MXPA01003462A - Sistema de transformacion en el campo de los huespedes fungosos filamentosos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un sistema de transformación novedoso en el campo de los huéspedes fungosos filamentosos para expresar y secretar las proteínas o polipéptidos heterólogos. La invención también cubre un proceso para la producción de cantidades grandes del polipéptido o la proteína de una manera, económica. Elsistema comprende una cepa fungosa transformada o transfectada del género Chrysosporium, más particularmente de Chrysosporium lucknowense y los mutantes o derivados de los mismos. La invención también abarca los transformantes que contienen las secuencias de codificación de Chrysosporium, asícomo las secuencias de regulación de la expresión de los genes de Chrysosporium.

Description

SISTEMA DE TRANSFORMACIÓN EN EL CAMPO DE LOS HUESPEDES FUNGOSOS FILAMENTOSOS Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a un sistema de transformación novedoso en el campo de los huéspedes fungosos filamentosos para expresar y secretar las proteínas heterólogas o los polipéptidos. La invención también abarca un proceso para producir grandes cantidades de polipéptidos de una manera económica. El sistema comprende una cepa fungosa transformada o transfectada del género Chrysosporium, más particularmente de Chrysosporium lucknowense y los mutantes o derivados de la misma. La invención también cubre los transformantes que contienen las secuencias de codificación de Chrysosporium. Las cepas de Chrysosporium mutantes novedosas se describe que son enzimas novedosas de la misma.

Antecedentes de la Invención Un número de huéspedes para la expresión de los genes y los métodos de transformación han sido descritos en el arte previo. Las bacterias son mencionadas frecuentemente Ref.128597 por ejemplo Escherichia coli. La E. coli sin embargo es un microorganismo incapaz de la secreción de un número de proteínas o polipéptidos y como tal es indeseable como la célula huésped para la producción de la proteína o el polipéptido a nivel industrial. Una desventaja adicional de E. coli, la cual es válida también para las bacterias en general, es que los procariotas no pueden proveer las modificaciones adicionales requeridas para numerosas proteínas eucarióticas o polipéptidos que van a ser producidos en una forma activa. La glicosilación de las proteínas y el plegado apropiado de las proteínas son ejemplos de procesamiento requeridos para asegurar que un polipéptido o proteína activa sean producidos. Para asegurar tal procesamiento algunas veces se pueden utilizar células de mamífero; sin embargo, la desventaja de tales células es que las mismas frecuentemente son difíciles de mantener y requieren medios costosos. Tales sistemas de transformación por lo tanto no son prácticos para la producción de las proteínas o polipéptidos a nivel industrial. Los mismos pueden ser eficientes en el costo para los compuestos farmacéuticos de costo muy elevado que requieren cantidades relativamente bajas, pero no ciertamente para enzimas industriales. Se ha desarrollado un número de sistemas de expresión de los hongos por ejemplo de Aspergillus niger, Aspergillus awamori , Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei . Se ha sugerido un número de otros sistemas pero por varias razones no han encontrado una aceptación o uso muy extendido. En términos generales el huésped ideal debe satisfacer un gran número de criterios: El huésped ideal debe ser fermentado fácilmente utilizando un medio económico. El huésped ideal debe utilizar el medio eficientemente.

El huésped ideal debe producir el polipéptido o la proteína con un rendimiento elevado, es decir debe exhibir una relación de proteína con respecto a la masa elevada. El huésped ideal debe ser capaz de la secreción eficiente de la proteína o polipéptido. El huésped ideal debe hacer posible el aislamiento y purificación facilitada de la proteína o polipéptido deseado.

El huésped ideal debe procesar la proteína o el polipéptido deseado de tal modo que el mismo sea producido en una forma activa que no requiera la activación o pasos de modificación adicionales. - El huésped ideal debe ser transformado fácilmente. El huésped ideal debe permitir que una amplia gama de elementos reguladores de la expresión sea utilizada asegurando por consiguiente una facilidad de aplicación y versatilidad.

El huésped ideal debe permitir el uso de marcadores seleccionables fácilmente que sean de uso económico. El huésped ideal debe producir agentes de transformación estables. - El huésped ideal debe permitir el cultivo bajo condiciones no perjudiciales para la proteína o polipéptido expresado, por ejemplo de viscosidad baja, de esfuerzo cortante bajo. Los sistemas fungosos que todavía no encuentra un uso extendido se describen por ejemplo en la Patente US No. 5,578,463 por Ber a y colaboradores que sugiere Neurospora , Podospora , Endothia , Mucor, Cochoibolus y Pyricularia, junto con Aspergillus y Trichoderma . Sin embargo solo se proporcionan ilustraciones de la transformación y expresión para Aspergillus y Trichoderma y ningún detalle es provisto para cualquiera de los otros huéspedes sugeridos. La Patente WO 96/02653 y las Patentes US Números 5,602,004, 5,604,129 y 5,695,985 de Novo Nordisk describen las desventajas de los sistemas de Aspergill us y Tri choderma y sugiere las condiciones de cultivo para otros hongos que pueden ser más adecuadas para la producción de proteínas a gran escala. Los únicos ejemplos provistos para cualesquiera cultivos transformados son aquellos de las cepas Myceliophtora thermophila , Acremonium alabamense, Thielavia terrestris y Sporotri chum cellulophilum . La cepa de Sporotrichum se reporta que sufre una lisis y produce pigmentos verdes bajo las condiciones de fermentación que no conducen a tales resultados para las otras cepas. Un mutante no esporulante de Thielavia terrestris se describe que es el organismo de elección en virtud de su morfología. Sin embargo también se estableció que la eficiencia de protoplastificación de Thielavia y Acremonium (por lo cual la cepa de Acremoni um utilizada fue el estado imperfecto de la cepa Thielavia utilizada) es baja y que la higromicina no fue útil como un marcador de la selección. Un gran número de otros ha sugerido que son potencialmente útiles en virtud de su morfología pero ninguna transformación de las mismas ha sido descrita. Las cepas sugeridas son Corynascus, Thermoascus, Chaetomium, Ctenomyces, Scytalidium y Talaromyces . Los huéspedes transformados son mencionados como solamente productores de niveles bajos de la xilanasa de Humicola introducida con la Thielavia que produce la cantidad más baja; sin embargo, la información es ambigua y podría inferirse realmente que Thielavia fue la mejor modalidad. La nomenclatura de esta referencia está basada en los nombres de ATCC de Industrial Fungi de 1994. Por consiguiente es evidente que no se logró un grado elevado de expresión heterólogo y que en efecto ninguna correlación positiva podría ser derivada entre la morfología postulada y el grado de expresión. Si se pudiera establecer alguna correlación, la misma probablemente sería negativa. De acuerdo con la clasificación fungosa del ATCC de 1996 el Sporotrichum thermophilum ATCC 20493 es una cepa de Myceliophthora thermophila . Comúnmente la cepa es todavía identificada como Myceliophthora thermophila . La impredecibilidad del arte es evidente a partir de las descripciones recientes. También Allison y colaboradores (Curr. Genetics 21:225-229, 1992) describe la transformación de Humicola grisea var. Thermoidea utilizando el método del acetato de litio y una secuencia de codificación de la enzima de Humicola, pero ningún reporte de la expresión de la proteína heteróloga a partir de tal cepa ha sido provisto. En 1997 una patente expedida a Hawaii Biotechnology Group para Neurospora transforma la expresión del péptido de mamífero tal como la quimosina. La transformación del Neurospora crassa auxotrófico ocurrió con los esferoplastos. Las regiones reguladoras transcripcionales endógenas fueron introducidas y la cotransformación fue llevada a cabo. Nada es mencionado que se relacione con otros huéspedes y otros protocolos de transformación. Nada es aparente de la descripción que se refiere al grado de expresión. Es problemático si el grado de expresión es elevado, porque las inmunotécnicas (las cuales son útiles para detectar cantidades pequeñas de la proteína) son las únicas técnicas utilizadas para ilustrar la presencia de la proteína. Ningún aislamiento real de la proteína es descrito. WO 97/26330 de Novo Nordisk sugiere un método de obtención de los mutantes de las células originales fungosas filamentosas que tienen una propiedad mejorada para la producción del polipéptido heterólogo. El método comprende encontrar primero una morfología alterada específica seguido por la evaluación ya sea si un agente de transformación produce más polipéptidos heterólogos que el padre u original. El método es ilustrado solamente para las cepas del Fusari um A3/5 y de Aspergillus oryzae. El método es sugerido para que sea aplicable para Aspergillus, Trichoderma , Thielavia , Furarium, Neurospora, Acremonium, Tolyplocadium, Humicola , Scytalidium, Myceliophthora o Mucor. Como se estableció anteriormente la impredecibilidad en el arte y también la impredecibilidad del método de la solicitud citada no proporcionan una enseñanza aplicable generalmente con una esperanza de éxito razonable.

