MX2011009636A - Sistema de producciónj de proteína de chrysosporium lucknowense. - Google Patents

Sistema de producciónj de proteína de chrysosporium lucknowense.

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Christine M Pynnonen
T Olson Phillip
Jan Wery
Johannes Heinrich Visser
Mark A Emalfarb
Jacob Visser
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Abstract

La presente invención proporciona un nuevo sistema de producción fúngica que comprende una cepa de huésped fúngico de Chrysosporium Iucknowense en donde la secreción de celulosa endógena es menor a 20% de la secreción de celulosa endógena de la cepa Chrysosporium Iucknowense UV 18-25. Preferentemente, también la secreción de proteasa endógena, ß-glucanasa endógena y celobiohidrolasa endógena es menor a 20% de la secreción de la cepa Chrysosporium Iucknowense UV 18-25. Además, se proporcionan cepas de huésped fúngico en donde diversos genes se han roto. De acuerdo a otro aspecto de la invención, se han descrito un método para la producción homóloga y/o heterologa de una proteína pura con una pureza de más de 75%, comprendiendo la expresión de un gen que codifica dicha proteína en las cepas de acuerdo a la invención. Además, también se ha descrito un método para la producción de mezclas de proteína artificial que comprende expresar un gen que codifica cada una de dichas proteínas en una cepa de acuerdo a la invención. Finalmente, también se proporciona un método para la selección simplificada de cepas que expresan funcionalmente una enzima deseada mediante la aplicación de dichas cepas.

Description

SISTEMA DE PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA DE CHRYSOSPORIÜM LUCKNO ENSE La presente invención se refiere a una cepa de huésped fúngico de Chrysosporium lucknowense . La invención además se refiere a un método para la producción homologa y/o heteróloga de una proteina pura con una pureza de más de 75%, a un método para la producción de mezclas de proteina artificial y a un método para selección simplificada de cepas que expresan funcionalment e una enzima deseada. La invención además se refiere a una secuencia promotora aislada adecuada para el control transcripcional de la expresión genética en Chrysosporium lucknowense y a un método para aislar una cepa de huésped fúngico de Chrysosporium lucknowense en donde la secreción de proteasa es menor a 20% de la secreción de proteasa de la cepa Chrysosporium lucknowense UV 18-25.
Los hongos se han probado ser excelentes huéspedes para la producción de una variedad de enzimas. Las cepas como Aspergí 1 lus , Trichoder a , Penicillium y recientemente el hongo Chrysosporium lucknowense Cl , se han aplicado en la producción industrial de un amplio rango de enzimas. Se han desarrollado las cepas super-productoras que secretan hasta 100 g/L o más de proteina en el caldo de fermentación (ver, por ejemplo, Hans Visser et al., Abstracts, J. of Biotechnology, S211-S241 (2007) . La gran capacidad de secreción de proteina de estos hongos los hace huéspedes preferidos para la producción objetivo de enzimas especificas o mezclas de enzimas. Sin embargo, típicamente, estos huéspedes secretan una mezcla de muchas enzimas diferentes, hacienda indefinido el producto de proteina cruda y produciendo, además de la actividad deseada de la enzima, un rango de actividades no relevantes o aún contra-productivas. Esto también se mantiene verdadero para el uso de tales huéspedes fúngicos para la producción de actividades específicas de la enzima mediante la sobre-expresión de genes seleccionados a través de planteamientos de modificación genética.
También en estos casos la enzima objetivo solamente constituirá una parte menor de la proteina total secretada.
Seria altamente deseable un sistema de producción microbial capaz de secretar altas cantidades de una enzima especifica sin la presencia de altos niveles de otras proteínas. Permitiría la selección simplificada de huéspedes que expresan funcionalmente una enzima deseada. Permitiría la producción de enzima relativamente pura. También permitiría la purificación simplificada a gran escala de la enzima deseada. Estas ventajas contribuirían grandemente a, por ejemplo, fácil generación de mezclas de enzimas artificiales adaptadas para diferentes aplicaciones, por ejemplo, hidrólisis de biomasa de planta (biocombustibles y químicos), terminado textil, aplicaciones en la industria de papel y pulpa.
La producción de enzimas extracelulares específicas relativamente pura a altos niveles por microorganismos que no secretan intrínsecamente altos niveles de proteína sería un planteamiento no preferido. La capacidad de secreción de enzima limitada de tales organismos evitaría la producción de la enzima de interés a alto nivel.
El objeto de la presente invención comprende el aislamiento de mutantes de una cepa fúngica con alta capacidad de secreción que inesperadamente no produce más altos niveles de muchas proteínas no deseadas, mientras mantiene buenas características de crecimiento, y docilidad a modificación genética. Estas cepas mutantes serían capaces de funcionar como un huésped para producción de enzimas específicas a alto nivel.
Para lograr el objeto propuesto de la invención, la invención proporciona una cepa de huésped fúngico de Chrysosporium lucknowense en donde la secreción de celulasa endógena es menor a 20% de la secreción de celulasa endógena de la cepa Chrysosporium lucknowense UV 18-25, preferentemente menor a 15%, más preferentemente menor a 10%, específicamente menor a 5%, más específicamente menor a 2%, más específicamente menor a 1%, aún más específicamente menor a 0.5%, o menor a 0.1%. La cepa Chrysosporium lucknowense UV 18-25 se ha descrito en la solicitud de patente internacional WO 0020555. Preferentemente, la secreción de una o más del grupo consistiendo de proteasa endógena, ß-glucanasa endógena y celobiohidrolasa endógena de la cepa de huésped fúngico de acuerdo a la invención es menor a 20%, más preferentemente menor a 15%, aún más preferentemente menor a 10%, especialmente menor a 5%, más especialmente menor a 1%, aún más especialmente menor a 0.5% o 0.1% de la secreción de proteasa endógena, ß-glucanasa endógena y celobiohidrolasa endógena respectivamente de la cepa Chrysosporium lucknowense UV 18-25. Todos los porcentajes mencionados se aplican a la secreción de proteasa, ß-glucanasa y celobiohidrolasa independientemente .
Preferentemente las cepas de acuerdo a la presente invención se caracterizan además en que la secreción de celobiohidrolasa endógena 1 (Cbhl) está ausente. Aún más preferentemente la cepa de acuerdo a la presente invención es cepa IL, depositada en Centraal Bureau Schimmelcultures (CBS) bajo el no de acceso 122189 o WIL#100.1 depositada en CBS bajo el número de acceso 122190.
Más preferentemente de las cepas de acuerdo a la presente invención el gen que - € -codifica endoqui tinasa 1 [chil) se ha roto. Aún más preferentemente, uno o más de los genes seleccionados del grupo que consiste de aquellos que codifican proteasa alcalina 1 (alpl) , proteasa alcalina 2 (alp2) , proteinasa A (pep4) , glucoamilasa (Glal) , exo-qui tinasa (Chi2) y laminarinasa (Lamí) se han roto. Especialmente, las cepas de acuerdo a la invención son WIL#100. lñalplApyr5 o WIL#100. lAalplAchilApyr5.
La invención también se refiere a un método para la producción homologa y/o heteróloga de una proteina pura con una pureza de más de 75%, preferentemente de más de 80%, más preferentemente de más de 85, 90 o 95%, que comprende expresar un gen que codifica dicha proteina en una cepa de acuerdo a la invención. Especialmente la invención proporciona un método para la producción de mezclas de proteina artificial que comprende expresar genes que codifican cada una de dichas proteínas de la mezcla en una cepa de acuerdo a la invención. En esta manera las mezclas de proteína pueden prepararse para diferentes aplicaciones, por ejemplo, hidrólisis de biomasa de planta (biocombustibles y químicos), terminado textil, aplicaciones en industria de papel y pulpa) . Además la invención proporciona un método para la selección simplificada de cepas que expresan funcionalmente una enzima deseada mediante la aplicación de cepas de acuerdo a la presente invención .
De acuerdo a otro aspecto de la invención se proporciona una secuencia promotora aislada adecuada para el control transcripcional de la expresión genética en Chrysosporium lucknowense , seleccionada del grupo que consiste de a. la promotora chil (0.8) que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 25, b. la promotora chil (1.8) que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 26, c. la promotora hexl que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 27, d. la promotora xyl6 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 28, y, e. la promotora gla que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 29 o una parte t ranscripcionalmente activa de las mi smas .
También se proporcionan por la presente invención un gen quimérico comprendiendo dicha secuencia promotora y un huésped comprendiendo dicha promotora y gen quimérico.
Finalmente se ha proporcionado un método para aislar una cepa de huésped fúngico de Chrysosporium lucknowense en donde la secreción de celulasa y proteasa es menor a 20% de la secreción de celulasa respectivamente proteasa de la cepa Chrysosporium lucknowense UV 18-25, comprendiendo las etapas de (i) colocar Chrysosporium lucknowense en placas de celulosa hinchada ácida (ASC) , ( ii ) seleccionar al menos una colonia que muestra una zona de despeje de celulosa reducida , (iii) colocar la cepa seleccionada en la etapa (ii) en placas de leche descremada, y ( iv ) s e 1 e cci ona r al menos una colonia que muestra una degradación de proteina reducida halo. Preferentemente este método comprende además las etapas de mutagénesis antes de las etapas (i) y/o (iii) .
Si en esta solicitud de patente los huéspedes de patente se definen al comparar el nivel de producción de varias enzimas con la cepa Chrysosporium lucknowense UV 18-25 entonces, por supuesto, la producción de una y la misma enzima en el huésped tiene que compararse con aquella en la cepa Chrysosporium lucknowense UV 18-25.
Las proteínas mencionadas en esta solicitud de patente como por ejemplo proteasa, ß-glucanasa, celobiohidrolasa, proteinasa A, glucoami lasa , exo-qui tinasa y laminarinasa se han definido como se describe en O 2009/0918537 a nombre de Dyadic International INC .
Para enfatizar las ventajas proporcionadas por la presente invención: se refiere al aislamiento de nuevos huéspedes fúngicos que han perdido su capacidad intrínseca para secretar altos niveles de una variedad de proteínas anteriores, mientras mantienen la habilidad de secretar áltos niveles de solamente pocas actividades de enzima. La invención también se refiere al uso de estos huéspedes para producir enzimas especificas a altos niveles sin co-producción de altos niveles de proteínas no específicas. Además la invención se refiere a la generación de mezclas de enzimas artificiales definidas adaptadas para diferentes aplicaciones.
La invención se aclarará ahora por los siguientes ejemplos no limitantes.
Leyendas a las figuras mencionadas: Figura 1: Muestras de medio de UVI8-25, IL tipo silvestre, ID tipo silvestre y los mutantes de proteasa WIL#100.1, ID#50.g y WID#100.b en SDS-PAGE. Estas cepas se cultivan en medio #1 (medio de baja densidad con celulosa) por 282 horas excepto para la vía 8 que es una muestra en medio #2 (alta densidad) . La muestra de medio en la vía 1 fue 2 veces diluida y la muestra de medio en la vía 8 fue 4 veces diluida.
Figura 2: Muestras de medio de cultivo en matraz de agitación de la cepa Cl WIL#100.1 y derivados. Vía 1, WIL#100.1; vía 2, WIL#100. lAchil; vía 3, WI L# 100.1 Aa lp 1 ; vía 4, WIL#100.1AalplAchil.
Figura 3: Vector de clonación Cosmid pAopyrGcosarpl .
Figura 4: Plásmido pCHI4.8. Se muestra el plásmido, que se aisla de clon #5 de E. coli. Este plásmido se utiliza en la construcción de los vectores de expresión genética de cepa blanca.
Figura 5: Sobre-expresión de chil a través de la introducción de copias de gen chil extras en WIL#100.1. Via 1, WlLtlOO.l cepa tipo silvestre (control); vía 3, WIL# 100.1 [ chi+/pyr5 ] # 3 ; via 4, IL#100.1 [chi+/pyr5] #9; via 5, IL# 100.1 [ chi+/pyr5 ] # 1 .
Figura 6: Plásmido Pcbhl -glaA ( I I ) -Tcbhl. Este plásmido se utiliza en la construcción de los vectores de expresión genética de cepa blanca.
Figura 7: El vector de expresión genética pPchi 1 ( 1.8 ) -Tcbhl Notl. , Figura 8: Un mapa esquemático del vector de expresión genética pCRS -pPchi 1 ( í .8 ) -Tcbhl .
Figura 9: Análisis SDS-PAGE de muestras de sobrenadante de cultivo de WIL# 100. LAalplApyr5 (B2), y cepas transformadoras que expresan CL10518 de WIL#100. LAalplApyr5 (B3, B4 ) . La flecha indica la posición CL10518.
Figura 10: Análisis SDS-PAGE de muestras de sobrenadante de cultivo de WIL# 100. LAalplApyr5 (DI), y de cepas transformadoras que expresan cbh2 de IL# 100. LAalplApyr5 (D3-D5) . La flecha indica la posición CBH2.
Figura 11: Análisis SDS-PAGE de muestras de sobrenadante de cultivo de WIL# 100. LAalplAchi lApyr 5 transformadas con pyr5 solamente (C), y de cepas transformadoras que expresan pgx de IL# 100. LAalplAchilApyr 5 (1, 2 ) .
Figura 12: Análisis SDS-PAGE de muestras de sobrenadante de cultivo de WIL#100.L AalplAchi lApyr5 transformadas con xyll (31, 34) y con xyllAcbd. Las flechas indican las bandas de proteina representando las variantes respectivas de xilanasa.
Figura 13: Análisis SDS-PAGE de muestras de sobrenadante de cultivo de WIL# 100. LAalplAchilApyr5 transformadas con med con marcador de selección solamente (71) y con abn2 (68-70) , M, marcador.
