FI105206B - Ilmentämisjärjestelmä - Google Patents

Ilmentämisjärjestelmä Download PDF

Info

Publication number
FI105206B
FI105206B FI904299A FI904299A FI105206B FI 105206 B FI105206 B FI 105206B FI 904299 A FI904299 A FI 904299A FI 904299 A FI904299 A FI 904299A FI 105206 B FI105206 B FI 105206B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
dna
dsm
gene
fragment
lambda
Prior art date
Application number
FI904299A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI904299A0 (fi
Inventor
Frank Buxton
Graaff Leendert Hendrik De
Jacob Visser
Hendrik Jan Dirk Bussink
Hermanus Cornelis Maria Kester
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB898919884A external-priority patent/GB8919884D0/en
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of FI904299A0 publication Critical patent/FI904299A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI105206B publication Critical patent/FI105206B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L21/00—Marmalades, jams, jellies or the like; Products from apiculture; Preparation or treatment thereof
    • A23L21/10—Marmalades; Jams; Jellies; Other similar fruit or vegetable compositions; Simulated fruit products
    • A23L21/11—Marmalades; Jams; Jellies; Other similar fruit or vegetable compositions; Simulated fruit products obtained by enzymatic digestion of fruit or vegetable compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01015—Polygalacturonase (3.2.1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