Descripción detallada de la invención Ahora se describe un sistema de expresión fungosa alternativo con la simplicidad del uso de los Aspergilli y Trichoderma mencionados anteriormente que satisfacen los requerimientos anteriores. El nuevo sistema no ha sido enseñado o sugerido en la técnica previa. El nuevo sistema de acuerdo con la invención proporciona las ventajas adicionales de que las velocidades de transformación son más elevadas que aquellas para el sistema de Trichoderma reesei utilizado frecuentemente. Además de que las condiciones del cultivo ofrecen el bono o recompensa adicional de que son ventajosos para el polipéptido expresado. En donde se haga referencia en esta especificación y en las reivindicaciones anexas a los "polipéptidos" o los "polipéptidos de interés" como los productos del sistema de expresión de la invención, este término también comprende las proteínas, es decir los polipéptidos que tienen una función particular y/o una estructura secundaria y/o terciaria. El pH del medio de cultivo puede ser neutral o alcalino, por consiguiente ya no se somete la proteína o el polipéptido producido al pH ácido agresivo y potencialmente inactivador. También es posible cultivar a un pH ácido tal como pH 4 para los casos en donde la proteína o el polipéptido es más adecuado para un medio ambiente ácido. Un cultivo adecuado puede ocurrir a un pH de entre 4.0-10.0. Sin embargo existe una preferencia para un pH neutral a alcalino cuando la cepa del huésped exhibe un mejor crecimiento a tal pH, por ejemplo entre 6 y 9. El crecimiento a temperatura alcalina el cual puede ser desde pH 8 hacia arriba y puede aún ser tan elevado como 10, también es una buena alternativa para algunos casos. También la temperatura del cultivo de tales cepas del huésped es ventajosa con respecto a la estabilidad de algunos tipos del polipéptido producido. La temperatura del cultivo es adecuadamente a una temperatura de 25-43 °C. Una temperatura en el intervalo desde 40 °C hacia abajo hasta 23 °C o 30 °C también es aplicada ventajosamente. Claramente tales condiciones son de interés particular para la producción de los polipéptidos del mamífero. La temperatura seleccionada dependerá de la efectividad del costo del cultivo y de la sensibilidad del polipéptido o de la cepa del cultivo. Las condiciones serán determinadas por la persona experta sin una carga indebida sobre la base de caso por caso, como es común en la técnica. También se ha averiguado que la relación de la biomasa con respecto a la viscosidad y la cantidad de la proteína producida es excedentemente favorable para el huésped de acuerdo con la invención. Se han llevado a cabo comparaciones con el Trichoderma longibrachia tum (inicialmente conocido también como Trichoderma reesei ) y con el Aspergillus niger. El Trichoderma longibrachiatum dio 2.5-5 g/l de la biomasa, el Aspergillus niger dio 5-10 g/l de la biomasa y el huésped de acuerdo con la invención dio 0.5-1 g/l de la biomasa bajo sus condiciones optimizadas respectivas. Esto ofreció por consiguiente una mejora de 5-10 veces sobre las cepas utilizadas comercialmente. Estas cepas comerciales son las cepas las cuales son consideradas por sí mismas en la técnica que van a ser productores elevados de las proteínas y las mismas son utilizadas exitosamente para la producción de las proteínas comerciales. Las cepas han sido cultivadas bajo sus condiciones óptimas desarrolladas y se extienden de manera viable a los fermentadores comerciales a gran escala. Las mismas cepas fueron utilizadas para ilustrar una mejora enorme en los valores de la viscosidad para los cultivos del huésped de acuerdo con la invención. Al final del proceso de fermentación la Trichoderma longibrachia tum dio un valor de 200-600 cP (Centipoises), el Aspergillus niger dio un valor de 1500-2000 cP y el huésped de acuerdo con la invención dio un valor abajo de 10 cP. Esto proporcionó por consiguiente al menos una mejora de 20-200 veces para los valores de la viscosidad sobre las cepas utilizadas comercialmente. Un aspecto adicional completamente sorprendente fue que los niveles de la proteína determinados para las células huésped de acuerdo con la invención fueron mucho más elevados que para las cepas de Aspergilli y Tri choderma reesei comerciales, aún con los nivelas de viscosidad y biomasa sorprendentemente bajos mencionados anteriormente. En resumen una facilidad para utilizar el sistema de transformación y el sistema de expresión, mejorados, versátiles, con las condiciones de cultivo mejoradas, ha sido introducido por el presente. Las cepas de acuerdo con la invención producen niveles de proteína sorprendentemente más elevados bajo estas condiciones mejoradas y además las mismas lo hacen en un tiempo más breve en el fermentador. La invención objeto está dirigida a las cepas de Chrysosporium mutantes que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifican una proteína o polipéptido heterólogo, la secuencia del ácido nucleico está enlazada operativamente a una región de regulación de la expresión y opcionalmente a una secuencia de codificación de la señal de secreción y/o a una secuencia de codificación de la proteína portadora. Preferentemente una cepa recombinante de acuerdo con la invención secretará el polipéptido de interés. Esto evitará la necesidad de romper o alterar la célula para aislar el polipéptido de interés y también minimiza el riesgo de degradación del producto expresado por los otros componentes de la célula huésped. El Chrysosporium puede ser definido por la morfología consistente con aquella descrita en Barnett y Hunter 1972, Illustrated Genera of Imperfect Fungi, 3/a. Edición de Burgess Publising Company. Otras fuentes que proporcionan detalles que se refieren a la clasificación de los hongos del género Chrysosporium son conocidos por ejemplo de la Clasificación de Sutton (Van Oorschot, C.A.N. (1980) "A revisión of Chrysosporium and allied genera" en Studies in Mycology No. 20 del CBS en Baarn The Netherlands pl-36) . El CBS es uno de los institutos depositarios del Tratado de Budapest. De acuerdo con estas enseñanzas el género Chrysosporium cae dentro de la familia Moniliaceae la cual pertenece al orden Hyphomycetales. Los criterios que pueden ser utilizados son los siguientes: 1. Signos o señales del orden Hyphomycetales : Los conidios son producidos directamente sobre el micelio, sobre las células esporaginosas separadas o sobre las conidiosporas distintas. 2. Signos o señales de la familia Moniliaceae Tanto los conidios como las conidiosporas (si están presentes) son transparentes o altamente coloreados; las conidiosporas son únicas o están en grupos flojos. 3. Signos o señales del género Chrysosporium Corda 1833: Las colonias están usualmente en dispersión, son blancas, algunas veces de color crema, de color café tenue o amarillas, del tipo del fieltro o pulvurentas. Las hifas son en su mayoría transparentes y de paredes lisas, con una ramificación más o menos ortotópica, irregular. Las hifas fértiles exhiben una diferenciación pequeña o ninguna diferenciación. Los conidios son terminales y laterales, tálicos, llevados todos sobre las hifas, sésiles o sobre protuberancias cortas o ramificaciones laterales, subhialina o subtransparente o amarillo tenue, de pared gruesa o delgada, subglobular, claviforme, piriforme, orobovoide, de 1 celda o célula, raramente de 2 celdas o células, truncadas. Los conidios intercalados están presentes algunas veces, son solitarios, ocasionalmente catenarios, subtransparentes o de color amarillo tenue, más anchos que las hifas de soporte; normalmente de 1 celda o célula, truncados en ambos extremos. Las Clamidosporas están presentes ocasionalmente. Otra fuente que proporciona información sobre la nomenclatura fungosa es ATCC (US) . Su sitio de la red es http://www.atcc.org. El CBS también tiene un sitio de la red (Http//www. cbs. knaw.nl) que proporciona información relevante. El VKM en Moscú también es una fuente confiable de tal información; la dirección de e-mail para VKM es http://www.bdt.org.br.bdt.msdn.vkm/general. Otra fuente es http/NT. ars-grin.gov/ . fungaldatabases. Todas estas instituciones pueden proporcionar enseñanzas sobre las características distintivas de un Chrysosporium. Las cepas definidas que son de Myceliophthora thermophila no se considera que definen las cepas de Chrysosporium de acuerdo con la definición de la invención.

En el pasado ha existido una confusión considerable sobre la nomenclatura de algunas cepas de Myceliophthora .

