCBHＩmRNA画分
は、選択された微生物の、CBHＩ遺伝子の領域を含有す
るゲノム消化断片の同定においてプローブとして使用す
るための放射性ラベルされた単鎖CBHＩcDNAを合成する
ための鋳型（template）を提供する。

mRNAから放射性ラベルされた単鎖cDNAを調製する方法は
よく知られている。Payvar，Ｆ．等，ジャーナル・オブ
・ビオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）（１９
７９）２５４：７６３６に記載されている一般的方法を
用いて、T.リーゼイＬ２７株CBHＩ濃縮mRNAからcDNAを
調製した。簡単に記載すれば、濃縮されたmRNAを１０ｍ
Ｍ水酸化メチル水銀で前処理してRNAを変性し、そして
放射性ラベルしたヌクレオチド類、プライマーとしての
オリゴｄＴ、及びRNAアーゼ阻害剤としての２ｍＭアデ
ノシン：VOSO₄を含有する反応混合物に導入した。cDNA
合成に続き、ポリＡRNAをNaOHで処理することにより破
壊し、そしてcDNAをゲル電気泳動によりサイズ分析して
完全な長さのcDNAが合成されていることを確認した。cD
NA画分の典型的なゲル電気泳動パターンは、cDNAの調製
に使用した濃縮されたmRNA画分のサイズ範囲におよそ対
応して、1.６〜1.８キロベース（ｋｂ）領域に顕著な要
主バンドを示した。

CBHＩプローブも公知の方法に従って、CBHＩmRNA断片を
放射性ラベルすることにより調製することができる。こ
の方法に代えて、成熟CBHＩ蛋白質の短セグメントの公
知のアミノ酸配列に対応するコード配列を有するように
造成された合成ポリヌクレオチドもまた、この発明にお
いて使用するための適当なCBHＩプローブを提供する。

D.5.CBHＩ遺伝子領域を含有するゲノムDNAクローンの調
製 選択された微生物から分離された全ゲノムDNAを１種又
は複数種のエンドヌクレアーゼで処理して、クローニン
グすることができるゲノム断片を生成せしめ、そして上
記のcDNA CBHＩプローブとハイブリド形成する能力によ
りCBHＩ遺伝子領域を含有するものとして同定する。CBH
Ｉ遺伝子領域を含有するとして同定されたクローンはゲ
ノムＤＮＡのヌクレオチド配列の決定に使用される遺伝
子材料を提供し、そして遺伝子の選択された領域を含有
するクローンは下記の方法に従ってイントロン不含CBH
Ｉ遺伝子を造成する場合に使用することができる。

T.リーゼイＬ２７DNAの完全ライブラリーをλＬ47.１中
に造成した。ファージDNAを分離し、そして次のように
してスタファー断片（stufferfragment）からクローニ
ングアームを精製することによりλファージベクターを
調製した。全ファージDNAから出発し、「接着末端」条
件下でcos部位を一緒に連結した。連結の効率はアガロ
ースゲル分析により約８０〜９０％であると決定され
た。連結されたファージDNAをBamHＩ及びSalＩで切断し
た。BamHＩ消化により連結されたアームからスタファー
断片が放出され、他方SalＩはスタファー断片を２回以
上切断し、BamHＩ消化アームからの一層容易な分離を保
証する。

BamHＩ消化アームをCsCl速度沈降勾配法によりスタファ
ー断片から精製した。

T.リーゼイゲノムDNAをSau３Ａにより部分消化し、そし
てNaCl速度勾配によりサイズ画分し、そして１５〜２０
ｋｂの範囲の分子を含有する画分を選択した。この画分
の断片をベクターのBamHＩアームと１：１のモル比、２
００μｇ／ｍの全DNA濃度において混合し、そして４
０℃にて一夜、２０μの体積中0.２Weissユニットの
Ｔ４DNAリガーゼを用いて連結した。連結混合物の0.５
μｇを、Hohn，Ｂ．メソド・イン・エンチモロジー（Me
thods in Enzymology）（１９７９）６８：２９９−３
０９に記載されているように凍結したパッケージ成分を
用いて、試験管内においてλヘッドにパッケージし、そ
して得られたファージをE.コリＭＭ２９４株上にプレー
トした。この方法により約1.７×１０^４ファージのライ
ブラリーが得られ、こはすべてのシングルコピー遺伝子
が代表される0.９９＋の可能性を与えた。

こうして得られたT.リーゼイゲノムライブラリーを、前
記のようにして調製した放射性ラベルされたCBHＩcDNA
を用いて検出した。試験した約60,０００ファージの内
５４ファージがcDNAプローブとハイブリド形成した。間
違った陽性反応物を除去するため、cDNAと最も強力にハ
イブリド形成する２３クローンをさらに精製し、そして
２種類の異るプローブにより検出した。一方のブローブ
は「誘導された」培養物由来のmRNAから調製したもので
あり、そして他方のプローブはCBHＩmRNAを欠く「非誘
導」培養物由来のmRNAから調製したものである。選択さ
れた２３ゲノムライブラリークローンの内２２クローン
が「誘導さた」cDNAプローブとハイブリド形成するが、
「非誘導」cDNAとはハイプリド形成しなかった。選択さ
た２２クローン中の１５クローンの制限分析により幾つ
かの重複が示され、CBHＩ遺伝子ライブラリーは６個の
特異クローンに減少した。

６クローン中、λ−CBH−４と命名された１クローンはC
BHＩゲノムコード配列のすべてを含有すると推定され、
これを用いて遺伝子サブフラグメントクローンを生成せ
しめた。実験的には、λ−CBH−４をHind IIIにより完
全消化し、そして生成した消化断片をHind III消化した
E.コリプラスミドpBR３２２中に連結した。組換形で消
化CBHＩ断片を含有するプラスミドをアンピシリン耐性
（pBR３２２ベクター上に担持されている）により選択
し、そしてテトラサイクリン耐性遺伝子の不活性化を導
く外来性DNAの挿入によりもたらされるテトラサイクリ
ン感受性についてスクリーニングした。CBHＩ遺伝子の
５′領域を含む1.１６kb断片、又は遺伝子の３′領域を
含む2.3kb断片のいずれかを含有するサブクローンを選
択した。これら２つのクローンをそれぞれpCBH１５７、
及びpCBH１６４と命名し、そしてそれぞれ第３Ａ図及び
第３Ｂ図に示す。

pCBH１５７はT.リーゼイＬ２７株由来の成熟CBHＩ蛋白
質の最初の２７８アミノ酸のためのコード領域を含有す
る。第３Ａ図に示すpCBH１５７の太線部分は完全1.１６
kb DNA断片を示し、該断片の一部分にそって内側を伸び
る線分は５′側CBHＩ遺伝子領域を示す。

λ−CBH−４由来の2.３kb Hind III断片を含有するpCB
H１６４は、成熟CBHＩ蛋白質のアミノ酸２７９〜４９６
の最後の２１８アミノ酸をコードするCBHＩゲノム遺伝
子の領域を含む。第３Ｂ図の太線部分は2.３kb DNA断片
を示し、そして内側の線分はCBHＩゲノム遺伝子のコー
ド領域を示す。

第３Ａ図及び第３Ｂ図はまた、CBHＩ遺伝子領域内の幾
つかの制限酵素部位を示す。これは常用の制限酵素部位
分析によって決定したものである。

pCBH１５７及びpCBH１６４を、セルロース誘導T.リーゼ
イＬ２７培養物から得られた全ポリARNA標品からCBHＩm
RNAを「釣り上げる（fish out）」能力について試験し
た。発表されている方法〔Harpold.Ｍ．Ｈ．等，ニュー
クレイック・アンド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）
（１９７８）５：２０３９〕に従って各クローンをニト
ロセルロースフイルターに結合せしめ、そして誘導され
たT.リーゼイＬ２７由来の全ポリＡRNAを、相補配列の
ハイブリド形成を許容する条件下でフイルターに加え
た。強く洗浄することによって非結合（非特異的）mRNA
を除去し、フイルターに結合したプラスミドと特異的に
ハイブリド形成するmRNAを溶出した。

各フイルターについて、結合RNA画分及び非結合RNA画分
を前記の無細胞蛋白質合成系において翻訳した。２つの
サンプルから翻訳された全蛋白質を、抗−CBHＩ抗体と
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aur
eus）の細胞との混合物により沈澱せしめた。翻訳され
た全蛋白質を、SDS−PAGE上で、そして前記の免疫沈澱
物の分析により分析した。プラスミドpCBH１６４及びpC
BH１５７の両者は、抗−CBHＩ抗体と免疫的に反応する
蛋白質の合成を指令することができるRNAと結合した。

D.6.ゲノム配列の決定 配列情報を得るために、上記の方法により得られたゲノ
ムCBHＩ遺伝子のサブクローンを、１種又は複数種のエ
ンドヌクレアーゼ消化することによりさらに細断し、ヌ
クレオチドの配列決定に適する長さのサブクローン断片
を生成せしめた。

遺伝子の５′側部分を含有するサブクローンpCBH１５７
をHind III及びEcoRIの両者を用いて実質上完全に消化
し、第３Ａ図から予想できるように、約６００ベースペ
ア（bp）及び約５００bpの２つの遺伝子領域断片を得
た。この２断片をＭ１３バクテリオファージベクターＭ
１３mp８及びＭ１３mp９にそれぞれサブクローニングし
た。

他のHind III断片サブクローンpCBH１６４をBamh I,Hin
d III、及びHinc IIにより消化した。生成した断片をベ
クターＭ１３mp８にサブクローニングした。

ベクターＭ１３mp８及びＭ１３mp９にサブクローニング
したCBHＩゲノム領域断片を、SangerＦ，等，ナショナ
ル・アカデミック・サイエンス・米国（Nat.Acad.Sci.U
SA）（１９７７）７４：５４６３、及びMessing,J.等，
ニュークレイック・アシド・リサーチ（Nucleic Acids
Res.）（１９８１）９：３０９に記載されているジデオ
キシ鎖ターミネーション法により配列決定した。配列の
部分はMaxam−Gilbert配列決定法〔Maxam，Ａ．Ｍ．
等，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブサイエンス，米国（Proc.Nat.Acad.Sci.,USA）
（１９７７）７４：５６０〕により確認した。T.リーゼ
イＬ２７株由来の1.１６kb Hind III断片中の５′Hind
III部位から２．３kb断片中のCBHＩ遺伝子の３′末端に
おけるストップコドンの後約３０６ヌクレオチドまで伸
びる完全遺伝子配列を第１表に示す。