105206
Ilmentämisjärjestelmä
Keksintö koskee geenitekniikan aluetta ja uusia DNA-mole-5 kyylejä, jotka sisältävät DNA-sekvenssejä, jotka koodit-f tavat proteiineja, joilla on polygalakturonaasiaktiivi- suutta, ja/tai niihin luonnostaan liittyen promoottori-, - signaali- ja/tai transkription lopetussekvenssejä. Uudet DNA-molekyylit ovat käyttökelpoisia konstruoitaessa eks-10 pressiokasetteja polygalakturonaasien tuottamista varten tai vieraiden geenien ilmentämistä varten rihmasienissä.
Vaikkakin geenitekniikassa jo tunnetaan lukuisia polypep-tidien ekspressiosysteemejä prokaryoottisille ja eukary-15 oottisille isännille, tarvitaan jatkuvasti uusia systeemejä, jotka ovat aikaisempia systeemejä edullisempia.
Hyvin runsaasti käytettyjä isäntiä ovat prokaryoottinen Escherichia coli ja eukaryoottiset hiivat, esim. Saccha-20 romvces cerevisiae. joita varten on kehitetty suuri määrä erilaisia ekspressiohybridivektoreita, enimmäkseen plas- • · · **’f’ mideja. E. coli -isäntien haittapuolena on se, että ne • · » *' ' eivät kykene glykosyloimaan polypeptidejä, ja että vie- « * raiden peptidien intrasellulaarinen ilmentäminen voi 25 johtaa peptidien kertymiseen solun sisään ja lisäkasvun • Il estymiseen. Hiivat kylläkin glykosyloivat mutta ne eivät :T: kuitenkaan E. colin tavoin eritä polypeptidejä, pieniä molekyylejä lukuunottamatta, kasvualustaan vaan periplas- miseen tilaan. Korkeammat eukaryoottiset isännät kuten, ’’ “ 30 nisäkkäiden syöpäsolut, kykenevät glykosyloimaan ja erit- • · · tämään kasvualustaan, niiden viljelyn kuitenkin ollessa ^ hidasta ja kallista, ja on olemassa vaara, että onkogee- • · · nisiä nukleiinihappoja voidaan eristää yhdessä tavoitel- .*. j lun peptidin kanssa.
.”·! 35 • «
Etsittäessä muita isäntiä on myös tutkittu rihmasieniä kuten Neurospora crassaa. Aspergillus nldulansla ja As- 105206 2 pergillus nigeriä. Niiden käyttäminen geenitekniikassa on ollut hitaampaa, johtuen pääasiallisesti sopivan trans-formaatiosysteemin puuttumisesta. Päinvastaisesta kuin Saccharomvces cerevisiaellä. rihmasienet eivät sisällä 5 plasmideja, joita voitaisiin käyttää vieraiden geenien liittämiseen ja fenotyyppiseen valintaan. Rihmasieniä on * kuitenkin mahdollista transformoida vierailla plasmideil-la, jotka sisältävät valikoitavan merkkigeenin. Useimmat tähän mennessä rihmasienille kuvaillut vektorit eivät 10 kahdennu itsenäisesti kuten hiivan vektorit, vaan kiinnittyvät sienen kromosomiin. Tämän tapahtuman esiintymistiheys on yleensä alhaisempi. Yhdistävä transformaatio tekee transformanteista kuitenkin mitoottisesti hyvin pysyviä, jopa ei-valikoivissa olosuhteissa. Enemmän kuin 15 sata kopiota sisältävästä pysyvästä integraatiosta on raportoitu.
Ensimmäinen rihmasienille kuvailtu vektori sisälsi Neuro-spora crassan qa-2 -geenin valikoitavana markkerina [Ca-20 se, M.E., Schweizer, M., Kushner, S.R. ja Giles, N.H.
(1979) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76, 5259-5263; Case, M.E.
I f i | (1982), Genetic Engineering of Microorganisms for Chemi- '· "· cals (Hollander, A., DeMoss, D., Kaplan, S., Konisky, J., 25 Savage, D. ja Wolfe, R.S. edit.), ss. 87-100, Plenum].
< f « « • « • · · : Aspergillus nidulansilla, jolla on suvullinen kierto, ja joka sen vuoksi on sopiva klassisiin geenimanipuloin-teihin, on kuvailtu sekä negatiivisia että positiivisia 30 valikointisysteemejä (Ballance et ai., BBRC 112. 284, • · · 1983; Tilburn et ai., Gene 26, 205, 1983; Yelton, et ai..
•••ί PNAS 81, 1470, 1984; Yelton ja Timberlake, J. Cell. Bio- • «t ·...· chem. Suppl. 9C, 173, 1985; Johnstone et ai., EMBO J. 4, * 1307, 1983; Tilburn et ai., Gene 26, 205, 1983; Wernars .···. 35 et ai., Curr. Genet. 9, 361, 1985; Kelly, J.M., EMBO J.
4, 475, 1985).
3 105206
Verrattuna N. orassaan tai A. nidulansiin, A. nlqer on verrattomasti tärkeämpi organismi, koska sitä käytetään laajalti entsyymien teollisessa tuotannossa, esim. käytettäväksi elintarviketeollisuudessa. A. nioerin tiede-5 tään erittävän useita eri hydrolyyttisiä entsyymejä, * esim. glukoamylaasia, a-amylaasia, pektinaasia, sel- lulaasia, β-glukanaasia, β-galaktosidaasia, narin-ψ ginaasla, pentosanaasia, hapanta proteaasia ja lignaasia, glukoamylaasin ja pektinaasikompleksin ollessa tärkeim-10 piä.
A. nigerillä ei ole tunnettua suvullista kiertoa. Mutaatioita ei siitä johtuen voi toteuttaa meioottisen rekom-binaation kautta. Klassisten mutaatio- ja valintamenet-15 telyjen avulla on kuitenkin saatu aikaan kantojen laajaperäisiä parannuksia hydrolyyttisten entsyymien erityksessä.
A. nigerin entsyymien geeneistä vain glukoamylaasin (Boel 20 et ai., EMBO J. 3, 1581, 1984) ja alkoholi- ja al-... dehydidehydrogenaasin (W0 86/06097) geenit yhdessä niiden » I · • · promoottori- ja signaalisekvenssien kanssa on karak- • · ’·' ' terisoitu, ja niitä on käytetty transformaatiokokeissa A.
nidulansilla ja A^. nigerillä.
25 *«·
Valintamarkkerina A. nigerille on käytetty heterologista :T: amds-geeniä (Kelly ja Hynes, EMBO J. 4, 475, 1985) ja argB-geeniä (Buxton gt gl., Gene 37, 207, 1985; EP 184 ....| 438; W0 86/06097), molemmat saatuina A. nidulansista.
30 • · · A. niaer on tärkein organismi pektiiniä hajottavien ent-syymien teollisessa tuotannossa, esim. polygalak- • · * ·...· turonaasien, pektiinilyaasien tai pektiiniesteraasien.
* : Pektiinit ovat molekyylipainoltaan suuria (200000-40000 • » ,···. 35 D) polygalakturonideja, jotka koostuvat a-1,4-glykosidi- f · sesti sidotuista D-galakturonihappopolymeereistä. Jotkut uronihapporyhmistä ovat esteröityneet metanolin kanssa, 105206 4 joka voidaan lohkaista pois pektiiniesteraasin avulla.
Pektiinit esiintyvät luonnossa korkeampien kasvisolujen aineosana, joissa ne ovat kiinnittyneinä selluloosamole-kyyleihin, joita tavataan pääasiassa primaarisoluseinässä 5 ja keskilamellissa. Rikkaimpiin pektiinilähteisiin lukeutuvat sitruunan ja appelsiinin kuoret, jotka sisältävät s noin 30 % tätä polysakkaridia. Pektiinientsyymit hajottavat hiilihydraattipolymeerisubstraattia joko hydrolysoimalla glykosidisen a-1,4-sidoksen (endo- ja eksopoly-10 galakturonaasit) tai transeliminaation (trans-isomeerin poiston) avulla (pektiinilyaasit), mikä johtaa tyydyttyneeseen ja a-4,5-tyydyttymättömään poly- tai oligoga-lakturonidiin. Systemaattinen nimi endo-polygalakt-uronaasille on (poly-(l,4-a-D-galakturonidi))glykaanihyd-15 rolaasi (EC 3.2.1.15) ja ekso-polygalakturonaasille (p-oly-(1,4-a-D-galakturonidi))-galakturonohydrolaasi (EC 3.2.1.67). Toinen merkityksellinen pektiiniä hajottava galakturonaasientsyymi on ramnogalakturonaasi, joka hydrolysoi sidoksia α-D-galakturonaatin ja L-ramnoosin vä-20 Iillä.
I I • I I
Samalla kun pektiinilyaasit ovat spesifisiä runsaasti
« I I
*·' ‘ esteröityneille pektiineille, polygalakturonaasit hydrol- *. *: ysoivat vähän esteröityneitä pektiinejä. Pek- 25 tiiniesteraasien ja polygalakturonaasien yhteistoiminta ί,,,ί voi myös depolymeroida runsaasti esteröityneitä pek- tiineja.
Polygalakturonaasin ja sen entsyymiseosten käyttösovellu-30 tukset hedelmä- ja kasviprosessoinnissa (taulukko 1) ovat • « v kehittyneet pektiinientsyymien alkuperäisistä käytöistä ...! pehmeän hedelmän käsittelyyn, korkeiden mehu- ja pigment- ··· *...· tisaantojen varmistamiseksi puristuksen yhteydessä ja raa'an puristusmehun kirkastamiseen. Näihin prosesseihin • · ,···. 35 käytettävät tekniset entsyymivalmisteet sisältävät pek- « t tiiniesteraaseja, polygalakturonaaseja ja pek-tiinilyaaseja vaihtelevina määrinä muiden entsyymien 5 105206 ohella kuten arabinanaasien, galaktanaasien, ksylanaa-sien, β-l,4-glukanaasien, glykosidaasien ja proteaasien.
Sienten pektinaasivalmisteita, jotka sisältävät enimmäk-5 seen endopolygalakturonaasia, ja jotka ovat vapaita pek-» tiiniesteraasista, käytetään tuloksekkaasti liottavina entsyymeinä mehevien nektarien tuottamiseksi, joilla on * pehmeämpi koostumus, ja jotka sisältävät enemmän liukoisia kuiva-aineita, pigmenttejä ja ravinteita kuin 10 tuotteet, jotka on valmistettu mekaanis-termisen prosessin avulla.
15 Taulukko 1 (viitteestä 32) Polygalakturonaasien ja niiden seosten käyttäminen hedelmä- ja kasvisteollisuudessa.
Entsyymit Käyttö 20 Polygalakturonaasi Liotus, citrus-mehun stabi- lointi/viskositeetin alenta-
I I I
• I I
minen
< I I
• · I •
• I
« · i '· '1 Pektiiniesteraasi + poly- Mehun kirkastus,mehun/öljyn 25 galakturonaasi ja/tai uuttaminen, citrus-kuoriöl- < 4 « pektiinilyaasi jyn, citrus-sulpun pesu • •f • t · • · ·
Pektiiniesteraasi/polyga- Lisää luonnontuotteen uutos-lakturonaasi/pektiinilyaasi ta 30 + (hemi )sellulaasit Biomassan/rehun 9 9 9 *· arvouttaminen Ϊ ·*· •••i (valorisointi) • •f • · • ·
• · V
• p • ·
P · P
P P
,···, 35 Pektiiniesteraasin läsnäolo voi helposti muuttaa puhtaan
P P
polygalakturonaasin liotusaktiivisuuden soluja rikkovaksi aktiivisuudeksi, johtuen pektiiniesteraasi/polygalakturo- 6 105206 naasiyhdistelmän yleisestä depolymeroivasta aktiivisuudesta.
Käyttämällä pektiinientsyymejä ja sellulolyyttisiä ent-5 syymejä, hedelmäsulppujen soluseinät voidaan hajottaa miltei täydelliseen nesteytymisvaiheeseen. Sekä endo-että ekso-β-Ι,4-glukanaasien (sellulaasien) samoin kuin pektiinientsyymien läsnäolo on olennaista, 31.
10 Polygalakturonaasi ja sen entsyymiseokset ovat käyttökelpoisia myös biomassan nesteytykseen ja sokeroimiseen, esimerkiksi fermentoitavien polysakkaridien tuottamiseksi kasvisoluista, 33, tai pektiinien modifioimiseksi (yleiskatsauksena, 32. Polygalakturonaasit yhdessä ksylanaasien 15 kanssa ovat käyttökelpoisia myös esimerkiksi paperimas-sateollisuudessa, 44.
Pektiinikompleksin proteiinit eivät ilmene A. niqerissä konstitutiivisesti. A. niqer ilmentää edellä mainittuja 20 entsyymejä indusoivissa olosuhteissa käyttäen pektiiniä tai sen hajotustuotteita, kun muut hiilenlähteet, kuten i « ( ' glukoosi tai sakkaroosi, ovat kasvua rajoittavia. Pin- • < · V ' taviljelmissä pektiinientsyymit pyrkivät pysyttelemään ti ·,"·j ulomman soluseinän yhteydessä.
·:· 25 • i ·
Sekä Rexovä-Benkovä ja Marcovic, 29, että Rombouts ja ···
Pilnik, 15, tuovat esiin joitakin polygalakturonaaseja, jotka on saatu Aspergillus niqeristä ja muista sienistä, ittt« samoin kuin bakteereista ja kasveista, jotka entsyymit • · 30 kuvailtiin puhdistettuina. Koska rakennetietoja ei kui- ·, tenkaan annettu, tarvitaan yhä yksittäisiä polygalak- #,)|* turonaaseja, joiden spesifinen aktiivisuus on korkea.
:***: Niiden tulisi edullisesti olla riittävän puhtaita, jotta « · · ^ ; niiden aminohapposekvenssit olisi mahdollista määrittää.
• < I
« · Tämän jälkeen polygalakturonaaseista käytetään myös nimitystä PG.
35 7 105206 Tämän keksinnön kohteina ovat puhdistetut yksittäiset PG:t joko luonnollisista tai transformoiduista isännistä.
5 Tämä keksintö perustuu yksittäisten PG-entsyymien, esim. ϊ 0PGI:n, II:n, IllA:n, IIIB:n IV:n, erityisesti PGI:n tai PGII:n, puhdistamiseen ja rakenteen osittaiseen määrit-z tämiseen, mikä mahdollistaa DNA-koettimien synteesin, jotka koodittavat proteiinin merkityksellisiä osia.
10 Tämän keksinnön yhtenä kohteena on seuloa ja eristää DNA-koettimien avulla DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat PGII:ta tai PGIrtä, mahdollisesti yhdessä niiden pre- ja postsekvenssien kanssa, A. nioerin geenikirjastosta.
15 Kohteena on lisäksi identifioida edelleen PG-geenejä hybridisoimalla osia PGII-geenistä (nimetty koodilla poall) tai PGI-geenistä (koodi pgal) sienikannan, esim.
A. nioerin geenikirjaston kanssa.
20 Kohteina ovat lisäksi rekombinantti-DNA-molekyylit, jotka koodittavat polygalakturonaasigeenin ekspressiokasetteja, jotka käsittävät polygalakturonaasin rakennegeenin, va-... linnaisesti intronisekvenssien kanssa, ja/tai PG-geenin a t « säätelysekvenssejä, esim. promoottori sekvenssejä, sig- • a a Y ] 25 naalisekvenssejä ja/tai transkriptionaalisia lopetussek- • a a *. ” venssejä. Keksinnön mukaisia rekombinantti-DNA- molekyylejä ovat lisäksi esimerkiksi hybridivektorit, ··· :..,Σ jotka sisältävät keksinnön mukaisesta PG-geenistä peräisin olevaa DNA:ta.
v 30
Kohteina ovat lisäksi isännät, erityisesti rihmasienet, * .···. esim. Asperoillus-isännät. transformoituina mainituilla m ♦ ♦ • vektoreilla, menetelmät rekombinantti-DNA-molekyylien ja «aa transformoitujen isäntien valmistamiseksi, ja rekom- a a a ·...· 35 binantti-DNA-molekyylien käyttö uusien ekspressiokaset- : tien tai hybridivektoreiden valmistamiseksi.
a a a a a • * a a a · a 105206 8 Tämän keksinnön kohteena on myös PG-entsyymien liikatuotanto, esimerkiksi Asperaillus-lalissa. ja yksittäisten PG-entsyymien tuotanto, joita muut PG:t eivät kontaminoi, tai niiden ennalta määritettyjen keinotekoisten seosten 5 tuotanto.
Toinen kohde koskee minkä tahansa heterologisen proteiinin tuotantoa, jonka rakennegeeni voidaan ilmentää esillä » olevan rekombinantti-PG-DNA:n ohjauksessa.
10
Keksinnön mukaiset eri kohteet tulevat selvemmiksi seur-aavasta yksityiskohtaisesta keksintöä koskevasta kuvauksesta.
15 Rekombinantti-DNA-molekwlit Tämä keksintö koskee rekombinantti-DNA-molekyyliä, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka on valikoitu ryhmästä, j ohon kuuluvat 20 a) Aspergillus niqerin DNA-insertti pGW1800:sta tai pGW-1900:sta, ... b) DNA-sekvenssi, joka hybridisoituu valmiin PGII:n tai • · « t 1 PGI:n kooditusalueeseen, jonka a)-kohdan DNA-insertti si- • · « '·' 'f 25 sältää, ja joka sisältää rakennegeenin polypeptidille, '· 1: jolla on polygalakturonaasiaktiivisuutta, ja valinnaises- ti sen promoottorin, kooditusalueen signaali- tai oh- • · · :...ί jauspeptidille ja/tai transkriptionaalisen terminaat- :T: torin, 30 c) kohdassa a) tai b) määritellyn DNA-sekvenssin johdan- .·;·. nainen, tai 1 • · · d) DNA-sekvenssi, joka koodittaa valmista PG:tä tai sen
Ml ’...· 35 signaalipeptidiä tai ohjauspeptidiä, ja joka on degene- f roitunut geneettisen koodin merkityksen osalta a)-kohdan, • · b)-kohdan tai c)-kohdan DNA-sekvenssin suhteen.
« · • · · 105206 9
Keksintö koskee erityisemmin rekombinantti-DNA-molekyy-liä, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka on valikoitu ryhmästä, johon kuuluvat 5 ; a) Aspergillus niaerin DNA-insertti pGW1800:sta, » b) DNA-sekvenssi, joka hybridisoituu valmiin PGII:n koo- ditusalueeseen, jonka a)-kohdan DNA-insertti sisältää, ja 10 joka sisältää rakennegeenin polypeptidille, jolla on polygalakturonaasiaktiivisuutta, ja valinnaisesti sen promoottorin, kooditusalueen signaali- tai ohjauspep-tidille ja/tai transkriptionaalisen terminaattorin, 15 c) kohdassa a) tai b) määritellyn DNA-sekvenssin johdannainen, tai d) DNA-sekvenssi, joka koodittaa valmista PG:tä tai sen signaalipeptidiä tai ohjauspeptidiä, ja joka on degene-20 roitunut geneettisen koodin merkityksen osalta a)-kohdan, b)-kohdan tai c)-kohdan DNA-sekvenssin suhteen, tai rekombinantti-DNA-molekyyliä, joka sisältää DNA-sek- • · i λ. venssin, joka on valikoitu ryhmästä, johon kuuluvat 25 • · · ’· / a) Aspergillus nigerin DNA-insertti pGWl900:sta, ··· • · · · ··· *...· b) DNA-sekvenssi, joka hybridisoituu valmiin PGI:n koodi- • · · ·.· : tusalueeseen, jonka a)-kohdan DNA-insertti sisältää, ja 30 joka sisältää rakennegeenin polypeptidille, jolla on ·:··· polygalakturonaasiaktiivisuutta, ja valinnaisesti sen * promoottorin, kooditusalueen signaali- tai ohjauspep- ·, tidille ja/tai transkriptionaalisen terminaattorin, « · · 1 · · • · ·...' 35 c) kohdassa a) tai b) määritellyn DNA-sekvenssin johdan- nainen, tai • · · • · • · 105206 10 d) DNA-sekvenssi, joka koodittaa valmista PG;tä tai sen signaalipeptidiä tai ohjauspeptidiä, ja joka on degeneroitunut geneettisen koodin merkityksen osalta a)-kohdan, b)-kohdan tai c)-kohdan DNA-sekvenssin suhteen.
5
Plasmidit pGW1800 ja pGW1900 sijaitsevat E. qoli -kan- , noissa JM109/pGWl800 ja vastaavasti DH5aF'/pGW1900, jotka on talletettu Deutsche Sammlung fUr Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM)'iin.
10
Polypeptidejä, joilla on polygalakturonaasiaktiivisuutta, nimitetään myös tässä yhteydessä polygalakturonaaseiksi (PG:t). Tämä ilmaus pitää sisällään myös luonnollisina esiintyvien polygalakturonaasien fragmentit tai mutantit, 15 joissa entsyymiaktiivisuutta on jäljellä. Ilmaukset poly-galakturonaasi tai PG, joita tässä on käytetty, sisältävät myös muita galakturonaaseja, joilla on substraattina oligo- tai polysakkaridi, joka käsittää galakturonaatin, esim. oligogalakturonaasin, joka pilkkoo oligogalak-20 turonaatin tai ramnogalakturonaasin, joka pilkkoo ram-noosin ja galakturonaatin muodostaman kopolymeerin, tai niiden osia tai mutantteja, joissa entsyymiaktiivisuutta on jäljellä. "Ohjauspeptidin" on tarkoitus olla prepro- *;' * PG:n sekvenssi, joka leikataan pois valmiin PG:n muodos- • « · * 25 tuksen aikana. "Signaalipeptidi" leikataan pois en- ·.*·: simmäisessä vaiheessa "signaalipeptidaasin" vaikutuksesta endoplasmaverkostossa.
··· • · • « » · · :*·*: Tämän keksinnön mukainen rekombinantti-DNA-molekyyli 30 sisältää esimerkiksi Aspergillus niqerin DNA-insertin pGW1800:sta tai pGW1900:sta.
• · ... * • · · pGW1800:n sisältämä 4,1 kiloemästä (ke) pitkä A. niqer ..li' N400 -insertti (kuvio 2) ulottuu Xbal-restriktiokohdasta « « · 35 (karttapaikka 1) EcoRI-restriktiokohtaan (karttapaikka ,·* : 4100). Tämä insertti sisältää PGII-geeni pqall:n promoot- • ·« torin ja transkriptionaalisen terminaattorialueen, samoin
• V
« · · 105206 11 kuin kooditusalueen prepro-PGII:lie, mukaanlukien intro-nit. A. niaerin inserttifragmentin DNA-sekvenssi, joka sisältää pga.II:n alkaen Xbal-kohdasta likimääräisessä karttapaikassa 1, ja päättyen PvuII-kohdassa likimääräi-5 sessä karttapaikassa 3050, esitettynä kuviossa 2, määri-. tettiin ja kuvataan sekvenssiluetteloinnissa kohdassa
Sequence Identification Number (SEQ ID NO.) 2 (sekvenssin v identifiointilista n:o 2).
10 paali:n promoottorialue ulottuu tämän DNA-sekvenssin paikkaan 1357 asti sekvenssin identifiointilistan 2 (SEQ ID NO.) 2 mukaan. prepro-PGII:n ohjauspeptidin kooditus-alue ulottuu paikasta 1357 paikkaan 1437. Signaalipep-tidiä koodittavat nukleotidit 1357 - 1419. Valmiin PGII:n 15 kooditusalue ulottuu paikasta 1438 paikkaan 2494. Sitä seuraa transkriptionaalinen terminaattorialue, joka alkaa paikasta 2499.
pGW1900:n sisältämä 8,6 kiloemäsparia (kep) pitkä A.
20 niqer N400 -insertti (kuvio 3) ulottuu BamHI-kohdasta karttapaikassa 1 BamHI-kohtaan likimääräisessä karttapaikassa 8600, mikä on osoitettu kuviossa 3. DNA-sekvenssi, joka ulottuu karttapaikasta noin 6280 paikkaan noin 3880 * I i
asti, annetaan sekvenssiluetteloinnissa kohdassa SEQ ID
• < » V : 25 NO. 1.
I i I f I · #>*·* 8,6 kep:a sisältävän insertin promoottorialue ulottuu DNA-sekvenssin paikkaan 910 SEQ ID NO. l:n mukaan, prep- • · · f"; ro-PGI:n 31 aminohappoa pitkän ohjauspeptidin kooditusa- 30 lue ulottuu paikasta 910 paikkaan 1002. Signaalipeptidiä koodittavat nukleotidit 910-963. Valmiin PGI:n kooditus- • · ' t...# alue alkaa paikasta 1003 ja ulottuu paikkaan 2127. Trans- • · · *. kriptionaalinen terminaattorialue alkaa paikasta 2131.
• · · f· « f 35 PGI:tä tai PGII:ta koodittavat DNA-sekvenssit, jotka on .·[ ; saatu pGW1900:n tai pGW1800:n A. niqer N400 -inserteistä, m · · I./ hybridisoituvat "homologisissa" olosuhteissa PGI-geenin • · 105206 12 tai vastaavasti PGII-geenin tai niiden osan kooditus-alueen kanssa, joka on peräisin A. niqer N400:sta. DNA-sekvenssit, jotka ovat ainakin osittain homologisia A. niaer N400:n PGI:n tai PGII:n kooditusalueen suhteen, ja 5 koodittavat proteiinia, joissa on PG-aktiivisuutta, ovat jäseniä PG-geeniperheessä. DNA-sekvenssit, jotka ovat , vain osittain homologisia, hybridisoituvat A. niqer N400-:n PGI- tai PGII-peräisten sekvenssien kanssa niin sano- , tuissa "heterologisissa" olosuhteissa, jotka ovat vähem-10 män kovia kuin "homologiset" olosuhteet. PG-geeniperheen jäsen, joka hybridisoituu vain "heterologisissa" olosuhteissa, voi olla A. niqer N400:n toinen PG-geeni kuin PGI- tai PGII-geeni, tai PGI-, PGII- tai eri PG-geeni PG:tä tuottavasta sienikannasta, joka on muu kuin A.
15 niqer N400. Sellainen sienikanta voi olla peräisin esimerkiksi ryhmästä Aspergillus spec.. esim. t±. iaponicus.
A. oryzae. A. nidulans. tai muu A. niqer -kanta kuin N400, Trichoderma spec.. Botrvtis spec.. Sclerotinia spec.. Fusarium spec, tai muu fytopatogeeninen sieni, 20 samoin kuin hiivasta, esimerkiksi PG:tä tuottavasta hiivasta Kluweromvces spec, kuten K. fraqilis. Edullinen esimerkki sellaisesta kannasta on A. niqer NW756. Keksinnön mukainen PG-geeniperhe käsittää siten geenit, ' jotka koodittavat PGI:tä, PGII:ta, PGIIIA:ta, PGIIIB:tä, • · · V ‘ 25 PGIV:ää ja muita PG-entsyymejä, jotka ovat edullisesti • · ·.'·· peräisin Aspergillus spec. 'stä. edullisemmin A. niqeri- ..*·* stä, edullisimmin kannasta N400 tai NW756, mutta myös muista PG:tä tuottavista sienikannoista. PG-geeniperheen • · · ·*·*: jäseniä nimitetään "PG-geeneiksi" .
30 x PG-geeniperheen jäsenten proteiinituotteet käsittävät • · entsyymejä ( "galakturonaaseja" ), jotka voivat pilkkoa • t · oligo- tai polysakkarideja, jotka sisältävät galak-turonaattia, esim. oligogalakturonaasin, ramnogalak-35 turonaasin tai erityisesti polygalakturonaasin.
• v • ♦ · • · · !..* Benton ja Davis, 7, kuvailevat tavanomaista hybridissä- • t 105206 13 tiomenetelmää. Homologiset ja heterologiset hybridisaa-tio-olosuhteet määritellään jäljempänä täsmällisemmin.
Ilmaus "johdannainen", käytettynä keksinnön mukaisten 5 uusien DNA-sekvenssien yhteydessä, on tarkoitettu sisältämään suuremmat johdannaiset, jotka sisältävät viereisiä sekvenssejä, mainittujen DNA-sekvenssien osia ja mutant-% teja, erityisesti keinotekoisia mutantteja.
10 Uusien DNA-sekvenssien suuremmat johdannaiset ovat sellaisia, jotka ovat leikattavissa A. nigerin genomista ja sisältävät DNA-sekvenssejä, jotka hybridisoituvat valmiin PGII:n tai PGI:n kooditusalueeseen, jonka pGW18800:n tai pGW1900:n sisältämä Aspergillus nigerin DNA-insertti 15 sisältää, jotka koodittavat polypeptidiä, jossa on poly-galakturonaasiaktiivisuutta, ja jotka voivat sisältää saman tai eri promoottorisekvenssin, signaalisekvenssin ja/tai transkriptionaalisen terminaattorisekvenssin kuin pGW1800:n tai pGW1900:n sisältämä Aspergillus nigerin 20 DNA-insertti. Sellaisia johdannaisia voidaan saada A.
niger N400:n tai NW756:n genomisesta kirjastosta, joka on saatu nukleiinihappojen fragmentoinnin avulla, käsittele-... mällä fragmentteja sopivalla restriktioentsyymillä, esim.
· I
';!/ EcoRI:llä. BamHI: llä tai HindIII:lla. liittämällä sopi- • · « ' 25 vaan vektoriin, esim. lambda-faagiin tai plasmidiin pBR- • « 322, kloonaamalla esim. E. coliin ja leikkaamalla jälleen * sopivan restriktioentsyymin avulla.
··♦ • · • ♦ ··«
Edullinen esimerkki DNA-sekvenssijohdannaisesta, joka 30 hybridisoituu A. niger N400:n PGI- tai PGII-geenin koodi-tusalueen kanssa "heterologisissa" olosuhteissa, on vek- • · ' torin insertti tai sen osa, joka on valikoitu vek- • · · toriryhmästä, johon kuuluvat lambda-PG-A9, -AIO, -A43, - « ..'.V B4, -B35, -B36, 35 -Cl, -C16, -C20, -C37, -D8, -Dll, -D12, -E6, -E38, -F5, : -G17, -G27, -X31 ja -Y33, pGW1756 ja pGW1910. Jälkimmäi nen sisältää A. niger N400:n PGC:tä koodittavan raken- m · — — ·* • · 105206 14 negeenin pqaC. joka on peräisin lambda-PG-C20:stä. pGW-1756 (kuvio 6) sisältää A. niaer NW756:sta peräisin olevan PGII-geenin, jonka restriktioasetelma ja DNA-sek-venssi (SEQ ID NO. 3) ovat erilaiset kuin A. niaer N400:n 5 PGII-geenillä. Kannat NW756 ja NW400 eivät sen vuoksi liity läheisesti toisiinsa ja saattaisivat kuulua eri * rihmasienilajeihin. A. niaer N400:n PGI- tai PGII-raken-negeeni voi siis spesifisesti hybridisoitua heterologi- m sissa olosuhteissa myös muiden lajien PG-geenien kanssa.
10
Plasmidi pGW1756 koostuu noin 4000 emäsparia (ep) pitkästä vektorifragmentista ja noin 5500 ep pitkästä A. niaer NW756:n DNA-fragmentista. PGII:ta koodittava geeni pgall sijaitsee noin 3300 ep pitkän HincII-restriktiofraomentin 15 sisällä. pGW1756 on talletettuna DSM:ssä.
A. niaer NW756:n pgall:n promoottorialue ulottuu nukleotidiin 889 SEQ ID NO. 3:n DNA-sekvenssissä, joka on annettu sekvenssiluetteloinnissa. prepro-PGII:n oh-20 jauspeptidin kooditusalue ulottuu ilmeisesti paikasta 890 paikkaan 970, kun taas signaalipeptidiä koodattavat nukleotidit 890-952. Valmiin proteiinin kooditusalue alkaa nukleotidillä 971, päättyy lopetuskodoniin paikassa 2028 ' * * V ja sisältää luultavasti yhden intronin. Kooditusaluetta • i · ! : 25 seuraa transkriptionaalinen terminaattorialue, joka alkaa paikasta 2031.
• · · * ·· f .1·. Plasmidi pGW1910 (kuvio 7) koostuu suunnilleen 7800 ep pitkästä insertistä, joka on peräisin lambda-PG-C20: stä, • · 30 ja vektori pUC9:stä. Polygalakturonaasigeeni pqaC sijait- * , see A. niaer N400 -insertin sisällä. Lähes koko pqaC- I,/ geenin DNA-sekvenssi annetaan sekvenssiluetteloinnissa :·| : kohdassa SEQ ID NO. 4.
« • f
IKI
35 A. niaer N400:n pqaC:n promoottori ulottuu nukleotidiin « · · .* . 663. pqaC:n koodittaman prepro-PG:n ohjauspeptidi ulottuu • · · 1 luultavasti nukleotidistä 663 nukleotidiin 782 ja sisäl • » · ^ * · • · 15 105206 tää DNA-sekvenssin paikasta 663 paikkaan 710, joka koo-dittaa signaalipeptidiä. Valmista PG:tä koodittaa sekvenssi, joka ulottuu nukleotidistä 783 nukleotidiin 1995, ja se sisältää useita introneja. Transkriptionaalinen 5 terminaattorialue alkaa lopetuskodonin jälkeen paikassa 1999.
- Tämän keksinnön sisältämät hybridisoituvien DNA-sek- venssien johdannaiset sisältävät saman promoottorisek-10 venssin, signaalisekvenssin ja/tai transkriptionaalisen terminaattorisekvenssin kuin pGW1800:ssa tai pGW1900:ssa, tai toisen promoottorisekvenssin, signaalisekvenssin ja/tai transkriptionaalisen terminaattorisekvenssin, jotka voivat olla peräisin polygalakturonaasigeeniperheen 15 toisesta geenistä. Hybridisoituviin DNA-sekvensseihin voidaan lisäksi liittää jokin muu promoottorisekvenssi, signaalisekvenssi ja/tai transkriptionaalinen terminaat-torisekvenssi, riippuen isännästä, jossa haluttu PG on tarkoitus ilmentää.
20
Useita eri promoottoreja, signaalisekvenssejä ja trans-kriptionaalisia terminaattoreita voidaan käyttää. Pro-t t>-1 moottoreja on tavallisesti saatavissa prokaryoottisten
« I I
geenien, eukaryoottisten geenien tai virusgeenien koodit-
• Il I I I
; , 25 tamattomilta 5’-alueilta, kun taas transkriptionaalisia • « « '· *· terminaattoreita on saatavissa koodittamattomilta 3'- ··· •••ί alueilta. Signaalisekvenssejä voidaan saada preproteiini- «·· en koodittavalta 5'-alueelta, jotka siirretään solun • · · V * eritysreitille. Esimerkkejä promoottoreista esitetään 30 jäljempänä.
• · " .·;*· Tämän keksinnön yhteydessä oleva signaalisekvenssi on ·, DNA-sekvenssi, joka koodittaa keksinnön mukaisen prepro- • · · ·"! PG:n signaalipeptidiä tai ohjauspeptidiä.
35
Viereiset sekvenssit, keksinnön tarkoittamassa merkityk- ψ · sessä, ovat myös DNA-fragmentteja, jotka eivät ole peräi- • *· 105206 16 sin sekvensseistä, jotka reunustavat genomissa olevaa PG-geeniä. Sellaisilla viereisillä sekvensseillä on esimerkiksi säätelytoimintoja, esimerkiksi promoottoritoiminto, tai ne koodattavat polypeptidiä, esim. rakennegeeni, tai 5 ne ovat kytkijöitä, jotka liittävät säätelysekvenssit ja rakennegeenin oikeassa lukukehyksessä tai oikealla etäi- » syydellä, tai sekvenssejä, jotka ovat peräisin vektorista, esim. faagista tai plasmidista, joita käytetään eks-pressioplasmidin konstruoinnissa. Sellaiset vierussek-10 venssit voivat saada aikaan ekspressiokasetteja tai fuu-siogeenejä.
Ilmaus "fragmentti", käytettynä uuden DNA:n yhteydessä, on tarkoitettu sisältämään myös suurempien johdannaisten 15 fragmentteja, erityisesti niitä, joissa on jäljellä promoottori-, signaali-, rakennetoimintoja tai transkrip-tionaalisia terminaattoritoimintoja. Ne voivat sijaita kahden restriktiokohdan välissä.
20 Edullisia DNA-fragmentteja ovat sellaiset, jotka sisältävät promoottorialueen, koodittavat prepro-PG:n ohjaus-tai signaalipeptidiä, tai koodittavat polypeptidiä, jossa on polygalakturonaasiaktiivisuutta, tai sisältävät trans-kriptionaalisen terminaattorialueen. Keksinnön mukainen
• · I
25 DNA-sekvenssi on siis myös sellainen, joka sisältää jon- • · « ! . kin yhdistelmän mainituista fragmenteista, esim. niistä, • · · * .* jotka sisältävät promoottori- ja/tai kooditusalueen oh- ··· jaus- tai signaalipeptidille ja/tai PG:lle ja/tai trans- m · ’···* kriptionaalisen terminaattorin ja vastaavia alueita.
• · ·
• · · I
·.· · 30
Fragmentti, joka sisältää PG:n promoottorialueen, ulottuu ·:·*: DNA-sekvenssissä prepro-PG:n rakennegeeni in noin paikkaan :*·*: 2000 saakka, edullisesti noin 500 - 1400 nukleotidiin saakka geenin yläpuolella. Promoottorialue sitoo RNA- ·::: 35 polymeraasin samoin kuin säätelyproteiineja.
• · • · • · ·
Fragmentti, joka sisältää PGI-geenin, pqal:n, promoot- • I · • · • « • I # 17 105206 torialueen, ulottuu esimerkiksi paikasta 1 paikkaan 909 SEQ ID NO. l:n mukaisessa sekvenssissä. Fragmentti, joka sisältää A. niaer N400:n PGII-geenin, pqall:n. promoottorialueen, ulottuu esimerkiksi paikasta 1 paikkaan 1356 5 SEQ ID NO. 2.:n mukaisessa sekvenssissä. pGW1756:n sisältämässä A. niaer NW756 -insertissä oleva fragmentti, joka sisältää pqall:n promoottorialueen, ulottuu esimerkiksi ' paikasta 1 paikkaan 889 SEQ. ID NO. 3.:n mukaisessa sek venssissä. pGW1910:n sisältämässä &. niaer -insertissä 10 oleva fragmentti, joka sisältää pqaC:n promoottorialueen, ulottuu paikasta 1 paikkaan 662 SEQ ID NO. 4.:n mukaisessa sekvenssissä.
Fragmentti, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka koodittaa 15 prepro-PG:n ohjauspeptidiä, ulottuu esimerkiksi promoottorin loppuosan ja valmista proteiinia koodittavan sekvenssin alkuosan väliin. Signaalipeptidin kooditusalue on lyhyempi kuin vastaavalla ohjauspeptidillä. Se alkaa myös promoottorin lopusta ja ulottuu kooditusalueelle sig-20 naalipeptidaasin katkaisukohtaan. A. niaer N400:n prepro-FGII:ssa ohjauspeptidi käsittää 27 aminohappoa. DNA-frag-mentti, joka koodittaa ohjauspeptidiä, ulottuu esimerkiksi ATG-kodonista paikassa 1357 XhoI-katkaisukohtaan pai-kassa 1429 SEQ ID NO. 2.:n mukaisessa DNA-sekvenssissä.
Ill 25 prepro-PGI: ssä ohjauspeptidi käsittää 31 aminohappoa.
• i < I . Tätä ohjauspeptidiä koodittava DNA-fragmentti esimerkiksi * ,* sijoittuu paikkojen 910 ja 1002 väliin SEQ ID NO. l.:n • · · •"j mukaisessa DNA-sekvenssissä. A. niaer NW756:n prepro- • « '··* PGII:n ohjauspeptidi käsittää luultavasti 27 aminohappoa, i ·;·β
*30 ja näin ollen DNA-fragmentti, joka koodittaa ohjauspeptidiä, on 81 ep:a pitkä DNA-fragmentti, joka asettuu paikkojen 889 ja 971 väliin SEQ ID NO. 3.:n mukaisessa DNA-sekvenssissä. DNA-fragmentti, joka koodittaa A. niaer N400:n pqaC-tuotteen luultavasti 40 aminohappoista oh-35 jauspeptidiä, ulottuu emäspaikasta 663 paikkaan 782 SEQ
9 9 '··* ID NO. 4.:n mukaisessa sekvenssissä.
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 105206 18
Kooditusalueet vastaaville signaalipeptideille sijaitsevat esimerkiksi seuraavissa DNA-fragmenteissa: emäspai-kat 911-963 SEQ ID NO. l.:ssä, 1358-1419 SEQ ID NO. 2.:-ssa, 890-952 SEQ. ID. NO. 3.:ssa ja 663-710 SEQ ID NO.
5 4.:ssä.
«
Fragmentti, joka sisältää valmiin PGI:n koko kooditusalu-een, ulottuu esimerkiksi paikasta 1003 paikkaan 2127 SEQ ID NO. l.:n mukaisessa sekvenssissä. Fragmentti, joka si-10 sältää A. niqer N400:n valmiin PGII:n koko kooditusalu-een, ulottuu esimerkiksi paikasta 1430 paikkaan 2497 SEQ ID NO. 2.:n mukaisessa sekvenssissä. Valmista A. niqer NW756:n PGII:ta koodittaa esimerkiksi DNA-fragmentti, joka ulottuu paikasta 953 paikkaan 2027 SEQ ID NO. 3.:n 15 mukaisessa sekvenssissä, ja valmista pgaC-geenituotetta koodittaa esimerkiksi DNA-fragmentti, joka sijaitsee emästen n:o 782 ja 1996 välissä SEQ ID NO. 4.:n mukaisessa sekvenssissä. Myös lyhyemmät fragmentit voivat kuitenkin koodittaa polypeptidejä, joissa on jäljellä PG-ak-20 tiivisuutta.
PGII:n tai PGI:n, samoin kuin muiden PG:iden raken-negeenit voivat sisältää introneja monen sienigeenin .’j': tavoin. Tämän keksinnön piiriin on sisällytetty myös 25 kuitenkin PG-entsyymien intronivapaita rakennegeenejä, • I « /•# . esim, sellaisia, jotka eivät sisällä introneja genomises- • · · sa DNA-sekvenssissä tai myös sellaisia, joita voidaan • · · *·;; saada cDNA: sta.
• « • « • · t
• · · T
V ’ 30 Fragmentti, joka sisältää transkriptionaalisen terminaat- torialueen, ulottuu esimerkiksi lopetuskodonista, esim.
• _ TAA:sta, TAG:stä tai TGAtsta, PG:n kooditusalueen lopus- sa, noin 300-2000, edullisesti noin 500-1000 emäspariin saakka geenin alapuoliseen suuntaan.
35
Mf ^ • · ’·" Sellainen fragmentti ulottuu esimerkiksi emäspaikasta !/·· 2131 paikkaan 2495 SEQ ID NO. l.:n mukaisessa sek- • · • · » · · 105206 19 venssissä, paikasta 2498 paikkaan 3031 SEQ ID NO. 2.:n mukaisessa sekvenssissä, paikasta 2031 paikkaan 3047 SEQ ID NO. 3.:n mukaisessa sekvenssissä, ja paikasta 1999 paikkaan 2304 SEQ ID NO. 4.:n mukaisessa sekvenssissä.
5
Edellä mainittuja fragmentteja voidaan kuitenkin laajen-' taa luonnollisilla 5'-pään vierussekvensseillä, tai niitä voidaan lyhentää 5'- tai 3'-päistä ja ne voivat siitä 10 huolimatta säilyttää promoottoriaktiivisuuden ja trans-kriptionaalisen terminaattoriaktiivisuuden, tai koodite-tut polypeptidit voivat säilyttää signaalipeptidi- tai galakturonaasiaktiivisuuden. Sellaiset fragmentit sisällytetään myös keksinnön piiriin.
15
Edellä olevat fragmentit voivat sisältää tai niiden vieressä voi olla kytkijöitä (linkkereitä), jotka huolehtivat onnistuneesta kytkennästä muihin DNA-molekyyleihin, ja/tai asettavat DNA-fragmentit, joilla on säätelytoimin-20 toja tai jotka koodattavat polypeptidiä, esim. promoottorin ja rakennegeenin, oikeaan lukukehykseen tai oikealle etäisyydelle toisistaan.
Edellä oleviin fragmentteihin sopivat kytkijät sisältävät 25 DNA-sekvenssin, joka sopii sen DNA:n restriktiokohtaan, . johon fragmentti on tarkoitus kytkeä. Ne voivat sisältää ’ ennalta määritetyn restriktiokohdan.
• · · • f·· • · · • · *·«·* Keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin mutantit ovat esim.
* ··· ·.· · 30 luonnollisina esiintyviä mutantteja. Keksintö pitää si sällään myös signaali- tai ohjauspeptidien kooditusaluei-*:**: den luonnollisia tai synteettisiä mutantteja, joilla on samankaltainen tai identtinen hydrofobisuusprofiili, esim. joissa kodonit polaarisille aminohapoille his-”” 35 tidiinille (He*), tyrosiinille (Y**1 ja arginiinille (Re<) '·'·* vaihdetaan toisten aminohappojen kodoneihin, joilla on samanlaiset varaukset, ja hydrofobiset aminohapot alanii- • * · • « « · • * · 105206 20 ni (A), leusiini (L) ja treoniini (T) korvataan muiden hydrofobisten aminohappojen kodoneilla. Positiivisesti varautuneen lysiinin kodoni voidaan esimerkiksi korvata arginiinin kodonilla ja päinvastoin, negatiivisesti va-5 rautuneen tyrosiinin kodoni glutamaatin tai aspartaatin kodonilla ja/tai polaarittoman, hydrofobisen alaniinin kodoni jollakin kodonilla aminohapoille treoniini, pro-liini, väliini, isoleusiini, leusiini, metioniini tai .
fenyylialaniini, ja vastaaville.
10
Keksinnön mukainen rekombinantti-DNA-molekyyli sisältää myös DNA-sekvenssejä, jotka ovat degeneroituneita geneettisen koodin merkityksen suhteen siten, että rajaton määrä nukleotidejä korvataan toisilla nukleotideillä 15 muuttamatta aminohapposekvenssiä, jota ne koodittavat.
Sellaiset degeneroituneet DNA-sekvenssit voivat olla käyttökelpoisia niiden erilaisten restriktiokohtien vuoksi, tai johtuen edullisesta kodonikäytöstä tietyssä isännässä.
20 Tämän keksinnön mukainen rekombinantti-DNA-molekyyli sisältää edullisesti Aspergillus niaerin DNA-insertin hybridivektorista, joka on valikoitu hybridivek-toriryhmästä, johon kuuluvat pGWl800, pGW1900, pGW1756, 25 pGWl910, lambda-PG-A9, lambda-PG-A10, lambda-PG-A43, «Il . lambda-PG-B4, lambda-PG-B35, lambda-PG-B36, lambda-PG-Cl, * lambda-PG-C16, lambda-PG-C20, lambda-PG-C37, lambda-PG-• « · ···· D8, lambda-PG-D11, lambda-PG-D12, lambda-PG-E6, lambda- PG-E38, lambda-PG-F5, lambda-PG-G17, lambda-PG-G27, lamb- • ·· V ’ 30 da-PG-X31 ja lambda-PG-Y33, tai sen osan, joka sisältää PG-geenin promoottorialueen tai kooditusalueen sig-naalipeptidille, ohjauspeptidille, prepro-PG:lie, PG:lle tai PG:n fragmentille, jossa on polygalakturonaasiak-tiivisuutta, tai PG-geenin transkriptionaalisen ter-35 minaattorialueen. Tämä keksintö kattaa myös itse inser- *·”’ tit.
• · • « • «· • · » · • · 105206 21
Keksintö koskee myös rekombinantti-DNA-molekyylejä, jotka ovat ekspressiokasetteja, jotka sisältävät keksinnön mukaisen promoottorialueen, DNA-fragmentin, joka koodit-taa ohjaus- tai signaalipeptidiä, rakennegeenin ja/tai 5 transkriptionaalisen terminaattorialueen, edullisesti sellaisia, jotka ovat peräisin vektorista, joka on valikoitu edellä mainitusta vektoriryhmästä.
Ilmaus "ekspressiokasetti" tarkoittaa DNA-sekvenssiä, 10 joka kykenee ilmentämään polypeptidin, ja joka sisältää promoottorin, haluttaessa signaalisekvenssin, edelleen rakennegeenin, haluttaessa, transkriptionaalisen ter-minaattorin ja valinnaisesti transkriptionaalisen tehosta jaelementin, ribosomin sitoutumiskohdan ja/tai lisäsää-15 telysekvenssejä.
Keksinnön mukaisessa ekspressiokasetissa PG-geeniperäiset toiminnalliset fragmentit voidaan yhdistää toiminnallisiin fragmentteihin, jotka ovat peräisin muista gee-20 neistä.
Useita erilaisia promoottorisekvenssejä voidaan käyttää, riippuen isäntäsolun luonteesta. Promoottorit, jotka ovat vahvoja ja samanaikaisesti hyvin säädeltyjä, ovat käyttö-25 kelpoisimpia. Luennan aloitussekvenssejä ovat esimerkiksi • « · . Shine-Dalgarno-sekvenssit. Sekvenssejä, jotka ovat vält- • · · ' .* tämättömiä kopioinnin aloitukselle ja lopetukselle ja ··» mRNA:n stabiloimiseksi, on tavallisesti saatavissa virus- • · *···* ten tai eukaryoottien cDNA:n 5'-alueista ja vastaavasti *.· * 30 3’-alueista, esim. ekspressioisännästä.
"**l Esimerkkejä promoottoreista ovat lambda-PL, lambda-PR, E.
colin lac, trp, tae, hiivan TRP-1, ADHI-, ADHII-, PH03-, 9 PH05- tai glykolyyttiset promoottorit kuten enolaasi-, *”I 35 glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi-, 3-fosfoglyse- • · **” raattikinaasi (PGK)-, heksokinaasi-, palorypälehappode- :/·; karboksylaasi-, fosfofruktokinaasi-, glukoosi-6-fosfaat- • »· • · 105206 22 ti-isomeraasi-, 3-fosfoglyseraattimutaasi-, palorypäle-happokinaasi-, trioosifosfaatti-isomeraasi-, fos-foglukoosi-isomeraasi- ja glukokinaasigeenien promoottorit, tai promoottorit, jotka ovat peräisin eukaryoot-5 tisista viruksista, esim. SV40:stä, Rous'in sarkoomavi-ruksesta, adenovirus 2:sta, naudan papilloomaviruksesta, papovaviruksesta, sytomegaloviruksesta peräisin olevat promoottorit tai nisäkässoluista peräisin olevat promoot- 1 torit, esim. aktiini-, kollageeni-, myosiini- tai β-glo-10 biinigeenien promoottorit. Eukaryoottiset promoottorit voidaan yhdistää tehostavien sekvenssien kanssa ("en-hansserielementit") kuten hiivan yläpuolisten aktivoivien sekvenssien (UAS) tai virusten tai solujen tehosta jaelementtien kuten sytomegaloviruksen IE-tehostajien, 15 SV40-tehostajan, immunoglobuliinigeenin tehostajan tai muiden kanssa.
Tehostajaelementit ovat kopiointia stimuloivia DNA-sek-venssejä, esim. viruksista peräisin olevia, kuten Simian-20 viruksesta (ihmisapinan-), polyoomaviruksesta, naudan papilloomaviruksesta tai Moloney'n sarkoomaviruksesta, tai genomista alkuperää. Tehostajasekvenssi voi olla peräisin myös Physarum polvcephalumin (PCT/EP 8500278) ekstrakromosomaalisesta ribosomaalisesta DNArsta, tai se i · » ... 25 voi olla geenin yläpuolinen aktivaatiokohta happamen I I l j fosfataasin PH05-geenistä (EP-patenttihakemus n:o 86 111 ** 820.6), tai PH05, trp, PH05-GAPDH-hybridi (EP-patenttihake- ·· · •”j mus n:o 86 111 820.6), tai vastaava promoottori.
• · • · • · · • ·« ·.· ’ 30 Signaalisekvenssejä voivat olla esimerkiksi esisekvenssi tai erityksen ohjaussekvenssi, jotka ohjaavat polypep-*:·” tidin erittymistä, tai vastaavat sekvenssit. Signaaliseksi1: venssi on esimerkiksi prepro-PGI:n, preproPGIIrn tai prepro-PGC:n signaali- tai ohjauspeptidi. Muut sig-35 naalisekvenssit tunnetaan kirjallisuudesta, esim. ne, • · *·;1 jotka von Hejne, G. on koonnut, Nucleic Acids Res. 14, 4683, (1986).
• · > a • · • · I >« 105206 23
Rakennegeenejä ovat tässä yhteydessä, paitsi ne, jotka koodattavat PGI:tä tai PGIIrta, myös ne, jotka koodit-tavat muita PG:itä tai niiden johdannaisia, erityisesti 5 fragmentteja, joissa on PG-aktiivisuutta, tai muut Asper-gillus-geenit ja rakennegeenit, jotka ovat lähtöisin viruksista, prokaryoottisista soluista tai eukaryottisis-« ta soluista, ja jotka voivat olla peräisin genomisesta DNA:sta tai cDNA:sta, joka on valmistettu mRNA-reitin 10 kautta tai voidaan syntetisoida kemiallisesti, jotka koodittavat monenlaisia käyttökelpoisia polypeptidejä, mukaanlukien glykosyloidut polypeptidit, jotka erityisesti ovat alkuperältään korkeampia eukaryoottisia, erityisesti nisäkäsperäisiä, kuten eläin- tai erityisesti ih-15 misperäisiä, kuten entsyymit, joita voidaan käyttää esimerkiksi ravinteiden tuottamiseen ja entsymaattisten reaktioiden suorittamiseen kemian alalla, tai polypeptidit, jotka ovat käyttökelpoisia ja arvokkaita ihmisten ja eläinten sairauksien hoitamisessa tai niiden ehkäise-20 misessä, esimerkiksi hormonit, polypeptidit, joilla on immunomodulatorisia, viruksia vastustavia ja tuumoria vastustavia ominaisuuksia, vasta-aineet, virusantigeenit, rokotteet, hyytymistekijät, elintarvikkeet ja vastaavat.
25 Esimerkkejä sellaisista rakennegeeneistä ovat esimerkiksi . sellaiset, jotka koodittavat hormoneja kuten sekretiiniä, • ·· ’ tymosiinia, relaksiinia, kalsitoniinia, luteinisoivaa • · · ”j hormonia, lisäkilpirauhasen hormonia, adrenokor- • · '···' tikotropiinia, melanosyyttiä stimuloivaa hormonia, β- ψ · * · V * 30 lipotropiinia, urogastronia tai insuliinia, kas vutekijöitä kuten epidermaalista kasvutekijää, insuliinin *:*" kaltaista kasvutekijää (IGF), esim. IGF-I:tä ja IGF-II:- ta, syöttösolun kasvutekijää, hermon kasvutekijää, lierin motukikudosperäisen hermosolun kasvutekijää tai transfor- 35 moivaa kasvutekijää (TGF) kuten TGF-p:aa, kasvuhormoneja • · *·;·' kuten ihmisen tai naudan kasvuhormoneja, interleukiinia : kuten interleukiini-l:tä tai -2:ta, ihmisen makrofagin • I · • « • · • « · 105206 24 vaeltamista inhiboivaa tekijää (MIF) interferoneja kuten ihmisen α-interferonia, esimerkiksi interferoni-aA:ta, -<zB:tä, -aD:tä tai -aF:ää, β-interferonia, x-interferonia tai interferonihybridiä, esimerkiksi aA-aD- tai aB-aD-5 interferonihybridiä, erityisesti interferonihybridiä BDBB, proteinaasin inhibiittoreita kuten dj-antitryp-siiniä, SLPI:tä ja vastaavia, hepatiitti-virusantigeenejä kuten hepatiitti B -viruksen pinta- tai ydinantigeeniä * tai hepatiitti A -viruksen antigeeniä, tai hepatiitti 10 eiA-eiB -antigeeniä, plasminogeenin aktivaattoreita kuten kudosplasminogeenin aktivaattoria tai urokinaasia, tuumorin nekroositekijää, somatostatiinia, renniiniä, β-endor-fiinia, immunoglobuliineja kuten immunoglobuliinien D, E tai G kevyt- ja/tai raskasketjuja, tai ihminen-hiiri-15 hybridi-immunoglobuliineja, immunoglobuliinia sitovia tekijöitä kuten immunoglobuliini E:tä sitovaa tekijää, kalsitoniinia, ihmisen kalsitoniinin kaltaista peptidiä, veren hyytymätekijöitä kuten tekijöitä IX tai Ville, erytropoetiinia, egliiniä kuten egliini C:tä, desul-20 fatohirudiinia kuten desulfatohirudiinivarianttia HV1, HV2 tai PA, ihmisen superoksididismutaasia, viruksen tymidiinikinaasia, β-laktamaasia, glukoosi-isomeraasia.
Edullisia geenejä ovat ne, jotka koodittavat ihmisen a-interferonia tai interferonihybridiä, erityisesti inter-25 feronihybridiä BDBB, ihmisen kudosplasminogeenin ak-
I I I
^ . tivaattoria (t-PA), hepatiitti B -viruksen pinta-antigee- * niä (HBVsAg), insuliinin kaltaista kasvutekijää I ja II,
Ml egliini C:tä ja desulfatohirudiinia, esim. HVl-variant- • · '··* tia. Tämän keksinnön mukaisissa hybridivektoreissa esillä V ' 30 oleva promoottori- ja/tai signaalisekvenssi on toimivasti kytkettynä polypeptidiä koodittavaan alueeseen, jotta varmistetaan polypeptidin tehokas ilmentyminen.
• · · i · · • · ·
Keksintö koskee myös rekombinantti-DNA-molekyylejä, jotka 35 ovat rekombinanttivektoreita, vaihtoehtoisesti nimitet- • · ’*”* tynä hybridivektoreiksi, jotka sisältävät DNA-sekvenssin, joka on valikoitu ryhmästä 105206 25 a) pGW1800:n tai pGW1900:n sisältämä Aspergillus niqer DNA-insertti, 5 b) DNA-sekvenssi, joka hybridisoituu valmiin PGIIrn tai PGI:n kooditusalueeseen, jonka a)-kohdan DNA-insertti sisältää, c) kohdassa a) tai b) määritellyn DNA-sekvenssin johdan-10 nainen, tai d) kohtien a), b) tai c) mukainen DNA-sekvenssi, joka koodittaa valmista PG:tä tai sen signaalipeptidi tai ohjauspeptidi, ja joka on degeneroitunut geneettisen 15 koodin merkityksen suhteen.
Ne ovat käyttökelpoisia kloonaukseen ja/tai ilmentämiseen isännissä, kuten bakteereissa, sienissä tai eläinsoluis-sa.
20
Sellaiset hybridivektorit voivat olla peräisin mistä tahansa vektorista, joka on käyttökelpoinen geenitekniikan alalla, kuten viruksista, faageista, kosmideista, plasmideista tai kromosomaalisesta DNA:sta, kuten SV40- < 25 johdannaisista, herpes-viruksista, papillooma-viruksista
I I
; retroviruksista, bakuloviruksista, lambda-faagista, esim.
’· !| NM989:stä tai EMBL4:stä, tai M13-faagista, esim. M13mp8- faagi-DNA:sta (viite 15), joka on tehty lineaariseksi BamHI-pilkkomisen avulla, bakteerisista plasmideista, *.* * 30 esim. pBR322:sta, pUC18:sta, tai hiivaplasmideista, esim.
hiivan 2p-plasmidista, tai myös kromosomaalisesta DNA:- Γ- · "**ί sta, joka on peräisin esimerkiksi rihmasienistä kuten :T: Aspergillus spec.:stä. esim. A. nioeristä. esimerkiksi | t sellaisista, joita annetaan EP-184 438:ssa, vajavaisesta m 35 viruksesta, faagista tai plasmidista auttajaviruksen • · läsnä ollessa, faagista tai plasmidista, joka mahdollis-taa mainitun vajavaisen viruksen, faagin tai plasmidin • »· « · • · • > · 105206 26 replikoinnin, esim. M13(+)KS-vektorista esim. M14K07-auttajafaagin läsnä ollessa.
Keksinnön mukaiset hybridivektorit huolehtivat kahden-5 tumisesta ja valinnaisesti halutun DNA:n ilmentämisestä sopivassa isännässä, joko ekstrakromosomaalisena elementtinä tai kiinnittyneenä isännän kromosomiin. Useita mahdollisia vektorisysteemejä on saatavissa keksinnön mukaisen kloonatun DNA:n yhdistämistä ja ilmentämistä varten.
10 Kaikki vektorit ovat periaatteessa sopivia, jotka kahdentuvat ja/tai ilmentävät halutun polypeptidin geeniä, joka sisältyy keksinnön mukaiseen ekspressiokasettiin, valitussa isännässä. Vektori valitaan riippuen isäntäsoluis-ta, joita on ajateltu transformaatioon. Sellaiset isäntä-15 solut voivat yleensä olla prokaryoottisia tai eukaryoot-tisia mikro-organismeja kuten bakteereja, sieniä kuten hiivoja tai rihmasieniä, tai alkuperältään korkeampia eukaryoottisia soluja kuten selkärankaisten, esimerkiksi nisäkkäiden soluja. Sopivia isäntäsoluja käsitellään 20 yksityiskohtaisesti jäljempänä. Keksinnön mukaiset hybridivektorit sisältävät periaatteessa edellä määritellyn kaltaista DNA:ta, kahdentumisen aloituskohdan tai itsenäisesti kahdentuvan sekvenssin, dominantteja markkeri-sekvenssejä, valinnaisesti ilmentymisen säätelysekvensse- I,, 25 jä, jotka ovat välttämättömiä halutun DNA:n lukemiseksi I I < | ja kopioimiseksi, ja valinnaisesti halutun tuotteen erit- • · · *· *ί tämiseksi ja valinnaisesti lisärestriktiokohtia.
« • · · · • ··
Replikaation (kahdentumisen) aloituskohta tai it-! 30 senäisesti replikoituva sekvenssi (DNA-elementti, joka 1 mahdollistaa ekstrakromosomaalisten elementtien it- ··♦·· senäisen kahdentumisen) saadaan aikaan konstruoimalla vektoriin eksogeeninen aloituskohta, kuten esimerkiksi •m sellainen, joka on peräisin Simian-viruksesta SV40 (i- « · · • •I 35 hmisapinan-) tai muusta viruslähteestä, tai isäntäsolun i · * ·... kromosomaalisten mekanismien avulla.
« • · • · • «i • · • t · • · • · • > · 105206 27
Keksinnön mukainen hybridivektori ja tämän keksinnön mukaiset molekyylit voivat sisältää valikoitavia markke-reita, jotka riippuvat isännästä, joka on tarkoitus transformoida, valikoida ja kloonata. Mitä tahansa merkkigee-5 niä voidaan käyttää, joka helpottaa transformanttien * valikointia markkerin fenotyyppisen ilmentymisen avulla.
Sopivia markkereita ovat erityisesti sellaiset, jotka ilmentävät antibioottiresistenssiä, esim. tetrasykliiniä tai ampisilliiniä vastaan, tai, auksotrofisten sienimu-10 tanttien ollessa kysymyksessä, geenit, jotka täydentävät isännän vajavuuksia. Vastaavat geenit antavat esimerkiksi resistenssin sykloheksimidiantibiootille, tai saavat aikaan prototrofian auksotrofisessa hiivamutantissa, esimerkiksi ura3-. Ieu2-. his3- tai trpl-geeni. Markke-15 reina on myös mahdollista käyttää rakennegeenejä, jotka ovat liittyneet itsenäisesti replikoituvaan osaseen edellyttäen, että transformoitava isäntä on auksotrofinen markerin ilmentämän tuotteen suhteen.
20 Erityisen tärkeitä ovat merkkigeenit, jotka täydentävät A. niaer -isännän vajavuuksia, kuten argB-geeni, joka koodittaa ornitiinikarbamoyylitransferaasia, esim. joka on peräisin A. nigeristä tai A. nidulansista (EP-184 438), tai A. nidulansin fragmentit, jotka ovat homologi- « · < V : 25 siä N. crassan pyr4-qeenin kanssa, 27.
« f 1 f « ( • < « m :\j Tämän keksinnön edullisia suoritusmuotoja ovat hybridi- ··· vektorit, jotka sisältävät keksinnön mukaisen ekspres- • « · 1 .··. siokasetin, esim. sellaisen, joka sisältää rakennegeenin 30 ja/tai promoottorin ja/tai DNA-sekvenssin, joka koodittaa • · · ohjaus- tai signaalipeptidiä ja/tai transkriptionaalisen terminaattorin, jotka ovat peräisin keksinnön mukaisesta ]<t1 PG-geenistä.
t · · t · « t • ·· 35 Esimerkkejä hybridivektoreista, jotka sisältävät kek- • · t 1 j"'· sinnön mukaisen ekspressiokasetin, ovat pGW1800, pGW1900, pGW1910, pGII-IFN AM119, pGIIss-IFN AM119, pGW1756, lamb- • « · « «· • · » · • · • · • · · 105206 28 da-A10, lambda-A43, lambda-PG-D8 ja lambda-PG-Dll.
Keksinnön kohteena ei ole ainoastaan rekombinantti-DNA-molekyyli, joka sisältää edellä kuvaillun PG-geeniperäi-5 sen insertin, vaan myös DNA-molekyyli, joka sisältää PG-geenin tai sen toiminnallisen fragmentin, esim. sellaisen, joka sisältää promoottorin, kooditusalueen sig-naalipeptidille, ohjauspeptidille tai proteiinille, jossa on PG-aktiivisuutta, tai itse transkriptionaalisen ter-10 minaattorialueen, joka voidaan eristää PG:tä tuottavasta sienikannasta, esimerkiksi Asperoillus spec.'stä. esim.
A. 1aponicuksesta. A. orvzaesta. A. nidulansista, A. nioerlstä. Trichoderma spec.'stä. Botrvtis spec.'stä. Sclerotinia spec.'stä. Fusarium spec.'stä tai muista 15 fytopatogeenisistä sienistä samoin kuin hiivasta, esimerkiksi PG:tä tuottavasta Kluweromvces spec.1stä kuten K. fraqiliksesta. Edullisia ovat DNA-molekyylit, jotka on eristetty A. niqerlstä.
20 Keksinnön mukaisia DNA-molekyylejä ja niiden johdannaisia, mukaanlukien fragmentit, voidaan käyttää DNA-geenikirjastojen tai mRNA:n seulontaan koskien muita samanlaisia DNA- tai mRNA-molekyylejä.
v · 25 Menetelmä rekombinantti-DNA-molekyylien valmistamiseksi < < < ! ! ! Keksinnön kohteena on lisäksi menetelmä edellä määritel- lyn rekombinantti-DNA-molekyylin valmistamiseksi, joka ··· käsittää sellaisella rekombinantti-DNA-molekyylillä • · · · .·". transformoidun isännän viljelyn, tai sen valmistamisen in • ·· 30 vitro -synteesin avulla.
• · » . Isäntien viljely suoritetaan tavanomaisessa ravintoalus- tässä, jota voidaan täydentää kemiallisilla yhdisteillä, • · · *·] ’ tai josta voidaan jättää pois niitä pois, mikä mahdollis- ··· 35 taa transformanttien negatiivisen tai positiivisen väli-
MM
.***; koinnin, so. sellaisten isäntien, jotka sisältävät halu- • 4« .* . tun DNA-molekyylin yhdessä valintamarkkerin kanssa, ei- « · ·
• 4 I
• · • · « • · m · 144 105206 29 transformanteista, so. sellaisista isännistä, joilta puuttuu haluttu DNA-molekyyli.
Mitä tahansa alalla käyttökelpoista transformoitavaa 5 isäntää voidaan käyttää, esim. bakteereja kuten E. colia, sieniä kuten Saccharomvces cerevisiaeta. Kluvveromvces lactista. tai erityisesti rihmasieniä kuten Asperoillus-t ta, esim. A. nidulansia. A. orvzaeta. A. carbonariusta.
A. awamoria ja erityisesti A. niaeriä. Edullinen isäntä 10 on A. nlaer An8, mutantti, jolta puuttuu pvrA-geeni. jota kuvaillaan enemmän jäljempänä, tai A. niaer N593. Isäntien transformointi suoritetaan tavanomaisilla menetelmillä.
15 DNA-sekvenssi, jonka keksinnön mukainen rekombinantti- DNA-molekyyli sisältää, voidaan saada polygalakturonaasia ilmentävän sienen genomista, tai se voidaan valmistaa esimerkiksi viljelemällä isäntää, joka transformoidaan keksinnön mukaisella rekombinantti-DNA-molekyylillä, ja 20 tarvittaessa eristää haluttu DNA-sekvenssi siitä, tai kemiallisen synteesin avulla nukleotidikondensaation kautta.
Sellaisia DNA-sekvenssejä voidaan erityisesti valmistaa 25 siten, että 4 · « 4 · a) eristetään genomista DNA:ta sopivista sienisoluista ja • · .·· valikoidaan haluttu DNA käyttäen esim. DNA-koetinta, tai III» .···. käyttäen sopivaa ekspressiosysteemiä ja seulomalla halu- 30 tun polypeptidin ilmentymisen suhteen, tai • · · * . b) eristetään mRNA:ta sopivista sienisoluista, valikoi- 1/ daan haluttu mRNA, esim. hybridisaation avulla DNA-koet- « · · V 1 timen kanssa, tai ilmentämällä sopivassa ekspressiosys- ··· 35 teemissä ja seulotaan halutun polypeptidin ilmentymisen
I I I I
.'"j suhteen, valmistetaan yksijuosteista cDNA:ta, joka on
III
.·. komplementaarinen sille mRNA:lie, sitten kaksijuosteista * · · • · · • · « · • » · 105206 30 cDNA:ta siitä, tai c) eristetään cDNArta cDNA-kirjastosta ja valikoidaan haluttu cDNA, esim. käyttäen DNA-koetinta, tai käyttäen 5 sopivaa ekspressiosysteemiä ja seulotaan halutun polypep-tidin ilmentymisen suhteen, tai/ja d) liitetään vaiheiden a), b) tai c) kaksijuosteista .
DNA:ta sopivaan vektoriin, 10 e) transformoidaan sopivia isäntäsoluja saadulla hybridi-vektorilla, f) valikoidaan transformoidut isäntäsolut, jotka sisältä-15 vät haluttua DNA:ta transformoitumattomista isäntäsoluis- ta ja kasvatetaan transformoituja isäntäsoluja, ja tarvittaessa, g) eristetään haluttu DNA ja/tai muutetaan DNA sen mutan-20 tiksi tai fragmentiksi.
Genomista DNA:ta voidaan eristää ja seuloa halutun DNA:n suhteen (vaihe a). Genomista DNA:ta eristetään sopivasta sienikannasta, joka ilmentää proteiineja, joissa on PG- -25 aktiivisuutta. Siitä valmistetaan genominen DNA-kirjasto pilkkomalla sopivien restriktioendonukleaasien avulla ja .·. : ja liittämällä sopiviin vektoreihin noudattaen väkiin- • t· ’.·] tuneita menetelmiä. Genominen DNA-kirjasto seulotaan DNA- [II! koettimen avulla kuten jäljempänä kuvaillaan, tai ilmen- *" 30 netään sopivassa ekspressiosysteemissä, ja saadut poly- • · · *·* * peptidit seulotaan tavanomaiseen tapaan. Jäljempänä esi tetään yksityiskohtainen kuvaus keksinnön mukaisen DNA- *·“· molekyylin eristämisestä genomisesta kirjastosta.
• · · « · · • · · .:. 35 Polyadenyloitu lähetti-RNA (vaihe b) eristetään sopivista *··· soluista tunnetuilla menetelmillä. Eristämismenetelmät • · • · käsittävät esimerkiksi homogenoinnin pesuaineen ja ribo- • · • · · • · · • · • · · • · • « • · * 105206 31 nukleaasin inhibiittorin kuten esim. hepariinin, guani-diini-isotiosyanaatin tai merkaptoetanolin läsnä ollessa, mRNA:n uuttamisen sopivien kloroformi-fenoli-seosten avulla, valinnaisesti suola- ja puskuriliuosten, pesuai-5 neiden ja/tai kationeja kelatoivien aineiden läsnä ollessa, ja mRNA:n saostamisen jäljellä olevasta vesipitoisesta, suolaa sisältävästä faasista etanolin, isopropanolin ^ tai vastaavan avulla. Eristettyä mRNA:ta voidaan edelleen puhdistaa sentrifugoimalla keesiumkloridigradientissa, 10 jota seuraa saostaminen etanolilla ja/tai kromatografisilla menetelmillä, esim. affiniteettikromatografialla, esimerkiksi kromatografoimalla oligo(dT)-selluloosalla tai oligo(dU)-sefaroosilla. Sellainen puhdistettu koko-nais-mRNA fraktioidaan edullisesti koon mukaan gradient-15 tisentrifugoinnin avulla, esim. lineaarisessa sak- karoosigradientissa, tai kromatografoimalla sopivilla koon perusteella fraktioivilla kolonneilla, esim. agaroo-sigeeleillä.
20 Tavoiteltu mRNA valikoidaan seulomalla mRNA suoraan DNA-koettimen avulla, tai translaation avulla sopivissa soluissa tai soluvapaissa systeemeissä, ja seulomalla saadut polypeptidit.
• · · ' 25 Tavoitellun mRNA:n valikoituminen saadaan edullisesti ai- • · · : kaan käyttäen DNA-hybridisaatiokoetinta, välttäen sillä : 1.· tavalla translaatiolisävaihe. Sopivia DNA-koettimia ovat •j1 DNA:t, joiden nukleotidisekvenssi on tunnettu ja sisältää ···· .’"j vähintään 17 nukleotidiä, esimerkiksi synteettiset DNA:t, • · · 30 mRNA:sta peräisin olevat cDNA:t, jotka koodittavat haluttuja polypeptidejä, tai genomiset DNA-fragmentit, jotka ' j sisältävät esim, viereisiä DNA-sekvenssejä, joita eris- tetään luonnollisesta lähteestä tai geneettisesti manipu- • · « loidusta mikro-organismista.
·:· 35 lltl
Synteettisiä DNA-koettimia syntetisoidaan tunnettujen M· / . menetelmien mukaisesti, joita kuvataan yksityiskohtaises- « «f « · « • f 105206 32 ti jäljempänä, edullisesti asteittaisen kondensaation avulla, käyttämällä kiinteäfaasista fosfotriesteri-, fosfiitti- triesteri- tai fosforamidiittimenetelmää, esim. dinukleotidikytkentäyksikköjen kondensointi fos-5 fotriesterimenetelmällä. Nämä menetelmät on sopeutettu haluttujen oligonukleotidien seosten syntetisointiin, käyttäen seoksia, jotka sisältävät kaksi, kolme tai neljä nukleotideistä dA, dC, dG ja/tai dT suojatussa muodossa, tai vastaavia dinukleotidikytkentäyksikköjä sopivassa 10 kondensaatiovaiheessa, kuten Y. Ike et ai. ovat kuvailleet (Nucleic Acids Research 11, 477, 1983).
Hybridisaatiota varten DNA-koettimet leimataan, esim. ra-dioaktiivisesti leimaamalla hyvin tunnetun kinaasireak-15 tion avulla. Koon mukaan fraktioidun mRNA:n hybridisointi DNA-koettimien kanssa, jotka sisältävät leiman, suoritetaan tunnettujen menetelmien mukaisesti, so. puskuri- ja suolaliuoksissa, jotka sisältävät lisäaineina kalsiumia kelatoivia aineita, viskositeettia säätäviä yhdisteitä, 20 proteiineja, ei-homologista DNA:ta ja vastaavia aineita, lämpötiloissa, jotka suosivat valikoivaa hybridisaatiota, esim. välillä 0°C - 80°C, esimerkiksi välillä 25°C - 50°C tai 65°C:n tienoilla, edullisesti lämpötilassa noin 20°C alle kaksijuosteisen hybridi-DNA:n sulamislämpötilan.
25 . - Fraktioitu mRNA voidaan lukea soluissa, esim. sammakon :\j varhaismunasoluissa, tai soluvapaissa systeemeissä, esim.
··· retikulosyyttilysaateissa tai vehnänalkiouutteissa. Saa- M·· .···. dut polypeptidit seulotaan entsyymiaktiivisuuden suhteen ··· 30 tai reaktion suhteen vasta-aineiden kanssa, jotka on « » » tehty natiivia polypeptidiä vastaan, esim. im-, munomäärityksessä, esimerkiksi radioimmunomäärityksessä, |tt1 entsyymi-immunomäärityksessä tai immunomäärityksessä i · « ’·1 ' fluoresoivien markkerien kanssa. Sellaiset im- « ·;· 35 munomääritykset ja polyklonaalisten ja monoklonaalisten
f IM
vasta-aineiden valmistaminen ovat alalla hyvin tunnettuja « · · . ja niitä käytetään sen mukaisesti.
• · «
• M
» « · • · * I · 105206 33
Yksijuosteisen komplementaarisen DNA:N (cDNA) valmistaminen valikoidusta mRNA-templaatista on alalla hyvin tunnettua, kuten kaksijuosteisen DNA:n valmistaminen 5 yksijuosteisesta DNA:sta. mRNA-templaattia inkuboidaan seoksessa, joka sisältää deoksinukleosiditrifosfaatteja, valinnaisesti radioaktiivisesti leimattuja deoksinuk-' leosiditrifosfaatteja (jotta kyetään seulomaan reaktion tulos), alukesekvenssin kuten oligo-dT-tähteen, joka 10 hybridisoituu mRNA:n poly(A)-hännän kanssa, ja sopivan entsyymin kuten käänteisen transkriptaasin esim. linnun myeloblastoosiviruksesta (AMV). mRNA-templaatin hajottamisen jälkeen, esim. alkalisen hydrolyysin avulla, cDNA:ta inkuboidaan seoksessa, joka sisältää deoksinuk-15 leosiditrifosfaatteja ja sopivaa entsyymiä, jolloin saadaan kaksijuosteista DNA:ta. Sopivia entsyymejä ovat esimerkiksi käänteistranskriptaasi, E, colin DNA-poly-meraasi I:n Klenow-fragmentti tai T4 DNA -polymeraasi. Hiusneulasilmukkarakenne, jonka yksijuosteinen cDNA muo-20 dostaa luonnostaan, toimii tavallisesti alukkeena toisen juosteen synteesille. Tämä hiusneularakenne poistetaan pilkkomalla Sl-nukleaasin avulla. Yksijuosteisen DNA:n 3'-päätä jatketaan vaihtoehtoisesti ensin homopolymeeri-sillä deoksinukleotidihännillä ennen mRNA-templaatin 25 hydrolyysiä ja sitä seuraavaa toisen cDNA-juosteen syn- . teesiä.
• · • · · • · · 0 · m ..*·* Vaihtoehtoisesti, kaksijuosteista cDNA:ta eristetään cDNA-kirjastosta ja seulotaan halutun cDNA:n suhteen ♦ ·· 30 (vaihe c). cDNA-kirjasto konstruoidaan eristämällä mRNA:- 0 ta sopivista soluista ja valmistamalla siitä yksijuos-teista ja kaksijuosteista cDNA:ta kuten edellä on kuvail- • 0 ...t tu. Tämä cDNA pilkotaan sopivilla restriktioendonuk- a a a leaaseilla ja liitetään lambda-faagiin, esim. lambda- a 35 charon 4A:han tai lambda-gtll:sta noudattaen väkiin- a · · tuneita menetelmiä. Nitroselluloosamembraaneilla repli-.·. : koitu cDNA-kirjasto seulotaan käyttäen DNA-koetinta kuten • *a • » aa· • a • · 34 10E206 edellä on kuvailtu, tai ilmennetään sopivassa ekspres-siosysteemissä, ja saadut polypeptidit seulotaan reaktiolla vasta-aineen kanssa, joka on spesifinen halutuille yhdisteille.