Figura 14: Análisis de transformadoras chil. #1, cepa control (transformadas con marcador de selección pyr5 solamente) . M, marcador. #65, transformadora chil. La flecha marca la banda de proteina Chil.
Figura 15: Gel de proteina de Aspergillus niger PGII heteróloga purificada por Cl. M, Proteínas marcadoras. Los pesos moleculares de 3 proteínas marcadoras se indican a la izquierda del gel. Vía 1, PGII puri fi cado .
E emplos Ejemplo 1: Aislamiento de mutantes Cl con actividad de celulasa grandemente reducida (cepas blancas) .
Cepa Cl UV18-25 (descrita en WO/2000/020555) se muta utilizando luz UV para producir la cepa UV26-2 (Apéndice 1 para los Ejemplos) . UV26-2 mostró grandes zonas de despeje en placas ASC (celulosa hinchada ácida), indicando la sobreproducción de celulasa .
UV26-2 no fue un mutante estable y marcado sucesivo de UV26-2 resultó en la generación de mutantes negativos de celulasa como se muestra por la ausencia de zonas de despeje en placas ASC. Estas colonias mostraron esporulación mejorada y color blanco, mientras las colonias normales, que producen celulasa, fueron de color crema y no mostraron esporulación en placas ASC.
Dos colonias blancas (UV26-2W1 y UV26-2W2) se recogieron de placas ASC junto con dos colonias normales y la producción de celulasa se evalúa utilizando un procedimiento de selección en matraz de agitación. Las colonias blancas produjeron 6 y 4 U/ml de actividad de celulasa AzoCMC, mientras las dos colonias normales produjeron 278 y 294 U/ml de actividad de celulasa. Esto confirmó que las colonias blancas son mutantes negativos de celulasa.
Ejemplo 2: Aislamiento y análisis de cepas deficientes de proteasa de UV26-2WIL y ÜV26-2WID .
La purificación de la cepa UV26-2 1 en placas de medio RM-ASP (Apéndice 2 para los Ejemplos) resultó en la identificación de 2 tipos de colonias: colonias con esporas de color claro como UV18-25 (UV26-2 IL indicada además como la cepa WIL) , y colonias con esporas de color oscuro (rosa) (UV26-2 ID indicada además como cepa WID) .
En experimentos adicionales los grupos de esporas de tanto WIL como WID se irradian con UV (Apéndice 1 para los Ejemplos) y se utilizan en un procedimiento de selección directa para mutantes deficientes de proteasa (Braaksma et al., 2008) . Los clones positivos se analizan en placas de leche descremada para su actividad de proteasa.
Después de varias vueltas de purificación y selección en placas de leche descremada, dos mutantes de WIL (WIL#50.c y WIL#100.1) y tres mutantes de WID (WID#50.g, WID#50.n y"WID#100.b) con un halo reducido en placas de leche descremada se seleccionan para cultivo para ensayos de degradación in vitro. En un primer experimento de cultivo estos mutantes y sus cepas de origen se cultivan en medio #2 Apéndice 1 para los Ejemplos) por 240 horas a 35°C. Aparentemente, la baja actividad de celulasa en estas cepas no permitió el crecimiento en medio a base de alta densidad de celulosa. En los siguientes experimentos de cultivo IL#50.c, WIL#100.1, ID#50.g y WID#100.b y sus orígenes se desarrollaron en medio de celulosa a baja (#1) y alta (#2) densidad por 240 horas a 35°C. También UV18-25 se toma como un control. Las cepas de origen 2W1D, 2WIL y UV18-25 también se cultivaron en medio #2. Ninguna de las cepas WIL o ID creció en medio de celulosa de alta densidad #2. En medio #1 podría observarse buen crecimiento para las cepas blancas y sus mutantes deficientes en proteasa, aunque la celulosa en el medio se utilizó duramente por las cepas 'blancas' . De manera inesperada, se observó que la cepa de origen UV26-2WID, que mostró un fenotipo de crecimiento inestable en placas ágar, no utilizó la celulosa en el medio.
Las muestras de medio de la cepa de origen WIL mostraron menos actividad de proteasa en placas de leche descremada en comparación con muestras de medio de cepa de origen WID y UV18-25 (Tabla 1) . Esto es contrario a lo que se observa cuando las cepas se desarrollaron directamente en placas de leche descremada. En ese caso un gran halo podría detectarse alrededor de la colonia de UV 18-25 y WIL después de 72 horas de crecimiento a 30°C, mientras un halo pequeño solamente podría detectarse después de 144 horas para WID. Las muestras de medio de mutante de proteasa WID#50.g mostraron un halo más pequeño en placas de leche hasta 162 horas de cultivo. Después de 186 horas de cultivo, halos fueron similares, como se observa para su cepa de origen.
Tabla 1: Análisis de medio de cepas de origen WIL y WID y sus mutantes de proteasa seleccionados WILilOO.1, WID#50. g y WlDilOO . b UV18-25 se toman como control Las actividades de proteasa de muestras de medio de WIL, WILilOO.1 y WILilOO . lAalpl también se determinan Estas cepas se cultivan en medio il (baja celulosa /lactosa /Pharmamedia ) El pH se mide y él medio se coloca en placas de leche descremada para determinar su actividad de proteasa El tamaño relativo del halo es una medida para la actividad de proteasa en el medio.. nd, no determinado .
El análisis de muestras de medio de 282 horas de estas cepas en geles SDS-PAGE mostró que las 'cepas blancas' produjeron mucho menos proteina que UV18-25 (Fig. 1) . En particular las dos proteínas 50/70 kDa principales (Cbhl) estuvieron ausentes en estos sobrenadantes de cultivo. En las cepas blancas las proteínas 'principales' son 75 y 45 kDa. Estas proteínas están presentes en medio de UV18-25 como proteínas menores.
A partir de esta primer selección de mutantes con menos proteasa en un UV26-2 1 anterior, las cepas lD#50.g y WIL#100.1 se seleccionan para análisis adicional.
Ejemplo 3; Comparación de actividades de enzima extracelular entre UV18-25 y WI L# 100.1.
Se determinaron diferentes actividades de enzima en el contenido de proteína extracelular de UV18-25 y muestras WIL#100.1 (Tabla 2) . En base a estos datos se concluye que WIL#100.1 segrega muy poca actividad específica de celulasa (menor a 1% de UV18-25) y tuvo muy poca o nada de actividad de proteasa detectable cuando se compara con UV18-25.
Acti vidades UV18-25 WILilOO .1 CMCa s e 6.20 0.04 /cel ulasa) Beta -glucanasa 10.2 0.53 Celobiohidrolasa 0.72 0.09 Proteasa (pH 5) 0.06 0.03 Proteasa (pH 7) 0.05 0.00 Proteasa (pH 9) 0.04 0.00 Tabla. 2: Actividades específicas de muestras (U/mg de proteínas) . Actividades de proteasa se miden en 3 diferentes valores de pH Además, los niveles de hidrolasas que llevan otras especificidades de substrato (por ejemplo, hemi-celulosa) también se reducen.
Ejemplo 4: Reducción adicional del nivel de prot eina : identificación de proteínas principales .
Como se describe arriba, la cepa blanca carece de espectro de enzima celulolítica extracelular cuando se compara con su cepa de origen. Por lo tanto, el contenido de proteína extracelular en cultivos de cepa blanca, según se analiza por SDS-PAGE, es bajo. Esta cepa característica es benéfica con respecto a la producción y purificación de proteína, ya que la cantidad relativa de cualquier proteína objetivo expresada en tal cepa será alta. Además, la (casi) ausencia de actividad de celulasa hace a la cepa blanca una cepa huésped ideal para probar nuevas celulasas o modificadas. Lo mismo es válido para xilanasas ya que no fue detectable ninguna actividad de xilanasa principal.
Para reducir además el nivel anterior de proteína, se cortaron varias bandas de proteína principal presentes en un gel SDS-PAGE de WIL#100.1 y cultivos de cepa derivados y se identificaron por secuenciación con terminal N y/o análisis MS- S. La proteína más abundante fue la endoqui t inasa Chil ( ident i f i cador de gen: CL06081, péptidos MVYDYAG, MPIYGRS, y MFXEASA) . Otras proteínas principales se identificaron como glucoamilasa (Glal, CL09507, péptidos TGGWSVVWPVLK (SEQ ID No 1) y VVGSSSEL ( I ) GNWDTGR ( SEQ ID NO 2) ) , exo-quitinasa (Chi2, CL00367, péptidos TIDAMAWSK (SEQ ID No 3), NFLPVADILR (SEQ ID No 4) , GAYHPSQ YS PEDVEK (SEQ ID NO 5) , y SWQLVYQHDPTAGLTAEEAK (SEQ ID No 6) y una laminarinasa (Lamí, CL08253, péptidos PQYESAGSVVPSSFLSVR (SEQ ID No 7) y VSGQVELTDFLVSTQGR (SEQ ID No 8) . También; una proteasa alcalina Alpl (CL04253) se ha identificado en caldo de cultivo WIL#1Ó0.1.
Alpl degrada proteínas ext racelulares , y puede degradar proteínas de interés.
Ejemplo 5: Reducción adicional del nivel de proteína: interrupción de los genes chil, chi2, glal y lamí.
El vector pChi3-4 (ver Ejemplo 9, Aislamiento del gen que codifica endoqui tinasa 1) se utiliza para la construcción del vector de interrupción de gen. Un fragmento Mscl/Stul de l.l-kb se reemplaza con el marcador de selección amdS- rep o el marcador de selección pyr5-rep, resultando en los vectores pAchil-amdS y p chil-pyr5, respectivamente. El fragmento de interrupción Achi 1- amdS se aisla de pAchil-amdS por digestión con EcoRI . El fragmento de interrupción chil-pyr5 se aisla de p chil-pyr5 por digestión con Smal. La transformación de la cepa WIL#100.1 Apyr5#172-12 utilizando los fragmentos de interrupción resultó en 215 transformadoras &chil-pyr5 y 32 transformadoras chil- amdS . Todas las transformadoras obtenidas se purifican y analizan con hibridización de colonia. El análisis Southern de estas transformadoras confirmó el aislamiento de una transformadora WIL#100.1 con un gen chi interrumpido (WIL#100.1 Apyr5Achil-pyr5iA6 (pyr5+) ) .
Los cultivos del matraz de agitación en medio de cultivo de baja densidad Cl se desarrollaron de una selección de cepas mutantes WIL#100. lApyr5Achil . Las muestras se analizan en SDS-PAGE para evaluar los perfiles de proteina por ausencia de proteina Chil (Fig. 2, via 2 versus vía 1) . Como se muestra ninguna proteina Chil de 45 kDa se observa en la cepa mutante Achil.
Las proteínas extracelulares más prominentes restantes en cepa blanca WI L# 100. lAalplAchi 1 y las cepas derivadas corresponden a glucoamilasa (Glal) , exo-quitinasa (Chi2) y laminarinasa (Lamí) . Estas enzimas se purifican del medio de cultivo. Las actividades enzimáticas de estas proteínas se verifican utilizando (entre otros) almidón, quitosano y laminar ina , respectivamente, ' como substratos. Además, los datos de análisis de espectrometría de masa (ver Ejemplo 4) combinados con datos de secuencia de genoma Cl revelaron los genes correspondientes. Para reducir además el antecedente de proteína ext race lula r , los genes que codifican Glal, Chi2, y Lamí se interrumpen y de esta manera se inactivan. La interrupción se basa en el intercambio del promotor genético y parte de la secuencia de codificación 5' por un marcador de selección amdS a través de recombinación homologa utilizando aproximadamente 1.5 kbp secuencias corriente arriba y corriente abajo que flanquean este promotor genético y parte de la secuencia de codificación 5' . Los vectores de interrupción genética por lo tanto contuvieron el cásete de expresión amdS más estas secuencias genéticas homologas de 1.5 kb de flanqueo. Las cepas blancas WIL# 100. l alplAchil y cepas derivadas se transformaron con los vectores de interrupción genética glal, chi2 y lamí y transformadoras se selecciona por el genotipo correcto utilizando PCR. Como tales, se obtienen las cepas blancas con una composición/contenido de proteina extracelular reducida adicional. Las proteínas objetivo producidas por estas cepas fueron más de 80% puras en el líquido de cultivo libre de célula cruda .
Ejemplo 6: Reducción adicional de actividad de proteasa: interrupción objetivo de genes que codifican proteasas.
En general, los genes que codifican proteasa se interrumpen utilizando fragmentos de ADN de interrupción que contuvieron marcadores de selección [amdS, pyr4 o pyr 5) flanqueados por aproximadamente fragmentos de ADN grandes de 1.5 kb homólogos a regiones aguas arriba y aguas abajo del gen a interrumpirse. En la introducción de estos fragmentos de ADN de interrupción en el huésped blanco, una recombinación homologa intercambio el gen a interrumpirse por el fragmento de marcador de selección. Las transformadoras correspondientes se seleccionan como tal. Los genes que se interrumpen de esta manera ya sea codifican actividades de proteasa des entajosas (con respecto a la estabilidad de proteina objetivo), por ejemplo, alpl, alp2, pep4) o proteina anterior significativa (chil) o se utilizaron como marcador de selección (pyr4, pyr5 ) . A través de este planteamiento se han construido numerosas cepas blancas Cl que pueden utilizarse como huéspedes para expresión de proteina objetivo (Tabla 3) .
Ejemplo 7; Identificación de promotores Fuertes para expresión genética: gen que codifica quitinasa [chil) .