Preferentemente los Chrysosporium de acuerdo con la invención son aquellos los cuales son claramente distinguibles como tales y no pueden ser confundidos con Myceliophthora , Sporotri chum o Phanerochaete chrysosporium. Las siguientes cepas están definidas como Chrysosporium pero la definición de Chrysosporium no está limitada a estas cepas; C. botryoides, C. carmichaelii , C. crassi tunica tum, C. europae, C. evolceannui , C. farini cola , C. fastidium, C. filiforme, C. georgiae, C. gl obiferum, C. globiferum var. Articulatum, C. globiferum var. ni veum, C. hirundo, C. hispanicum, C. holmii , C. indicum, C. inops, C. keratinophilum, C. kreiselii , C. kuzurovianum, C. lignorum, C. loba tum, C. lucknowense, C. lucknowense Garg 27K, C. médium, C. médium var. Spissescens, C. mephi ticum, C. merdarium, c . merdarium var. Roseum, C. minor, C. pannicola , C. parvum, C. parvum var. crescens, C. pilosum, C. pseudomerdarium, C. pyriformis, C. queenslandi cum, C. sigleri , C. sulfureum, C. synchronum, C. tropicum, C. undula tum, C. vallenarense, C. vespertilium, C. zona tum. El C. lucknowense forma una de las especies de Chrysosporium que ha ocasiona un interés particular elevado porque el mismo ha provisto un productor natural elevado de proteínas de celulasa (WO 98/15633 y la Patente US 5,811,381 relacionada) . Las características de esta Chrysosporium lucknowense son: Las colonias logran 55 mm de diámetro sobre agar de glucosa Sabouraud a los 14 días, son de color cremoso, del tipo del fieltro y apelusadas; densas y de 3-5 mm de altura; los márgenes son definidos, regulares, y fimbriados; de color amarillo tenue inverso hasta crema. Las hifas son transparentes, de paredes lisas y delgadas, poco ramificadas. Las hifas aéreas son en su mayoría fértiles y septadas estrechamente, de 1-3.5 mm de anchura. Las hifas sumergidas son infértiles, de aproximadamente 1-4.5 mm de anchura, con las hifas más delgadas que frecuentemente son retorcidas. Los conidios son terminales y laterales, en su mayoría sésiles o sobre protuberancias frecuentemente cónicas, cortas o sobre ramificaciones laterales cortas. Los conidios son solitarios pero en proximidad estrecha entre sí, 1-4 conidios se desarrollan sobre una célula hifal, subtransparente, de paredes absolutamente delgadas y lisas, en su mayoría subglobulares, también claviformes, orobovoides, de 1 celda o célula, de 2.5 x 11 x 1.5-6 mm, con cicatrices básales amplias (1-2 mm) . Los conidios intercalados están ausentes. Las clamidosporas están ausentes. Los depósitos ATCC 44006, CBS 251.72, CBS 143.77 y CBS 272.77 son ejemplos de las cepas de Chrysosporium lucknowense y otros ejemplos son provistos en WO 98/15633 y US 5,811,381. Una cepa adicional fue aislada de estas especies con una capacidad de producción aún más elevada para las celulasas. Esta cepa es llamada Cl por su notación interna y se depositó en el Depósito Internacional del All Russian Collection de microorganismos de la Academia Rusa de Ciencias Bakrushina Street 8, Moscú, Rusia 113184 el 29 de agosto de 1996, como un depósito de acuerdo con el Tratado de Budapest y se le asignó el Número de Acceso VKM F-3500D. El mismo es llamado Chrysosporium lucknowense Garg 27K. Las características de la cepa Cl son como sigue: Las colonias se hicieron crecer hasta aproximadamente 55-66 mm de diámetro de tamaño sobre agar de papa-dextrosa en aproximadamente 7 días; son de color blanco cremoso, del tipo del fieltro, de 2-3 mm de altura en el centro, los márgenes son definidos, regulares, fimbriados; de color cremoso, tenue, opuesto. Las hifas son transparentes, de paredes lisas y delgadas, con pocas ramificaciones. Las hifas aéreas son fértiles, septadas, de 2-3 mm de anchura. Las hifas sumergidas son infértiles. Los conidios son terminales y laterales; sésiles o sobre ramificaciones laterales cortas; están ausentes; solitarios, pero en proximidad estrecha entre sí, transparentes, de paredes delgadas y lisas, subglobulares, claviformes u obovoides, de 1 celda o célula, de 4-10 mm. Las clamidosporas están ausentes. Los conidios intercalados están ausentes. El método de aislamiento de la cepa Cl se describe en WO 98/15633 y US 5,811,381. Las cepas que exhiben tal morfología están incluidas dentro de la definición de Chrysosporium de acuerdo con la invención. También están incluidos dentro de la definición de Chrysosporium las cepas derivadas de los predecesores de Chrysosporium que incluyen aquellos que han mutado algo ya sea naturalmente o por mutagénesis inducida. En particular la invención cubre los mutantes de Chrysosporium obtenidos por mutagénesis inducida, especialmente por una combinación de irradiación y mutagénesis química. Por ejemplo la cepa Cl fue mutagenizada sometiéndola a la luz ultravioleta para generar la cepa UV13-6. Esta cepa fue mutada subsiguientemente con N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina para generar la cepa NG7C-19. Esta última cepa a su vez fue sometida a mutación por la luz ultravioleta conduciendo a la cepa UV18-25. Durante este proceso de mutación las características morfológicas han variado algo en el cultivo en el líquido o sobre las placas así como bajo el microscopio. Con cada mutagénesis sucesiva los cultivos mostraron menos de la apariencia apelusada y del tipo del fieltro sobre las placas que son descritas como que son característicos del Chrysosporium, hasta que las colonias lograron una apariencia plana y enmarañada. Un pigmento café observado con la cepa del tipo silvestre en algunos medios también fue menos prevalecientes en las cepas mutantes. En el cultivo líquido el mutante UV18-25 fue apreciablemente menos viscoso que la cepa Cl del tipo silvestre y los mutantes UV13-6 y NG7C-19. Aunque todas las cepas mantuvieron las características microscópicas amplias del Chrysosporium, las micelas llegaron a ser más estrechas con cada mutación sucesiva y con la fragmentación distinta de UV18-25 que pudo ser observada. Esta fragmentación de los micelios es probable que sea la causa de la viscosidad inferior asociada con los cultivos de UV18-25. La capacidad de las cepas para esporularse se redujo con cada paso mutagénico. Lo anterior ilustra que para una cepa que pertenece al género Chrysosporium existe algo de abatamientoa partir de la definición morfológica anterior. En cada paso de mutación la producción de la celulasa y las proteínas extracelulares también se ha incrementado adicionalmente aunque varias mutaciones condujeron a una reducción de la expresión de la proteasa. Los criterios con los cuales la taxonomía fungosa puede ser determinada están disponibles de CBS, VKMF y ATCC por ejemplo. En particular la forma anamórfica del Chrysosporium se ha encontrado que va a ser adecuada para la aplicación de la producción de acuerdo con la invención. El metabolismo del anamorfo lo hace extremadamente adecuado para un alto grado de expresión. Un teleomorfo también debe ser adecuado porque la composición genética de los anamorfos y los teleomorfos es idéntica. La diferencia entre el anamorfo y el teleomorfo es aquella que está en el estado asexual y la otra en el estado sexual. Los dos estados exhiben una morfología diferente bajo ciertas condiciones. Es preferible utilizar cepas de Chrysospori um no tóxicas de las cuales ya se conoce un número en el arte porque esto reducirá los riesgos para el medio ambiente durante la producción a gran escala y simplifica los procedimientos de reducción con la reducción concomitante en los costos. Una región de regulación de la expresión es una secuencia de ADN reconocida por la cepa de Chrysosporium del huésped para la expresión. La misma comprende una secuencia promotora enlazada operativamente a la secuencia del ácido nucleico que codifica el polipéptido que va a ser expresado. El promotor está enlazado de tal modo que la colocación frente al codón de iniciación de la secuencia que va a ser expresada permita la expresión. La secuencia promotora puede ser constitutiva o inducible. Cualquier secuencia reguladora de la expresión o combinación de la misma capaz de permitir la expresión de un polipéptido a partir de una cepa de Chrysosporium es contemplada. La secuencia de regulación de la expresión es adecuadamente una región de regulación de la expresión fungosa, por ejemplo una región de regulación del ascomiceto. Adecuadamente la región de regulación de la expresión fungosa es una región de regulación de cualquiera de los siguientes géneros de hongos: Aspergillus, Trichoderma , Chrysosporium, Hansenula , Mucor, Pichia , Neurospora , Tolypocladium, Rhizomucor, Fusarium, Peni cillium, Saccharomyces, Talaromyces o las formas asexuales alternativas semejantes a Emericella , Hypocrea por ejemplo el promotor de Celobiohidrolasa de Trichoderma, el promotor de glucoamilasa de Aspergill us, el promotor de deshidrogenasa del fosfato de gliceraldehido de Aspergillus, la alcohol deshidrogenasa A y el promotor de la alcohol deshidrogenasa R de Aspergillus, el promotor de amilasa TAKA de Aspergillus, el fosfoglicerato y los promotores de control de la ruta cruzada de Neurospora, el promotor de proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei el promotor de lipasa de Rhizomucor miehei y el promotor de beta-galactosidasa de Penicillium canescens. Una secuencia de regulación de la expresión del mismo género que la cepa huésped es extremadamente adecuada, porque la misma es más probable que esté adaptada específicamente al huésped específico. Por consiguiente preferentemente la secuencia de regulación de la expresión es una de una cepa de Chrysospori um.

Se han encontrado cepas particulares del Chrysosporium que expresan proteínas en cantidades extremadamente grandes y las secuencias que regulan la expresión natural de estas cepas son de interés particular. Estas cepas están designadas internamente como la cepa Cl de Chrysosporium, la cepa UV13-6, la cepa NG7C-19 y la cepa UV18-25. Las mismas han sido depositadas de acuerdo con el Tratado de Budapest en el Depósito All Russian Collection (VKM) en Moscú. La cepa Cl del tipo silvestre fue depositada de acuerdo con el Tratado de Budapest con el número VKM F-3500 D, fecha de depósito 29-08-1996, el mutante UV13-6 de Cl fue depositado con el número VKM F-3632 D, y la fecha de depósito 02-09-1998, el mutante NG7c-19 de Cl fue depositado con el número VKM F-3633 D y la fecha de depósito 02-09-1998 y el mutante UV18-25 de Cl se depositó con el número VKM F-3631 y la fecha de depósito 02-09-1998. Preferentemente una región que regula la expresión que hace posible la expresión elevada en el huésped seleccionado es aplicada. Esta también puede ser una región que regula la expresión elevada derivada de un huésped heterólogo, tal como la que es bien conocida en el arte. Los ejemplos específicos de las proteínas que se sabe que van a ser expresadas en grandes cantidades y por consiguiente proporcionar secuencias que regulan la expresión adecuada para la invención son, sin estar limitadas a ellas, la hidrofobina, proteasa, amilasa, xilanasa, pectinasa, esterasa, beta-galactosidasa, celulasa (por ejemplo endoglucanasa, celobiohidrolasa) y poligalacturonasa. La producción elevada ha sido averiguada en condiciones de fermentación tanto de estado sólido como sumergidas. Los ensayos para evaluar la presencia o producción de tales proteínas son bien conocidas en la técnica. Los catálogos de Sigma y Megazyme proporcionan por ejemplo, ejemplos numerosos. Megazyme está localizado en Bray Bussines Park, Bray, County Wicklow en Irlanda. Sigma Aldrich tiene muchos afiliados en todo el mundo por ejemplo USA P.O. Box 14508 St. Louis Missouri. Para la celulasa se hará referencia a los ensayos disponibles comercialmente tales como los ensayos de CMCase, los ensayos endoviscométricos, los ensayos de Avicelasa, los ensayos de beta-glucanasa, los ensayos de RBBCMCase, los ensayos de Cellazyme. Las alternativas son bien conocidas por una persona experta en la técnica y pueden ser encontradas a partir de la literatura general que se refiere al sujeto y tal información se considera incorporada aquí para referencia. A manera de ejemplo se hará referencia a "Methods in Enzymology" volumen 1, 1995 directo hasta los volúmenes 297-299 de 1998. Adecuadamente una secuencia promotora de Chrysosporium es aplicada para asegurar un buen reconocimiento del mismo por el huésped.