5
Alalla tunnetaan useita eri menetelmiä kaksijuosteisen cDNA:n tai genomisen DNA:n liittämiseksi sopivaan vektoriin (vaihe d). Komplementaarisia homopolymerijaksoja » voidaan esimerkiksi lisätä kaksijuosteiseen DNA:hän ja 10 vektori-DNA:hän, inkuboimalla vastaavien deoksinuk- leosiditrifosfaattien ja entsyymin, kuten terminaalisen deoksinukleotidyylitransferaasin, läsnä ollessa. Vektori ja kaksijuosteinen DNA liitetään sen jälkeen yhteen emäs-pariutuksella komplementaaristen homopolymeerihäntien 15 välillä, ja lopuksi ligoidaan spesifisten liitosentsyy-mien kuten ligaasien avulla. Muita mahdollisuuksia ovat synteettisten kytkijöiden liittäminen kaksijuosteisen DNA:n päihin, tai kaksijuosteisen DNA:n liittäminen vektoriin tasapäisen tai 20 esiintyöntyväpäisen ligaation avulla. Sopivia vektoreita käsitellään jäljempänä yksityiskohtaisesti.
Sopivien isäntäsolujen transformointi saadulla hybridi-vektorilla (vaihe e) ja transformoitujen isäntäsolujen 25 valikointi ja kasvattaminen (vaihe f) ovat alalla hyvin . tunnettuja. Jäljempänä esitetään edelleen esimerkkejä : sellaisista menetelmistä. Hybridivektorit ja isäntäsolut ·;· voivat olla erityisen sopivia DNA:n tuottamiseen, tai M·· muutoin haluttujen polypeptidien tuottamiseen.
*«· 30 • « ·
Halutun DNA:n, sen mutanttien ja fragmenttien eristäminen . keksinnön mukaisesti saadaan aikaan alalla tunnetuilla menetelmillä, esim. uuttamalla fenolilla ja/tai klorofor- • i i millä. DNA:ta voidaan valinnaisesti manipuloida edelleen ·1:· 35 esim. käsittelemällä mutageenisilla aineilla mutanttien
MM
saamiseksi, tai pilkkomalla restriktioentsyymeillä frag- • « · .1 . menttien saamiseksi, modifioimalla toista tai molempia « « · • «· • 1 » • · • m » » · 105206 35 päitä vektoriin liittämisen helpottamiseksi, poistamalla koodittamattomat välisekvenssit ja vastaavilla tavoilla.
Keksinnön mukaisen DNA:n nukleotidisekvenssi voidaan mää-5 rittää sinänsä tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi Maxam-Gilbert-menetelmällä, käyttäen päästä leimattua DNA:ta, tai Sangerin dideoksi-ketjunpysäytysmenetelmällä.
Tämän keksinnön mukaisia PG-geenisekvenssejä voidaan valio mistaa myös in vitro -synteesin avulla tavanomaisten menetelmien mukaisesti. In vitro -synteesi on erityisen käyttökelpoinen PG-ekspressiokasetin pienempien fragmenttien valmistamiseksi, esim. PG-geenin DNA-sekvenssien valmistamiseksi, jotka koodittavat promoottori- tai sig-15 naalipeptidiä, esimerkiksi PGI-, PGII- tai pgaC-geenien, PG-geenin tai sen mutantin DNA-sekvenssien valmistamiseksi, jotka sisältyvät edellä määriteltyyn DNA-molekyyliin, erityisesti lambda-klooneissa.
20 Sopivia DNA:n synteesimenetelmiä om esitetty tiivistelmänä S.A. Narangin toimesta (Tetrahedron 39, 3, 1983). Tunnetuilla synteesimenetelmillä on mahdollista valmistaa polynukleotidejä 120 emäksen pituuteen saakka, hyvällä saannolla, hyvin puhtaana ja verrattain lyhyessä ajassa. 25 Sopivasti suojattuja nukleotidejä kytketään toisiinsa . ' fosfodiesterimenetelmällä (K.L. Agarwal et ai., Angew.
Chemie 84, 489, 1972), tehokkaammalla fos- • t ··· fotriesterimenetelmällä (C.B. Reese, Tetrahedron 34.
• · · · .·**. 3143, 1972), fosfiittitriesterimenetelmällä (R.L. Let- 30 singer et ai., J. Am. Chem. Soc. 98, 3655, 1976) tai • · · fosforamidiittimenetelmällä (S.L. Beaucage ja M.H. Car-ruthers, Tetrahedron 22, 1859, 1981). Oligonukleotidien • · ja polynukleotidien synteesin yksinkertaistaminen tehdään • « · ’·' ’ mahdolliseksi kiinteäfaasisella menetelmällä, jossa nuk- ·;1 35 leotidiketjut sidotaan sopivaan polymeeriin. H. Rink et • · · · ai. (Nucl. Acids Research 12, 6369, 1984) käyttävät tri- • · · .1 . nukleotidejä yksittäisten nukleotidien asemesta ja kyt- • · · • · · • · »· • · t · tl· 105206 36 kevät ne fosfotriesterimenetelmällä kiinteäfaasisessa synteesissä. Polynukleotidi voidaan siten valmistaa lyhyessä ajassa ja hyvillä saannoilla. Varsinainen kaksijuos-teinen DNA kootaan entsymaattisesti kemiallisesti valmis-5 tetuista, toisiaan peittävistä oligonukleotideistä molemmista DNA-juosteista, jotka pysyvät yhdessä oikeassa järjestyksessä emäspariutumisen avulla, ja jotka sen jälkeen liitetään kemiallisesti DNA-ligaasientsyymin avulla. Toinen mahdollisuus käsittää kahden DNA-juosteen 10 toisiaan peittävien, yksinkertaisten oligonukleotidien inkuboinnin neljän tarvittavan deoksinukleosiditrifos-faatin läsnä ollessa DNA-polymeraasin, esimerkiksi DNA-polymeraasi I:n, polymeraasi I:n Klenow-fragmentin tai T4 DNA -polymeraasin, tai AMV:n (linnun myeloblastoosivirus) 15 käänteistranskriptaasin kanssa. Kaksi oligonukleotidiä pysyvät sillä tavalla yhdessä oikeassa järjestyksessä emäspariutumisen avulla, ja niitä täydennetään tarvittavilla nukleotideillä entsyymin avulla, jolloin saadaan täydellistä kaksijuosteista DNA:ta (S.A. Narang et ai., 20 Anal. Biochem. 121., 356, 1982).
Seuraavassa kuvaillaan yksityiskohtaisemmin tämän keksinnön mukaisen rekombinantti-DNA-molekyylin valmistusta genomisesta kirjastosta, ja homologisia ja heterologisia 25 hybridisaatio-olosuhteita PG-geeniperheen jäsenten iden- . tifioimiseksi.
• · • · · • · # • · ·:· Genominen kirjasto voidaan valmistaa esim. hydrolysoimal- ·'1'1 la osittain A. niger -kannan, esim. NW756:n tai N400:n,
Ml 30 genomista DNA: ta Sau3A: 11a tai Mbol: llä. ja kloonaamalla suurimolekyylipainoiset DNA-fragmentit sopivaan isäntä- ##tt; vektoriin, esim. E. colin plasmidiin pUN121 tai lambda- • · ... vektoriin, esim. EMBL4:ään.
• · · • · · t1|' 35 Muut sopivat sienikannat, jotka tuottavat haluttuja PG- entsyymejä, esimerkiksi Aspergillus spec., esim. A. Iapo- • » » / . nicus, A. oryzae. A. nidulans. A. niger. Trichoderma • · · • · · • · 37 105206 spec., Botrvtis spec., Sclerotinia spec., Fusarium spec, tai muut fytopatogeeniset sienet, samoin kuin hiivat, esimerkiksi PG:tä tuottava Kluweromvces spec, kuten K. fraailis. voivat toimia genomisen kirjaston lähteenä, ja 5 muita sopivia vektoreita, esim. edellä määriteltyjä vektoreita, voidaan käyttää fragmenttien vastaanottajina.
PG-entsyymejä koodittavien DNA-sekvenssien seulomiseksi genomisesta kirjastosta onnistuneesti, tarvitaan hybridi-10 soituva DNA-koetin. Tämä voi olla synteettinen DNA-koe-tin, jos halutun PG:n aminohapposekvenssi tai osa siitä on tunnettu, tai toinen PG-geeni tai sen osa, joka hybri-disoituu haluttuun PG-geeniin. Koska PG-sekvenssiä sen paremmin kuin PG-geeniä tai sen osaa ei tunnettu ennen 15 keksintöä, PG-entsyymien puhdistukseen, PG:n N-ter- minaalisen sekvenssin rakenteen määrittämiseen ja käyttökelpoisten DNA-koettimien valmistukseen liittyvät ongelmat ratkaistiin ensin.
20 Esillä olevien PG-entsyymien puhdistukseen voidaan käyttää kaikkia sitä sisältäviä lähteitä. Esimerkiksi raa'at lähteet kuten Aspergillus niaeristä saadut entsyymiseok-,,, set, kuten Rapidase", pektinolyyttisiä entsyymejä sisältä-
I I I
'' vä, kaupallisesti saatavissa oleva seos, voi toimia läh- ' 25 teenä.
I i
(Il < I
» · ..*·* Puhdistamisessa noudatetaan tavanomaisia puhdistus- menetelmiä kuten poistosuolausta, suolan poistamista, uudelleen saostamista eri suolamuodossa, kromatografiaa, 30 esim. affiniteettikromatografiaa, esim. ristikytkyal- ginaatilla, ioninvaihtokromatografiaa, esim. DEAE-Sepha-dex- tai Sepharose-kolonnilla, geelipermeaatio- • · « kromatografiaa, esim. Sephacryl-kolonnilla, elektroforeesi:* siä, esim. SDS-polyakryyliamidigeelin avulla, isoelek- f · · 35 tristä fokusointia ja vastaavia menetelmiä tai jotain « : niiden yhdistelmää.
• · · • · » · » • *
• » I
105206 38 Tässä keksinnössä PGI, PGII, PGIIIA, PGIIIB ja PGIV eristettiin puhtaassa muodossa Rapidase": sta. Mainitut PG:t ovat endo-polygalakturonaaseja (E.C.3.2.1.15), joilla on seuraavat fysikokemialliset ominaisuudet: PGI:n Mr on 55 5 K, isoelektrinen piste (IEP) on 3,2-3,5 ja pH-optimi entsyymiaktiivisuudelle 4,9. PGII:n arvot ovat Mr:n osalta ' 38 K, IEP on 4,6-5,9, pH-optimi on 4,8; PGIIIA:n Mr on 57 K, IEP 3,3 ja pH-optimi 4,3, PGIIIB:n Mr on myös 57 K ja * IEP 3,3, pH-optimin ollessa kuitenkin 4,5. Lopuksi PGIV:n 10 Mr on 59 K, IEP 3,7 ja pH-optimi 4,8. Annetut Mr-arvot määritetään SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, IEP-arvot isoelektrisellä ohutlevyfokusoinnilla.
PGI:n N-terminaalinen sekvensointi osoitti seuraavan sek-15 venssin: ala1-ser-thr-X4-thr5-phe-thr-ser-ala9 PGI:n 21 kDa BrCN-fragmentin N-terminaalinen sekvensointi 20 osoitti sekvenssin ala-ser-thr-X4-thr-phe-thr-ser-ala-ser-glu,
f I
• i r *' ' so. PGI:n N-terminaalinen sekvenssi ja 5,5 kDa BrCN-frag- III 5 ' 25 mentin sekvensointi osoitti sekvenssin • i «
I I I
ala-asp-gly-ala-val-ile-asp-gly-asp-gly-ser.
·* • · • · • · · ·*·*: PGII:n N-terminaalinen sekvensointi osoitti sekvenssin 30 asp1-ser-X3-thr-phe5-thr-thr-ala-ala-ala10-ala-lys-ala12 9 · • · · • · · # · · ja 17 kDa BrCN-fragmentista sekvenssin • * · II·· 35 ala-phe-ser-val-gln-ala-asn-asp-ile-thr-phe.
• · • ♦ · • · · X3:a ja x4:ää sekvensseissä ei identifioitu sillä kertaa.
• · • · • · · 105206 39
Perustuen PGI:n 5,5 kDa BrCN-fragmentin aminohapposekvenssiin, seuraava oligonukleotidiseos syntetisoitiin 5 met ala asp gly ala vai
HR 6298 5’ (d) ATG GCI GARX GGI GCI GTI
t ile asp gly asp gly ATR3 GARX GGI GARX GG 3' 10
Perustuen PGII:n 17 kDa BrCN-fragmentin aminohapposekvenssiin, seuraavat kaksi oligonukleotidiseosta syntetisoitiin 15 met ala phe ser vai gin ala
HR6195 5' (d) ATG GCI TTRt TCI GTI CAR2 GCI
HR6196 5’ (d) ATG GCI TTRj AGI GTI CAR2 GCI
20 asn asp ile HR6195 AARX GARj AT 3' HR6196 AARi GARj AT 3’ * t 4
« f I
' Oligonukleotidisekvensseissä I on inosiini, Rx on T tai C, ' 25 R2 on A tai G ja R3 on T, C tai A.
I I I I I I I « • · m ..*·* Seokset merkittiin radioaktiivisesta, ja niitä käytettiin
Aspergillus niaer N400:n genomisen kirjaston seulomiseksi PGI- ja vastaavasti PGII-geenien osalta.
30
Identifioidut geenit tai geeni fragmentit sekvensoidaan • · ' sen jälkeen tavanomaisten menetelmien mukaisesti. A.
• « · niaer N400:n PGI- ja PGII-geenien sekvenssit esitetään sekvenssiluetteloinnissa kuvattavien SEQ ID NO. l:n ja
IM
35 vastaavasti 2:n mukaisten sekvenssien avulla.
• · • · · « · ·
Seulontatarkoituksia varten DNA-koettimet leimataan ra- $ · 0 0 0 » « 105206 40 dioaktiivisesti alalla tunnetuilla menetelmillä, käyttäen esim. r32P-ATP:tä ja T4 -kinaasia tai a3ZP-dATP:tä ja E. colin DNA-polymeraasi I:tä, riippuen käytettävän koettimen tyypistä. Isäntämikro-organismeja, jotka sisältävät 5 tämän keksinnön mukaisia nukleiinihappoja inserttinä, identifioidaan hybridisoimalla leimatun DNA-koettimen ’ kanssa geenikirjaston suodinkopioilta.
t
Kloonit, jotka reagoivat hybridisaatiossa yhteen tai 10 useampaan DNA-koettimeen, eristetään ja monistetaan.
Käytetyt hybridisaatio-olosuhteet ovat tavanomaisia ja voivat olla enemmän tai vähemmän kovat.
15 Kovat olosuhteet ovat sellaiset, joissa vain homologia-asteeltaan korkeat DNA-sekvenssit voivat hybridisoitua ("homologiset” hybridisaatio-olosuhteet). "Heterologisi-ssa" eli vähemmän kovissa olosuhteissa myös läheisesti yhteen kuuluvat DNA-sekvenssit, joiden homologiataso on 20 alhaisempi, voivat hybridisoitua. Hybridisaation kovuuteen vaikuttavat esimerkiksi hybridisaatio ja pesulämpö-tila, formamidi- tai suolapitoisuus, DNA:n G+C-sisältÖ, hybridisaatioajan kesto ja DNA-koettimen pituus. Valaise-' via vaan ei rajoittavia esimerkkejä "homologisista" ja ' 25 "heterologisista" hybridisaatio-olosuhteista annetaan .'· jäljempänä esimerkit-jaksossa.
·· · • · · · Käyttämällä yhtä tai useampaa DNA-koetinta, jotka ovat peräisin PGI- tai PGII-geenistä, erityisesti sellaisia, 30 jotka sisältävät ainakin osan niiden kooditusalueesta, genomisesta kirjastosta peräisin olevat hybridisoituvat • · kloonit, esim. A. nioerin. edullisesti A. nioer N400:n • · « tai A. nioer NW756:n, voidaan identifioida ja jakaa eri ryhmiin, perustuen niiden homologia-asteeseen ja havait- * · · *...· 35 tujen hybridi sortuvien restriktiofragmenttien perusteel- ,·] : la. Esimerkkejä edullisista klooneista, jotka on saatu A.
I M
nioer N400:n kirjastosta, ovat lambda-PG-A9, -AIO, - • · • t · 105206 41 A43, -B4, -B35, -B36, -Cl, -C16, -C20, -C37, -D8, -Dll, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 ja -Y33. Niiden valmistamista kuvaillaan yksityiskohtaisesti jäljempänä esimerkit-jak-5 sossa. Esimerkki edullisesta kloonista, joka on peräisin A. niaer NW756:sta, on plasmidi pGW1756.
Näitä klooneja, samoin kuin plasmideja pGWl800, pGW1803, pGW1900, pGW1902 ja pGW1910, voidaan käyttää muiden kek-10 sinnön mukaisten rekombinantti-DNA-molekyylien valmistamiseksi, erityisesti sellaisten, jotka sisältävät PG-geenisekvenssien fragmentteja niihin sisältyneinä. Mainittuja muita rekombinantti-DNA-molekyylejä valmistetaan tavanomaisella tavalla käyttämällä tavanomaisia restrik-15 tioentsyymejä, kytkijöitä, ligaatiota, monistamista ja eristysmenetelmiä. Edullisesti valmistetaan ekspres-siovektoreita, jotka voivat olla pro- tai eukaryoottisia vektoreita tai sukkulavektoreita, niiden määrän lisäämiseksi sekä pro- että eukaryoottisissa soluissa. Esimerkit 20 sellaisten sukkulavektoreiden konstruoimiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja. Ekspressiovektorit voivat sisältää homologisia tai heterologisia geenejä. Jäljempänä an-netaan esimerkkejä sellaisista geeneistä.
t < 25 Keksinnön mukaisten rekombinantti-DNA-molekyylien in-. . serttejä tai niiden fragmentteja voidaan saada tavanomai- sella tavalla, esim. rekombinantti-DNA:n katkaisemisen • · ♦ jälkeen sopivilla restriktioentsyymeillä ja haluttujen DNA-fragmenttien eristämisen jälkeen agaroosigeelielek-30 troforeesilla.
• ·
Keksinnön mukaisten DNA-molekyylien mutantteja, erityi- • · ♦ sesti PG-geenisekvenssien, jotka sisältävät uusia re- « striktiokohtia, voidaan myös valmistaa, esimerkiksi in • · · ·...· 35 vitro paikkakohdennetun mutatoinnin avulla, tavanomaisten * : menetelmien mukaisesti [kokooma-artikkeli, M.J. Zoller ja .···. M. Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983), D. Botstein • · • · · 105206 42 ja D. Shortle, Science 229. 1193 (1985) tai K. Norris et ai., Nucl. Acids Res. 11, 5103 (1983)].
Keksintö koskee myös keksinnön mukaisten rekombinantti-5 DNA-molekyylien käyttöä hybridivektoreiden valmistukseen rakennegeenin ilmentämistä varten.
Transformoidut isännät ,
Keksintö koskee lisäksi transformoituja isäntäsoluja kek-10 sinnön mukaisten rekombinantti-DNA-molekyylien monistamiseksi tai erityisesti ekspressiokasetin ilmentämiseksi, joka sisältyy keksinnön mukaiseen rekombinantti-DNA-mole-kyyliin.
15 Esimerkkejä sopivista isännistä, erityisesti keksinnön mukaisten rekombinantti-DNA-molekyylien monistamista varten, ovat mikro-organismit, joilta puuttuvat tai jotka sisältävät hyvin vähän restriktioentsyymejä tai modifi-ointientsyymejä, kuten bakteerit, erityisesti Escherichia 20 coli -kannat, esimerkiksi E. coli X1776, E. coli Y1090, I· coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221, E. coli DH5a, tai edullisesti E. coli DH5aF', JM109, MH1 tai HB101, tai E. coli K12-kanta, Bacillus subtilis. Bacillus
III
' stearothermophilus. Pseudomonas. Haemophilus. Streptococ- I < v ; 25 cus ja muut bakteerit, hiivat, esimerkiksi Saccharomvces cerevisiae kuten S. cerevisiae GRF18. Sopivia isäntäsolu->#*ϊ* ja ovat lisäksi korkeampien organismien solut, erityises- ti vakiintuneet jatkuvat ihmisen solulinjat tai eläinso- * 9 ;*·*; lulinjat, esim. ihmissikiön keuhkojen fibroblastit L132, 9 30 ihmisen pahanlaatuisen melanooman Bowes-solut, HeLa-so-lut, SV40-viruksen muuttamat, afrikkalaisen vihreän api- • nan COS-7 munuaissolut tai kiinanhamsterin munasarjan *\ * (CHO) solut.
c · « • « · · 35 Esimerkkejä sopivista isännistä keksinnön mukaisen eks- ,·*. ; pressiokasetin ilmentämiseksi ovat edellä määritellyt • · · solut ja erityisesti rihmasienet, esimerkiksi Penicil- • * I t · 105206 43
Hum. Cephalosporlum tai edullisesti Aspergillus spec., esim. A. carbonarlus. A. awamori tai edullisesti A. ni-aer. A. nidulans tai A.oryzae.
5 Edullisia transformoituja isäntiä ovat E. coli MH1, transformoituna plasmidilla pGW1800 tai pGW1803, E. coli JM109, transformoituna plasmidilla pGW1800 tai pGW1803, E. coli DH5aF', transformoituna plasmideilla pGW1900, -1902, -1756 tai -1910, pGII-IFN AM119 tai pGIIss-IFN 10 AM119, Aspergillus niger An8 tai N593 tai Aspergillus nidulans. transformoituna plasmidilla pGII-IFN AM119 tai pGIIss-IFN AM119, ja valinnaisesti valintamarkkeriplas-midilla pCG59D7.
15 Keksintö koskee myös menetelmää sellaisten transfor- manttien valmistamiseksi, joka käsittää sopivan isäntäso-lun käsittelemisen transformoivissa olosuhteissa tämän keksinnön mukaisella rekombinantti-DNA-molekyylillä, erityisesti keksinnön mukaisella hybridivektorilla, va-20 linnaisesti yhdessä valintamarkkerigeenin kanssa, ja valinnaisesti transformanttien valikoimisen.
Mikro-organismien transformointi suoritetaan tavanomaisten menetelmien mukaisesti kuten kirjallisuudessa on 25 kuvailtu, koskien esimerkiksi S. cerevisiaetä (A. Hinnen . . et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 1929, 1978), B.
..ΙΓ subtilista (Anagnostopoulos et ai., J. Bacteriol. 81.
ί,.,ϊ 741, 1961), ja E. colia (M. Mandel et ai., J. Mol. Biol.
53, 159,1970).
30 E. coli -solujen transformointimenettely sisältää sen mu- * kaisesti esimerkiksi solujen Ca2*-esikäsittelyn, mikä mah- · · dollistaa siten DNA:n sisäänoton, ja inkuboinnin hybridi- • · · vektorin kanssa. Sitä seuraava transformoitujen solujen • · · ·...· 35 valikointi voidaan saada aikaan esimerkiksi siirtämällä .·. : solut valikoivalle kasvualustalle, joka mahdollistaa .···. transformoitujen solujen erottamisen kantasoluista, mikä • » • · * 105206 44 riippuu vektori-DNA:n markkerisekvenssin laadusta. Edullisesti käytetään kasvualustaa, joka ei mahdollista vektoria sisältämättömien solujen kasvua. Hiivan transfor-mointi käsittää esimerkiksi vaiheet, joissa hiivan solu-5 seinä poistetaan entsymaattisesti glukosidaasien avulla, saatuja sferoplasteja käsitellään vektorilla polyety- * leeniglykolin ja Ca2*-ionien läsnä ollessa, ja soluseinä regeneroidaan siirrostamalla sferoplastit agarin sisään. »
Regeneraatioagar valmistetaan edullisesti tavalla, joka 10 mahdollistaa transformoitujen solujen regeneroinnin ja valikoimisen, kuten edellä on kuvailtu, samanaikaisesti.
Korkeampaa eukaryoottista alkuperää olevien solujen, kuten nisäkässolulinjojen, transformaatio saadaan edul-15 lisesti aikaan transfektion avulla. Transfektio suoritetaan tavanomaisilla menetelmillä kuten kalsiumfosfaat-tisaostuksella, mikroinjektiolla, protoplastien yhteen-sulauttamisella, elektroporaatiolla, so. DNA:n siirtäminen lyhyen sähköpulssin avulla, joka ohimenevästi lisää 20 solumembraanin läpäisevyyttä, tai auttajayhdisteiden kuten dietyyliaminoetyylidekstraanin, dimetyylisulfok-sidin, glyserolin tai polyetyleeniglykolin ja vastaavien yhdisteiden läsnäolon avulla. Transfektiomenettelyn jälkeen transfektoidut solut identifioidaan ja valikoidaan 25 esim. viljelemällä valikoivassa alustassa, joka on valit-. tu riippuen valintamarkkerin laadusta, esimerkiksi nor- maalissa viljelyalustassa kuten Dulbecco'n modifioidussa
:***: Eagle’n alustassa (DMEM), minimaaliperusalustassa, RPMI
··« ;*·*; 1640 -alustassa ja vastaavissa alustoissa, jotka sisältä- 30 vät esim. vastaavaa antibioottia.
i ·
Transformoituja isäntäsoluja viljellään alalla tunnetuil- • · · la menetelmillä nestemäisessä alustassa, joka sisältää assimiloituvia hiilenlähteitä, esim. hiilihydraatteja : 35 kuten glukoosia tai laktoosia, typpeä, esim. aminohap- ,·[ ; poja, peptidejä, proteiineja tai niiden hajotustuotteita • · · !..* kuten peptone ja, ammoniumsuolo j a tai vastaavia, ja epäor- • · 105206 45 gaanisia suoloja, esim. sulfaatteja, fosfaatteja ja/tai natriumin, kaliumin, magnesiumin ja kalsiumin karbonaatteja. Alusta sisältää lisäksi esimerkiksi kasvua edistäviä aineita kuten hivenaineita, esimerkiksi rautaa, sink-5 kiä, mangaania ja vastaavia hivenaineita.
Alusta valitaan edullisesti niin, että se aiheuttaa valintapainetta ja estää niiden solujen kasvun, jotka eivät ole transformoituneet, tai jotka ovat kadottaneet hybri-10 divektorin. Alustaan lisätään siten esimerkiksi antibioottia, jos hybridivektori sisältää antibioottiresis-tenssigeenin markkerina. Jos esimerkiksi käytetään isän-täsolua, joka on auksotrofinen välttämättömän aminohapon suhteen, kun sitä vastoin hybridivektori sisältää geenin, 15 joka koodittaa entsyymiä, joka täydentää isännän vajavuutta, käytetään minimaalialustaa, josta puuttuu mainittu aminohappo, transformoitujen solujen viljelemiseksi.
Korkeampaa eukaryoottista alkuperää olevia soluja kuten 20 nisäkässoluja kasvatetaan kudosviljelyolosuhteissa, käyttäen kaupallisesti saatavia alustoja, esimerkiksi Dulbec-co'n modifioitua Eagle*n alustaa (DMEM), mini-,,, maaliperusalustaa, RPMI 1640 -alustaa ja vastaavia alus- i t toja kuten edellä on määritelty, valinnaisesti täydennet- 25 tynä kasvua edistävillä aineilla ja/tai nisäkässeerumeil- ·.·. la. Soluviljelymenetelmät kudosviljelyolosuhteissa ovat #.*j* alalla hyvin tunnettuja ja sisältävät homogeenisen sus- :*]*: pension viljelyn, esim. ilmasekoitusreaktorissa (airlift- ) tai jatkuvatoimisesti sekoitinreaktorissa, tai im-30 mobilisoidun tai solusulkeumaviljelyn, esim. ontoissa kuiduissa, mikrokapseleissa, agaroosimikrohelmien pinnal-la, huokoisten lasihelmien pinnalla, keraamisten patruu- • ♦ · noiden pinnalla, tai muissa mikrokantajissa.
I < * * f · · i • · · 35 Viljely suoritetaan alalla tunnetuilla menetelmillä.
.·, : Viljelyolosuhteet, kuten lämpötila, alustan pH-arvo, ja * * · ρ···| fermentointiaika, valitaan siten, että keksinnön mukaista • · * I · JS 105206 polypeptidiä tai johdannaista saadaan maksimitiitteri. E. coli - tai hiivakantaa viljellään siten edullisesti aerobisissa olosuhteissa pinnanalaisviljelmänä ravistellen tai sekoittaen noin 20°C-40°C:n lämpötilassa, edullisesti 5 noin 30°C:ssa, ja pH-arvossa 4-8, edullisesti noin pH 7:ssä, noin 4-30 tunnin ajan, edullisesti niin kauan kunnes keksinnön mukaisesta polypeptidistä tai johdannaisesta saavutetaan maksimisaannot. » 10 Transformoituneiden solujen valikoimisen mahdollistamiseksi transformoitumattomista soluista, keksinnön mukaiset DNA-molekyylit sisältävät valin-tamarkkerin tai, vaihtoehtoisesti, solut transformoidaan yhdessä toisen vektorin kanssa, joka sisältää sellaisen 15 markkerin. Muiden systeemien tavoin sellainen valin-tamarkkeri on ilmentyvä rakennegeeni, jonka ilmentämä polypeptidi (entsyymi) antaa resistenssin yhdisteitä vastaan, jotka ovat toksisia saajaorganismille, tai joka täydentää mutantin entsyymisysteemin, jolta puuttuu sel-20 lainen välttämätön polypeptidi. Sellaisia merkkigeenejä, jotka ovat sopivia transformoitujen rihmasienisolujen valikoimiseen, ovat esimerkiksi tunnetut aa-2-. pyrG-. trpC-. amdS- tai aroB-oeenit.
25 Kuten EP-278.355:ssä on kuvailtu, pyrA-niminen merkkigee-ni eristettiin A. niaerln genomisesta kirjastosta, joka geeni liittyy läheisesti ja toimii samalla tavoin kuin A.
m u · nidulansin pyrG ja N. crassan pyr4. nimittäin tuottaen m.fl : entsyymiä orotidiini-5'-fosfaattidekarboksylaasi. Tämä 30 entsyymi katalysoi orotidiini-5'-fosfaatin dekarbok- syloitumista uridyylihapoksi (uridiini-5' -fosfaatti), ja myös fluorioroottihapon toksiseksi fluoriuridiiniksi. E. coli -klooni, joka sisälsi pyrA-aeenin. identifioitiin
«M
hybridisoimalla pDJB2:n 1,1 ke HindiII-fragmentin kanssa • · · ~ ·...· 35 (viite 25), joka sisälsi osan pyr4-aeenistä. Jonkin muun 9 :*·.· pyr-qeenln DNA:ta voidaan kuitenkin käyttää, joka koodit- • · .···. taa orotidiini-5'-fosfaattidekarboksylaasia. Positiivi- • · 105206 sesta kloonista, nimeltä E. coll B75183/pCG59D7, eristettiin plasmidi pCG59D7, joka sisältää pyrA-qeenin, ja sitä käytettiin A. nlaer pyrA~~"utantin kotransformointiin. Sellaisesta pyrA~~"utantista puuttuu orotidiini-5'-fos-5 faattidekarboksylaasin geeni, ja se on sen vuoksi kykene-, mätön tuottamaan vastaavaa entsyymiä. Sellainen mutantti valmistettiin käsittelemällä A. niaer N756:n konidiospo-reja mutatoivassa UV-säteilyssä, ja pesäkkeet, jotka säilyvät elinkykyisinä fluorioroottihapon ja -uridiinin 10 läsnä ollessa, valikoidaan. Pesäkkeet, jotka säilyvät elinkykyisinä fluorioroottihapon läsnä ollessa ja uridiinin puuttuessa, eliminoidaan. Jäljelle jääneet uridiiniä tarvitsevat mutantit kuuluvat, niiden transformoitavuuden mukaan, kahteen komplementaatioryhmään, pyrA:hän ja pyrB-15 :hen, joita edustavat mutantit An8 ja vastaavasti AnlO. Niitä käsitellään protoplastimuodossa transformoivissa olosuhteissa pyrA:ta sisältävän plasmidin pCG59D7 kanssa. Vain An8-pesäkkeiden todettiin transformoituvan ja sisältävän pyrA-qeenin, minkä osoitti siitä pilkotun DNA:n 20 hybridisaatiokyky pUNl2l:n DNA:n kanssa.
Polypeptidien valmistaminen ,,, Keksintö koskee lisäksi menetelmää polypeptidien valmis- tamiseksi, jolle on tunnusomaista, että homologinen tai 25 heterologinen rakennegeeni, esimerkiksi sellainen, jonka merkitys on esitetty edellä, liitettynä keksinnön mukai-seen ekspressiokasettiin, ilmennetään sopivassa transfor- • > · :,.,5 moidussa isännässä tavanomaisten menetelmien mukaisesti.
:T: Tarvittaessa polypeptidi eristetään tavanomaiseen tapaan.
30 Riippuen ekspressiokasetin rakenteesta, tuotteita joko tuotetaan tai, jos signaali sekvenssi on läsnä, tuotetaan ja eritetään. Ekspressiokasetti sisältyy tavallisesti hybridivektoriin mutta voi myös tulla liitetyksi isännän • · · genomiin • · · ·...* 35 transformoinnin jälkeen.
• · lii • · · » ·
Sopiva isäntä on esimerkiksi sieni, esim. rihmasieni, * · 105206 48 erityisesti Aspergillus-kanta. jos keksinnön mukaisesta PG-geenistä peräisin olevaa promoottoria tai muuta rih-masienistä saatua promoottoria käytetään homologisen tai heterologisen rakennegeenin ilmentämiseen. Jos muita 5 promoottoreita kuitenkin käytetään, esimerkiksi sellaisia, jotka ovat peräisin prokaryooteista tai korkeammista eukaryooteista, muut isännät ovat sopivia, esimerkiksi bakteerit kuten E. coli, tai vastaavasti korkeammat , eukaryoottiset solut.
10 A. niqerin PG-geenien promoottorit ovat indusoituvia A. niaer -solussa, so., niihin kiinnittyneen rakennegeenin ilmentymistä, esim. rakennegeenin, joka koodittaa PG:tä tai jonkin vieraan geenin ilmentymistä, indusoi pektiinin 15 tai pektiinin hajotustuotteiden lisääminen alustaan.
Riittävän glukoosimäärän läsnä ollessa promoottori ei kuitenkaan ole indusoituva, jos isäntänä käytetään A. niaer -kantaa, esim. An8:aa tai N593:a. Tämä tarkoittaa sitä, että geenit, jotka ovat A. niqerin PG-promoottorin 20 ohjauksessa, ovat "kataboliitti-repressoituja" A. niqer-issä. Jos kuitenkin käytetään toista Asperqillus-kantaa. edullisesti A. orvzaetä tai edullisimmin A. nidulansia, A. niqerin PG-promoottorin ohjauksessa oleva geeni ilmentyy konstitutiivisesti, so. myös pektiinin poissa ollessa 25 ja/tai glukoosin läsnä ollessa. Siitä johtuen voi olla edullista ilmentää geenejä A. niqerin PG-promoottorin ohjauksessa muussa Asperaillus-isännässä kuin A. niqeris- ·»· sä, edullisesti A. orvzaessä tai edullisimmin A. nidulan-ί sissa, koska esimerkiksi glukoosia voidaan pektiinin 30 sijasta lisätä ravintoalustaan energian- ja hiilenläh- ♦j·*; teeksi halutun geenin ilmentämisen aikana.
·#· • · · • · ♦ « · · ...ί Jos käytetään promoottoria, joka ei ole peräisin tämän M » ·...* 35 keksinnön mukaisesta PG-geenistä, keksinnön mukaisen eks- .·. : pressiokasetin konstruointiin, esim. joka sisältää PG:tä • · .···. koodittavan rakennegeenin, muita isäntiä voidaan käyttää » · • » · 105206 49 ekspressioisäntinä. Sopivat isännät ovat riippuvaisia käytettävästä promoottorista ja ovat esim. bakteereja kuten E. coli. tai hiivoja kuten S. cerevisiae tai Kluv-veromvces lactis. Sopivia isäntiä ja promoottoreita kek-5 sinnön mukaisten polypeptidien valmistamiseen ovat myös ne, jotka edellä esitettiin sopivina transformaatiota varten.
Tällä hetkellä on mahdollista yli-ilmentää yhtä tai use-10 ampaa haluttua PG:tä, jossa yhteydessä voidaan käyttää useita eri menetelmiä. Puhdistettua yksittäistä PG:tä voidaan valmistaa soveltamalla tavanomaisia puhdistus-menetelmiä pektinolyyttisiä entsyymejä sisältävään seokseen, joka sisältää PG:a. Toiselle menetelmälle, yk-15 sittäisen PG:n tuottamiseksi, edullisesti PGI:n, PGII:n tai paaC-aeenltuotteen tuottamiseksi, on tunnusomaista se, että sopiva isäntä, joka ei kykene ilmentämään mitään PG:tä, tai joka ilmentää PG:tä vähäisessä määrin, tai joka ei ilmennä PG:tä liitetylle PG-geenille käytettävis-20 sä induktio-olosuhteissa, transformoidaan hybridivek-torilla, joka sisältää rakennegeenin, joka koodittaa PG:tä, esim. PGI:tä, PGII:ta tai pqaC-qeenituotetta. tai ... PG:n fragmenttia, jossa on PG-aktiivisuutta, ja että ; mainittu rakennegeeni ilmennetään. Jos käytetään isäntää, 25 joka ei kykene ilmentämään mitään PG:tä, vastaava yksittäinen PG voidaan saada puhtaassa muodossa, se tar- ..ΙΓ koittaa, minkään muun PG:n kontaminoimatta. On myös mah- ··· Σ,.,· dollista tuottaa ennalta määriteltyjä PG-seoksia, valin- naisesti yhdessä muiden entsyymien kanssa, ilmentämällä 30 transformoidussa isännässä ei ainoastaan yhtä vaan useam-paa kuin yhtä haluttua PG-geeniä, valinnaisesti yhdessä * muita entsyymejä koodittavien geenien kanssa. Ennalta • · · määriteltyjä seoksia voidaan myös saada aikaan il- ...: mentämällä yhtä tai useampaa haluttua PG:n ja/tai muiden • · · ·...· 35 entsyymien geeniä, esim. pektiiniesteraasien, pek- « .·. : tiinilyaasien, sellulaasien, sekaendoglukanaasien, hemi- • · .·♦·. sellulaasien, ksylanaasien, arabinaasien, galaktanaasien, * ♦ • »· 105206 50 a- ja β-glykosidaasien ja vastaavien entsyymien geeniä, isäntäkannassa, valinnaisesti sellaisessa, jolla on tietyt edellytykset entsyymituotannossa.
5 Ennalta määriteltyjä entsyymiseoksia voidaan myös saada jakamalla osiin tiettyjä PG-geenejä isännässä "geenien hajaannuttamisen" avulla, mikä on alalla hyvin tunnettua tekniikkaa, käyttäen eristettyjä keksinnön mukaisia PG- * geenej ä.
10
Isäntä, joka ei kykene ilmentämään mitään PG:tä, on joko mikro-organismi, jolla ei ole vastaavaa geeniä, esim. PG' Aspergillus-kanta. toinen PG~-ei-Asperaillus-sieni tai jokin muu eukaryoottinen tai prokaryoottinen PG*-solu, tai 15 Aspergillus-kanta. esim. A. orvzae tai A. nidulans, joi den endogeenisten PG-geenien ilmeneminen on estetty sopivasti kulutetussa kasvualustassa, esim. se on "katabo-liittirepressoitu" ja/tai indusoitumaton, kun taas ek-sogeeninen PG-promoottori, joka on toimivasti kytketty 20 haluttuun PG-rakennegeeniin, esim. A. niger -peräinen promoottori, on aktiivinen näissä olosuhteissa, tai kun PG-geeni on yhdistetty toiseen promoottoriin.
Muut promoottorit ja kannat, jotka ovat sopivia PG-ent-25 syymien valmistukseen, ovat samoja, joita edellä on esitetty kuvattaessa ekspressiokasetteja.
··· • · · «
• M
·’...· Polypeptidit 1a koostumukset ::ί Pektinolyyttisiä entsyymejä sisältävästä seoksesta puh- 30 distetut yksittäiset PG:t, edullisesti Aspergillus niger-peräisestä pektinolyyttisten entsyymien seoksesta, eri-tyisesti RapidaseR:sta, ja PG:t, joita tämän keksinnön • · · mukainen DNA-sekvenssi koodittaa, ja niiden johdannaiset, • « · joissa on PG-aktiivisuutta, jos ne on erityisesti tuotet- • · « ·...· 35 tu sopivassa isännässä, joka on transformoitu ekspres- : siohybridivektorilla, joka koodittaa sellaista PG:tä tai • · .···. sen PG-aktiivista johdannaista, ja sen fysiologisesti • · 105206 51 hyväksyttävät suolat ovat myös tämän keksinnön mukaisia kohteita. Erityisen edullisia ovat Aspergillus nlaerin PGI, PGII, PGIIIA, PGIIIB ja PGIV puhdistetuissa muodoissa. Keksintö koskee mainittuja polypeptidejä aina kun ne 5 on tuotettu tämän keksinnön mukaisella menetelmällä.
Keksintö koskee lisäksi entsymaattisia koostumuksia, jotka sisältävät yhden tai useamman sellaisen yksittäisen PG:n ja/tai sen johdannaisen, jossa on PG-aktiivisuutta, 10 ja/tai sen biologisesti hyväksyttäviä suoloja, valinnaisesti ennalta määriteteltynä yhdistelmänä yhden tai useamman sopivan entsyymin kanssa, jolla on muuta kuin PG-aktiivisuutta.
15 Muuta kuin PG-aktiivisuutta sisältäviä entsyymejä, jotka ovat sopivia mainittujen entsyymikoostumusten valmistukseen, ovat kasvisolun seinämän polymeerejä hajottavat ja modifioivat entsyymit. Sellaisia entsyymejä ovat esim. pektiiniesteraasit, pektiinilyaasit, sellulaasit, sekaen-20 doglukanaasit, hemisellulaasit, ksylanaasit, arabinaasit, galaktanaasit, a- ja β-glykosidaasit, ja vastaavat entsyymit.
I 1 I I I I
Tämä keksintö koskee lisäksi mainittujen entsyymikoos-
I I I
25 tumusten valmistusta tavanomaisella tavalla.
m .,*·* Mainittujen yksittäisten PG-entsyymien ja/tai niiden PG- aktiivisten johdannaisten ja/tai mainittujen entsymaat-tisten koostumusten käyttö kasviaineksen käsittelyssä on 30 myös tämän keksinnön kohteena.
« • · - .«·, Yksittäiset keksinnön mukaiset PG:t ja/tai niiden PG- • · · aktiiviset johdannaiset tai sellaista PG:tä tai johdan-naista sisältävät entsymaattiset koostumukset ovat käyt- • · t 35 tökelpoisia esim. kasvi- tai hedelmämehun kirkastuksessa, .·. : mehusaannon lisäämiseksi kasvi- tai hedelmämehu tuot annos- f · · ,··[ sa ja puristussaannon lisäämiseksi öljyä sisältävistä • · • I « 105206 52 siemenistä tai hedelmistä, kasvi- tai hedelmämehun stabi-loimiseksi, kasvi- tai hedelmämehun viskositeetin alentamiseksi, biomassan nesteyttämiseksi, liotukseen, luonnontuotteiden kuten luonnollisten pigmenttien, aromin ja 5 mausteiden uuttautumisen lisäämiseksi, biomassan, elintarvikkeiden tai rehun arvouttamiseksi, sei- * luloosakuitujen talteenoton parantamiseksi paperimassan-valmistuksessa ja vastaavissa systeemeissä.
10 Edullisimmat keksinnön mukaiset suoritusmuodot ovat niitä, joita kuvaillaan jäljempänä esimerkit-jaksossa.
Kuvio 1: Faagi lambda-D:n ja lambda-E:n EcoRI-fraa- menttien osittaiset restriktiokartat, jotka on saatu A.
15 niaerin genomisesta kirjastosta hybridisaation avulla yhdistettyjen koettimien HR6195:n ja HR6196:n kanssa, jotka koodattavat osaa PGII-geenistä. Numerot osoittavat likimääräisiä etäisyyksiä kiloemäspareissa oikeanpuoleisista EcoRI-kohdista.
20
Kuvio 2: pGW1800:n osittainen restriktiokartta. Plasmidi sisältää vektorin pEMBL18 DNA:ta ja 4,1 kep:a sisältävän Xbal/EcoRI-insertin. joka on saatu faagi lambda-E:stä, joka sisältää A. nioer N400:n PGII-geenin. Ap on ampisil-25 liiniresistenssigeeni ja nuolet osoittavat A. nioer -peräisen DNA:n.
··· ···· * ·
Kuvio 3: pGW1900:n osittainen restriktiokartta. Se koos- « ·· V · tuu pUC9-vektorista ja faagi PGI-lambda-7:n 8,6 kep Bam- 30 HI-fragmentista.
« · ·*·*; Kuvio 4: Kloonausstrategia plasmideille pGII-IFN AM119 ·. ja pGIIss-IFN AM119.
« « · «.«<« • · · « · ’··* 35 Kuvio 5: DNA-inserttien, DNA 5:n ja DNA 6:n, asteit- täinen valmistaminen pGII-IFN AM119 -plasmidin ja vas- • · taavasti pGIIss-IFN AM119 -plasmidin konstruoimista var- 53 105206 ten polymeraasiketjureaktio(PCR)-menetelmän avulla.
Kuvio 6: pGW1756:n osittainen restriktiokartta. pGW1756 on 5,5 kep XhoI-Bglll-fragmentti, joka kuljettaa A. niaer 5 NW756:n polygalakturonaasi II -geeniä liitettynä vek toriin pEMBL18. Vektorissa olevia restriktiokohtia ei esitetä. Fragmentin ensin mainitut XhoI- ja BglII-kohdat esitetään myös, mutta nämä on tuhottu liittämällä vektorin Sali- ja vastaavasti BamHI-kohtiin.
10
Kuvio 7: pGW1910:n osittainen restriktiokartta. pGW1910 on lambda-faagi lambda-PG-C20:n 7,8 kep Bqlll-fragmentti liitettynä vektori pUC9:n BamHI-kohtaan. PGC (pgaC)-geeniä koodittavan A. niaer N400:n geenin likimääräinen 15 sijainti osoitetaan.
Seuraavat esimerkit auttavat valaisemaan keksintöä, eivät kuitenkaan millään tavalla tarkoitettuna rajoittamaan sitä.
20
Lyhenteillä on seuraavat merkitykset: .': Amp ampisilliini
I I
bis Tris bis(2-hydroksietyyli)imino-tris(hydroksimetyy- ( t 25 li)metaani ' . BSA naudan seerumin albumiini ··· ···· DTT 1,4-ditiotreitoli • t '···’ EDTA etyleenidiamiinitetraetikkahappo, dinatrium • · · ·.* * suola 30 IPTG isopropyyli-p-D-tiogalaktopyranosidi *;·” kbp kiloemäsparia (kep) :T: PEG polyetyleeniglykoli \ PTH fenyylitiohydantoiini SDS natriumdodekyylisulfaatti « 35 Tet tetrasykliini :*.i TFA trif luorietikkahappo TP trypsiinipeptidi • * « 54 105206
Tris tris(hydroksimetyyli)aminömetaani X-gal 5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-3-galaktosidi
Puskurit, alustat, reaaenssit SM 100 mM NaClra, 8,1 mM MgS04ra, 50 5 mM Tris-HCl:a pH 7,5, 0,01 % gelatii nia LB 1 % tryptikaasipeptonia (BBL), 0,5 % hiivauutetta (BBL), 1 % NaCl:a ja 0,5 mM Tris-HCl:a pH 7,5 10 LM 1 % tryptikaasipeptonia (BBL), 0,5 % hiivauutetta (BBL), 10 mM NaCl:a ja 10 mM MgCl2:a PBS 0,37 g NaH 2P04ra, 2,7 g Na2HP04ra, 8,5 g NaCl:alitraa kohti H20:ta 15 SSC 0,15 M NaClra, 0,015 M tri-natrium— sitraattia
PSB 10 mM Tris-HCl:a, pH 7,6, 100 mM
NaClra, 10 mM MgCl2ra, 0,05 % (paino/-tilavuus) gelatiinia.
20 TE 10 mM Tris-HClra pH 8,0, 0,1 mM EDTAra pH 8,0 minimaalialusta 1 litra sisältää 1,5 g KH2P04ra, 0,5 g KClra, 0,5 g MgS04.7H,0rta, 0,9 mg ZnS04-7H20rta, 0,2 mg MnCl2.4H20rta, 0,06 mg CoCl2.6H2Orta, 0,06 mg CuS04.-25 5H20rta, 0,29 mg CaCl2.6H20rta, 0,2 mg ‘ , FeS04.7H20rta, typen- ja hiilenlähteitä ··· kuten tekstissä on määritelty tai 6 g * · ’···* NaN0,ra ja 10 g glukoosia litraa kohti, V ° ellei näitä lähteitä mainita selvästi, 30 säädettynä pH-arvoon 6,0 NaOHrlla *:*·: täydellinen alusta minimaalialusta, jossa 6 g NaN03ra ja 10 g glukoosia litraa kohti, lisäksi litraa kohti 2 g trypti-kaasi- « f i w '".I peptonia (BBL), 1 g kasamino- happoja 35 (DI f co), 1 g hiivauutetta (BBL), 0,5 g ribonukleiinihapon natriumsuolaa hii-vasta (ICN, Cleveland, USA), 2 ml
»M
55 105206 vitamiiniliuosta, säädettynä pH-arvoon 6,0 NaOH:11a vitamiiniliuos 100 ml:aa kohti 10 mg tiamiinia, 100 5 mg riboflaviinia, 10 mg pantoteenihap- poa, 2 mg biotiiniä, 10 mg p-amino-bentsoehappoa, 100 mg nikotiiniamidia, 50 mg pyridoksiini-HCl:a 10 TBE 1 litra sisältää 4 ml 0,5 M EDTA-liu- osta pH 8,0, 10,8 g Tris:a ja 5,5 g H3BO3: a fenoli fenoli käsiteltynä kuten Maniatis et 15 ai. ovat kuvailleet (s 438; viite 6) näytepuskuri 10 % (tilavuus/tilavuus) glyserolia, 100 mM EDTA:a pH 8,0 ja 0,01 % bromi-fenoli sinistä 20 RNaasi ARNaasi A käsiteltynä kuten Maniatis et ai. ovat kuvailleet (s. 451; viite 6) 25 Seuraavia kantoja käytetään: m ··· A. nioer N400 villityyppi • ·
*···* A. niaer N402 cspA
IM
V * A. nioer NW756 runsaasti pektinaasia tuottava kanta 30 A. nioer N756 runsaasti pektinaasia tuottava kanta ”·*! A. nioer An8 DSM 3917, uridiiniauksotrofinen pek- tinaasikompleksia runsaasti tuottavas- *. takannasta A. nioer N756 « * «
*::: A. nioer N593 cspA. pyrA
« 1 35 E. coli NM539 metB, supE. hsdM*. hsdR'- supF. (P2co- x3) • · E. coli LE392 F"' hsdR514(rk'’mk*), supE44. supF58.
« « · 105206 56 lacYl. tai (laclZY)6, oalK2.galT22. metBl, trpR55, lambda" E. coli DH5aF' F', endAl, hsdR17. (rk”mk1), supE44.
thi- 1, recAl. avrA. (rej.Al. ) δΟφΙβσΖ 5 M15, A(lacZYA-araF)ul69. lambda”
E. coli JM109 endAl, recAl. qyrA96. thi. hsdR17(rk'· T
mk1), relAl. supE44. lambda”· (lac-proAB), [FI, traD36, proAB. laclqZ M15] 10 E. coli JM110 rpsL. thr, leu, thi. lacY. qalT, ara.
tonA, tsx, dam, dcm, supE44. (lac-proAB). [F', traD36. proAB. laclqZ
M15]
I 1 I
·· ·
MM
• · · • · • Γ • · · • · « • · · • · · a · IM • · · • · m 9 9 « I I <
« f f I
«ft I « « 1 « · · a • a • 1 a • · « • · a · • · • a • · · 5 57 105206
Seuraavia vektoreita käytetään PGW613
Goosen et ai., 13, ovat kuvailleet tätä plasmidia.
M13mp-faagi M13mpl8- ja M13mpl9-vektorit (Norrander et ai., 24) ovat , johdannaisia yksijuosteisesta DNA-bakteriofagista M13, ja ne on suunniteltu helpottamaan DNA:n sekvensointia mah-10 dollistamalla DNA-fragmenttien kloonaus monikäyttöisessä monikytkijäkohdassa ja saman restriktiofragmentin kloonaus molempiin mahdollisiin suuntiin. Näihin vektoreihin kloonattuja sekvenssejä voidaan helposti käyttää temp-laatteina sekvensointireaktioissa tai yksijuosteisten 15 koettimien tuotannossa, käyttäen normaalia oligodeok- siribonukleotidialuketta ja E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmenttia. Vektori-DNA kuljettaa E. colin lac-operonin promoottoria ja geneettistä informaatiota β-galaktosidaasin 145:stä ensimmäisestä aminohaposta. Moni-20 kytkijäsekvenssit, jotka sisältävät monirestriktiokohtia, liitetään IacZ-sekvenssiin. Monikytkijä säilyttää lacZ-lukukehyksen ja vektori saa aikaan LacZa-isäntäkannassa alleelikomplementaation, mikä tuottaa sinisiä plakkeja maljoilla, jotka sisältävät IPTG:tä ja X-gal:ia. Rekom-25 binanttifaagit, jotka sisältävät inserttejä, jotka tuhoa-vat lukukehyksen tai muutoin häiritsevät lavZa-peptidin ”** ilmentymistä, ilmenevät värittöminä plakkeina.
• · • · • v · • · · V 5 PGW635 " 30 Plasmidi on lyhyempi versio plasmidista pGW6l3. Se sisäl- ”*** tää myös pyrA-geenin. Goosen et ai·, 42, kuvailevat sitä.
• ·« T · t · • · · EMBL4 « » I ' T,!( EMBL4 on lambda-vaihtovektori, jonka kloonauskapasiteetti 35 on 9-23 kep:a (Frischauf et ai., 9). Se sisältää moni-
I I
:,*·| kloonausalueen lambda-käsivarsien ja epäolennaisen täyte- : i alueen välissä. Tämä mahdollistaa monirestrik- • · · 58 10E206 tioentsyymipilkkomisten suorittamisen sellaisella tavalla, että täytealueen uudelleen liittyminen vektorin käsivarsiin vähenee, kun kiinnostuksen kohteena olevaa vierasta DNA:ta liitetään. Vektorissa käytetään hyväksi myös 5 Spi-fenotyyppiä, mikä saa aikaan rekombinanttien suoran valikoinnin (Zissler et ai., 21). * PEMBL18 1a PEMBL19
Dente e£ ai. (10, 22, 23) ovat kuvailleet näitä plasmide-10 ja.
Esimerkki 1: Polvoalakturonaasln eristäminen 1a karakte-15 risointi
Esimerkki 1.1: Polvaalakturonaasien I, II. IlIA. Ilib 1a IV puhdistaminen
Entsyymiaktiivisuus määritetään entsyymifraktioista, 20 jotka saadaan jäljempänä kuten edellä on kuvailtu (Rozie et ai., 2), käyttäen modifioitua ferrisyaniditestiä .'. (Roby t et ai., 3).
I I I
! f i i ( i
Polygalakturonaasit I, II, IIIA, IIIB ja IV puhdistetaan I _ 25 Rapidase :sta, kaupallisesti saatavasta, pektinolyyttisiä entsyymejä sisältävästä seoksesta, joka saadaan Aspergil- • · lus nioeristä (Gist-brocades, S6clin, Ranska). 50 g raa- • ·· *.* · kaa entsyymi jauhetta (Erä-n:o K2B 078) liuotetaan 190 ml:aan 20 mM natriumasetaattipuskuria pH 3,6, sentrifu- *:·*: 30 goidaan 10 min. nopeudessa 25 000 g kiinteiden aineiden poistamiseksi, ja suola poistetaan Sephadex G-50 -kolon- *, nilla (5 x 90 cm), joka on tasapainotettu samassa pus- • · · ··· kurissa.
• · · • • · • · · 35 Ensimmäinen vaihe puhdistusmenettelyssä on affiniteettik- • · romatografointivaihe, jossa käytetään ristikytkyalginaat- • · · tia, jonka kolonnitilavuus on 5,2 mg/g, joka tasapainote- 105206 59 taan myös 20 mM natriumasetaattipuskurilla pH 3,6 (kolo-nnidimensiot 2,5 x 30 cm). Entsyymi, josta suola on poistettu, ladataan tähän kolonniin ja pestään sen jälkeen käyttäen 100 mM natriumasetaattipuskuria pH 4,2:ssa ja 5 vastaavasti 5,6:ssa (400 ml kumpikin). Siinä missä PGI ja PGII adsorboituvat alginaattimatriisiin, PG:t IIIA, IIIB ja IV eivät absorboidu.
Esimerkki 1,1.1: PGI:n 1a PGII:n puhdistaminen 10 Adsorboituneet PGI- ja PGII-proteiinit eluoidaan ris- tikytkyalginaattikolonnista lineaarisen natriumkloridig-radientin (0-1 M) avulla 100 mM natriumasetaattipuskuris-sa pH:ssa 5,6, joka on lievä modifikaatio aikaisemmin käytetystä menetelmästä (Rombouts gt gl., 1). PGI eluoi-15 tuu yhdessä PGII:n kanssa noin 0,5 M NaCl-pitoisuudessa.
PGI:n ja PGII:n sisältävää entsyymifraktiota dialysoidaan 20 mM natriumasetaattipuskuria pH 5,7 vastaan, ja se sijoitetaan DEAE-Sephadex A-50 -kolonniin (2,5 x 30 cm), 20 joka on tasapainotettu samassa puskurissa. Entsyymit eluoidaan käyttäen lineaarista NaCl-gradienttia (0-0,6
M). PGI eluoituu noin 0,3 M NaCl:ssa, PGII noin 0,2 M
NaCl:ssa. Entsyymifraktiot, jotka sisältävät PGI:tä ja PGII:ta, kerätään erikseen, dialysoidaan 20 mM bis-Tris- ' 25 HCl:a pH 5,8 vastaan ja kromatografoidaan DEAE-Sepharose
Fast Flow -kolonnilla, joka on tasapainotettu samassa *...· puskurissa. Käytettäessä NaCl-gradienttia, PGII eluoituu • ·· V* suunnilleen 120 mM natriumkloridissa, PGI noin 250 mM:- ssa. Aktiiviset entsyymifraktiot, jotka sisältävät PGI:tä ·:**: 30 ja PGII:ta, väkevöidään dialysoinnin jälkeen 20 mM natri- :*·*: umasetaattipuskuria pH 5,7 vastaan lopputilavuuteen 25 ml pienellä DEAE-Sepharose Fast Flow -kolonnilla (1,6 x 10 ··· cm), eluoimalla 1 M natriumkloridilla tässä puskurissa.
• · *”·* Kummankin kahden entsyymin, PGI:n ja PGII:n, lopullinen :*·.· 35 puhdistaminen saadaan aikaan geelipermeaatio- • · ;*’*· kromatografian avulla Sephacryl S200 -kolonnilla (1,6 x ·»» 90 cm) 0,1 M natriumasetaatissa pH 4,2:ssa.
«„ 105206 PGII tuottaa yhden ainoan vyöhykkeen SDS-polyak-ryyliamidigeelielektroforesoinnissa ja sen näennäinen molekyylimassa on 38 kDa. Spesifinen aktiivisuus on 2760 5 U/mg proteiinia, määritettynä 0,075 M natriumasetaat- tipuskurissa pH 4,2:ssa. Isoelektrisessä fokusoinnissa ' entsyymissä esiintyy mikroheterogeenisyyttä. Huomattavan pääkomponentin lisäksi suunnilleen pH:ssa 5,2, suuri määrä vähäisempiä vyöhykkeitä havaitaan pH-alueella 4,6 -10 5,9.
Myös PGI:ssä esiintyy yksi ainoa vyöhyke SDS-polyakryyli-amidielektroforeesissa. Tämän entsyymin näennäinen mole-kyylimassa on 55 kDa. Spesifinen aktiivisuus on 550 U/mg 15 proteiinia, määritettynä 0,075 M natriumasetaattipus- kurissa pH:ssa 4,2. Isoelektrisessä fokusoinnissa entsyymissä esiintyy myös mikroheterogeenisyyttä. Useita vyöhykkeitä havaitaan pH-välillä 3,2 - 3,5.
20
Esimerkki 1.1.2.: PGIIIA:n. PGIIIB:n la PGIV:n puhdis-, taminen
Ristikytkyalginaattikolonnin effluentti (esimerkki 1.1), joka sisältää sitoutumattomat PG:t, säädetään pH-arvoon 25 5,7 1 M natriumhydroksidin avulla ja ladataan DEAE-Sepha- dex A-50 -kolonniin (2,5 x 30 cm), joka on tasapainotettu ·*** 0,02 M natriumasetaattipuskurissa pH:ssa 5,7. Entsyymit • · v ’ eluoidaan DEAE-Sephadex-kolonnista lineaarisen natrium- kloridigradientin (0-1 M) avulla. PGIV eluoituu 0,38 M ;··; 30 natriumkloridissa, PGIIIA ja PGIIIB eluoituvat yhdessä 0,5 M natriumkloridissa.
* ··· 5 ml:sta kumpaakin kahta entsyymifraktiota poistetaan
suola Sephacryl S-200 -kolonnilla (1,6 x 90 cm) 0,1 M
:*·.· 35 natriumasetaattipuskurissa pH:ssa 4,2. Aktiiviset frak- • « tiot kerätään yhteen, laimennetaan viisinkertaisesti • · · tislatulla vedellä ja ladataan MONO Q -kolonniin (Pha- 105206 61 rmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi), joka on tasapainotettu 0,02 M bis-Tris/HCl-puskurissa pH:ssa 5,8. Käytettäessä 20 ml lineaarista natriumkloridigradienttia (0,1-0,4 M), PGIV eluoituu 0,32 M natriumkloridissa, kun 5 taas PG:t IIIA ja IIIB eluoituvat yhdessä 0,4 M natriumkloridissa.
Kumpikin entsyymifraktioista kromatografoidaan uudelleen erikseen MONO Q -kolonnilla edellä kuvailluissa olosuh-10 teissä. PG-aktiivisuutta sisältävät fraktiot kootaan
yhteen, dialysoidaan 0,025 M piperatsiini/HCl-puskuria pH
6,0 vastaan ja ladataan MONO P -kolonniin (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi), joka on tasapainotettu samassa puskurissa. Kolonni eluoidaan 10-%:isella (tila-15 vuus/tilavuus)monipuskuri 74:llä (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi) pHrssa 3,0 virtausnopeudella 0,75 ml/min.
Lopullinen puhdistaminen suoritetaan geelipermeaatiok-20 romatografialla TSK G 3000 SW -kolonnilla (0,75 x 30 cm) (LKB, Bromma, Ruotsi), joka on tasapainotettu 0,05 M natriumfosfaattipuskurissa pH:ssa 6,2, virtausnopeudella 0,5 ml/min.
25 Kolonni kalibroidaan seuraavilla proteiinistandardeilla: naudan seerumin albumiini (68 kDa); muna-albumiini (45 *·..· kDa) ja kymotrypsinogeeni A (25 kDa).
··· • · · • · · • Näennäinen molekyylin massa 53 kDa määritetään PGIV:lie *:**: 30 geelipermeaatiokromatografian avulla. PGIVrssä esiintyy :*·*; yksi ainoa vyöhyke SDS-polyakryyliamidigeelielektroforee- sissa, ja sen näennäinen molekyylimassa on 59 kDa määri- • · · *·*! tettynä elektroforeesilla 15-%:isella polyak- • t '···' ryyliamidigeelillä. Spesifinen aktiivisuus on 780 U/mg 35 proteiinia, määritettynä 0,075 M natriumasetaattipus- • « kurissa pH:ssa 4,2. Isoelektrisessä fokusoinnissa entsyy- • f missä esiintyy yksi selvästi erottuva vyöhyke pHrssa 3,7.
62 105206 PGIIIArta ja PGIIIB:tä sisältävien aktiivisten fraktioiden geelipermeaatiokromatografiasta, kalibroidulla TSK G 3000 SW -kolonnilla, samoissa olosuhteissa kuin 5 PGIV:lle kuvailtiin, oli tuloksena ko. kahden entsyymin erottuminen, näennäisten molekyylimassojen ollessa 32 ja vastaavasti 52 kDa. SDS-polyak- ryyliamidigeelielektroforeesissa (15-%:inen polyak- - ryyliamidigeeli) kuitenkin molemmilla entsyymeillä esiin-10 tyy yksi ainoa vyöhyke, joilla on identtinen molekyyli- massa 57 kDa. PGIIIA:n ja PGIIIB:n spesifinen aktiivisuus on 150 ja vastaavasti 250 U/mg proteiinia, määritettynä 0,075 M natriumasetaattipuskurissa pH:ssa 4,2. Isoelekt-risen fokusoinnin yhteydessä kummallakin entsyymillä 15 esiintyy yksi selvästi erottuva vyöhyke pH-arvossa 3,3.
Esimerkki 1.2.: Polyqalakturonaasien ominaisuuksien vertailu 1a niiden immunologinen yhteys Lähtien 50 g:sta Rapidasea (Gist-brocades, S6clin, Rans-20 ka), viisi endopolygalakturonaasia puhdistetaan kuten esimerkissä 1.1. on kuvailtu. Näiden puhdistettujen ent-syymien ominaisuudet esitetään yhteenvetona taulukossa II.
! Taulukko II. Viiden A. niqer -polyqalakturonaasin fysi- 25 kaalis-kemiallisia ominaisuuksia 1a pH-ootlmit
Entsyymi Mr* I.E.P.b oH-ootimi (aktiivisuusi · · • i • · 0· PGI 55K 3,2-3,5 4,9 PGII 38K 4,6-5,9 4,8 ·:··: 30 PGII IA 57K 3,3 4,3 pgiiib 57k 3,3 4,5 *. PGIV 59K 3,7 4,8 11 · • · · · •«· ------ 1 — • ·
Selitykset: * Ekstrapoloitu arvo, määritettynä SDS- 35 geelielektroforeesilla.
• « b Isoelektrinen piste, määritettynä isoelektrisellä ohutlevyfokusoinnilla.
• I · 63 105206
Kaikkien puhdistettujen entsyymien näennäinen molekyyli-massa on välillä 55-59 kDa 15-%:isella SDS-polyak-ryyliamidigeelillä, paitsi PGII:n, joka näyttää olevan 5 paljon pienempi proteiini (38 kDa). PGII:n erityisolemusta tähdentää sen suhteellisen korkea isoelektrinen piste, verrattuna alhaisiin isoelektrisen pisteen arvoihin, jotka on määritetty muille polygalakturonaaseille. Kaikkien polygalakturonaasien pH-optimi on samalla alueella 10 (4,3-4,9).
Spesifisiä vasta-aineita puhdistettua PGI:tä ja PGII:ta vastaan tehdään valkoisissa urospuolisissa New Zealand-kaneissa Uitzetter'in, 36, kuvaileman immunisaatiokaavion 15 mukaan.
Ristireaktiivisuutta kahden antiseerumin ja viiden puhdistetun polygalakturonaasin välillä seurataan kuten jäljempänä on esitetty. 0,4-1,0 pg puhdistettua proteii-20 nia ladataan 10-%:iselle SDS-polyakryyliamidigeelille ja siirretään elektroforesoinnin jälkeen geeliltä nitrosel-luloosakalvolle, käyttäen menetelmää, jota Bowen et ai., 37, ovat kuvailleet. Nitroselluloosablotin inkubointi
f t I
spesifisten antiseerumien kanssa, jota seuraa värjäys 25 peroksidaasilla leimatulla vuohen anti-kani-IgG:llä, suoritetaan Uitzetter' in, 36, mukaan. Inkuboinnin yh- • · *···* teydessä PGI-spesifisen antiseerumin kanssa todetaan V · voimakas signaali PGItlle ja PGIIIArlle, -IIIB:lle ja - IV;lie. PGII tuottaa jonkin verran heikomman signaalin ·;*·; 30 tämän vasta-aineen kanssa. Biotin inkuboinnista PGII- :T: spesifisen antiseerumin kanssa on tuloksena voimakas vyöhyke PGII;lie, mutta vain heikkoja vyöhykkeitä muille *11* neljälle polygalakturonaasille.
• ( • « · « « • · 35 Esimerkki 1.3.; Aminohapposekvenssin määrittäminen poly-qalakturonaasi II;n svanoaeenibromidl-fragmenteista Suunnilleen 100 pg PGII:ta liuotetaan 150 pl:aan 70-%;- 105206 64 ista muurahaishappoa, ja kiinteää syanogeenihromidia lisätään satakertaisena molaarisena ylimääränä metionii-niin nähden (joita esiintyy 4 tähdettä entsyymimolekyyliä kohti). Reaktioseosta sekoitetaan jatkuvasti 24 tunnin 5 ajan huoneen lämpötilassa suljetussa reaktioastiassa.
Vettä lisätään 24 tunnin kuluttua, ja valmiste kuivataan huuhtelemalla N2:lla. Tämä vaihe toistetaan muurahaishapon poistamiseksi.
10 Elektroforesoinnin jälkeen 15-%:isillä SDS-polyak- ryyliamidigeeleillä, suunnilleen 10 yksittäistä vyöhykettä voidaan värjätä Coomassie Brilliant Blue:11a. Ne edustavat epätäydellisesti ja täydellisesti katkenneita fragmentteja. Käsittelemättömän proteiinin lisäksi, jonka 15 molekyylimassa on 38 kDa, seuraavat vyöhykkeet havaitaan: 33, 30, 27, 19, 17, 12, 10, 7,5, ja 6 kDa. Ottamalla näytteitä säännöllisin välein 24 tunnin reaktiojakson aikana, ja analysoimalla nämä SDS-polyak-ryyliamidigeelielektroforeesin avulla, järjestys, jossa 20 osittaiset ja lopulliset reaktiotuotteet ilmestyvät, samoin kuin niiden asema toisiinsa nähden, on määritetty. 17 kDa fragmentti on sisäfragmentti, kun taas 5 kDa fragmentti sijaitsee joko C-päässä tai N-päässä. 24-tuntisen käsittelyn fragmentit blotataan sen jälkeen Immobilon- i « 1 ' 25 P:lle, joka on polyvinylideenidifluoridimembraani (Mi- V : llipore), Matsudaira'n et ai., 4, kuvaileman menetelmän • · '·,’·· mukaan. Kolmea fragmenttia käytetään kaasufaasiseen sek- ·:* vensointiin, nimittäin 17 kDa sisäfragmenttia ja kahta ;1; pienempää fragmenttia (5 ja 6 kDa).
«*· .·:·. 30 • · ·
Aminohapposekvenssit määritetään Applied Biosystems'in model 470 A proteiinien sekvensointilaitteella, joka on • · ... kytketty suoraan Applied Biosystems1 in 120 A PTH -analy- « i · saattoriin. Membraanifragmentit, jotka sisältävät 0,5-1 » 35 nmoolia tiettyä peptidiä, pestään, ladataan kaasufaasi-seen sekvensointilaitteeseen ja niistä suoritetaan sek- »M ^ ; venssianalyysi Amons'in, 5, kuvaileman ohjelman mukaises- • * · • · • · · • · • · 5 65 105206 ti.
5 kDa fragmentille saadaan seuraava sekvenssi:
Paikka: 1 5
Aminohappo: asp - ser - X - thr - phe - thr - thr - ala -
Paikka: 10 12 13 10 Aminohappo: ala - ala - ala - lys (ala) -(ala)
Paikassa 3 (X) ei havaita mitään aminohappoa. Koska käytetty sekvensointiohjelma ilmaisee vain kys-teiinitähteitä, jos proteiini on S-pyridyylietyloitu 15 edeltäkäsin, on todennäköistä, että paikassa 3 voi olla kysteilni (Amons, 5). Paikoissa 12 ja 13 todetaan jälkiä ala:sta kuten suluilla on osoitettu. Vaikka jälki paikassa 12 on selvästi seurausta epätäydellisestä reaktiosta aikaisemmassa vaiheessa, alhainen ala-signaali paikassa 20 13 edustaa aminohappoa ala peptidin paikassa 13.
Sekvenssi 17 kDa fragmentille on
Paikka: 1 5
I I I
: 25 Aminohappo: ala - phe - ser - vai - gin - ala - asn - « i * » i « • · *
Paikka: 10 *· ·
Aminohappo: asp - ile - thr (ile) - phe (thr) ·»·« • · · • · • · §···, 30 Jäljet isoleusiinista ja treoniinista, jotka havaittiin • · · kahdessa viimeisessä vaiheessa, kuten suluilla on osoitettu, ovat selvästi seurausta epätäydellisistä reaktioista aikaisemmissa vaiheissa.
• · * i i · • I · • 1 35 Esimerkki 1.4.: Polyqalakturonaasi I:n N-terminaalisen M*» .·**; osan aminohapposekvenssin määrittäminen '·»* / . 100 pg esimerkin 1.1.1. mukaisesti puhdistettua PGI:tä » · · « · · • · • >· • * • · Ψ * · 105206 66 dialysoidaan kolme kertaa 1 l:aa vastaan Millipore-suoda-tettua vettä ja lyofilisoidaan. Aminohapposekvenssi määritetään kuten esimerkissä 1.3. on kuvailtu. Seuraava N-terminaalinen aminohapposekvenssi on määritetty entsyy-5 mille
Paikka: 1 5
Aminohappo: ala - ser - thr - X - thr - phe - thr - ser - 10 Paikka: 9
Aminohappo: ala
Kysteiinitähteitä proteiinissa ei ole modifioitu, eikä niitä siten havaita. Kysteiiniä esiintyy todennäköisesti 15 sekvenssin paikassa 4 (X). PGI:n N-terminaalisessa sekvenssissä esiintyy homologiaa PGII:n 5 kDa syanogeenibro-midigragmentin aminohapposekvenssin kanssa, joka on eristetty Rapidase'sta (esimerkki 1.3), ja PGII:n N-ter-minaalisen aminohapposekvenssin kanssa, joka on eristetty 20 A. nioerin transformantista N593/pGW1800-27 (esimerkki 6.3). Tämä homologia esitetään seuraavassa kaaviossa, jossa otaksutaan, että kysteiini esiintyy paikassa 4 ja 3, PGI:n ja vastaavasti PGII:n sekvensseissä: i i · V : 25 PGI ala - ser - thr - cys - thr - phe - thr - ser - ala :"i ; FGII asp - ser - cys - thr - phe - thr - thr - ala • · • · 1 • · · • · .·· Avoin tila paikassa 2 olevan seriinitähteen ja paikassa 3 • ·♦· .···. olevan kysteiini tähteen välissä esitetään polygalakturo- '···, 30 naasi II:n sekvenssissä kummankin sekvenssin saattamisek- • · · si suoraan linjaan.
t
Seriinitähde PGI:n sekvenssin paikassa 8 ei ole läsnä • · · vastaavassa paikassa PGII:n sekvenssissä (paikka 7), ·; 35 mutta jälkimmäisessä tapauksessa samantyyppinen amino- • · · · happo, so. pieni hydroksyyliaminohappo (treoniini), on läsnä.
I I · • · · • · 1 · I · • · • t · 67 105206 PGI:n ja PGII:n N-terminaalisissa aminohapposekvensseissä esiintyy homologiaa, mutta ne eivät ole identtiset. Erot ovat sellaisia, että nämä eivät voi olla tuloksena yhden 5 geenin tuotteen osittaisesta modifikaatiosta, kuten esimerkiksi osittaisesta proteolyyttisestä katkaisusta. Johtopäätöksenä on se, että saman perheen eri geenit * koodittavat PGI:tä ja PGII:ta.
10 Esimerkki 1.5.: Aminohapposekvenssin määrittäminen polv-qalakturonaasi I:n svanoaeenibromidi-fragmenteista Suunnilleen 100 pg PGI:tä liuotetaan 150 plraan 70-%:ista muurahaishappoa, ja kiinteää syanogeenibromidia lisätään proteiinifragmenttien valmistamiseksi kuten esimerkissä 15 1.3 on kuvailtu. Neljä metioniinitähdettä on läsnä ent- syymimolekyyliä kohti. Elektroforesoinnin jälkeen 15-%:isillä SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja värjäyksen jälkeen Coomassie Brilliant Blue:11a havaitaan suurehkoja vyöhykkeitä, joiden molekyylimassat ovat 39,5, 35, 21, 20 19,5 ja 5,5 kDa.
21 ja 5,5 kDa fragmentit sekvensoidaan, käyttäen samaa laitteistoa ja menettelyä kuin esimerkissä 1.3 on kuvailtu.
0'1 25 « I 1 : 21 kDa fragmentin sekvenssi on « · • ♦ · • ·· • · ··· Paikka: 1 «··· .··'. Aminohappo: ala - ser - thr X thr - phe -
• M
' .·:·. 30 • · ·
Paikka: 10 ~ . Aminohappo: thr - ser - ala - ser - glu *· ·
♦ M
• «
Kysteiini esiintyy todennäköisesti sekvenssin paikassa 4 ·; 35 (X), samalla tavoin kuin mitä on kuvailtu esimerkeissä • · · · 1.3 ja 1.4. 21 kDa fragmentin sekvenssi on identtinen • · . käsittelemättömän PGI-proteiinin N-terminaalisen amino- ♦ · · • · · « · » 105206 68 happosekvenssin kanssa, jota on kuvailtu esimerkissä 1.4.
5,5 kDa fragmentilla on seuraava sekvenssi 5 Paikka: 1 5
Aminohappo: ala - asp - gly - ala - vai - ile - >
Paikka: 10
Aminohappo: asp - gly - asp - gly - ser 10 Näistä sekvenssituloksista päätellään, että 5,5 kDa fragmentti ei vastaa proteiinin N-päätä.
«(· • 1 1 • · 1 * • · • · · • ·· • · • · « • ··· • · · • · • · ··1 w • · · • · · • · · • · • · » • · · • · « • « · * · · · · t • · • · * « · • · • · · « 1 1 * t 1 v · · 69 105206
Esimerkki 1.6.: Trvpsiinipeptidin aminohapposekvenssin määrittäminen PGII denaturoidaan osittain dialysoimalla 0,5-%:ista 5 (tilavuus/tilavuus) muurahaishappoa vastaan ja pakaste- kuivataan jälkeenpäin. Entsyymi (1 mg) suspendoidaan 1 ml:aan 0,2 M N-etyyli-morfoliiniasetaattipuskuria pH 8,0, ja inkuboidaan sen jälkeen 37°C:ssa trypsiinin (Sigma) kanssa, jota lisätään moolisuhteessa 1:50 PGII:n suhteen. 10 Entsyymikäsittely pysäytetään 24 tunnin kuluttua lisäämällä etikkahappoa (30-%:inen loppupitoisuus). Hydroly-saatti pakastekuivataan. Hydrolysaattinäytteitä liuotetaan 0,l-%:iseen trifluorietikkahappoon, joka sisältää 2,5 mM ditiotreitolia, ja pidetään 37°C:ssa vähintään 1 15 tunnin ajan. Trypsiinipeptidit (100 μ1:η näytteet, jotka sisältävät 100-200 pg proteiinia) erotetaan käyttäen Spectra Physics SP 8000 HPLC:tä, joka on varustettu Nuc-leosil C-18 -kolonnilla (4,6 x 150 mm) (Supelco) ja suo-jaavalla Vydac-esikolonnilla (Chrompack). Kolonnilämpö-20 tilaa 25°C, virtausnopeutta 2 ml/min. ja lineaarista gradienttia käytetään, joka muuttuu 50 minuutissa 100-%:isesta liuotin A:sta (0,1 % TFA:ta vedessä) 50-%:iseksi liuotin A:ksi + 50-%:iseksi liuotin B:ksi (0,1 % TFA:ta asetonitriilissä). Peptidit ilmaistaan UV-absorption 25 avulla 214 nm:ssä. Yksi peptideistä, joka vapautuu myö-\ hään hydrolyysin kuluessa, näyttää hyvin erottuneelta muista piikeistä kromatogrammissa suunnilleen 21-%:isessa ♦·· asetonitriilissä. Tämä peptidi kuivataan huuhtelemalla ·♦1· kuivalla ilmalla 25°C:ssa ja sekvensoidaan.
• · • 30 • · ·
Aminohapposekvenssi määritetään esimerkissä 1.4 kuvaillun ’ . menetelmän mukaisesti. Sekvenssi on: • · • · · • « · • · · • M • · « ·
• M
• · * · • · · • · « · • 1 · • · · » · 70 105206
Paikka: 1 5
Aminohappo: thr - ile - ser - gly - ala - thr - gly -Paikka: 10 14 5 Aminohappo: ser - vai - ser - glu - ile - thr - tyr
Esimerkki 2: Aspergillus niqerin aenomisen kirjaston konstruointi ^ 10 Esimerkki 2.1: Suurlmolekyylipainolsen DNA:n eristäminen A. niqer N400:sta
Aspergillus niqer N400 -kannan konidiosporeja siirros-tetaan 200 ml:aan minimaalialustaa itiöiden lop-putiheyteen 10® itiötä/ml ja ravistellaan 1 l:n erlen-15 meyer-pulloissa 24 tunnin ajan 28°C:ssa nopeudella 300 rpm, käyttäen New Brunswick'in pyöriväliikkeistä ravis-telulaitetta. Rihmasto kerätään talteen suodatuksen avulla käyttäen BOchner suppiloa Myra-kankaan kanssa, pestään kylmällä steriilillä saliinilla, jäädytetään nestetypessä 20 ja joko säilytetään -60°C:ssa tai käytetään suoraan.
Menetelmä, jota käytetään DNA:n eristämiseksi genomisen kirjaston valmistamiseksi, perustuu Yelton'in et ai., 18, kuvailemaan menetelmään.