Varias bandas de proteina principales se aislan de muestras de fermentación de WIL#100.1 desarrolladas en medio de celulosa de baja densidad para identificar y aislar promotores fuertes que pueden utilizarse para expresión genética en la cepa WIL y sus derivados. La secuenciacion de terminal ,N de una mezcla de péptidos obtenidos después del tratamiento CNBr de la proteina de WIL#100W1 de 45 kDa principal resultó en la identificación de cuatro péptidos diferentes. Tres de estos péptidos (MVYAG, MPIYGRS y MFXEASA) mostraron homología con una endoquit inasa de Aphanocladium álbum/ Trichoderma harzianum (CHI_APHAL P32470) .
En base a estas secuencias de péptido, los cebadores se diseñan para obtener fragmentos PCR que contienen una parte de gen que codifica endoquit inasa (Tabla 4) . Los cebadores PCR se diseñan en base al uso del codón preferido de Cl.
Tabla 4: Los cebadores diseñados de endoquitinasa putativa en base al uso de codón de Cl .
Las reacciones PCR con estos cebadores se llevan a cabo utilizando 7ADN cromosómico de UV18-25 como ADN templado. Los fragmentos PCR se clonan y el análisis de secuencia mostró que uno de los fragmentos PCR clonados obtenido con Endochitpeplc y Endochitpep2 reve (173 bp) contuvieron una parte de un gen que codifica endoquit inasa {chil) . El análisis de hibr idi zación de ADN cromosómico de UV18-25 BamHl y HindIII digerido con este fragmento chil como sonda mostró una señal de hibridización clara que confirma que el fragmento PCR se originó de ADN Cl. Este fragmento se utiliza para clonar el gen complete de la biblioteca de gen de cósmido Cl en orden. La secuencia de fragmento (SEQ ID No 18) fue como : ATGGGCTACGACTACGCCGGCTCGTGGAGCACCGCGGCGGGACACCA GGCCAACCTGTACCCGACCGCCGACGCGGGCAGGACGCCCTTCTCGA CCGACAAGGCCCTGTCCGACTACG CGCCGCCGGCG CGACCCGGCC AAGATCGTGCTCGGCATGCCCATCTACGGCCG Ejemplo 8: Construcción de una biblioteca de cósmidos ordenada de Chrysosporium lucknowense UV18-25 en E. coli.
Para la construcción de la biblioteca de cósmidos Cl, se utiliza el vector de clonación de cósmido no comercial, pAOpyrGcosarpl (Fig. 3) . Este vector lleva el marcador de selección pyrG de Aspergillus oryzae permitiendo la transformación dé un amplio rango de cepas fúngicas. Además, para la transformación altamente eficiente de varias especies Aspergillus (para las cuales está disponible una gran colección de cepas mutantes para clonación de complementacíón del gen Cl correspondiente) el replicador AMA1 está presente en este vector. Un sitio de clonación único BamHl permite la clonación de A.DN genómico parcialmente digerido Sau3A de cepa ÜV18-25 Chrysosporium.
Una biblioteca de cósmidos de UV18-25 se construye en E. coli y se almacenó como reservas de glicerol en -80 C. El tamaño de inserción promedio fue 20-35 kb . En total, 6800 clones se obtienen, que se representan una cobertura de genoma de aproximadamente 5 veces. Para ordenar estos clones en las placas de 384 cavidades, las diluciones de las reservas de glicerol se colocan en placas en placas LB-agar, que contienen ampicilina, 7680 colonias individuales se recogen manualmente e inoculan en veinte placas de 384 cavidades. Estas veinte placas de 384 cavidades representan la biblioteca de cósmidos ordenados de UV18-25 en E . coli.
Las colonias individuales en las veinte placas de 384 cavidades se colocan en filtros de nylon (Hybond), utilizando una placa de 384 Staccato (Zymarks) . La biblioteca de cósmidos ordenados se colocan por octuplicato (en total 160 filtros) . Estos filtros se colocan en placas de medio de LB-ampicilina y se incuban a 37 °C para permitir que las colonias se desarrollen en filtros. De manera subsiguiente, las colonias se lisan y el ADN cósmido se une a los filtros utilizando procedimientos estándar.
Ejemplo 9: Aislamiento del gen que codifica endoquit inasa 1 (chil) .
El fragmento PCR chil 173-bp se utiliza como una sonda marcada radioactiva para hibridi zación de filtros duplicados de la biblioteca de cósmidos. La hibridi zación de la biblioteca genética del cósmido utilizando este fragmento chil resultó en 3 clones positivos. El ADN se aisla de estos clones y el análisis de restricción seguido por análisis Southern se llevó a cabo. Un fragmento HindIII 4.8 kb y un fragmento BglII 3.4 kb mostró hibridi zación utilizando la sonda chil. Los fragmentos HindIII 4.8 kb y BglII 3.4 kb conteniendo el gen chil se aislan y subclonan en pMTL24, resultando en los vectores pCHI4.8 (Fig. 4) y pChi3-4, respectivamente. De manera subsiguiente, se utiliza un subclon BglII para análisis de secuencia para obtener más datos de secuencia. La secuencia del gen chil completa de UV18-25 se obtiene. El tamaño del gen chil es 1529bp en el cual están presentes 2 intrones de lllbp y 138bp.
Ejemplo 10: Sobreexpresión de la endoqui tinasa en WIL#100.1.
Para la sobreexpresión de endoqui tinasa el fragmento BglII 3. kb conteniendo el gen chil se aisla de pChi3-4. Las cepas de múltiples copias chil putativas en IL# 100. lApyr5 se generan por co- t ransformación del fragmento chil BglII 3.4 kb y un fragmento de selección pyr y transformadoras correctas se confirman por hibidri zación de colonia. Los cultivos del matraz de agitación en medio de baja densidad Cl se realizan de una selección de cepas de múltiples copias WIL#100.1. Las muestras se analizan en SDS-PAGE para evaluar los perfiles de proteina para la sobreproducción de Chil (Fig. 5) . Tres de las cepas chil de múltiples copias (vias 3, 4, 5) muestran una banda 45 kDa más fuerte en comparación con la cepa de origen (vía 1) indicando la sobreexpresión de quitinasa y la utilidad de la promotora chil para alta expresión genética.
Por lo tanto, se construye un vector de clonación de expresión Cl general ( pPchi 1 ( 0.8 ) -Tcbhl Notl) conteniendo la promotora chi (Rchi) para dirigir la sobreexpresión de los genes clonados. Inicialmente , el sitio EcoRI aguas arriba op Pchi en Pchi#4.8 se remueve por una digestión EcoRI parcial y tratamiento del fragmento lineal con Klenow produciendo pChi 1# 4.8AEcoRI . A partir de este vector el fragmento Sacl-Sphl 1.9 kb se clona en el sitio correspondiente de pPcbhl-glaA ( 11 ) - Tcbhl (Fig. 6) . En el vector resultante, pP c i -T cbh 1 NotI#l , los genes objetivo puede insertarse en los sitios NcoI-EcoRI. Los casetes de expresión para la transformación en cepas Cl pueden aislarse de estas construcciones como fragmentos Notl.
La secuencia promotora chil 0.8 kb en pCHI#4.8 podría ser más que suficiente para accionar la expresión chil. Sin embargo, una promotora chil más larga también se generó al amplificar el fragmento PstI-HindIII (aguas rriba del sitio HindIII en la posición 775 relativa al codón de inicio ATG) , utilizando uno del clon de cósmido positivo previamente identificado como ADN templado. El fragmento resultante se clona en pGEM-T-Easy y se secuencia. A partir de este plásmido, el fragmento Ps tl-Hindl I I se aisla y clona en los sitios correspondientes de pPchi 1-xyll-Tcbhl produciendo pPchi 1 ( 1.8 ) -xyl I -Tcbhl , en los cuales el tamaño de la promotora es 1.8 kb . El fragmento también se clona en el sitio correspondiente de pPchil-Tc£>hl NotI#7.1, produciendo el vector de expresión general pPchil ( 1.8 ) -Tcbhl Notl (Fig. 7) .
Los niveles de expresión genética dirigidos por la promotora de quitinasa extendida (Pchil (1.8) ) y por la promotora de quitinasa inicialmente utilizada (Pchil (0.8)) se comparan por la expresión de dos genes reporteros, xyll y alpl. Las transformadoras de cepa blanca se generan, ya sea se expresan xyll (que codifican una xilanasa) o alpl (que codifican una proteasa alcalina) (Tabla 5) .
Reportera Actividad de Actividad de la reportera la reportera Pchil 0.8 kb Pchil 1.8 kb Alpl (R19) 0.7 (A) 1.9 (B) Xyll (R14) 122 (C) 1175 (D) Tabla 5: Comparación de las promotoras Pchi extendidas en términos del nivel de expresión de proteína reportera. La actividad de la, actividad de xilanasa se expresa como U/ml y la a ct ividad de proteasa alcalina como U/mg de proteína A = WIL#100.1 [Pchi 1 ( 0 , 8) -a lpl /pyr5] # 9 , B = WIL#100.1 [Pchil (1,8) -alpl/pyr5] #22, C WIL#100. lAalpl [ chil-xyll] #95 , D WIL#100. lAalpl [Pchil (1.8) -xyll ] #47 De manera sorprendente, la expresión genética reportera fue más alta en caso de la promotora chil extendida (1.8 kb ) , que indica la necesidad de las regiones aguas arriba adicionales. En conclusión, el sistema de expresión a base de Pchil se desarrolla para expresión de alto nivel de genes en las cepas Cl blancas .
Ejemplo 11: Identificación de otras promotoras Fuertes para expresión genética.
Un planteamiento diferente para buscar promotoras fuertes se realiza utilizando la detección cuantitativa de los niveles de ARN mensajero de WIL o WIL#100.1 ARN. Las muestras de ARN se aislan de micelio del cual se toman muestras en diferentes puntos en el tiempo durante un proceso de fermentación de lote alimentado. Un número de genes se identifican como siendo fuertemente expresados. Para verificar el nivel de expresión de estos genes, las muestras de ARN también se separan en gel, transfieren e hibridan a sondas especificas para estos genes (Tabla 6) .
Tabla 6: Cuantificación de las señales de exprés ión de los diferentes genes en fermentaciones de lote alimentado controladas . Las señales de h ibridi za ción de sonda se cuantifican utilizando un densitómetro . La señal de la sonda en Northern blot se correlaciona con la señal de esta sonda en un Southern blot de ADN genómico Cl . Por lo tanto, los valores en la tabla representan el nivel de señal de hibridización northern relativo al nivel de señal de hibridización del Southern blot (que se fijó en I). Las secuencias de gen se dan abajo.
La promotora cbhl, que es una promotora fuerte en cepas UV 18.25, no está activa en las cepas blancas. La promotora chil fue la más fuerte tanto bajo condiciones de alimentación glucosa como xilosa. La promotora hexl es una promotora constitutiva fuerte durante todas las fases de fermentación y bajo ambas condiciones de alimentación de azúcar. La promotora xy26 es altamente activa bajo la condición de alimentación de xilosa solamente. Las promotoras pep4 , his2a y bgll son moderadamente activas. Para expresión 'genética de alto nivel en las cepas blancas las promotoras chil, hexl y xyl6 son muy útiles. Las promotoras alternativas que también dan alta expresión son aquellas de los genes pep , his2a y bgll. Los experimentos northern adicionales también indican que las promotoras de los genes xyl4 y xyl8 pueden utilizarse para expresión genética de alto nivel en las cepas blancas cuando se desarrollan en xilosa. Glucoamilasa (Glal, identificador de gen: CL09507) ha mostrado ser una proteina principal en cepas Cl blancas. La promotora glal, por lo tanto, también es un buen candidato a utilizarse para la expresión de genes de alto nivel de interés en cepas blancas. Como se muestra la glucoamilasa fue altamente abundante en una cepa blanca desarrollada en la presencia de almidón. Esto indicó que la promotora glal es fuerte e inducible por almidón y sus productos de degradación, como maltosa.
Las secuencias de nucleótidos de Pchil(0.8) , Pchil(1.8), Phexl, Pxyl6 y Pglal se dan abajo. Obsérvese que los codones de inicio ATG de las regiones de codificación correspondientes se dan en letras cursivas en negritas .
Ejemplo 12: Sistema de expresión genética de cepa blanca Dos vectores de expresión se designan para expresión de genes en WIL y derivados: pPchil ( 1.8 ) -Tcbhl Notl fue como se describe arriba. Adicionalmente, pCRS Pchil-Tcbhl (Fig. 8) se construye al colocar la secuencia de repetición Cl en frente de la promotora Pc il en pPchil ( 1.8 ) -Tcbhl Notl. Estos vectores se han designado en tal manera que también pueden combinarse dando como resultando un vector único que contiene múltiples casetes de expresión. Los múltiples casetes pueden cortarse del vector como un fragmento ADN lineal único .
Muchos genes se han clonado y expresado en WIL o derivados. El procedimiento general fue como sigue: Los genes se identifican por purificación y caracterización de los productos genéticos (genética inversa) y/o por extracción de genoma. Los genes se amplifican por PCR o se sintetizan químicamente. La amplificación de genes por PCR se realiza al utilizar polimerasas de ADN PCR a prueba de lectura (Phusion o Supertaq plus) . Los genes amplificados se clonan en vectores de clonación PCR, es decir, pGEM-T-Easy (Promega) o pJetl (Fermentas) y se secuencian para verificar lo correcto de la secuencia. Subsiguientemente, los genes se liberan del vector de clonación PCR y se ligan en los sitios Ncol y EcoRI del (los) vector (es) de expresión.