Se ha encontrado que las secuencias que regulan la expresión heteróloga trabajan tan eficientemente en Chrysosporium como las secuencias de Chrysosporium naturales. Esto permite que las construcciones y vectores bien conocidos sean utilizados en la transformación de Chrysosporium así como ofrecen numerosas otras posibilidades para la construcción de vectores que hacen posibles buenas velocidades de expresión en este huésped de secreción y expresión novedosa. Por ejemplo las técnicas de transformación de Aspergillus estándares pueden ser utilizadas como se describió por ejemplo por Christiansen y colaboradores en Bio/Technol. 6:1419-1422 (1988). Otros documentos que proporcionan detalles de los vectores de transformación de Aspergillus, por ejemplo las patentes U.S. Nos. 4,816,405, 5,198,345, 5,503,991, 5,364,770 y 5,578,463, EP-B-215.594 (también para Trichoderma ) y sus contenidos, son incorporadas aquí para referencia. Como se han averiguado velocidades de expresión extremadamente elevadas para la celulasa, para las cepas de Chrysosporium, las regiones de regulación de la expresión de tales proteínas son preferidas particularmente. Se hará referencia para los ejemplos específicos a las cepas de Chrysosporium depositadas mencionadas previamente. Una construcción de ácido nucleico que comprende una región reguladora de la expresión del ácido nucleico del Chrysosporium, preferentemente de Chrysosporium lucknowense o un derivado del mismo forma una modalidad separada de la invención como lo hace la cepa de Chrysosporium mutante que comprende tal elemento enlazado operativamente a un polipéptido que va a ser expresado. Adecuadamente tal construcción del ácido nucleico será una región reguladora de la expresión de Chrysosporium asociada con la expresión de la celulasa o la xilanasa, preferentemente la expresión de la celobiohidrolasa, más específicamente la expresión de una celobiohidrolasa de 55 kDa. Las secuencias promotoras de Chrysosporium de una endoglucanasa de 25 kDa (C1-EG5) y de una endoglucanasa de 43 kDa (C1-EG6) , en donde los pesos moleculares son determinados de acuerdo con SDS PAGE (con los pesos moleculares de acuerdo con los datos de la secuencia de aminoácidos que son de 21.9 kDa y de 39.5 kDa), son provistos a manera de ejemplo. Por consiguiente, las secuencias promotoras de Chrysosporium de la hidrofobina, proteasa, amilasa, xilanasa, esterasa, pectinasa, beta-galactosidasa, celulasa (por ejemplo la endoglucanasa, la celobiohidrolasa) y la poligalacturonasa se considera también que caen dentro del alcance de la invención. Cualquiera de los promotores o las regiones reguladoras de la expresión de las enzimas descritas en las Tablas A o B pueden ser expresadas adecuadamente. La secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención puede ser obtenida adecuadamente de una cepa de Chrysosporium de acuerdo con la invención, tal cepa está definida en cualquier parte en la descripción. La manera en la cual las secuencias promotoras pueden ser determinadas son numerosas y bien conocidas en el arte. Los experimentos de deleción de la nucleasa de la región corriente arriba del codón ATG al inicio del gen relevante proveerá tal secuencia. También por ejemplo el análisis de las secuencias de consenso puede conducir al descubrimiento de un gen de interés. Utilizando técnicas de hibridación y amplificación, un experto en la técnica puede llegar fácilmente a las secuencias promotoras correspondientes. Las secuencias promotoras de las endoglucanasas de Cl fueron identificadas de esta manera, clonando los genes correspondientes, y se dan en las SEC ID No.'s 2 (EG5) y 1 (EG6) , respectivamente. Otros promotores preferidos de acuerdo con la invención son el promotor de celobiohidrolasa de 55 kDa (CBH1) y los promotores de xilanasa (XylF) de 30 kDa, porque las enzimas son expresadas a un nivel elevado por sus propios promotores. Las secuencias promotoras correspondientes pueden ser identificadas de una manera directa por clonación como se describe posteriormente para los promotores de endoglucanasa, utilizando la información de la secuencia parcial dada en la SEC ID No. 4 (para CBH1) y SEC ID No. 5 (para XylF), respectivamente. Los promotores de las enzimas degradantes de los carbohidratos de Chrysosporium, especialmente los promotores de Cl, pueden ser utilizados ventajosamente para expresar los polipéptidos deseados en un organismo huésped, especialmente un organismo fungoso u otro organismo huésped microbiano. Las secuencias promotoras que tienen al menos 60%, preferentemente al menos 70%, más preferentemente al menos 80% de identidad de la secuencia de nucleótidos con la secuencia dada en las SEC ID No.'s 1 y 2, o con las secuencias encontradas para otros genes de Chrysosporium, son parte de la presente invención. Para las modalidades particulares de la cepa recombinante y la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, se hará referencia a los ejemplos. También se hará referencia a las cepas recombinantes del arte previo que describen secuencias promotoras de expresión elevada, en particular aquellas que proveen la expresión elevada en los hongos por ejemplo tales como los que se describen para Aspergillus y Tri choderma . El arte previo proporciona un número de regiones reguladoras de la expresión para su uso en Aspergillus por ejemplo la patente US 5,252,726 de Novo y US 5,705,358 de Unilever. Los contenidos de tal arte previo son incorporados aquí para referencia. El gen de hidrofobina es un gen fungoso que es expresado altamente. Por consiguiente se sugiere que la secuencia promotora de un gen de hidrofobina, preferentemente de Chrysosporium, puede ser aplicada adecuadamente como una secuencia reguladora de la expresión en una modalidad adecuada de la invención. Las secuencias de los genes de Trichoderma reesei y Tri choderma harzianum para la hidrofobina ya han sido descritas por ejemplo en el arte previo así como una secuencia de genes para Aspergillus fumiga tus y Aspergill?s nidulans y la información de las secuencias relevantes es incorporada aquí para referencia (Muñoz y colaboradores, Curr. Genet. 1997, 32 (3) :225-230; Nakari-Setala T. y colaboradores, Eur. J. Biochem. 1996 15:235 ( 1-2 ): 248-255, M. Parta y colaboradores, Infect . Immun . 1994 62 (10): 4389-4395 y Stringer M.A. y colaboradores Mol . Mi crobiol . 1995 16 (1) :33-44 ) . Utilizando esta información de la secuencia una persona experta en el arte puede obtener las secuencias de regulación de la expresión de los genes de hidrofobina de Chrysosporium sin experimentación indebida a continuación de las técnicas estándares como se sugirió ya anteriormente. Una cepa de Chrysosporium recombinante de acuerdo con la invención puede comprender una región de regulación de la hidrofobina enlazada operativamente a la secuencia que codifica el polipéptido de interés. Una secuencia de regulación de la expresión también puede comprender adicionalmente un mejorador o un silenciador. Estos también son bien conocidos en el arte y usualmente están localizados a alguna distancia del promotor.