25 Kirjaston konstruointia varten 10 g rihmastoa hienonne-taan nestetypessä 1 g:n erissä Braun'in mikro-repijässä. Hienonnettu rihmasto siirretään 1 l:n steriiliin erien- • ·
·*· meyeriin, joka sisältää 200 ml uuttopuskuria (50 mM EDTA
·♦·· .·**; pH 8,5, 0,2 % SDS) ja 200 μΐ dietyylipyrokarbonaattia.
··· 30 Seos lämmitetään hitaasti huoneen lämpötilaan ja kuumen- • · · netaan sen jälkeen 20 min. aikana 68°C:seen ravistellen . ajoittain. Suspensio jäähdytetään huoneen lämpötilaan ja ·#··· sentrifugoidaan 15 min. nopeudessa 12 000 x g. 1/16 tila-V * vuutta 8 M kaliumasetaattiliuosta pH 4,2 lisätään super- 35 natanttiin, ja seos jätetään jäiden päälle 1 tunniksi.
Saostuma poistetaan sentrifugoimalla (20 min.; 16 000 x • · . g; 4°C). Nukleiinihapot seostetaan supernatantista in- • · · • · · • » · · • · • · • i · 105206 71 kuboimalla 0,6 tilavuuden kanssa isopropanolia jäiden päällä 15 min, ajan. Seostettu nukleiinihappo kerätään talteen sentrifugoimalla (10 min.; 6000 x g; 4°C), pestään 70-%:isella etanolilla ja kuivataan lyhytaikaisesti.
5 Pelletti suspendoidaan 10 ml:aan TE:tä, joka sisältää 20 pg/ml RNaasi A:ta, (Boehringer, Mannheim) ja inkuboidaan 15 min. 37°C:ssa. DNA:ta käsitellään nukleaasivapaalla pronaasilla (1 mg/ml loppupitoisuus) (Kochlight, Coin-brook) 1 tunnin ajan 37°C:ssa. Pronaasikantaliuos TE-10 puskurissa sisältää 20 mg/ml entsyymiä, jota esi-inkuboidaan 1 tunnin ajan 37°C:ssa nukleaasien pilkkomiseksi.
8,5 g CsCl:a liuotetaan 9 ml:aan saatua DNA-liuosta, 0,2 ml 10 mg/ml etidiumbromidia lisätään, ja tätä liuosta 15 sentrifugoidaan joko Beckman SW41 -roottorissa 60 tunnin ajan nopeudessa 33 000 rpm, tai Beckman 50 Ti -roottorissa 40 tunnin ajan 45 000 rpm. DNA-vyöhyke otetaan talteen ja etidiumbromidi poistetaan moninkertaisella uuttamisella isopropanolin kanssa, tasapainotettuna NaCl:n kylläs-20 tetyn vesiliuoksen kanssa. 5 tilavuutta TE-puskuria lisätään ja DNA-liuosta käsitellään perättäisesti TE:llä kyllästetyllä fenolilla, fenoli/kloroformi/isoamyylialko-holilla 25:24:1 ja kloroformi/isoamyylialkoholilla 24:1. DNA seostetaan lisäämällä 0,1 tilavuutta 3 M natriumase-25 taattia pH 5,2, 2,5 tilavuutta etanolia ja inkuboimalla ; yli yön -20°C:ssa. Saostuma otetaan talteen sentrifugoi- ·'·,· maila (1 h, 30 000 x g; 4°C), pestään 70-%:isella etano- " · · lilla, kuivataan ja liuotetaan 400 pl:aan TE-puskuria.
···· IM • · • · ' 30 Esimerkki 2.2: A. nlger N400:n DNA:n osittainen pilkko- * · · minen MboI:llä 1a fragmenttien eristäminen • , Mbol-pitoisuuden testaamiseksi, jolla saadaan suurin * f* määrä DNA-fragmentteja välillä 13,6 - 23 kiloemäsparia V ' (kep), 1 pg:n eriä A. nioer N400:n DNA:sta pilkotaan ··· 35 sopivassa, toimittajan suosittelemassa puskurissa ale- « * nevien Mbol-määrien kanssa (0,5 - 0,001 U) 1 tunnin ajan ,· . 37°C:ssa 10 μ1:η tilavuudessa. Reaktio pysäytetään lisää- • · * • M • · « · * • · • · • » · 105206 72 mällä 1 μΐ 0,25 M EDTA:a, ja näytteet ladataan 0,6-%:i-selle agaroosigeelille TBE-puskurissa, joka sisältää 1 pg/ml etidiumbromidia. Sopivina kokomarkkereina on seos, joka sisältää lambda-DNA:ta ja Bqlll:11a pilkottua lamb-5 da-DNA:ta, joka tuottaa vyöhykkeet 49, 22,8, 13,6, 9,8, 2,3, kep, ja näkymätön 0,45 kep fragmentti. Mbol-pitoi-suus, joka tarvitaan tuottamaan korkea saanto halutuista 13,6 - 23 kep fragmenteista, on noin 0,02 U/pg DNA:ta.
200 pg DNA:ta pilkotaan sen mukaisesti 2 ml:n kokonais-10 tilavuudessa, ja jaetaan 20:een yhtäsuureen näyteosaan välittömästi entsyymilisäyksen jälkeen. Yhden tunnin kuluttua 37°C:ssa, hydrolysaatit asetetaan jäiden päälle.
Sen jälkeen kun 1 pl:n näytteestä on tarkistettu oikea hydrolyysiaste ajamalla geelillä, EDTA:a lisätään lop-15 pupitoisuuteen 25 mM, entsyymi lämpöinaktivoidaan 65°C:ssa 10 min. ajan, näytteet kerätään yhteen ja DNA seostetaan, pestään, kuivataan ja liuotetaan 400 pl:aan TE-puskuria.
Fragmentoitu DNA erotetaan 0,4-%:isella preparatiivisella 20 agaroosigeelillä (keskikaivo 120 x 1,5 mm). BolII:11a pilkottua lambda-DNA:ta käytetään markkerina osittain pilkottujen DNA-fragmenttien koon määrittämiseksi elektroforeesissa 4°C:ssa ja 40 V:n jännitteessä (3 V/cm). Oikeankokoisia fragmentteja sisältävä geelialue leikataan 25 pois geelistä, ja DNA elektroeluoidaan geelistä steriilissä dialyysiletkussa 2 ml:ssa TBE-puskuria 2-3 tunnin t .·. : aikana 100 V:n jännitteessä. Virta käännetään 30 sekunnin *.·, ajaksi ja DNA:ta sisältävä puskuri otetaan talteen. Frag- mentit väkevöidään sen jälkeen etanolisaostuksella ja • i 30 liuotetaan 100 pl:aan TE-puskuria. - • · · • i ·
Esimerkki 2.3: Vektori-DNA:n valmistaminen 1a A. niaer ** * N400:n suurimolekvvlipainoisten DNA-fraamenttien kloonaus V : EMBL4: ään » 35 A. niaer N400:n genominen kirjasto konstruoidaan lambda- .···. vektorissa EMBL4. Frischauf et ai., 9, ja Karn et ai., · 'i* 19, ovat kuvailleet vektoria, jonka kloonauskapasiteetti • · • t f • · * • · • »« « » • · * · · 105206 73 on 9-23 kep, ja joka on ostettu Promega Biotech. Inc.'-lta. Genomin eri osista lähtöisin olevien kak-soisinserttien välttämiseksi kloonaukseen käytetään 13,6 kep minimifragmenttipituutta.
5 10 pg lambda-EMBL4-DNA:ta hydrolysoidaan loppuun 50 yksiköllä BamHI:tä toimittajan suosittamassa puskurissa 100 pl:n tilavuudessa 2 tunnin ajan 37°C:ssa. Entsyymiä inak-tivoidaan 10 min. ajan 65°C:ssa. NaCl-pitoisuus nostetaan 10 tasolle 150 mM ja 50 yksikköä Säliltä lisätään ja in- kubointia jatketaan vielä 2 tuntia 37°C:ssa. Sen jälkeen kun EDTA:a on lisätty pitoisuuteen 25 mM ja entsyymi on inaktivoitu (kuumentamalla 10 min. ajaksi 65°C:seen), liuos uutetaan yhtäsuurilla tilavuuksilla fenolia (TE-15 kyllästettyä), fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholia 25:-24:1, ja kloroformi/isoamyylialkoholia (24:1). Pienten BamHI/Sali-polvlinkkerifragmenttien eliminoimiseksi DNA saostetaan 0,6 tilavuudella isopropanolia sen jälkeen, kun on lisätty 0,1 tilavuutta 3 M natriumasetaattia pH 20 5,2. 15 minuutin kuluttua jäiden päällä ja 15 minuutin sentrifugoinnin jälkeen 12 000 x g 4eC:ssa, saostuma pestään perusteellisesti 70-%:isella etanolilla, kuiva- .’Γ. taan ja liuotetaan 40 pl:aan TE-puskuria.
* ( I I I I t f '/ 25 Esimerkki 2.4: A. niqer N400:n aenomisten DNA-frag- 'lii menttlen liaointi 1a pakkaaminen in vitro • · ill* On oleellista, että esimerkin 2.3 mukaisesti valmistetut • · · vektorin cos-kohdat tehdään kaksijuosteisiksi ennen li-gaatioreaktiota. Vektoria kuumennetaan liuoksessa, joka 30 sisältää 100 mM Tris-HCl:a pH 7,5 ja 10 mM MgCl2:a, 10 ·♦· ί.ί ϊ min. ajan 65°C:ssa, ja se pariutetaan sen jälkeen 1 tunnin aikana 42°C:ssa. Koeligaatioiden perusteella, vektorin suunnilleen 1:1 suhteen fragmentteihin nähden todetaan • · *1* tuottavan eniten rekombinantteja. Ligaatio suoritettiin • · \*'i 35 liuoksessa, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl:a pH 7,5, 10 mM ς.,,ς MgCl2:a, 10 mM DTT:a ja 1 mM ATP:a, käyttäen 9,5 pg vek toria ja 10 pg DNA-fragmentteja kokonaistilavuudessa 100 74 105206 μΐ. DNA-ligaasia (BRL) lisätään pitoisuudessa 0,5 U/pg DNA:ta ja ligaatioseosta inkuboidaan yli yön 14°C:ssa.
Ligaation testaamiseksi ajetaan näyte ligoidusta DNA:sta agaroosigeelillä. Kontrollina ligoidaan myös 0,5 pg vek-5 toria ilman fragmenttilisäystä 5 pl:n tilavuudessa.
f
Tilavuudeltaan suuri ligaatioseos väkevöidään etanoli-saostuksella ja liuotetaan 20 pl:aan TE-puskuria ennen in vitro pakkaamista. In vitro pakkaaminen suoritetaan Pro-10 mega Packagene -uutteiden kanssa valmistajan ohjeiden mukaisesti, käyttäen 10 pl:n eriä 1 pg:n DNA:ta pakkaamiseksi. 1 pg suurimolekyylipainoista kontrollifaagia lambda-cl857 Sam 7, joka toimitetaan uutteiden mukana, pakataan erikseen kontrolliksi. Pakkaamisen jälkeen lisä-15 tään 500 pl faagiliuospuskuria (PSB) ja 5 pl kloroformia. Rekombinanttifaagikantaliuoksia voidaan säilyttää 4°C:ssa.
Saatu kirjasto on konstruoitu kahdesta erillisestä ligaa-tiokokeesta.
20 Esimerkki 2.5: Titraus 1a A. niaer N400:n aenomisen kirjaston monistaminen E. coli NM539 -soluja kasvatetaan LB-alustassa, joka « sisältää 0,2 % maltoosia, 10 mM MgS04:a ja 1 mM CaCl2:a, : optisen tiheyden (600 nm) arvoon 1,0. Tästä viljelmästä « « 25 lisätään 0,2 ml:n näyte-eriä 0,1 ml:aan sopivaa faagi-laimennusta PSB:ssä. Faagiadsorption jälkeen 20 min.
« · ;;; aikana 37°C:ssa, 3 ml 0,6-%:ista LB-pinta-agaria, jonka • · · lämpötila on 45°C, lisätään, seos maljataan LB-agarmal- joille ja näitä inkuboidaan yli yön 37°C:ssa. Plakkeja ’·’*· 30 muodostavien yksikköjen (pfu) lukumäärät ml:aa kohti • · · : faagisuspensiota ovat 12xl05 ja 4,2xl05 pfu/ml kahden faagikantaliuoksen osalta, jotka on valmistettu esimerkin m .«·«, 1.4 mukaisesti. Taustan vähentämisen jälkeen, joka las- • « "* ketään kontrolliligaatioista ilman fragmentteja (17 % ja • 35 vastaavasti 40 %), rekombinanttien absoluuttinen määrä on • « · 6xl05. Rekombinanttien sisältämä DNA vastaa enemmän kuin 200 Aspergillus niaer -genomia.
105206 75
Kirjaston monistamiseksi, 80 μ1:η näyte-eriä kumpaakin faagikantaliuosta käytetään E. coli NM539 -solujen infek-toimiseksi, jotka maljataan LB-pinta-agaroosissa LB-agar-5 maljoille ja inkuboidaan yli yön 37°C:ssa. Faagit eluoi-daan agaroosista ravistelemalla maljoja kevyesti 5 ml:n kanssa PSB:tä maljaa kohti 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. PSB otetaan talteen, sentrifugoidaan (10 min. nopeudessa 6000 x g) bakteerien poistamiseksi, ja kloro-10 formia lisätään (loppupitoisuus 0,5 %). Molemmat faagi-kantaliuokset, jotka monistuvat suunnilleen samassa määrin, sekoitetaan sen jälkeen (40 ml:n kantaliuos), tiirataan (8xl09 pfu/ml) ja varastoidaan 4°C:ssa.
15 Esimerkki 3: A. nlgerln qenomisen kirjaston seulonta nukleiinihappojen suhteen, jotka liittyvät läheisesti polygalakturonaaseihin
Esimerkki 3.1: Oliaonukleotidlseosten synteesi, jotka 20 koodittavat polvgalakturonaasi II:n 17 kDa syanooeeni-bromidifragmenttia
Oligonukleotidejä syntetisoidaan Aspergillus nioerin ;'· genomisen kirjaston seulomiseksi, joka kirjasto on vai- i mistettu esimerkin 2 mukaisesti, käyttäen fos- 25 foriamidiittimenetelmää (M.H. Caruthers, 8) Applied Bio- ^..., systems'in (model 380 B) oligonukleotidisyn- • · "I teesilaitteella. Esimerkissä 1.2 kuvailtu 17 kDa syano- • · · geenibromidifragmentti on sisäisesti sijaitseva peptidi. Esimerkissä 1.4 määritettyä aminohapposekvenssiä voidaan v * * 30 sen vuoksi jatkaa N-päässä metioniinitähteellä. Syn- • · · V * tetisoidut oligonukleotidit ovat kompleksisia seoksia, m kun geneettisen koodin degeneraatio otetaan lukuun. Tek- .···. nisistä syistä on välttämätöntä vähentää nukleotidien • · *·" määrää seoksessa. Niiden oligonukleotidien pois sulkemi- 35 seksi, joilla on väärä yhdistelmä TG ja AC paikassa 10 ja 11, ja seoksen koon rajoittamiseksi, kaksi erillistä oligonukleotidiseosta, jotka oligot vastaavat koodittavan 105206 76 juosteen sekvenssiä, syntetisoidaan ottamalla huomioon geneettisen koodin degeneroituneisuus. Tarvittavien oli-gonukleotidien määrää vähennetään edelleen sijoittamalla inosiini vaihtuvaksi emäkseksi (wobble base) neljään eri 5 paikkaan syntetisoiduissa 29-meereissä, ja jokainen seos sisältää siten 16 erilaista oligonukleotidiä (Ohtsuka et * ai., 16). Kaksi seosta, joita nimitetään HR6195:ksi ja HR6196:ksi, edustavat DNA:ta, joka koodittaa seuraavaa aminohapposekvenssiä, ja niillä on seuraava koostumus: 10 aminohapposekvenssi: met ala phe ser vai
HR6195: 5' (d) ATG GCI TTRX TCI GTI
HR6196: 5' (d) ATG GCI TTRX AGI GTI
15 aminohapposekvenssi: gin ala asn asp lie HR6195: CAR2 GCI AAR2 GARr AT 3' HR6196: CAR2 GCI AARX GAR2 AT 3' joissa I on inosiini, Rj on T tai C, R2 on A tai G.
20
Esimerkki 3.2: Oliqonukleotidiseoksen synteesi, loka koo-dittaa polyqalakturonaasi I:n 5.5 kDa svanooeenibromidi- fraqmenttia I I I ' : Esimerkissä 1.5 kuvailtu 5,5 kDa syanogeenibromidifrag- lii 25 mentti on sisäalueella sijaitseva peptidi, jota valmis- ' 1'.'. tetaan CNBr-katkaisulla. Sen aminohapposekvenssiä voidaan • m sen vuoksi jatkaa N-päässä metioniinitähteellä. Tarvit- • · · ** * tavien oligonukleotidien määrää vähennetään liittämällä inosiinia vaihtuvaksi emäkseksi (wobble base) viidessä *·’** 30 eri kohdassa 32-meereissä, joita syntetisoidaan.
• · · • · 9 Tämä rajaa seoksen 24 oligonukleotidiä käsittäväksi.
”··, HR6298-niminen seos edustaa DNA:ta, joka koodittaa seu- • · raavaa aminohapposekvenssiä, ja sillä on seuraava koos- • m :.*·· 35 tumus: • · · • · • * » · t 105206 77
Aminohapposekvenssi: met ala asp HR6298 5’ (d) ATG GCI GARj 5 gly ala vai ile asp gly asp gly GGI GCI GTI ATR2 GARx GGI GARx GG 3' joissa I on inosiini, on T tai C ja R2 on T, C tai A.
10 Esimerkki 3.3: Olioonukleotidien 32P-leimaus
Lyofilisoidut oligonukleotidiseokset HR6195, HR6196 ja HR6298 liuotetaan tislattuun veteen 29 μΜ pitoisuuksiin. Näiden liuosten näytteitä laimennetaan kymmenkertaisesti reaktioseoksen valmistamiseksi. Reaktioseos koostuu joko 15 20 pmoolista oligonukleotidiseosta HR6195 yhdessä 20 pmoolin kanssa seosta HR6196, tai pelkästään 40 pmoolista HR6298:aa, 34 pmoolista [τ-32Ρ]-ATP:a (NEN, 6000 Ci/mmoo-li), ja 30 yksiköstä T4 polynukleotidikinaasia (BRL) 50 pl:ssa kinaasipuskuria, joka sisältää 50 mM Tris-HCl:a 20 (pH 7,6), 10 mM MgCl2:a, 5 mM DTT:a, 0,1 mM EDTA:a ja 0,1 mM spermidiiniä (Maniatis et ai., 6, s. 122). Inkubointi suoritetaan 37°C:ssa 30 min. aikana. Reaktio pysäytetään lisäämällä 4 μΐ 0,5 M EDTA:a (pH 8,0). Reaktioseoksia käytetään puhdistamatta genomisen kirjaston seulontaan 25 (esimerkki 3.4) tai Southern-blottien käsittelemiseen ' 1.. koettimella (esimerkki 3.6.).
m » • · • · · * · · • · '·' ’ Esimerkki 3.4: A. niaer N400:n kirjaston seulonta
Osa Aspergillus niaer N400-kannan edellä kuvaillusta ***** 30 genomisesta kirjastosta (esimerkki 2) laimennetaan SM:- VJ ään, ja 0,1 ml:n eriä kustakin, jotka sisältävät noin 2000 pfu:ta, maljataan. Isäntäsoluja valmistetaan siir-rostamalla 50 ml:aan LB-alustaa, jota on täydennetty « · 0,2-%:illa maltoosia, 0,5 ml yli yön LB-alustassa kas- • ·
35 vanutta E. coll NM539 -viljelmää, ravistelemalla 4 tuntia nopeudella 250 rpm Gallenkamp' in pyöriväliikkeisessä ravistelijassa 37°C:ssa, minkä jälkeen lisätään 0,5 ml 1 M
105206 78
MgS04:a ja 0,5 ml 0,5 M CaCl2:a. 0,2 ml:n näyte-eriä näistä soluista sekoitetaan kukin erikseen 0,1 ml:n erän kanssa faagisuspensiota, ja näitä seoksia inkuboidaan huoneen lämpötilassa puoli tuntia. Sen jälkeen lisätään 3 5 ml 0,7-%:ista agaroosia LM-alustassa 47°C:ssa, pyörrese-koitetaan lyhytaikaisesti ja maljataan välittömästi LM-agarmaljoille. Maljoja inkuboidaan yli yön 37°C:ssa ja jäähdytetään 2 tunnin ajan 4°C:ssa.
10
Kustakin maljasta tehdään kaksi kopiota Benton'in ja Davis' in, 7, plakkihybridisaatiomenetelmän mukaisesti. Ensimmäinen filtteri (Schleicher and Schull BA85) asetetaan maljan pinnalle 1 min. ajaksi, toinen kopio 2 min. 15 ajaksi, ja kopioiden paikat merkitään käyttäen tussia. Filttereiden poistamisen jälkeen ne asetetaan astiaan, joka sisältää 100 ml denaturoivaa liuosta (1 M NaCl, 0,5 M NaOH) 0,5 min. ajaksi, ja sen jälkeen 1 min. ajaksi 100 ml:aan neutraloivaa liuosta (0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 1,5 M 20 NaCl). Filtterit siirretään astiaan, joka sisältää 3x- SSC:a, pyyhitään hansikaskädellä bakteerijäänteiden pois-tamiseksi, ja huuhdellaan 3xSSC:llä. Filtterit blotataan, niitä kuivataan 10 min. ajan huoneen lämpötilassa ja paistetaan Whatman 3 MM -paperin päällä uunissa 80°C:ssa 2 25 tunnin ajan.
IM • · • · *** Paistetut filtterit kostutetaan 3xSSC:ssä, pestään tässä • · · liuoksessa 1 tunnin aikana huoneen lämpötilassa ja siirretään sen jälkeen astiaan, joka sisältää 250 ml esiläm- ***** 30 mitettyä (65°C) esihybridisaatioseosta, joka sisältää • · · · 2xSSC:a, jos käytetään oligonukleotidiseoksia HR6195 ja .:. HR6196, ja lxSSC:a, jos käytetään oligonukleotidiseosta ]***. HR6298, edelleen lOx Denhardt'in liuosta (0,2 % BSA:ta, « · *!' Boehringer'in fraktio V; 0,2 % Ficoll 400:aa, Pharmacia; * · ·,**: 35 0,2 % polyvinyylipyrrolidoni-10:tä, Sigma), 0,1 % SDS:ää • · · ja 0,1 mg/ml hienonnettua ja juuri denaturoitua sillin siittiöiden DNA:ta. Esihybridisaatio suoritetaan 5 tunnin 105206 79 aikana 65°C:ssa ravistelevassa vesihauteessa. Seuraavaksi filttereitä pestään kerran puolen tunnin ajan 250 ml:ssa esilämmitettyä (65°C) hybridisaatioseosta, joka on identtinen esihybridisaatioseoksen kanssa, lukuun ottamatta 5 sillin sperman DNA:n pois jättämistä. Filtterit asetetaan sen jälkeen astiaan, joka sisältää 150 ml esilämmitettyä (65°C) hybridisaatioseosta, johon aikaisemmin leimatut yhdistetyt oligonukleotidiseokset HR6195 ja HR6196 (esimerkki 3.1) tai leimattu seos HR6298 oli juuri lisätty.
10
Siinä tapauksessa, että käytetään HR6195:ttä ja HR6196-:tta, astia asetetaan ravistelevaan vesihauteeseen 65°C:-seen, termostaatti säädetään 47°C:seen, ja hybridisaation annetaan jatkua 14 tunnin ajan. Filttereitä pestään 250 15 ml:ssa esilämmitettyä (47°C) hybridisaatioseosta puolen tunnin ajan 47°C:ssa, jota seuraa pesu huoneen lämpötilassa 250 ml:ssa 2xSSC:tä vaihtaen puskuria kaksi kertaa, kumpikin 45 min. Pesu suoritetaan kovissa olosuhteissa siirtämällä filtterit astiaan, joka sisältää 250 ml esi-20 lämmitettyä (63°C). 6xSSC:tä, 0,05 % natriumpyrofosfaattia, ja inkuboimalla sen jälkeen 30 min. ajan ravistelevassa vesihauteessa 63°C:ssa. Filttereitä pestään sen jälkeen huoneen lämpötilassa 2xSSC:ssä vaihtaen puskuria kaksi kertaa, 30 min. kumpikin. Filtterit kuivataan ilmassa.
25 kiinnitetään Whatman 3MM-paperialustalle, peitetään muo- '1.. vipäällyksellä ja annetaan valottua Kodak XAR5-filmiin · kolmen päivän ajan -60°C:ssa, käyttäen vahvistusvarjostin- • a · ta.
*”**· 30 Tällä tavalla saadaan kuusi positiivista signaalia kuu- ί.ϊ ί delta seulotulta maljalta. Positiiviset plakit meistetään steriilillä pasteur-pipetillä asettamalla maljat varovai-sesti autoradiogrammin päälle käyttäen hyväksi tus- • · simerkkejä. Positiivisia plakkeja sisältävät agarpalat 35 lisätään 1 ml:aan SM:ää ja 2,5 μΐ kloroformia lisätään.
» · : : Faagien annetaan diffundoitua agarista huoneen lämpöti lassa 1 tunnin ajan pyörresekoittaen ajoittaisesti, ja 105206 80 inkuboidaan sen jälkeen yli yön 4°C:ssa. Agar ja bak-teerijäänteet poistetaan sentrifugoimalla 5 min., 2,5 μΐ kloroformia lisätään ja faagikantaliuosta säilytetään 4°C: ssa.
5
Positiiviset kloonit ovat nimeltään lambda-C - lambda-G ja lambda-I. Koska faagit maljataan korkeassa tiheydessä, positiiviset plakit puhdistetaan kahdesti maljäämällä ne alhaisessa tiheydessä, ja toistamalla koko menettely, 10 joka käsittää toistomaljauksen, hybridisaation ja positiivisten plakkien poimimisen.
Siinä tapauksessa, että käytetään oligonukleotidiseosta HR6298, astia asetetaan ravistelevaan vesihauteeseen 15 65°C:seen, termostaatti säädetään 52°C:seen, ja hybridisaation annetaan jatkua 14 tunnin ajan. Sen jälkeen filttereitä pestään kerran 250 ml:ssa esilämmitettyä (52°C) hybridisaatioseosta puolen tunnin ajan 52°C:ssa, jota seuraa pesu huoneen lämpötilassa vaihtaen kahdesti 250 ml 20 2xSSC-puskuria, molemmat 45 min. Sen jälkeen suoritetaan pesu kovissa olosuhteissa siirtämällä filtterit astiaan, joka sisältää 250 ml esilämmitettyä (64°C) 4xSSC:tä, 0,05 % (paino/tilavuus) natriumpyrofosfaattia, ja inkuboimalla sen jälkeen sitä 0,5 tunnin ajan ravistelevassa vesihau-25 teessä 64°C:ssa. Filtterit pestään sen jälkeen huoneen ...^ lämpötilassa vaihtaen kahdesti 2xSSC-puskuria, molemmat • · I” 30 min. Filtterit kuivataan ilmassa, kiinnitetään Whatman ti· *·’ * 3MM -paperialustalle, peitetään muovipäällyksellä ja annetaan valottua Kodak XAR5-filmille kolmen päivän * * 30 ajan -60°C:ssa, käyttäen vahvistusvarjostinta.
• · · • to • t · • Tällä tavalla saadaan yhdeksän positiivista signaalia ,···, kuudelta seulotulta maljalta. Positiiviset plakit ir- a rotetaan steriilin Pasteur-pipetin avulla asettamalla • · ·.*·: 35 maljat huolellisesti autoradiogrammin päälle käyttäen · · tussimarkkereita. Agarpalat, jotka sisältävät positiivisia plakkeja, lisätään 1 ml:aan SM:ää ja 2,5 μΐ klo- 105206 81 roformia lisätään. Faaglen annetaan diffundoitua agarista huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan ajoittaisessa pyörre-sekoituksessa (vortex), ja niitä inkuboidaan sen jälkeen yli yön 4°C:ssa. Agar ja bakteerisolujäänteet poistetaan 5 sentrifugoimalla 5 min. ajan, 2,5 μΐ kloroformia lisätään ja faagikantaliuoksia säilytetään 4°C:ssa.
Positiivisille klooneille annetaan nimeksi PGI-lambda 1- 9. Positiiviset plakit puhdistetaan edelleen maljaamalla 10 niitä pienessä tiheydessä käyttäen heterologisena koettimena pGW1803:n 1,2 kep BamHI/EcoRI-palaa (esimerkki 3.8) hybridisaatiota varten, joka suoritetaan 60°C:ssa, kun taas pesu suoritetaan 2 x SSCzssä, myös 60°C:ssa.
15 Esimerkki 3.5; Lambda-DNA;n eristäminen DNA:n eristämiseksi rekombinanttiklooneista faageja ensin monistetaan. Tätä tarkoitusta varten E. coli LE392 -isän-täsoluja kasvatetaan optiseen tiheyteen (600 nm) 1,0 LB-alustassa, johon on lisätty 10 mM MgS04:a ja 0,2 % maltoo-20 siä. Sen jälkeen maljataan erikseen 50 μΐ puhdistettujen faagien kantaliuoksista kuten esimerkissä 2.5 on kuvail-tu. Yli yön kestävän inkuboinnin jälkeen 37eC:ssa faagit eluoidaan yhteenkasvamattomilta maljoilta levittämällä 5 ml SM-liuosta maljojen pinnalle ja inkuboimalla kaksi I ( 25 tuntia lievässä ravistuksessa. Eluoidut faagit kerätään talteen ja 0,1 ml kloroformia lisätään. Seosta pyörrese- t ·
Hl koitetaan lyhytaikaisesti ja solujäänteet poistetaan • · · ’·* ’ sentrifugoimalla. Supernatantit otetaan talteen, kloro formia lisätään 0,3-%:tin pitoisuuteen ja tuloksena ole- ***** 30 vaa maljalysaattia säilytetään 4°C:ssa.
··· 9 · · ♦ · · Lähes yhteenkasvaneiden maljojen saamiseksi lähtömate-[*!*. riaaliksi faagi-DNA:n eristämistä varten, 10 μ1:η mal- jalysaattieriä maljataan E. coli LE392 -isäntäsolujen • * 35 kanssa. Yön yli kestäneen inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa, • t agaroosipintakerros kaavitaan kolmelta lähes yhteenkas-vaneelta maljalta. Nämä kerrokset yhdistetään, 20 ml SM- 105206 82 liuosta ja 0,4 ml kloroformia lisätään ja tuloksena olevaa seosta ravistellaan 37°C:ssa 30 min. ajan. Solujäänteet ja agaroosi poistetaan sentrifugoimalla, super-natantti otetaan talteen ja sen tilavuus säädetään 18 5 ml:ksi SM-liuoksella. Yhtä suuri tilavuus 2 M NaCl:a, 20 % PEG6000:a (BDH, Poole, Iso-Britannia) SM:ssä lisätään ja liuokset sekoitetaan ja laitetaan jäihin. 75 minuutin kuluttua faagit pelletoidaan sentrifugoimalla 20 min. nopeudessa 12 000 x g 4°C:ssa. Supernatantti dekantoidaan 10 ja jäännösneste poistetaan Kleenex-kankaan avulla. Pelletti suspendoidaan uudelleen 3 ml:aan SM-liuosta ja seuraavaksi uutetaan 3 ml:11a kloroformia. Vesifaasia käsitellään RNaasi A:11a (67 pg/ml) ja DNaasi I:llä (33 pg/ml) 20 min. 37°C:ssa. Sen jälkeen tämä seos uutetaan 15 lisäämällä 2 ml fenolia, pyörresekoitetaan, lisätään 1 ml kloroformia, pyörresekoitetaan uudelleen ja erotetaan kaksi faasia sentrifugoimalla. Vesifaasi uutetaan vielä kaksi kertaa, 3 ml:11a fenoli/kloroformia (1:1) ja vastaavasti 3 ml:11a kloroformia. DNA saostetaan sen jälkeen 20 vesifaasista lisäämällä perättäisesti 0,3 ml 3 M natrium-asetaatti puskuria (pH 5,2) ja 6 ml etanolia. Tämä seos jätetään 4eC:seen 16 tunnin ajaksi ja sen jälkeen DNA otetaan talteen sentrifugoimalla (10 min., 12 000 x g, 4°C). Pelletti liuotetaan 0,4 ml:aan TE-puskuria, RNaasi A:ta 25 lisätään pitoisuuteen 200 pg/ml ja inkuboidaan 37°C:ssa 1 tunti. DNA saostetaan lisäämällä 38 μΐ 3 M natriumase- • taattipuskuria (pH 5,2) ja 0,8 ml etanolia 4°C:ssa 1 «tl *·' * tunnin kuluessa. DNA otetaan talteen sentrifugoimalla ja liuotetaan seuraavaksi 100 pl:aan TE-puskuria.
"··: 30 V · Esimerkki 3.6: Restriktioanalvvsi A. nioer N400:n PGII:n 1a PGI:n lambda-klooneista "•’t Positiivisista faageista, jotka sisältävät PGII-sekvens- • « sejä, lambda-D ja lambda-E valitaan jatkoanalyysiin.
• · ·.*·; 35 Ensin osoitetaan restriktioanalyysin avulla, että molem- 1*1 mat faagit sisältävät inserttejä, jotka ovat peräisin A. niqer -genomin samalta alueelta, ja seuraavaksi konstru- 105206 83 oidaan lambda-E:n osittainen restriktiokartta.
2 pg faagi-DNA:ta pilkotaan 20 yksiköllä EcoRI:tä tai BamHI:tä tai näiden entsyymien yhdistelmää 100 pl:n tila-5 vuudessa 3 tunnin kuluessa 37°C:ssa toimittajan (BRL) suosittelemassa puskurissa ja 0,8 mg/ml RNaasi A:n läsnä ollessa. Sen jälkeen lisätään 10 pl 3 M natriumasetaat-tipuskuria (pH 5,2) ja seosta uutetaan 80 μ1:η kanssa kloroformia. DNA seostetaan vesifaasista lisäämällä 250 10 μΐ etanolia ja seos asetetaan jäiden päälle 1 tunnin ajaksi. DNA otetaan talteen sentrifugoimalla, liuotetaan 25 pl:aan 1 x näytepuskuria ja kuumennetaan 65°C:ssa 10 min. Näytteet ajetaan 0,7-%:isella agaroosigeelillä käyttäen kokomarkkereina 1 pg HindXII;11a pilkottua lambda-15 DNA:ta (BRL). Geeli valokuvataan UV-läpivalaisijan päällä käyttäen Polaroid 667 -filmiä. DNA siirretään Schleicher & Schiill BA85 -nitroselluloosamembraanille Southern'in (1975) menetelmän mukaisesti, jota Maniatis et ai., 6, on kuvaillut ss. 382-386. Sen jälkeen membraani paistetaan 20 ja hybridisoidaan yhdistettyjen, leimattujen oligonuk-leotidiseosten HR6195 ja 6196 kanssa, joita esimerkissä 3.3 on kuvailtu.
Fragmenttien pituudet lasketaan valokuvasta ja autora-25 diogrammeista vertailemalla tunnettuihin markkerivyöhyk-keisiin. Taulukossa III esitetään pienempien kuin 5 kep • · *" fragmenttien koot, jotka fragmentit on saatu faageista * · · *·’ * lambda-D ja lambda-E eristetyn DNA:n pilkkomisen jälkeen
EcoRI:llä. BamHI:llä ja vastaavasti näiden entsyymien ***** 30 yhdistelmällä. Käytetyn elektroforeesisysteemin erotus- • · · V * kyvyllä ei ole mielekästä vertailla suurempikokoisia fragmentteja. Päätellen joidenkin vyöhykkeiden läsnäolon "*. perusteella, joiden intensiteetti on alentunut EcoRI- • · hydrolysaateissa, EcoRI ei ole kokonaan pilkkonut DNA:ta.
· •.’•i 35 Niiden fragmenttien intensiteetit, jotka ovat läsnä EcoRI- • i * /BamHI-kaksoishydrolysaateissa. mutta ei kummassakaan yksittäisessä hydrolysaatissa, ovat verrattavissa BamHI- 105206 84 fragmenttien intensiteetteihin samalla kokoalueella. Niiden on sen vuoksi edustettava kokonaan pilkkoutuneita tuotteita. Fragmentit, jotka hybridisoituvat yhdistettyjen oligonukleotidiseosten HR6195 ja HR6196 kanssa, 5 ovat, lambda-E:n ollessa kysymyksessä, suurempi kuin 10 kep fragmentti BamHI-hydrolysaatissa, 7,4 kep EcoRI-fraq-mentti ja suurempi kuin 10 kep fragmentti EcoRI-hvdrolv-saatissa, ja 2,8 kep fragmentti sekä suurempi kuin 10 kep fragmentti BamHI/EcoRI-kaksoishvdrolvsaatlssa. Lambda-D:n 10 tapauksessa, fragmentit, jotka hybridisoituvat yhdistettyjen oligonukleotidiseosten HR6195 ja HR6196 kanssa, ovat: suurempi kuin 10 kep fragmentti BamHI-hydrolysaatissa, 5,8 kep fragmentti ja suurempi kuin 10 kep fragmentti EcoRI-hvdrolvsaatissa. ja 1,2 kep fragmentti sekä 15 suurempi kuin 10 fragmentti BamHI/EcoRI-kak- soihydrolysaatissa. Kun havaitaan useampia fragmentteja, esim. EcoRI-hvdrolvsaateissa. suurempaa fragmenttia pidetään osittaisesta katkaisusta syntyneenä tuotteena. Lamb-da-D:stä ja lambda-E:stä saatujen samankokoisten frag-20 menttien hybridisoitumista oligonukleotidiseosten kanssa ei havaita.
Edellä luetelluista eroavuuksista faagien lambda-D ja lambda-E välillä päätellään, että faagit lambda-D ja 25 lambda-E eivät ole identtiset. Taulukossa III luetellaan kuitenkin kaksi EcoRI-fragmenttia, kolme BamHI-frag- * · menttia ja vähintään neljä BamHI-EcoRI-fragmenttia, joi- *·* * den koko on sama lambda-D:ssä ja lambda-E:ssä. Näiden fragmenttien täytyy olla lähtöisin näiden faagien inser-30 teistä, koska vektori ei sisällä EcoRI- tai BamHI-kohtia, l lukuunottamatta BamHI-kohtia. joita käytettiin liittämään \*m Asperqillus-DNA:n fragmentteja vektoriin ja EcoRl-kohtia.
m *1" jotka ovat näiden BamHI-kohtien vieressä ja siten myös *" insertin viereisiä (Frischauf et ai., 9). Siitä päätel- • · !.*·· 35 lään, että faagien lambda-D ja lambda-E insertit ovat peräisin Aj_ niger -genomin samalta alueelta. Yhdessä sen tosiseikan kanssa, että asiaankuuluva hybridisoituva 105206 85
BamHI-EcoRI-fragmentti lambda-D:stä on pienempi kuin vastaava fragmentti lambda-E:stä, esim. 1,2 kep vastaan 2,8 kep, ja olettamuksen kanssa, että havaitut erot res-triktiokuviossa eivät johdu kloonausartefaktista, on 5 seurauksena se, että lambda-D:n hybridisoituvan 1,2 kep BamHI-EcoRI-fragmentin EcoRI-kohta ei ole peräisin A. niaer-PNA:sta eikä ole yksi EcoRI-kohdista, jotka reunus-, tavat tämän faagin inserttiä. Siitä seuraa lisäksi, että toisessa suunnassa lambda-D:n insertti ulottuu enimmil-10 lään 1,2 kep oligonukleotidiseoksen kanssa hybridisoitu-van sekvenssin toiselle puolelle. Lisäksi päätellään, että lambda-E:n sekvenssi, joka hybridisoituu oligonukleotidiseoksen kanssa, sijaitsee 1,2 kep puitteissa Bam-HI-kohdasta hybridisoituvan 2,8 kep BamHI-EcoRI-fraamen-15 tin reunasta (kuvio 1).
< I i ( r I i i i • « ·· ··· • · · • · · » ····· • · · · • · · t t · r 1 ··· ···· • · · f « · a · « • a • · · • · t • t · · • · • « • # · 86 105206
Taulukko III:
Pienempien kuin 5 kep sisältävien fragmenttien likimääräinen koko (kiloemäspareissa), jotka on saatu faageista 5 lambda-D ja lambda-E eristetyn DNA:n pilkkomisen jälkeen restriktioentsyymeillä EcoRI. BamHI ja vastaavasti näiden , entsyymien yhdistelmällä. (P) tarkoittaa fragmentteja, jotka luultavasti ovat tuloksena osittaisesta katkaisusta.
10
EcoRI BamHI EcoRI + BamHI
lambda-D lambda-E lambda-D lambda-E lambda-D lambda-E
4,4 4,4 3,8 3,8 15 3,5(P) 3,2(P) 2,8 2,4 2,4 2,4 2,4 2,2 2,2 2,2 2,2 1,6 1,6 1,6 1,6 20 1,5 1,5 1,2 0,98 0,84 0,84 0 : 0,72 0,72 25 0,68 0,68 ;\i 0,62 0,62 0,62 0,62 • · ·· ·
MM
Lambda-E:n osittaisen restriktiokartan konstruoimiseksi • · ,···. faagi-DNA:ta pilkotaan EcoRI:llä, Xbal:llä. Hindlll: 11a 1 · · 30 ja kaikilla mahdollisilla näiden entsyymien yhdistelmil- . lä. Tämä suoritetaan kahdessa vaiheessa. Ensin 6 pg DNA:- ]#>* ta inkuboidaan 105 min. ajan 37°C:ssa 200 U EcoRI:tä joko • · · ** * ollessa läsnä tai ei 200 μ1:η tilavuudessa, joka sisältää ·;· toimittajan (BRL) suosittamaa puskuria sekä RNaasi A:ta • · · · 35 (2 mg/ml). Reaktioseokset uutetaan sen jälkeen 100 pl:lla « « « ,· , fenoli/kloroformia (1:1) ja sen jälkeen 100 pl:lla kloro- t i · ’· ’· formia. DNA seostetaan tästä vesifaasista lisäämällä 0,1 • M 9 • · • · 105206 87 tilavuutta 3 M natriumasetaattipuskuria ja 2 tilavuutta etanolia. Kymmenen minuutin seisottamisen jälkeen jäiden päällä saostumat kerätään talteen sentrifugoimalla. Pelletit kuivataan ilmassa ja liuotetaan 100 pl:aan TE-pus-5 kuria. Näitä liuoksia käytetään sitten seuraavia in-kubointeja varten joko restriktioentsyymin puuttuessa (EcoRI:llä pilkottua materiaalia vain) tai Hindin:n.
Xbal;n tai näiden entsyymien yhdistelmän läsnä ollessa. Inkuboinnit suoritetaan 2 tunnin kuluessa 37°C:ssa 20 μ1:η 10 tilavuudessa, joka sisältää 10 μΐ sopivaa DNA-liuosta, RNaasi A:ta (2 mg/ml), 10 U sopivaa restriktioentsyymiä ja toimittajan (BRL) suosittamaa puskuria. Inkubaatio pysäytetään lisäämällä 5 μΐ 5 kertaisesti väkevöityä näytepuskuria ja näytteet analysoidaan myöhemmin kuten 15 edellä on kuvailtu.
Autoradiogrammissa havaitaan yksi ainoa hybridisoiva vyöhyke, joka on suurempi kuin 10 kiloemästä, Hind-111:11a, Xbal:llä ja näiden kahden entsyymin yhdis-20 telmällä saaduissa hydrolysaateissa. Suurinpiirtein samankokoinen vyöhyke on läsnä kaikissa muissa hydrolysaateissa, vaikka intensiteetiltä vaimeampana, mikä osoittaa, että entsyymit eivät ole kokonaan katkoneet DNA:ta. Toinen ja voimakkaimmin hybridisoituva vyöhyke EcoRI-:25 hydrolysaatissa edustaa 7,4 kep fragmenttia. Osoittaen jälleen epätäydellistä pilkkomista, tämä vyöhyke on läsnä •
EcoRI:n ja toisen entsyymin hydrolysaateissa, vaikkakin ]·’··, intensiteetiltään vaimeampana. EcoRI/HindiII-kak- « · soishydrolysaatista ja EcoRI/HindiII/Xbal-koi- _ 1 · - ' 30 moishydrolysaatista saadaan 3,6 kep hybridisoituva frag mentti. Hybridisoituva 4,1 kep fragmentti havaitaan kak- » 1 ’ soishydrolyysissä entsyymeillä EcoRI ja Xbal. Tämä frag- • · · ·.· 1 mentti on läsnä myös kolmoishydrolysaatissa entsyymeillä m
EcoRI. Hindin ja Xbal mutta intensiteetiltään hyvin vai- • « · « .···. 35 meana. Jälkimmäisessä tapauksessa 4,1 kep fragmenttia • 1 ' pidetään osittaisena katkaisutuotteena.
* 1 1 1 » · 1 • # ♦ · * 1 * » • « · 105206 88 Päätellään, että 7,4 kep EcoRI-fragmentti. joka hybri-disoituu yhdistettyjen oligonukleotidiseosten HR6195 ja HR6196 kanssa, voidaan katkaista jollakin entsyymeistä Xbal, Hindin tai BamHI. ja että näiden entsyymien kat-5 kaisukohdan sijainnin täytyy olla kuten kuviossa 1 on esitetty. Tämä kuva esittää vain osittaista restriktio- > karttaa, esim. 7,4 kep EcoRI-fragmentti voisi vielä sisältää enemmän kuin yhden katkaisukohdan jollekin entsyymeistä Hindlll. Xbal ja BamHI. jossa tapauksessa vain se 10 kohta, joka on lähinnä spesifistä sekvenssiä, joka hybri-disoituu yhdistettyjen oligonukleotidiseosten kanssa, on esitetty.
Xbal- tai Hindlll-pilkkoutumista ei saada aikaan faagilla 15 lambda-D, mutta otaksutaan, että Xbal- ja HindIII-re-striktiokohdat sijatsevat kuten faagissa lambda-E.
Yhdeksästä positiivisesta kloonista, jotka kuljettavat PGI-geenisekvenssejä, neljä faagia PGI-lambda-4,lambda-20 5,lambda-6 ja lambda-7 valitaan jatkoanalysointia varten.
Ensin osoitetaan, että faagit sisältävät inserttejä, jotka ovat peräisin Aj_ nioer -genomin samalta alueelta, ja seuraavaksi tehdään lambda-5:n osittainen restrik-tiokartta kuten edellä on kuvailtu PGII-geenisekvenssin 25 osalta, joka sisältää faagit D ja E. DNA pilkotaan re- striktioentsyymeillä (entsyymeistä taulukossa IV), kuten • 9 entsyymitoimittajät ovat suositelleet. Fragmentit erote- • Ml .···. taan agaroosigeelillä ja blotataan nitroselluloosalle • · '•ym kuten edellä on kuvailtu. Sen jälkeen membraani pais- a · · 30 tetaan ja hybridisoidaan PGII:ta koodattavan raken- v negeenin aikaisemmin katkoluetun 1,2 kiloemästä (ke) sisältävän BamHI/EcoRI-fragmentin kanssa. Tämä fragmentti
• M
V5 on peräisin plasmidista pGW1803, jota kuvaillaan esimer- · kissä 3.8. Fragmentti eristetään agaroosigeelipaloista ja • M* .1·. 35 50 ng fragmenttia katkoluetaan kuten Maniatis et ai. (ss.
# 109-112), 6, on kuvaillut. Ennen sen lisäämistä hybridi- • · · *· "· saatioseokseen, katkoluettu DNA denaturoidaan 10 min.
(»» • · • · 105206 89 aikana kiehuvassa vesihauteessa. Nitroselluloosasuotimet hybridisoidaan radioaktiivisen koettimen kanssa kuten esimerkissä 3.8 on kuvailtu, paitsi että esihybridisaa-tion ja hybridisaation lämpötila on 60eC. Sen jälkeen 5 membraanit pestään 60°C:ssa käyttämällä esilämmitettyä puskurisarjaa. Ensin membraanit huuhdellaan 6 x SSC:ssä ja pestään kahdesti 0,5 tunnin ajan hybridisaatiopus-_ kurissa. Sen jälkeen suotimet pestään perättäisesti 4 x SSCrssä ja 2 x SSC:ssä 30 min. ajan puskuria kohti. Nämä 10 puskurit sisältävät sekä 0,1 % SDS:ää että 0,1 % Na4P207x-10H20:ta. Viimeisen pesun jälkeen membraanit huuhdellaan lyhytaikaisesti 0,lxSSC:ssä ja sen jälkeen niiden annetaan kuivua ja myöhemmin ne valotetaan röntgensädefil-mille.
15 Käytettävä koetin edustaa pientä osaa PGII:n promoottorialueesta (200 emäsparia) ja suuren osan koodittavasta sekvenssistä. Kuvailluissa hybridisaatio-olosuhteissa tällä koettimella saadaan voimakkaita signaaleja kaikkien 20 edellä eristettyjen faagien kanssa (esimerkki 3.4), jotka sisältävät PGI-geenisekvenssejä.
Fragmenttien pituudet lasketaan valokuvasta ja autora- i '·' diogrammeista vertailemalla tunnettuihin markkerivyöhyk- 25 keisiin. Taulukossa IV luetellaan hybridisoituvat frag- \· mentit ja niiden likimääräiset koot.
• · • · ·
MM
.··. Taulukko IV: • ·
Likimääräinen koko hybridisaatiofragmenteilla (kiloemäs- Λ 1 1 1 * 1 30 paria), jotka on saatu PGI lambda-4-7:stä eristetyn DNA:n pilkkomisen jälkeen restriktioentsyymeillä EcoRI , BamHI.
T 1 1 XhoI ja näiden entsyymien yhdistelmillä, samoin kuin Bam- »«1 V: HI/BglII:11a « · · • « · · • · · • · • · • · · * · » · » • · · • · · · • · • · • ♦ 9 105206 90
Faagi
Restriktio- lambda-4 lambda-5 lambda-6 lambda-7 entsyymi 5
BamHI 8,6 8,6 s 23 8,6
EcoRI 6,4 6,4 6,4 6,4
EcoRI /BamHI 6,4 6,4 6,4 6,4
XhoI 2: 23 2 23 £23 £ 23 10 XhoI/EcoRI 2,0 2,0 2,0 2,0
BamHI/BqlII 7,5 7,5 £ 23 7,5
Taulukosta IV selviää, että kaikki faagit sisältävät 6,4 kep EcoRI-fragmentin ja 2,0 kep XhoI/EcoRI-fragmentin.
15 kun taas EcoRI/BamHI-kaksoishvdrolvsaatti johtaa myös 6,4 kep fragmenttiin. Faageilla lambda-4, lambda-5 ja lambda-7 on myös identtisiä fragmentteja pilkottaessa BamHI:llä (8,6 kep) ja BamHI/BqllI:11a (7,5 kep). Vektori ei sisällä BamHI-kohtia lukuun ottamatta BamHI-kohtia, joita on 20 käytetty Asperqillus-DNA:n fragmenttien liittämiseksi (Frischauf et ai., 9). Näiden kolmen faagin inserttien katsotaan sen vuoksi olevan peräisin A_^ niqer -genomin samalta alueelta.
25 Osittaisen restriktiokartan konstruoimiseksi lambda-5 . .. faagi-DNA:ta pilkotaan myös Kpnl:llä. Smal:llä. SstI:llä • · .;· ja Sali:llä ja BamHI:llä yhdessä näiden entsyymien kans- • M» .···. sa. Lisäksi analysoidaan Bqlll/XhoI-hydrolvsaatti. Kaikki • « ,···, nämä inkuboinnit suoritetaan myös 3 tunnin kuluessa 37°C:- • · · 30 ssa, paitsi Smal:n kohdalla (30°C), 20 μ1:η tilavuudessa, ' , joka sisältää 1 pg faagi-DNA:ta. Taulukossa V on lueteltu | 1 fragmentit, jotka hybridisoituvat PGII:n koettimen kanssa *.1 1 60°C:ssa.
« • · · « · « 1
• · I
• · « ·
III
· • · · • M • · • · · • « • · 91 105206
Taulukko V:
Likimääräiset koot hybridisoituville fragmenteille (kilo-emäsparia), jotka saatiin PGI-lambda-5:stä eristetyn 5 DNA:n pilkkomisen jälkeen restriktioentsyymeillä Bgl.II, Kpnl. Smal. SstI.'Sali ja BamHI:llä yhdessä näiden entsyymien tai XhoI:n kanssa. Kaksoishydrolysaatti ΒσΙΙΙ/Xho-I on myös esitetty.
10 Fragmentin pituus
Fragmentin pituus
Restriktioentsyymi (kep) Restriktioentsyymi (kep)
BamHI 8,6 15 Bglll 9,7 BamHI/Bglll 7,5
Kpnl 5,1; 2,7 BamHI/XhoI 4,2
EcoRI 6,4 Balll/XhoI 3,0
Smal 4,7 BamHI/Kpnl 4,8; 2,8
SstI 9,9 BamHI/SstI 8,3 20 Sali 8,9 BamHI/Sali 8,5 PGI-lambda-5:n restriktiokartta voidaan laatia myös hyb-ridisoituvista fragmenteista, joista voidaan päätellä, I t v että polygalakturonaasi I:tä koodittava geeni sijaitsee 25 8,6 kep BamHI-fragmentissa.
* I .
• ·
Esimerkki 3.7: pGW1800:n ia pGW1803:n konstruointi ···* .···. Faagien lambda-D ja lambda-E asiaankuuluvat EcoRI-Xbal- • o .···. fragmentit liitetään pEMBL-vektoreihin (Dente ja Cortese, _ · · · 30 10), josta ovat tuloksena plasmidit pGW1803 ja vastaavas- . ti pGW1800.
r ***** «·· *·* ’ Kuviosta 1 ja esimerkistä 3.5 päätellään, että faagilla ··· lambda-D on oltava 2,5 kep EcoRI-Xbal-fragmentti, joka on • · · · .·*·. 35 identtinen faagi lambda-E:n EcoRI-Xbal-fragmentin osan « « · / , kanssa. 6 pg lambda-D:n DNA:ta pilkotaan 60 U:lla Xbal:tä • · · *· *: 2 tunnin ajan 37°C:ssa 200 ui:n tilavuudessa BRL:n suosit- » · * * · • · • · 105206 92 telemassa puskurissa, joka sisältää RNaasi A:ta (1,5 mg/-ml). NaCl-pitoisuudeksi säädetään sen jälkeen 140 mM, väkevöityä reaktiopuskuria lisätään tilavuuden lisääntymisen kompensoimiseksi, 60 U EcoRI:ta lisätään ja in-5 kubointia jatketaan 2,5 tunnin ajan 230 μ1:η tilavuudessa. Reaktioseos uutetaan sen jälkeen 100 pl:lla kloroformia ja DNA saostetaan vesifaasista lisäämällä 0,1 tilavuutta 3 M natriumasetaattipuskuria (pH 5,2) ja 2 tila- ^ vuutta etanolia. Inkuboinnin jälkeen 4°C:ssa 16 tunnin 10 ajan DNA otetaan talteen sentrifugoimalla, pelletti kuivataan ilmassa ja liuotetaan sen jälkeen näytepuskuriin. Restriktiofragmentit erotetaan 0,6-%:isella, sulamispisteeltä alhaisella agaroosi (BRL)-geelillä 0,5 x TBE-pus-kurissa, joka sisältää etidiumbromidia. DNA-fragmentit 15 tehdään näkyviksi UV-valossa ja geelipala, joka sisältää 2,5 kep EcoRI-Xbal-fragmentin, eristetään.
Faagi-lambda-E:n DNA:ta inkuboidaan restriktioentsyymien
Xbal ja EcoRI kanssa, pääasiallisesti kuten edellä on ku- 20 vailtu. DNA saostetaan kloroformilla uuttamisen jälkeen, pelletoidaan sentrifugoimalla, liuotetaan näytepuskuriin ja ajetaan elektroforeesilla 0,6-%:isella agaroosigeelil- lä 1 x TBE-puskurissa. Geelipala, joka sisältää 4,1 kep
Xbal-EcoRI-fragmentin, otetaan talteen ja säilytetään - 25 20°C:ssa. Silanoitu lasivillatulppa laitetaan 0,5 ml:n _ mikrosentrifugikoeputken pohjalle, joka sisältää 60 μΐ väkevää TE-puskuria (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM ED- .···. TA). Geelipala sulatetaan, laitetaan koeputkeen ja putki • · jäädytetään nestetypessä. Pieni reikä lävistetään pienen • · · ' 30 putken pohjaan ja se laitetaan 1,5 ml:n mik- " rosentrifugiputkeen, ja geelipalan sisältämä puskuri ja * ’ DNA otetaan talteen sentrifugoimalla. Geelipalan jäänteet • · · V : suspendoidaan 50 pl:aan väkevää TE-puskuria, tämä suspen- « sio jäädytetään jälleen nestetypessä ja puskuri otetaan
• · · I
35 talteen sentrifugoimalla. Eluaatit yhdistetään sen jäl- #· t keen ja uutetaan 100 piillä kloroformia. DNA saostetaan • · *· *: vesifaasista, otetaan talteen sentrifugoimalla ja liuote- • · · • 9 9 9 9 4 9 105206 93 taan 40 pl:aan TE-puskuria. DNA-pitoisuus estimoidaan agaroosigeelielektroforeesin avulla, minkä jälkeen vyöhyke tehdään näkyväksi UV-valossa, ja käytetään 1 pg lamb-da-DNA:ta (BRL), pilkottuna Hindin:11a. vertailuna.
5 pEMBL18- ja pEMBLl9-vektorit valmistetaan pilkkomalla pe-rättäisesti Xbal:llä ja EcoRI:llä toimittajan (BRL) suosittamissa olosuhteissa. DNA:n uuttaminen fenolilla, fenoli/kloroformilla (1:1) ja kloroformilla ja DNA:n 10 seostaminen etanolilla suoritetaan kuten Maniatis, 6, on kuvaillut, paitsi että jätetään pois isoamyylialkoholi kloroformiliuoksesta ja DNA:n saostamiseen käytetty lämpötila on 4°C.
15 DNA-fragmentit liitetään sopivaan vektoriin 25 pl:n reak- tiotilavuudessa, joka sisältää BRL:n suosittelemaa puskuria sekä ATP:tä (1 mM), 1,5 U T4 DNA -ligaasia (BRL), 100 ng vektori-DNA:ta, joka on valmistettu kuten edellä on kuvailtu, ja asiaan kuuluvan restriktiofragmentin.
20 Xbal:llä ja EcoRI:llä pilkottua pEMBL18:ta käytetään pGW1800:n konstruointiin sekä ekvimolaarinen määrä puhdistettua 4,1 kep Xbal-EcoRI-fragmenttia lambda-E:stä.
.'1' Reaktioseosta inkuboidaan 16 tuntia 16°C:ssa, ja reaktio 25 pysäytetään sen jälkeen lisäämällä 125 μΐ tislattua vettä ja jäädyttämällä. Xbal:llä ja EcoRI:llä pilkottua pEMBL-19:ta käytetään pGWl803:n konstruointiin. Tässä tapauk-sessa agaroosipala, joka sisältää D:n 2,5 kep Xbal-EcoRI-fragmentin, sulatetaan 60°C:ssa ja 4 μΐ, joka sisältää ; *.* * 30 noin 15 ng DNA:ta, lisätään 11 pl:aan tislattua vettä, minkä jälkeen lisätään muut reaktioseoksen komponentit.
»· Ligaatioreaktion annetaan jatkua 14 tuntia 20°C:ssa, minkä ϊ jälkeen lisätään T4 DNA -ligaasia 1 lisäyksikkö. Reak- I:. tiota jatketaan vielä 7 tuntia ja sen jälkeen reaktio 35 pysäytetään kuten edellä on kuvailtu.
• · • · · • · :.’*i 50 μΐ tuloksena olevista ligaatioreaktioseoksista käy- • · · • · • · • »· 105206 94 tetään E. coli:n transformointiin kuten on kuvailtu BRL:n Ml3-kloonaus/dideoksisekvensointimanuaalissa (ss. 30-33, 11), paitsi että E. coli DH5aF':a ja E. coli JM 109:ää kasvatetaan OD550-arvoihin 0,7 ja vastaavasti 0,9, ennen 5 pullojen asettamista jäiden päälle. Ensin mainittu kanta transformoidaan käyttämällä fragmentin lambde-D sisältä- ^ vää ligaatioreaktioseosta, jälkimmäinen kanta transformoidaan käyttämällä fragmentin lambda-E sisältävää ligaa- ’ tioreaktioseosta. Lämpöshokin jälkeen soluja inkuboidaan 10 jäiden päällä kaksi minuuttia, ja sen jälkeen lisätään 1 ml LB-alustaa ja soluja inkuboidaan 37°C:ssa 1 tunnin ajan. Solut sentrifugoidaan pieninopeuksisella sentrifu-goinnilla, 1 ml supernatanttia poistetaan ja solut resus-pendoidaan varovasti. Sen jälkeen solut maljataan LB-15 agarmaljoille, jotka sisältävät 100 pg/ml ampisilliiniä, ja joiden pinnalle oli levitetty IPTG/X-gal-liuosta (= 200 μΐ H20:ta, 30 μΐ dimetyyliformamidia, joka sisältää 2 % X-gal:ia, ja 20 μΐ 24 mg/ml IPTG-liuosta vedessä).
Maljoja inkuboidaan yli yön 37°C:ssa.
20
Useita valkoisia erillispesäkkeitä käytetään yli yön kasvaneiden viljelmien saamiseksi LB-alustaan, joka si- * sälsi 0,1 % glukoosia ja 75 μg/ml ampisilliiniä. Näitä viljelmiä käytetään plasmidin eristämiseksi, käyttäen 25 Holmes'in ja Quigley'n, 12, pienimittaista (miniprep) ^ menetelmää. Plasmidit pilkotaan useilla restrik- ·· tioentsyymeillä toimittajan (BRL) suositusten mukaisesti • · · · ;***; ja RNaasi A:n (0,5 mg/ml) läsnä ollessa, ja tuotteet • · · analysoidaan agaroosigeelillä. Plasmidit, jotka tuottavat 30 odotetunkokoisia Xbal-EcoRI-. BamHI-EcoRI- ja Hindlll- fragmentteja, valikoidaan, ja E. coli -soluja, jotka ... sisältävät niitä, säilytetään -20°C:ssa.
< · · • Φ · m • •J· Kaksi uutta plasmidia konstruoidaan. pGW1800 on faagi 35 lambda-E:n 4>1 kep Xbal-EcoRI-fragmentti liitettynä vek- . toriin pEMBL18. pGW1803 on faagi lambda-E:n 2,5 kep Xbal- • · · ~ *!..* EcoRI-fragmentti liitettynä vektoriin pEMBLl9.
• · • 9 m j m 95 1052 06
Esimerkki 3.8: pGW1800:n 1a pGW1803:n restriktioanalvvsl pGW1800:n ja pGWl803:n välinen yhteys varmistetaan laajennetulla restriktioanalyysillä. Spesifinen sekvenssi, 5 joka hybridisoituu yhdistettyjen oligonukleotidien HR6195 ja HR6196 kanssa, osoitetaan pGW1803:n spesifiselle alueelle. Kloonausartefaktien, kuten A^_ niaer -peräisten DNA-fragmenttien deleetioiden ja ligaatioiden, puuttuminen osoitetaan vertailemalla restriktiofragmentteja, 10 jotka saadaan plasmidista pGW1800 ja vastaavasti A.;, niaer N400:n DNA:sta.
pGW1800:aa ja pGW1803:a lisätään E. coli -kannassa JM109 ja vastaavasti DH5aF', ja plasmidi-DNA:ta otetaan talteen 15 250 mlrsta yli yön kasvaneista viljelmistä LB-alustassa, joka sisältää 0,1 % glukoosia ja 100 pg/ml ampisilliiniä, kuten Maniatis et ai. (ss.90-91; 6) on kuvaillut, ja sus-pendoidaan lopuksi TE-puskuriin. Koska pGW1800:aa käytetään myös A;, niaer:n transformoinein, se puhdistetaan 20 jakamalla vyöhykkeisiin keesiumkloridigradientissa. 2,5 ml:aan DNA:n TE-liuosta lisätään 3,3 g CsCl:a ja 1 ml etidiumbromidia (10 mg/ml vedessä). Sentrifugointi suoritetaan Beckman"'in VTi 65.2 -roottorissa 20°C:ssa 16
I I
tunnin ajan nopeudessa 45 000 rpm. Kahdesta UV-valossa I · 25 näkyvästä fluoresoivasta vyöhykkeestä alempi, joka sisäl-•.‘i tää kovalenttisesti suljettua rengasmuotoista plasmidi- tt*j· DNA:ta, otetaan talteen putken kyljestä lävistäen. DNA- liuosta (suunnilleen 1 ml) uutetaan 5 kertaa vedellä
• M
kyllästetyllä butanolilla etidiumbromidin poistamiseksi. 30 Tilavuus säädetään sen jälkeen 15 ml:ksi vedellä, ja DNA saostetaan lisäämällä 30 ml etanolia. DNA otetaan talteen • · T ...# sentrifugoimalla ja sen jälkeen pelletti pestään kerran • t · *. 75-%:isella etanolilla, ja seuraavaksi se liuotetaan TE- puskuriin ja sitä säilytetään -20°C:ssa. pGW1803:a ei 35 eristetä CsCl-gradientista, vaan nopeammalla menet-,·’ ; telyllä. RNaasi A:ta lisätään 4 ml:aan DNA-liuosta pitoi- · i suuteen 100 pg/ml, ja tätä seosta inkuboidaan 37°C:ssa 1 * · • i · 105206 96 tunti ja uutetaan myöhemmin yhtä suurella tilavuudella fenolia, fenoli/kloroformia (1:1) ja kloroformia. Sen jälkeen DNA saostetaan vesifaasista lisäämällä 0,4 ml 3 M natriumasetaattipuskuria pH 5,2 ja 8 ml etanolia. DNA 5 otetaan talteen sentrifugoimalla, tuloksena oleva pelletti pestään 75-%:isella etanolilla ja kuivataan ilmassa ja ' liuotetaan seuraavaksi TE-puskuriin.
r A. nicrerin DNA:ta eristetään lievästi modifioidulla mene- 10 telmällä, jota käytetään kasvien RNA:n eristämiseksi (Slater, 21). Rihmasto pestään saliinilla, jäädytetään nestetypessä ja 2,5 g hajotetaan käyttäen mikrorepijää (Braun). Rihmastojauhe uutetaan juuri valmistetun uut- topuskurin kanssa. Uuttopuskuri valmistetaan seuraavasti: 15 5 ml:aan tri-isopropyylinaftaleenisulfonihappoa (TNS, 20 mg/ml) sekoitetaan 5 ml p-aminosalisyylihappoa (PAS) (120 mg/ml) ja 2,5 ml 5 x RNB-puskuria (5 x RNB sisältää 121,1
g Tris:iä, 73,04 g NaCl:a ja 95,1 g EGTA:aa 1 l:ssa, pH
8,5). Kun fenolia on lisätty 7,5 ml, uuttopuskuria tasa- 20 painotetaan 10 min. 55°C:ssa. Lämmintä puskuria lisätään sen jälkeen rihmastojauheeseen ja suspensiota sekoitetaan 2 min. Sitten lisätään 5 ml kloroformia ja sekoitetaan 2 min. Faasit erotetaan sentrifugoimalla (10 min. 10 000 x g) ja vesifaasi uutetaan vielä kerran 10 ml:11a fenoli/- 25 kloroformia (1:1) ja sen jälkeen kahdesti kloroformin . .. kanssa.
• · • · · ··· · ·**'; Vesifaasi sisältää sekä RNA:ta että DNA:ta. DNA saoste- • · · .·;·. taan 2 tilavuudella etanolia huoneen lämpötilassa ja 30 otetaan talteen sentrifugoimalla (10 min. 10 000 x g), pestään kahdesti liuottamalla uudelleen steriiliin tis-
... lattuun veteen ja seostamalla jälleen etanolilla. RNA
• · · * poistetaan lisäämällä RNaasi A:ta (20 pg/ml) lopulliseen •J* liuokseen.
···· * * * _ _ : : 35 • * · / . pGW1800:n ja pGW1803:n fysikaalisten karttojen konstru- *,.* oimiseksi valmistetaan useita reaktioseoksia, jotka si- • · • · • I · 105206 97 sältävät suunnilleen 1 pg plasmidi-DNA:ta, RNaasi A:ta pitoisuudessa 1 mg/ml (vain pGW1803:n ollessa kysymyksessä), BRL:n suosittelemaa asiaan kuuluvaa puskuria ja 10 yksikköä restriktioentsyymiä, ottaen huomioon, että 5 eri entsyymit valitaan erillisiä reaktioseoksia varten. Useissa tapauksissa valitaan kahden eri entsyymin yhdistelmä, tai plasmidi-DNA katkaistaan tietyllä entsyymillä tai entsyymiyhdistelmällä, jota seuraa DNA:n seostaminen natriumasetaatin ja etanolin läsnä ollessa ja sen jälkeen 10 DNA:n talteenotto sentrifugoimalla, jota materiaalia käytetään sitten substraattina toiselle tai kolmannelle restriktioentsyymille. Reaktioseoksia inkuboidaan 37°C:ssa 1 tunnin ajan, sen jälkeen reaktio pysäytetään lisäämällä 5 kertaa väkevöityä näytepuskuria, ja seuraavaksi reak-15 tiotuotteet analysoidaan l-%:isella agaroosigeelillä TBE-puskurissa. Spesifisten fragmenttien lasketusta koosta päätellään yksittäisten restriktioentsyymikohtien paikka suhteessa vertailupisteeseen, joka on keinotekoisesti valittu ainoassa Xbal-kohdassa. pGW1800:n restrik-20 tiokartta esitetään kuviossa 2. pGWl803:n A_j, niaer -pe- räisen DNA:n restriktiokartta (ei esitetty) on identtinen pGW1800:n kartan kanssa Xbal-kohdassa paikassa 1, Hindi -kohtaan paikassa 2000. pGWl803 ei kuitenkaan sisällä
f I
' BolII-kohtaa. joka on läsnä paikassa 2400 pGW1800:ssa.
25 pGWl800:n 0,4 kep Hindi-Bglll-fragmentti liikkui elekt-roforeettisesti samalla tavalla kuin pGW1803:n HincII-·;· EcoRI-fragmentti, joka sijaitsee A^_ niaer -peräisen in- sertti-DNA:n lopussa. Otaksutaan, että pGW1803:n A^. niger • · · -peräinen DNA on identtinen pGW1800:n Aj_ niaer -peräisen * 30 DNA:n kanssa Xbal-kohdan, paikassa 1, ja paikan välillä, #joka on hyvin lähellä tai kohdalla, mutta ei mukaan-• · T ... lukien, BglII-kohtaa paikasa 2400. Faagin lambda-D EcoRI- t · · *·; ’ Xbal-fragmentin päätelty koko, 2,5 kep (esimerkki 3.6) "* osoittaa siten lievää yliestimointia.
• Ml "* M» - _ : : 35 • · · / . Spesifisen sekvenssin paikantamiseksi, joka hybridisoituu yhdistettyjen oligonukleotidiseosten HR6195 ja HR6196 • * • »· 105206 98 kanssa, pGW1803:n DNA katkaistaan ja tuloksena olevat fragmentit erotetaan kuten edellä on kuvailtu. DNA siirretään sen jälkeen nitroselluloosamembraanille ja sen annetaan hybridisoitua yhdistettyjen ja leimattujen oli-5 gonukleotidiseosten HR6195 ja HR6196 kanssa kuten edellä on kuvailtu. Fragmentit, jotka hybridisoituvat yhdistettyjen oligonukleotidiseosten HR6195 ja HR6196 kanssa, ovat 0,64 kep Hindi-fragmentti Hindi-hvdrolvsaatissa ja · 0,62 kep NcoI-EcoRI-fragmentti Ncol/EcoRI-kak-10 soishydrolysaatissa. Otaksutaan, että spesifinen sekvenssi, joka hybridisoituu yhdistettyjen oligonukleotidiseosten HR6195 ja HR6196 kanssa, sijaitsee Ncol-kohdan, paikassa 1750, ja Hindi-kohdan, paikassa 2000, välissä pGWl803:n restriktiokartassa, jotka koordinaatit 15 vastaavat samaa sekvenssiä pGW1800:n restriktiokartalla.
Kloonausartefaktien puuttuminen osoitetaan vertailemalla pGW1800:n restriktiofragmentteja niaer N400:n DNAista saatuihin restriktiofragmentteihin. pGW1800:n hydroly-20 saatteja valmistetaan kuten edellä on kuvailtu. Kannan N400 kromosomaalisen DNA:n hydrolysaatteja valmistetaan 37°C:ssa 200 μ1:η reaktiotilavuudessa, joka sisältää 2 yg DNA:ta, 0,5 mg/ml RNaasi A:ta, BRL:n toimittamaa reak- < I | tiopuskuria (REact Buffer 2 XhoI:lie. Xbal:lie. EcoRV:lie v 25 ja Bglll:lie. REact Buffer 4 Kpnlille ja REact Buffer 3
EcoRI:lie ja Sällille) ja 80 yksikköä kutakin käytettyä ··· restriktioentsyymiä kohti. Reaktioseosta inkuboidaan 2 ···· :***: tuntia ja uutetaan sen jälkeen 100 yl:lla kloroformia.
• · ·
Sen jälkeen DNA saostetaan vesifaasista lisäämällä 20 μΐ 30 3 M natriumasetaattipuskuria pH 5,2 ja 0,5 ml etanolia, . minkä jälkeen seisotetaan jäiden päällä 45 min. DNA ote- • · ... taan sitten taas talteen sentrifugoimalla ja kuivataan • · · *\ * ilmassa. DNA liuotetaan näytepuskuriin, ja nämä näytteet tf".‘ ja pGW1800:n hydrolysaatit ja lambda-DNA:n kokomarkkerit 35 ladataan 0,7-%:iselle agaroosigeelille TBE-puskurissa.
• · · .* . Elektroforesoinnin jälkeen muodostunut kuvio dokumen- • · · !..* toidaan ja A_;_ nigerin kromosomaalisen DNA:n hydrolysaat- « · « · • I · 105206 99 tikaistojen DNA siirretään nitroselluloosa membraanille, kuten edellä kuminankin osalta on kuvailtu. Membraani paistetaan ja katkaistaan kahteen osaan, jotka hybridi-soidaan eri koettimien kanssa.
5
Hybridisaatiossa käytetyt koettimet olivat pGW1800:n katkoluetut 1,45 kep ja 2,05 kep EcoRV-Bqlll-fraamentlt. Fragmentit eristetään ennalta agaroosigeelipaloista kuten edellä on kuvailtu, ja 100 ng fragmenttia katkoluetaan 10 erillisissä reaktioissa kuten Maniatis et ai. (ss. 109-112, 6) on kuvaillut. Ennen hybridisaatioseokseen lisäämistä katkoluettu DNA denaturoidaan 10 min. ajan kiehuvassa vesihauteessa.
15 Paistetut nitroselluloosasuotimet kostutetaan 3xSSC:ssä ja siirretään sen jälkeen erillisille maljoille, jotka sisältävät 100 ml esilämmitettyä (68°C) hybridisaatio- puskuria, joka sisältää 6xSSC:tä, 10 mM EDTAraa, 0,1 mg/ml juuri lisättyä hierrettyä ja denaturoitua sillin 20 sperman DNA:ta, 0,1 % Na4P2O7xl0H2O: ta, 0,5 % SDS:ää ja 5xDenhardt’in liuosta (0,1 % BSA, Boehringer-fraktio V, 0,1 % Ficoll 400, Pharmacia; 0,1 % polyvinyylipyr- rolidoni-10, Sigma). Esihybridisaatio tapahtuu 2 tunnin aikana 68°C:ssa ravistelevassa vesihauteessa, ja sen 25 jälkeen hybridisaatiopuskuri korvataan tuoreella pusku- .. rilla (75 ml), johon katkoluettu koetin myöhemmin lisä- ·;· tään. Hybridisaation annetaan jatkua 68°C:ssa vähintään 16 ·««« tunnin ajan. Sen jälkeen membraanit pestään 68°C:ssa M· .·;·. käyttäen esilämmitettyä puskurisarjaa, jotka kaikki pus- • i « T ’ 30 kurit sisältävät 0,1 % SDS:ää ja 0,1 % Na4P2O7xl0H2O:ta, , mutta SSC:n määrän aletessa. Membraanit huuhdellaan ensin * ... 4xSSC:ssä ja sen jälkeen ne pestään 4xSSC:ssä kahdesti 10 • · · '·*' * min. ajan. Sen jälkeen suotimet pestään perättäisestä ·:· 4xSSC:ssä, 2xSSC:ssä, 0,5xSSC:ssä, 0,2xSSC:ssä ja 0,lx- 1(1« 35 SSCrssä 30 min. puskuria kohti. Viimeisen pesun jälkeen • · · . membraanit huuhdellaan lyhytaikaisesti 0,lxSSC:ssä ja sen • » · jälkeen niiden annetaan kuivua, ja myöhemmin ne valote- • · • « • · · 100 105206 taan röntgensädefilmille.
Membraani, jota on koetinkäsitelty 1,45 kep gcoRV-Bglli-fragmentin kanssa, sisältää seuraavat hybrldlsoituvat 5 fragmentit: 2,4 kep fragmentti Xhol-hvdrolvsaatissa. 2,8 kep ja 1,2 kep fragmentit Kpnl-hvdrolysaatissa ja 1,3 kep fragmentti Bgl.II/EcpRV-kaksoishydrolysaatissa. Membraani, jota on koetinkäsitelty 2,05 kep EcpRV-Bqlll-fraqmentin · kanssa, sisältää seuraavat fragmentit: suuri, suunnilleen 10 11 kep fragmentti EcoRI/Sali-kaksoishydrolysaatissa, 2,3 kep ja 2,1 kep fragmentit Xhol-hvdrolvsaatissa. 2,3 ja 1,4 kep fragmentit XhoI/Xbal-kaksoishvdrolvsaatissa. 1,2 kep fragmentit Kpnl-hydrolysaatissa ja 2,0 kep fragmentti EcoRV/BqllI-kaksoishydrolysaatissa.
15
Neljän osalta hybrldisoituvista fragmenteista vain olemassaolo ja minimikoko voidaan osoittaa pGWl800:n re-striktiokartalta, so.fragmentit, jotka ovat homologisia käytetyn koettimen kanssa, mutta joista toinen pää on 20 ulkopuolella sekvenssin, joka on läsnä pGW1800:ssa. Nämä fragmentit ovat, 2,05 kep EcoRV-BqlII-koettimen tapauksessa, fragmentti EcoRI/Sali-hydrolysaatissa, 2,1 kep fragmentti Xhol-hvdrolvsaatissa ja 3,2 kep fragmentti Kpnl-hvdrolysaatissa. ja 1,45 kep EcoRI-Bqlll-koettimen 25 tapauksessa, 2,8 kep fragmentti Kpnl-hvdrolvsaatissa.
Nämä fragmentit ovat kaikki suurempia kuin minimikoko, ·· joka päätellään pGW1800:n restriktiokartalta. Genomisen • « · · A*, nicer -DNA: n eri hybridi soi tuvat fragmentit voidaan • · · korreloida fragmenttien kanssa, jotka ovat läsnä pGW1800- • · · 30 :n hydrolysaateissä, ja kaikilla on laskettu koko, joka ^> on hyvin lähellä kokoa, joka on päätelty pGW1800:n re- ... striktiokartalta. Päätellään, että pGW1800:n nioer - • · · *·* * peräinen DNA on luotettava kuva osasta A^. nicer N400 - mm'\’ genomia.
35 • · · .* . Esimerkki 3.9: pGW1900:n 1a pGW1902:n restriktioanalvvsi • · ·
Faagin PGI-lambda-7 8,6 kep BamHI-restriktiofragmentti, « · 105206 101 joka hybridisoituu PGII:n kooditussekvenssien kanssa (katso taulukko IV, esimerkki 3.6), liitetään pUC9-vek-toriin (Vieira, J. ja Messing, J., 1982, Gene 19, 259-268), josta on tuloksena plasmidit pGW1900 (kuvio 3) ja 5 pGW1901, joilla insertti on vastakkaisessa orientaatios sa. 1,5 pg:aan PGI-lambda-7:n DNA:ta 5 pl:ssa TE-puskuria lisätään 1 μΐ spermidiiniä 10 mM kantaliuoksesta, 20 U BamHI:tä. BRL:n suosittamaa reaktiopuskuria ja steriiliä tislattua vettä lopputilavuuteen 30 μΐ. Pilkottuihin 10 näytteisiin lisätään neljäsosa (tilavuus/tilavuus) la- tauspuskuria (latauspuskuri - 0,25 % bromifenolisinistä; 0,25 % ksyleenisyanolia ja 15 % Ficoll 400:aa H20:ssa). Reaktiofragmentit erotetaan 0,6-%:isella agaroosigeelillä 1 x TAE-puskurissa, joka sisältää etidiumbromidia (1 15 pg/ml)(50 x TAE-puskuri - 242 g Tris:iä, 57,1 ml etik- kahappoa ja 100 ml 0,5 M EDTA:aa pH 8,0 litraa kohti).
DNA-fragmentit tehdään näkyviksi UV-valon alla ja gee-lipala, joka sisältää 8,6 kep BamHI-fragmentin, eriste-20 tään. DNA-fragmentit eristetään elektroforeettisesti tavanomaisten menetelmien mukaisesti. Eluointi suoritetaan 100 V jännitteessä 1 tunnin aikana. DNA-otetaan talteen ja saostetaan 2 tilavuudella etanolia. Sentri-
( 1 I
fugoinnin jälkeen Eppendorf-sentrifugissa 30 min. ajan 25 saostuma kerätään talteen, kuivataan Speedvac-laitteessa ^ -j ja liuotetaan 10 pl:aan TE-puskuria. Vektori pUC9 (1 pg) ··♦ tehdään lineaariseksi käyttäen 10 U BamHI:tä 37°C:ssa 1,5 • ·· · ;'**» tunnin aikana, käyttäen suositeltua BRL-puskuria koko- • · · naisreaktiotilavuudessa 20 μΐ. Sen jälkeen lisätään 1 μΐ 30 CIP-liuosta (suunnilleen 2 U), ja seosta inkuboidaan 30 min. ajan 37°C:ssa. Linearisoitu vektori valmistetaan myös elektroforeesin avulla. Se liuotetaan 20 pl:aan TE-pus- • ti ·]' kuria, mikä vastaa DNA-pitoisuutta suunnilleen 50 ng/μΐ.
• · · • · · · 35 Llgaatioreaktiossa yksi μΐ linearisoitua ja CIP:llä käsi- « « · m.\ . teltyä pUC9-vektoria (50 ng) ja 4 μΐ BamHI-fragmenttia (suunnilleen 100 ng) ligoidaan 1,2 U:n kanssa T4 DNA -li- « « • · • · · 105206 102 gaasia sopivassa ligaasipuskurissa. Lopullinen reak-tiotilavuus on 10 ml. Reaktion annetaan jatkua 14 tunnin ajan 14°C:ssa ja sen jälkeen seos laimennetaan TE-pus-kurilla 50 pl:ksi.
5 50 μΐ tuloksena olevia ligaatioreaktioseoksia käytetään transformoimaan E. coll kuten BRL:n M13 kloonaus/dideok-sisekvensointimanuaalissa (ss. 30-33; 11) on kuvailtu, 5 paitsi että E. coli DH5aF':a kasvatetaan OD550-arvoon 0,5-10 0,7 ennen pullojen asettamista jäiden päälle, Lämpöshokin jälkeen soluja inkuboidaan jäiden päällä kahden minuutin ajan, ja sen jälkeen 1 ml LB-alustaa lisätään ja soluja inkuboidaan 37°C:ssa 1 tunnin ajan. Solut pelletoidaan pieninopeuksisella sentrifugoinnilla, 1 ml supernatanttia 15 poistetaan ja solut suspendoidaan varovasti uudelleen.
Sen jälkeen solut maljataan LB-agarmaljoille, jotka sisältävät 100 pg/ml ampisilliiniä, ja joiden pinnalle oli levitetty IPTG/X-gal-liuosta (=200 μΐ H20:ta, 30 μΐ dime-tyyliformamidia, joka sisälsi 2 % X-gal:ia ja 20 μΐ 24 20 mg/ml IPTG-liuosta vedessä). Maljoja inkuboidaan yli yön 37°C:ssa. Useita valkoisia erillispesäkkeitä käytetään yli yön kasvaneiden viljelmien saamiseksi LB-alustassa, joka sisälsi 0,1 % glukoosia ja 75 μg/ml ampisilliiniä. Näitä V ' viljelmiä käytetään plasmidin eristämiseksi käyttäen ! 25 Holmes'in ja Quigley'n, 12, pienimittaista menetelmää.
.Plasmidit pilkotaan useilla restriktioentsyymeillä toi-··· mittajan (BRL) suositusten mukaisesti ja RNaasi A:n (0,5
MM
mg/ml) läsnä ollessa, ja tuotteet analysoidaan agaroosi- *9* geelillä. Plasmidit, jotka tuottavat odotetunkokoisia • 4 ♦ 30 BamHI-fragmentteja valikoidaan, ja E. coli -soluja, jotka . sisältävät niitä, säilytetään glyserolin pinnalla -20°C:- ssa. Uudet plasmidit pGW1900 (esitetty kuviossa 3) ja • · · *·' ' pGW1901, jotka kuljettavat inserttiä vastakkaisessa ko- ··· piointisuunnassa, käytetään jatkokokeisiin.