Se toma cuidado especial cuando se designan los cebadores PCR. El codón inicial ATG del gen a expresarse fue parte del sitio de restricción Ncol en los vectores de expresión de cepa blanca. Por lo tanto, los cebadores PCR 5' (ATG) contuvieron sitios de restricción, que son compatibles con el sitio Ncol limitado del vector. Estos sitios fueron, es decir, Ncol por sí mismo (C CATGG) , o sitios compatibles que se cortan dentro del sitio de reconocimiento (BspHI, T^CATGA; Pcil, A^CATGT), o sitios compatibles que se cortan fuera del sitio de reconocimiento (Bsal,, GGTCTC(l/5); BspMl, ACCTGC(4/8); Esp31, CGTCTC ( 1 / 5 ) ) .
En algunos casos, los sitios de restricción adicionales a aquellos que se van a utilizar para clonación de los genes se encuentran en los genes. En estos casos, los genes se amplifican por PCR de fusión, donde la fusión de los dos fragmentos PCR se selecciona para tener lugar en el sitio de restricción adicional no deseado. El sitio de restricción no deseado se remueve al utilizar cebadorés de fusión conteniendo mutaciones de substitución única en la secuencia del sitio de restricción no deseado. En caso de que el sitio de restricción no deseado estuviera presente dentro de una región de codificación de proteina, el nucleótido substituido 1 se selecciona de tal manera que el codón mutante codificó el mimo aminoácido que el codón original.
Los casetes de expresión se liberan de la estructura del vector de ADN de E. coli por restricción Notl . El cásete de expresión se transforma subsiguientemente en los derivados WIL de manera simultánea con un marcador de selección, es decir, pyr5 o amdS en experimentos de co-transformación, Las transformadoras de alta producción y positivas se selecciona por SDS-PAGE o análisis de ensayo de enzima del medio de crecimiento. Los mejores productores se aplican en fermentaciones para producir alta cantidad del producto genético deseado.
Las siguientes proteínas se han producido utilizando el sistema de expresión genética de cepa blanca y genes correspondientes.
En la solicitud de patente internacional WO 2009/018537 se ha descrito: Abfl, Abf2, Abnl, Axel, Bgll (=Bgl3A) , Cbhl, Cbh2, Cbh4, Chil, Eg2, Eg5, FaeAl , FaeA2, FaeB2, Gall (=Gal53A), Glal (=Glal5A) , Pmel, Xyll, Xyll(cd) , Xyl2, Xyl3, Xyl3-cbd (=xyl3(cd) ) , Xyl4, Xyl5, Xyl6.
En la solicitud de patente internacional WO 2009/033071 se ha descrito: Abf3, Abn2, Abn3, Abn4, Abn5, Abn7 , Abn9, Aguí, Axe2, Axe3, Bga2, Bxll, Bxl2, Abf5 (anteriormente conocido como Bxl3), genes GH61 (identificadores de gen: CL09768, CL10518, CL05022, CL04725, CL04750, CL06230, CL05366), Gln, Pgxl, Rgal, Rgxl, Xgll, Xyl7, Xyl8, Xyl9, XyllO, Xylll.
Alpl : La secuencia de ADN Alpl se da por SEQ ID NO 30. La secuencia de aminoácidos Alpl se da en SEQ ID NO 31.
El gen alpl se expresa y Alpl mostró actividad de proteasa (Tabla 5) . El "kit de detección colorimétrica de proteasa" (Sigma, número de producto PC0100) se utiliza para determinar la actividad de proteasa Alpl.
Ejemplo 13: Expresión de los genes de proteina que codifican la familia Cl GH61.
El gen que codifica la proteina GH61 ( ident ificador CL10518) se sobreexpresa en cepas Cl WIL#100.L AalplApyr5 y IL#100. lAalplAchilApyr5. Las muestras de sobrenadante de cultivo se analizan por , SDS-PAGE y las bandas de proteína se colorean con azul brillante Coomassie (CBB) . La proteína CL10518 es ±26 kDa (Fig. 9) . Se conduce una fermentación de lote alimentado estándar, que produjo 13 g de proteína por filtrato de fermentación de litro, en base al ensayo de determinación de proteína BCA.
El análisis funcional de esta proteína se ha descrito en la solicitud de patente Internacional WO 2009/033071.
Ejemplo 14: Expresión de gen que codifica celulasa Cl: cbh2.
El gen que codifica CBH2 (identificador CL09854) se sobreexpresa en la cepa Cl WIL#100. LAalplApyr5. Las muestras de sobrenadante de cultivo se analizan por SDS-PAGE y bandas de proteína se colorean con azul brillante coomassie (CBB). La proteína CBH2 migra a aproximadamente 55 kDa (Fig. 10) . Se conduce una fermentación de lote alimentado estándar, que produjo 10 g de proteína por litro de filtrado de fermentación, en base al ensayo de determinación de proteína BCA.
El análisis funcional de esta proteína se ha descrito en la solicitud de patente Internacional WO 2009/018537.
Ejemplo 15: Expresión del gen que codifica 1 exo-poligalacturonasa Cl pgx.
El gen que codifica PGX (CL10389 identificador ) se sobreexpresa en la cepa Cl WIL#100.L AalplAchi lApyr5. Las muestras de sobrenadante de cultivo se analizan por SDS-PAGE y las bandas de proteina se colorean con azul brillante coomassie (CBB) . La proteina PGX migra a aproximadamente 60 kDa (Fig. 11) . Se conduce una fermentación de lote alimentado estándar, que produjo 9 g de proteina por litro de filtrado de fermentación, en base a un ensayo de determinación de proteina BCA.
El siguiente ensayo se utiliza para medir la actividad de poligalacturonasa. Este ensayo mide la cantidad de azúcares reductoras liberadas de ácido poligalacturónico (PGA) por la acción de una poligalacturonasa. Una unidad de actividad se define como 1 µp??? de azúcares reductoras liberadas por minuto bajo las condiciones de reacción especificadas.
Reactivos - Regulador de acetato de sodio (0.2 M, pH 5.0) se prepara como sigue. 16.4 g de acetato de sodio anhidro o 27.2 g de acetato de sodio * 3H20 se disuelve en agua destilada de manera que el volumen final de la solución sea 1000 mL (Solución A) . En un matraz separado, 12.0 g (11.44 mL ) de ácido acético glacial se mezclan con agua destilada para hacer el volumen total de 1000 mL (Solución B) . Regulador de acetato de sodio 0.2 M final, pH 5.0, se prepara al mezclar la Solución A con Solución B hasta que el pH de la solución resultante es igual a 5.0. Ácido poligalacturónico (PGA) se compra de Sigma (St. Louis, USA) . Reactivo A: 10 g de hidrazida de ácido p-benzoico hidroxi (PAHBAH) suspendido en 60 mL de agua. 10 mL de ácido clorhídrico concentrado se agrega y el volumen se ajusta a 200 mi. Reactivo B: 24.9 g de citrato de trisodio se disuelven 500 mi de agua. 2.2 g de cloruro de calcio se agrega así como 40 g de hidróxido de sodio. El volumen se ajustó a 2 L con agua. Ambos reactivos se almacenan a temperatura ambiente. Reactivo de trabajo: 10 mi de Reactivo A se agrega a 90 mi de Reactivo B. Esta solución se prepara cada día, y se almacena en hielo entre usos.
Utilizando los reactivos anteriores, el ensayo se realiza como se detalla abajo.
Muestra de enzima - 50 pL de PGA (10.0 mg/mL en 0.2 M regulador de acetato de sodio pH 5.0) se mezcla con 30 µ?. de 0.2 M regulador de acetato de sodio pH 5.0 y 20 i de la muestra de enzima y se incuban a 40°C por 75 minutos. A 25 µ?_ de esta mezcla de reacción, se agregan 125 pL de solución de trabajo. Las muestras se calientan por 5 minutos a 99°C. Después de enfriar, las muestras se analizan al medir la absorbencia a 410 nm (A4i0) como As (muestra de enzima) .
Capa de Substrato - 50 L de PGA (10.0 mg/mL en 0.2 M regulador de acetato de sodio pH 5.0) se mezcla con 50 pL de 0.2 M regulador de acetato de sodio pH 5.0 y se incuban a 40°C por 75 minutos. A 25 L de esta mezcla de reacción, se agregan 125 L de solución de trabajo. Las muestras se calientan por 5 minutos a 99°C. Después de enfriar, las muestras se analizan al medir la absorbencia a 410 nm (A4i0) como ASB (muestra de capa de substrato) .
Cálculo de Actividad La actividad se calcula como sigue: determinar la actividad de pol igalacturbnasa por referencia a una curva estándar de ácido galacturónico .
Actividad (IU/ml) = AA4i0/SC * DF donde ??4?0 = As (muestra de enzima) - SB (capa de substrato), SC es la ranura de la curva estándar y DF es el factor de dilución de enzima .
Se encuentra que AA4i0 de Pgxl (CL10389) es 0.78 con DF de 1 para enzima producida en cultivos de placa de microconcentración. No se analiza una curva estándar, por lo tanto no puede calcularse actividad confiable. La única conclusión que se saca es que la enzima se encontró activa hacia ácido po 1 i ga lacturóhi co , y por lo tanto se sugiere que es una poligalacturonasa .
El análisis funcional de esta proteina se ha descrito en la solicitud de patente Internacional O 2009/033071.
Ejemplo 16: Expresión de un gen que codifica xilanasa Cl con y sin su dominio de unión de carbohidrato: Xyll.
El gen que codifica Xyll ( ident if icador CL00649) se sobreexpresa en la cepa Cl IL#100.L AalplAchi lApy r 5. Dos variantes de Xyll se produjeron: ya sea Xyll de longitud completa o Xyll sin su dominio de unión a carbohidrato (cbd) . Muestras de sobrenadante de cultivo se analizan por SDS-PAGE y las bandas de proteina se colorean con azul brillante coomassie (CBB) (Fig 12) . La proteina Xyll migra a aproximadamente 40 kDa, mientras su contraparte menos CBD migra a aproximadamente 30 kDa. Se conducen las fermentaciones de lote alimentado estándar, que produjeron hasta 33 g de proteina por litro de filtrado de fermentación, en base a un ensayo de determinación de proteina Bradford. Las actividades de xilanasa de estos filtrados alcanzaron hasta 3,500 U/mL.
El siguiente ensayo se utiliza para medir la actividad de xilanasa hacia AZO-arabinoxilan de trigo. Este substrato es insoluble en soluciones reguladas, pero rápidamente se hidrata para formar partículas de gel que se hidrolizan fácil y rápidamente por fragmentos marcados con tinte soluble que liberan endo-xilanasas específicas.
Reactivos - Regulador de acetato de sodio (0.2 M, pH 5.0) se prepara como sigue. 16.4 g de acetato de sodio anhidro o 27.2 g de acetato de sodio * 3H20 se disuelve en agua destilada de manera que el volumen final de la solución sea 1000 mL (Solución A) . En un matraz separado, 12.0 g (11.44 mL) de ácido acético glacial se mezcla con agua destilada para hacer el volumen total de 1000 mL (Solución B) . El 0.2 M regulador de acetato de sodio final, pH 5.0, se prepara al mezclar Solución A con Solución B hasta que el pH de la solución resultante es igual a 5.0.
AZO-arabinoxi lan de trigo (AZO-WAX) de Megazyme (Bray, Ireland, Cat . #I-AWAXP) se utiliza como el substrato de ensayo. 1 g de AZO-WAX se suspende en 3 mL de etanol y se ajusta a 100 mL con 0.2 M regulador de acetato de sodio pH 5.0 utilizando agitador magnético. 96% de etanol se utiliza para terminar la reacción enzimática.
Utilizando los reactivos anteriores, el ensayo se realiza como se detalla abajo: Muestra de enzima 0.2 mL de 10 mg/ml solución de reserva AZO-WAX se precalienta a 40°C po:r 10 minutos. Esta solución de reserva precaleñtada se mezcla con 0.2 mL de la muestra de enzima (precalentada a 40°C por 10 min) y se incuban a 40°C por 10 minutos. Después de exactamente 10 minutos de incubación, 1.0 mL de 96% de etanol se agregan y después la absorbencia a 590 nm (A590) se mide como As (muestra de enzima) .
Capa de substrato 0.2 mL de 10 mg/ml solución de reserva AZO-WAX se precalienta a 40°C por 10 minutos. Esta solución de reserva precalentada se mezcla con 200 µ? de 0.2 M regulador de acetato de sodio pH 5.0 (precalienta a 40°C por 10 min) y se incuban a 40°C por 10 minutos. Después de exactamente 10 minutos de incubación, 1.0 mL de 96% etanol se agregan y después la absorbencia a 590 nm (A590 ) se mide como ASB (capa de substrato) .
Cálculo de Actividad La actividad se calcula como sigue: determinar la actividad de endo-xi lanasa por referencia a una curva estándar, producida de una endo-xilanasa con actividad conocida hacia AZO-WAX.
Actividad (IU/ml) = ??590 / SC * DF donde ??590 = As (muestra de enzima) - ASB (capa de substrato) , SC es la ranura de la curva estándar y DF es el factor de dilución de enzima .
El análisis funcional de esta proteina se ha descrito en la solicitud de patente Internacional WO 2009/018537.
Ejemplo 17: Expresión del gen que codifica arabinasa 2 Cl: abn2.
El gen que codifica Abn2 (identificador CL03602) se sobreexpresa en cepa Cl WIL#100.L AalplAchi lApyr 5. Las muestras de sobrenadante de cultivo se analizan por SDS-PAGE y bandas de proteina se colorean con azul brillante coomassie (CBB) . La proteina Abn2 migra a aproximadamente 50 kDa (Fig. 13) . Se conduce una fermentación de lote alimentado estándar, que produjo 7 g de proteina por litro de filtrado de fermentación, en base a un ensayo de determinación de proteina BCA.
El análisis funcional de esta proteina se ha descrito en la solicitud de patente Internacional WO 2009/033071.
Ejemplo 18: Expresión del gen que codifica endo-quit inasa Cl: chil.