得られたヌクレオチド配列を、コンピユーターにプログ
ラムされたマッチング操作により、Fagerstam，Ｌ．
等，前掲、及びFagerstam，Ｌ．Ｇ．，前掲によるT.リ
ーゼイCBHＩの公知のアミノ酸配列と比較した。マチン
グ操作により、所与のアミノ酸配列に対応するコドンに
ついての３種類の可能なリーデイングフレームのそれぞ
れにおいてヌクレオチド配列を試験した。マッチング操
作は、CBHＩ遺伝子のコード領域とT.リーゼイＱＭ９４
１４由来のCBHＩの公知のアミノ酸配列の領域との間に
ほぼ完全な対応をもたらした。このマッチングは、後で
検討するように、正しいリーデイングフレーム、開始コ
ドン及び終止コドン、並びに遺伝子中の２個のイントロ
ンの同定を可能にした。第１表はさらに、遺伝子の部分
をコードするリーダー配列に対応するアミノ酸を示す。
（リーダー配列アミノ酸はアンダーラインが付してあ
る。）この発明書において言及する選択された制限エン
ドヌクレアーゼの認識配列を表中にアンダーラインを付
して示す。非翻訳イントロンのオーバラインを付した部
分は、他の遺伝子において報告されているイントロンの
配列に類似すると認識される部分を示す。

上記の表において、ATG開始コドンはpCBH１５７中の挿
入された配列の５′末端から数えてヌクレオチド２１０
−２１２に位置する。ヌクレオチド２６１−２６３のコ
ドンは成熟CBHＩ蛋白質中のＮ−末端グルタミン（ピロ
グルタミン）アミノ酸に対応する。ヌクレオチド２１０
と２６０の間のコドンはおそらく、１７アミノ酸から成
る疎水性ペプチドリーダー配列をコードし、このアミノ
酸配列は対応するコード配列により決定され、表中にア
ンダーラインを付して示す。ヌクレオチド２６１〜６７
１のコドンは成熟CBHＩ酵素の最初の１３７アミノ酸を
コードする。

成熟CBHＩ蛋白質のアミノ酸１３７及び１３８をコード
するコード領域間に、この明細書においてCBHＩ遺伝子
中の第１イントロン又は上流イントロンとして同定され
る６７bp領域が存在する。このイントロンは７bp AGCTG
AC配列（第１表中オーバーラインで示されている）を含
有し、この配列は酵母からのアクチン遺伝子のイントロ
ン配列〔Langford，Ｃ．Ｊ．等、セル（Cell）（１９８
３）３３：５１９〕中、及びアスペルギルス・アワモリ
（Aspergillus awamori）由来のグルコアミラーゼ遺伝
子中の３個のイントロン中の７−merと類似し、そして
ニューロスポーラ・クラッサ（Neurospora crassa）由
来のグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子中のイントロ
ン配列〔Kinnaird，Ｊ．等、ジーン「Gene」（１９８
２）２０：３８７〕、及びA.アワモリグルコアミラーゼ
遺伝子中のイントロンの１つと同一である。この配列
は、mRNA転写物からイントロンをスプライシングするた
めに必要なシグナルを提供するようである。さらに、こ
のイントロンは、ドナー共通配列TAAGTG、及びアクセプ
ター共通配列TTTAAGG（表中オーバーラインで示してあ
る）を含有し、これらはMount，Ｓ．Ｍ．，ニュークレ
イック・アンド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）（１
９８２）１０：４５９により揚げられたドナー部位共通
配列及びアクセプター部位共通配列と同一である。

アミノ酸１３８（システイン）からアミノ酸３６９（ア
スパラギン酸）までは、ヌクレオチド７３９−１４３４
の間にわたる非中断蛋白質コード領域によりコードされ
る。アミノ酸３６９及び３７０をコードするコドン間の
遺伝子領域は６３非コードヌクレオチドを含有し、これ
はゲノムCBHＩ遺伝子中で第２イントロンすなわち下流
イントロンを構成する。この第２イントロンもまた、酵
母イントロンに特異的な７bp配列AGCTGAC、並びにドナ
ー共通配列GTGAGT及びアクセプター共通配列TTACAGを含
有し、これらは酵母遺伝子（Mount，Ｓ．Ｍ．，前掲）
におけるイントロン−エクソン接続部における公知のド
ナー部位配列及びアクセプター部位配列と同一である。

第２イントロンの後に、成熟CBHＩ蛋白質のアミノ酸３
７０−４９６をコードする非中断１２７コドン領域が続
く。このＣ−末端アミノ酸はロイシン（ヌクレオチド１
８７６−１８７８によりコードされる）である。遺伝子
の３′コード領域における終止コドンの下流にあるヌク
レオチド１８７９−２２２１は、表示されているように
SmaＩ部位及びHinc II部位を含有する。

第１表中の遺伝子の蛋白質コード部分中のヌクレオチド
の配列は、示されたアミノ酸の配列をコードする１つの
コドン配列を構成する。コドンの多くは、そのコドンに
より特定されるアミノ酸を変えることなく、一般に第３
ヌクレオチド部分においてヌクレオチド配列を変えられ
得る。遺伝子中に単一ヌクレオチド変異すなわち点変異
（point mutation）を生じさせる方法は当業者に知られ
ている。この明細書において定義する「コドン配列」な
る語は、特定のアミノ酸配列をコードするすべてのヌク
レオチド配列を包含し、第１表に示されるヌクレオチド
配列はそこに示されたアミノ酸配列をコードする多くの
コドン配列の１つである。

遺伝子のコドン配列を保存するヌクレオチド置換に加え
て、この発明は、上に検討したように、コードされたCB
HＩ酵素中の「中立的な」又は非臨界的なアミノ酸変化
を導く、遺伝子中のヌクレオチドの変化を予想する。特
に蛋白質アミノ酸配列中の進化的変化についての研究か
ら、蛋白質の機能的特性を有意に変化せしめることな
く、蛋白質中に中立的なアミノ酸変化が生じうることが
知られている。小さなコドン変化を実験的に生じさせる
ために多くの方法を用いることができ、この方法には、
点変異又は欠失変異を生じさせるために遺伝子を変異源
処理する方法；遺伝子を選択的に開裂し、次に選択され
たヌクレオチドを除去又は付加し、そして次に遺伝子を
連結する方法；及び常用のオリゴヌクレオチド変異誘発
法が含まれる。このようにして変異を受けたCBHＩ遺伝
子は酵素的に活性なCBHＩ酵素をコードし、そしてしば
しば、その比活性が、変異を受けていないCBHＩ酵素と
比べて実質上変化しない酵素をコードするであろう。こ
の発明は、そのコドン配列がCBHＩ酵素中のこのような
中立的なアミノ酸変化をコードする遺伝子、及びそのコ
ドン配列が変異を受けていない成熟CBHＩのアミノ酸配
列と厳格な１：１コドン対応を有する遺伝子を包含す
る。この明細書における定義において、そのコドン配列
が成熟CBHＩと「実質的な」１：１対応を有する遺伝子
には、厳格な対応を有する遺伝子、及び中立的な又は小
さコドン変化を有し、CBHＩ（エキソ−セロビオヒドロ
ラーゼ）酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺
伝子の両者が包含される〔Shoeker，Ｓ．Ｐ．等、ビオ
ケミカ・ビオフィジカ・アクタ（Biochem.Biopheys.Act
a）（１９７３）５２３：１４７参照のこと〕。

第４図は、前記の配列データから構成された、T.リーゼ
イＬ２７株からのゲノムCBHＩ遺伝子の地図を示す。こ
の地図は、幾つかの制限エンドヌクレアーゼ部位と関連
させて、特に前記の1.１６kb及び2.3kb Hind III遺伝子
断片を規定するHind III部位と関連させて、遺伝子の蛋
白質コード領域を示す。この地図からわかるように、遺
伝子中の上流イントロンは1.１６kb Hind III断片の中
央領域に位置し、そして下流イントロンは2.3kb断片の
中央の蛋白質コード領域に位置する。

ここに記載した例において、T.リーゼイＬ２７株CBHＩ
遺伝子の上流イントロン及び下流イントロンの存在及び
位置を、配列決定されたゲノム遺伝子とコードされた蛋
白質のアミノ酸配列とを比較することによって決定し
た。この方法は高い精度をもってイントロンを規定する
ために使用することができる方法の１つである。この方
法に代えて、遺伝子イントロンの長さ位置を、ゲノムCB
HＩ遺伝子のヌクレオチド配列と、この明細書に記載し
た一般的方法に従って調製されそして配列決定された完
全な長さのCBH I cDNAのヌクレオチド配列を比較するこ
とによっても決定することができる。また、ヌクレオチ
ド配列のみからゲノム遺伝子イントロンの存在及び位置
を同定することもできる。前に検討したように、T.リー
ゼイＬ２７株CBHＩ遺伝子中の両イントロンは、酵母イ
ントロンに特徴的な７bp配列を含有し、従ってイントロ
ンを予備的に同定するための手段を提供している。同様
に、イントロンのドナー領域及びアクセプターエンド領
域は、すでに掲げられている幾つかの共通配列の１つと
一致する特徴的な共通配列によって同定することができ
よう。この発明は、イントロンの同定をアミノ酸−コド
ンマッチング法に関連して説明したが、ヌクレオチド配
列から遺伝子イントロンの存在及び位置を決定するため
のここに記載した他の２つの方法もこの発明の方法に含
まれる。

D.7.遺伝子からのイントロン配列の除去 この項は、イントロン不含CBHＩ遺伝子を造成する方法
を記載する。この方法はまず、適当なクローニングベク
ターに、５′遺伝子末端からゲノムCBHＩ遺伝子中の
５′末端イントロンの下流の選択された制限エンドヌク
レアーゼ部位に伸びる５′ゲノムCBHＩ遺伝子断片を得
ることを含む。一般に、CBHＩ遺伝子領域を含有するゲ
ノムDNA消化クローンを調製するためにD.５項に前記し
た方法が、この５′ゲノム遺伝子断片を調製するために
適用され得る。