Las secuencias que regulan la expresión también pueden comprenden los promotores con los sitios de unión del activador y los sitios de unión del represor. En algunos casos tales sitios también pueden ser modificados para eliminar este tipo de regulación. Los promotores fungosos filamentosos en los cuales los sitios creA están presentes ya han sido descritos. Tales sitios creA pueden ser mutados para asegurar que la represión de la glucosa que resulta normalmente de la presencia de los sitios no mutados sea eliminada. La patente WO 94/13820 de Gist-Brocades ilustra este principio. El uso de tal promotor hace posible la producción del polipéptido codificado por la secuencia del ácido nucleico regulada por el promotor en la presencia de la glucosa. El mismo principio también es evidente de WO 97/09438. Estos promotores pueden ser utilizados ya sea con o sin sus sitios de creA. Los mutantes en los cuales los sitios creA han sido mutados pueden ser utilizados como secuencias reguladoras de la expresión en una cepa recombinante de acuerdo con la invención y la secuencia de ácidos nucleicos que la misma regula pueden ser expresadas entonces en la presencia de la glucosa. Tales promotores de Chrysosporium aseguran la antirrepresión de una manera análoga a aquella ilustrada en WO 97/09438. La identidad de los sitios creA ya es conocida de la técnica previa. Alternativamente, es posible aplicar un promotor con los sitios de unión de CreA que no han sido mutados en una cepa huésped con una mutación en cualquier parte en el sistema de represión por ejemplo en el propio gen de creA, de modo que la cepa puede, sin importar la presencia de los sitios de unión de creA, producir la proteína o polipéptido en la presencia de la glucosa. Las secuencias terminadoras también son secuencias reguladoras de la expresión y estas están enlazadas operativamente a la terminal o extremo 3' de la secuencia que va a ser expresada. Cualquier terminador fungoso es probable que sea funcional en la cepa de Chrysosporium del huésped de acuerdo con la invención. Los ejemplos son el terminador trpC de A. nidulans (1), el terminador de alfa-glucosidasa de A. niger (2), el terminador de glucoamilasa de A. niger (3), el terminador de carboxil proteasa de Mucor miehei (US 5,578,463) y el terminador de celobiohidrolasa de Tri choderma reesei . Naturalmente, las secuencias terminadoras de Chrysosporium funcionarán en el Chrysosporium y son adecuadas por ejemplo el terminador de EG6. Una cepa de Chrysospori um recombinante adecuada de acuerdo con la invención tiene la secuencia de ácidos nucleicos que va a ser expresada y enlazada operativamente a una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos definida como la secuencia de la señal. Una secuencia de la señal es una secuencia de aminoácidos la cual cuando esté enlazada operativamente a la secuencia de aminoácidos del polipéptido expresado permita la secreción de la misma a partir de los hongos huéspedes. Tal secuencia de la señal puede ser una asociada normalmente con el polipéptido heterólogo o puede ser uno natural con respecto al huésped. También puede ser extranjero o externo con respecto tanto al huésped como al polipéptido. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de la señal debe ser colocada en un marco para permitir la traducción de la secuencia de la señal y del polipéptido heterólogo. Cualquier secuencia de la señal capaz de permitir la secreción de un polipéptido a partir de una cepa de Chrysosporium está contemplada. Tal secuencia de la señal es adecuadamente una secuencia de la señal fungosa, preferentemente una secuencia de la señal del ascomiceto. Los ejemplos adecuados de las secuencias de la señal pueden ser derivados de las levaduras, en general o cualquiera de los siguientes géneros específicos de los hongos: Aspergillus, Trichoderma , Chrysosporium, Pi chia , Neurospora , Rhizomucor, Hansenula , Humi cola , Mucor, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium, Saccharomyces, Talaromyces o las formas secuenciales alternativas de los mismos semejantes a Emeri cella , Hypocrea . Las secuencias de la señal que son particularmente útiles están asociadas frecuentemente de manera natural con las siguientes proteínas, una celobiohidrolasa, una endoglucanasa, una beta-galactosidasa, una xilanasa, una pectinasa, una esterasa, una hidrofobina, una proteasa o una amilasa. Los ejemplos incluyen la amilasa o la glucoamilasa de Aspergillus o Humicola (4), la TAKA amilasa de Aspergill us oryzae, la alfa-amilasa de Aspergillus niger, la carboxil peptidasa de Mucor (US 5,578,463), una lipasa o proteinasa de Rhizomucor miehei , la celobiohidrolasa de Trichoderma (5), la beta-galactosidasa de Penicillium canescens y el factor de correspondencia alfa de S a echa romyees . Alternativamente la secuencia de la señal puede ser de una amilasa o gen de subtilisina de una cepa de Bacillus . Una secuencia de la señal del mismo género que la cepa huésped es extremadamente adecuada porque es más probable que esté adaptada específicamente al huésped específico, por consiguiente de manera preferente la secuencia de la señal es una secuencia de la señal de Chrysosporium. Se han encontrado cepas particulares de Chrysosporium para excretar proteínas en cantidades extremadamente grandes y naturalmente las secuencias de la señal de estas cepas son de interés particular. Estas cepas son designadas internamente como la cepa Cl de Chrysosporium, la cepa UV13-6, la cepa NG7C-19 y la cepa UV18-25. Las mismas han sido depositadas de acuerdo con el Tratado de Budapest como se describe en otra parte en esta descripción. Las secuencias de la señal de los hongos filamentos, la levadura y los bacterias son útiles. Las secuencias de la señal de origen no fungoso también se consideran útiles, particularmente las de bacterias, plantas y mamíferos. Una cepa de Chrysosporium recombinante de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la invención puede comprender además un marcador seleccionable. Tal marcador seleccionable permitirá una selección facilitada de las células transformadas o transfectadas. Un marcador seleccionable frecuentemente codifica un producto del gen que proporciona un tipo específico de resistencia extraña o externa con respecto a la cepa no transformada. Esta puede ser la resistencia a los metales pesados, los antibióticos y los biocidas en general. La prototrofía también es un marcador seleccionable útil de la variedad no antibiótica. Los marcadores seleccionables no antibióticos pueden ser preferidos en donde la proteína o el polipéptido de interés va a ser utilizado en los alimentos o las substancias farmacéuticas con el objeto de acelerar o hacer menos complicada la aprobación reguladora de tal producto. Muy frecuentemente la indicación GRAS es utilizada para tales marcadores. Un número de tales marcadores están disponibles para la persona experta en la técnica. La FDA proporciona por ejemplo una lista de tales marcadores. Los utilizados más comúnmente son los marcadores seleccionables seleccionados del grupo que confiere resistencia un fármaco o que proporcionan alivio contra un defecto nutricional por ejemplo el grupo que comprende la amdS (acetamidasa) , hph (fosfatransferasa de higromicina), pyrG (orotidina-5' -fosfato descarboxilasa), trpC (antranilato sintasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa) , sC (sulfato adeniltransferasa) , bar (fosfinotricina acetiltransferasa) , resistencia al glufosinato, niaD (nitrato reductasa) , un gen de resistencia a la bleomicina, más específicamente Sh ble, resistencia a la sulfonilurea por ejemplo la mutación ilvl de la acetolactato sintasa. La selección también puede ser llevada a cabo en virtud de la cotransformación en donde el marcador de la selección está sobre un vector separado o en donde el marcador de la selección está sobre el mismo fragmento de ácido nucleico que la secuencia de codificación del polipéptido para el polipéptido de interés. Cuando se utilice aquí, el término polipéptido heterólogo es una proteína o polipéptido no expresado y secretado normalmente por la cepa huésped de Chrysosporium utilizada para la expresión de acuerdo con la invención. El polipéptido puede ser de origen animal o vegetal (vertebrado o invertebrado) por ejemplo de origen de mamífero, de pescado, de insecto, o de microorganismo, con la condición de que no ocurra en la cepa huésped. Un mamífero puede incluir el ser humano. Un microorganismo comprende los virus, bacterias, arquebacterias y los hongos, es decir los hongos filamentosos y las levaduras. El manual de Bergey para la Bacterial Determinology (Determinología Bacteriana) proporciona listas adecuadas de bacterias y arquebacterias. Para propósitos farmacéuticos muy frecuentemente existirá una preferencia hacia las proteínas humanas y por consiguiente un huésped recombinante de acuerdo con la invención que forma una modalidad preferida será un huésped en donde el polipéptido es de origen humano. Para propósitos tales como la producción de alimentos adecuadamente el polipéptido heterólogo será de origen animal, vegetal o de algas. Tales modalidades por lo tanto también son consideradas ejemplos adecuados de la invención. Las modalidades alternativas que son útiles también incluyen un polipéptido heterólogo de cualquier origen bacteriano, de levadura, viral, arquebacteriano y fungoso. El origen fungoso es más preferido. Una modalidad adecuada de la invención comprenderá una secuencia de ácido nucleico heteróloga con un uso del codón adaptado. Tal secuencia codifica la secuencia de aminoácidos natural del huésped a partir del cual se deriva la misma, pero tiene una secuencia del ácido nucleico diferente, es decir una secuencia de ácido nucleico en la cual ciertos codones han sido reemplazados por otros codones que codifican el mismo aminoácido pero los cuales son utilizados más fácilmente por la cepa huésped que es utilizada para la expresión. Esto puede conducir a una mejor expresión de la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga. Esta es una práctica común para una persona experta en la técnica. Este uso del codón adaptado puede ser llevado a cabo con base en el uso del codón conocido de origen fungoso frente el uso del codón de origen no fungoso. El mismo también puede estar adaptado más específicamente al uso del codón del propio Chrysosporium. Las similaridades son tales que el uso del codón como se observa en Tri choderma , Humi cola y Aspergillus no debe ser capaz de intercambiar las secuencias de tales organismos sin la adaptación del uso del codón. Los detalles están disponibles para la persona experta que se relacionan con el uso del codón de estos hongos y son incorporados aquí para referencia. La invención no está restringida a las cepas de Chrysosporium recombinantes mencionadas anteriormente, pero también cubre una cepa de Chrysosporium recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína homologa para una cepa de Chrysospori um, la secuencia del ácido nucleico que está enlazada operativamente con una región de regulación de la expresión y la cepa recombinante que expresa más de la proteína que la cepa no recombinante correspondiente bajo las mismas condiciones. En el caso del polipéptido homólogo de interés el mismo es preferentemente una enzima neutral o alcalina semejante a una hidrolasa, una proteasa o una enzima que degrada los carbohidratos como ya se describió aquí en otra parte. El polipéptido también puede ser ácido. Preferentemente la cepa recombinante expresará el polipéptido en cantidades mayores que la cepa no recombinante. Todos los comentarios mencionados frente al polipéptido heterólogo también son válidos (mutatis mutandis) para la celulasa del polipéptido homólogo. Por consiguiente la invención también cubre las cepas de Chrysosporium diseñadas genéticamente en donde la secuencia que es introducida puede ser de origen de Chrysosporium. Tal cepa, sin embargo, puede ser distinguida de las cepas que están presentes de manera natural en virtud por ejemplos de las secuencias heterólogas que están presentes en la secuencia de ácidos nucleicos utilizadas para transformar o transfectar el Chrysosporium, en virtud del hecho de que las copias múltiples de la secuencia que codifica el polipéptido de interés están presentes o en virtud del hecho de que estas son expresadas en una cantidad que excede aquella de la cepa no diseñada bajo condiciones idénticas o en virtud del hecho de que la expresión ocurre bajo condiciones normalmente no expresivas. Este último puede ser el caso si un promotor inducible regula la secuencia de interés contrario a la situación no recombinante o si otro factor induce la expresión, que es el caso en la cepa no diseñada. La invención como se definió en las modalidades precedentes no está propuesta para cubrir las cepas de Chrysosporium que están presentes de manera natural. La invención está dirigida a las cepas derivadas a través de ya sea las tecnologías genéticas clásicas o las metodologías de ingeniería genética. Todas las cepas recombinantes de la invención pueden comprender una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína heteróloga seleccionada de las enzimas de degradación de los carbohidratos (celulasa, xilanasa, mananasas, manosidasas, pectinasas, amilasas, por ejemplo glucoamilasas, a-amilasas, alfa- y beta-galactosidasas, a- y ß-glucosidasas, ß-glucanasas, quitinasas, quitanasas), proteasas (endoproteasas, amino-proteasas, amino y carboxi-peptidasas), otras hidrolasas (lipasas, esterasas, fitasas), oxidorreductasas (catalasas, glucosa-oxidasas) y transferasas (transglicosilasas, transglutaminasas, isomerasas e invertasas) .