El gen que codifica chil (identificador CL06081) se sobreexpresa en cepa Cl WIL#100.L AalplApyr5. Las muestras de sobrenadante de cultivo se analizan por SDS-PAGE y bandas de proteina se colorean con azul brillante coomassie (CBB) . La proteina Chil migra a aproximadamente 40 kDa (Fig. 14) . Se conduce una fermentación de lote alimentado estándar, que produjo 12 g proteina por litro de filtrado de fermentación, en base a un ensayo de determinación de proteina BCA.
El análisis funcional de esta proteina se ha descrito en la solicitud de patente Internacional WO 2009/018537.
Ejemplo 19: Expresión de un gen heterólogo: poli-galacturonasa II de Aspergillus niger.
El gen que codifica poli-galacturonasa II de Aspergillus niger (número de acceso X58893) se expresa en cepa Cl WIL# 100. lAalplAchilApyr5. Después de la fermentación la enzima se purifica utilizando cromatografía de intercambio de ion y cromatografía de exclusión de tamaño. Endo-PGII purificado migró a aproximadamente 40 kDa en gel SDS-PAGE (Fig. 15) . ¡ Esta enzima heteróloga fue funcional como se muestra por actividad en ácido poli- galacturónico utilizando el siguiente ensayo. Ensayo de azúcares reductoras : método PAHBAH Soluciones de reserva: Substrato: 1% (p/v) de ácido poligalacturónico en H2O.
Reactivo A: hidrazoda de ácido p-hidroxibenzóico (PAHBAH) {10 gramos) se agrega a 60 mi de agua y se mezcla. A esta se agregan 10 mi de HC1 concentrado y el volumen se hace hasta 200 mi. Reactivo B: Disolver el citrato de trisodio (24.9 g) en 500 mi de agua, agregar cloruro de calcio (2.20 g) y disolver, agregar hidróxido de sodio (40.0 g) y disolver. Ajustar el volumen a 2 litros. La solución debe ser transparente. Almacenar ambos reactivos a temperatura ambiente. Reactivo de funcionamiento: agregar 10 mi de Reactivo A a 90 mi de Reactivo B. Preparar esta solución fresca diariamente, y se almacena en hielo entre usos .
Ensayo : 1. 50 µ? substrato 2. 30 µ? 0.2M HAc/NaOH pH 5.0 3. 20 µ? muestra/enzima (microplaca no diluida; termentador >20 x diluido) 4. Incubar a 37 °C por 10 minutos 5. 25 µ? mezcla de ensayo + 125 µ? reactivo de funcionamiento (en microplaca PCR) o 50 µ? mezcla de ensayo + 250 µ? reactivo de funcionamiento (en tubo de 1.5 -mi) 6. Calentar a 99°C por 5 minutos en Ciclador PCR Térmico (microplaca PCR) o agua hirviendo (tubo de 1.5-ml) 7. Transferir 100 µ? a microplaca NUNC y mide la extinción a 410nm Ejemplo 20: Generación de mezclas de enzimas artificiales para sacarificación de biomasa de planta eficiente.
Una mezcla de enzima artificial se crea al mezclar proteína cruda de Cl UV 18-25Aalpl con proteína cruda de cepas blancas expresando Cl - ß -g luco s i da s a Bgll, Cl -arabinofuranosidasa 7Abf3 y Abn7, Cl-xilanasa Xyl2 y C 1 - ß -xi lo s ida s a Bxll, siendo I L# 100. LAa l 1 Apyr5 [ Bgl 1 /pyr 5 ] , WIL#100. LAalplAchilApyr5 [Abf 3/pyr5] , WIL#100.LAalplAchilApyr5[Abn7/pyr5], \ WIL#100. LAalplApyr5 [Xyl2/pyr5] , y WIL#100. LAalplAchil [Bxll/AmdS] , respectivamente. La proporción de los diferentes componentes en una base de proteína fue 10 (UV18-25Aalpl ) : 1 (proteínas de cepa blanca ) .
La eficiencia de sacarificación de la proteína cruda de UV18-25Aalpl sólo se probó en substrato de germen de trigo y se comparó con la eficiencia de la mezcla artificial. Se utilizan 10 mg proteína/g de germen de trigo de material seca. Las condiciones fueron como sigue: temperatura 50°C, pH 5.0, tiempo 72 horas.
Se muestra que la mezcla de enzima de UV18-25Aalpl solo liberó aproximadamente 30% de la glucosa, aproximadamente 5% de la xilosa y 12% de la arabinosa del germen de trigo. La mezcla artificial liberó al menos 60% de la glucosa, 60% de la xilosa y 25% de la arabinosa del germen de trigo.
Ejemplo 21: Construcción de las bibliotecas genéticas en cepa blanca C 1 WIL#100.1AalplAchilApyr5 y_ selección de xilanasas .
Una biblioteca genética de ADN genómico de cepa Cl UV18-25 se construye en Cl-cepa IL# 100. lAalplAchilApyr5 por métodos previamente descritos por Verdoes et al. (2007) . La biblioteca se selecciona para actividad de xilanasa como se describe por el Ejemplo 4 en el capitulo 4, que produjo varios clones positivos que expresaron diferentes xilanasas. El análisis SDS-page reveló la presencia de bandas de proteina extra en los clones positivos. El análisis PCR utilizando diferentes combinaciones de cebador se basan en la secuencia de las xilanasas Cl conocidas y la secuencia de vector reveló la presencia de 3 diferentes Cl-xilanasas . Este resultado se confirmó por análisis Southern.
Apéndice 1 para los Ejemplos: procedimiento de mutación UV para cepas Cls 1. Difundir la cepa de origen sobre placas PDA (agar de dextrosa de papa) e incubar a 35°C por 14 días para obtener esporas. 2. Raspar esporas en 0.9% de salina y filtrar a través de algodón para remover micelio. Diluir la suspensión de espora resultante a 1x106 esporas/ml utilizando salina. Remover una alícuota pequeña de suspensión de espora, diluir en salina y difundir la placa en PDA para determinar el conteo de espora viable inicial. 3. Agregar 10 mi de suspensión de espora a una placa de Petri de vidrio estéril conteniendo un sujetador de papel y agitar en una placa de agitación magnética. Remover la parte superior del vidrio e irradiar con luz UV para obtener 90-99.9% de muerte. Utilizar una lámpara Pen-Ray como la fuente de luz UV (254 nm) y calentar por al menos 10 minutos antes de irradiar la suspensión de esporas. 4. Difundir la placa en placas en placas selectivas ASC (Apéndice 2 para los Ejemplos) con las luces del cuarto apagadas, utilizando un volumen para obtener menos de 30 colonias en cada placa. 5. Invertir las placas, poner en bolsas de plástico rojas e incubar a 30°C por 6-7 dias para crecer y dejar zonas de despeje por desarrollar. 6. Determinar el % de muerte para la mutación como la diferencia entre el conteo de placa viable inicial y un conteo de placa en PDA después de la irradiación por UV .
Apéndice 2 para los Ejemplos: Medio Placas de Agar Selectivas ASC Ajustar el pH a 7.5 con HC1 y esterilizar 30 minutos a 121°C. Después de la esterilización agregar 20 mi de 25 g/1 DOC (ácido deoxi có 1 i co ) , filtrado estéril. Verter aproximadamente 20 mi/ en la placa. Difundir esporas mutadas por UV a places ASC e incubar por 7-14 días para permitir el crecimiento de colonia y despeje de celulosa.
Medio RM-ASP Ajustar pH a 6.5 antes de la esterilización en autoclave. Esterilizar la glucosa por separado como una solución al 50%.
Medio de celulosa de baja y alta densidad Ajustar a pH 7.0. secuencia chil: ver WO 2009/018537.
Secuencia de ADN pep4 (SEQ ID No. 19) : 1 gctggctcaccgttatttgctcccgcaggaagtccaggtcctcctcgcagttggacaaac 61 tctgcttcgcagcctgcaactttgactcaaggagcgcctcggcctcgtcgattgggtaag 121 acagcatgacgttggcctgccaaatgtcagcctctagaagcacactcccactctcgttgg 5 131 aaaggttcctaecccaagccacaagtaaacctcgtccgtcggcggtatctcggccttcgc 241 atagagagtgtcgttcaattcgaatgttgtctctatcggatcagattcgccctgccacaa 301 tcoaccgccgatcagcaccatggccgctcatcgagagtggcaacgcctcgccctaccgtc 361 ctcagcttcaaaaagcggacagcctccagcgttttccgaatgtcgggcattttgtccttt 421 agtcccgctaccctccgctgcaggttctgctccatgaactggtatttcctgcacgccgac 481 cacgtatcagccgaacgccgtccgtcaaggctggatttcaatcttaaccgggagagctca 541 cgcaatcatctcttggaaccgacgcagcgtcggctcaacatctgctcgtgaegfcgacata €01 gtcctcgaecttgtcgacgaatggcgcatacggaatgccacgaggattggagggtgtggc ^ g €€1 gtccctgtctcgtgcaggtggtcagtcagcaataacagccagagtgca atgctagaatg 721 gcgcccgcgggggagggaaagtttggttaccttgctgctgcttccttgtctgtgctcgcc 781 atcttggacaaattctcacatgttgcagtggaaggatactgcaagcgactgttaacccga 841 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CCTCGATACCGGTAGCTCCAACCTGTGGGTTCCATCAGTCGAGTGCGGCTCGATTG 2701 CTTGTTACCTGCACTCGAAGTATGACTCATCTGCCTCGTCCACCTACAAGAAGAACGGAA 2761 CCTCGTTCGAGATCCGCTACGGGTCAGGCAGCCTGAGCCCCT TCSCTCTCACGACACAG 2821 TGTCCATCGGCGATATCACTATCCAGGGCCAGGACTTTGCCGAGGCGACCAGCGAGCCCG 2881 GTCTTGCCTTTGCCTT GGCCGTTTCGACGGTATCCTTGGCCTTGGCTACGACCGGATCT 2941 CAGTCAACGGCATCGTCCCGCCTTTTTACAAGATGGTCGAGCAGAAGCTCATCGATGAGC 3001 CCGTCTTCGCCTTCTACCTGGCCGATACCAATGGCCAGTCTGAGGTTGTCTTTGGCGGTG 3061 TTGACC^CGACAAGTACAAGGGCAAGATCACCACCATTCCGTTGAGGCGCAAGGCCTACT 3121 GGGAGGTTGACTTCGATGCCATTTCTTACGGCGACGACACTGCCGAGCTTGAGAACACTG 3181 GCATCATCCTGGACACCGGTACTTCTCTGATCGCTCTGCCCAGCCAGCTCGCCGAGATGC 3241 TCAACGCTCAGATCGGCGCTAAGAAGAGCTACACTGGCCAGTACACCATCGACTGCAACA 3301 AGCGCGACTCCCTCAAGGATGTCACGTTCAACCTGGCTGGCTACAATT CACGCTCGGCC 3361 CCTACGACTACGTTCTCGAGGTCCAGGGCAGCTGCATTTCTACCTTTATGGGCATGGATT 3421 TCCCGGCTCCTACTGGGCCAC7TGCGATCCTGGGCGATGCCTTCCTCCGGAGGTATTACT 3481 CCATTTATGACCTTGGCGCCGACACCGTCGGTCTGGCTGAGGCCAAGtgattgaaggatg 3541 ggcggcagggaaagacgatgggtaatacggggagtctgggaatcgggctttggactgtgg 3601 tctgtatctagttgctcaagagagttgtcgtttgattttgttataggatctgtctaggaa 3661 ccttagcaggagtgaaattttttcgtgtacgagcatcggcgggctgaagtggtttgataa 3721 caagtctggacttgagtacgcaggcagttgcacaatctgcttcgcegaggagagcaaagg 3781 cgtcctctttgaaaaagcctacctacgcgtcacaggggtataattttttgagtttgaect 3841 