*9*9 .·*·. 35 « · 4 9 9 .* . pGWl900:aa lisätään E. coli -kannassa DH5aF', ja plas- • · * *;/ midi-DNA;ta otetaan talteen 250 ml:sta yli yön kasvanutta 9 9 9 9 9 » · 105206 103 LB-alustaa, joka sisälsi 0,1 % glukoosia ja 100 pg/ml ampisilliiniä, kuten Maniatis et ai.(ss. 90-91; 6) on kuvaillut, ja suspendoidaan lopuksi TE-puskuriin. Koska pGW1900:aa käytetään myös A·. nigerrn transformointiin, se 5 puhdistetaan jakamalla vyöhykkeisiin keesiumkloridigradi-entissa. 2,5 ml:aan DNA:n TE-liuosta lisätään 3,3 g CsCl-:a ja 1 ml etidiumbromidia (10 mg/ml vedessä). Sentrifu-gointi suoritetaan Beckman1'in VTi 65.2-roottorissa 20°C:~ ssa 16 tunnin aikana nopeudessa 45 000 rpm. Kahdesta UV-10 valon alla näkyvästä fluoresoivasta vyöhykkeestä alempi, joka sisältää kovalenttisesti suljettua renkaanmuotoista plasmidi-DNA:ta, otetaan talteen putken kylkilävistyksel-lä. DNA-liuosta (suunnilleen 1 ml) uutetaan 5 kertaa vedellä kyllästetyllä butanolilla etidiumbromidin pois-15 tamiseksi. Sen jälkeen tilavuus säädetään 15 ml:ksi vedellä ja DNA seostetaan lisäämällä 30 ml etanolia. DNA otetaan talteen sentrifugoimalla, ja sen jälkeen pelletti pestään kerran 75-%:isella etanolilla, ja sen jälkeen se liuotetaan TE-puskuriin ja sitä säilytetään -20°C:ssa.
20
Lisäksi, pGW1900:n Kpnl-hydrolvsaatista eristetään elek-troforeettisesti 2,7 kep Kpnl-fragmentti agaroosigeelipa-lasta ja liitetään pEMBL18:iin (Dente & Cortese, 10), i « « v ! mistä ovat tuloksena plasmidit pGW1902 (kuvio 4) ja vas- v 25 tavasti pGW1903.
• · • «k • · ··· pGW1900:n ja pGW1902:n fysikaalisten karttojen konstru- ···· .··1. oimiseksi valmistetaan useita reaktioseoksia, jotka si- • · · sältävät suunnilleen 1 pg plasmidi-DNA:ta, BRL:n suosit- ^ i « · 30 telemaa asiaan kuuluvaa puskuria ja 10 yksikköä restrik- . tioentsyymiä tai kahden eri restriktioentsyymin yhdis- T telmää. Reaktiotuotteet analysoidaan l-%:isillä agaroosi- • · ’·] 1 geeleillä TAE-puskurissa. Spesifisten fragmenttien las- ·;· ketusta koosta osoitetaan yksittäisten restrik- 35 tioentsyymikohtien paikka kuviossa 3 ja vastaavasti 4.
• # 1 · • · ·
Esimerkki 3.10: A. niaer NW756:n polvaalakturonaasi II - • 1 »«» 105206 104 geenin (poall) molekulaarinen kloonaus A. nlaer NW756:n genomista DNA;ta analysoidaan Southern blot -analyysin avulla käyttäen Α^_ niger N400:n pgall-geeniä (so. pGW1800;n 1,2 kep BamHI-BglII-fragmentti) 5 koettimena. Sen suhteen mitä esimerkissä 7.1 on kuvailtu, kaksi muunnosta tehdään. Tässä tapauksessa valitaan re-striktioentsyymit, jotka katkaisevat A^_ niger N400:n pgall-geenin rakenneosan alueella ja hybridisaatio-olo- * suhteet ovat kovemmat, so. esimerkissä 7.2 kuvailtavat 10 "homologiset" olosuhteet. BamHI-hydrolysaatissa havaitaan nyt yksi 3,3 kep hybridisortuva fragmentti. Näissä hybri-disaatio-olosuhteissa havaitaan yksi sekvenssi, joka sekvenssi määritellään sen vuoksi A^ niger NW756:n pgall-geeniksi. Yksi hybridisoituva 3,3 kep HincII-fragmentti 15 havaitaan, mikä osoittaa HincII-kohdan puuttumisen raken-negeenistä. Hybridisoituva Xhol-Bglll-fragmentti käsittää 5,5 kep. Nämä tulokset eivät sovi yhteen esimerkissä 3.7 annettujen tulosten kanssa, eivätkä A^_ niger N400 pgall:n DNA-sekvenssille luettelossa SEQ ID No.2 kuvatun sek-20 venssin kanssa. Siitä johtuen päätellään, että A_j_ niger NW756:n pgall-geeni ei ole identtinen A*. niger N400:n pgall-geenin kanssa.
A. niger NW756:n genominen kirjasto konstruoidaan kuten 25 kannan N400 osalta esimerkissä 2 on kuvailtu muunnellen vähän. Sau3AI:tä käytetään Asperolllus-DNA:n kat- • · kaisemiseksi, saman sekvenssin tunnistavan Mbol;n sijasta (isoschizomer). NW756:n kirjasto konstruoidaan lambda- !l* vektoriin EMBL3, joka liittyy läheisesti EMBL4:ään, 9.
• « · * 30 EMBL3-DNA, valmiiksi pilkottuna BamHI:llä ja EcoRIillä ja fosfataasilla käsitelty, on ostettu Promega'lta. Osa • ' tuloksena olevasta kirjastosta maljataan ja plakkipoimin-
• M
V * toja preparoidaan kuten esimerkissä 3.3 on kuvailtu.
Suotimet hybridisoidaan sen jälkeen pGW1803:n 1,2 kep ,···. 35 BamHI-EcoRI-fragmentin kanssa käyttäen homologisia olo- • · suhteita, joita kuvaillaan esimerkissä 7.2. Positiiviset • · ·.**; faagit puhdistetaan uudelleenseulontavaiheessa, ja näiden t t» « · • · • · · 105206 105 faagien sisältämä DNA puhdistetaan jälkeenpäin kuten esimerkissä 3.4. on kuvailtu. DNA:sta suoritetaan re-striktioanalyysi käyttäen entsyymejä Bqlll ja XhoI. Seu-raavaksi eristetään, kuten esimerkissä 3.6 on kuvailtu, 5 5,5 kep XhoI-BglII-fragmentti yhdestä positiivisesta faagista, joka sisältää tämän fragmentin. Tämä fragmentti liitetään sen jälkeen BamHI:llä ja Sali:llä pilkottuun pEMBL18-vektoriin, ja tuloksena olevaa ligaatioseosta käytetään E. coli JMl09:n transformointiin (esimerkki 10 3.6). Transformantit analysoidaan sen jälkeen pesäkehyb- ridisaation avulla "heterologisissa" olosuhteissa kuten esimerkissä 7.3 on kuvailtu. Positiivisen kloonin sisältämä plasmidi-DNA puhdistetaan, ja sitä käytetään myöhemmin fysikaalisen kartan konstruointiin (esimerkki 3.7).
15 pGW1756:n restriktiokartta esitetään kuviossa 6. pGW1756 on 5,5 kep XhoI-Bglll-fraamenttl. joka sisältää A^. niaer NW756:n pqall-qeenin liitettynä vektoriin pEMBL18.
20 Esimerkki 4: Polyqalakturonaaslqeenien nukleotidisekvens-sin määrittäminen
Esimerkki 4.1: A. niqer N400:n polyqalakturonaasi II-qeeni (pqall) 25 pGW1800:n ja pGW1803:n sopivia restriktiofragmentteja . .. eristetään agaroosigeelielektroforesoinnin jälkeen ja • · liitetään M13mpl8RF- ja Ml3mpl9RF-vektoreihin, käyttäen «·«· .···. 2-10 kertaista fragmenttiylimäärää suhteessa vektoriin.
.···. E. coli JMl09:n transformoi nti suoritetaan kuten edellä " · · · 30 on kuvailtu ottaen huomioon, että lämpöshokin jälkeen , solut maljataan välittömästi kuten BRL:n M13 kloonaus/- dideoksisekvensointimanuaalissa (s. 34; 11) on kuvailtu.
9 9 9 *·* * Yksijuosteisten DNA-templaattien eristäminen rekombinant- ··· tifaageista suoritetaan kuten Ausubel et ai. (jakso 7.3.9; • · · · 35 40) on kuvaillut, ottaen huomioon, että solut otetaan • · 9 9 • · » .· . talteen supernatanttien lisäksi, ja näitä soluja säilyte- • · ♦ *· tään myöhemmin glyseroliviljelmänä -20°C:ssa.
• ♦ • · • » · 105206 106
Yhtä siten saaduista klooneista, joka on pGWl803:n 2,4 kep Xbal-EcoRI-fragmentti liitettynä M13mpl8:n polylink-keriin, manipuloidaan jälkeenpäin jotta kyettäisiin saa-5 maan sekvensointitietoja Hindlll-, PstI-. BamHI- ja vastaavasti Ncol-kohdista« Erillisiä YT-alustassa yön yli kasvaneita viljelmiä valmistetaan E. coli JMl09:stä ja asiaan kuuluvasta kloonista, käyttäen jälkimmäisessä · tapauksessa osaa glyseroliviljelmästä siirroksena. Sen 10 jälkeen 200 ml 2xYT-alustaan siirrostetaan 0,4 ml JM109-viljelmää, ja tätä viljelmää inkuboidaan sen jälkeen 2,5 tuntia pyöriväliikkeisessä ravistelijassa 37eC:ssa. Sen jälkeen lisätään 20 ml asiaan kuuluvan kloonin yli yön kasvanutta viljelmää, ja inkubointia pyöriväliikkeisessä 15 ravistelijassa jatketaan 5 tunnin ajan. Replikatiivinen DNA-muoto eristetään sen jälkeen näistä soluista kuten pGW1803:n kohdalla edellä kuvailtiin. Tämä DNA pilkotaan sitten Hindlll:11a, PstI:llä. BamHI:llä ja vastaavasti Ncol:llä. BamHI:llä ja Ncol:llä pilkottu DNA pilkotaan 20 sen jälkeen Sali:llä. uutetaan seuraavaksi fenoli/kloro-formil-la (1:1) ja kloroformilla ja saostetaan sen jälkeen etanolilla. Yhteensopimattomat tarttuvat päät täytetään sen jälkeen käyttäen 5 yksikköä T4 DNA -polymeraasia _ r i i v (BRL) puskurissa kuten Maniatis et ai. (s. 117; 6) on 25 kuvaillut, ja dCTP:n, dATP:n, dGTP:n ja dTTP:n läsnä ; .. ollessa pitoisuudessa 0,1 M kukin erikseen. Reaktioseok- • · ··· siä, joiden tilavuus on 25 μΐ, inkuboidaan 5 min. ajan .··*. 37°C:ssa, ja sen jälkeen lisätään 5 μΐ 0,5 M EDTA:aa, ja seoksia uutetaan sen jälkeen fenolilla. Siten saaduissa • · 30 neljässä DNA-valmisteessa läsnä olevat pienet DNA-frag- . mentit poistetaan elektroforeesin avulla 0,7-%:isella *99rm sulamispisteeltään alhaisella agaroosigeelillä, ja geeli- • · · palat, jotka sisältävät suuria fragmentteja, eristetään.
·· Nämä DNA-fragmentit tehdään sen jälkeen renkaanmuotoisik- • Iff • “*; 35 si käyttäen T4 DNA -ligaasia. Tuloksena olevia ligaatio- • · · . reaktioseoksia käytetään sen jälkeen E. col^ JM109:n · · ’· " transformointiin kuten edellä on kuvailtu.
Ml • « • · • Il 105206 107
Koska Bell on herkkä substraatin metylaatiolle, se ei voi katkaista plasmidi-DNA:ta, joka on eristetty E. coli JM109:stä tai E. coli DH5aF':sta. Sen vuoksi käytetään 5 aikaisemmin eristettyjä pGW1800:aa ja pGW1803:a E. coli JM110:n transformointiin (Yanisch-Perron et ai., 29), ja plasmidi-DNA:ta eristetään sen jälkeen kuten esimerkissä 3.8 on kuvailtu, paitsi että lisätään 0,1 % kasaminohap-poja kaikkiin alustoihin, joita käytetään E. coli JMllO:n 10 kasvatukseen. E. coli JM110:stä eristettyä plasmidi-DNA:-ta käytetään sen jälkeen subkloonien saamiseksi, jotka mahdollistavat sekvenssianalyysin Bell-kohdasta.
Tuloksena olevat kloonit sekvensoidaan T7Sequencing™ 15 Kit'in avulla Pharmacialta, käyttäen toimittajan suosittelemia olosuhteita. Joissain tapauksissa siten saatua sekvensointitietoa käytetään ohjelmoitaessa spesifisten oligonukleotidien synteesiä Caruthers'in, 8, menetelmän mukaisesti. Nämä oligonukleotidit ovat HR6425, joka on 20 5'(d)CAAGAACGTCACCATCGAAC3', HR6439, joka on 5’(d)- GAATTGCTCACGGTGGAGTG3’ ja HR6440, joka on 5'(d)ACTTGGGCT-TCTTCTTTCCG3'. Näitä oligonukleotidejä käytetään myöhemmin spesifisinä sekvensointialukkeina asiaan kuuluville :T: templaateille. Tämä aluke tuottaa kaksi päällekkäistä 25 sekvensointikuviota (ladder), käytettäessä M13-templaa- i teillä, ja siitä johtuen tätä aluketta käytetään emäksel- • · .:. lä denaturoidun pGW1800:n kaksijuostesekvensointiin nou- I’··, dattamalla Pharmacian ohjeita.
• · • · · • · · * · · 30 pGW1800:ssa sijaitsevan PGII:ta (pgall) koodittavan geenin sekvenssi saadaan molemmista DNA-juosteista. Sekven- T * * sointi alapuoliseen suuntaan (Xbal-kohdasta paikassa 1 ··· V · PvuII-kohdan suunnilleen paikassa 3028 suuntaan) suorite- taan Xbaim-. EcoRV(noin 334)-, HindllHnoin 557)-, ,·*·. 35 PstKnoin 827)-, Bell (noin 1056 ) -. BamHI (noin 1158)-, / . Hindi (noin 1344 ja noin 1974)-, Kpnl (noin 1565 ja noin ’· ” 2706)-, Ncol(noin 1749)- ja vastaavast BqllHnoln 2379)- « * » • · • 9 9*9 105206 108 kohdista, kun taas aluketta HR6425 käytetään sekven-soimaan BqlII-kohdan alue. Sekvensointi vastakkaiseen suuntaan suoritetaan PvuIKnoin 3028 ja noin 1442)-,
Kpnlfnoin 2706 ja noin 1565)-, BallIfnoin 2379)-, Hin-5 cllfnoin 1974)-, BamHIf noin 1158)-, Bellf noinl056)-.
PstIfnoin827)-. Hindlllfnoin 557)- ja vastaavasti EcoRV-kohdista, kun taas alukkeita HR6439 ja HR6440 käytetään sekvensoitaessa Hindi(noin 1974)- ja vastaavasti Kpnl- * (noin 1565)-kohtien toiselle puolelle.
10 pqall:n sekvenssi esitetään sekvenssiluettelossa kohdassa SEQ ID NO.2. 3031 ep (emäsparia) sisältävä sekvenssi alkaa Xbal-kohdan ensimmäisellä nukleotidillä paikassa 1 pGWl800:ssa, ja päättyy PvuII-kohdan viimeiseen nuk-15 leotidiin, joka on osoitettu likimääräisenä karttapaik-kana 3050 pGW1800:n restriktiokartassa. pqall-geeni käsittää 1356 nukleotidiä promoottorialueella, 1138 nukleotidiä rakenneosassa (mukaanlukien mahdollinen 52 nukleotidiä käsittävä introni) ja 537 nukleotidiä transkrip-20 tionaalisella terminaattorialueella.
Sekvenssi, joka sijaitsee välittömästi signaalisekvenssin ja XhoI-katkalsukohdan alapuolella, koodittaa aminohappo- i sekvenssiä, joka on täysin yhtäpitävä sekvenssin kanssa, < : 25 joka on saatu polygalakturonaasi II:n 5 kDa fragmentille otaksumalla, että kysteiini on läsnä paikassa 3 (esimerk- ···· „ _ .
... ki 1.3).
• · • · ··« • ·· • · # *·* * DNA-sekvenssi koodittaa 27 aminohappoa sisältävää ohjaus- 30 peptidiä, arginiinin ollessa viimeinen aminohappo ennen • ' valmiin proteiinin sekvenssiä. Tämä ohjauspeptidi on • · · ·.· * poistettava proteolyyttisellä lohkaisulla. Koska sig- « .:. naalipeptidaasin katkaisukohtia ei todeta välittömästi ,.···, arginiinitähteiden jälkeen eikä välittömästi varautune!- • · 35 den aminohappojen jälkeen yleensä (von Heijne; 39), oh- • · jauspeptidi poistetaan vähintään kahdessa proteolyyt-
»M
ϊ...: tisessä vaiheessa, so. ohjauspeptidi edustaa prepro-sek- 105206 109 venssiä. Tässä tapauksessa signaalipeptidaasi lohkaisee pre-sekvenssin eli signaalipeptidin, kun taas jäljellä olevan pro-sekvenssin lohkaisee vielä toinen proteaasi.
5 Polygalakturonaasi II:n rakennegeeni sisältää yhden in-tronin, sisältäen todennäköisimmin nukleotidisekvenssin paikasta 1987 paikkaan 2038. Tämä sekvenssi sisältää ' terminaatiokodoneja kaikissa kolmessa mahdollisessa luku- kehyksessä. Tämän intronin läsnäolo muuttaa lukukehystä 10 tavalla, joka on yhdenmukainen saatujen proteiinin sek-vensointitulosten kanssa (katso esimerkki 1). Ennen in-tronia oleva lukukehys varmistetaan syanogeenibromidi-fragmenttien aminohapposekvenssien avulla (esimerkki 1.3), kun taas intronin jälkeinen lukukehys varmistetaan 15 trypsiinipeptidi-TP4:n aminohapposekvenssin avulla (esimerkki 1.5), joka sekvenssi voidaan myös johtaa nuk-leotidisekvenssistä paikasta 2183 paikkaan 2225. Intronin 5'-silmukointikohta, GTAAGC, muistuttaa sienten 5'-sil-mukointikonsensusta GTPuNGT, kun taas 3’-silmukointikohta 20 TAG on täysin yhtäpitävä sienten 3' konsensussilmukoin-tikohdan PyAG kanssa, 41.
V Esimerkki 4.2: A. niaer N400;n polygalakturonaasi I (poa- r t · :/ ' I)-geeni 25 Sopivia restriktiofragmentteja eristetään pGW1900:sta ja ψ pGW1902:sta agaroosigeelielektroforeesin jälkeen kuten ···· .·*·. esimerkissä 3.9 on kuvailtu. Nämä liitetään M13mpl8RF- ja • ·· M13mpl9RF-vektoreihin BRL:n M13 kloonaus/dideoksisekven- • · · sointimanuaalin mukaisesti, 11. Kompetentteja soluja val-. 30 mistetaan kuten Pharmacia Manual'ssa M13 kloonaus/sekven- sointisysteemille on kuvailtu. E. coli JM101:n transfor- «- · · · *·* * mointi suoritetaan kuten Messing et ai., 30, on kuvail- ··· lut. Yksijuosteisten DNA-templaattien eristäminen rekom- • · f · binanttifaageista noudattelee tavanomaisia menetelmiä • · · ,· . 35 (esim. 11, ss. 29-34). Tuloksena olevat kloonit sekven- • · · *· " soidaan käyttäen T7 sequencing™ -pakkausta Pharmacia'lta (Uppsala, Ruotsi), käyttäen toimittajan suosittelemia 105206 110 olosuhteita.
pGW1900 sekvensoidaan EcoRI-kohdasta likimääräisestä karttapaikasta 5750 Clal-kohtaan saakka likimääräisessä 5 karttapaikassa 3900, joka sijaitsee lähellä HindiIl-koh- taa suunnilleen paikassa 3790. Useita oligonukleotidejä ^ (304-307) syntetisoidaan käyttäen Caruthers'in, 8, menetelmää. Näillä oligonukleotideillä on seuraavat sek- - venssit: 10 N:o 304 5'(d) TTCAGCCCAAGCGTCAATCC3' N:o 305 5'(d) ACCTGAACGACTTCACCATC3' N:o 306 51(d) TCTGTAGGACGTCTGGTTG 3' N:o 307 5'(d) TGGCAGTAAAACCACCTAAC3' 15
Niitä käytetään spesifisinä sekvensointialukkeina asiaan kuuluville templaateille.
Oligonukleotidiä numero 307 käytetään emäksellä denatu-20 roidun pGWl900:n kaksijuostesekvensointiin noudattaen toimittajan ohjeita T7 sequencing™ -pakkaukselle, pgal-geenin koko sekvenssi esitetään sekvenssiluettelon koh-dassa SEQ ID N0.1. Sekvenssi perustuu kummallakin juos-: teella saatuihin sekvensointitietoihin.
25 2495 ep pgal-sekvenssi alkaa EcoRI-kohdan ensimmäisellä .···. nukleotidillä likimääräisessä karttapaikassa 6280 pGWl- * * 900: ssa, ja päättyy 12 nukleotidiä Cl ai-kohdan viimeisen * nukleotidin toiselle puolelle lähellä HindiII-kohtaa, 30 joka on osoitettu paikassa 3880. pgal-sekvenssi käsittää 909 nukleotidiä promoottorialueella, rakenneosan 1218 • · · V : nukleotidiä, mukaanlukien kaksi mahdollista intronia, 52 ··· ep (introni A) ja 62 ep (introni B), ja 366 nukleotidisen im .*··. transkriptionaalisen terminaattorialueen.
*" 35 • * • · · '· '·' Aminohapposekvenssit, jotka on saatu valmiille polyga- • » · ·...· lakturonaasi I:lle (katso esimerkki 1.4) ja 21 kDa syano- 105206 111 geenibromidifragmentille (esimerkki 1.5), ovat täysin yhtäpitäviä aminohapposekvenssin kanssa, joka voidaan johtaa nukleotidisekvenssistä, ja joka alkaa paikasta 1003. DNA-sekvenssi koodittaa siten 31 aminohappoa sisäl-5 tävää ohjauspeptidiä, lysiinin ollessa viimeinen aminohappo ennenkuin valmis proteiini alkaa. Samoista syistä kuin mitä esitettiin PGII:n tapauksessa, jossa ohjauspep-tidi päättyy arginiinitähteeseen, tämä PGI-ohjauspeptidi edustaa prepro-sekvenssiä, joka myös poistetaan vähintään 10 kahdessa proteolyyttisessä vaiheessa. Sekvenssiä, joka hybridisoituu oligonukleotidiseoksen kanssa, käytetään koettimena ja se alkaa nukleotidisekvenssin paikassa 1277. 5,5 kDa syanogeenibromidipeptidifragmentille määritetty N-terminaalinen aminohapposekvenssi, joka on määri-15 tetty kuten esimerkissä 1 on kuvailtu, on täysin yhtäpitävä oletetun aminohapposekvenssin kanssa, joka perustuu nukleotidisekvenssiin.
Polygalakturonaasi I:n rakennegeeni sisältää kaksi intro-20 nia. Introni A käsittää nukleotidisekvenssin paikasta 1138 paikkaan 1189. 5'-silmukointikohta G T A T G T on yhtäpitävä sienten 51-silmukointikohdan konsensussek- • « · venssin GT Pu NGT, 41, kanssa, kun taas lariaat-
tisekvenssi (lasso-) GC TAAC ja 3'-silmukointikohta TAG
: 25 ovat yhtäpitäviä tunnettujen konsensussekvenssien Pu CT
; Pu AC ja Py AG kanssa. Tämän intronin läsnäolo muuttaa • · ·· .”·. lukukehystä tavalla, joka on yhdenmukainen proteiinisek- venssitulosten kanssa, jotka on saatu etäämpänä sijait- • « « sevan 5,5 kDa syanogeenibromidifragmentin avulla (katso . 30 esimerkki 1). Toinen introni (B) käsittää nukleotidisek- venssin 1610-1671. Sekä lariaattisekvenssi että 3'-sil- • · « ’] * mukointikohta ovat yhtäpitäviä tunnettujen konsensussek- ··· venssien kanssa. 5'-silmukointikohta G C A C G A ei ole • · · *
yhtäpitävä konsensussekvenssin GT Pu NGT kanssa, mutta GC
» · .· . 35 5'-silmukointikohdassa, sekä A +6-paikassa 5'-silmukoin- « · · tikohdan suhteen on todettu joissakin muissa geeneissä, 41, 43.
105206 112
Introni B:n läsnäolo perustuu seuraaviin perusteisiin: a) Se muuttaa lukukehystä, kun taas muissa kahdessa luku-5 kehyksessä esiintyy esivaiheisia pysäytyksiä.
* b) Introni pqall:ssa esiintyy samassa paikassa, ja aminohapposekvenssi, joka edeltää tätä intronia, Asn - Ser - »
Gly - Glu, on identtinen molemmissa proteiineissa. Amino- 10 happosekvenssien välillä havaitaan myös voimakasta homo- logiaa sisältävä alue, jotka sekvenssit on johdettu nuk-leotidisekvensseistä, jotka seuraavat välittömästi mahdollista intronia: 15 Aminohappotähde PGII Asn - Ile - Trp - Phe - Thr Gly - Gly - Thr - Cys PGI Ser - Ile - Ser - Phe - Thr Gly - Gly - Thr - Cys 20 PGII Ile - Gly - Gly - His - Gly - Leu - Ser - Ile -
Gly PGI Ser - Gly - Gly - His - Gly - Leu - Ser - Ile -:T: Gly 25
Esimerkki 4.3: Homologia A. niqer N400-polvaalak- ,···. turonaasien välillä • ·
nigeristä eristetyt polygalakturonaasit PGI ja PGII
• · · ‘ katalysoivat samaa reaktiota ja ovat immunologisesti 30 toistensa lähellä kuten esimerkissä 1.2 on kuvailtu.
• · • · · V * Näitä entsyymejä koodattavat geenit liittyvät myös lähei- .·· sesti toisiinsa, koska genomisesta Ai. niqer N400-kirjas-
«•M
.··'. tosta eristetään muita polygalakturonaasigeenejä pqali- • ^ 35 geenin ohella kuten esimerkissä 7.2 on kuvailtu. Sek- • · · *· " venssivertailu, joka koskee oletettuja PGI:n ja PGII:n aminohapposekvenssejä valmiissa entsyymeissä, jotka eroa- 105206 113 vat 2 tähteen pituudella, osoittaa suurta homologia-as-tetta. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että PG:itä koodittavat geenit liittyvät läheisesti toisiinsa ja edustavat jäseniä polygalakturonaasigeeniperheessä.
5
Esimerkki 5: A, nioerin kotransformaatio käyttäen A. nioerin pvrA-qeeniä valintamarkkerina la polvoalak-turonaasi I:n tai II:n geeniä kuljettavaa plasmidia ko-transformoivana plasmidina 10
Esimerkki 5.1: A. nioerin transformointiin käytettävien plasmidien lisääminen 1a puhdistaminen Plasmidia pGW635, joka on lyhyempi versio pGW613:sta (Goosen et ai., 13), ja joka myös sisältää pyrA-geenin, 15 ja plasmidia pGWl800, joka sisältää polygalakturonaasi II -geenin, lisätään E. coli MHl:ssä ja vastaavasti JM109:-ssä. Plasmidia pGW1900 lisätään E. coli DH5aF':ssa. Plas-midi-DNA:ta otetaan talteen 250 ml:sta yli yön kasvaneista viljelmistä kuten Maniatis et ai. (ss. 90-91; 6) on 20 kuvaillut ja esimerkissä 3.7 on kuvailtu.
Esimerkki 5.2; Protoplastien valmistaminen 1a uridiini-. auksotrofisen mutantin A. nlaer -kannan N593 transfor- mointl 25 Aj. niaer -kanta N593 (cspA.pyrA). joka on parentaalin N400-kannan johdannainen, on saatu positiivisen valinnan • · · ·"* avulla toksista analogia, 5-fluori-oroottihappoa, vastaan • · "···* kuten hiivalla (Boeke et ai., 14) uridiinin läsnä ollessa ··· ““ 9 • · «.
*·* * kuten Goosen gt ai., 13, on kuvaillut.
30
Nestemäiseen minimaalialustaan, joka sisältää lisäksi 0,5 - % hiivauutetta, 0,2 % kasaminohappoja, 10 mM uridiinia (Janssen Chemie) ja 50 mM glukoosia, siirrostetaan 106 A^ « niaer N593:n konidiosporia ml;aa kohti ja inkuboidaan 20 « · '·;* 35 tuntia 30°C;ssa New Brunswick'in pyöriväliikkeisessä • * ravistelijassa. Rihmasto otetaan talteen suodattamalla Mira-kankaan läpi, pestään iso-osmoottisella mini- 114 105206 maalialustalla (STC), jolla on seuraava koostumus: 1,33 M sorbitolia, 10 mM Tris-HCl:a pH 7,5, 50 mM CaCl2:a. Yhden gramman määrä rihmastoa resuspendoidaan 20 ml:aan STC:tä. Protoplastit vapautuvat rihmastosta 2 tunnin sisällä 5 lisäämällä 150 mg suodattamalla steriloitua Novozym 234:-ää (Novo Industries, Tanska) ja inkuboimalla seosta 30°C:-ssa ravistelijassa nopeudella 95 rpm. Protoplastit erotetaan jäännösrihmastosta suodattamalla, käyttäen suppiloa, s jossa on lasivillatuppo. Sen jälkeen lisätään kylmää 10 STC:tä 40 ml:n tilavuuteen, ja seos asetetaan jäiden päälle 10 min. ajaksi. Protoplastit otetaan talteen sent-rifugoimalla (10 min., 2500 rpm), ja pelletti resuspendoidaan 5 ml:aan STC:tä. Protoplastit pelletoidaan vielä kerran ja suspendoidaan lopuksi 1 ml:aan kylmää STC:tä.
15
Transformaatiota varten 5 x 106 protoplastia siirretään 200 pl:aan, joita sitten inkuboidaan yhdessä 1 pg:n kanssa pGW635:ttä ja 20 pg:n kanssa pGW1800:aa tai pGW1900:- aa. Plasmidi-DNA:n lisäämisen jälkeen protoplasteihin, 50 20 μΐ PCT:tä (10 mM Tris-HCl:a pH 7,5, 50 mM CaCl2:a, 25 % PEG6000:a) lisätään, ja inkubaatioseosta pidetään jäiden päällä 20 min. ajan. Sen jälkeen lisätään toiset 2 ml PCT:tä, ja seosta inkuboidaan vielä 5 min. huoneen lämpötilassa. Lopuksi lisätään 4 ml STC:tä ja sekoitetaan.
25 Yhden ml:n näytteitä tästä lopullisesta transfor- maatioliuoksesta sekoitetaan 4 ml:n kanssa nesteytettyä iso-osmoottista MM-pinta-agaria, joka on stabiloitu 0,95 • · *···’ M sakkaroosilla. Protoplast!seos maljataan välittömästi ··· *.1 1 agarmaljoille, jotka sisältävät samaa iso-osmoottista 30 minimaalialustaa, ja näitä inkuboidaan 30°C:ssa. Sopivat % » "'1! kontrollikokeet sisältävät protoplasteja, joita on käsi- telty samalla tavalla ilman plasmidi-DNA:ta ja stabiloimattomalla minimaalialustalla 2,5 mM uridiinin kanssa.
• · · « « · · · » • · *·;2 35 Kolmen päivän kasvatuksen jälkeen 30°C:ssa, hyvin kasvavat transformantit tulevat näkyviin, jotka itiöivät (150 2 :3: transformanttia/pg pGW635:ttä). Sen lisäksi esiintyy 3 • »· 105206 115 suuri määrä luultavasti epäonnistuneita transformantteja. Suunnilleen 300 transformanttia saadaan pGW1800:lla ja suunnilleen 100 pGW1900:lla. Molemmista transformanteis-ta, pGW1800:lla ja pGW1900:lla, kaksikymmentä pesäkettä 5 poimitaan sattumanvaraisesti, yksittäisten transfor-manttien itiöitä otetaan ja maljataan erikseen 50 mM glukoosiminimaalialustalle erillispesäkkeiden saamiseksi, jotka puhdistetaan vielä kerran ja käytetään sen jälkeen itiöiden lisäämiseksi transformanttien jatkoanalysointia 10 varten.
Esimerkki 5.3: Polvaalakturonaasia liikaa tuottavien A. niaer -kannan N593 kotransformanttien valikointi kehän-muodostuksen perusteella pektlinlä sisältävillä kiinteil-15 lä alustoilla
Suunnilleen 200 pesäkettä, jotka on transformoitu pGW-1800:11a ja suunnilleen 100 pesäkettä, jotka on transformoitu pGW1900:lla, jotka on saatu kuten esimerkissä 5.2 on kuvailtu, seulotaan polygalakturonaasiaktiisuuden 20 lisääntymisen perusteella pesäkeseulontamenetelmällä ilman edeltävää puhdistamista. Seulontaan käytetty alusta sisältää 2 % (paino/tilavuus) glukoosia, 0,5 % omenapek-: tiiniä (34,8 %:n esteröitymisaste, Obipektin, Bischof- fszell), minimaalialustan suoloja ja itiöhivenaineita; 6 25 g/1 NaN03:a; 0,2 % hiivauutetta,; 0,2 % peptonia, 0,004 %
Triton X-100:aa ja 1,2 % agaria. Petrimalja siirrostetaan keskeltä ja inkuboidaan 2 päivän ajan 30°C:ssa. Pesäkkeitä ”! säilytetään yli yön kylmässä. Maljan pinta värjätään sen • aa '·* * jälkeen lisäämällä 5 ml:n kerros 0,05-%:ista rutenium- 30 punaliuosta, jota inkuboidaan 5 min. ravistellen. Sitou-tumaton väri poistetaan sen jälkeen pesemällä tislatulla ··· V * vedellä toiset 5 min. Polygalakturonaasin tuotannon näis- sä olosuhteissa ilmaisee muodostuneen kehän koko. Suun- 1111 .··«, nilleen 50-%:illa siten analysoiduista transformanteista • · 35 on korkeampi polygalakturonaasiaktiivisuus kuin vil- • a :.’*i lityypillä.
aa a · a a « · a 105206 116
Kaksikymmentä pesäkettä pGW1800-transformanteista ja 7 pesäkettä pGW1900-transformanteista poimitaan pektiiniä sisältävillä kiinteillä alustoilla muodostuneiden kehien koon perusteella, ja toisen seulonnan jälkeen näillä 5 positiivisilla pesäkkeillä 45 tunnin kasvun jälkeen, 6 pesäkettä kumpaakin transformanttia poimitaan lopuksi ja puhdistetaan kuten esimerkissä 5.2 on kuvailtu.
Esimerkki 5.4; Polvoalakturonaasi II-transformoitu1en A.
10 niger -kantojen genominen analysointi
Esimerkin 5.2 tai 5.3 mukaisesti saatuja transformantteja samoin kuin parentaalia villityypin kantaa N402 viljellään nestemäisessä minimaalialustassa, joka sisältää lisäksi 0,5 % hiivauutetta, 0,2 % kasaminohappoja, 50 mM 15 glukoosia ja NaN03:a (6 g/1). Kahdeksantoista tunnin kasvatuksen jälkeen 30°C:ssa, DNA uutetaan ja analysoidaan kotransformoivan plasmidin suhteen. A_j_ niger -DNA:ta eristetään kuten edellä jo on kuvailtu.
20 Kromosomaalisen DNA:n (2 pg) pilkkomisia suoritetaan 37°C:ssa 200 pl:n reaktiotilavuudessa, joka sisältää 50 mM Tris-HCl:a pH 8,0, 10 mM MgCl2:a, 100 mM NaClra ja 4 mM spermidiiniä, jonka pH on säädetty arvoon 7,5 Tris-emäk-/ sellä ennen sen lisäämistä reaktioseokseen. 20 U sekä 25 EcoRI:tä että Sall:tä lisätään, ja reaktioseosta in- kuboidaan 2 tunnin ajan 37°C:ssa. Sen jälkeen lisätään ”** toiset 20 U kumpaakin entsyymiä, ja inkubointia jatketaan • · *”·* toiset 2 tuntia. Reaktioseos (200 μΐ) uutetaan sen jäi- « · · keen 100 pl:lla kloroformia. DNA seostetaan sen jälkeen
30 vesifaasista lisäämällä 1/10 (tilavuus/tilavuus) 3 M
*·**· natriumasetaattipuskuria pH 5,2 ja 2,5 tilavuutta etano- • · · · lia. Inkuboinnin jälkeen 4°C:ssa 1 tunnin ajan ja sentri- fugoinnin jälkeen, DNA-pelletti ilmakuivataan ja liuote- « f taan 20 pl:aan näytepuskuria. Transformanttien 1a A.
35 niger N402:n sisältämä DNA, pilkottuna EcoRI/SalI:11a, • · analysoidaan Southern-blottien hybridisaation avulla :#ι>ϊ kuten edellä on kuvailtu, pGW1800:n 1,2 kep gamHI/Bglll- 105206 117 fragmentti PGII-koettimena.
Kotransformaatiofrekvenssin todetaan olevan yli 75 %. Yhdeksän transformanttia on analysoitu Southern-blottauk-5 sella. Koetin hybridisoituu N402:ssa, suuren genomisen fragmentin kanssa. pGW1800:n sekvenssejä sisältävien transformanttien genomisissa bloteissa todetaan 4,1 kep * EcoRI-Sall-insertti. Vyöhykkeen intensiteetti vaihtelee riippuen kopioluvusta. Analysoiduissa tapauksissa genomi-10 nen fragmentti, joka edustaa villityypin geeniä, todetaan aina, mikä osoittaa heterologista fuusiota. Analyysi polygalakturonaasi II -tuotannosta A_j_ niqer -transforman-tissa, jota jäljempänä nimitetään koodilla N593/pGW1800-27, esitetään yksityiskohtaisena esimerkkinä (esimerkki 15 6). DNA-laimennussarjasta kopioluvun estimoidaan olevan vähintään luokkaa 20. Villityypin hybridisoituvan fragmentin ja 4,1 kep fragmentin lisäksi todetaan joitakin vähäisempiä hybridisoituvia fragmentteja tässä kannassa, jotka edustavat reunafragmentteja II-tyypin integraatio-20 tapahtumista tai uudelleenjärjestelyistä.
Esimerkki 5.5: Polygalakturonaasi II:n tuotanto transfor- i i : moiduilla A. niqer -kannoilla 1a A. niqer N402:lla
Kahtakymmentä esimerkissä 5.2 kuvailtua pGW1800-transfor- 25 mänttiä ja kuutta esimerkissä 5.3 kuvailtua pGW1800-t- ... ransformanttia kasvatetaan alustassa, joka sisältää mini- * t···, maalisuola-alustan, johon lisätään ureaa (4,2 g/1), 1 % • · I» (paino/tilavuus) omenapektiiniä (d.e. 61,2 %) ja 1 % • · o ' (paino/tilavuus) vehnänleseitä. Viljelmiä kasvatetaan 43 30 tuntia 30°C:ssa käyttäen Gallenkamp'in pyörivälrikkeistä * ’ ravistelijaa nopeudella 250 rpm, ja viljelmäsuodoksia • · · V· saadaan. Rihmasto poistetaan suodattamalla Mira-kankaan a läpi käyttäen Buchner-suppiloa.
• * f »
« < I
• (
• I
'·' 35 Näiden näytteiden PGII-pitoisuus tutkitaan Western-blot- « » · '. '! tauksella, joka suoritetaan käyttäen alkaliseen fosfataa- · · siin perustuvaa ilmaisumenetelmää Biorad'in oh- 105206 118 jekäsikirjan mukaisesti. Western-blottien signaalien perusteella, esimerkissä 5.2 sattumanvaraisesti saatujen 20 transformantin joukosta 70 % tuottaa merkitsevästi enemmän polygalakturonaasi II: ta kuin A^_ nioer N402.
5 Transformantit, jotka valikoitiin vyöhykekoon perusteella, käyttäen pesäkeseulontamenetelmää (katso esimerkki * 5.3), tuottavat kaikki merkitsevästi enemmän entsyymiä kuin A_j_ niaer N402.
10 A. niaer N402 -kanta ja kolme transformanteista, nimettynä N593/pGW1800-27, N593/pGW1800-30 ja N593/pGW1800-37, valitaan polygalakturonaasiaktiivisuuden määrittämiseksi.
Viimeksi mainitut kolme kantaa ovat esimerkissä 5.2 saatujen pGW1800-transformanttien joukosta.
15 N593/pGWl800-30 ja N593/pGWl800-37 sisältävät kumpikin monta pGW1800-kopiota, mutta vähemmän kopioita kuin N-593/pGWl800-27. Kantoja kasvatetaan l-%:isella pektiini-alustalla (d.e. 61,2 %), johon lisätään 1 % (paino/tila-20 vuus) kuivattua ja jauhettua sokerijuurikasmassaa, käyttäen edellä kuvailtuja olosuhteita. Pelkistävien sokerei-den ja PG-aktiivisuuden inhibiittoreiden poistamiseksi, PGII puhdistetaan osittain fermentoinnin jälkeen käyttäen ristikytkyalginaattia. Yksi ml viljelmäsuodosta laimen-25 netaan 1 ml:11a 20 mM natriumasetaattipuskuria pH 4,2 ja . ladataan sen jälkeen pieneen kolonniin, jonka kolon- • · ··· nitilavuus on 2 ml ristikytkyalginaattia (5,2 ml/g) tasa- • ·· · .···. painotettuna tässä puskurissa. Kolonni pestään sen jäi- • · · keen 4 ml:11a natriumasetaattipuskuria ja seuraavaksi • · · 30 PGII-aktiivisuus sykepumpataan kolonnista, käyttäen 4 ml . 20 mM natriumasetaattipuskuria pH 4,2, johon on lisätty 1 ]>#* M NaCl:a. Eluaatin PG-aktiivisuus määritetään sen jälkeen • · · ’ kuten on kuvailtu, 2, ja saadusta arvosta lasketaan PG- ··· aktiivisuus viljelmäsuodoksessa.
IMI
35
I I I
. Seuraavat PG-aktiivisuudet on laskettu viljelmäsuodok- • · sille, jotka on saatu 20 h siirrostuksen jälkeen: 2,2, • m • · 105206 119 5,6, 5,8 ja 10,8 yksikköä/ml kannoille N402, N593/pGW-1800-30, N593/pGW1800-37 ja vastaavasti N593/pGW1800-27. Nämä arvot ovat 40 tunnin jälkeen saaduille viljelmäsuo-doksil- le, samassa järjestyksessä, 2,8, 13,7, 16,4, ja 5 vastaavas- ti 30,9 yksikköä/ral.
* Näyttää siis siltä, että pGW1800:aa voidaan menestyksellisesti käyttää Aj_ nioerin transformointiin paljon korkeamman PG-aktiivisuuden tuottamiseksi.
10
Esimerkki 5.6: Polvaalakturonaasi I:n tuotanto transformoiduilla A. niaer -kannoilla 1a A. nloer N402;lla 1a N593;11a
Seitsemäätoista esimerkissä 5.2 kuvailtua pGW1900-tran-15 sformanttia ja kuutta esimerkissä 5.3 kuvailtua pGW1900-transformanttia samoin kuin Aj_ niaer N402:ta ja N593:n pyr*-transformanttia kasvatetaan alustassa, joka sisältää minimaalisuola-alustan, johon on lisätty ureaa (4,2 g/1), 1 % (paino/tilavuus) omenapektiiniä (d.e. 61,2 %) ja 1 % 20 sokerijuurikasmassaa. Viljelmiä kasvatetaan 64 tuntia 30°C:ssa käyttäen Gallenkamp'in pyöriväliikkeistä ravis-telijaa nopeudella 250 rpm, ja välillä otetaan näytteitä viljelmäsuodoksista 20 tunnin ja 39 tunnin kuluttua.
' Näiden näytteiden sisältämää PGI-pitoisuutta tutkitaan «44 V ' 25 kuten PGII-pitoisuutta esimerkissä 5.5 Western-blottauk- !.'« sen avulla.
·· ♦ ···♦
Western-blottien signaalien perusteella testattujen 23 • · · ;”*j transformantin joukosta 65 % tuottaa merkitsevästi enem- - 9 r 30 män PGI:tä kuin niaer N402. Kehäkoon perusteella vali- koidut transformantit tuottavat kaikki enemmän PGI:tä • · * kuin A.J. niaer N402, ja neljä kuudesta transformantista on *. suurtuottajia. Aktiivisuusmääritykset osoittavat, että m .,!·* tässä alustassa aktiivisuus 20 tunnin kuluttua on korke- 35 ampi kuin 39 tunnin kuluttua. Ottamalla huomioon kak- • · · .·] ; sitoista eri PGI-transformoitua Aj_ niaer -kantaa, ak- tiivisuus vaihtelee 2,8 ja 7 U/ml välillä, kun taas t- • · • I f 105206 120 ransformoimaton kontrollikanta N402 ja A^ niaer N593/pGW-635-transformantti tuottavat 0,5 ja vastaavasti 0,8 U/ml.
Tämä aktiivisuus on vähintään sekä PGI:n että PGIIrn villityypin tasojen tulos, kun taas aktiivisuuden lisään-5 tyminen transformanteilla on seuraus suuremmasta PGI:n ilmentymisestä.
Esimerkki 6: Polvqalakturonaasi II:n eristäminen, puh- * distaminen 1a karakterisointi PGII:ta liikaa tuottavasta 10 A. niaer -transformantista N593/PGW1800-27
Esimerkki 6.1: Viljelyolosuhteet polvqalakturonaasi II:n valmistamiseksi
Esimerkissä 5.4 kuvailtua A_j_ niaer PGII-transformanttia 15 N593/pGW1800-27 kasvatetaan täydellisellä alustalla petri-maljoilla 3-4 päivän ajan 30°C:ssa konidioiden tuottamiseksi. Konidiot otetaan talteen 5 ml:11a steriiliä saliinia, joka sisältää 0,005 % Tween 80:tä, maljaa kohti. Itiösuspensiota ravistellaan Griffin'in ravis-20 telijalla 20 min. ajan ja itiölaskennan jälkeen, 106 itiötä/ml lisätään 1 l:n silikonoituihin erlenmeyerpul-loihin, jotka sisältävät 300 ml steriiliä kasvualustaa.
Tämä alusta on minimaalialusta, joka sisältää 70 mM am-monimkloridia typenlähteenä ja 1 % (paino/tilavuus) ome-25 napektiiniä (esteröitymisaste 61,2 %) ja 1 % (paino/tila-i\i vuus) sokerijuurikasmassaa hiilenlähteinä. Rihmastoa ·· kasvatetaan 43 tuntia 30°C:ssa käyttäen Gallenkamp'in • « · · j·". pyöriväliikkeis- tä ravistelijaa nopeudella 200 rpm.
« · ·
Kasvatuksen jälkeen rihmasto poistetaan suodattamalla • · · 30 Mira-kankaan läpi käyttäen btichner-suppiloa. Viljelmäsuo-doksen pH säädetään arvoon 4,2 käyttäen 1 N NaOH:a. 0,02 ... % natriumatsidia lisätään kaikissa myöhemmissä vaiheissa • 9 9 '* * mikrobikasvun estämiseksi.
• ai • « · 35 Esimerkki 6.2: A. niqer-transformantista N593/PGW1800-27 aa· .* . saadun polyqalakturonaasi II:n puhdistaminen • a ·
Viljelmäsuodos (suunnileen 2,5 1) applikoidaan ris- • · • · 105206 121 tikytkyalginaattikolonniin (2,5 x 25 cm), joka on tasapainotettu 20 mM natriumasetaattipuskurilla pH 4,2. Lataamisen jälkeen kolonni eluoidaan perättäisesti yhdellä kolonnitäytetilavuudella tasapainotuspuskuria, yhdellä 5 kolonnitäytetilavuudella 20 mM natriumasetaattipuskuria pH 5,6, 1200 ml:11a lineaarista suolagradienttia (0-0,5 M NaClta) edellisessä puskurissa, ja lopuksi 275 ml:11a 1 M NaCl-liuosta samassa puskurissa. 6 ml:n jakeita kerätään ja niiden entsymaattinen aktiivisuus testataan kuten 10 esimerkissä 1.1 on kuvailtu. Keskimmäinen osa aktiivisista jakeista kerätään yhteen ja dialysoidaan kolmasti 20 mM bis Tris-HCl-puskuria pH 6,0 vastaan. Lopullinen ent-syymiliuos (475 ml) applikoidaan sen jälkeen DEAE-Sepha-rose Fast Flow-kolonniin (Pharmacia), joka on tasapaino-15 tettu samalla puskurilla. Pesun jälkeen NaCl-gradientti applikoidaan samassa puskurissa, ja polygalakturonaasiak-tiivisuus tulee eluoiduksi suunnilleen 100 mM NaCl:ssa. Aktiiviset jakeet analysoidaan SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesin avulla. Nämä jakeet, joilla on suuri 20 PGII-pitoisuus, kootaan yhteen (54 ml), dialysoidaan 20 mM bis Tris-HCl-puskuria pH 6,0 vastaan ja puhdistetaan edelleen Mono Q -kolonnilla (Pharmacia), joka on tasapainotettu samalla puskurilla. Lataamisen jälkeen entsyymi eluoidaan applikoimalla suolagradientti (0-1 M 25 NaCl). Entsyymi kerätään mielivaltaisesti kahteen eri : koosteeseen A ja B, jotka vastaavat 0,2-0,26 M osaa nat- · ··· riumkloridigradientista ja 0,26-0,34 M osaa gradientista.
···· .···. Kumpikin jae sisältää yhden ainoan proteiinivyöhykkeen • · · SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa samassa koh- • · · 30 dassa kuin PGII.
• Esimerkki 6.3: Polvoalakturonaasi II:n N-termlnaalisen • f « '·* * osan aminohapposekvenssin määrittäminen *!· 200 pg PGII:ta yhdistetyistä koosteista A ja B, jotka on « · · · 35 puhdistettu esimerkin 6.2 mukaisesti, dialysoidaan kolme • * · .· , kertaa 1 l:aa vastaan Millipore-suodatettua tislattua • · · ’· *· vettä ja lyofilisoidaan. Aminohapposekvenssi määritetään • « 105206 122 kuten esimerkissä 1.3 on kuvailtu, käyttäen Applied Bio-systems' in model 470A kaasufaasista proteiinin sekven-sointilaitetta. Seuraava N-terminaalinen aminohapposekvenssi määritetään entsyymille: 5
Paikka: 15 *
Aminohappo: asp - ser - X - thr - phe - thr - thr - ala -Paikka: 10 15
Aminohappo: ala - ala - ala - lys - ala - gly - lys - ala 10 Paikka: 20
Aminohappo: lys - X - ser - thr - ile
Kysteiinitähteet proteiinissa ei ole modifioitu eikä niitä siten havaita. Ne esiintyvät todennäköisesti sek-15 venssin paikassa 3(X) ja paikassa 18(X) (katso esimerkki 1.3). Kolme viimeistä aminohappotähdettä havaitaan ainoastaan alhaisina tasoina. Tälle puhtaalle entsyymille saatu sekvenssi vastaa täsmälleen PGII:n N-pään aminohapposekvenssiä johdettuna PGII-geenin nukleotidisek-20 venssistä (katso esimerkki 4 ja kuvio 4, kaava II). Vastaava nukleotidisekvenssi osoittaa myös kysteiinitähteet odotetussa paikassa, nimittäin paikassa 3 ja 18. Tämä sekvenssi vastaa myös sekvenssiä, joka on määritetty 5 kDa syanogeenibromidifragmentille katso esimerkki 1.3), : : 25 joka sen vuoksi vastaa proteiinin N-päätä.
I « I ( > • M • · ··· Esimerkki 6.4: Transformantista N593/pGW1800-27 puhdis- • ·· · .·*·. tetun polvaalakturonaasi II:n ominaisuuksia • · ·
Esimerkin 6.2 mukaisesti puhdistettua entsyymiä on ver- • · · 30 tailtu Rapidase'sta puhdistettuun entsyymiin, jota ku- . vailtiin esimerkissä 1.1. Molemmilla entsyymeillä on *,,* identtiset näennäiset 38 kDa molekyylimassat SDS-poly- • · · ’ akryyliamidigeeleillä, ja ne reagoivat identtisesti pölyni* klonaalisten vasta-aineiden kanssa, jotka on tehty puh- 35 distettua PGII:ta vastaan. Monoklonaalinen vasta-aine, • * · .* . joka reagoi ainoastaan PGII:n yhtenäisen epitoopin kans- • · · sa, eikä PGI:n, IIIA:n, IIIB:n tai IV:n, reagoi myös • · • · • ·« 105206 123 esimerkin 5.2 mukaisesti puhdistetun entsyymin kanssa. Isoelektrisessä fokusoinnissa PGIIzlla, tuotettuna ja puhdistettuna esimerkkien 6.1 ja 6.2 mukaisesti, esiintyy terävä vyöhyke pl-arvossa, joka on sama kuin PGIIzlla (pl 5 - 5,2). Johtuen PGIIzn mikroheterogeenisyydestä, joitakin muita vyöhykkeitä on havaittu, alemmilla pl-arvoilla, käytettäessä pH-gradienttia pH 3-7 tai pH 3-10. Samanlaiset kuviot saadaan käytettäessä esimerkin 6.1 mukaisesti tuotettua PGIIzta.
10
Esimerkki 7z Polvaalakturonaasi II -geeniin läheisesti liittyvien sekvenssien ilmaisu 1a eristäminen
Esimerkki 7.1z Polyqalakturonaasi II -geeniin läheisesti 15 liittyvien sekvenssien ilmaisu DNAzta eristetään A^_ niaer NW756zsta, käyttäen edellä kuvailtua menettelyä. DNA-pilkotaan entsyymeillä BamHI,
EcoRI ja näiden entsyymien yhdistelmällä kuten esimerkissä 5.4 on kuvailtu. DNA-fragmentit erotetaan sen jäl-20 keen 0,6-%zisella agaroosigeelillä, Ja ne siirretään sen jälkeen nitroselluloosamembraanille kuten esimerkissä 3.7 on kuvailtu. Paistettu membraani esihybridisoidaan 2 tunnin aikana 60°Czssa esilämmitetyssä hybridisaatiopus-v kurissa, joka sisältää 1 % BSAzta (Boehringer), 1 mM
25 EDTAzaa, 0,5 M natriumfosfaattia pH 7,2 (lisättynä 1 M Ιψ'.: kantaliuoksesta, joka sisältää 89,0 g Na2HP04.2H20zta ja 4 ··* ml 85-%zista H.PO.zää litraa kohti) ja 7 % SDSzää, kuten ··♦·
Church ja Gilbert, 38, ovat kuvailleet, ja johon tuoreel- • · · taan lisätään hierrettyä ja denaturoitua sillin sperman *· f · · 30 DNAzta pitoisuuteen 0,1 mg/ml. Sen jälkeen lisätään kat- koluettua pGW1800zn 1,2 kep BamHI-EcoRI-fragmenttia, joka on valmistettu kuten esimerkissä 3.7 on kuvailtu, ja m · · m\ * hybridisaation annetaan jatkua 44 tuntia 60°Czssa samalla /l· kevyesti sekoittaen. Membraani pestään sen jälkeen kaksi 35 kertaa esilämmitetyssä (60°C) hybridisaatiopuskurissa 9 9 9 . (ilman sillin sperman DNAzta) 10 min. ajan. Sen jälkeen 9 · » membraania pestään kaksi kertaa 20 min. 60°Czssa esilämmi- 9 9 9 * 105206 124 tetyssä puskurissa, joka sisältää 5xSSC:tä, 0,1 % SDSrää ja 0,1 % Na4P207.10H20: ta. Membraani kuivataan sen jälkeen ja valotetaan Kodak XAR5-filmille 3 päivän ajan -60°C:ssa.
5 Näissä olosuhteissa ei havaita epäspesifistä hybridisaatiota, mikä on seurausta hybridisoituvien DNA-fragmentti- ’ en merkittävän levittymisen puuttumisesta, ja lisäksi koettimen hybridisaation puuttumisesta lambda-kokomarkke-reiden kanssa. Kullakin kaistalla havaitaan useita hybri-10 disoituvia vyöhykkeitä, kun taas kullakin kaistalla yksi vyöhyke on paljon voimakkaampi kuin muut vyöhykkeet. Nämä voimakkaat vyöhykkeet vastaavat 3,3 kep fragmenttia Bam-HI-hydrolysaatissa, 20 kep suurempaa fragmenttia EcoRI-hydrolysaatissa ja 3,3 kep fragmenttia BamHI/EcoRI-kak-15 soishydrolysaatissa. Vyöhykkeet, joiden intensiteetti on alhaisempi, vastaavat 17, 9,5, 6,4 ja 2,0 kep fragmentteja BamHI-hvdrolvsaatissa. 15, 12, 6,5 ja 4,8 kep fragmentteja EcoRI-hvdrolvsaatissa ja 7,6, 6,4, 4,0, 3,7 ja 2,0 kep fragmentteja BamHI/EcoRI-kaksoishydrolysaatis-20 sa.
Siitä tosiseikasta, että spesifisiä hybridisaatiosignaa-leja voidaan havaita, seuraa, että niaer N400:n PGII-
i - J
geeniä voidaan käyttää ilmaisemaan tiettyjä sekvenssejä 25 A_i_ nioer NW756:sta saadussa DNAtssa. Fragmenttien, jotka tuottavat voimakkaita hybridisaatiosignaaleja, otaksutaan sisältävän PGII-geenin. Periaatteessa, heikosti hybridi- ···· .···. soituva fragmentti voi saada alkunsa, jos restrik- • tioentsyymi katkaisee DNA:n käytettävän koettimen kanssa 30 homologisen alueen sisällä ja lähellä sen päätä. Tämä ei kuitenkaan voi täysin selittää hybridisoituvien suurten fragmenttien määrää, joka havaitaan tässä esimerkissä.
• · · V * Tuloksena on se, että spesifisiä DNA-sekvenssejä on ha- m <· vaittu, jotka ovat homologisia PGII-geenin kanssa mutta 35 eivät ole identtisiä sen kanssa. Näiden DNA-sekvenssien • · • · · otaksutaan olevan erilaisia PG-geenejä, mikä sopii yhteen * * * ’· ” tosiseikan kanssa, että PG-molekyyleillä esiintyy homolo- >>· · • · * * * 105206 125 glaa proteiinitasolla (katso esimerkki 1.4).
Esimerkki 7.2: Polvaalakturonaasi II -geeniin liittyvien geenien eristäminen 5 Suunnilleen 1 x 104 faagia A*, niaer N400:n kirjastosta maljataan 5 maljalle käyttäen E. coli LE392:ta, ja kolme nitroselluloosakopiota tehdään kustakin maljasta kuten esimerkissä 3.4 on kuvailtu, ottaen huomioon, että kolmatta suodinta inkuboidaan maljan pinnalla 5 min. ajan.
10 Jokaisen maljan ensimmäistä ja toista suodinta käsitellään käyttäen olosuhteita, joita nimitetään "heterologi-siksi". Kolmatta suodinta käsitellään kovissa olosuhteissa, joita nimitetään "homologisiksi". Suodinten esihybri-disaatio, hybridisaatio ja pesu suoritetaan 60°C:ssa 15 heterologisissa olosuhteissa ja 68°C:ssa homologisissa olosuhteissa. Paistamisen jälkeen suotimet kostutetaan 3xSSC:ssä, ja sen jälkeen niitä esihybridisoidaan kahden tunnin ajan esilämmitetyssä hybridisaatiopuskurissa, joka sisältää lOx Denhardt'in liuosta (katso esimerkki 3.4), 20 50 mM Tris-HCl:a pH 7,5, 20 mM EDTA:aa pH 8,0, IM NaCl:- a, 0,5 % SDS:ää ja 0,1 % natriumpyrofosfaattia, johon tuoreeltaan lisätään hierrettyä ja denaturoitua sillin sperman DNA:ta. Suotimet siirretään sen jälkeen yksi kerrallaan pulloon, joka sisältää 50 ml hybridisaatiopus- 25 kuria, joka sisältää sillin sperman DNA:ta, johon on : ennalta lisätty pGW1800:n katkoluettua 1,2 kep BamHI- • ·
Balll-fraamenttia. Hybridisaation annetaan jatkua 40
MM
.···. tuntia, ja sen jälkeen suotimet pestään, joko käyttäen • · ,···, homologisia tai heterologisia olosuhteita. Homologiset , i · « 30 pesuolosuhteet ovat seuraavat: suotimia pestään kahdesti , 0,5 tunnin ajan liuoksessa, joka sisältää 2xSSC,0,l % * ] * SDS:ää, ja 0,1 % natriumpyrofosfaattia, ja sen jälkeen • · f *·* * kahdesti 0,5 tunnin ajan liuoksessa, joka sisältää 0,2x- ·· SSC,0,1 % SDS:ää ja 0,1 % natriumpyrofosfaattia. Hetero-
MM
35 logiset olosuhteet ovat seuraavat: suotimia pestään kah- t · .* , desti 0,5 tunnin ajan hybridisaatiopuskurissa, ja sen • « · '· ” jälkeen 0,5 tunnin ajan liuoksessa, joka sisältää 4xSSC,- » · • ·
* M
105206 126 0,1 % SDS:ää ja 0,1 % SDS:ää ja 0,1 % natriumpyrofosfaat-tia, ja lopuksi liuoksessa, joka sisältää 2x$SC,0,l % SDS:ää ja 0,1 % natriumpyrofosfaattia. Suotimet kuivataan ilmassa ja valotetaan Kodak-XAR5-filmille 3 päivän ajan -5 60°C:ssa käyttäen vahvistusvarjostimia. Positiivisia signaaleja tuottavat faagit otetaan talteen kuten esi- - merkissä 3.4 on kuvailtu.
Homologisiin olosuhteisiin saatetuilta suotimilta on 10 saatu 7 positiivista signaalia, jotka signaalit ovat läsnä myös vastaavissa paikoissa suotimilla, joita käsiteltiin heterologisissa olosuhteissa. Näiden signaalien katsotaan johtuvan rekombinantti-lambda-faageista, jotka kuljettavat PGII-geeniä. Näiden signaalien lisäksi on 15 saatu 30 positiivista signaalia suotimilla, joita käsiteltiin heterologisissa olosuhteissa, ja nämä signaalit ovat läsnä vastaavassa paikassa kummallakin suotimella.
Signaalin vahvuus näiden 30 signaalin joukossa vaihtelee. Suurimman osan näistä signaaleista otaksutaan johtuvan 20 faageista, jotka sisältävät PG-geenin, joka on erilainen kuin PGII-geeni.
A. nioer N400:n genominen kirjasto seulotaan toisen kerran. Plakkipoimintoja valmistetaan kuten edellä on ku-25 vailtu. Lukuunottamatta käytettyä lämpötilaa, hybridisaa-!t‘·, tio suoritetaan kuten edellä. Hybridisaatio ja pesu ta- pahtuvat 62oC:ssa toiselle suotimelle kahdesta maljalta saadusta suotimesta, kun taas toinen suodin hybridisoi- • · v daan ja pestään 68°C:ssa. Hybridisaation jälkeen suotimet 30 pestään käyttäen voimakkaita SSC (HSSC)-olosuhteita, joko 62°C:ssa tai 68°C:ssa. HSSC-olosuhteet ovat seuraavat: • « ... suotimia pestään kaksi kertaa 5 minuutin ajan 4 x SSC:- • · · *. ssä, sen jälkeen suotimia pestään kahdesti 0,5 tunnin ajan 4 x SSC:ssä ja seuraavaksi kahdesti 0,5 tunnin ajan 35 2 x SSC:ssä, ottaen huomioon, että käytettävät SSC-liuok-
Mf . set sisältävät myös 0,1 % SDS:ää ja 0,1 % natriumpyrofos- !..* faattia.
• · • · •« · 105206 127
Suotimilta, joita inkuboitiin 68°C:ssa ("homologiset" hyb-ridisaatio-olosuhteet), on saatu viisi voimakasta positiivista signaalia, jotka signaalit ovat läsnä myös vas-5 taavassa paikassa suotimilla, joita inkuboitiin 62°C:ssa. Restriktioanalyysi esimerkin 3.5 mukaisesti yhdellä näistä faageista osoittaa, että tämä faagi sisältää inser-tin, jossa PGII:ta koodittava geeni (pqall) sijaitsee. Näiden viiden faagin ajatellaan sen vuoksi kaikkien si-10 sältävän pqall:n. Suotimilla, joita inkuboitiin 62°C:ssa ("heterologiset" hybridisaatio-olosuhteet), on lisäksi läsnä 17 positiivista signaalia, jotka eivät hybridisoidu tai hybridisoituvat vain heikosti vastaavilla 68°C:ssa inkuboiduilla suotimilla. Signaalin vahvuus näiden 17 15 signaalin joukossa vaihtelee.
16 faagia ensimmäisestä seulonnasta ja 10 faagia toisesta seulonnasta, jotka faagit eivät sisällä pqall:ta. valitaan lisäkarakterisointiin. Nämä faagit puhdistetaan 20 käyttäen niiden alkudetektioon käytettyjä olosuhteita. Karakterisoidut faagit ovat taulukossa VII lueteltuja faageja ja kahdeksan muuta faagia (numerot 2, 3, 7, 31, 33, 40, 41, 42). 1-30 numeroidut faagit on saatu kirjas-ton ensimmäisessä seulonnassa, kun taas faagit, joilla on I ' V 25 suuremmat numerot, on saatu toisessa seulonnassa.
• ·
Eron tekemiseksi niiden faagien välillä, jotka sisältävät :***: polygalakturonaasi I -geenin ja niiden, jotka sisältävät • 11 muita polygalakturonaasi II:een liittyviä sekvenssejä, - · 30 valikoitujen faagien plakkipoimintoja hybridisoidaan ennalta katkoluetun pGW1900:n 1,8 kep Hindlll-fragmentin • · T ... kanssa (esimerkki 3.9.). Hybridisaatio tapahtuu 62°C:ssa, • · · *, kun taas pesu tapahtuu myös 62°C:ssa käyttäen samalla SSC- ti|;‘ puskurisarjaa, jotka puskurit sisältävät kaikki 0,1 % 35 SDS:ää ja 0,1 % natriumpyrofosfaattia (4 x SSC, 2 x SSC,
I · I
#.j . 1 x SSC, 0,5 x SSC, 0,2 x SSC ja 0,1 x SSC; inkubointi kestää 0,5 tuntia puskuria kohti). Näitä olosuhteita • * • · • i · 105206 128 käyttämällä, faagit 2, 3, 7, 40. 41 ja 42 tuottavat voimakkaita hybridisaatiosignaaleja, verrattavissa signaaliin, joka saadaan faagilla PGI-lambda-7, joka viimeksi mainittu faagi sisältää pgal-geenin (esimerkki 3.6.).
5 Yhdestä näistä faageista saadun DNA:n restriktioanalyysi osoittaa myös, että tämä faagi sisältää insertin, jossa ’ pgal-geeni sijaitsee. Näiden kuuden faagin katsotaan siten kaikkien sisältävän pgal-geenin. Muut analysoidut ^ faagit (1, 8, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 43) tuottavat vain 10 heikon hybridisaatiosignaalin jos sitäkään, eivätkä nämä faagit siitä johtuen sisällä pgal-geeniä.
Sen selville saamiseksi, mitkä faagit sisältävät identtisiä fragmentteja, DNA:ta eristetään taulukossa VII 15 esitetyistä faageista kuten esimerkissä 3.5 on kuvailtu, ja pilkotaan kuten esimerkissä 3.6 on kuvailtu, ja tuloksena olevat fragmentit karakterisoidaan sen jälkeen Sout-hern-blot-analyysillä. HinfI- ja Hindi-hvdrolvsaattien analysoimiseksi geelien agaroosipitoisuus nostetaan 1-20 %:iksi (paino/tilavuus). Southern-blotit hybridisoidaan 60°C:ssa ennalta katkoluetun pGW1803:n 1,2 kep Bam-HI/EcoRI-fragmentin kanssa, samalla kun pesu tapahtuu myös 60°C:ssa, käyttäen edellä kuvailtuja HSSC-olosuh-teita. Restriktioentsyymit, joiden todetaan olevan käyt-25 tökelpoisia näiden faagien alkuluokittelun tekemiseksi, . . käsittävät yhdistelmät BamHI ja Bglll, ja Hinfl ja Hin ,.|i1 dl, joita jälkimmäisiä entsyymejä käytetään erikseen.
:"j: Hindi ja Hinfl synnyttävät tavallisesti pieniä restrik- tiofragmentteja, jotka tässä tapauksessa, minimoivat 30 mahdollisuuden, että tuloksena olevat hybridisoituvat fragmentit sisältävät DNA:ta, joka on peräisin EMBL77784- • · vektorista, pgall:een läheisesti liittyvän sekvenssin *. lisäksi.
• f · • · · · • · t * · • · • » · « · • « 1 • I · • · •
• I
129 105206
Taulukko VII: PGIIreen liittyvien lambda-faagien luokittelu, perustuen hybridisoituvien lambda-DNA-fragmenttien kokoon (kilo-5 emäspareina), jotka on saatu näistä faageista eristetyn DNA:n pilkkomisen jälkeen Hindi:11a. Hinfltllä ja Bglll-/BamHI:llä ja joskus Sali:llä. käyttäen pGW1803:n 1,2 kep BamHl/EcoRI-fraamenttia koettimena.
Lambda-faagiryhmät*
Restriktio- entsyymi A B C* D E F Gb
Lambda-faagit, jotka kuuluvat vastaaviin ryhmiin: 9,10, 4,35, 1,16, 8,11, 6,38 5 17,27 43 36 20,37 12
Fragmentin pituus (kep)
Hindi 1,25 2,4 1,75 1,3,-0,4 1,3 2,3 0,78
Hinfl 0,7; 1,1 1,28 1,8 0,65 0,6 0,3
Bgl.II/
BamHI 7,2; 3,1 8,7 1,7 4,1 223 3,0(la-17) 0,56 (la-10) (la-4) (la-20) (la-6) 4,9 (la-27) • . Sali 6,9 e.m. 6,8 1,3;0,5 e.m.
·:· (la-16; la-20) • t · ··· • c · • · c • * Faageilla numero 16 ja 20 on myös yhteisenä 1,64 kep Kpnl-fragmentti ja 1,38 kep HindI/Kpnl-fragmentti.
v • · · • · · • · · 5 b Ryhmän G faagit hybridisoituvat vain heikosti PGII:n ...T kanssa ei-kovissa olosuhteissa.
• · « • · • · « · · : e.m.- Pilkkomista ei suoritettu.
• ·» la lambda • t • · • · 130 105206
Taulukossa VII esitetyistä tuloksista selviää, että u-seimpien faagiryhmien kohdalla useita tyypillisiä faageja on eristetty itsenäisesti. Ottaen huomioon tosiseikka, 5 että ainoastaan kaikkien hybridisoituneiden signaalien valikointi on otettu alkuseulontaan, kussakin ryhmässä ' todettu lambda-faagien lukumäärä (ryhmä A: 3; B: 3; C: 4; D: 3; E: 2) osoittaa, että eri geenien esiintymistiheys ’ todetaan samaksi. PGI-geenin tapauksessa, tämä määrä on 10 suurempi (6 analysoiduista 26 faagista), kun taas PGII:n sisältäviä faageja havaitaan samassa esiintymistiheydessä (12 analysoiduista 59 faagista). Ryhmä G on heikommin hybridisoituva kummankin koettimen kanssa, jotka ovat peräisin joko PGI-geenistä tai PGII-geenistä. Hybridisoi-15 tuvien 3,0 ja 4,9 ke fragmenttien lisäksi faageissa numero 17 ja vastaavasti 27, useita hybridisoitumattomia fragmentteja, jotka ovat identtisiä molemmissa faageissa, ja jotka ovat peräisin inserteistä, havaitaan Bqlll/Bam-HI-hydrolysaatissa, nimittäin 5,6 kep, 5,1 kep, 1,45 kep 20 ja 0,57 kep fragmentti. Myös Hindi- ja HinfI-pilkonnat molemmista faageista ovat melkein samat.
Tässä esimerkissä eristetyt faagit nimetään uudelleen seuraavasti: 25 c
Ryhmä: Numero: Nimi: ·· · "* *::: A 9 lambda-PG-A9 t · ’···' 10 lambda-PG-A10 • ·« V : 43 lambda-PG-43 30 B 4 lambda-PG-B4 35 lambda-PG-B35 36 lambda-PG-B36 C 1 lambda-PG-Cl • a i 16 lambda-PG-Cl 6 a '··/ 35 20 lambda-PG-C20 37 lambda-PG-C37 • · D 8 lambda-PG-D8 • aa 131 105206 11 lambda-PG-Dl1 12 lambda-PG-Dl2 E 6 lambda-PG-E6 38 lambda-PG-E38 5 F 5 lambda-PG-F5 G 17 lambda-PG-G17 27 lambda-PG-G27 ei määritetty 31 lambda-PG-X31 ei määritetty 33 lambda-PG-Y33 10
Esimerkki 7.3: PGC-geenin (pgaC) subkloonaus; pGW1910:n konstruointi
Faagi lambda-PG-C20 (esimerkki 7.2; faagi 20, ryhmä C) pilkotaan BolII:llä ja tuloksena olevat fragmentit erote-15 taan agaroosigeelillä. Geelipalat, jotka sisältävät hyb-ridisoituvan 7,8 kep Bglll-fragmentin, otetaan talteen ja fragmentti eristetään sen jälkeen kuten on kuvailtu (esimerkki 3.6). Bglll-fragmentti liitetään BamHI:llä pilkottuun ja CIP:llä (vasikan suoliston fosfataasi) käsitel-20 tyyn pUC9:ään. Ligaatioreaktioseosta käytetään E. coli JMl09:n transformointiin (esimerkki 3.6). Useat tuloksena olevista valkoisista pesäkkeistä hajotetaan YT-agarille, johon on lisätty ampisilliiniä. Kasvettuaan yli yön pe-säkkeet adsorboidaan nitroselluloosasuotimelle. Suotimel- • I · .·. : 25 la olevat pesäkkkeet hajotetaan sen jälkeen ja vapautunut f I » DNA kiinnitetään paistamalla kuten Maniatis et ai. on ”.Y. kuvaillut (6; s. 314). Paistetut suotimet kostutetaan • ·
Hl 2xSSC:ssä ja niitä hangataan kevyesti hansikoidulla kä- • · « *·’ ' dellä bakteerisolu jäänteiden poistamiseksi. Suotimet 30 hybridisoidaan sen jälkeen pGW1803:n 1,2 kep BamHI-EcoRI- t '·*'· fragmentin kanssa käyttäen heterologisia olosuhteita • · t ' v * kuten esimerkissä 7.2 on kuvailtu (60°C, pesut 2xSSC:llä).
Positiivinen klooni valitaan ja plasmidi-DNA puhdistetaan "··, kuten edellä on kuvailtu. Plasmidi-DNA:ta käytetään sit- « · T 35 ten restriktioanalyysiin fysikaalisen kartan konstruoimi- 9 · seksi.
IM • · • ·
• · I
132 105206 Tällä tavalla on konstruoitu uusi plasmidi. pGW1910 (kuvio 7) on faagin lambda-PG-20 7,8 kep Bqlll-fragmentti liitettynä vektorin pUC9 BamHI-kohtaan. Tämä subklooni sisältää faagin lambda-PG-20 hybridisoituvia frag-5 mentteja, esim. 1,1 kep Smal-fragmentin ja 1,6 kep Kpnl-fragmentin. Näiden fragmenttien sijainnista pGW1910:n fysikaalisella kartalla päätellään, että tämä plasmidi sisältää koko PGC-geenin (pgaC). * 10 Esimerkki 8: Ihmisen hybridi-interferoni BDBB:n ilmeneminen PGII-promoottorin ohjauksessa
Esimerkki 8.1; Plasmidin pGII-IFN AM119 prekursorin konstruointi (kuvio 4) 15 Plasmidi pGW1800 pilkotaan EcoRI:llä ja käsitellään T4-polymeraasilla kuten jäljempänä. Tämän DNA:n uudelleen ligointi ja E. coli DH5aF':n transformointi antaa mahdollisuuden plasmidin pGW1800-E eristämiseksi, joka on sama kuin pGW1800, paitsi että EcoRI-katkaisukohta puut-20 tuu.
Plasmidi pGW1800-E pilkotaan Bgl.II:llä ja käsitellään , bakteerisella alkalisella fosfataasilla (BRL) 50 mM Tris- HCl:n pH 8,0 ja 50 mM NaCl:n läsnä ollessa 1 tunnin ajan 25 65°C:ssa. Alkalinen fosfataasi inaktivoidaan pilkkomalla ' proteinaasi K:11a (Boehringer Mannheim) ja fenoliuutolla.
• · · ***j DNA saostetaan sen jälkeen etanolilla, kuivataan ja liuo- • ·
*···’ tetaan veteen. Tarttuvat päät täytetään sen jälkeen T4 DNA
*.* " -polymeraasin avulla kuten jäljempänä.
30
Plasmidi pJDB207-IFN AM119 (EP 205 404) pilkotaan Hin-:T: dIII:lla ja Clal:llä. Näiden lineaaristen fragmenttien \f tarttuvat päät täytetään T4 DNA -polymeraasilla (Boehrin- ger Mannheim) siten, että läsnä on 0,1 mM kutakin seuraa- • · 35 vista dCTP, dGTP, dATP ja dTTP sekä 67 mM Tfis-HCl:ia pH 7,5, 6,7 mM MgCl2:a, 16,7 mM (NH4)2S04:a ja 5 mM DTT:tä 30 min. kuluessa 37°C:ssa. Reaktio pysäytetään kuumentamalla • · · 105206 133 65°C:ssa 5 min. ajan. Fragmentit erotetaan 0,8-%:isella geeliytymislämpötilaltaan alhaisella agaroosigeelillä (BioRad), ja 1 kep fragmentti, joka sisältää IFN AMll9:n kooditusalueen, katkaistiin ja DNA puhdistettiin Elutip D 5 (Schleicher & SchUll)-kolonnilla, ja etanolisaostettiin (Schmitt & Lohen, 34).
100 ng IFN AMI19-fragmenttia ja valmistettu pGW1800-E-vektori liitetään yhteen 5 pl:ssa liuosta, joka sisältää 10 20 mM Tris-HCl:ia pH 7,5, 10 mM MgCl2:a, 10 mM DTT:tä, 1 mM ATP:tä ja 1 yksikön T4 DNA-ligaasia (Boehringer Mannheim), 2 tunnin kuluessa huoneen lämpötilassa. Tämä seos transformoidaan kompetentteihin E. coli DH5aF' -soluihin. Ampisilliinille resistenttejä transformantteja seulotaan 15 niiden plasmidi-DNA:n restriktiohydrolyysin avulla niiden identifioimiseksi, jotka sisältävät plasmidin pGII-IFN AMI19 prekursorin.
Esimerkki 8.2: Täsmällisten pGII-IFN AM119- 1a pGIIss-IFN 20 AMI 19-fuusioiden muodostaminen PCR;n avulla (kuviot 4 -ja 51
Noudatettu PCR-menetelmä on kuten Horton et ai., 35, on kuvaillut ja esitetään kuviossa 5.
25 pGW1800 tehdään lineaariseksi Xbal-pilkonnalla ja seoste taan etanolilla. Uudelleen veteen suspendoimisen jälkeen *'!! 100 ng tätä DNA:ta monistetaan polymeraasiketjureaktiolla • « *·; (PCR), käyttäen oligonukleotidejä A ja B (kuvio 5) auto- » · · ‘ maattisessa lämpötilan syklityslaitteessa 25 syklin ver-
30 ran (kunkin käsittäessä 1 min. 94°C:ssa, 2 min. 40°C:ssa, ja 3 min. 72eC:ssa), jota seurasi 10 min. 72°C:ssa. 100 pM
• · · * V · kutakin oligonukleotidiä ja 0,5 μΐ Taq-polymeraasia (Per- kin Elmer Cetus) käytetään kuhunkin reaktioon 100 μ1:η t tilavuudessa, käyttäen toimittajan suosittelemaa reak- · 'I' 35 tiopuskuria. Tämä antaa DNA l:n (kuvio 5).
» · • · · • i i • ·
Samalla tavalla käsitelty pGW1800 oligonukleotidien A ja 105206 134 C kanssa tuottaa DNA 2:n.
Samalla tavoin pJDB207-IFN AM119, joka on linearisoitu BamHI:llä ja viety PCR:ään joko oligonukleotidien D ja F 5 tai oligonukleotidien E ja F kanssa, tuottaa DNA 3:n tai vastaavasti DNA 4:n.
Nämä reaktioseokset seostetaan etanolilla, liuotetaan uu- * delleen veteen, ja näyte-erä tarkistetaan geelillä DNA-10 fragmenttien pitoisuuden määrittämiseksi seoksissa.
Käyttämällä samoja olosuhteita kuin edellä, DNA 1 ja DNA 4 viedään PCR:ään oligonukleotidien A ja F kanssa, jolloin saadaan DNA 5, ja DNA 2 ja DNA 3 samojen oligonuk-15 leotidien kanssa, jolloin saadaan DNA 6 (kuvio 5).
DNA 5 alkaa BamHI-kohdasta ja päättyy EcoRI-kohtaan ja sisältää alkuperäisen lähtömetioniinikodonin, kytkettynä PGII-promoottorifragmenttiin, täydellisen fuusion oikeas-20 sa lukukehyksessä valmiin hybridi-interferonin BDBB koodi tusalueeseen.
;T; DNA 5:n BamHI-EcoRI-fragmentti liitetään BamHI-EcoRI:llä katkaistuun plasmidin pGII-IFN AM119 prekursoriin, joka 25 on konstruoitu esimerkissä 8.1, plasmidin pGII-IFN AM119 muodostamiseksi.
• · · » ···· • · · • · ·”' Samalla tavoin DNA 6:n BamHI-EcoRI-fragmentti, joka si- * e ’·* * sältää PGII-promoottorifragmenttiin kytketyn PGII-sig- 30 naalisekvenssin täydellisen fuusion oikeassa lukukehyk- sessä valmiiseen hybridi-interferoniin BDBB, liitettiin V * pGII-IFN AM119 -prekursoriin plasmidin pGIIss-IFN AM119 muodostamiseksi.
«IM
• · « « « • f 35 Esimerkki 8.3: Aspergillus niaer -mutantin foi8 kotrans-formolnti pCG59D7:llä ia pGIIss-IFN:llä tai pGII-IFN:llä Uridiiniauksotrofinen mutantti An8 (*DSM 3917, julkis 105206 135 tettu EP 278 355:ssä) kotransformoidaan plasmldilla pCG-59D7 ja pGIIss-IFN:llä tai pGII-IFN AM119:sta, jolloin saadaan uridiiniprototrofeja.
5 Aj. niaer An8:n konidioitiöitä kasvatetaan 4 päivän ajan 28°C:ssa täydellisessä alustassa täyteen itiöintiin. 2xl08 konidioitiötä käytetään siirrostettaessa 200 ml minimaa-lialustaa, joka sisältää lisäksi 1 g/1 arginiinia ja uri-diiniä.
10 20 tunnin kasvatuksen jälkeen 28°C:ssa nopeudella 180 rpm, rihmasto kerätään talteen suodattamalla Mira-kankaan läpi, pestään kahdesti 10 ml:11a liuosta, joka sisältää 0,8 M KCl:a ja 50 mM CaCl2:a ja suspendoidaan 20 mitään 15 liuosta, joka sisältää 0,8 M KClta, 50 mM CaCl2:a, ja 0,5 mg/ml Novozym 234tää (Novo Industries). Seosta in-kuboidaan ravistelevassa vesihauteessa (30°C, 50 rpm) kunnes protoplasteja vapautuu riittävästi (havaittuna mikroskooppisesti 90- 120 min. kuluttua). Protoplas-20 tisuspensio suodatetaan lasivillatupon läpi suppilossa rihmastojäänteiden poistamiseksi. Protoplastit pel-letoidaan lievällä sentrifugoinnilla (10 min. 2000 rpm) huoneen lämpötilassa ja pestään kahdesti 10 ml:11a liuosta, joka sisältää 0,8 M KClta ja 50 mM CaCl2:a. Lopuksi 25 protoplastit resuspendoidaan 200-500 pl:aan liuosta, joka sisältää 0,8 M KClta ja 50 mM CaCl2:a, mikä ar.taa pitoi-suudeksi lxl08/ml.