特に、この明細書に説明する有利な方法は、完全なCBH
Ｉ遺伝子を含有する１又は複数の断片を生成せしめる条
件下で、選択された制限エンドヌクレアーゼによりゲノ
ムDNAを処理する第１段階を含む。次に、この完全遺伝
子断片をさらに消化して、２又はそれより多くの遺伝子
サブフラグメントを生成せしめる。このサブフラグメン
トには、例えば前記のT.リーゼイＬ２７株からの1.１６
kb５′CBHＩ遺伝子断片が包含される。

第２段階は、１又は複数のCBH I cDNAコード配列断片を
組換形として得ることを含み、このcDNAコード配列は、
非中断蛋白質コード遺伝子領域を得るために、ゲノム遺
伝子断片の対応するイントロン含有領域と共にスプライ
ングすることができ又はそれと置き換えることができる
ものである。cDNA遺伝子片は常法に従って、好ましくは
濃縮されたCBH I mRNAから単鎖cDNAを生成せしめ、そし
てこの単鎖cDNAから二本鎖cDNAを形成することによって
造成される。

濃縮されたCBH I mRNAを得るための一般的方法はD.３項
に前記した方法に従う。濃縮されたmRNAは、逆転写酵素
の存在下でオリゴdTと反応した場合、やはり前記の方法
に従って、cDNA鎖を合成するための鋳型として機能す
る。mRNA／cDNAハイブリド中のmRNAをNaOHで処理するこ
とによって加水分解し、単鎖cDNAは保存する。このcDNA
は、Maniatis等、モレキュラー・クローニング−Ａ・ラ
ボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning-A Labora
tory Manual），Cold Spring Harbor Laboratory,Cold
Spring Harbor，ニューヨーク（１９８２）２３５−２
３８頁に記載されている方法に従ってE.コリDNAポリメ
ラーゼＩにより第２のcDNAを合成する反応を開始し、そ
してこの合成のための鋳型として機能し、「ヘアーピ
ン」二重鎖DNAをもたらす。第２のcDNA鎖の合成の後、
ヌクレアーゼＳＩで処理することによりヘアーピンルー
プを除去し、そして種々のデュプレックスcDNAを選択す
ることができる。

T.リーゼイＬ２７株CBH I mRNAをコピーすることにより
得られる二重鎖cDNAを上記の方法によって得、そして標
準的方法に従ってpUC8ベクターにクローニングした。ク
ローンを、CBHＩゲノムDNAの領域を含有する前記のpCBH
１５７クローン又はpCBH１６４クローンの１つとハイブ
リド形成する能力により同定した。選択されたcDNA断片
クローンの１つをｐ８０５と命名し、第６図に示す。図
中に太線で示されている、ｐ８０５中のcDNA断片は、遺
伝子の５′末端からNcoＩ部位を越えて下流に伸びる。
このNcoＩ部位は図示されているように、ゲノム遺伝子
中第１イントロンすなわち上流イントロンの下流側に位
置する。

ｐ４１７及びｐ２４７と同定された２つの他のcDNAクロ
ーンを第７図に示す。図から明らかなように、ｐ２４７
中のcDNA断片はcDNAの３′末端からBstE II部位を越え
て上流に伸びる。

ｐ４１７中のcDNA断片は、上記のBstE II部位において
断片２４７と重なり、そしてCBHＩ遺伝子中の内部Hind
III部位を越えてそれから上流に伸びる。上記の３種類
のcDNA断片の長さ及び相対的位置を、常用の制限エンド
ヌクレアーゼ地図の作成によって決定した。

イントロン不含CBHＩ遺伝子を造成するために、上流イ
ントロンを含有するゲノムDNAの部分を５′ゲノム断片
から切り取り、そして切り取られたイントロン含有領域
に対応するcDNA領域を挿入した。次に、このイントロン
不含５′遺伝子断片を、選択された制限エンドヌクレア
ーゼ部位において、この部位から遺伝子の３′末端に伸
びる３′末端cDNA断片に連結した。後の説明において、
イントロン不含５′遺伝子断は、ベクターが適当な宿主
に導入された場合にこの断片の発現を可能にする制御配
列に隣接して適当な発現ベクターにクローニングした。
次に、遺伝子の残りの３′cDNA部分を発現ベクターに導
入し、遺伝子発現のためのベクター中に配置されそして
方向付けられた完全な長さのイントロン不含CBHＩ遺伝
子を生成せしめた。

D.7.apCBH５の造成／上流イントロンの除去 第６図はT.リーゼイＬ２７株ゲノムDNA由来の1.１６kb
Hind III断片を含有するプラスミドpCBH１５７を示す。
この断片は第３Ａ図にも示されている。前記の遺伝子ヌ
クレオチド配列データから、1.１６kb断片が遺伝子中の
第１ATG開始シグナルにおける翻訳の開始点への１１bp
５′側にユニークSac II認識部位を、そして遺伝子断片
中上流イントロンへの３２bp３′側にユニークNcoＩ切
断部位を含有することが知られている。これは図示され
ている通りである。

約８００bpの５′端cDNA断片を含有するプラスミドｐ８
０５もまた、第６図に示すように、上記のユニークSac
II部位及びNcoＩ部位を含有する。プラスミドpCBH１５
７及びｐ８０５のそれぞれをSac II及びNCoＩにより処
理し、プラスミドpCBH１５７から上流イントロンを含有
する５７３bp断片を放出せしめ、そしてプラスミドｐ８
０５から対応するイントロン不含５０６ｂｐ断片を放出
せしめた。ｐ８０５からのイントロン不含Sac II／Nco
Ｉ断片を消化されたpCBH１５７プラスミド中に連結し、
pCBH５と称する新しいプラスミドを形成した。このプラ
スミドは、上流イントロンが除去された1.１６kb Hind
III断片から成るキメラ性ゲノム／cDNA遺伝子断片を含
有する。

D.7.b.pCBH３の造成／下流イントロンの除去 ３′イントロン不含遺伝子断片の造成を検討しよう。第
７図に関して、プラスミドｐ２４７は、遺伝子のTAA終
止コドン７７bp離れた位置にSmaＩ部位、ゲノム遺伝子
中の下流イントロンへ約１３８ヌクレオチドだけ３′の
位置にユニークBstE II部位、及びcDNAコード配列に関
して５′側であるプラスミドのポリリンカー領域にユニ
ークSalＩ部位を含有する。

プラスミドｐ４１７はやはり第７図に示されており、ｐ
２４７と同様であるがCBHコード配列中にBstE II部位を
含有し、そしてCBHＩコード配列内でHibd III認識部位
を越えてさらに５′方向に伸び、そしてBst II部位の上
流約６００bpにユニークSalＩ部位を含む。

遺伝子の終止コドンの下流末端から中間Hind III部位を
越して上流に伸びる３′cDNA遺伝子クローンを造成する
ために、プラスミドｐ２４７及びｐ４１７のそれぞれを
BstE II、そして次にSal Iにより完全消化した。ｐ４１
７からの小さい方の６００bp BstE II／Sal I DNA断片
を精製し、そしてBstE II／Sal I ｐ２４７ベクター断
片と連結した。図に示すプラスミドpCBH３は、cDNAの
３′末端から遺伝子中の中間Hind III部位に伸びるcDNA
断片を有する目的とする組換体であると同定された。

D.8 細菌宿主のための発現ベクターの造成 pCBH５及びpCBH３からのCBH I遺伝子断片を、選択され
たＥ．コリ／Ｓ．セレビシエーシャトルベクター中に、
trpプロモーターの制御下にCBH I遺伝子の発現を許容す
るように調整された位置及び方向にクローニングした。
宿主ベクターは、第５図に示す通りのpDG１５１と命名
された１1.１２kbシャトルベクターであり、１９８４年
５月１１日にATCCに寄託され、寄託番号３９６８６が与
えられた。このプラスミドは、カナマイシン、ネオマイ
シン、Ｇ４１８、及び他の抗生物質に対する抗生物質耐
性を付与する酵素をコードする変形されたアミノグリコ
シドホスホトランスフェラーゼAPH-I遺伝子を含有す
る。

このプラスミドの配列は次の通りである。

1. コーディネート０−1.５４は、peno４６から誘導さ
れたENO１遺伝子の1.５４kb Hind III／EcoR I３′非翻
ターミネーター配列である〔Holland,M.J.等，ジャーナ
ル・オブ・ビオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）（１９８１）２５６：１３８５〕。

2. コーディネート1.５４−2.７５は、変形されたAPH-
I遺伝子を含有する（これは、ザ・モレキュラー・バイ
オロン・オブ・イースト（The Molecular Biology of Y
east）Cold Spring Harbor Meeting，１９８３年８月１
６〜２１日に詳細に記載されている）。

3. コーディネート2.７５−2.８５は、逆向きのポリリ
ンカーの反復に挾まれた重複lacオペレーター配列を含
んで成る配列を含有する。変形されたAPH-IのATG開始コ
ドン（2.７５における）に直接先行するこの配列は次の
通りである。

4. コーディネート2.８５−2.９５は、trpプロモータ
ー−オペレーターを含有する１０７bpの５′−EcoR I
（修復された）／BamH I−３′断片である。

5. コーディネート2.９５−3.０４は、Sph I（修復）
部位及びSal I部位間に９０bp pBR３２２断片を含有す
る。

6. コーディネート3.０４−5.２５は酵母由来LEU２遺
伝子のコピーである。これは、Xho I／Sal I消化物とし
てYEp１３から得られた〔Broach,J等、ジーン「Gene」
（１９７９）８：１２１〕。