Tabla A: Intervalo de pH en donde las enzimas retienen la actividad y/o la estabilidad * Pesos moleculares (por MALDi; Nota: *todos los otros pesos moleculares por SDS PAGE *las enzimas fueron tomadas en contenidos de proteína iguales *xyl = xilanasa *endo = endoglucanasa *gal = galactosidasa *gluc = glucosidasa *CBN = celobiohidrolasa *PGU = poligalacturonasa o Tabla B. Actividades de las enzimas aisladas del ultrafiltrado de las cepas 18-25 haciadiferentes substratos (pH 5) unidades/mg proteína o ^actividad hacia la caseína tejida expresada en unidades arbitrarias/mg Los productos más interesantes que van a ser producidos de acuerdo con la invención son las celulasas, las xilanasas, las pectinasas, las lipasas y las proteasas en donde las celulasas y las xilanasas segmentan o desdoblan los enlaces beta-1,4 y las celulasas comprenden las endoglucanasas, las celobiohidrolasas y las beta-glucosidasas. Estas proteínas son extremadamente útiles en varios procesos industriales conocidos en el arte. Específicamente para las celulasas se hace referencia por ejemplo a WO 98/15633 que describe las celobiohidrolasas y las endoglucanasas de uso. Los contenidos de la solicitud son incorporados aquí para referencia. También se hará referencia a las Tablas A y B que proporcionan detalles de las proteínas de Chrysosporium interesantes. Se encontró de acuerdo con la invención, que los mutantes de Chrysosporium se pueden hacer que tengan una expresión reducida de la proteasa, haciéndolos por consiguiente aún más adecuados para la producción de los productos proteináceos, especialmente si el producto proteináceo es sensible a la actividad de la proteasa. Por consiguiente la invención también involucra una cepa de Chrysospori um mutante la cual produce menos proteasa que la cepa de Chrysosporium no mutante, por ejemplo menor que la cepa Cl de C. lucknowense (VKM F-3500 D) . En particular la actividad de proteasa de tales cepas es menor que la mitad de la cantidad, más particularmente menor que 30 % de la cantidad producida por la cepa Cl. La actividad de proteasa reducida puede ser medida por los métodos conocidos, tales como midiendo el halo sobre las placas de leche espumosa o desnatada o por degradación de BSA. Una modalidad de la invención que es de interés particular es un Chrysosporium recombinante de acuerdo con la invención en donde la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de interés codifica un polipéptido que es inactivado o inestable a un pH ácido, es decir un pH abajo de 6, aún abajo de 5.5, más adecuadamente aún abajo de pH 5 y aún tan abajo como o inferior que pH 4. Esta es una modalidad particularmente interesante, porque los sistemas de expresión fungosos descritos generalmente no son cultivados bajo las condiciones que son neutrales a alcalinas, pero que son cultivadas a un pH ácido. Por consiguiente el sistema de acuerdo con la invención proporciona un sistema de expresión fungosa seguro para las proteínas o los polipéptidos que son susceptibles a ser inactivados o que son inestables a pH ácido. Muy específicamente una cepa recombinante como se definió en cualquiera de las modalidades de acuerdo con la invención, en donde la secuencia del ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés codifica una proteína o polipéptido que exhibe una actividad y/o estabilidad óptima a un pH arriba de 5, preferentemente a pH neutral o alcalino (es decir arriba de 7) y/o a un pH más elevado que 6, se considera una modalidad preferida de la invención. Más del 50%, más del 70% y aún más del 90% de las actividades óptimas de tales valores de pH se anticipa que son las modalidades particularmente útiles. Un polipéptido expresado bajo las condiciones de cultivo no necesariamente tiene que ser activo a las condiciones del cultivo, en efecto puede ser ventajoso que el mismo sea cultivado bajo condiciones en las cuales el mismo sea inactivo porque su forma activa podría ser perjudicial para el huésped. Este es el caso de la proteasa por ejemplo. Lo que se requiere sin embargo es que la proteína o el polipéptido sea estable bajo las condiciones del cultivo. La estabilidad puede ser la estabilidad térmica. La misma también puede ser la estabilidad contra las composiciones o substancias químicas específicas, tales como las que están presentes por ejemplo en las composiciones o procesos de producción o la aplicación del polipéptido o la proteína de interés. LAS en las composiciones detergentes que comprenden las celulasas o las lipasas, etc., es un ejemplo de una substancia química frecuentemente perjudicial para las proteínas. Los períodos de tiempo de uso en las aplicaciones pueden variar desde una exposición breve a prolongada de modo que la estabilidad pueda estar sobre una extensión variable del tiempo que varía por aplicación. La persona experta será capaz de averiguar las condiciones correctas sobre una base de caso por caso. Se puede hacer uso de un número de ensayos disponibles comercialmente para determinar las actividades óptimas de los diversos productos enzimáticos. Los catálogos de Sigma y Megazyme por ejemplo, muestran tales ensayos. Los ejemplos específicos de las pruebas son mencionados en cualquier parte en la descripción. Los fabricantes proporcionan una guía sobre la aplicación. Se ha encontrado sorprendentemente que una cepa de Chrysosporium que puede ser utilizada adecuamente para transformar o transfectar la secuencia de interés que va a ser expresada, es una cepa que exhibe una biomasa relativamente baja. Se ha encontrado que las cepas de Chrysosporium que tienen una biomasa de dos a cinco veces inferior que aquella de Tri choderma reesei cuando se cultiva a una viscosidad de 200-600 cP al final de la fermentación y que exhibe una biomasa de 10 a 20 veces inferior que aquella del Aspergillus niger cuando se cultiva a una viscosidad de 1500-2000 cP bajo las condiciones correspondientes, es decir sus condiciones de cultivo óptimas respectivas pueden proveer un nivel elevado de la expresión. Este nivel de expresión excede bastante aquel de las dos cepas de referencia comerciales a una biomasa mucho menor y a una viscosidad mucho más baja. Esto significa que el campo de expresión de tales cepas de Chrysosporium serán apreciablemente más elevado que el del Aspergillus niger y de Tri choderma reesei . Tal cepa de Chrysosporium transformada o transfectada forma una modalidad adecuada de la invención. Se encontró una biomasa de 0.5-1.0 g/l de la cepa Cl de Chrysosporium (18-25) como lo opuesto a 2.5-5.0 g/l del Trichoderma reesei y 5-10 g/l de Aspergillus niger bajo las condiciones descritas anteriormente. En los ejemplos se proporcionan detalles de este proceso. En una modalidad adecuada una cepa de Chrysosporium recombinante de acuerdo con la invención produce una proteína o polipéptido en al menos la cantidad equivalente a la producción en moles por litro de celulasa por la cepa UV13-6 o C-19, y más preferentemente al menos equivalente a o más elevada que aquella de la cepa UV18-25 bajo las condiciones idénticas o correspondientes, es decir sus condiciones de cultivo óptimas respectivas. Inesperadamente se ha encontrado que las velocidades de expresión y secreción son extremadamente elevadas cuando se utiliza una cepa de Chrysosporium que exhibe la morfología micelial de la cepa UV18-25 es decir los micelios cortos fragmentados. Por consiguiente una cepa recombinante de acuerdo con la invención exhibirá preferentemente tal morfología. La invención sin embargo también cubre las cepas no recombinantes o las cepas diseñadas de otras manera del Chrysosporium que exhiben esta característica novedosa e inventiva. También está cubierta por la invención una cepa de Chrysosporium recombinante en cualquiera de las modalidades descritas de acuerdo con la invención que exhiben además una esporulación reducida en comparación con Cl, preferentemente abajo de aquella de la cepa UV13-6, preferentemente abajo de aquella de NG7C-19, preferentemente abajo de aquella de UV18-25 bajo las condiciones del fermentador equivalente. También está cubierta por la invención una cepa de Chrysosporium recombinante en cualquiera de las modalidades descritas de acuerdo con la invención que además exhiben al menos la cantidad de la relación de producción de la proteína con respecto a la biomasa en comparación con Cl, preferentemente en comparación con aquella de las cepas UV13-6, NG7C-19 y UV18-265 bajo las condiciones del fermentador equivalentes. La invención también cubre sin embargo las cepas no recombinantes o las cepas diseñadas de otra manera del Chrysosporium que exhiben esta característica novedosa e inventiva como tal o en combinación con cualquiera de las otras modalidades. Otra modalidad atractiva de la invención también cubre una cepa de Chrysosporium recombinante que exhibe una viscosidad abajo de aquella de la cepa NG7C-19, preferentemente abajo de aquella de UV18-25 bajo las condiciones del fermentador correspondientes o idénticas. La invención también cubre sin embargo las cepas no recombinantes o las cepas diseñadas de otra manera de Chrysosporium que exhiben esta característica novedosa e inventiva como tal o en combinación con cualquiera de las otras modalidades. Se ha determinado que la viscosidad de un cultivo de UV18-25 está abajo de 10 cP como lo opuesto a aquella de Trichoderma reesei que es del orden de 