• · • 1 • · · ♦ · • · · '·' 1 Transformaatiota varten 200 piin näytettä protoplastisus- 30 pensiosta inkuboidaan seoksessa, joka sisältää 5 pg pCG-59D7tää ja 50 pg pGIIss-IFN AM119- tai pGII-IFN AM119-DNA:ta, ja 50 pl PCT-liuosta (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2, 25 % PEG 6000). Inkubointiseosta pidetään jäiden päällä 20 min. ajan, vielä 2 ml PCTttä lisätään, ja seos-35 ta inkuboidaan vielä 5 min. huoneen lämpötilassa. 4 ml liuosta, joka sisältää 0,8 M KCl:a ja 50 mM CaCl2:a, « « · ί.,,ί lisätään ja 1 ml:n näyte-eriä lopullisesta transfor- 105206 136 maatioliuoksesta sekoitetaan nestemäiseksi tehdyn mini-maaliagaralustan kanssa (minimaalialusta + 1 g/1 ar-giniinia + 10 g/1 Bacto-Agar'ia (Difco)), stabiloidaan 0,8 M KCl:n kanssa. Seokset valetaan välittömästi samaa 5 alustaa sisältäville agarmaljoille ja inkuboidaan 30°C:-ssa.
2-3 päivän kasvun jälkeen 28°C:ssa, pysyvät transformantit näkyvät voimakkaasti kasvavina ja itiöivinä pesäkkeinä 10 taustakasvua vasten, joka käsittää monia satoja pieniä, luultavasti epäonnistuneita transformantteja.
Esimerkki 8.4: Hybridi-interferoni BDBB:n geenin ilmeneminen PGII-promoottorin ohjauksessa 15 Kotransformaatiokokeen transformantteja (esimerkki 8.3) poimitaan ja niistä analysoidaan interferonin ilmeneminen. Interferoniaktiivisuus määritetään Armstron-g'in menetelmän mukaisesti (J.A. Armstrong, Appi. Microbiol. 21^. 732 20 1971)), käyttäen ihmisen CCL-23 -soluja ja vesikulaarista stomatiittivirusta (VSV) ärsykeviruksena.
: : : Transformanttien konidioitiöitä esiviljellään yk- sittäisesti 50 mltssa esiviljelyalustaa (Pectin Slow Set ;'·/ 25 L (Unipectin, SA, Redon, Ranska) 3 g/1, NH4C1 2 g/1, KH2P04 0,5 g/1, NaCl 0,5 g/1, MgS04x7H20 0,5 g/1, CaS04x- ,···. 2H20 0 , 5 g/1, pH 7,0, 1 % arginiini). Esiviljelmää in- • · t!j!t kuboidaan 72 tuntia 250 rpm 28°C. 10 % esiviljelmästä • · · ’ käytetään siirrostettaessa 50 ml pääviljelyalustaa (Soi- 30 jajauho 20 g/1, Pectin Slow Set 5 g/1, 1 % arginiini).
* * Viljelmää kasvatetaan 72-96 tuntia 250 rpm ja 28°C:ssa.
··· • · · • · · Näytteitä otetaan eri aikoina (joka 20. tunti), solut • > · · .···. pelletoidaan sentrifugoimalla ja rikotaan jäädytyskuiv- 35 auksen ja kuivana jauhamisen avulla. Sekä supernatantista • * · *· *! että solu-uutteista testataan interferoniaktiivisuus « · « kuten on kuvailtu (edellä). Pääosan interferoniak- 105206 137 tlivisuudesta todetaan erittyvän alustaan transforman-teista, jotka sisältävät pGIIss-IFN AM119 -plasmidin, kun taas transformanteilla, jotka sisältävät pGII-IFN AM119 -plasmidin, sitä on pääasiassa solu-uutteissa.
5
Esimerkki 9: Polvaalakturonaasi I:n 1a polvaalakturonaasi II;n tuotanto transformoiduilla A. nidulans -kannoilla
Esimerkki 9.1: A. nidulans G191 E. coll MH1:n transfor-10 mointiin käytettävien plasmidien lisääminen 1a puhdistaminen pGW635:ttä lisätään E. coli MHl:ssä, pGW1800:aa JM109:ssä ja pGW1900:aa DH5aF':ssa.
15 Esimerkki 9.2; Protoplastien valmistaminen 1a uridlini-auksotroflsen A. nidulans -mutantln transformolnti Ballance ja Turner, 1985, 27, ovat kuvailleet A. nldula-nsin mutanttikantaa G191 (pyrG. pabaAl, fwAl, uaY9).
20 Rihmastoa kasvatetaan 37°C:ssa ja jatkossa menetellään kuten A_j_ nloer:n kohdalla on kuvailtu (katso esimerkki 5.2), paitsi että 2 mg p-aminobentsoaattia lisätään alus-talitraa kohti. Protoplasteja valmistetaan noudattaen A^_ nioerllle kuvailtua menettelyä. Transformaatiota varten 5 « 25 x 106 protoplastia siirretään 200 pl:aan STC-liuosta, I ( joita inkuboidaan sen jälkeen seoksessa, joka sisältää 1 t pg pGW635:ttä ja 20 pg pGW1800:aa tai 25 pg pGW1900:aa. Maljoja inkuboidaan 3 päivän ajan 37°C:ssa.
i i « • · · 30 Suunnilleen 50 transformanttia/pg pGW635:ttä saadaan ko- *·"· transformaatiokokeessa, ja kustakin kokeesta 20 transfor- • · > V * mänttiä jatkopuhdistetaan 50 mM glukoosiminimaalialustal- la. Näitä kantoja käytetään myöhemmin itiöiden kasvat-tamiseksi jatjcoanalysointia varten.
35 « · ·,*·: Esimerkki 9.3; Western-blot-analwsi polvaalakturonaasi I;n 1a polvaalakturonaasi II;n tuotannosta transformoi- 138 105206 duilla A. nidulans -kannoilla
Kotransformantteja, jotka on saatu esimerkin 5.2 mukaisesti käyttäen pGWl800:aa kotransformoivana plasmidina, kasvatetaan pinnanalaisesti 75 ml:ssa minimaalialustaa, 5 käyttäen 2 mg/1 p-aminobentsoaattia, 7,5 g/1 NH4N03:a typenlähteenä ja 1 % (paino/tilavuus) omenapektiiniä * (d.e. 61,2 %) sekä 1% (paino/tilavuus) sokerijuurikas-massaa hiilenlähteenä, aloittaen 105 konidioitiöllä ml:aa kohti. Gallenkamp'in pyöriväliikkeistä ravistelulaitetta 10 käytetään 250 rpm nopeudella, ja kasvatuslämpötilana pidetään 30°C.
Näytteitä otetaan 43 ja 68 tunnin kasvatuksen jälkeen, sentrifugoidaan ja supernatanttia dialysoidaan yli yön 15 4°C:ssa 5 mM natriumfosfaattipuskuria pH 6,5 vastaan, joka sisältää 0,02 % (paino/tilavuus) natriumatsidia. Näiden näytteiden sisältämän PGII:n pitoisuusanalyysi suoritetaan Western-blottauksella (katso sivu 69) käyttäen poly-klonaalisia tai monoklonaalisia vasta-aineita. Kontrol-20 Iina käytetyt A. nidulans -näytteet eivät sisällä PGII-ristireaktiivista materiaalia testattaessa mono-klonaalisilla vasta-aineilla.
Il
• I I
• I I
Kaikki kaksikymmentä analysoitua transformanttia tuot-25 tavat polygalakturonaasi II:ta, vaikka määrä vaihtelee eri transformanttien kesken. Päävyöhykkeen lisäksi, jolla
• •M
.···. on odotettu molekyylipaino (38 kDa), havaitaan useita • 9 vähäisempiä vyöhykkeitä, joilla on pienempi molekyylipa!- • · ’ no, jotka mitä todennäköisemmin edustavat hajotustuot- 30 teitä. Eniten entsyymiä tuottava transformantti on A.
nidulans G191/pGWl800-13. Tämän transformantin polygalak-V * turonaasiaktiivisuutta, käyttäen erilaisia kasvualustoja, ··· verrattiin vastaanottajalkannan aktiivisuuteen kuten
• III
.··*. taulukossa VIII on esitetty.
• · · 35 • ·
Taulukko VIII
A. nidulans -transformantin G191/pGWl800-13 ja A. nidul- i · · 105206 139 ans G191:n viljelmäsuodosten polygalakturonaasiak-tiivisuuksla. Kantoja kasvatetaan siirrostamalla 106 itiötä/ml 30°C:ssa minimaalialustassa, käyttäen N- ja C-lähteitä kuten on määritelty ja runsaasti fosfaattia (15 5 g KH2P04/litra) sekä 1 % hiivauutetta.
Kanta C-lähde N-lähde Fermen- Polygalakt- tointi- uronaasiak-aika tiivisuus 10 (U/ml) G191 3 % glukoosi 1 % NH4C1 40 e.h.
G191/pGW635-l 3 %. glukoosi 1 % NH4C1 40 e.h G191/pGW1800-13 3 % glukoosi 1 % NH4C1 40 120 15 G191 1 % pektiini + 1 % NH4C1 40 e.h.
1 % sokerijuuri-kasmassa G191/pGW1800-13 1 % pektiini + 1 % NH4C1 40 130 20 1 % sokerijuuri- kasmassa I » ' ! ! e.h. - ei havaittu i I E .
I < ' I < 25 Koska transformantti G191/pGWl800-13 syntetisoi korkeita PGII-tasoja pektiiniaineiden puuttuessa, muiden saatujen ,···, A. nidulans Gl91/pGW1800-transformanttien PGII-tuotantoa • · analysoidaan myös lisää. Tätä tarkoitusta varten 19 t- • · · * ransformanttia samoin kuin G191/pGW635-l:tä kasvatetaan 30 alustassa, joka koostuu minimaalialustan suoloista, käyttäen 0,4 % NH4Cl:a typenlähteenä ja 5 % glukoosia hiilen- • · · * ·.· ’ lähteenä, lisättynä fosfaatilla korkeassa pitoisuudessa ··· (15 g/1 KH2P04). Viljelmäsuodoksia sadaan 46 ja 69 tunnin ·· « « .···. jälkeen, ja ne analysoidaan jälkeenpäin Western-blottauk- '· 35 sella koetinkäsittelemällä monoklonaalisella vasta-ai- « · '· ” neella, ilman että viljelmäsuodoksia väkevöidään ja dia- • « · lysoidaan etukäteen. Vähintään 17 kaikkiaan 19:sta A.
105206 140 nidulans G191/pGW1800 -transformantista syntetisoi PGII:-ta glukoosialustalla, kun taas yhtään signaalia ei saada A. nidulans G191/pGW635-l:llä. Se tosiseikkka, että selviä signaaleja saadaan, merkitsee korkeata ilmenemistasoa 5 verrattuna A. nidulans N402:een, jota on kasvatettu poly-galakturonaasia indusoivissa olosuhteissa, jollaisia kuvailtiin esimerkissä 5.5, koska vain heikkoja PGII-signaaleja saadaan transformoimattoman kannan vil-jelmäsuodoksien Western-bloteista, käytettäessä väkevöi-10 mättömiä suodoksia ja monoklonaalista vasta-ainetta. A. niaer G191/pGW1800-13:n ja kuuden muun G191/pGW1800-t-ransformantin PGII-tuotanto, käyttäen edellä kuvailtua alustaa mutta l-%:inen juurikasmassa ja l-%:inen pektiini hiilenlähteinä 5-%:isen glukoosin sijasta, analysoidaan 15 myös kuten edellä on kuvailtu. Päinvastaisesti kuin A. nidulans G191/pGWl800-13, nämä kuusi transformanttia tuottavat paljon enemmän PGII:ta pektiini- ja juurikas-massa-alustalla, kun taaskaan yhtään signaalia ei havaita A. nidulans G191/pGW635-l:llä.
20
Esimerkin 9.2 mukaisesti saatuja kotransformantteja, käytettäessä pGW1900:aa kotransformoivana plasmidina, kasvatetaan kahdella erilaisella alustalla. Ensimmäinen alusta koostuu runsasfosfaattisesta minimaalisuola-alus-25 tästä, johon lisätään NH4Cl:a (4,0 g/1), 1 % (paino/tila- < <;< vuus) omenapektiiniä (d.e. 61,2 %) ja 1 % (paino/tila- t vuus) sokerijuurikasmassaa, kun taas joitakin transfor-mänttejä kasvatetaan myös tässä alustassa urea (4,2 g/1) • · · typenlähteenä NH4Cl:n asemesta. Eroavuus aikaisempaan 30 matalafosfaattiseen minimaalialustaan (sivu 28) on se, ’·’*· että 15 g KH2P04:ää käytetään litraa kohti 1,5 g:n asemes- ··· ί,ί · ta. Toinen alusta koostuu myös runsaasti fosfaattia si- sältävästä minimaalisuola-alustasta, johon lisätään 0,1 % hiivauutetta, NH4Cl:a (10 g/1) ja 3 % (paino/tilavuus) • · 35 glukoosia typen- ja hiilenlähteeksi. Kumpaankin alustaan • · lisätään 2 mg/1 p-aminobentsoaattia. Viljelmiä kas-'·"/· vaietaan 42 tuntia 30°C:ssa, käyttäen Gallenkamp'in pyöri- 105206 141 väliikkeistä ravistelijaa nopeudella 250 rpm, ja näytteitä otetaan viljelmäsuodoksesta 20 tunnin ja 42 tunnin jälkeen. A. nidulans G191:n Western-bloteissa, jota oli kasvatettu samanlaisissa olosuhteissa kuin transfor-5 mänttejä, ei havaita lainkaan tai havaitaan hyvin vähän proteiinia, joka ristireagoi polyklonaalisen vasta-aineen kanssa, joka on tehty puhdistettua polygalakturonaasi I:tä vastaan. Viljelmäsuodoksissa, jotka käsittävät 75 % transformanteista, PGI:tä havaitaan merkittävinä tasoina.
10 NH4Cl:n käyttäminen urean sijasta ja runsaan fosfaatin käyttäminen myös kompleksisissa alustoissa vähentää huomattavasti tuotetun polygalakturonaasin proteolyyttistä hajoamista. Western-blottaustulosten ja ak-15 tiivisuusmääritysten perusteella G191/pGW1900-6:n lasketaan tuottavan yli 1 g entsyymiä litraa kohti kuten taulukossa VI osoitetaan, koska PGI:n spesifinen aktiivisuus on 550 U/mg (Kester ja Visser, 1990).
20 Taulukko VI
A. nidulans -transformantin G191/pGW1900-6:n ja kontro-llikannan G191/pGW635-l:n viljelmäsuodosten polygalak-turonaasin aktiivisuuksia. Kantoja kasvatetaan siirros- « tamalla 106 itiötä/ml 30°C:ssa minimaalialustassa, käyt- « ; 25 täen N- ja C-lähteitä kuten on osoitettu ja runsaasti fosfaattia (15 g KH2P04/1).
9 9 999 9 99 9 9 9 9 99 9 999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 * 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 ' 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 m 9 9 9 9 9 ·
• I
142 105206
Kanta Olähde N-lähde Fermen- Polygalakt- tointi- uronaasiak-alka tiivisuus 5 (U/ml) G191/pGW635-l 3 % glukoosi 0,4 % NH4C1 64 e.h.
G191/pGW635-l 1 % pektiini + 0,4 % NH4C1 49 e.h.
1 % sokerijuuri-10 kasmassa G191/pGW635-l 1 % pektiini + 0,4 % urea 26 e.h.
1 % sokerijuuri-kasmassa G191/pGW1900-6 3 % glukoosi 0,4 % NH4C1 64 5 15 G191/pGW1900-6 1 % pektiini + 0,4 % NH4C1 22 17 1 % sokerijuuri-kasmassa " 0,4 % NH4C1 26 125 " 0,4 % NH4C1 49 570 20 G191/pGW1900-6 1 % pektiini + 0,4 % urea 22 125 1 % sokerijuuri-kasmassa " 0,4 % urea 26 225 I I I 9 : 25 " 0,4 % urea 49 140 * « e.h. = ei havaittavissa ···· • · · • « "I pqal- ja pqall-geenit, jotka koodittavat polygalak- • · « turonaasia I ja vastaavasti polygalakturonaasia II, eivät 30 ilmene Α^_ nigerissä glukoosia sisältävillä alustoilla, *’**· edes monikopioisissa transformanteissa, joilla on suuri ··· · geeniannos. A^. niqer -geenien ilmeneminen A. nidulans - t transformanteissa, kuten kannoissa G191/pGW1900-6 ja « G191/pGW1900-10 ja vastaavasti kuten kannoissa G191/pGW- ’:** 35 1800-13 ja G191/pGW1800-20, osoittaa kuitenkin, että A.
• « nidulansissa näiden geenien kataboliittirepressio on
«M
ί.,.ϊ kierretty. Tämä merkitsee erilaisia spesifisyyksiä kata- 105206 143 boliittirepressiosysteemissä näiden eri Asperoillus-la1i-en keskuudessa. Tätä voidaan käyttää hyväksi tietyn A. nigerin polygalakturonaasigeenin ilmentämiseksi eri isännässä kuten A. nidulansissa. olosuhteissa, jotka estävät 5 itse isännän polygalakturonaasien ilmentämisen. Siten saadut polygalakturonaasientsyymit ovat käytännöllisesti katsoen puhtaita.
Esimerkki 10: Polvaalakturonaasi II:n eristäminen, puh-10 distaminen 1a karakterisointi A. nidulansin transforman-tista G191/PGW1800-13
Esimerkki 10.1: PGII:n tuottaminen käyttäen G191/pGW1800-13-transformanttia 15 A. nidulansin transformanttia G191/pGW1800-13 kasvatetaan 100 ml:n viljelminä 1% sokerijuurikasmassaa ja 1 % pek-tiiniä sisältävällä alustalla, jonka koostumus on kuten esimerkissä 5,3, paitsi että käytetään 15 g/1 KH2P04:ää 1,5 g/1 sijasta. Samalla tavoin tätä transformanttia 20 kasvatetaan myös sekä matalissa että korkeissa fosfaat-titasoissa minimaalialustalla, käyttäen 5 % tai 1 % glukoosia hiilenlähteenä. Nämä alustat eivät johda havaitsi ' tavaan polygalakturonaasi II:een Aj_ niaer N402:ssa, kun taas kanta A. nidulans G191 itsessään on kykenemätön ' 25 tekemään PGIIrta kuten esimerkissä 9.3 on kuvailtu.
« * • · * ,···. A. nidulansin transformantin G191/pGW1800-13 viljelmäsuo- • · dosnäytteissä, otettuna 72 tunnin jälkeen, käyttäen 5 % • · · * glukoosia ja runsaasti fosfaattia, todetaan suunnilleen ’ ^ 30 860 U/ml PG-aktiivisuus, kun sitävastoin käytettäessä * * niukasti fosfaattia tämä määrä on 550 U/ml. Havaitut ‘ V * alentuneet tasot silloin, kun käytetään 1 % glukoosia ja runsaasti fosfaattia, johtuvat pääasiassa proteiinien »Ml .···, hajoamisnopeuden (turnover) lisääntymisestä, kun hiilen- • « I" 35 lähde loppuu 48 tunnin kuluttua. Siinä tapauksessa, että *· ‘i glukoosia on 1 % ja fosfaattia on niukasti, tuotantotaso * · pysyy matalana koko viljelyjakson aikana. Saadun proteii- 105206 144 nin määrä litraa kohti viljelmäsuodosta, kun käytetään 5 % glukoosia ja runsaasti fosfaattia, lähentelee tasoa 1 g litraa kohti. SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi osoittaa, että transformantin viljelmäsuodos sisältää 5 yhden proteiinivyöhykkeen, jonka molekyylimassa vastaa A. niaer PGII:n molekyylimassaa.
Esimerkki 10.2: PGII:n eristäminen 1a puhdistaminen A. * nidulansin transformantin G191/pGW1800-13 viljelmän suo-10 doksesta
Viljelmäsuodos (suunnilleen 2 1), jonka pH on suunnilleen 4,9, laimennetaan 5-kertaiseksi tislatulla vedellä, ja säädetään sen jälkeen pH-arvoon 6,0 käyttäen 2 N NaOH:a. Entsyymin väkevöimiseksi liuos ladataan 600 ml Sephadex 15 DEAE-A50-kolonniin, joka on esitasapainotettu 20 mM kali-umfosfaattipuskuriin pH 6,0, joka on sijoitettu biichner-suppiloon suurten virtausnopeuksien mahdollistamiseksi.
Kaikki entsyymiaktiivisuus adsorboituu ioninvaih-tomateriaaliin ja kerätään 300 ml:aan eluoimalla 1 M 20 NaCl:lla samassa puskurissa (talteenotto: 65 %). Entsyy-miliuos dialysoidaan sen jälkeen 10 mM Bis Tris-puskuria pH 6,0 vastaan ja ladataan Sepharose DEAE Fast Flow-ko-lonniin (60 ml pakatun kolonnin tilavuus), joka on tasa-painotettu samaan puskuriin. Entsyymiaktiivisuus eluoi- : 25 daan, käyttämällä 0-0,5 M NaCl-gradienttia puskurissa, J · [ suunnilleen 0,15 M NaCl:n kohdalla (kokonaistalteensaa-nti: 57 %).
• · • · • f « • · · • · t
Esimerkki 10.3: PGII:n ominaisuuksia, loka on puhdistettu 30 A. nidulansin transformantin A. nidulans G191/PGW1800- *· · 13:n vlllelmäsuodoksesta • · · V * Esimerkin 10.2 mukaisesti puhdistettua PGII:ta on ver- .:. rattu entsyymiin, joka on puhdistettu Rapidase'sta kuten .···. esimerkissä 1.1 on kuvailtu (PGII-tapaus). Molemmilla • · *·' 35 entsyymeillä on identtinen näennäinen molekyylimassa 38 • · ·.**: kDa SDS-polyakryyliamidigeeleillä, ja ne reagoivat ident-
» » I
tisesti polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa ja monok- 145 105206 lonaalisen vasta-aineen kanssa (katso esimerkki 6.4). Isoelektrisessä fokusoinnissa PGII:lla, joka on A. nidu-lans -transformantin tuottama ja puhdistettu esimerkin 10.2 mukaisesti, esiintyy paljon vähemmän mik- 5 roheterogeenisyyttä kuin entsyymillä, joka on A*. nioerin tuottama, koska päävyöhykkeen (pl 5,2) lisäksi havaitaan vain yksi vähäisempi vyöhyke.
Kummankin entsyymin kineettisiä ominaisuuksia on vertail-10 tu määrittämällä 25°C:ssa 0,075 M natrlumasetaatissa pH
4.2 polygalakturonaasiaktiivisuus vaihdellen polygalak-turonaattipitoisuutta 0,2 ja 1 mg/1 välillä, käyttäen modifioitua ferrisyaniditestiä. A^. nioer PGII:lle Rapida-se'sta VBak. on 2760 U/mg proteiinia Κ,-arvon ollessa 0,8 15 mg/ml polygalakturonaattia (USB). Transformantista peräisin olevalle PGII:lle VBak. -arvo on hieman korkeampi nimittäin 3480 U/mg proteiinia, kun taas KB on identtinen. Lopuksi, A. nidulansin transformantista puhdistettua PGIIrta on käsitelty syanogeenibromidilla esimerkin 1.3 20 mukaisesti (PGII-tapaus). Tämä johtaa identtiseen frag-menttikuvioon kuin mitä havaitaan Rapidase'sta puhdistetulla PGII:lla.
• Il
• I I
• · I
• «Il : : : Esimerkki 11: A. niaer NW756:n paall-aeenin ilmeneminen 25 transformoiduissa A. nicer N593-kannoissa ··· pGW1756:tta (esimerkki 3.10) käytetään A^ nioer N593:n ···· .···. transformointiin, käyttäen pGW635:ttä selektiivisenä ··♦ .···, vektorina (esimerkki 5.2). Kahdeksan sattumanvaraisesti • · « poimittua transformanttia puhdistetaan ja käytetään jat-. 30 koanalyysiin. Niitä kasvatetaan nestemäisessä minimaali- suola-alustassa, johon lisätään ammoniumkloridia (4,0 *·] * g/l), 1 % pektiiniä (d.e. 61,2 %) ja 1 % kuivattua ja ··· jauhettua sokerijuurikasmassaa, käyttäen esimerkissä * · m m 5.5 kuvailtuja olosuhteita. PGII:n liikatuotanto trans- « · · ,· . 35 formanttien viljelmäsuodoksiin osoitetaan Western-blot-
III
tauksella, käyttäen PGII-spesifisiä vasta-aineita. Kaksi • · ’··' PGII:ta liikaa tuottavasta transformantista (N593/pGW- 105206 146 1756-6 ja N593/pGW1756-7) valitaan, ja näitä kantoja ja kontrollikantaa N402 (katso esimerkki 5.5) kasvatetaan jälleen käyttäen edellä kuvailtuja olosuhteita. Viljelmän suodoksia saadaan 44 tunnin kohdalla siirrostuksen jäl-5 keen, ja polygalakturonaasiaktiivisuus raakasuodoksista määritetään kuten on kuvailtu, 2, kun taas entsyymireak-tioseos puskuroidaan pH-arvossa 4,8 käyttäen 50 mM natri-umasetaattia. - 10 Tulokset osoittavat myös, että pqall-geeni p6W1756:ssa on toiminnallinen, ja että tätä plasmidia voidaan käyttää A. niqerin transformointiin polygalakturonaasiaktiivisuuden yli-ilmentämiseksi.
• < ·
| « I
i i i i < · I · 1 • I 1
III
• t · · • · · • · • · • t · ·· • · · • · · • · • · · • 1 1 • · · • · · • · · · I I I • 1 • · « · · • · • « « Il « · · • · « · · 147 105206
Esimerkki 12: PolvgalakturonaasiC;n tuottaminen transformoiduilla A. nidulans -kannoilla
Plasmidia pGW1910, joka sisältää Aj_ nloer N400:n poaC-5 geenin (esimerkki 7.3), käytetään kotransformoivana plas-midina kokeessa, joka on suunniteltu A. nidulans G191:n transformoimiseksi uridiiniprototrofiseksi kuten esimerkissä 9.2 on kuvailtu. Kymmenen tuloksena olevista trans-formanteista puhdistetaan, ja niitä käytetään sen jälkeen 10 itiöiden kasvattamiseen jatkoanalyysiä varten. Näitä kantoja ja G191/pGW635-l:tä kasvatetaan nestemäisessä minimaalisuola-alustassa, joka sisältää lisäksi 2 mg/ml p-aminobentsoaattia, 4,0 g/1 NH4Cl:a typenlähteenä, 1 % sokerijuurikasmassaa ja 1 % pektiiniä hiilenlähteinä, 15 fosfaattia lisättynä korkeassa pitoisuudessa (15 g/1 KH2P04). 106 itiötä/ml siirrostetaan ja inkuboidaan Sodissa Gallenkamp'in pyöriväliikkeisessä ravistelijassa nopeudella 250 rpm. Viljelmän suodoksia saadaan 65 tunnin kohdalla siirrostuksen jälkeen, ja suodokset analysoidaan 20 sen jälkeen puhdistamatta tai väkevöimättä edeltä käsin. Western-blotteja inkuboidaan vasta-aineseoksen kanssa, jotka on tehty PGI:tä ja PGIIrta vastaan (esimerkki 1.2).
• I I
v Aktiivisuusmäärityksiä, 2, suoritetaan 50 mM natriumaset- :T: aattipuskurissa pH 4,8, joka sisältää 0,25 % polygalak- : ’ ·. · 25 turonihappoa (USB).
• I
« « • · ·· .···. Western-blottauksen perusteella useimmat saadut transfor- • · ,··*. mäntit tuottavat suuria määriä polygalakturonaasiC: tä (PGC). Tämä tulos varmistetaan määrittämällä PG-ak-30 tiivisuus transformanttien ja kontrollikannan (A. nidu-lans G191 • f· ' V * transformoituna pGW635:llä) supernatanteista.
♦ ·· • m m · .·". Esimerkki 13: A. nioerln poaA- 1a poaD-aeenien il- « · · / . 35 meneminen transformoiduissa A. nidulans -kannoissa • · * *;,/ poal-. pgall- ja pgaC-oeenien lisäksi A. nidulansin tran- • · sformointiin käytetään muita Aj_ niger -polygalakturonaa- f U. 105206 sigeeniperheen jäseniä (esimerkki 7.2). Tässä esimerkissä käytetään lambda-faagissa olevia klooneja, sen sub-kloonien sijasta plasmidivektorissa.
5 Lambda-faagin DNA:ta valmistetaan maljalysaateista kuten esimerkissä 3.5 on kuvailtu, ja sitä uutetaan sen jälkeen kerran vielä fenolilla ja kloroformilla. Kotransfor-maatiokoetta varten käytetään suunnilleen 20 pg lambda- ’ DNA:ta, ja DNA:ta saadaan suunnilleen yhtä suurina määri-10 nä saman ryhmän kahdesta faagista (esim. lambda-PG-10 yhdessä lambda-PG-A43:n kanssa tai lambda-PG-D8 yhdessä lambda-PG-Dll:n kanssa). A. nidulans G191:n kotransfor-mointi suoritetaan kuten esimerkissä 9.2 on kuvailtu, kun taas kontrollit käsittävät nyt kotransformaatioita pGW-15 1900:11a ja lambda-PGI-7:llä erikseen. Käyttämällä edellä kuvaillulla tavalla valmistettua lambda-faagin DNA:ta, transformaatiofrekvenssit ovat alempia verrattuna plas-midi-DNA:han, joka on puhdistettu vyöhykejaolla keesium-kloridigradienteissa.
20
Asiaan kuuluvia transformantteja puhdistetaan ja analysoidaan kuten esimerkissä 12 on kuvailtu pGW1910-trans-V : formanttien osalta. Tässä tapauksessa transformantteja : kasvatetaan myös alustalla, joka sisältää 3 % glukoosia 25 hiilenlähteenä (korkea fosfaattipitoisuus, 0,1 % hiiva-
• I
·· uutetta, 1 % ammoniumkloridia).
«M· • · · • · • ·
Transformantit A. nidulans G191/lambdaA-l ja G191/lamb- • · i daD-1 on saatu käyttämällä ryhmien PG-A ja vastaavasti . 30 PG-D faageja, jotka edellä on mainittu. Polygalak- turonaasiaktiivisuudet juurikasmassa/pektiinialustan • · · *·[ * viljelmäsuodoksissa 65 tunnin kohdalla siirrostuksen ··· jälkeen olivat merkittävästi korkeampia kuin kontrolli- «·· .***; kannalla G191/pGW635-l. Ryhmien A ja D faageissa läsnä « · · .·. 35 olevat, pqall:n kaltaiset sekvenssit koodittavat siten • · · ’· " proteiineja, joissa on polygalakturonaasiaktiivisuutta.
• · *.··* Western-blottien perusteella otaksutaan, että nämä geeni- U9 105206 tuotteet, polygalakturonaasiA ja vastaavasti polygalak-turonaasiD kulkeutuvat samanlaisesti liikkuen elektroforeesissa kuin PGI.
5 nidulans G191/lambdaA-l tuottaa polygalakturonaasiA:ta myös alustalla, jossa glukoosi on hiilenlähteenä.
Esimerkki 14: Hvbridi-interferonin Ilmeneminen transformoiduissa A. nidulans -kannoissa 10 Kotransformaatiokoetta varten käytetään suunnilleen 20 pg plasmidi-DNA:ta pGII-IFN AM119 tai pGIIss-IFN AM119. A. nidulans G191:n kotransformointi suoritetaan kuten esimerkissä 9.2 on kuvailtu.
15 Merkitykselliset transformantit puhdistetaan ja analysoidaan kuten transformanteille esimerkissä 8.4 on kuvailtu. Tässä tapauksessa transformantteja kasvatetaan myös alustalla, joka sisältää 3 % glukoosia hiilenlähteenä (korkea fosfaattipitoisuus, 0,1 % hiivauutetta, 1 % am-20 moniumkloridia).
Eri ajankohtina (joka 20. tunti) otetaan näytteitä, solut • t · v : pelletoidaan sentrifugoimalla ja rikotaan jäädytyskuiva- : : uksella ja kuivana jauhamisen avulla. Sekä supernatantis- 25 ta että solu-uutteista testataan interferoniaktiivisuus kuten on kuvailtu (edellä). Pääosan interferoniak- ···· .*··. tiivisuudesta havaitaan erittyvän alustaan transforman- teillä, jotka sisältävät pGIIss-IFN AM119 -plasmidin, kun • · · taas transformanteilla, jotka sisältävät plasmidin pGII- 30 IFN AM119, pääasiassa solu-uutteet osoittavat, että A.
mmamm nidulans tuottaa IFN:ää pGII-IFN AM119:sta tai pGIIss-IFN
» · * * **! * AM119:sta, kun glukoosia käytetään ainoana hiilenlähtee- ··· nä.
• * · · • · > · • · .* . 35 Esimerkki 15: Polvoalakturonaasi II:n 1a polvoalak- » i · ’· '· turonaasi I:n maserolntiominaisuuksla (liotusominaisuu- • t · 1" ^‘ — π· ^ '··' ksia) 150 105206
Kurkun kudoksen solujen irtaantumista käytetään A_j_ niqe-rin polygalakturonaasien maseroivan aktiivisuuden määrittämiseksi. Kurkkuhedelmä ostetaan paikallisesta kaupasta, ja pinta dekontaminoidaan sen jälkeen pyyhkimällä kan-5 kaalia, joka on kastettu etanoliin tai upottamalla yhdeksi tunniksi Javel-veteen (kauppalaatu, laimennettu 0,5-%:iseksi natriumhypokloriitin suhteen). Kurkku paloitellaan sen jälkeen ja palojen pehmeä sisäosa poistetaan. 1
Kaksi tuloksena olevista paloista (suunnilleen 12 g) 10 laitetaan 100 ml:n erlenmeyer-pulloon, joka sisältää 25 ml maserointipuskuria, johon polygalakturonaasia oli edeltä käsin lisätty, tai sitten ei. Sen jälkeen in-kuboidaan 24 tuntia kevyesti ravistellen edestakaisin 30°C:seen termostoidussa vesihauteessa. Pulloja tarkastel-15 laan sen jälkeen visuaalisesti. Täydellinen maseraatio täyttää seuraavat kriteerit: (i) kurkkuhedelmän kuori on pääasiallisesti vapaa kiinni tarttuvasta kudoksesta, makroskooppisella tarkastelulla osoitettuna; (ii) mase-rointipuskuri on muuttunut voimakkaan sameaksi; (iii) 20 solujen irtoamisen ja maseraatiopuskurin voimakkaan sameuden välillä vallitsee positiivinen korrelaatio, osoitettuna irrallisten solujen suurena osuutena, jotka näyttä-
• I I
' vät olevan ehjiä, arvosteltuna mikroskooppisen tarkas- ; telun perusteella.
25 ;· Polygalakturonaasi II ja polygalakturonaasi I, jotka on • · · · valmistettu kuten esimerkissä 1 on kuvailtu, testataan • · · .1:·. eri puskureissa. Maseraatiopuskuri A (MBA) on 50 mM nat- riumasetaatti pH 4,8. Maseraatiopuskuri B (MBB) on fos- 30 faatti-sitraatti-puskuri, (Ishii( 1976), Phytopathology
... 66, ss. 281-289). MBB:tä valmistetaan sekoittamalla 0,1 M
• · · *\ 1 sitruunahappo- ja 0,1 M Na2HP04-liuoksia kunnes haluttu tt1i· pH-arvo 4,5 saavutetaan, ja sen jälkeen lisätään yhtä suuri tilavuus tislattua vettä, ja myöhemmin lisätään • · · 35 naudan seerumin albumiinia loppupitoisuuteen 10 mg/25 ml, *..1 käyttää väkevää 10 mg/ml liuosta.
• · • m • · · 151 105206
Kurkun kudos maseroituu täysin 24 tunnissa käytettäessä 1 pg polygalakturonaasi II:ta MBA:ssa. Tässä puskurissa kurkun kudos ei maseroidu polygalakturonaasin puuttuessa, tai jos läsnä on 1 pg polygalakturonaasi I:tä. Kurkun 5 kudoksen maseroituminen MBB:ssä testataan polygalakturonaasin poissa ollessa tai siten, että polygalakturonaasi I:tä tai vastaavasti polygalakturonaasi II:ta on läsnä 10 pg. Taaskaan maseroitumista ei havaita entsyymin puuttuessa eikä polygalakturonaasi I:n läsnä ol-10 lessa, kun taas polygalakturonaasi II maseroi kurkun kudoksen kokonaan. Esimerkin 10 mukaisesti valmistetulla PGII:lla on myös maseroivia ominaisuuksia.
I « I
• I < « t • < : « « · < ···· 999 • · • » • f • · · • · · * « ♦ · · • · · 9 · · · ··· · · · • · · ·· · • · • · ♦ « · • « · • · · • · 1 · · • · • 9 • · · 1 52 105206
Viitejulkaisut: 1. Rombouts, F.M., Cieraeds, Visser J. ja
Pilnik, W. Purification of various pectic enzymes on crosslinked polyuronides in T.C.J. Gribnau, J.
Visser ja R.F.J. Nivard (Eds) Affinity chromatography ja Related Techniques s. 255-260. 1982,
Elsevier, Amsterdam. * 2. Rozie, H., Somers, W., Bonte, A., Visser, J, van't Riet, K. and Rombouts, F.M. (1988) Bio-techn. Appi. Biochem UD, 346-358.
3. Robyt, J.F., Ackerman, R.J. and Keng, J.G.
(1973), Anal. Biochem. 45, 517-524.
4. Matsudarai, P. (1987), J. Biol. Chem. 262,10035-10038.
5. Amons, R. (1987), Vapor-phase modification of sulfhydryl groups in proteins, FEBS Letters 212.
68-72.
6. Maniatis, T., Fritsch, E.F. ja Sambrook, J.,
Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982).
7. Benton, W.D. ja Davis, R.W. (1977), Science 196, 180-182.
* 8. Caruthers, M.H. Chemical ja Enzymatic Synthesis : of Gene Fraglnellts: a laboratory manual, Verlag
Chemie (1982).
t 9. Frischauf, A.M., Lehrach, H., Poustra, A. ja Murray, N. ( 1983 ), J. Mol. Biol. 170, 827-842.
• · *’ 10. Dente, L. ja Cortese, R. (1987), Methods in Enzy- mology, vol. 155 s. 111-119.
t *·**· 11. BRL, Ml3 cloning/dideoxy sequencing instruction • ·· ·,· * manual.
.:. 12. Holms, D.S. ja Quigley, M. (1981), Anal. Biochem "··. Ill, 193.
• · *!* 13. Goosen, T. , Bloemheuvel, G., Gysler, Ch., de Bie, • « ·.*·: v.a. , van den Broek, H.W.J. ja Swart, K. (1987),
Current Genetics H, 499-503.
14. Boeke, J.D., Lacroute, F. ja Fink. G.R. (1984), 153 105206
Acids Res. 9, 309-321 (1981).
31. Renard, C.M.G.C., Voragen, A.G.J., Schols, H.A., Searle-van Leeuwen, M.J.F., Thibault, J.F., Pil-nik, W. , (1989). Apple protopectin: preliminary study of enzymatic extraction. In: J.P. Roozen, F.M. Rombouts, A.G.J. Voragen (eds.): Food Science: Basic Research for Technological Progress. PUDOC, Wageningen, Hollanti.
32. Voragen, A.G.J. (1989): Food enzymes: prospects and limitations. In: J.P. Roozen, F.M. Rombouts, A.G.J. Voragen (eds.): Food Science: Basic Research for Technological Progress. PUDOC, Wageningen, Hollanti.
33. Beldman, G., Rombouts, F.M., Voragen, A.G.J., Pilnik, W. (1984) Enzyme Microb. Technol. 6., 503-507 .
34. Schmitt, J.J, ja Cohen, B.N. (1983) Quantitative Isolation of restriction fragments from low-melting agarose by Elutip-a affinity chromatography. Analytical Biochemistry 133.462-4♦ 35. Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K., ja Pease, L.R. (1989). Engeneering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 22, 61-68.
36. J.H.A.A. Uitzetter (1982). Studies on carbon .·. j metabolism in wild type and mutants of Asperoil- lus nldulans. PhD Thesis, Agricultural University ‘IV.t wageningen, Hollanti.
• · 37. Bowen, G.M., Steinberg J., Laemmli, U.K. ja Wein- • · · ’ traub H. (1980). Nucl. Acids Res £, 1-20.
38. Church, G.M. ja Gilbert, W. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA £1, 1991-1995.
• · · * v · 39. von Heijne, G. (1986), Nucleic Acids Research 14.
4683-4690.
« "··, 40. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E. , Moore, 'V D.D., Smith, J.A., Seidman, J.G. ja Struhl, K.
• · (eds.) (1987), Current Protocols in Molecular • § · • Biology, John Wiley and Sons, New York, Chichcs- 105206
Mol. Gen. Genet 197. 315-346.
15. Rombouts, F.M. ja Pilriik, W. (1980). Pectic Enzymes. In. A.H. Rose (ed.) Microbial Enzymes ja Bioconversion. Economic Microbiology Vol.5. Academic Press, s. 227-282.
16. Ohtsuka, E., Matsuki, S., Ikehara, M. Takahashi, Y. ja Matsubara, K. (1985), J. Biol. Chem. 260.
2605-2608.
17. Pharmacia T7 sequencing TM Kit Instruction Manu- ’ al, s. 1-35.
18. Yelton, M.M., Hamer, J.E. ja Timberlake, W.E.
(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474.
19. Karn, J., Brenner, S., Barneff, L. ja Cesareni, G. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5172-5176.
20. Slater, R.J. (1984): Methods in Molecular Biology vol. 2 Ed. J.M. Walker, The Humana Press Inc.
21. Zissler, J. et al. (1971): The Bacteriophage Lambda, Cold Spring Harbor Labs, New York, A.D.
Hersley toimittaja.
22. Dente, L., Cesareni, G. ja Cortese, R. (1983)
Nucl. Acids Res. H, 1645-1655.
23. Dente, L., Sollazzo, M., Baldari, C., G. Cesareni
• I I
' ja R. Cortese; DNA Cloning vol. 1. a practical V : approach ed. D.M. Glover, IRL Press, Oxford 1985.
« « :.’-i 24. Norrander, J., Kempe, T. ja Messing, J. (1983) •l· Gene 26, 101-106.
···· :***: 25. Boel E., Hansen M.T., Hjort I., Hoegh I., Fiil ··· N.P. (1984), EMBO J. 2, 1581-1585.
26. Mount S.M. (1982), Nucleic Acids Res. IQ, 459- ....: 472.
• · ... 27. Ballance D.J. ja Turner G. (1985), Gene 36, 321- • · · - • · · t \ 331.
28. Birnboim H.C. & Doly J. (1979), Nucleic Acids
Res. 7, 1513-1523.
• · « / . 29. Yanisch-Perron, C., Vieira, J. ja Messing, J.
(1985) Gene 33, s. 103-119.
• · *···’ 30. Messing, J., Crea, R. ja Seeburg, P.H. Nucleic 105206 ter, Brisbane, Toronto, Singapore.
41. Rambosek, J. ja Leach, J. (1987), Recombinant DNA in filamentous fungi: progress and prospects, CRC Critical Reviews in Biotechnology 6, 357-393.
42. Goosen, T., Van Engelenburg, F., Debets, F. , Swart, K., Bos, K., ja van den Broek, H.W.J.
(1989) Mol.Gen. Genet. 213.. 282-288.
43. Shapiro, M.B., ja P. Senapathy (1987) Nucleic Acids Res H, 7155-7171.
44. K.S. Poutanen (1990). Communicated at the 199th ACS Meeting, Boston Mass., April 22-27, 1990; Abstract 90 of the Cellulose, Paper and Textile Division.
Talletetut mikro-organismit:
Seuraavat mikro-organismit ja faagit on talletettu the Deutshce Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen-talletuslaitokseen (DSM), osoite Mascheroder Weg 16, D-3300 Braunschweig, Saksa.
Mikro-organismi: DSM-No.: Talletuspäivä:
Escherichia coli JM109/ 5505 August 30, 1989 V 1 pGW1800 • · « • · « • f ·
Escherichia coli DH5aF'/ 5866 March 21, 1990 m’l· pGW1900 ··· • 9 9 9 999 .T. Escherichia coli DH5aF'/ 5942 May 18, 1990 pGW1756 9 ... Escherichia coli DH5aF'/ 5943 May 18, 1990 • · 9 ’·* * pGW1910 9 999 9 9999
Escherichia coli DH5aF'/ 5944 May 18,1990 : . pGW1911 • «9 • · 9 9 9 9 9 *··' Escherichia coli LE 392 5941 May 18, 1990 156 Λ _ _ _ .
105206
Faagit: kaikki May 18,1990 XPG-A9 5945 XPG-AIO 5951 XPG-A43 5964 APG-B4 5949 λ PG-B3 5 5960 XPG-B36 5961 XPG-Cl 5948 XPG-C16 5954 APG-C20 5956 XPG-C37 5962 λ PG-D8 5947 λ PG-D11 5952 XPG-D12 5953 XPG-E6 5946 XPG-E38 5963 λ PG-F5 5950 λ PG-G17 5955 λ PG-G27 5957 λ PG-X31 5958 XPG-Y33 5959 ι ι ·
• I
« I
a · · • · · • · a a « • · I • · a a a ···* • · · • a • · • · · • ♦f • · a «aa a • a a a a • a · I · I ^ • a «aa M·· • · • a a a a a a a • a a a a a a a a a a a a a a a a a a a iS7 105206
Sekvenssiluettelointi SEP ID NO.1
Sekvenssityyppi: Nukleotidi vastaavan polypeptidin kanssa 5 Sekvenssin pituus: 2495 emäsparia Juosteisuus: kaksinkertainen Topologia: lineaarinen Molekyylityyppi: genominen
Alkuperäinen organismilähde: Aspergillus niaer N400 10 Välitön koelähde: plasmidi pGW1900 (DSM 5866)
Yksityiskohdat: paal-geeni, joka koodittaa Α^_ niqer N400-:n prepro-polygalakturonaasi I:tä 15 1-909: promoottorialue 901-963: PGI:n signaalipeptidin kooditusalue 901-1002: PGI:n prepro-sekvenssin kooditusalue 1003-2127: valmiin PGI:n kooditusalue 1138-1189: introni 20 1610-1671: introni • « i V ' 2138-2130: lopetuskodoni
« · I
V : 2131-2495: 3' koodittamaton alue, osa transkrip- tionaalisesta terminaattorialueesta • i • · « • tl* 25 GAATTCGGAA GAATGTCTGC GTTCGTGCGC ACAACGACGT 40 tcctaaaatt tatccgatga tcaaccgagg aaccagggtc 8o GAACCCCTGA AAGGAATCTC GCCGAAAGGA TCAATCATAT 120 TGATTCGCGG ACCCTGTAAA GTGCCCTAAA GGGTCTTTGC 160 • · CACTCGATAG TGGGATCGGC ACTGGCAGTT TCTAGTCTCG 200 * ♦ ♦ · _ _ \ 30 TCAGTGCGGC CATTTCCGAC CGATCCGTAG TGCTGGTGGG 240 ..li* TGAGTCCCAG AGCAGTCTAT ATCGATATCA TCACCAAATT 280 O CCAAGGACCG TGGGATGACG AGTATGCATT GGCACTGAGA 320 .·! : ATTGCCGAGA TCATGCCCCC GTCCTGGAGG TGCATCCATC 360 • «f ,···[ AAGCATGTTG CGACAGAGTG AAACAGCGTG GATAAGCCGG 4 00 • · "* ATGGGGCAGA TGGGGGAAGA GAGCGAGACA CGGCATCAGC 440 AGTGGAGATG CCGAGAAGTG CCGAGAGCCG CCGATGCTTC 480 158 1 0 5 2 0 6 GACCTTCAGC CCAAGCGTCA ATCCATGCCT TCTTGGGTCA 520 GGGTTGGCCG GACTGTAAGC CCGTTAGCGT CTGAGATACG 560 CCGGATGACA CGAACCTTGG TGCTTACCAA TGCTGTGATG 600 CATGCAGTGC CGGCGGTATC CCTGGCTGAA GCGCCCATCG 640 CCGTTAGAGA TTGATACCCG GGTGGATCGG AGGGTCCCCT 680 TGGTCTTTCC ACCAATAATG GAGGTATCTC ACTGCTTTGT 720 TCAGGAACAG AAGCTTAGCA TGGACCAGTC TTTCACGTAT 760 AAAACTCTCC AGGACTTCCG TCGTTGAGAT GCTCTATCCA 800 ACAACACCTC ACTCTTCCAC TCCTTGTTCT TTCTTTCTGT 840 TGACCAGACC CCATCCATTC TTTTGGCCGA AACCTGTTCT 880 GTTGACCAGA ACCTATACCA ACAATCACC ATG CAC TCT 918
Met His Ser 1 TAC CAG CTT OTT GGC CTG GCC GCT GTC GGC TCC CTC 954
Tyr Gin Leu Leu Gly Leu Ala Ala Val Gly Ser Leu 5 10 15 GTC TCT GCC GCC CCC GCT CCT TCT CGC GTC TCC GAG 990
Val Ser Ala Ala Pro Ala Pro Ser Arg Val Ser Glu 20 25 • I ( « I f • • 1 < • « « ’ TTC GCT AAG AAG GCC TCT ACC TGC ACC TTC ACC TCT 102 6 • ·
Phe Ala Lys Lys Ala Ser Thr Cys Thr Phe Thr Ser - · ..li1 30 35 ··· • · • ··· :T: gcc tct gag gcc agc gag agc atc tcc agc tgc tcc 1022
Ala Ser Glu Ala Ser Glu Ser lie Ser Ser Cys Ser ....Ϊ 40 45 50 • 1 ·· • · · · ,, GAT GTT GTC CTG AGC AGC ATC GAG GTC CCC GCT GGC 1098 9 ...: Asp Val Val Leu Ser Ser lie Glu Val Pro Ala Gly · · :...: 55 60 · • · · · · • · · · · • · • · · 105206 GAG ACC CTC GAC CTG TCC GAT GCT GCT GAT GGC TCC 1134
Glu Thr Leu Asp Leu Ser Asp Ala Ala Asp Gly Ser 65 70 75 ACC GTATGTGCTC TCAGCCGTCT TCCATCCTGG CTATCACGCT 1177 Thr AACACCATCT AG ATC ACC TTC GAG GGC ACC ACT TCC TTC 1216 He Thr Phe Glu Gly Thr Thr Ser Phe 80 85 GGA TAC AAG GAA TGG AAG GGC CCC CTG ATC CGC TTC 1252
Gly Tyr Lys Glu Trp Lys Gly Pro Leu He Arg Phe 90 95 GGT GGT AAG GAT CTG ACT GTC ACC ATG GCC GAC GGC 1288
Gly Gly Lys Asp Leu Thr Val Thr Met Ala Asp Gly 100 105 GCT GTC ATC GAC GGT GAC GGT TCC CGC TGG TGG GAC 1324
Ala Val He Asp Gly Asp Gly Ser Arg Trp Trp Asp ,,, 110 115 120 « · •
III
v : AGC AAG GGT ACC AAC GGT GGC AAG ACC AAG CCC AAG 1360 • « *. Ser Lys Gly Thr Asn Gly Gly Lys Thr Lys Pro Lys 125 130 • · · • · • · • · · TTC ATG TAC ATC CAC GAT GTT GAG GAC TCG ACC TTC 1396 -J. ·
Phe Met Tyr He His Asp Val Glu Asp Ser Thr Phe ....: 135 140 145 • · 9 Φ · · • · · • · · *. AAG GGC ATC AAC ATC AAG AAC ACT CCC GTC CAG GCC 1432 ...: Lys Gly He Asn He Lys Asn Thr Pro Val Gin Ala C.: 150 155 • • · · • · • 1 · · • · • · • · · 160 105206 ATC AGT GTC CAG GCT ACC AAC GTC CAC CTG AAC GAC 1468
Ile Ser Vai Gin Ala Thr Asn Val His Leu Asn Asp 160 165 TTC ACC ATC GAC AAC TCC GAC GGT GAT GAC AAC GGT 1504
Phe Thr He Asp Asn Ser Asp C-ly Asp Asp Asn Gly 170 175 180 GGC CAC AAC ACC GAC GGT TTC GAC ATC AGC GAG TCT 1540
Gly His Asn Thr Asp Gly Phe Asp He Ser Glu Ser 185 190 ACC GGT GTC TAC ATC AGC GGT GCT ACC GTC AAG AAC 1576
Thr Gly Val Tyr He Ser Gly Ala Thr Val Lys Asn 195 200 205 CAG GAC GAC TGC ATT GCC ATC AAC TCT GGC GAG 1609
Gin Asp Asp Cys He Ala He Asn Ser Gly Glu 210 215 GCACGATATC CCTATTCCAC TATCATTCCT TCCATTCATA 1649
I I I
• I I lit TCGCTAACAA TCAAACCCAC AG AGC ATC TCT TTC ACC 168 6 « I « ,·, : Ser He Ser Phe Thr i: 220 ·· · «··· ··· • · *···1 GGC GGT ACC TGC TCC GGT GGC CAC GGT CTC TCC ATC Π22 • ·· *·1 ' Gly Gly Thr Cys Ser Gly Gly His Gly Leu Ser He 225 230 « • · ggc tct gtc ggt ggc cgt gat gac aac acc gtc aag Π58 9 1:, Gly Ser Val Gly Gly Arg Asp Asp Asn Thr Val Lys T.: 235 240 245 • · • · • · · • · • · • · • · t · • · 9 9 M» 161 105206 AAC GTG ACC ATC TCC GAC TCC ACT GTC AGC AAC TCC 1794
Asn Vai Thr Ile Ser Asp Ser Thr Val Ser Asn Ser 250 255 GCC AAC GGT GTC CGC ATC AAG ACC ATC TAC AAG GAG 1830
Ala Asn Gly Val Arg lie Lys Thr lie Tyr Lys Glu 260 265 ACC GGT GAT GTC AGC GAG ATC ACC TAC TCT AAC ATC 1866
Thr Gly Asp Val Ser Glu lie Thr Tyr Ser Asn lie 270 275 280 CAG CTC TCC GGA ATC ACC GAC TAC GGT ATC GTC ATC 1902
Gin Leu Ser Gly lie Thr Asp Tyr Gly lie Val lie 285 290 GAG CAG GAC TAC GAG AAC GGC TCT CCC ACC GGC ACC 1938
Glu Gin Asp Tyr Glu Asn Gly Ser Pro Thr Gly Thr 295 300 305 CCC TCC ACC GGT ATC CCC ATC ACT GAT GTC ACC GTT 1974
Pro Ser Thr Gly lie Pro lie Thr Asp Val Thr Val « · · 310 315
• I I
* « • · · ’’ / GAC GGT GTC ACC GGT ACT CTC GAG GAT GAC GCC ACC 2010 ··· ··1! Asp Gly Val Thr Gly Thr Leu Glu Asp Asp Ala Thr 320 325 «·· • · · • · · ▼ CAG GTC TAC ATT CTC TGC GGT GAC GGC TCT TGC TCT 2046 T” Gin Val Tyr lie Leu Cys Gly Asp Gly Ser Cys Ser 330 335 340 • · · *::: GAC TGG ACC TGG TCC GGT GTT GAC CTC TCT GGT GGC 2082 • ·
Asp Trp Thr Trp Ser Gly Val Asp Leu Ser Gly Gly 345 350 • · · · • · • · • · · '62 105206 AAG ACC AGC GAT AAA TGC GAG AAC GTT CCT TCC GGT 2118
Lys Thr Ser Asp Lys Cys Glu Asn Val Pro Ser Gly 355 360 365 GCT TCT TGC TAA ATCGTTCCTC CGGATGCGAG GCAACGTCTG 2160 Ala Ser Cys 368 TAGGACGTCT GGTTGTATAT ATCGATCCAC ACTTGACATG 2200 TACTAGTTAG GTGGTTTTAC TGCCATAGTG TTAGTGAATA 2240 ATAGGAGCTT TGCTCAATAT GTGAATTTGT AGCAGAAGTA 2280 AATGAGTAGA CTGATAGAGG TAATGATGAA AGATAGAATT 2320 TAATACCAGG TGATGAAGTT AATAACGGGG TGAATTAGGG 2360 CGCGTAGGCT TAGGTATATA AGTTGTCATC CCTCACACTC 2400 GAAATCTCTT CCTCTTTCTT ATATCTTCCA ACCTCTGAAC 2440 CACCAGTTGC CTCCACAGAC TAACAAGATT CTTCTATATC 2480 GATGCTTGAT CTCAA 2495 · a • a a a a * aaa a a a a a a a a a a a a a a a a a a aaa a aaaa aaa a a a a aaa a aa a · a aaa a a a a aaa aaa aaa a a aaa • aaaa aaa a a a a aaa a a a aaa a a a a a aaa a a a a aaa 105206 SEQ ID NO.2
Sekvenssityyppi: Nukleotidi vastaavan polypeptidin kanssa Sekvenssin pituus: 3031 emäsparia 5 Juosteisuus: kaksinkertainen ψ Topologia: lineaarinen
Molekyylityyppi: genorainen
Alkuperäinen organismilähde: Aspergillus niger N400 Välitön koelähde: plasmidi pGWl800 (DSM 5505) 10
Yksityiskohdat: pgall-geeni, joka koodittaa A^_ niger N400:n prepro-polygalakturonaasi II:ta 1-1356: promoottorialue 15 1357-1419: PGII:n signaalipeptidin kooditusalue 1357-1437: PGII:n prepro-sekvenssin kooditusalue 1438-2494: valmiin PGII:n kooditusalue 1987-2038: introni 2495-2497: lopetuskodoni 20 2498-3031: 3' koodittamaton alue, osa transkrip- tionaalisesta terminaattorialueesta TCTAGAAGCA CTTCCCGTGG TGGAGAACAT AACACGCTGG 40 TTAATCTGCT TGACGAACGC GTTGTCTCCA GGTCAGAGCA 80 f < i S·'·' TGACTCCCTC TCAATATAGC TGGCTTCTAC AACCTTGAAA 120 ' . 25 ATAGGGGTAA TGGAGCGAAT CCGGCTAGAA GAGGGTAATG 160 • « · ’’ / AACGGGACAA tatggttcac CTGCCATGAT GGAATAGTGT 200 ”5 GCGCACTGGT GGCTTCCGAT GCACCAGACT CAGACATAAA 240 CCGTTTTGCG CCAGCACTAC TTTGTCCTCC TGCCCCGAGG 280 • · · : AATGAATCCA ATAGGAGGAA TGTCGATATT CGCGCTCGAT 320 30 AGCATCACTC GGATATCGAG AATACCGGGC TGAGGTTGTT 360 ""I GCAGGTGGAA AGATTTGCTC AATCTGTATC GAAAAAACGT 4 00 * :T: AACTTGATGA ATGACCTTTC AACAACTAAC CGCCCCTATC 440 CACTGCTGTG ACCAGTATAG TCCACCGGAT TCGCTCACCG 480 • 1 · ttagccagtg GCTTCCTCCT TTTTCGTCAT CTTTTCCTCT 520 ·...· 35 TCTTGACTGG CCCCACTCCA GGTTGCTTGT TGCCGGCAAG 5 60 · · • · · · • · 9 · • · · 164 1 0 5 2 0 6 CTTTCGACCC TGATTAGCGA GCTTTGCGCA CTATTCCTGA 600 TTTAGCTGTC GAAGGAACGG ATGGACGCTG CGCTAGTTTC 640 ATCTCGAATC TCTGATATTA ACATTGGCTA CAGACTAGCC 680 GATTACGCTC CGGAATCTGG CACACAGGGA GTTTATGGAC 720 CGTTCATTGG TGGAACTAGC AAAGCACCAT AATTGCCGCG 760 GACCCTGCAT TTCAGGCTGC AGCCTTACTA GGATTAGTAT 800 AGCTGTCTTC TCGTACTCGT ACACTGCAGT ACCGGCCTGG 840 AATCTCGGGA TCAACGATGG CATCCGCTTC CTCCAGGACT 880 TACGGCTGCT TGTGAAGGCC AATTATAGTG TTGCTTGTTT 920 ACGTGCCAAT TCAGCGGTAC ATACAAACGC TTCTCTATCT 960 TGCCCTTTTT GACAATAGGT TTACCCTCGG GAGCGGAGCT 1000 TTGCCTTCTT TCCACCGACA TGCGCATCCG TTCCATCACC 1040 CGCGGAACCC GTCGGCTGAT CAGCCACGCA CGGCTGGTAT 1080 AAATTAATCG GCCACTCATG TCGAACTGAG GTTCACGGGA 1120 AAACGCAATA TTTGAGACAA CACCTCAATA TGAAACGAGG 1160 ATCCAGGGTC CTACATTTCC TCCAGGGGCT GTCGGCAGTT J200 ATGAACTTTT CGACCGGAAA AGATTCGCAA TAGTCGTGAG 1240 TATAAGAACC TCGTACCTGC TCACACTGAT GTCTACTTGC 1280 TCATCATTCC ACACTCATTC AAAATCTTAC CAACAACACT 1320 CCTTCTGTCA TTCTTTTCTA TTGTTAACAA TTAATC ATG CAC 1362
Met His 1 • · «
Ml « · · • · « /·. : TCG TTT GCT TCT CTT CTC GCC TAC GGC CTG GTC GCC 1398 Ser Phe Ala Ser Leu Leu Ala Tyr Gly Leu Val Ala • · · 5 o ··· • · • · • · · • ·· V : GGC GCC ACC TTC GCT TCT GCC TCT CCT ATC GAA GCT 1434
Gly Ala Thr Phe Ala Ser Ala Ser Pro He Glu Ala ·:··: 15 20 25 ▼ ··· • · · • · · \§ CGA GAC AGC TGC ACG TTC ACC ACC GCT GCC GCT GCT 14 70
Arg Asp Ser Cys Thr Phe Thr Thr Ala Ala Ala Ala 30 35 • ·
• · I
• · · • · 1 · t • · • · • · · 165 105206 AAA GCG GGC AAG GCG AAA TGC TCT ACT ATC ACC CTT 1506
Lys Ala Gly Lys Ala Lys Cys Ser Thr lie Thr Leu 40 45 50 AAC AAC ATC GAA GTT CCA GCT GGA ACC ACC CTC GAC 1542
Asn Asn Ile Glu Val Pro Ala Gly Thr Thr Leu Asp 55 60 CTG ACC GGT CTC ACC AGC GGT ACC AAG GTC ATC TTC 1578
Leu Thr Gly Leu Thr Ser Gly Thr Lys Val He Phe 65 70 GAG GGC ACC ACG ACC TTC CAG TAC GAA GAA TGG GCA 1614
Glu Gly Thr Thr Thr Phe Gin Tyr Glu Glu Trp Ala 75 80 85 GGC CCC TTG ATC TCC ATG AGT GGC GAA CAT ATC ACC 1650
Gly Pro Leu He Ser Met Ser Gly Glu His He Thr 90 95 GTC ACT GGT GCC TCC GGC CAC CTC ATC AAT TGC GAT 1686
Val Thr Gly Ala Ser Gly His Leu He Asn Cys Asp • · < 100 105 110 • I I « • « ♦ · · GGT GCG CGC TGG TGG GAT GGC AAG GGA ACC AGC GGA 1722 ·· ’III Gly Ala Arg Trp Trp Asp Gly Lys Gly Thr Ser Gly !—! 115 120 • ·· • « · • · · AAG AAG AAG CCC AAG TTC TTT TAC GCC CAT GGC CTT 1758 m *!*" Lys Lys Lys Pro Lys Phe Phe Tyr Ala His Gly Leu 125 130
• •I
"’.I GAC TCC TCG TCT ATT ACT GGA TTA AAC ATC AAA AAC 1794 • · ·*· Asp Ser Ser Ser He Thr Gly Leu Asn He Lys Asn 135 140 145 • ·
Ml • · · ·»· 166 105206 ACC CCC CTT ATG GCG TTT AGT GTC CAG GCG AAT GAC 1830
Thr Pro Leu Met Ala Phe Ser Val Gin Ala Asn Asp 150 155 ATT ACG TTT ACC GAT GTT ACC ATC AAT AAT GCG GAT 1866 lie Thr Phe Thr Asp Val Thr lie Asn Asn Ala Asp 160 165 170 GGC GAC ACC CAG GGT GGA CAC AAC ACT GAT GCG TTC 1902
Gly Asp Thr Gin Gly Gly His Asn Thr Asp Ala Phe 175 180 GAT GTT GGC AAC TCG GTC GGG GTG AAT ATC ATT AAG 1938
Asp Val Gly Asn Ser Val Gly Val Asn lie lie Lys 185 190 CCT TGG GTC CAT AAC CAG GAT GAC TGT CTT GCG GTT 1974
Pro Trp Val His Asn Gin Asp Asp Cys Leu Ala Val 195 200 205 AAC TCT GGC GAG GTAAGCAGCT CTGCATATAT GCTTGATTCG 2016 Asn Ser Gly Glu 210 • I % • < • « · • I · TAATTATATT GATATTCTAT AG AAC ATC TGG TTC ACC GGC 2056 ···
Asn lie Trp Phe Thr Gly *·*·* 215 ♦ · · • · · GGC ACC TGC ATT GGC GGC CAC GGT CTC TCC ATC GGC 2092 ’·**· Gly Thr Cys lie Gly Gly His Gly Leu Ser lie Gly ίΤ: 220 225 * • · « TCT GTC GGC GAC CGC TCC AAC AAC GTC GTC AAG AAC 2128 • · *!' Ser Val Gly Asp Arg Ser Asn Asn Val Val Lys Asn V·: 230 235 240 « · a « · • · ··· 105206 G'TC ACC ATC GAA CAC TCC ACC GTG AGC AAT TCC GAA 2164
Val Thr lie Glu His Ser Thr Val Ser Asn Ser Glu 245 250 AAC GCC GTC CGA ATT AAG ACC ATC TCT GGC GCC ACT 2200
Asn Ala Val Arg lie Lys Thr lie Ser Gly Ala Thr 255 260 GGC TCC GTG TCC GAG ATT ACG TAC TCC AAC ATC GTC 2236
Gly Ser Val Ser Glu lie Thr Tyr Ser Asn lie Val 265 270 275 ATG TCT GGC ATC TCC GAT TAC GGC GTG GTC ATT CAG 2272
Met Ser Gly lie Ser Asp Tyr Gly Val Val lie Gin 280 285 CAG GAT TAC GAA GAC GGC AAG CCT ACG GGT AAG CCG 2308
Gin Asp Tyr Glu Asp Gly Lys Pro Thr Gly Lys Pro 290 295 300 ACG AAC GGT GTC ACT ATT CAG GAT GTT AAG CTG GAG 2344
Thr Asn Gly Val Thr lie Gin Asp Val Lys Leu Glu I.. 305 310 • t · • I · • 9 t • · *· / AGC GTG ACT GGT AGC GTG GAT AGT GGG GCT ACT GAG 2 380 ··· •”j Ser Val Thr Gly Ser Val Asp Ser Gly Ala Thr Glu :...J 315 320 • ·· • · · • · · • ATC TAT CTT CTT TGC GGG TCT GGT AGC TGC TCG GAC 2416 ·:··: He Tyr Leu Leu Cys Gly Ser Gly Ser Cys Ser Asp 325 330 335 • · · TGG ACC TGG GAC GAT GTG AAA GTT ACC GGG GGG AAG 24 52 * · *·;·1 Trp Thr Trp Asp Asp Val Lys Val Thr Gly Gly Lys 340 345 • · • · « · • · • 168 105206 AAG TCC ACC GCT TGC AAG AAC TTC CCT TCG GTG GCC 2488 Lys Ser Thr Ala Cys Lys Asn Phe Pro Ser Val Ala 350 355 360 TCT TGT TAG GCTGCTAGGT TGGTGAGTTG TAGCCCTAGC 2527
Ser Cys 362 TGAAATTCGT CTGCTTCGTC TGCTTCGTCT GCTTCGTCTG 2567 CTTCGTCTGC TTCTTCTGCT TCGTCTGCTT TGTCTGCTTT 2607 GTCTGCTTCG TCCACTTCGT CCACTTCGAC TGGTTAGATG 2647 GGCCTTGTAA TAGTTTTTAG AGAGAACAGA ATATGTACAG 2687 TAAGCCTTAG AGGTGGTACC GAGTTGTATA TTTATTTAAA 2727 ATGTTACCTA TCGCGTGTCT TTATATTTAT AGCCTTTTAC 2767 ATATATACGG AGCTACAGTG GATTATCTTA CAGCCCACAC 2807 TCATCGTGCT GGGAACTACG TGAATGAATG CTCGGTTAGA 2847 AGGCCTTGCT CACTGCCACA ACCAACCAGG AACCTTGGCA 2887 GGTACATGCT TGGGCATTTT TGTCTGGCCC TATCTCTTTC 2927 CAGATGGTGG TCTGGATGAG TCACGGCACG AGTAGATTGA 2967 CCGCTACTCC AACCCGCGCA TAAAGCATAC GCCAGAAGTG 3007 CAAGGGATAC AAGACAGCCA GCTG 3031 »II 9 9 · • f ·
• I
• · I • • · • » · • · · • · 9 • · · • · · · • · · · • · · · ··· • · · • · ·
• -W
m · *·· • · · • · · • v · • · I · • · · • « ♦ · 9 9 9 9 • · • · · « « · • · 1 · · • · • · • · · 169 105206 SEQ ID NO.3
Sekvenssityyppi: Nukleotidi vastaavan polypeptidin kanssa Sekvenssin pituus: 3047 emäsparia 5 Juosteisuus: kaksinkertainen Topologia: lineaarinen Molekyylityyppi: genominen
Alkuperäinen organismilähde Aspergillus niqer NW756 Välitön koelähde: pGW1756 (DSM 59) 10
Yksityiskohdat: pgaII-geeni, joka koodittaa Aj. niqer NW756:n prepro-polygalakturonaasi II:ta 1-889: promoottorialue 15 890-952: PGII:n signaalipeptidin kooditusalue 890-970: PGII:n prepro-sekvenssin oletettu kooditus alue 971-2027: valmiin PGII:n oletettu kooditusalue 1520-1571: introni 20 2028-2030: lopetuskodoni 2031-3047: 3' koodittamaton alue, osa transkrip tionaalisen terminaattorin aluetta CCGGATTTGC TCACCGTTGG CCAATGGCTT CCTCCTTTCC 40 • · · V ·' TGTCTTCTCC TTCCTCTCCT TGACTGGCCC CACTCCAGGT 80 25 : TGCTTATTGC CGGCAAGCTT TCAACCCTGA TTAGCGAGCT 120 TTGCACACTA TTCCCGATGT AGCTGTCGAA GGAACGGATG 160 · ··· GACGCTGCAC TAGTTTCATT TCGAATCTCT GATATTAATA 200 • ·· · .**. CTAACTACAG AGTGACTAGC CGATCACGCT CCGGATCTGG 24 0 • · CACAGAGTGA TTTTTTGAAT CATTCATTGG TGGAATTTGC 280 ' ·.· · 30 AAGGCACCAT AAATGCCGCA GACCCTGCAT ATCGAGCTAC 320 . AGCCTTACTG GGATTAGTAT AGCTGCCATC TCGTACTCGT 360 ACACTGCAGA ACCGGCTTGG ATCCCAAGGC CTACGATGAC 4 00 * ACCCGTTTCC TCCAGGACTG ATGGCTGTTT GTGAAGGCGA 440 ;· __ ATTATAGTAC TGCTTGTCAA TGTCTTGAGT CAGCGGTATA 4 80 · 35 TATGAATCTG TCTTTGTCTT TCCACCTTGA CAATAATGTT 520 • · · ACGCTCAAGA GGGCATTTTG CGTTCTTTTC ATCGACATGC 560 • « '· " GAACCTGTTC GGTCACCCGC GGACCCCGTC GGCTGATCAG 600 • · · • · • « • Il 170 105206 CCACCACGGC TCATATATAT TAGTTGCCCA CCATGTCGAA 640 CTTAAGTTCA TTAAAAAAAA GGTAACATTT GAGACAATAT 680 CTTAATGTGA AACGTGAACC CTGGACTAGC ATCTCTCCAG 720 AGGCTGTCGG CAGTTATGAC TTTCCGATCA GAAGAGATGC 760 GCTGAAATTG TGACTATAAG AACCTCAAGC CTGCCGATGC 800 TGAGGTGAGT TTGCTCATCA TCCTACACTC ATTTGGCATC 840 AGACCGATTA CACTCTTTTT GTCCTTTTTT TCTATCGCTA 880 TCATTGACC ATG CAC TCC TTT GCT TCT CTT CTG GCC 916
Met Ηίε Ser Phe Ala Ser Leu Leu Ala 1 5 TAC GGC CTA GCC GCC AGC GCC ACC CTC GCT TCT GCC 952
Tyr Gly Leu Ala Ala Ser Ala Thr Leu Ala Ser Ala 10 15 20 TCC CCC ATC GAA GCC CGG GGA AGC TGC ACC TTC AAA 988
Ser Pro lie Glu Ala Arg Gly Ser Cys Thr Phe Lys 25 30 ACG GCT GCT GCT GCC AAA GCG GGC AAG GCA GGG TGC 1024
Thr Ala Ala Ala Ala Lys Ala Gly Lys Ala Gly Cys 0": 35 40 45 • If
• · I
• If • TCT ACC ATC ACC CTT GAC AAC ATC GAA GTC CCC GCT 10 60 • · »·· Ser Thr He Thr Leu Asp Asn Ile Glu Val Pro Ala
• ••I
.···. 50 55 • · • · · • ·· • · · * GGA ACC ACC CTC GAC CTG ACC GGT CTC ACC AGC GGT 1096 . Gly Thr Thr Leu Asp Leu Thr Gly Leu Thr Ser Gly 60 65 • ·· • · · · · ·:· ACG AAG GTC ATC TTC GAG GGC ACC ACG ACC TTC GAT 1132
• •M
.**·. Thr Lys Val lie Phe Glu Gly Thr Thr Thr Phe Asp 70 75 80 « · • « 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 105206 TAT GAA GAA TGG GCA GGC CCC TTG ATC TCC ATG AGT 1168 Tyr Glu Glu Trp Ala Gly Pro Leu Ile Ser Met Ser 85 90 GGC AAA GAT ATC ACC GTC ACT GGT GCC TCA GGC CAT 1204
Gly Lys Asp Ile Thr Vai Thr Gly Ala Ser Gly His 95 100 105 CTC ATC AAC TGC GAC GGT GCG CGG TGG TGG GAC GGC 1240
Leu Ile Asn Cys Asp Gly Ala Arg Trp Trp Asp Gly 110 115 AAG GGG ACC AGC GGA AAG AAG AAG CCC AAG TTC TTC 1276
Lys Gly Thr Ser Gly Lys Lys Lys Pro Lys Phe Phe 120 125 TAC GCT CAT GGC CTT GAC TCC TCG TCC ATT ACT GGA 1312
Tyr Ala His Gly Leu Asp Ser Ser Ser Ile Thr Gly 130 135 140 TTG ΑΛΤ ATC AAG AAC ACT CCC CTT ATG GCG TTT AGT 1348
Leu Asn Ile Lys Asn Thr Pro Leu Met Ala Phe Ser
III
: 145 150 « a · • · « GTT CAG GCG GAT GAC ATC ACT CTG ACT GAC ATT ACC 1384 *·· Vai Gin Ala Asp Asp Ile Thr Leu Thr Asp Ile Thr :*·*; 155 160 165 M· • 99 ’ :: : ATC AAC AAC GCG GAC GGT G AT ACC CTG GGT GGA CAC 14 20
Ile Asn Asn Ala Asp Gly Asp Thr Leu Gly Gly His 170 175 • · · 9 9» ·:· AAC ACT GAT GCG TTT GAT GTT GGT AAC TCT GTC GGT 14 56 • * « ·
Asn Thr Asp Ala Phe Asp Vai Gly Asn Ser Vai Gly 180 185 • · · • · · • · « * · • · • ·
• M
172 105206 GTG AAT ATC ATC AAA CCG TGG GTC CAT AAC CAG GAT 1492
Val Asn lie lie Lys Pro Trp Val His Asn Gin Asp 190 195 200 GAG' TGT CTT GCG ATC AAC TCT GGC GAG GTAAGCAGCT 152 9 Asp Cys Leu Ala lie Asn Ser Gly Glu 205 210 TTGAACATAG ATTTGATTTG CATGTATGTT GATATTCTAT AG 1571 AAC ATC TGG TTT ACC AGC GGC ACC TGC ATT GGC GGC 1607
Asn Ile Trp Phe Thr Sei Gly Thr Cys lie Gly Gly 215 220 CAC GGT CTC TCC ATC GGT TCT GTC GGC GGC CGC TCC 1643
His Gly Leu Ser lie Gly Ser Val Gly Gly Arg Ser 225 230 AAC AAC GTT GTC AAG AAC GTC ACT ATC GAA CAC TCC 1679
Asn Asn Val Val Lys Asn Val Thr lie Glu His Ser 235 240 245
• « I
« < · • · 4 ACC GTG AGC AAT TCC GAG AAC GCC GTC CGG ATT AAG 1715
Thr Val Ser Asn Ser Glu Asn Ala Val Arg lie Lys • · .:. 250 255 9 ···« • V · • · • · .·!·. ACC GTC TCT GGT GCC ACT GGT TCC GTG TCT GAG ATC 1751
Thr Val Ser Gly Ala Thr Gly Ser Val Ser Glu lie 260 265 270 « · • · t V : ACA TAC TCC AAC ATT GTC ATG TCC GGC ATC TCC GAT 1787 ··· Thr Tyr Ser Asn lie Val Met Ser Gly lie Ser Asp • 9 « · . 275 280 • 1 • · · • · • · • · · · « · • · • · • · · 173 105206 TAC GGC GTC GTT ATC CAG CAG GAT TAC GAG GAT GGC 1823
Tyr Gly Vai Val lie Gin Gin Asp Tyr Glu Asp Gly 285 290 AAG CCT ACG GGT AAG CCC ACG AAC GGT GTC ACT ATT 1859
Lys Pro Thr Gly Lys Pro Thr Asn Gly Val Thr lie 295 300 305 ACG GAT GTC AAG CTG GAG AGC GTG ACT GGT ACT GTG 1895
Thr Asp Val Lys Leu Glu Ser Val Thr Gly Thr Val 310 315 GAT AGT AAG GCT ACT GAT ATC TAT CTC CTT TGC GGA 1931
Asp Ser Lys Ala Thr Asp lie Tyr Leu Leu Cys Gly 320 325 330 TCT GGT AGC TGC TCG GAC TGG ACT TGG GAC GAT GTG 1967
Ser Gly Ser Cys Ser Asp Trp Thr Trp Asp Asp Val 335 340 AAG GTC ACT GGA GGA AAG AAG TCT ACT GCT TGC AAA 2003
Lys Val Thr Gly Gly Lys Lys Ser Thr Ala Cys Lys 345 350 • « i • « « • · * .·. : AAC TAC CCT TCG GTG GCT TCT TGC TAG GTTAGTAGGT 204 0 • · · • · .:. Asn Tyr Pro Ser Val Ala Ser Cys 355 360 362 • » ··· ··· • · # ·.* * TGTTcgGTTG TAGCACTTGC TAACATGCAT TTGCCTTGAG 2080 GGGTCAAATG GATTTGTGAA ATTATCGGTG TGAAAGAAGA 2120 GATGGTGTCC AGTAAGATTC AGTGGTGGCA GCGTGTATAG 2160 ·«· : CTCTATACAA TGTTATTTAT CGCATAACTC TATATATCAA 2200 * .:. ATACTCGATT AAGAGAACCT GCCTTCAGCC ACAAATAACC 224 0 !··. AAGTTCCTCG GCAGGTATCA GATTCCGGGA ACCCCTACCT 2280 • · AGCCTTACTC CGTTGCAGAT AGTTCTGCTG GTAAATCAGG 2320 • « :.**i ATGGTATGCT GAATTACGAT GCCAGCAAAT TCACCGCTAC 2360 • · · • · • · • « · 105206 TCCAACCCGC GCATAAAACA TACGCCAGAA GTGCAAGGGA 2400 TAAAGACAGC CAGCTGTGTC TTCGCGCAAG TAACTCTGCA 2440 TAATCCAGTT TCTGACATAG TATAGTCATC TCTTCTACAC 2480 CTTGGCAAAC TCCCTCTCCA TAAACTCCCT CACAGTAATA 2520 AGCGTCTCCC TCCCCTTCCC GCCCTTGGCC TTAAACGCCG 2560 CCTTCTTCAA CGCCGCAGCC GTTTGAATCT CCGTAGGCCC 2600 ATTACCAAAG TACTCCCCAT CCCTAAACTG CGAATAAATA 2640 AAAACATCCC GCTCCTGCTC ACGCCAATAC TCCCCTTTCG 2680 TATTCATGTC GTTCGGGTCC GCTAGAACCT CATACCGGGC 2720 TTTCTTGCCA GTCACTATAC CCATCACCGT CAGCATCTAC 2760 TCATCACTCA TCACGTAAAA GATAATGATA AGTAAAACCT 2800 TACCAoAAAC AAACGTATTC ACCACCTCCG CCGATGAAAC 2840 AATATCACTC GACCCCTGAA TCAGCCGTCT ATTCCACCGC 2880 AACGGGTTAA CAAAAACCCC ATGAACCAGA TCCCCAAAGT 2920 CATCCTTCAT ACTGATCCAG GGGAAATCTT CTTTCCCGCC 2960 CCAAAATGGC GTCTTGTATG TTAGATAACC CTCAGAGTCA 3000 GGGAATGTGG GCCATCCGCC GAATAAGTCG GCGTAGTCCG 3040 GCTCGAG 3047 « I a » I a · < a
I I I
a « ( a a I a • a • · · • · · • · • a a • · · · • · · a · • 9 aa· ··· • · · a a a a ^ • · • · · • · · · a • a · a • a 1 a • a 9 9 9 9 9 · • · · • a · • a a a • a • a a a a 175 105206 SEQ ID NO.4
Sekvenssityyppi: Nukleotidi vastaavan polypeptidin kanssa Sekvenssin pituus: 2304 5 Juosteisuus: kaksinkertainen Topologia: lineaarinen Molekyylityyppi: genominen
Alkuperäinen organismilähde: Aspergillus niger N400 Välitön koelähde: pGW1910 (DSM 5943) 10
Yksityiskohdat: pgaC-geeni. joka koodittaa A,, niger N400-:n prepro-polygalakturonaasi C:tä 1-662: promoottorialue 15 663-710: PGC:n signaalipeptidin kooditusalue 663-782: PGC:n prepro-sekvenssin oletettu koodi tusalue 783-1995: valmiin PGC:n oletettu kooditusalue 927-1001: introni 20 1428-1483: introni 1614-1666: introni 1996-1998: lopetuskodoni 1999-2304: 3' koodittamaton alue, osa transkriptio- ... naalisen terminaattorin aluetta « 25 CCATGGCTGA AACTTTGCCC CTGACCTAGT CCATTTCATT 4 0 : TTATATAATG CTGATGAGAT ATGGTTCTTG CACAACTATG 80 f ♦· *.:! CTTTTCCTCG GTCGGTGCGT AATGTATAGT TCGTGGGTGG 120 TAAGGAAATT CACCGACAGC AACTCCCAGC ATAACATGGA 160 * 9 GAAGAACCGA tgaatgagca GCGACAAACA TGGTACCACA 200 ’ · · · 30 ATTCTTGAAT AAGCATTTAG ACTCCGGCTT GGTTTTTTCC 240 GTTGCATTGG CGCTGGTGTT GTTCCTGCGC ACGGTGCAAC 280 CGTTATCTCC ACCAATGATT ACCTGCAGAA AGCCCATGGC 320 :’X: TGCAACCACC CAGCCGACTT GAGTCCACCT AACAGCATAC 3 60 TCAGCATACT CGATGCTGGG AATTACTTCA GGTATGGTCG 4 00 * !···. GCTGAATATG CAGTCGATTT CCGGCGCCAG GAACAGTCCG 440 • · *.** GCCCCCTCAC CACGGACATA GACCCGCCAC CAAAACGTCG 4 80 • « ATAGCGGCCT CGCTTCGTCA ACGACCATTT TGCCCACCCC 520 ·»· • · • · • · · '76 105206 TGACACCCAG GAAAGACGTC TTCCAATAAC AATATAAAAG 5 60 GGCGAGTCTT GTCCTCTCAC TTTCCGTCTT TCGAGTATGC 600 CTTGCCAGTT CCCAACTTGA CTTGAGACCT CCCATTTCGG 640 TCATTTGTCA CCCGCTATAA GA ATG GTC CGT CAG CTT 677
Met Val Arg Gin Leu 1 5 4 ATC CTG ATC AGC AGT CTG CTG GCA GCT GTT GCT GTG 713 lie Leu lie Ser Ser Leu Leu Ala Ala Val Ala Val 10 15 CGC GCG CCT GCC GAT CCG GCT CAT CCC ATG GTT ACG 749
Arg Ala Pro Ala Asp Pro Ala His Pro Met Val Thr 20 25 GAA GCG CCT GAC GTC AAT TTG GTT GAA AAG AGG GCG 785
Glu Ala Pro Asp Val Asn Leu Val Glu Lys Arg Ala 30 35 40 ACT ACT TGC ACC TTC TCG GGC TCC GAA GGT GCA TCC 821
Thr Thr Cys Thr Phe Ser Gly Ser Glu Gly Ala Ser V ' 45 50
I 1 I
AAG GCC AGC AAG TCG AAA ACC TCT TGC TCC ACA ATC 857 • · ·;· Lys Ala Ser Lys Ser Lys Thr Ser Cys Ser Thr lie • · · · 55 60 65 • · a • ·· • · · • · · TAC CTG TCC GAC GTG GCC GTC CCA TCT GGC ACA ACC 8 93
Tyr Leu Ser Asp Val Ala Val Pro Ser Gly Thr Thr 70 75 • · · • · a a ·:· CTT GAT CTC TCT GAC CTG AAT GAT GGA ACC CAC 92 6 • · · ·
Leu Asp Leu Ser Asp Leu Asn Asp Gly Thr His
III
80 85 • · · • a · a a a a a a a a a a a * 177 105206 GTACGTTCCC CGGGTGATTC ATGTCTTATT CTCACACCCA 966 ATCGCGTCAA TAGTACTGGC TGACAGATGT ACTAG GTG ATC TTC 1010
Val lie Phe 90 CAG GGA GAA ACC ACT TTT GGA TAC GAG GAA TGG GAA 104 6
Gin Gly Glu Thr Thr Phe Gly Tyr Glu Glu Trp Glu 95 100 GGG CCT CTT GTG CGT GTT TCT GGA ACT GAT ATC ACG 1052
Gly Pro Leu Val Arg Val Ser Gly Thr Asp lie Thr 105 110 115 GTC GAG GGG GAG AGC GAC GCG GTG CTC AAT GGC GAT 1118
Val Glu Gly Glu Ser Asp Ala Val Leu Asn Gly Asp 120 125 GGC AGC CGC TGG TGG GAT GGA GAG GGT GGC AAT GGT 1154
Gly Ser Arg Trp Trp Asp Gly Glu Gly Gly Asn Gly 130 135 • I I « I « f « 4 «
t 4 I
V 1 GGT AAA ACA AAG CCC AAG TTC TTC TAT GCC CAT GAC 1190 ·.1·· Gly Lys Thr Lys Pro Lys Phe Phe Tyr Ala His Asp *:1 140 145 150 ·♦·· ··♦ • · • · ··· - TTG ACC TCT TCC ACC ATC AAG AGC ATC TAC ATC GAG 1226 • · ·
Leu Thr Ser Ser Thr lie Lys Ser lie Tyr lie Glu t ....: 155 160 • · ··· • · · *\ ' AAC TCT CCT GTG CAG GTG TTC AGC ATC GAT GGC TCC 12 62
Asn Ser Pro Val Gin Val Phe Ser lie Asp Gly Ser 165 170 175 • · · • « • · 9 • t • · · · • · • 1 * · « 178 105206 ACT GAT CTT ACC ATG ACT GAT ATC ACG GTG GAT AAC 1298
Thr Asp Leu Thr Met Thr Asp Ile Thr Val Asp Asn 180 185 ACG GAT GGT GAC ACG GAC GAC CTC GCC GCC AAT ACG 1334
Thr Asp Gly Asp Thr Asp Asp Leu Ala Ala Asn Thr 190 195 GAT GGC TTC GAC ATC GGG GAA AGC ACC TAT ATC ACG 1370
Asp Gly Phe Asp lie Gly Glu Ser Thr Tyr lie Thr 200 205 210 ATC ACA GGT GCC GAA ATC TAC AAC CAA GAT GAC TGC 1406 lie Thr Gly Ala Glu lie Tyr Asn Gin Asp Asp Cys 215 220 GTT GCC ATC AAT TCT GGA GAG GTATGCGTCC CCTGGCACTG 1447 Val Ala lie Asn Ser Gly Glu 225 230 ATTGAGAGGA GAGGCGCCTT GCTGACGAT CTGGTAG AAC 1486
Asn • « I «It
• I I
« < « • It ATT TAT TTC AGT GCC AGT GTG TGT TCT GGT GGT CAC 1522 • · .:. lie Tyr Phe Ser Ala Ser Val Cys Ser Gly Gly His.
235 240 ψ · ··· • ··
III
’1’ ’ GGC CTG TCT ATT GGC TCT GTT GGT GGT CGG GAT GAT 1558
Gly Leu Ser lie Gly Ser Val Gly Gly Arg Asp Asp *Σ1’: 245 250 255 • ·· • · · • · · .:. AAC ACT GTC AAG AAC GTG ACG TTT TAT GAT GTC AAT 1594 • · · · .···, Asn Thr Val Lys Asn Val Thr Phe Tyr Asp Val Asn 260 265 • · • · · • ·· • · M • · • ·
Mf 179 105206 GTT CTC AAG TCC CAG CAA GGTAAGGGAA AGCATTTGAA 1632
Val Leu Lys Ser Gin Gin 270 CCATCCGTTT GCCGTCCTCT AACGTATGCT TTA GCA ATC CGT 1674
Ala lie Arg 275 ATC AAG ACC ATC TAC GGC GAC ACT GGC TCC GTC AGC 1710 lie Lys Thr lie Tyr Gly Asp Thr Gly Ser Val Ser 280 285 GAA GTC ACT TAC CAT GAG ATT GCC TTT TCG GAC GCT 1746
Glu Val Thr Tyr His Glu lie Ala Phe Ser Asp Ala 290 295 300 ACT GAT TAC GGC ATT GTC ATT GAG CAG AAC TAT GAT 1782
Thr Asp Tyr Gly lie Val lie Glu Gin Asn Tyr Asp 305 310 GAC ACC TCC AAG ACC CCT ACT ACC GGG GTA CCG ATC 1818
Asp Thr Ser Lys Thr Pro Thr Thr Gly Val Pro lie 315 320 « · « • « « · < ACG GAT TTT GTG CTC GAG AAC ATC GTT GGA ACG TGT 1854 • · .:. Thr Asp Phe Val Leu Glu Asn lie Val Gly Thr Cys "·♦. 325 330 335 • · ··· m ·· m · · · * GAA GAT GAT GAT TGT ACC GAA GTA TAC ATT GCC TGC 18 90
Glu Asp Asp Asp Cys Thr Glu Val Tyr lie Ala Cys 340 345 ··· • I « • ♦ · GGT GAT GGC AGC TGC TCG GAT TGG ACT TGG ACT GGC 192 6 » .···, Gly Asp Gly Ser Cys Ser Asp Trp Thr Trp Thr Gly ’** 350 355 360 • « • · · t ·» • · «II • · • 9 99 9 180 105206 GTG AGC GTG ACT GGC GGC AGT GTC AGT GAC GAC TGC 1962
Vai Ser Vai Thr Gly Gly Ser Val Ser Asp Asp Cys 365 370 CTT AAT GTT CCC TCC GGG ATT AGC TGC GAT TTG TAG 1998
Leu Asn Val Pro Ser Gly lie Ser Cys Asp Leu 375 380 383 GCCGTTGTGA TTGGGGGAGA TGTTCCCGGG TACTCTGGTC 2038 GTTCGTTTAG CCAGCCCTTT CTGTTGAGTG GCCTGTTCTT 2078 CTATACTGTC GATTGTGTGT GAGATTACTA CCTTGCCCGA 2118 GGAAAGAGCA GTGCATCCTA TCTTTTATTC TTTGCCGGTC 2158 GGGGTTGGCC TACTAGTACA TTGTACCCGA AGAGTCAACG 2198 GTGAAAGTAA AGGGCTTACA GAATTAGTCC AGGAGCAAAG 2238 ACAACTTTTA TCAGAGCGCA TCGGTCACGT CATGTTGAAA 2278 GTATTGATCA ATGAAGATAA CCTTGG 2304 • I · « « a • f < «
• « I
• · «
• I I
• * • a a • aa • · • aa · a aaaa
• · V
• · • a a · · aaa • I · aaa • • a aaa • · · a a a • a · a · · · • a « I · a a • a a • a a a · · a a a a a a a a a a a a aaa