7. コーディネート5.２５−8.９７中の２ミクロンプラ
スミドレプリコンは、pDB２４８〔Beach,D.等、ネイチ
ャー（Nature）（１９８１）２９０：１４０〕をEcoR I
（修復）及びSal Iで消化し、そしてレプリコンを含む
２．７kb DNA断片を分離することにより得られる。適切
なSal I部位の存在はBeachの開示からは推定できなかっ
た。しかしながら、pDB２４８は、前記のBeachの文献に
示されたLEU２領域１２μPst Iティリング部位から約５
０bp下流にSal I部位を含有することが示された。

8. コーディネート8.９７−１1.１２は、Amp^R及びＥ．
コリ複製開始点を提供するpBR322のTthlll I（修復）／
EcoR I消化断片を含有する。

第８図は、pCBH５由来のイントロン不含５′端遺伝子断
片をpDG１５１に挿入する方法を示す。プラスミドpCBH
５をSac IIで完全消化し、そして３′突出２塩基接着末
端をdCTPの存在下でＥ．コリDNAポリメラーゼＩ（Pol
I）（Klenow）により修復した。Pol Iを不活性化した
後、DNA基質をHind IIIで完全消化し、そして８９５bp
Sac II（修復）／Hind III断片を精製した。第５図に示
す拡大した遺伝子領域に間し、プラスミドpDG１５１をX
ma Iにより完全消化し、２つの隣接するXma I部位間に
重複する合成lacオペレーター断片を含有する６２bp DN
A断片を放出せしめた。５′突出４塩基接着末端をdCTP
及びdGTPの存在下でPol Iにより修復した。Pol Iを不活
性化した後、平滑末端DNAをHind IIIにより完全消化し
た。１1.１２kbベクターDNA断片中の修復されたXma I部
位は、Ｅ．コリtrpプロモーター及びリーダーペプチド
リボゾーム結合部位の１８ヌクレオチド３′側にあり、
そして接着Hind III部位は変形されたPPH-I遺伝子の開
始コドンに直接先行する。

pDG１５１DNA部位（１．５μｇ）及び精製されたpCBH５
DNA断片（0.２４μｇ）を、ml当り約６０μｇの全DNA濃
度において、接着末端条件のもとで連結した。連結され
たDNA断片を２０μｇ／mlに稀釈し、そして分子内環化
に好都合な平滑末端条件下で連結を継続した。Ｅ．コリ
Ｋ１２／GM１１９株を、連結されたDNA１５０ngを用い
てアンピシリン耐性に形質転換し、そして非−構成的
（nom-comstitutive）Lac⁺コロニーを、目的とする１1.
９４kbプラスミドptrpCBH５の存在についてスクリーニ
ングした。第８図に示すプラスミドptrpCBH５は、修復
されたpDG１５１Xma I部位に新しいユニークXma I認識
部位を有する目的とする挿入部を含有する。第８図に示
されるプラスミド構成は制限酵素地図の作成により確認
した。Ｅ．コリＫ１２／GM１１９中のプラスミドptrpCB
H５はシタス・マスター・カルチュアー・コレクション
（Cetus Master Culture Collection;CMCC）に寄託さ
れ、CMCC寄託＃１８４２の番号を有する。このプラスミ
ドはNorthern Regional Research Labaratory(NRRL)、
ペオリア，イリノイに寄託され、そして番号NRRL＃Ｂ15
574を有する。

D.8.a ptrpCBH８の造成 pCBH３からの３′cDNA遺伝子断片をptrpCBH５中にサブ
クローニングする方法を第９図に示す。プラスミドpCBH
３をHind IIIにより完全消化し、CBH I遺伝子の中間Hin
d III部位からSma I部位に隣接する遺伝子の３′末端を
越えて伸び３′Hind IIIに至るpUC８からの配列を含
む、約８００bpの３′CBH Iコード断片を放出せしめ
た。プラスミドptrpCBH５もHind IIIで消化し、APH-I遺
伝子における開始コドンに直接先行するHind III部位に
おいてベクターを線状にした。精製されたpCBH３／Hind
III断片（０．２μｇ）を接着末端条件下でptrpCBH５
／Hind III断片（１．６μｇ）と連結した。Ｅ．コリＫ
１２／MM２９４株をアンピシリン耐性に形質転換し、そ
してコロニーを目的とするプラスミドの存在についてス
クリーニングした。ptrpCBH８と称する新プラスミドの
造成を第９図に示す。Hind III、BamH I及びEcoR Iによ
る制限地図の作成により表示された構成が確認された。
プラスミドptrpCBH８は、CBH Iコード配列を挾んで２個
のXma I／Sma I部位を含有する。いずれかの酵素でptrp
CBH８を消化することにより1.６３kbのDNA CBH I遺伝子
断片を生成し、この断片は、コード領域の５′末端に約
１２bp及びコード領域の３′末端に約８０bpを伴う完全
CBH Iコード領域を含有する。Ｅ．コリＫ１２／MM２９
４中のプラスミドptrpCBH８はCMCC＃１８４１と称さ
れ、そしてNRRLに寄託され、番号NRRL＃B15573を有す
る。

D.8.b. ptrp８１の造成 pCBH３からの３′CBH I cDNA断片をptrpCBH５に挿入す
る方法は次の通りである。pCBH３をSma I及びHind III
で処理し、中間Hind III部位から下流のCBH I遺伝子の
完全コード配列を含有する７３４bp断片を放出せしめ
た。シャトルベクターptrpCBH５（Ｅ．コリＫ１２dam^-1
宿主であるＧＭ１１９中に調製）をエンドヌクレアーゼ
Stu I及びHind IIIにより次々に処理し、Hind III／Stu
Iベクター断片を放出せしめた。pCH３からの精製したC
BH３ Sm I／Hind III断片を、ptrpCBH５ Stu I／Hind
III断片と、接着末端条件下で、そして次に平滑末端条
件下で連結した。Ｅ．コリＫ１２／ＭＭ２９４をアンピ
シリン耐性に形質転換し、そして目的とするプラスミド
の存在についてコロニーをスクリーニングした。ptrpCB
H８１と称する新プラスミドの構成を第１０図に示す。
Ｅ．コリＫ１２／ＭＭ２９４中のプラスミドptrpCBH８
１はCMCC＃１８４３として同定され、そしてNRRLに寄託
され番号NRRL＃Ｂ１５５７５を有する。

第１０図に示すように、Sma I／Stu I融合は新ベクター
中にSma I部位を再生しない。従ってptrpCBH８１プラス
ミドは、CBH Iイントロン不含遺伝子の開始（メチオニ
ン）コドンに１２bp先行し、そしてtrpリーダーリボゾ
ーム結合部位の１６bp後にユニークSma I／Xma I部位を
有する。

D.8.c. ptrpCBH８２の造成 D.8.a.及びD.8.b.項に前記したプラスミドptrpCBH８、
及びptrpCBH８１をさらに変形して、trpリボゾーム結合
（RBS）と目的とするCBH Iコード配列のATG開始コドン
との間の間隔を短縮した。後で詳細に記載するように、
ptrpCBH８中のRBSとATC開始コドンとの間の介在配列の
２３ヌクレオチドを７ヌクレオチド断片によって置き換
え、そして得られた変形された断片をptrpCBH８１の対
応部分と置換した。変形された配列はさらに、この領域
に最初に含まれていたBma I部位及びXma I部位に代る重
複するCla I認識部位及びAha III認識部位を含有する。
置換方法は第１１図と関連させて下に記載する。

D.8.c.1. プレーATG配列の変形 Sal I／Pst I DNA断片をptrpCBH８から、これらの酵素
を用いる二重消化により切り出した。この断片は、pDG
１５１trpプロモーター（第５図）の５′側のSal I部位
からCBH遺伝子（第７図）の３′側に隣接するPst I部位
まで伸びる。この断片をアガロースゲル電気泳動により
分離し、そして電気溶出により分離した。

バクテリオファージＭ１３mp10w DNAをSal Iで処理し、
次にPst Iで消化してSal I／Pst Iファージ断片を放出
せしめた。バクテリオファージＭ１３mp 10wは部位変異
誘発に使用されるタイプの常用のファージであり、匹敵
するタイプのファージがNew England Biolabs（ベバリ
ンマサチューセッツ）から入手可能である。Sal I／Pst
I断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、そして
電気溶出により回収した。

上記のようにして調製したptrpCBH８及びＭ１３mp 10w
のSal I／Pst I断片を標準的条件下で連結し、そして凍
結したコンピテントＥ．コリＫ１２／ＤＧ９８株に形質
転換した。細胞を、５×１０^-4Ｍイソプロピルチオガラ
クトシド（IPTG）（Sigma Chem．；セントルイス，ミズ
リーから入手される）及び４０μｇ／mlのX-galを含有
する培地上にプレートした。非α−補完白色プラーク
（１６／４０５，４％）を新鮮な培地に拾い上げた。ミ
ニカルチュアーを期待されるサイズ（９kb）の組換単鎖
ファージDNAについてスクリーニングした。Ａ６と称す
る目的とする組換ファージの構造を制限分析を用いて確
認した。

次の配列、 ５′−CAACCTCCGATACATTTTAAATCGATACCCTTTTTAC-３′を
有する化学合成した純粋なオリゴデオキシヌクレオチド
を、Maxam及びGilbert〔Maxam,A.等、メソド・イン・エ
ンチモロジー（Methods in Enzymology）（１９８０）
６８：５２１，Academic Press〕の方法の変法に従って
放射性ラベルした。簡単に記載すれば、New England Nu
clearから得た³²P-ATP８７ｐモル（２９００Ci/mモル）
を乾燥し、そして４０mM Tris-Cl,pH7.6,１０mM MgCl₂,
5mMDTT,0.1mMスペルミジン、及び０．１mM EDTAを含有
する溶液全容３０μ中で５０ｐモルのオリゴマー及び
１２ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと混合した。こ
の混合物を３７℃にて１時間インキュベートし、さらに
１２Ｕのキナーゼを加え、そしてさらに１時間反応を継
続した。粗生成物を、１mmの１６％アクリルアミドゲル
を用いて、冷却しながら５００Ｖにて３０分間電気泳動
を行うPAGEにより精製した。最も遅く泳動するバンドを
切り取り、破砕し、そして１００℃にて１０分間加熱し
た後に０．５mlずつのハイブリド形成緩衝液を用いて２
回溶出した。溶液の比活性は５．３×１０⁶dpm/pm（７
５％導入）であった。