acgccctgtcccataccaaccgcgtcccaatccccgtcaaccettgcaatgteattacce 3901 gtggatgtatcacgtagcagaagccgacatcccacacgcttcaaccttcctatccagaca 3961 atgacatggtaagctcattttttaaaggtcgccgtcctccctcccttcacgtgattcatt 4021 ttccttgcgcctcgtggcgcatcccctgacttcatgccgtacggatcaaagggtgcaaac 4081 ttgccccgcacctcctttctgccgccatcatcatcaccatcatcgccgtttgtcgcctgc 1 1 gcagcatgtagcacggacgacgcettgctgtagtcaaacggctcctgctcggcatcgCca 4201 tcatggccttcctcctgttcgcccgaggtctgttegtcggctgccgaggtcgcggeggag 4261 gcagatgtctgctgctgctgctgctgctgctgcttctgggctttcttggcggctcgaagt 4321 gccttcctggcttgagccttgagttcctttgctccctttatgtccccgttttgagccagt 4381 tgctctgccaagagctgagcacgcttgaactcttctcgagcagccttcttggcttgtttc 4441 tttgcctgcttggcggccttgtcatcaccaccctcaacttcctgctcgacactaggagac 4501 ttcgggtggtctttgcct cggaactatctccacccatctcgatgtcggaaactgcttcg 561 gcttcggatgctgactcaacatcaacatccctagacttccgctttcgaccagccttcaga 4621 gtgaaaccttcttcttcgagaacagggagacccttggtgtcttgttcagcgacacgcctg Secuencia de aminoácidos Pep4 (SEQ ID No 20) : 1 MKDAFLLTAA VLLGSAQGAV H MKLQKIPL SEQLEAVPIN TQLEHLGQKY MGLRPRESQA 61 DAIFKGMVAD VKGNHPIPJS NFMNAQYFSE ITIGTPPQSF KWLDTGSSN LWVPSVECGS 121 IACYLHSKYD SSASSTYKKN GTSFEIRYGS G3LSGFVSQD TVSIGDITIQ GQDFABATSE 181 PGLAFAFGRF DGILGLGYDR ISVNGIVPPF Y HVEQ LID EPVFAFYLAD TNGQSEVVFG 241 GVDHD YKG MTTIPLRRKA YWEVDFDAIS YGODTAELEN TGIILDTGTS LIALPSQLAE 301 MLNAQIGA K SYTGQYTIDC HKRDSLKDVT FNLAGYNFTL GPYDYVLEVQ GSCISTFMGM 361 DFPAPTGPLA ILGDAFLRP.Y YSIYDLGADT VGLAEAK Secuencia de ADN his2a (SEQ ID No 21) : 1 cattcatggg tttgaggccc gattttgaac gtatatccta ggctatattc ggggtaagat 61 actggaagcg ctgggccgga tgactagcta tttcaagtgc ccaagagccc atcataccta 121 ecttgcggcc taagatctag ccaaatcatt cattggttac cccagactcg acgaacctga 131 tatccgsatc cagggcaagt caaatcgccg agtaagactt gacaaacccg gaacccaaga 241 actgcgcaat ctgggagcag gtttccgacc agcatggaaa caccccgatg gaaaacccac 301 acatacgggg atggggacta acgccggaca aatcaaaaac cctggaggat tgggtaacga 361 tggggaagtg cgacgggcac tcaacccttc aagcgttgca ggaccttgta cagccaagca 421 gaatgacgga aaccgatgag caaacccgga atctgatgat cctggaacag aatcatctgt 481 cttgggtacc gacgttggag tgagagtgtg caaattagea ggaccaagca actatactac 541 ctaaatcagg tcgatcagtt atcagccctt gcaaaccaga cttgatggag ggaagággtg 601 aaagctgtga ttgagggagg aagctgagaa ttggtggtgg ttgttttgct cagccágggt 661 gtaggacgag aagaacgcgt tcgagatttc ggagagcagg ctgtcctaga gcattatttt 721 cctggccttg ageaaactta agccagtttt tttttccccg tcgggaggga agtcgctttg 781 aa ttgaagc ttgcgggcgc agagctcggc tccataagca tccaatcaaa tgagcctgaa 941 gcagtcgacc gatttttttt tatctgggtg taatcgcaac catgcacata accgttttgg 901 gactagctcc aacagctctg atcaacaacc tgagaaaggc gcgagtgatc cgtgatccca 961 cacccttacg cgaaaactac ttaactccca cctcccccac cgcgggccaa cttcttccaa 1021 ctcccactca accaacttcc gtt tcccat caatcactgc attcgcgcgt caagctcttc 1081 ctcgccctta caccaaccac ataacttttt tatcctttga caaggaccat caatcaaaAT 1141 GACTGGCGGC GGCAAGTCCG GTGGCAAGGC GAGCGGTTCC AAGAACGCGC AATCgtaggt 1201 gcccttttcg cgtcatctac ccgcgccttc gtgcagttgg gcatggttca gccetgaact 1261 ccagatqccc gttccggtgc tcttacagtt ggctaacttt ttgtagTCGT TCATCTAAGG 1321 CCGGTCTTGC GTTCCCTGTC GGTCGTGTCC ACCGCCTTCT CCGGAAGGGC AACTACGCCC 1381 AGCGTGTCGG TGCCGGTGCT CCCGTTTACC TGGCTGCCGT TCTCGAGTAT CTTGCCCCTG 1.441 AAATTCTGGA GCTGGCTGGC AACGCCGCTC GCGACAACAA GAAGACGCGT ATCATCCCGC 1501 GTCACTTGCA ACTCGCTATC AGGAACGATG AGGAGTTGAA CAAGCTTCTC GGGCACGTCA 1561 CCATCGCCCA GGGTGGTGTC CTTCCCAACA TCCACCAGAg tacgccgcct taccagacga 1621 tetctaatgc gcaaatctaa etttgtttec agACCTTCTG CCGAAGAAGA CCGGCAAGAC 1601 CGGCMGAAC TTGTCGCAGG AGCTCtgatt ttcgcggttg ggtttttttg ctttattttc 1741 tggtcggcac gctgggttca tgatatcggg gtcacggttt cgggtcattg gttgcttttt 1801 gcgcgtgttt gggctgtaca ttaattccat gatgggcatg gtcatggtta tgaatgagaa 1861 tatcctctga acatccaaat cctgacacag tttgctcgag ttgatgtctg cattggaagc 1921 gactcgttga cggtaccgcg tagagtcttg tcgcttacga aattcttgca tcgcacagat 1981 tacccagtag tgccatagta ctctttaaga tgataagcgc attcgagccc ggcatcgcac 2041 agactttccc atgccttgat atatgcgaat tcctatgtac aagagatteg tcgcgaaaga 2101 gcccgtcaaa acttgagcgg ggggggagct gcaaaagcct gtcagctaat tcgagtgaga 2161 cgcgcaaagc aagecaaett acgatccagg tggggcgccg ggaggttcct ctcgtatttc Secuencia de aminoácidos His2A (SEQ ID No 22) : 1 MTGGG SGGK ASGS NAQSR SSKAGLAFPV GRVHRULRKG NYAQRVGAGA PVYLAAVLEY 61 LAAEI LELAG NAARDN KTR IIPRHLQLAI RNDEELN LL GHVTIAQGGV LPNIHQNLLP 121 K TG TGKKL SQEL Secuencia de ADN hexl (SEQ ID No 23) : gtcaacttactccgagtctcgcaccgagttcga actgagcaccgtacccacaactccgt cattgacgttgctgagggcgagtatcgtgcccgtgtccagcccaaecaccgcaagcaagc 121 ttccgtagtcggtaccaccgtcaacggatcgcggttcagccacagecgcaaggccagcag 181 caccacctccacccacacc^acgagtacaccgtcgatccccctagccaccgccccgtcca 241 caagaaggagtcggttgaagtcgccggtaccactgttgacccccctgctcctcgttcgac 301 ctaccacgagcaggtgaacattgttgaagagaccgttgacgctcaccgttacgctcctca 361 acccaacaacaacaacaagATGGGCTACTACGACSAGGACGgtaagcatcttccttcccc 421 tttgatgttgttccttacccgtgacatccatcggtcgtatgctttcttagccacacacaa 481 gtgttgtgacaagtgccgtgctcacgccgatatcagGCCACTACCACTCTTTCCGCCATG 541 GATTGCACAAGTTGGCTGACCGTATTGCGCATCCTGAAGGCCATGACCGCGTTGAGGTGA 601 GCGAGGTTCGTGAGACCCGCCGCACCCGCGCTCCGTCTTCGGAGGCGTACACGCCGAACA 661 CGGTCACCATTCCGTGCCACCACATCCGCCTCGGCGACATCCTGATCCTCCAGGGCCGCC 721 CCTGCCAGGTCATCCGTATCTCGACCTCGGCTGCCACTGGCCAGCACCGCTATCTTGGTG 781 TCGACCTCTTCACCMGCAGCTCCATGAGGAGTCGTCGTfCGTCTCGAACCCTGCTCCCA 841 GCGTCGTCGTCCAGACGAT6CTTGGCCCTGTTTTCAAGCAGTACCGCGTCCTCGACATGC 901 AGGACGGCCACATCGTCGCCATGACCGAGACGGGCGATGTCAAGCAGAACCTGCCCGTCA 961 TCGACCAGAGCAACCTCTGGGGCCGCCTCAAGCAGGCCTTCGAGACTGGCCGCGGCAGCG 1021 TCCGTGTCCTGGTCGTTTCTGACAACGGCAACGAGATGGCTGTTGACATGAAGGTCGTCC 1081 ACGGCTCGCGCCTCTAAgtcaagccggcaggctctcatgcaagcttcggggctacgagtc 1141 gggcggcattgggtttgegtttgatgcatcttggttacggcgtgtatgtcatttgaagat 1201 tgaaagctgcgccttggtcgactcctggcgccggatggatatacatg tcctcgggagga 1261 tatgaaggtttcatgtcgctagtttcacgtgtatatgatgactgtaatggatggatgttt 1321 atggccaactttqcgattgatatcttgaaccttttttctggtcgtgtgagtgaacagtga 1381 ttaagtgagagtgaggtatgcaccgtttatcacaaggttgcct gatatcccaccttcaa 1441 cgggcgtggggaatcgaagtccctcccctacagtaagtagcctctcttgaatgacctgaa 1501 acgcaacccctccgagccactaccacacctaactacgaaacaaccactttcctgttccag 1561 gaagctccagttctcccgctaccctcccctcccgccgttcaggctgtacgcttacctccc 1621 aacctcatcttcgagaggtctaatccgtacacacttaacagtgcatcctgacatagctaa 1681 ccatcateactctagtteattageegtcccgccatcccgtcaattacattcccggctgtt Secuencia de aminoácidos hexl (SEQ ID No 24) : ? 1 MGYYDEDGHY HSFRHüLHKL ADRIAHPEGH DRVEVSEVRE TRRTRAFSSE AYTPNTVTtP 61 CHHIRLGDIL ILQGRPCQVI R1STS TGQ HRYLGVDLFT KQLHEESSFV SNPAPSVWQ 121 TMLCPVP QY RVLDMQDGHI VA TETGOVK QNLPVIDQSN LWGRL QAFE TGRGSVRVLV 181 VSD GMEMAV DMKVVHGSRL. bgll: ver WO 2009/018537. Observar que bgll = Bgl3A 7.
Cbhl: ver WO 2009/018537. Observar que cbhl = CBHI 1 Pchil (0.8) (SEQ ID No 25) : AGCTTGACCCTTTCAGAGCTAGGTTTCATTAGGCCTTCGAAAACAACCCAAGGCCCCGTC GCAACGATCACAACCGGCCGATAACCAGATCTCGGTAGGTCCGATAAGGATCCAAAATGG TGTCGGCTGACGTTGCATGTGCCCAGGCAGGAGGATGATCCCCAGGGTTGTTGCCGGCAG CTCCCGCACGTCGGGGAGGGGGAGGGGGAGGGGAAAGCCCTAACTAACGTTCGTTCTATC ACGGGCCGACCGGGCCATGCTTTCGGCTTGTGAGCGGTGGGGTCAAGGGCAACAAGAAAT GCTAAGTGCGGGACGAAGACACGCGGGCATGAGGTCTCAGGGTGACCTGCGCAAAACCAA GTCCCACTCGCCATGCCTCCAGCAGCAACGTTGCCGTAGAAGGGTCAGGGGGTTTGTTGT AGACCCACGACCATGCTGCCGGCGAGCGGAGGGTTGGCTTGCTACAGGCGCTGAAGGGTC AACTCGGTGCCCAAAGTGGCTACCAAGCGTGCCATCAAGGGAAATGAGATGATGGTGGCT CGTGGGCAAAGAAAAGACAAGGGAGGTGACTCTAGAGAGATGCTCTCGAGTTCACGGGTA TAAGAGCACTGTGATCGTTCACAAAGCCGGCGTACTCCTCTAGAGCATCTATCATCAACA TCACCAGAAAGGTCNTAGACCAGGTGGTTGCCATATCCAGTCGCAAAAGAGCCAAAGAGC GAAGGAGCACGAAAGCACAGCCCAATCATTCCCTGCTTTGCTACTTCTTCTCCACCATO Pchil (1.8) (SEQ ID No 26) : GTGCCTTACCTATGGGCTCCTAGTCTCGTTCCTCTTTTTGATAGATTTGTATTTTGCAAC GTTGCAAAA GAGACATTTCAATCATATGTAGCCGCCAGCTACTGTTAGCGTACTCAGCG TTGCCCAAACGGCGGTTTTTCTGGGTAGCACTGTGCCGCGTGCCCCTGAGCCGTGCGTCG CGGAAACCCCCTTAAGTAGCAAGTATGTTACCGCCGAGACCGACAATGCTGTTGGTTACC TCGCTGGTCCArGATTGCAATCTAGATATCGTGCGGGGCTTTTGCAATCGGTTTTCCCTA CCCACTTTCTTCTTTTGGACACTTTCTCTTTTGGAAAATGCCGAAATGATGCGGCTCGCT CACGCCCCGAAGTCCCGAGCTGGGGCTAGATCCGTGATTGCAACGCGGTGCGAACGCGAC TGGGGCAGACCTCGCTCAGCCT GGTCGTGCCGGAA GGCGGGTACCTTTACCAGGTCGG GATCAATTACATAGGATGCCATGTGCGTGGATTTGATTGCATCGCTGTCCCTTTTGTATG TGTCCGAGAGCGAGACATCAACGCGAAAACCGGAATGCTCCCAACGTCGCTCTCTGTTCA TAGGGTCTTTTTTTTTCTTCTGCTCCATATCATCTGTCTTGAACTAAGrGATCATCTGCT GTCACGTCCCGCCCAATGATTGTAAAGAATGATAAGTGATGCTCGCCGGGGCCAGGCTCT GTGAAAGTTCCCTCTTTGGTTGACGATCAGGTAGCGCCAACGTTGATTGGGCCGCCCGTA AAATCCGACCCTGTCTCCTTTCGTTGCAAGTCTCCGCGAGACCGTGCCAAGCATGTTCTC CGGATCCCTCAATTACATAAGGTT GGCTCCAGGGTAGGTCTGGAAGCTACCCACCTCGG CCAAGCAACCAATCACAACCAGACCTCGCGGGGTTTCGACCTTCCTGGTTTGTCTCAGGG CTGGCCAACGTCCTCCCGTGGCGGGTGCCTGGTGATCGCAGGTCGCAGGCGAGTGCCGGG CACGCGGAGCCCCCGTCAAAGCTTGACCCTTTCAGAGCTAGGTTTCATTAGGCCTTCGAA AACAACCCAAGGCCCCGTCGCAACCATCACAACCGGCCGATAACCAGATCTCGGTAGGTC CGATAAGGATCCAAAATGGTGTCGGCTGACGTTGCATGTGCCCAGGCAGGAGGATGATCC CCAGGGTTGTTGCCGGCAGCTCCCGCACGTCGGGGAGGGGGAGGGGGAGGGGAAAGCCCT AACTAACGTTCGTTCTATCACGGGCCGACCGGGCCATGCTTTCGGCTTGTGAGCGGTGGG GTCAAGGGCAACAAGAAATGCTAAGTGCGGGACGAAGACACGCGGGCATGAGGTCTCAGG GTGACCTGCGCAAAACCAAGTCCCACTCGCCATGCCTCCAGCAGCAACGTTGCCGTAGAA