200-600 cP, con aquella del Aspergillus niger que es del orden de 1500-2000 cP bajo sus condiciones de cultivo óptimas respectivas al final de la fermentación. El proceso utilizado para tal determinación es provisto en los ejemplos. La viscosidad puede ser evaluada en muchos casos por la verificación visual. La fluidez de la substancia puede variar a tal extensión grande que la misma puede ser casi sólida, semejante a la salsa o líquida. La viscosidad también puede ser averiguada fácilmente por la viscosimetría giratoria de Brookfield, el uso de tubos de viscosidad cinemática, el viscosímetro de bola descendente o el viscosímetro del tipo de taza. Los rendimientos de tal cultivo a viscosidad baja son más elevados que aquellos de los cultivos de viscosidad más elevada conocidos comercialmente por unidad de tiempo y por celda o célula. El procesamiento de tales cultivos de viscosidad baja de acuerdo con la invención es ventajosa en particular cuando los cultivos son escalados hacia arriba. Las cepas de Chrysosporium de objeto con la viscosidad baja funcionan muy bien en los cultivos tan grandes como los cultivos de hasta 150,000 litros. Por consiguiente cualquier tamaño del cultivo de hasta 150,000 litros proporciona una modalidad útil de la invención. Cualquier otro tamaño convencional de la fermentación debe ser llevada a cabo bien con las cepas de acuerdo con la invención. El razonamiento detrás de esto es que pueden surgir problemas en la producción a gran escala con la formación de los agregados que tiene micelios que son demasiado densos y/o están distribuidos no uniformemente. Los medios como un resultado no pueden ser utilizados efectivamente durante el cultivo conduciendo a un proceso de producción ineficiente en particular en las fermentaciones a gran escala es decir arriba de 150,000 litros. La aereación y el mezclado llegan a ser problemáticos conduciendo a la inanición de los nutrientes y el oxígeno y por consiguiente a una concentración reducida de la biomasa productiva y a un rendimiento reducido del polipéptido durante el cultivo y/o puede conducir a tiempos de fermentación más prolongados. Además que una viscosidad elevada y un cizallamiento elevado no son deseables en los procesos de fermentación comerciales y en los procesos comerciales comunes, los mismos son los factores limitantes de la producción. Todos estos aspectos negativos pueden ser superados por el huésped de Chrysosporium de acuerdo con la invención el cual exhibe características mucho mejores que Tri choderma reesei , Aspergillus niger y Aspergillus oryzae que son utilizados comercialmente a este respecto es decir exhibe niveles de producción de la proteína y propiedades de la viscosidad y Figuras de la biomasa mejorados. Una cepa de Chrysospori um seleccionada de Cl, UV13-6, NG7C-19 y UV18-25 ilustra varios aspectos de la invención excesivamente buenos. La invención sin embargo también cubre las cepas recombinantes o las cepas diseñadas de otra manera de Chrysosporium derivadas de las cuatro cepas depositadas que también exhiben cualquiera de las características novedosas e inventivas como tales o de una manera combinada. La fecha de depósito de estas cepas ha sido presentada en otra parte en la descripción. La invención también cubre las cepas recombinantes o las cepas diseñadas de otra manera de Chrysosporium derivadas de las cuatro cepas depositadas que también exhiben cualquiera de las características novedosas e inventivas como tales o en combinación. Una cepa de Chrysospori um de acuerdo con la invención también comprende una cepa que exhibe bajo las condiciones de cultivo correspondientes una biomasa al menos dos veces tan baja como aquella de Trichoderma reesei , adecuadamente aún más arriba de 5 veces inferior que aquella del Trichoderma reesei , específicamente de una Trichoderma reesei que exhibe una viscosidad de 200-600 cP como se describió bajo las condiciones de los ejemplos. Una cepa de Chrysospori um de acuerdo con la invención también comprende una cepa que produce el polipéptido en al menos la cantidad en moles por litro de la celulasa por la cepa Cl, UV13-6, NG7C-19 o UV18-25 bajo condiciones correspondientes o idénticas. Las cepas de Chrysosporium de acuerdo con la invención son preferidas adicionalmente si las mismas exhiben condiciones de crecimiento óptimas a pH neutral a alcalino y temperaturas de 25-43 °C. Puede existir una preferencia por el pH neutral y aún por el pH alcalino. Tales condiciones de producción son ventajosas para un número de polipéptidos y proteínas, en particular aquellas susceptibles al ataque por el pH ácido o aquellas que son inactivas o inestables a temperaturas bajas. Sin embargo también es una modalidad de la invención incluir las cepas de Chrysosporium que pueden ser cultivadas a pH ácido porque esto puede ser útil para ciertas proteínas y polipéptidos. Un pH ácido adecuado se toma en cuenta desde 7.0. Un pH ácido inferior que 6.5 es contemplado como uno que proporciona una buena modalidad de la invención. Un pH alrededor de 5.0-7.0 también es una modalidad adecuada. Un pH neutral puede ser de 7.0 o alrededor de 7 por ejemplo 6.5 a 7.5. Como se estableció en otra parte el pH de interés óptimo depende de un número de factores que serán evidentes para la persona experta en la técnica. Un pH más elevado que 7.5 es alcalino, adecuadamente se puede utilizar uno entre 7.5-9.0. Cuando se comparan los datos de las cepas de acuerdo con la invención con otras cepas que tienen quizás otras condiciones óptimas (por ejemplo Aspergillus y Trichoderma) para las comparaciones de las mediciones de la viscosidad, la determinación de la biomasa o la producción de proteínas, se debe hacer utilizando las condiciones óptimas relevantes para la cepa relevante. Esto será obvio para la persona experta en la técnica. Una cepa de Chrysosporium de acuerdo con cualquiera de las modalidades mencionadas anteriormente de la invención, la cepa que exhibe además la producción de una o más de las enzimas fungosas seleccionadas de las enzimas degradantes de los carbohidratos, las proteasas, otras hidrolasas, oxidorreductasa, y transferasas mencionadas anteriormente, se considera una modalidad particularmente útil de la invención. Los productos más interesantes son específicamente las celulasas, xilanasas, pectinasas, lipasas y proteasas. Sin embargo también es útil como una modalidad de la invención una cepa de Chrysosporium que exhibe la producción de una o más enzimas fungosas que exhiben una estabilidad y/o actividad óptima neutral o alcalina, preferentemente una estabilidad y/o actividad óptima alcalina, la enzima es seleccionada de las enzimas que degradan los carbohidratos, las hidrolasas y las proteasas, preferentemente las hidrolasas y las enzimas degradantes de los carbohidratos. En el caso de Chrysosporium no recombinante, tales enzimas son adecuadamente diferentes de la celulasa como se describió en WO 98/15633. Las enzimas de interés particular son las xilanasas, proteasas, esterasas, alfa galactosidasas, beta-galactosidasas, beta-glucanasas y pectinasas. Las enzimas no están limitadas a las mencionadas anteriormente. Los comentarios frente a la estabilidad y la actividad en cualquier parte en la descripción también son válidos aquí. La invención también cubre un método de producción de un polipéptido de interés, el método comprende cultivar una cepa de Chrysosporium en cualquiera de las modalidades de acuerdo con la invención bajo las condiciones que permiten la expresión y preferentemente la secreción del polipéptido y la recuperación del polipéptido de interés producido subsiguientemente . En donde la proteína o el polipéptido sea mencionado, las variantes y mutantes por ejemplo los mutantes de substitución, inserción o deleción de las proteínas que están presentes naturalmente, están propuestas para que se incluya que exhiben la actividad del no mutante. Lo mismo es válido frente a las secuencias del ácido nucleico correspondiente. Los procesos tales como el desordenamiento de los genes, el diseño de las proteínas y la evolución directa, la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis al azar son procesos a través de los cuales tales polipéptidos, variantes o mutantes pueden ser obtenidos. Las patentes US 5,223,409, US 5,780,279 y US 5,770,356 proporcionan la enseñanza de la evolución directa. Utilizando este proceso se crea una biblioteca de las secuencias de los genes mutados al azar por ejemplo porque el desordenamiento de los genes por medio de la PCR propensa al error ocurre en cualquier tipo de célula. Cada gen tiene una región de secreción y una región de inmovilización fijada a la misma de tal modo que la proteína resultante sea secretada y permanezca fija a la superficie del huésped. Subsiguientemente se crean las condiciones que necesitan la actividad biológica del polipéptido particular. Esto ocurre para un número de ciclos que conduce por último a un gen final con las características deseadas. En otras palabras un proceso directo acelerado de evolución. La patente US 5,763,192 también describe un proceso para obtener el ADN, el ARN, los péptidos, los polipéptidos o la proteína por medio de las secuencias generadas estocásticamente que se unen a los polinucleótidos sintéticos, la introducción de las mismas en un huésped seguido por la selección de la célula huésped con la característica