組換Ｍ１３mp１０ｗバクテリオファージＡ６をＥ．コリ
Ｋ１２／ＤＧ９８株中に調製し、そして単鎖ファージDN
Aを精製した。１ｐモルの単鎖ファージDNA及び１０ｐモ
ルの合成ヌクレオチドプライマー（キナーゼ処理してな
い）を、２０mM Tris-Cl、pH8、２０mM MgCl₂、１００mM
NaCl、２０mM ２−メルカプトエタノールから成る液１
５μ中で、６７℃にて１分間、そして次に３７℃にて
３０分間加熱することによりアニーリングした。次にア
ニーリングしたDNAをDNAポリメラーゼＩ（Klenow）及び
５００μMdNTPと共に０℃にて３０分間インキュベート
し、そして次に３７℃にした。アリコート（0.０５又は
0.２５ｐモル）を、５分、２０分、及び４５分後に取り
出し、Ｅ．コリＫ１２／ＭＭ２９４に形質転換し、そし
てＥ．コリＫ１２／ＤＧ９８株と共にプレートした。

このプレートを４℃に冷却し、そしてBiodyneから得ら
れるPal I膜を用いてプラークを取り上げた（第１の
紙においては１〜２分間、第２の紙については１０分
間以上）。紙を２．５Ｍ NaCl，０．５Ｍ NaOH中で
変性した（５分間）。変性媒体を３Ｍ酢酸ナトリウムに
よりpH５．５に中和し、紙を真空中で１時間８０℃に
て加熱し、そして次に６×SSC、５×Denhart溶液、０．
１％SDS、５０μｇ／ml酵母t-RNA中で５4.４℃にて２時
間前ハイブリド形成した。次に紙を、６．５×１０⁶c
pm／1.２５ｐモルのキナーゼ処理した合成オリゴヌクレ
オチド（２．５ml／紙）を用いて５0.５℃にて一夜プ
ローブ処理し、６×SSC中で４０℃にて５分間ずつ２回
洗浄し、そして６×SSC中で５0.５℃で５分間洗浄し、
そして−８０℃にて一夜オートラジオグラフ処理した。

前記合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド１−１５は
CBH I遺伝子の５′末端に相補的であり、そしてヌクレ
オチド２３−３７はptrpCBH８中のＳ／Ｄ配列と隣接す
るBamH I部位との間のコントロール領域に相補的であ
る。第１１図の拡大された部分からわかる通り、目的と
する組換ファージ〔ptrpCBH８１の末端相同（end-homol
ogous）部分がオリゴヌクレオチドプライマーで置換さ
れている〕はBamH I部位及びXma I部位を喪失し、そし
てオリゴヌクレオチドの中央部分に由来するCla I部位
及びAha III部位を獲得している。さらに詳しくは、図
の下部拡大部分に示されているように、変形されたファ
ージはCBH遺伝子のATG開始コドンに直接隣接してTTTAAA
からなるAha III認識部位を含有する。

候補プラークを取り上げ、Ｅ．コリＫ１２／ＤＧ９８株
に感染せしめた後、複製形（RF）DNAを、新しいCla I及
びAha III認識部位の獲得、並びにXma I認識部位の喪失
について試験する。適切な分析結果を示す１つの候補を
mp１０ｗ５Ａと命名した。

D.8.c.2. ptrpCBH８１への置き換え プラスミドptrpCBH８１、及びmp１０ｗ５ＡRF-DNAのそ
れぞれを、Sal I及びBamH Iを用いて完全消化し、そし
て消化物を標準的条件下で連結した。連結混合物をXma
Iにより消化することにより不所望の連結混合物を不活
性化し、そしてこれを用いてＥ．コリＫ１２／ＭＭ２９
４をAmp^Rに形質転換した。

候補プラスミドを制限分析により分析した。これは、Sa
l I／Bam I消化により1.２６kb DNA断片を；Cla I／Bam
H I消化により1.０７kb DNA断片を；そしてBamH I／Aha
III消化により1.０７kb DNAを放出するものである。第
１１図においてptrpCBH８２として示す正しい構成が配
列決定により確認された。

9. CBH Iをコードする酵母発現プラスミドの造成 pDG１５１から誘導されたD.8項の細菌／酵母複製プラス
ミドのベクター骨格の特徴を維持しながらENO１プロモ
ーターの制御のもとにCBH Iコード配列を配置して幾つ
かのプラスミドを造成した。penoCBH５００・２０２と
称する、これらのベクターの内の１つの造成を第１２図
に示す。

プラスミドpPM1４をENO１プロモーターの分離源として
使用した。pPM1４は、エノラーゼ−Ｉ翻訳開始部位に先
行する７２３bpからエノラーゼATG開始コドンのヌクレ
オチド−２にわたる断片を含有するpeno４６〔Holland,
M.J.等、ジャーナル・オブ・ビオロジカル・ケミストリ
ー（J.Biol.Chem.）（１９８１）２５６：１３８５〕か
らの７２２bp EcoR I／Hind III断片を含有するpBR３２
２の誘導体である。pPM１４をEcoR Iで消化し、dATP及
びdTTPの存在下でKlenowで処理し、そして次にHind III
で処理してEcoR I（平滑）／Hind III ENO１プロモータ
ー含有断片を得た。

プラスミドptrpCBH８１をSal Iで消化し、４種数すべて
のdNTPの存在下でKlenowで処理し、そして次にHind III
で完全消化した。

前記において調製した断片を等モル比において接着末端
条件下で連結し、次に平滑末端連結し、そして連結生成
物をNru I及びSma Iで処理して不所望の連結生成物を不
活性化した。連結混合物を用いてＥ．コリＫ１２／ＭＭ
２９４をAmp^Rに形質転換し、そして形質転換体を、peno
CBH２４と称する目的の１1.３２kbプラスミドの存在に
ついてスクリーニングした。制限分析により正しい構成
を確認した。

第１２図に関し、ptrpCBH８２をAha IIIで消化し、そし
てCBH Iをコードする２．２kb DNA断片をアガロースゲ
ル電気泳動により精製した。

この操作により切断される２つのAha III部位は、(1)す
ぐ前に記載したように、CBH I遺伝子の５′末端に隣接
して導入したAha III部位、及び(2)ptrpCBH８１及びptr
pCBH８２中のCBH I遺伝子の３′末端に接するpDG１５１
ベクター領域に含まれるAha III部位である。次にこの
断片をBamH Iで消化して２つのサブフラグメント、すな
わち５′CBH I配列をコードする１０６８bp Aha III／B
amH I断片、及び３′CBH I配列をコードし、さらに細菌
DNA及び３′非翻ENO１配列の広がりを含有する1.１３kb
BamH I／Aha III断片を得る。

プラスミドponoCBH２４をHind IIIで消化し、Ｓ１ヌク
レアーゼで処理し、そして次にBamH Iで消化した。前記
の断片及びpenoCBH２４からのベクターDNA断片を２：１
のモル比で接着末端条件下で連結し、そして次に平滑末
端条件下で連結した。この連結混合物を用いてＥ．コリ
Ｋ１２／ＭＭ２９４株をAmp^Rに形質転換し、そして好結
果の形質転換体を、５′CBH I配列を含有する目的の１
2.２kbプラスミドについてスクリーニングした。EcoR I
消化において2.０５kb断片を放出し、そしてHae III消
化において２００bp断片を放出することにより同定され
た好結果の候補をpenoCBH５００Ｘと命名した。ここで
Ｘは後で特定する標識番号である。プラスミドを、成熟
CBH Iコード配列のヌクレオチド３１−４８に相補的な
内部オクタマープライマーを用いて、ジデオキシDNA配
列分析によりさらに分析した。

プラスミドpenoCBH５００．２０２は次の配列、 をコードし、Hind III接着末端の正確な除去及びAha II
I／CBH I DNA断片への融合が示された。

プラスミドpenoCBH５００．１０８、及びpenoCBH５０
０．１５０は次の同じDNA配列、 をコードし、１個のＡ／Ｔ塩基対がＳ１ヌクレアーゼ処
理中に除去されたことが示された。

プラスミドpenoCBH５００．２１２は次の配列、 をコードし、２個のＡ／Ｔ塩基対、及び１個のＣ／Ｇ塩
基対がENO１プロモーター断片から除去されたことが示
された。

D.10. 酵母におけるクローニングされたCBH I遺伝子の
発現 酵母S.セレビシエーＳ１７３−６Ｂ株をpenoCBH５０
０．２０２により形質転換し、そしてLEU⁺形質転換体に
ついて選択した。好結果の形質転換体コロニーを培養
し、そして最少培地に炭素源としてグルコースを用いて
１０の発酵槽中で増殖せしめた。培養物は光学濃度
（OD₆₈₀）１０まで増殖した。発酵槽の内容物を過
し、液体画分を濃縮し、そして水に対して透析した。

得られた約１０の培地を５００mlに減少せしめ、そし
てD.2に前記した方法に従って、DEAEセファロースカラ
ムに適用することによりさらに精製した。５００mgの蛋
白質をカラムに適用し、約４３７mgを非吸着画分中に回
収し、そして約１００mg、すなわち１８％をCBH Iに対
応する単一ピークとして溶出した。

10.c 酵母における組換法により生産されたCBH Iの特
徴付け 分泌され精製されたCBH I（組換CBH I）を特徴付け、そ
してD.2項に前記した方法に従って分離された天然Ｔ．
リーゼイCBH Iと比較した。結果を後記の第２表に要約
する。

組換CBH I及び天然CBH Iのウエスタンブロット分析を標
準的方法に従って行った。第１３図中のレーン１及び３
は、それぞれ天然CBH I及び組換CBH Iのゲルパターンを
示す。第２表に示すように、ブロット分析により、天然
CBH Iの見かけ分子量は約６０ｋドルトンであり、そし
て組換CBH Iのこれは約１００ｋドルトン〜２００ｋド
ルトンの間であることが示された。