GGGTCAGGGGGTTTGTTGTAGACCCACGACCATGCTGCCGGCGAGCGGAGGGTTGGCTTG CTACAGGCGCTGAAGGGTCAACTCGGTGCCCAAAGTGGCTACCAAGCGTGCCATCAAGGG AAATGAGATGATGGTGGCTCGTGGGCAAAGAAAAGACAAGGGAGGTGACTCTAGAGAGAT GCTCTCGAGTTCACGGGTATAAGAGCACTGTGATCGTTCACAAAGCCGGCGTAC CCTCT AGAGCATCTATCATCAACATCACCAGAAAGGTCNTAGACCAGGTGGTTGCCATATCCAGT CGCAAAAGAGCCAAAGAGCGAAGGAGCACGAAAGCACAGCCCAATCATTCCCTGCTTTGC TACTTCTTCTCCACCATC Phexl (SEQ ID No 27) GATCCTAAGTAAGTAAACGAACCTCTCTGAAGGAGGTTCTGAGACACGCGCGATTCTTQT GTATATAGTTTTATTTTTCACTCTGGAGTGCTrCGCTCCACCAGTACATAAACCTTTTTT TTCACGTAACAAAATGGCTTCTTTTCAGACCATGTGAACCATCTTGATGCCTTGACCTCT TCAGTTCTCACTTTAACGTANTTCGCGTTAGTCTGTATGTCCCAGTTGCATGTAGTTGAG ATAAATACCCCTGGAAGTGGGTCTGGGCCTTTGTGGGACGGAGCCCTCTTTCTGTGGTCT GGAGAGCCCGCTCTCTACCGCCTACCTTCTTACCACAGTACACTACTCACACATTGCTGA ACTGACCCATCATACCGTACTTTATCCTGTTAATTCGTGGTGCTGTCGACTATTCTATTT GCTCAAATGGAGAGCACATTCATCGGCGCAGGGATACACGGTTTATGGACCCCAAGAGTG TAAGGACTATTATTAGTAATATTATATGCCTCTAGGCGCCTTAACTTCAACAGGCGAGCA CTACTAATCAACTTTTGGTAGACCCAATTACAAACGACCATACGTGCCGGAAATTTTGGG ATTCCGTCCGCTCTCCCCAACCAAGCTAGAAGAGGCAACGAACAGCCAATCCCGGTGCTA ATTAAATTATATGGTTCATTTTTTTTAAAAAAATTTTTTCTTCCCATTTTCCTCTCGCTT TTCTTTT CGCATCGTAGTrGATCAAAGTCCAAGTCAAGCGAGCTATTTGTGCTATAGCT CGGTGGCTATAATCAGTACAGCTTAGAGAGGCTGTAAAGGTATGATACCACAGCAGTATT CGCGCTATAAGCGGCACTCCTAGACTAATTGTTACGGTCTACAGAAGTAGGTAATAAAAG CGTTAATTGTTCTAAATACTAGAGGCACTTAGAGAAGCTATCTAAATATATATTGACCCT AGCTTATTATCCCTATTAGTAAGTTAGTTAGCTCTAACCTATAGArAGATGCATGCGGCC GCAGGTACCAGGCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGT TTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACA TCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACA GTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGG TGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTT CGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCG GGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGA TTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCC GATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGAC GTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCC TATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAA AAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAAT TTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATA CATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGA AAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCA TTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGAT CAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAG AGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGC GCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCT CAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACA GTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTT CTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCAT GTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGT GACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTA CTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAftGTTGCAGGA CCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGT GAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATC GTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCT GAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATA CTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTT GATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCC GTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTG CAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACT CTTTTTCCGAAGGTAACTG3CT CAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTG TAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACA ACCTCGCTCTG CTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGAC TCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGGACA CAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGA GAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTC GGAACAGGAGAGCGCACGA3GGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCT GTCGGGTTTCGCCACCTCT3ACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGG AGCCTATGGAAAAACGCCA3CAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCT TTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCC TTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGC GAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCAT TAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATT AATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGT ATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGAT TACGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGT GGCGGCCGCTCTAGAACTAGTACGGCGTGCAAGTAGTGTCTTTCTTTGCACTCCCGCCGT CCCAGAAGACGCCGCAACAAGCTGAGCTTGCTGGAAGCCGAACAAAGGCGTTACAGAGCA CAAACATAGTGGCAGTGTAGGAACTCTAACTGGGACCAAAACTACGGGCCCGGCAGAAAC GTTCCCCGCCCCGAAGCGAAGGCGAACGTCGAAAAGCAAGACCGGGACCGCTCGTCCCAG GATTAGCCACGAAGTTCCAGACCAAGTATAGGAGTAAACGCTCGCTCGTCAAAACAATTG TCACCAATCAGCACCACATCGGCACATAACAACCGGTTGCGGAACTCGCATGTGAAGAAC AAGCGGCTCCGGGGGAGTGATCGGCTCGGGCGGATGACCCGGACTCTTCCGCGCAGCAAC TCGGCGTGTTGTTGACGGCAGTACTCCGTAGTTGCCATGACAACAGTCAATGGCGTGCTT CACMGGTGGAGAGCCGAGAAAGCACCTCGGCATGTACGAGTATGTAGATAGTGTATCAA GCAGGAAGATGGGGGTTACTTTATCTCAATCAGATGCCTGTAAGCGAGAGCCGAGAGCCT GCCCTGTTGTTGACACAATTCTGGCCTGATACGAGTGACAAGCGCTGGGACGGCGGCTGG GGTCTTTTGCTCGCGGCTTCAGCTCAATTCCAATCCTGGGCCGGTGCCGAACGGCCCAAT CGCGAGCGCCCACGA TCGGAGGTCGAGGAAAGAAGGCTGGGCGAGACGCGGCGACAAG CTGTGGCAAAATGGCC TTGAGGTTCTGGGTCGGCTGGTGATCAACCATGCATTTCCCA GCCCGCAGATTCTCTTTCTCTCTCGTGCAGCAGCGGCACCAGCAGCAGCAGCAGCCAGGG GTTTGACCAACCTCTCCGCCCAGCCACCGATAGTAAAGATGCTGCCTGCGTATTCTGGGC TGCAGGAGTTCCAAGATCTTTCGGTCTGGCCACCAGCTGTCACGTCACCCTCCACCTTTG GACGACGTTGCTGGAAAATTCGAAGCCTTCACTAAGATAACTATGCCGTAGCACTTGCAG CCCCGGAAGCTGCAAGTTGATTCTTGGAGGGCTCTCTCCACCACCAATACGGGAGATCTG GCCCCGCACTTGAGGAGGCTGGAGTCTCGGATCGCCCACTTCGCGTCGCCCTGGGCCCTG GGCCCTGGGGTGATGGGCCCGTTGCCGTGGTGGATGGCAGGAGCTTTTCAGCTCTCAATG GGCGAATGCTACTCCGTAGGTCGGAGTGGCTGGAAGCGGCGGAACGGACAGGGGGAGGTT GGGGAAAATGCTCCGCAGGAAGAGCAGGGAGTGGGGAGCTGCGGTCGGCCCTGTGGAGCC CGTGCAGGGCCAGCTAATCCAATTCGGGCCACAATAAACAAGAGAGGGCCCCACATCArG TAAACAGAGGCTCAGAAGCTCCTGCCACACTGGGAGGGTTTCGAAGTCTGACGACTGCCA ATGGACCCCAGCCATCGCGAGCACACAGCAGTTCGCACGCTCCCATTGGGTTCCTCATCA CGCAGTCGCTCTCCCCGCCAACCAGCGCCAGGTCCGGGAACAGCGGCGCAAATGCGTATT TGAGGGCGCCTCGCTCGAGCAACCTGTGCCTGACCTrCTCCTCCTCCTTCTGCACCTTGC ATCTCGTCGCGTCCACTCGCAGGCAACCACACATCCrCCTCCTCTCCCAAAACCCCCCCG CTTTTTCTTTCCCTTGTTGGAATTCGATTGAAAAAGAAGACGGGTCCGTCTAGAGACCGC CTTCTCACCTTTCTCTCGACTTCTTTCTAGGAAAAGAAGCAAGAGTCATTCTTCTTGTCC ACCTTCTGGTTCACGGAAGGTCGAGGAGAAGATTGCCTCTGCCCCCAAAGTCGCCAACCT GGACTTTGAAGCACGTGTTCCGGTCCCTTTCAGTGTCTTCCCGTCCTCGTACAGGGAGrC CGAGACCGCCACCCAAACCCACTCCCACGAAGAGGTTGAGATCAAGCTCCCCCAGCTCGC CGGACGGGAAGGTCAACACTCTTCATTCCAAGCCCAAGCACATCTTCCTCCCAGCGGAGA GGGTCGCTTCAGAGAAGAAGAGGTCCGCATCACTCGTCAAGAGGAACATCACCGCCGTCC CGGCATCCGTGAAGAGTTCGTTCACCGCGAGGAGCGTCACCGGTAAGTTTAGTTTTTGTT TTGATTCACCACCCATTGTCTTCCCCGCCTTTTTCTTTTTCTTCCCTTGCTCTCTTGCCC CTGTCTAGTGTAGGGCATTGCCAAGGCCATCTTCACACACACACACCCCCCCCCCCCCCC ACCCTCAGCTGGGGGGGGGGGTGGCCTGGGTTGACCAAGGGACGGTGAAGACTACTACTA CTTGAGCCACTCAAACCCATGCATGACACAGGGTTTTCCTTTTTCTTTTCTCTTTTCCTT TAACTAACCAACCACTCCAACATTAGCCCTCAGTCAACCTACTCCGAGTCTCGCATCGAG TTCGATACTGAGCACCGCACTCACAACTCCGTCATTGACGTTGCTGAGAGCGAGTATCGT GCCCGTGTCCAGCCCAACTACCGCAAGGAAGCTTCCGTAGTCGGTACCACCGTCGACGGA TCCCGCTTCAGCCACAGCCGCAAGGCCAGCAGGACCACCTCCACCCACACCGACGAGTAC ACCGTCGATCCCCCTAGCCACCGCCCCGTCTACAAGAAGGAGTCGGTTGAAGTCGCCGGT ACCACTGTTGACCCCCCTGCTCCTCGTTCGACCTACCACGAGCAGGTGAACATTGTTGAA GAGACCGTTGACGCTCACCGTTACGCTCCTCAACCCAACAACAACAACACCATG Pxyl6 (SEQ ID No 28 ) : GCGGCCGCTTCCCCATGAATGGCAACCGGGCTGATGACCTGTGTGGGAAGAAATGGGGTT GGGTCGGGCAATGGGAAGAAAACGGAAAGAGGGAAGGAAACATGCCTGTAGTCGAGGCTG AGAGTGTACGTACGTCCGTACATTCCAGTAACCAGGCGAGAATGAGCAATGATACCCCGC ATTTCTTGGATAATTAACTCGTTCCAGAGCACGACTTACGCAGCACTACTCCGTACTGTT GGAGCGCTTAGCACGCTGGAAACTTGGCAGCCGTCCGAAGCCGCTCGGCCCCATCCTCTC GCTGGTAGCTAGTGTAGTCCCGTGCTTTACAACGCGGCTATACAGCCCGTACAGTTGTAA AGTACCTACATACATGCACTACTATTATTATCCTTCTAGAGTGGGTTCCGAATTCCAGGG AAGATCTTCCTATGGCTATCTGGCTGAAACTTGGGGGAGGAGTGCGGAAGGGGGGAGGGG AACGAGCCTCCACATTGCATACGACCGGGGAATGCGGGACCCTAAGCGAACCAGGAACCC GGTTATTGCACTCGGAATTGCCGCAGATCCCTGCGTTCCACCCGCTCGAACGGTCAACAT TAACTAATCTGTAGTGGAGTTACTGTTGACTTTCTGACTCG GTCACTGGTCC CGCCCA AGTTCGAAAACAGAATTGCATTTTTGTCCTTTTGTTCGGAGCTTTCGAGGAATAATTCCA TTGTAGGTATGGAGTAATTATGGAGTATACACGGCCCAGGGGCGCTACACACACCATCGC CGAGAATGGGAGGTCGAGCTCGCGACGCTCAGGATCCCATCGATATTrTCCCTTATCCCT GCTCTCACTAGCGCGCAGAGCCGCCTCCGCGCGGGGATGCCGGTTGTTGCCGGCGTGCTT TTTATCCGCTGCCCTTGGTTGCTCATTTCCCGGTTCTTGGGTCGCTTGCCAAGCAGCTCC GGCGGAGAAGAATACCACAGGAGGGAGCATCGGGGCGCGAAGGGCATTGCACTATGCGGA CGAGATGCTTCAACACCATCATGGACCTGTCCGGAACTCCCAAGAACAGGCGACGCCAAG GACGGAGTAGACCTCCCCGGTCCGTCTTCTCTCTGCCTGGCAATTTAGCCAAAAATCCGA CCCGACTTGCGACGATTCCTACCTCCTAGCGCGTGCGCGCTGAAGCAGTCGCGAGAGTCG CAAGGCATGGGCCCGAGTCTGGCTGGCATCGTCAAACGTGATCGGCCCGTCGAGCGTGCG TGTATAAATGCATCAAGGAGCGACTGCCCCCCCATCAATAACCACCCGGT GCTTGAGTC TCTCGCACTCGCGGCCCCTTCTTCTCTGCTTCGCACGCATCTCGCTGTCTCGCTGTCTCG CTGTCTCACTGTCTCGCTGTCTCACTGTCTCGCTGTCTCACTGTCTCGCTGTCTCACTGT CTCACTCGTCCATCAGAGCAAAACCA SU Pglal (SEQ ID No 29) : TAGTAGTTGTCAACCTTGGCAGCGAGAGTCCCGAGGCGGTAGATGAGAGAAAAAAGGACC