Claims (10)

181 10E206 Patentt ivaat imukset
1. Yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää vektorissa olevan Aspergillus nigerin DNA-insertin tai 5 osan siitä, joka DNA koodittaa galakturonaasi- tai polyga-lakturonaasiaktiivisuutta omaavaa polypeptidiä, ja/tai signaali- tai ohjauspeptidiä ja/tai peptidiä, jolla on promoottori- ja/tai transkription terminaatioaktiivisuutta, joka vektori on jokin seuraavista: 1PG-A9, -AIO, -A43, -B4, 10 -B35, -B36, -Cl, -C16, -C20, -C37, -D8, -Dll, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 tai -Y33, tai pGW1756, pGW1910, pGW1800 tai pGW1900.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli, 15 tunnettu siitä, että se on yhdistelmävektori 1PG-A9, 1PG-A10, 1PG-A43, 1PG-B4, XPG-B35, 1PG-B36, 1PG-C1, 1PG-C16, 1PG-C20, XPG-C37, 1PG-D8, iPG-Dll, 1PG-D12, 1PG-E6, 1PG-E38, 1PG-F5, 1PG-G17, 1PG-G27, 1PG-X31 tai 1PG-Y33, tai pGW1756, pGW1910, pGW1800 tai pGW1900, joilla 20 on talletusnumerot DSM 5945, DSM 5951, DSM 5964, DSM 5949, DSM 5960, DSM 5961, DSM 5948, DSM 5954, DSM 5956, DSM 5962, DSM 5947, DSM 5952, DSM 5953, DSM 5946, DSM 5963, DSM 5950, DSM 5955, DSM 5957, DSM 5958, DSM 5959, DSM 5942, DSM 5943, « I DSM 5505 ja vastaavasti DSM 5866. f .·. : 25 • i • I ,·.
3. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen yhdistel- '!!!_ mä-DNA-molekyylin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että • · * » · • · * · · '·’ * a) eristetään genomista DNA:ta sopivista sienisoluista ja 30 valikoidaan haluttu DNA käyttäen esim. DNA-koetinta, tai • · · ·...* käyttäen sopivaa ekspressiosysteemiä ja seulomalla halutun V « · · polypeptidin ilmentymisen suhteen, tai • · .···. b) eristetään mRNArta sopivista sienisoluista, valikoidaan • · 35 haluttu mRNA, esim. hybridisaation avulla DNA-koettimen • · *.**: kanssa, tai ilmentämällä sopivassa ekspressiosysteemissä ja seulotaan halutun polypeptidin ilmentymisen suhteen, vai- 105206 182 mistetaan mainitulle mRNA:lle komplementaarista yksijuos-teista cDNA:ta, ja siitä sitten kaksijuosteista cDNA:ta, tai 5 c) eristetään cDNAita cDNA-kirjastosta ja valikoidaan haluttu cDNA, esim. käyttäen DNA-koetinta, tai käyttäen sopivaa ekspressiosysteemiä ja seulotaan halutun polypeptidin V ilmentymisen suhteen, tai/ja 10 d) liitetään vaiheiden a), b) tai c) kaksijuosteista DNA:ta sopivaan vektoriin, e) transformoidaan sopivia isäntäsoluja saadulla yhdistel-mävektorilla, 15 f) valikoidaan transformoidut isäntäsolut, jotka sisältävät haluttua DNA:ta transformoitumattomista isäntäsoluista ja kasvatetaan transformoituja isäntäsoluja, ja tarvittaessa, 20 g) eristetään haluttu DNA ja/tai muutetaan DNA sen mutan-tiksi tai fragmentiksi.
4. Transformoitunut Eschericia coli, Aspergillus niger tai • · Aspergillus nidulans -isäntä, tunnettu siitä, että se on .·. : 25 transformoitu patenttivaatimuksen l mukaisella yhdistelmä- * * · DNA-molekyylillä. t
· • · · • * ·“ 5. Menetelmä patenttivaatimuksen 4 mukaisen transformoitu- « · · *·' * neen isännän valmistamiseksi, tunnettu siitä, että sopiva
30 E. coli, A. niger tai A. nidulans -solu käsitellään trans- formoivissa olosuhteissa tämän keksinnön mukaisella yhdis-• · · ^ !φ#>! telmä-DNA-molekyylillä, erityisesti keksinnön mukaisella yhdistelmävektorilla, mahdollisesti yhdessä valintamerkki- • · ...p geenin kanssa, ja mahdollisesti trans formant it valikoidaan. • « 35
• « '·.*·: 6. Menetelmä polypeptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, *:“* että rakennegeeni, joka on liitetty ekspressiokasettiin, 105206 183 joka sisältää vektorissa olevan DNA-insertin tai osan siitä, joka DNA koodittaa galakturonaasi- tai polygalaktu-ronaasiaktiivisuutta omaavaa polypeptidiä, ja/tai signaali-tai ohjauspeptidiä ja/tai peptidiä, jolla on promoottori-5 ja/tai transkription terminaatioaktiivisuutta, joka vektori on jokin seuraavista: 1PG-A9, -AIO, -A43, -B4, -B35, -B36, -Cl, -C16, —C20, -C37, -D8, -Dll, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 tai -Y33, tai pGW1756, pGW1910, pGW1800 tai pGW1900, ilmennetään sopivassa isännässä tavanomaisten 10 menetelmien mukaisesti, ja polypeptidi eristetään mahdollisesti tavanomaisella tavalla.
7. Menetelmä yksittäisen polygalakturonaasin valmistamiseksi, joka on polygalakturonaasi I, polygalakturonaasi II, 15 polygalakturonaasi IIIA, polygalakturonaasi IIIB tai polygalakturonaasi IV, tunnettu siitä, että sellainen polygalakturonaasi puhdistetaan Aspergillus nigeristä saadusta raa'asta entsyymiseoksesta tavanomaisten menetelmien mukaisesti. 20
8. Yksittäinen galakturonaasi tai polygalakturonaasi, jota koodittaa patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tai sen johdannainen, jolla on galakturonaasi- tai polygalakt- • · uronaasiaktiivisuutta, tai sen biologisesti hyväksyttävä .·. : 25 suola. • «· • f ··· ”.Y.'
9. Entsymaattinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsit- • · tää patenttivaatimuksen 8 mukaisen polypeptidin tai jonkin • · · sen seoksen, valinnaisesti ennalta määritettynä yhdistelmä-30 nä yhden tai useamman entsyymin kanssa, jolla on muuta kuin ·«· ·...· polygalakturonaasiaktiivisuutta. ' ·♦· • · • ·
10. Patenttivaatimuksen 8 mukaisen polypeptidin tai patent- • · #·.·. tivaatimuksen 9 mukaisen entsymaattisen koostumuksen käyttö • * *Γ 35 kasviaineksen käsittelemiseksi. « · • ♦ · • · · • · * • · 105206 184
FI904299A 1989-09-02 1990-08-31 Ilmentämisjärjestelmä FI105206B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB898919884A GB8919884D0 (en) 1989-09-02 1989-09-02 Fungal expression system
GB8919884 1989-09-02
GB909013616A GB9013616D0 (en) 1989-09-02 1990-06-19 Fungal expression system
GB9013616 1990-06-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI904299A0 FI904299A0 (fi) 1990-08-31
FI105206B true FI105206B (fi) 2000-06-30