２種類の酵素をグリコシダーゼエンド−Ｈで処理した。
このグリコシダーゼは、蛋白質のＮ−結合グリコシル残
基を脱グリコシル化する。脱グリコシル化処理した天然
蛋白質及び組換蛋白質を上記のようにウエスタンブロッ
ト分析により試験した。結果をそれぞれ第１３図中のレ
ーン２及びレーン４に示す。この図から明らかなよう
に、脱グリコシル化された両蛋白質はおよそ同じ分子量
を有し、組換CBH Iは、天然CBH Iと異り、大きなＮ−結
合残基によって高度にグリコシル化されていることが示
された。これに対して天然CBH Iは、第２表に示すよう
に主としてＯ−結合残基を含有することが知られる。グ
リコシル化された組換CBH Iの見かけ分子量が非常に大
きいのは、Ｎ−結合糖残基が、天然酵素中のＯ−結合グ
リコシル化における部位当り１〜２糖残基と比べて長い
ためである。

精製された天然酵素及び組換酵素のCBH I活性を常法に
従って、燐酸膨潤セルロースからのセロビオースの生成
について測定した。第２表からわかるように、Lowryの
蛋白質測定に基いて、天然CBH Iは約0.５７ユニット／m
gの比活性を有し、組換CBH Iのそれは0.３４ユニット／
mgであった。蛋白質のアミノ酸組成に基いて、組換CBH
Iについての一層高い比活性値（0.４６ユニット／mg）
が算出された。明らかなように、この発明の組換CBH I
は、Ｔ．リーゼイ由来の天然CBH Iとほとんど同じ比活
性を有する。

組換CBH Iの同一性を確認するために、D.2項に前記した
方法を用いて、アミノ末端断片（残基１〜３７）及び中
間断片（残基２２５〜２５１）のアミノ酸配列を決定し
た。２つの配列はそれぞれ、アミノ酸組成において天然
CBH Iの対応断片と同一であった。興味あることに、組
換蛋白質は成熟天然CBH Iと同じアミノ末端ピログルタ
ミンを含有し、(1)リーダーポリペプチドの除去、及び
(2)アミノ末端グルタミン残基を含む同じプロセシンが
組換酵素において生ずることが示された。

要約すれば、CBHセルラーゼをコードする遺伝子がクロ
ーニングされ、そして酵母において発現された。そし
て、適当な制御配列を用いることにより種々の宿主にお
いて発現するために改造することができる。組換CBHが
入手できることは、セルロース廃棄物の一層効率的な利
用、及び最終的にはグルコース及びエタノールを包含す
る有用な誘導体への該廃棄物の転換及びセルロース材料
の特定の変性のための転換の可能性を提供する。

CBH遺伝子の造成及び発現を酵母において発現されるT.
リーゼイ遺伝子に関連させて説明したが、この明細書に
記載した技法は他のCBH遺伝子、例えば種々の菌類由来
のCBH I遺伝子の造成に適用し得ることが理解される。
この明細書に説明した発現ベクターの、他の蛋白質の発
現への一般的適用は前記のB.3項に検討されている。

E. 組換EG Iの製造 この項は組換EG I遺伝子、及び酵母におけるその発現を
説明する。例として、EG Iコード配列をHind IIIカセッ
トとして造成し、そして酵母エノラーゼ制限配列に機能
的に結合するように酵母発現ベクターに連結した。

E.1. ＥＧＩについて濃縮されたmRNAの調製及びcDNAの
合成 セルロース誘導T.リーゼイＬ２７株からポリ−A RNAを
得、そしてD.3に前記したのと実質上同様にしてアガロ
ース電気泳動により画分した。

標準的方法に従って精製ＥＧＩを用いてＥＧＩに対して
特異的な抗体を調製した。簡単に記載すれば、Shoemake
r,S.等、バイオ・テクノロジ（Bio Technology）（１９
８３年１０月）６８７に記載されている方法によって得
た精製ＥＧＩをフロインドのアジュバントと混合し、そ
して０．２〜０．４mlの混合物をニュージランドホウイ
トラビットに筋肉内注射した。抗体価がOuchterlony,
O.,Arkiv Kemi（１９４９）１：４３の二重免疫拡散法
により検出できるようになるまで１０日１２１回注射を
反復した。

正しいmRNA画分を証明するため、少量ずつの各RNA画分
を、New England Nuclear Company、ボストン，マサチ
ューセッツから網状赤血球溶解物／メチオニンＬ−（３
５Ｓ）−翻訳系として販売されている無細胞蛋白質合成
系に加えた。この系により合成されたＥＧＩの存否を、
合成された全蛋白質のSDS-PAGE及び抗−ＥＧＩ抗体と免
疫沈殿しそして次に解離された翻訳系由来蛋白質のSDS-
PAGEにより確認した。

E.2. cDNAプローブの調製 無細胞合成系において高レベルのＥＧＩを含成したmRNA
画分を選択し、そしてこれを用いてD.4項に前記したの
と実質上同様にして単鎖コピーDNAを生成せしめた。単
鎖DNAをゲル電気泳動によりサイズ分析し、期待されるc
DNAサイズに対応する主要バンドを観察した。

E.3 二重鎖cDNAライブラリーの調製 E.1項で調製したmRNA画分を用いて、Maniatis等、モレ
キュラー・クローニング−Ａ・ラボラトリー・マニュア
ル（Molecular Cloning-A Laboratory Manual）（１９
８２）Cold Spring Harbor Laboratory，コールドスプ
リングハーバー，ニューヨーク、２３５−２３８頁の方
法に従ってcDNAライブラリーを作成した。こうして得た
二重鎖cDNAを次に、標準的方法に従ってpUC-8クローニ
ングベクター中にクローニングし、そしてＥＧＩをコー
ドすることが知られている４kb Hing IIIゲノム断片
（前記）を用いて検出した。

プローブとハイブリド形成する３つのcDNAクローン、す
なわちpcEG１０，pcEG９，及びpcEG１を選択してさらに
検討した。これらを、制限分析及びジデオキシ法を用い
るcDNA領域の配列決定により分析した。pcEG１０は配列
の３′領域をコードし、そしてpcEG１は５′部分をコー
ドすることが見出された。

E.4. ＥＧＩ遺伝子の調製及び配列決定 T.リーゼイＬ２７株からのλ−ファージ中のゲノムライ
ブラリーを、Shoemaker,S.等、バイオ・テクノロジー
（Bio Technology）（１９８３年１０月）６９１−696
頁に記載されている方法（この記載を引用によりこの明
細書に組み入れる）、及びさらにD.5項に前記した方法
により調製した。このλ−ゲノムライブラリーを、Shoe
maker,S.等（前掲）に記載されているようにして、但し
プローブとしてE.2項において調製した単鎖cDNAを使用
してスクリーニングした。陽性反応を示すファージから
の１つの断片をpUC8にサブクローニングし、pUC8-hを得
た。このベクターは、全ＥＧＩ遺伝子にわたる４kb Hin
d III断片を含有する。

この断片中のコード配列の位置を、制限分析、並びに
５′末端合成オリゴヌクレオチド及び３′末端cDNAプロ
ーブへのハイブリド形成により決定した。DNAを、EcoR
Iと共にKpn I，Sst I，Xba I及びSph Iを用いて消化
し、そしてプローブとして成熟ＥＧＩ配列のアミノ酸残
基１６−２０に対応し、４ヌクレオチドのあいまいさ
（ambiguity）を有する１６merを用いて、サザンブロッ
ト分析〔Southern,ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー（J.Mol.Biol.）（１９７５）９８：５０
３〕に付した。その結果、遺伝子の主要部分がKpn I部
位及びSst I部位の間に位置することが示された。pUC8
−ｈゲノムDNAの制限地図を第１４図Ａに示す。

さらに、４kb Hind III配列の部分とEGIコード配列との
同一性を制限／選択実験によって確認した。４kb断片
を、Harpold,M.H.等、ニュークレイック・アシド・リサ
ーチ（Nucleic Acids Res.）（１９７８）５：２０３９
の方法に従ってニトロセルロース紙に結合せしめた。
誘導された培養物由来の全mRNAを紙に加え、そして結
合したmRNAを強力な条件下で洗浄することにより非結合
mRNAから分離した。次に紙に結合したmRNAを溶出し
た。各紙について、結合mRNA画分及び非結合mRNA画分
を無細胞蛋白質合成系において翻訳し、そして合成され
た蛋白質を抗−ＥＧＩ抗体及びスタフィロコッカス・ア
ウレス細胞の混合物を用いて沈殿せしめた。免疫沈殿物
からの蛋白質をSDS-PAGEに付した。実験結果を第１５図
に示す。図中のレーン１は並行して泳動した幾つかの分
子量マーカーを示す。レーン２は無細胞合成系中で生産
された全ポリA-RNR翻訳生成物のゲルである。全翻訳生
成物の抗−ＥＧＩ免疫沈殿をレーン３に示す。分子量に
おいてEGIに対応する単一バンドを示す。プローブとハ
イブリド形成するポリA-RNAの翻訳生成物のゲルパター
ンをレーン４に示す。このレーンはＥＧＩの分子量に相
当する主たるバンドを示す。レーン４の材料は、抗−Ｅ
ＧＩ抗体により免疫沈殿した後、レーン５に示されるＥ
ＧＩについて期待される分子量を有する単一バンドをも
たらす。レーン６及び７はそれぞれ、４kb Hind III断
片とハイブリド形成しなかったポリA-RNAにより指令さ
れた翻訳生成物のすべて、及び抗−ＥＧＩ免疫沈殿物を
示す。図から明らかな通り、４kb Hind III断片を含有
する紙に結合したmRNAのみが、抗−ＥＧＩにより免疫
沈殿する蛋白質の合成を指令することができた。

次に、ＥＧＩ遺伝子の完全コード配列を標準的制限法及
び配列決定法を用いて得た。結果を後の第３表に示す。
配列決定された断片は１６９７ヌクレオチドを含有し、
この配列は成熟蛋白質の４３７アミノ酸残基のコード配
列に先行する２２アミノ酸リーダー配列のための６６ヌ
クレオチドを包含する。DNA配列はさらに、ヌクレオチ
ド位置８９３〜９６２、及び１５５３〜１６０９に２個
のイントロンを含有する。イントロンの位置は、このコ
ード配列をcDNApcEG１０及びpcEG１の同様の配列決定に
より得られた配列と比較することにより、そして公知の
アミノ酸配列（表に示してある）と比較することにより
推定した。リーダーペプチド（アミノ酸１−２２）に対
応するコード配列はＥＧＩの分泌を開始するためのシグ
ナル配列を提供し、そしてこの明細書においてＥＧＩシ
グナル配列と称する。第３表のアミノ酸配列は、連続し
た形でＥＧＩのポリペプチド配列である。