GATGTTGACTTCCATGCCATCGATGGCGTCGTCTCGGCTAGACGTCGTCGGCGTTATTCT GGGGGAGGCAATCCCGGGTGAGGAGAGAAATAGACGCGTCGCCATCTAGCAGCCATCACT CAGTGGCATCACCTGCGCGTTGACTTGCCTTCGAAGGCTCTCCTGAGCCGAGCATGTGAT TACGATGTATAAGACCTGCATTGAGCTCGACGTTCCCGAGCGTCGGCGCGAGCTTCCAAT TCGGTTGAGGCTCCGGCGGCTTCCCCCGGTTTCCTGCTGGACTAGCTGCCGTGGCGGGGG GACGGCAGAGCGACTCCGACGCGCCCCATGCGAGCAACGGCCCGATTTTCGATGAGATCT GCGGGGCGCCGGAGTGGCAGCAGTTCGTCAGCTTGGCAGGCACGGCTCCCCACCTTCTTC CTTCTTCCACACTAGGCCCTCCCACAAGCGACCAGATGCTTGTTAAGTACGCAGTAGTGT CTCGGCTCGCCCAGAGAACAATGGCACGCCGATCrGTCTAATGACCAAGAGCGACGGTTC GAGACCATCCATTGGACTGGAGGGCCTGCGAGGCATCACGCCGAACCCATGTCATGCTAC TCTT C GTTCACCCCCGGAGATGGCGTGAAACTGCGCGTTTACTCGCGGCTCAGCATGT GCTCACGTTGGGTAGGTCCCGCAAAGTCAGAGGTAGGGAGGTACTTTGTAGGCACAAATC ATGTACACGTTCGTACCTGAGGTAGCTATCTCGCCTCAGGCACACGAGGCCCGTTCGACG AGAGAGAGGAAGAGCAACCAAGAATAGTCAAGGATATTATTACTCTTTCCCTGGTATTTC TGGACATTTTGTCCAGGATTTTGTTCGCCCTTTAATTTTGAACAATTATGCTCCCGTCGG CTCCGATCCACGCCTCTTAACTCTCCTTTAGCCTTTCGCCTCTATTTCCTTGAATTTCAA TTCTCCCAAGGGCCCTGCTTTCTACAGCAAAGAATCCGTACCCTACTCTCTTTCGCGCAC AGAGTGAGGGAGCAACAGGGATTGCGAAATGCACAGCAGAGTTTGTGTAACTTCGGCAGC TCTTCCCCACATTCAGATGCATGTTACTGGAGAATGCGGAGAAGTTATAGTCTGGGGTAG TAGGTATAACGCTGGTACTCCCGAGGTAGGTAGCAACCTTGGCTGACCTTGGGAAGCGAG GGCGCTTGTGACGCTGACGATCCAGAAGCAGCCCGCCGATAGTATACGTGGAGACGGTGC TTCTTGCTATAAGCGCTCAACTCCGCTACCCATGTTCACCGTCTTCCCCTTGGACGACGG CATCACTCCGATACCCATGTCTCCTGGGTAGCTCCGAGTAGTCGCCCGAGCGCCCTTCTC CCCCCTCCCCCTTTCTCCTAATAAACGGCCGAGTCGGGCAGCCTCGACGTTGCACCGTAG CGTCGCAGCCTGCGTAGAAGCACGCGTAGAAGCACCGAGCTCCAAGCTCCAAGACGGCAA AAGCCGCCGCGAAGTGGCCGTCGGCCCTTCCCCGCATGCGCAGCTCCGGCACCAGGTCCG AAACGCTCCATCACCCCATATCCCAGTCAGAACAGCGGCTGCT TCCGGATTTGGAAGTC TGGAGGTCGCGAATGAAGGCTCGCGTTCGACTATAATAACAGCTCCGGATGGCAGGCCTC GTTGCCCAGCTCCAGGACCACCTCCCATCCGTAAACGGATCTGGCCTCGTCACGCCCGCC ATG Secuencia de ADN Alpl comprende (SEQ ID No 30) : ATGCACTTCTCCftCCGCTCTCCTGGCCTTCCTGCCCGCCGCCCTCGCGGCCCCTACTGCCGAGACCCTCGAC AAGCGCGCCCCGATCCTGACTGCTCGCGCTGGCCAGGTCGTCCCGGGCAAGTACATCATCAAGCTCCGCGAC GGAGCCAGCGACGATGTCCTTGAGGCCGCCATCGGCAAGCTCCGCTCCAAGGCCGACCACGTCTACCGCGGC AAGTTCAGGGGCTTTGCCGGCAAGCTCGAGGATGACGTCCTTGACGCCATCCGTCTTCTCCCCGAAgtg ag t ccgcgtcccggaaagaaatagagcgagcgggggagagagtgaagggcgaaaagagccgtgt t t tgttaaccg cttgtcttttctttctctcttgcaatagGTCGAGTACGTCGAGGAGGAGGCCATCTTCACCATCAACGCGTA CACCTCGCAGTCCAACGCCCCCTGGGGCCTTGCGCGCCTCTCGTCCAAGACCGCGGGCTCCACCACCTACAC CTACGACACCAGCGCCGGCGAGGGCACCTGTGCCTATGTGATCGACACGGGCAT rACACTAGCCACTCCgt atgtctcgcggttacctcccctttcggaagaaggggcatccatatgctgacccctc tgatcacagGACTTC GGCGGCCGTGCCACTTTCGCCGCCAACTTCGTCGACAGCTCTAACACCGATGGCAACGGCCACGGCACCCAC GTCGCCGGCACCATCGGCGGCACCACGTACGGTGTTGCCAAGAAGACCAAGCTCTACGCCGTCAAGGTTCTC GGCTCCGACGGCTCTGGCACCACgtatgcctcgcacccgcgcacccgcacacccgcccggccgctatct tct gactgaca ttcctctttctcctctcta gTTCTGGTGTC ATTGCTGGCAT CAACTTCG TCGCTGACGACGCGC CCAAGCGCAGCTGCCCCAAGGGCGTCGTCGCCAACATGTCGCTCGGCGGTAGCTACTCGGCCTCCATCAACA ACGCCGCCGCCGCCCTCGTCAGGTCGGGCGTCTTCCTGGCCGTCGCCGCCGGCAACGAGAACCAGAACGCCG CCAACTCGTCGCCCGCCTCCGAGGCGTCCGCCTGCACCGTCGGCGCCACCGACAGGAACGACGCCAAGGCCA GCTACTCCAACTACGGCAGCGTCGTCGATATCCAGGCCCCCGGCfCCAACATCCTGAGCACCTGGATCCGCA GCACCTCTGCTACCgtaagccccccctccccccacccacccccagcctttggcgacattcccgccccgtatt tatttctccggggtgggggagaaacaaaacaaaatagctaacatgagatgcactctcagMCACCATCTCGG GTACCTCGATGG CTCCCCCCACATTGCCGGCCTCGGTGCCTACCTCCTGGCCCTCGAGGGCTCCAAGACCC CTGCCGAGCTCTGCAACTACATCAAGTCGACCGGCAACGCCGCCATCACTGGCGTTCCCAGCGGCACCACCA ACCGCATCGCCTTCAACGGCAACCCCTCTGCCtga Secuencia de aminoácidos Alpl (SEQ ID No 31) : 1 MHFSTALLAF LPAALAAPTA ETLDKRAPIL TARAGQVVPG KYII LRDGA SDDVLEAAIG 61 KLRSKADHVY RGKFRGFAG LEDDVLDAIR LLPEVEYVEE EAIFT1NAYT SQSNAPWGLA 121 RLSSKTAGST TYT DTSAGE GTCAYVIDTG 1YTSHSDFGG RñTFAANFVD SSNTDGNGHG 181 THVAGTIGGT TYGVAKKTKL YAVKVLGSDG SGTTSGVIAG INFVADDAPK RSCPKGVVAN 241 MSLGGSYSAS INNAAAALVR SGVFLAVAAG NENQNAANSS PASEASACTV GATDRNDAKA 301 SYSNYGSWD IQAPGSNILS TWIGSTSATN TISGTSMASP HIAGLGAYLL ALEGS TPAE 361 LCNYIKSTGN AAITGVPSGT TNRIAFNGNP SA Lista de referencias Braaksma , M. and P. 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Claims (15)

REIVI DICACIONES
1. Una cepa de huésped fúngico de Chrysosporium lucknowense en donde la secreción de celulasa endógena es menor a 20% de la secreción de celulasa endógena de la cepa Chrysospo ium lucknowense UV18-25.
2. Una cepa de huésped fúngico según la reivindicación 1 en donde la secreción de una o más del grupo consistiendo de proteasa endógena, ß-glucanasa endógena y celobiohidrolasa endógena es menor a 20% de la secreción de proteasa endógena, ß-glucanasa endógena y celobiohidrolasa endógena respectivamente de la cepa Chrysosporium lucknowense UV18-25.
3. La cepa según la reivindicación 1, se caracteriza además en que la secreción de celobiohidrolasa endógena 1 (Cbhl) está ausente .
4. La cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es WIL depositada en CBS bajo el no de acceso 122189 o WIL#100.1 depositada en CBS bajo el número de acceso 122190.
5. La cepa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, se caracteriza además en que el gen que codifica endoquit inasa 1 ( chi 1) se ha roto.
6. La cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, se caracteriza además en que uno o más de los genes seleccionados del grupo que consiste de aquellos que codifican proteasa alcalina 1 (alpl), proteasa alcalina 2 {alp2) , proteinasa A (pep4) , glucoami lasa (Glal) , exo-quit inasa (Chi2) y laminarinasa (Lam 1) se han roto.
7. La cepa de la reivindicación 6, que es WIL#100. lAalplApyr5 o WIL#100.1AalplAchilApyr5.
8. Un método para la producción homologa y/o heteróloga de una proteina pura con una pureza de más de 75%, que comprende expresar un gen que codifica la proteina en la cepa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Un método para la producción de mezclas de proteína artificial que comprende expresar genes que codifican cada una de las proteínas en una cepa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Un método para selección simplificada de cepas que expresan funciona lmente una enzima deseada mediante la aplicación de cepas como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
11. Una secuencia promotora aislada adecuada para el control transcripcional de la expresión genética en Chrysosporium lucknowense, seleccionada del grupo que consiste de f. la promotora chil(0.8) que comprende la secuencia de nucleótidos de SÉQ ID NO 25, g. la promotora chil(1.8) que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 26, h. la promotora hexl que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 27, i. la promotora xyl6 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 28, y j. la promotora gl a que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 29 o una parte transcripcionalmente activa de las mismas .
12. Un gen quimérico comprendiendo la secuencia promotora de la reivindicación 11 ¡.
13. Una celúla huésped comprendiendo la secuencia promotora aislada de la reivindicación 11 o el gen quimérico de la reivindicación 12.
14. Un método para aislar una cepa de huésped fúngico de Chrysosporium lucknowense en donde la secreción de proteasa y celulosa es menor a 20% de la secreción de proteasa de la cepa Chrysosporium lucknowense UV18-25, comprendiendo las etapas de (i) colocar Chrysosporium lucknowense en placas de celulosa hinchada ácida (ASC), (ii) seleccionar al menos una colonia que muestra una zona de despeje de celulosa reducida, (iii) colocar la cepa seleccionada en la etapa (ii) en placas de leche descremada, y (iv) seleccionar al menos una colonia que muestra una degradación de proteina reducida halo.
15. El método según la reivindicación 14, comprendiendo además la etapa de mutagénesis antes de las etapas (i) y/o (iii) . ! RESUMEN La presente invención proporciona un nuevo sistema de producción fúngica que comprende una cepa de huésped fúngico de Chrysosporium lucknowense en donde la secreción de celulasa endógena es menor a 20% de la secreción de celulasa endógena de la cepa Chrysosporium lucknowense UV 18-25. Preferentemente, también la secreción de proteasa endógena, ß-glucanasa endógena y celobiohidrolasa endógena es menor a 20% de la secreción de la cepa Chrysosporium lucknowense UV 18-25. Además, se proporcionan cepas de huésped fúngico en donde diversos genes se han roto. De acuerdo a otro aspecto de la invención, se han descrito un método para la producción homologa y/o heteróloga de una proteina pura con una pureza de más de 75%, comprendiendo la expresión de un gen que codifica dicha proteina en las cepas de acuerdo a la invención. Además, también se ha descrito un método para la producción de mezclas de proteina artificial que comprende expresar un gen que codifica cada una de dichas proteínas en una cepa de acuerdo a la invención. Finalmente, también se proporciona un método para la selección simplificada de cepas que expresan funcionalmente una enzima deseada mediante la aplicación de dichas cepas.
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