Family

ID=26295856

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI904299A FI105206B (fi) 1989-09-02 1990-08-31 Ilmentämisjärjestelmä

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0421919A3 (fi)
JP (1) JP3576549B2 (fi)
AU (1) AU640405B2 (fi)
CA (1) CA2024487C (fi)
FI (1) FI105206B (fi)
HU (1) HU220337B (fi)
IE (1) IE903180A1 (fi)
IL (1) IL95553A (fi)
NO (1) NO316388B1 (fi)
NZ (1) NZ235115A (fi)
PT (1) PT95171B (fi)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5863783A (en) * 1991-03-27 1999-01-26 Gist-Brocades, N.V. Cloning and expression of DNA molecules encoding arabinan-degrading enzymes of fungal origin
JP2866739B2 (ja) * 1991-12-09 1999-03-08 ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ アスペルギルスエンドキシラナーゼ▲ｉｉ▼遺伝子に由来する発現／分泌調節領域を用い、形質転換したカビでタンパク質を産生して分泌させるための方法
WO1994014952A1 (en) * 1992-12-23 1994-07-07 Novo Nordisk A/S An enzyme with polygalacturonase activity
PL175670B1 (pl) * 1992-12-24 1999-01-29 Gist Brocades Nv Oczyszczona i wyizolowana sekwencja DNA kodująca polipeptyd wykazujący aktywność enzymu poligalakturonazy (PGX) z Aspergillus tubigensis
US5674728A (en) * 1993-11-03 1997-10-07 Novartis Corporation Aspergillus niger vacuolar aspartyl protease
WO1999041386A2 (en) * 1998-02-10 1999-08-19 Dsm N.V. Novel endo-xylogalacturonase
US6602696B1 (en) 1998-09-18 2003-08-05 Dsm N. V. Aspergillus tubigensis polygalacturonase
ATE389715T1 (de) 1999-03-22 2008-04-15 Novozymes As Enzymatisches behandlungsverfahren
EP2379717B1 (en) 2008-12-19 2015-09-02 DuPont Nutrition Biosciences ApS Process for production of an enzyme product
JP2023046320A (ja) * 2021-09-22 2023-04-03 花王株式会社 糖化酵素の製造方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8626879D0 (en) * 1986-11-11 1986-12-10 Ici Plc Dna
GB8702475D0 (en) * 1987-02-04 1987-03-11 Ciba Geigy Ag Expression system
DE3908813A1 (de) * 1989-03-17 1990-09-20 Roehm Gmbh Verfahren zur expression eines aus aspergillus niger stammenden gens in einem aspergillus

Also Published As

Publication number Publication date
EP0421919A3 (en) 1992-04-15
EP0421919A2 (en) 1991-04-10
JPH03224489A (ja) 1991-10-03
NO903812D0 (no) 1990-08-31
NZ235115A (en) 1991-09-25
HUT54735A (en) 1991-03-28
FI904299A0 (fi) 1990-08-31
PT95171A (pt) 1991-06-25
IE903180A1 (en) 1991-03-13
AU6205490A (en) 1991-03-07
CA2024487C (en) 2008-04-29
JP3576549B2 (ja) 2004-10-13
NO316388B1 (no) 2004-01-19
CA2024487A1 (en) 1991-03-03
HU220337B (hu) 2001-12-28
IL95553A (en) 2005-12-18
AU640405B2 (en) 1993-08-26
NO903812L (no) 1991-03-04
PT95171B (pt) 1997-09-30
IL95553A0 (en) 1991-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3228419B2 (ja) セルロースまたはヘミセルロース分解性酵素
US5863759A (en) Process for the production of protein products in aspergillus
US7517668B1 (en) Process for the production of protein products in aspergillus
CA1338400C (en) Recombinant fungal cellulases
US5874558A (en) Nucleic acid encoding a recombinant humicola sp. lipase
MX2011009636A (es) Sistema de producciónj de proteína de chrysosporium lucknowense.
FI105206B (fi) Ilmentämisjärjestelmä
JP2633885B2 (ja) 新規な発現系
Levasseur et al. Homologous expression of the feruloyl esterase B gene from Aspergillus niger and characterization of the recombinant enzyme
CA2395617A1 (en) Trichoderma reesei xylanase
FI119060B (fi) Aspergillus nigerin asparagiinihappoproteaasi
FI104637B (fi) Uudet yhdistelmä-DNA-molekyylit sekä bakteeri- ja sieni-isännät yhdistelmäinterferonien ja pektiinilyaasien tuottamiseksi
FI103206B (fi) Uusi ilmentämisjärjestelmä sieniä varten
US5447862A (en) Pectin lyase genes of aspergillus niger
KR0179653B1 (ko) 진균 발현 시스템
US5922561A (en) Genes encoding signal recognition particle of Aspergillus niger
JP2003529367A (ja) コーヒーマンナーゼ

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: NOVARTIS AG

FG Patent granted

Owner name: NOVARTIS AG