E.5 イントロン不含ＥＧＩコード配列の造成 E.4項からのプラスミドpUC8-hをSph Iで消化し、そして
Sph I断片をアガロースゲル上で精製した。分離された
断片を、標準的方法に従ってSph I消化Ｍ１８mp８にク
ローニングした。連結されたファージをコンピテント
Ｅ．コリＤＧ９８株に形質転換し、そして細胞を、IPTG
(5×10^-4M)の存在下X-gal（４０mg/ml）を含有するプレ
ート上にプレートした。非α−補完白色プラークを、期
待される１０．３kbサイズの組換単鎖ファージDNAにつ
いてスクリーニングした。ＪＶ８２．２と称する目的と
する組換ファージの構造を制限分析を用いて確認した。
この構成を第１４図フレームＢに示す。このベクターを
Φ８２．２と命名する。

下流イントロンの除去はゲノムクローンの３′部分を、
濃縮されたmRNAから調製されたcDNAクローンの対応部分
で置き換えることにより行い、そして制限分析により特
徴付けた。具体的には、ＪＶ８２．２をPst Iで完全消
化し、そしてこの消化物をpcEG１０からのpst I消化断
片と連結し、第１４図のコードフレーム中に示されるＪ
Ｖ１０4.３４（Φ１０4.３４）を得る。pcEG１０からの
Pst I断片は、下流イントロンを含有する部分を含むゲ
ノムクローン中のコード領域に対応するコード領域を含
む。すなわちＪＶ１０4.３４は下流イントロンが除去さ
れたＥＧＩ遺伝子の完全コード配列を含む。

上流イントロンを除去するために、部位特定変異誘発を
用いた。第１上流イントロンを含む配列に相補的である
がイントロン配列を欠いているオリゴヌクレオチドプラ
イマーを合成した。このプライマー配列： ５′−GGCAGCGGCTACCAAAAGGTACTACGGCCCCGGAGA−３′ を有する。組換Ｍ１３mp１９バクテリオファージＪＶ１
０4.３４をＥ．コリＫ１２／ＤＧ９８株中に調製し、そ
して常法に従って単鎖ファージを精製した。単鎖ファー
ジをDNA合成のためのプライマーとして用いて、標準的
方法に従ってプライマーとして合成オリゴマーを用いる
部位特定変異誘発を行った。プローブとして放射ラベル
したオリゴマーを用いるスクリーニングにより得られた
好結果のバクテリオファージ候補ＪＶ１２9.３（Φ１２
9.３）を第１４図のフレームＤに示す。ＪＶ１２9.３は
適切なリーディングフレーム中に完全な非中断ＥＧＩコ
ード配列を含有する。

イントロン不含遺伝子をさらに精巧にし、第１４図フレ
ームＥ及びＦに示すように、コード配列の直接上流及び
下流にHind III部位を設けてHind IIIカセットとして操
作できるようにした。上流Hind III部位を設けるため
に、コード配列の直接上流の配列に相補的であるが、AT
G翻訳開始コドンの５′に隣接してHind III部位を形成
するために６個のミスマッチを有する合成オリゴヌクレ
オチド： ５′−CTTAGTCCTTCTTGAAGCTTTAAAATGGCGCCCT-3′ を使用して、上記の部位特定変異誘発により天然上流配
列を置き換えた。得られたファージをHind IIIを用いて
さらに処理し、そして再連結して新しい５′近くのHind
IIIと第１４図フレームＡ〜Ｄに示す上流部位との間の
DNA部分を除去し、ＪＶ１３4.１（第１４図中フレーム
ＥのΦ１３4.１）を得た。

同様にして、部位特定変異誘発法において合成ヌクレオ
チド： ５′−AATGCCTTTAGAAGCTTGACTTGCCT-3′ を使用してＥＧＩ遺伝子を含有するＭ１３ベクターを、
Hind IIIカセットＪＶ１３9.２（第１４図中フレーム
Ｆ、Φ１３9.２）として造成した。

E.6. ＥＧＩコード配列を含有する発現ベクターの造成 エノラーゼ−１プロモーター及びエノラーゼ−１ターミ
ネーターの制御のもとにＥＧＩ配列を含有する酵母にお
いて有用な発現ベクターを、酵母宿主ベクターpMAC 101
のHind III部位にHind IIIカセットを連結することによ
り造成した。

pMAC 101は、変形された酵母エノラーゼ−１（ENO1）プ
ロモーター配列及び酵母エノラーゼ−１（ENO1）ターミ
ネーター配列の間に設けられたHind切断部位を含有する
１0.２kbベクターである。このベクターはさらに、酵母
LEI2遺伝子、酵母２μ複製開始点、並びにpBR３２２の
複製開始点及びAmp^R部分を有する。pMAC101は、下に記
載するように、ベクターpJV１６０から、該ベクター中
のHind III遺伝子カセットを除去することにより容易に
得られる。

酵母におけるＥＧＩのための発現ベクターpJV１６０を
造成するために、pMAC１０１をHind IIIにより完全消化
し、そして複製形（RF）のＪＶ１３9.２から切り出され
たHind IIIカセットに連結した。連結混合物を使用して
酵母Ｃ ４６８株を形質転換した。好結果の形質転換体
をLEU⁺について選択し、そして陽性の候補を、下記のよ
うにカルボキシメチルセルロース（CMC）の上層を透明
にする能力により測定した。（セルラーゼ複合体酵素の
内エンドグルカナーゼのみがカルボキシメチルセルロー
スを加水分解するために適当な特異性を有する。セロビ
オヒドロラーゼはセルラーゼ自体に特異的であり、CMC
を加水分解しない。） E.7. 酵母におけるＥＧＩの発現の確認 LEU2⁺について選択した後、３種類の好結果の形質転換
体を、Teather,R.等、アブライド・エンビロンメンタル
・ミクロ(Aplld.Envir.Micro.)（１９８２）４３：７７
７の方法に実質上従って、ＥＧＩの生成について測定し
た。コロニーの最少培地上に３０℃にて増殖せしめ、そ
して０．５％CMC、１５mM NaOAc,pH４．５、及び１０mM
ナトリウムアジドを含有する上層寒天（０．８％）で覆
った。次にプレートを３７℃にて４時間インキュベート
した。CMCの透明化を可視化するために、プレートを１m
g/mlのコンゴーレッドにより１５分間処理し、そして１
M NaClで５分間処理し、次に１M HClで５分間処理し
た。分泌される機能的に活性なＥＧＩを生産する３種類
の酵素形質転換体の能力を試験するために、３種類の形
質転換体のそれぞれ、及びpMAC１０１で形質転換された
酵母（対照）の培養上清液を調製した。上清サンプル
（１倍、又は２０倍に濃縮したもの）をCMCプレート上
にスポットし、そして上記のようにしてＥＧＩ活性につ
いて測定した。結果を第１６図に示す。スポット１〜４
は、３種類のEGI（１−３）及び対照(4)の１倍濃度の結
果であり、スポット５〜８は対応する２０倍濃度の結果
である。図から明らかなように、すべてのＥＧＩ形質転
換体は活性なＥＧＩを分泌したが対照形質転換体は分泌
しなかった。スポット９はT.リーゼイ由来の天然ＥＧＩ
により形成されたものである。

ＥＧＩの発現の証明はまた、ウエスタンブロット法によ
っても行った。３種類の酵母培養物からの前記の測定に
よってＥＧＩ活性を示す濃縮された培養上清をSDS-PAGE
上で泳動し、ニトロセルロースに移し、そして抗−ＥＧ
Ｉ抗体を用いて検出し、次に¹²⁵Iで放射性ラベルしたst
aph A蛋白質で処理した。

第１７図中レーン１はT.リーゼイ由来の天然の精製され
たＥＧＩを示す。レーン２，３，４は３種類のＥＧＩ酵
母形質転換体のそれぞれの上清液のゲルパターンであ
る。図から明らかな通り、ＥＧＩ形質転換体のそれぞれ
は天然ＥＧＩの分子量よりは幾分高い分子量を有するポ
リペプチドを分泌する。このバンドは、pMAC101を用い
て形質転換した酵母からの上清液中には見出されなかっ
た。ＥＧＩの分子量が高いのはおそらく、CBH Iについ
てすでに記載したのと同様に、翻訳後プロセシングにお
いて天然ＥＧＩと異るためであろう。

酵母におけるＥＧＩの好結果の発現のために使用される
方法は、ベクター制御配列における適当な変形により、
細菌宿主及び酵母宿主を含む種々の宿主において発現を
達成するために適用することができる。CBH Iの場合と
同様に、この発明の方法は、T.リーゼイ由来のＥＧIIを
含む他の種々のエンドグルカナーゼの遺伝のクローニン
グ、及び発現を得るために使用することができる。

特に組換CBH Iと相俟って、組換ＥＧＩが入手可能であ
ることは、セルロース生成物の一層効率的な使用、セル
ロースの有用な誘導体への転換、及び／又はセルロース
材料の選択的変性の可能性を提供する。CBH Ｉ，ＥＧ
Ｉ、及び場合によってはβ−グルコシダーゼを含むセル
ロース分解系は、個々の分離された組換酵素から、又は
セルラーゼの組合せを含有する多宿主系を使用すること
により構成することができる。

前記のATCC及びNRRLへの寄託に加えて、下記の微生物
が、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブ
タペスト条約に基いてアメリカン・タイプ・カルチュア
・コレクション、12301パークラウンドライブ、ロック
ベレ、メリーランド、米国（ATCC）に寄託され、維持さ
れており、そしてブタペスト条約に基いて入手可能であ
る。これらの菌株の入手可能性を、いずれかの国の特許
法に基いてその政府の権威の下に認められた権利に反し
てこの発明を実施することの承諾であると解してはなら
ない。

寄託には下記のATCC寄託番号、及びMaster Culture Col
lection of Cetus Corprationの番号が与えられた。

【図面の簡単な説明】

第１図はセルラーゼ誘導体炭素源の存在下（レーン１）
又は非存在下（レーン２）で増殖したT.リーゼイから分
離されたポリA RNAのゲル電気泳動パターンを示し； 第２図は、無細胞合成系で生産されたポリペプチドのゲ
ル電気泳動パターンを示し、この系には(a)セルラーゼ
誘導条件下で増殖したT.リーゼイから得られた全ポリA
RNA（レーン１及び２）、(b)全誘導ポリA RNAの３つの
異るサイズの画分（レーン３〜８）、又は(c)セルラー
ゼ非誘導条件下で増殖したT.リーゼイの細胞から得られ
たポリA RNAのサイズ画分（レーン９及び１０）が加え
られ、この図において奇数番号のゲルパターンは種種の
RNAサンプルの指令のもとに合成された全ポリペプチド
を示し、そして偶数番号のゲルパターンは抗−CBH I抗
体の存在下で免疫沈殿する対応するペプチドを示し； 第３Ａ図は、T.リーゼイＬ２７株ゲノムDNAからの1.１
６kb Hind III断片を含有するpCBH 157と称するベクタ
ーの地図であり； 第３Ｂ図は、同じゲノムDNAからの上記1.１６kb断片に
隣接する２．３kb Hind III断片を含有するpCBH１６４
と称するベクターの地図であり； 第４図は、T.リーゼイＬ２７株からの隣接する２個のHi
nd IIIゲノム消化断片であって一緒になってCBH I遺伝
子を含有するものの地図であり； 第５図は、この発明の１つの態様において使用するE.コ
リ／S.セレビシエーシャトルベクターの地図であり； 第６図は、この発明の１つの態様に従ってCBH I遺伝子
のイントロン不含５′端部分を造成する段階を示し； 第７図は、この発明の態様に従ってイントロン不含CBH
I遺伝子の３′端部分を造成する段階を示し； 第８図は、pDG１５１（第５図）及びpCBH５（第６図）
からのptrpCBH５と称するベクターの造成を示し； 第９図は、ptrpCBH５（第８図）及びpCBH３（第７図）
からの、完全な長さのイントロン不含CBH I遺伝子を含
有するptrpCBH８と称するベクターの造成を示し； 第１０図は、ptrpCBH５及びpCBH５からの、完全な長さ
を有するイントロン不含CBH I遺伝子を含有するptrpCBH
８１と称するベクターの造成を示し； 第１１図は、E.コリ中でのCBH Iの発現に適するベクタ
ーのptrpCBH８２の構成を示し； 第１２図は、酵母中でのCBH Iの発現に適するベクターp
eno５００．２０２の造成を示し； 第１３図は、天然CBH I及び組換CBH Iのウエスタンブロ
ット分析の結果を示し； 第１４図は、フレームＡにおいてpUC8-hのＥＧＩコード
部分の制限地図を、フレームＢ〜ＤにＥＧＩのイントロ
ン不含コード配列を造成するまでの一連の段階を、そし
てフレームＥ及びＦにＥＧＩコード配列の直接上流及び
下流にHind III部位を設けるための段階を示し； 第１５図は、T.リーゼイからの４kb Hind III断片の、
ＥＧＩ合成を指令することができるmRNAを分離する能力
を試験するハイブリド形成実験の結果を示し； 第１６図は、pJV１６０により形質転換されたコロニー
の、CMCを加水分解する能力を示し； そして、 第１７図は、pJV１６０で形質転換された酵母及び対照
ベクターで形質転換された酵母の培養上清液において行
われたウエスタンブロットのラジオオートグラムであ
る。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:885） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 マイケル アラン イニス アメリカ合衆国，カリフオルニア 94602, オークランド，カールセン ストリート 3133 (72)発明者 ジヤネル バン アースデル アメリカ合衆国，カリフオルニア 94803, エル ソブランテ，サン パブロ ダム ロード 4172エー (72)発明者 シヤーリー イー ウオク アメリカ合衆国，カリフオルニア 94583, サン ラモン，ロモンド サークル 611 (72)発明者 マーサ ベイリー ラドナー アメリカ合衆国，カリフオルニア 94804, リツチモンド，バレツト アベニユ 2800 (72)発明者 ビツキー シユウエイカート アメリカ合衆国，カリフオルニア 94707, ケンシングトン，バリイ ロード 1513

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】セロビオヒドロラーゼＩをもたらす次のア
   ミノ酸配列： X-Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro
   Pro Leu Thr Trp Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr
   Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser Val Val Ile Asp Ala
   Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser Thr
   Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cy
   s Pro Asp Asn Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu
   Asp Gly Ala Ala Tyr Ala Ser Thr Tyr Gly Val Thr
   Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Gly Phe Val Thr G
   ln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Le
   u Met Ala Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu
   Leu Gly Asn Glu Phe Ser Phe Asp Val Asp Val Ser
   Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr Phe V
   al Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pr
   o Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr
   Cys Asp Ser Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile
   Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly Trp Glu Pro Ser S
   er Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly Se
   r Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser
   Ile Ser Glu Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr
   Val Gly Gln Glu Ile Cys Glu Gly Asp Gly Cys Gly G
   ly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr Cys As
   p Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly
   Asn Thr Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr
   Leu Asp Thr Thr Lys Lys Leu Thr Val Val Thr Gln P
   he Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr Tyr Val Gl
   n Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu
   Gly Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr
   Cys Thr Ala Glu Glu Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser P
   he Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln Phe Lys Lys Al
   a Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp
   Asp Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser
   Thr Tyr Pro Thr Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly A
   la Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr Ser Ser Gly Val Pr
   o Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys Val
   Thr Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser
   Thr Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly A
   sn Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Th
   r Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr
   Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr
   Val Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn P
   ro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu（配列中、Ｘは存在しない
   か、又は次のアミノ酸配列：Met Tyr Arg Lys Leu Ala
   Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg Alaを有す
   るリーダー配列を示す）、 又は該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸
   が付加、欠失もしくは置換されており且つセロビオヒド
   ロラーゼＩの酵素活性をもたらすアミノ酸配列、 をコードしている塩基配列を含んで成るDNA。
2. 【請求項２】イントロンを含有している特許請求の範囲
   第１項に記載のDNA。
3. 【請求項３】イントロンを含有することなく前記アミノ
   酸配列をコードしている特許請求の範囲第１項に記載の
   DNA。
4. 【請求項４】セロビオヒドロラーゼＩをもたらす次のア
   ミノ酸配列： X-Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro
   Pro Leu Thr Trp Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr
   Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser Val Val Ile Asp Ala A
   sn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser Thr As
   n Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys
   Pro Asp Asn Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu
   Asp Gly Ala Ala Tyr Ala Ser Thr Tyr Gly Val Thr T
   hr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Gly Phe Val Thr Gl
   n Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu
   Met Ala Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu
   Leu Gly Asn Glu Phe Ser Phe Asp Val Asp Val Ser G
   ln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr Phe Va
   l Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro
   Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr
   Cys Asp Ser Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile A
   sn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly Trp Glu Pro Ser Se
   r Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly Ser
   Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser
   Ile Ser Glu Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr V
   al Gly Gln Glu Ile Cys Glu Gly Asp Gly Cys Gly Gl
   y Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr Cys Asp
   Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly
   Asn Thr Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr L
   eu Asp Thr Thr Lss Lys Leu Thr Val Val Thr Gln Ph
   e Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr Tyr Val Gln
   Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu
   Gly Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr C
   ys Thr Ala Glu Glu Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Ph
   e Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln Phe Lys Lys Ala
   Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp
   Asp Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser T
   hr Tyr Pro Thr Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Al
   a Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr Ser Ser Gly Val Pro
   Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys Val
   Thr Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser T
   hr Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly As
   n Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr
   Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr
   Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr V
   al Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pr
   o Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu（配列中、Ｘは存在しない
   か、又は次のアミノ酸配列：Met Tyr Arg Lys Leu Ala
   Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg Alaを有す
   るリーダー配列を示す）、 又は該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸
   が付加、欠失もしくは置換されており且つセロビオヒド
   ロラーゼＩの酵素活性をもたらすアミノ酸配列、 をコードしている塩基配列を含んで成る発現ベクター。
5. 【請求項５】セロビオヒドロラーゼＩをもたらす次のア
   ミノ酸配列： X-Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro
   Pro Leu Thr Trp Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr
   Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser Val Val Ile Asp Ala A
   sn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser Thr As
   n Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys
   Pro Asp Asn Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu
   Asp Gly Ala Ala Tyr Ala Ser Thr Tyr Gly Val Thr T
   hr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Gly Phe Val Thr Gl
   n Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu
   Met Ala Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu
   Leu Gly Asn Glu Phe Ser Phe Asp Val Asp Val Ser G
   ln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr Phe Va
   l Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro
   Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr
   Cys Asp Ser Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile A
   sn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly Trp Glu Pro Ser Se
   r Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly Ser
   Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser
   Ile Ser Glu Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr V
   al Gly Gln Glu Ile Cys Glu Gly Asp Gly Cys Gly Gl
   y Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr Cys Asp
   Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly
   Asn Thr Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr L
   eu Asp Thr Thr Lys Lys Leu Thr Val Val Thr Gln Ph
   e Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr Tyr Val Gln
   Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu
   Gly Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr C
   ys Thr Ala Glu Glu Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Ph
   e Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln Phe Lys Lys Ala
   Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp
   Asp Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser T
   hr Tyr Pro Thr Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Al
   a Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr Ser Ser Gly Val Pro
   Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys Val
   Thr Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser T
   hr Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly As
   n Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr
   Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr
   Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr V
   al Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pr
   o Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu（配列中、Ｘは存在しない
   か、又は次のアミノ酸配列：Met Tyr Arg Lys Leu Ala
   Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg Alaを有す
   るリーダー配列を示す）、 又は該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸
   が付加、欠失もしくは置換されており且つセロビオヒド
   ロラーゼＩの酵素活性をもたらすアミノ酸配列、 をコードしている塩基配列を含んで成る発現ベクターに
   より形質転換された酵母。