predeterminada correspondiente. Las técnicas de clonación y de aislamiento de las proteínas o los péptidos estándares, pueden ser utilizadas para llegar a la información de la secuencia requerida. Las partes de las secuencias conocidas pueden ser utilizadas como las sondas para aislar otros homólogos en otros géneros y cepas. La secuencia del ácido nucleico que codifica una actividad de la enzima particular puede ser utilizada para seleccionar una biblioteca de Chrysosporium por ejemplo. Una persona experta en la técnica deducirá cuales condiciones de hibridación son apropiadas. Los métodos convencionales para la construcción de bibliotecas de hibridación del ácido nucleico y las técnicas de clonación son descritas en Sambrook y colaboradores (Eds) (1989) En "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor, Press Plainview, New York, y Ausubel y colaboradores (Eds) "Current Protocols in Molecular Biology" (1987) John Wiley and Sons, New York. La información relevante también puede ser derivada de los folletos y patentes posteriores, así como de varios juegos o conjuntos disponibles comercialmente en el campo. En una modalidad alternativa, el método comprende cultivar una cepa de acuerdo con la invención bajo las condiciones que permitan la expresión y preferentemente la secreción de la proteína o el polipéptido o el precursor del mismo y recuperar el polipéptido producido subsiguientemente y de manera opcional someter el precursor a pasos de aislamiento y purificación adicionales para obtener el polipéptido de interés. Tal método puede comprender adecuadamente un paso de segmentación del precursor en el polipéptido o precursor de interés. El paso de segmentación puede ser segmentado o desdoblado con una proteasa semejante a Kex-2, cualquier proteasa formada en parejas de aminoácidos básicos o Kex-2 por ejemplo cuando el sitio de segmentación de la proteasa se enlaza a un portador de la proteína secretado en la cavidad y el polipéptido de interés. Una persona experta en la técnica puede encontrar fácilmente que las secuencias de la proteasa semejantes a la Kex-2 como los detalles de la secuencia del consenso para tales están disponibles y un número de alternativas ya han sido descritas, por ejemplo la furina. Adecuadamente en un método para la producción del polipéptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la invención, el cultivo ocurre a pH más elevado que 5, preferentemente 5-10, más preferentemente 6-9. Adecuamente en tal método el cultivo ocurre a una temperatura de entre 25-43 °C, preferentemente 30-40 °C. La cepa de Chrysosporium utilizada en el método de acuerdo con la invención es muy adecuadamente una cepa de Chrysosporium recombinante de acuerdo con cualquiera de las modalidades descritas. El método de acuerdo con la invención en tal caso puede estar precedido adicionalmente por el paso de la producción de una cepa de Chrysosporium recombinante de acuerdo con la invención. La selección de las condiciones apropiadas dependerá de la naturaleza del polipéptido que va a ser expresado y tal selección radica muy adentro del reino y campo de actividad normal de una persona experta en el arte. El método de producción de una cepa de Chrysosporium recombinante de conformidad con la invención también es parte de la invención objeto. El método comprende introducir establemente una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido heterólogo y homólogo en una cepa de Chrysosporium, la secuencia de ácidos nucleicos está enlazada operativamente a una región de regulación de la expresión, la introducción ocurre de una manera conocida per se para la transformación de los hongos filamentosos. Como se estableció anteriormente, numerosas referencias de los mismos están disponibles y una selección pequeña ha sido citada. La información provista es suficiente para hacer posible que la persona experta lleve a cabo el método sin una carga indebida. El método comprende la introducción de una secuencia de ácido nucleico que comprende cualquiera de los elementos de los ácidos nucleicos descritos en las diversas modalidades del Chrysosporium recombinante de acuerdo con la invención como tales o en combinación. A manera de ejemplo la introducción puede ocurrir utilizando el método de transformación de los protoplastos. El método es descrito en los ejemplos. Los métodos de transformación de los protoplastos o esferoplastos, alternativos, ya son conocidos y pueden ser utilizados como se ha descrito en la técnica previa para otros hongos filamentosos. Los detalles de tales métodos pueden ser encontrados en muchas de las referencia citadas y por consiguiente son incorporados aquí para referencia. Un método de acuerdo con la invención comprende adecuadamente la utilización de una cepa no recombinante de Chrysosporium de acuerdo con la invención como el material de partida para la introducción de la secuencia deseada que codifica el polipéptido de interés. La invención objeto también cubre un método de producción de la enzima de Chrysosporium, el método comprende cultivar una cepa de Chrysosporium de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la invención como se describió anteriormente en o sobre el medio de cultivo a un pH más elevado que 5, preferentemente 5-10, más preferentemente 6-9, adecuadamente 6-7.5, 7.5-9 como los ejemplos de los intervalos de pH neutrales y alcalinos. La invención objeto también cubre tal método que utiliza el medio de cultivo a una temperatura de entre 25-43 °C, preferentemente 30-40 °C. La combinación del pH y la temperatura preferidas es una modalidad preferida especialmente del método de producción de la enzima Chrysosporium de acuerdo con la invención.

De manera más general la invención cubre además un método de producción de enzimas que exhiben una actividad y/o estabilidad óptima neutral o alcalina, preferentemente una actividad y/o estabilidad óptima alcalina. Los intervalos preferidos frente al pH y la actividad óptima así como los ensayos con los cuales se pueden determinar estos, han sido provistos en otra parte en la descripción. La enzima debe ser seleccionada de las enzimas de degradación de los carbohidratos, las proteasas, otras hidrolasas, oxirreductasas, y transferasas, como se describió anteriormente, el método comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la enzima correspondiente. Adecuadamente tal enzima será una enzima de Chrysosporium. Un método adecuado tal como este comprende la producción específicamente de la celulasa, la xilanasa, la pectinasa, la lipasa y la proteasa, en donde la celulasa y la xilanasa segmentan o desdoblan los enlaces ß-1,4 y la celulasa comprende la endoglucanasa, la celobiohidrolasa y la ß-glucosidasa. El método de acuerdo con la invención puede comprender cultivar cualquier huésped de Chrysosporium de acuerdo con la invención que comprende el ácido nucleico que codifica tales enzimas mencionadas anteriormente. Adecuadamente la producción de los huéspedes de Chrysosporium no recombinantes de acuerdo con la invención está dirigida a la producción de la enzimas que degradan los carbohidratos, las hidrolasas y las proteasas. En tal caso la enzima es adecuadamente diferente de una celulasa. Los ejemplos adecuados de los productos que van a ser producidos se dan en las Tablas A y B. Los métodos de aislamiento son análogos a aquellos descritos en WO 98/15663 y son incorporados para referencia. Las enzimas producidas por las cepas de Chrysosporium de acuerdo con la invención también están cubiertas por la invención. Las enzimas de origen del Chrysosporium cuando pueden ser aisladas de las cepas de Chrysosporium no recombinantes de acuerdo con la invención también están cubiertas. Las mismas exhiben las características de estabilidad, y actividad mencionadas anteriormente. Adecuadamente las mismas son estables en la presencia de LAS. En particular las proteasas con pl 4-9.5, las proteasas con un PM de 25-95 kD, las xilanasas con pl entre 4.0 y 9.5, las xilanasas con PM entre 25 y 65 kD, las endoglucanasas con un pl entre 3.5 y 6.5, las endoglucanasas con PM de 25-55 kDa, las ß-glucosidasas, las a,ß-galactosidasas con un pl de 4-4.5, las ß-glucosidasas, las a,ß-galactosidasas con un PM de 45-50 kDa, las celobiohidrolasas de pl de 4-5, las celobiohidrolasas de PM de 45-60 kDa, por ejemplo un PM de 55 kD y pl de 4.4, poligalacturonasas, con un pl de 4.0-5.0, la poligalacturonasa de 60-70 kDa, por ejemplo 65 kDa, las esterasas con un pl de 4-5, y las esterasas con un PM de 95-105 kDa con las características de estabilidad y actividad mencionadas anteriormente, son reivindicadas. Los pesos moleculares (PM) son aquellos determinados por SDS-PAGE. Las enzima no recombinantes, es decir la enzima que está presentes de manera natural, es diferente de la celulasa que se describió en WO 98/15633. Una enzima como la descrita en 98/15663 está excluida. Las enzimas de acuerdo con la invención están representadas por las enzimas de la Tabla B. Las enzimas con combinaciones de los valores de pl y los pesos moleculares mencionados anteriormente también están cubiertas. La invención también está relacionada con la (sobre) producción de los productos diferentes de las proteínas por las cepas mutantes (recombinantes) de la invención. Tales productos diferentes de las proteínas incluyen los metabolitos primarios tales como los ácidos orgánicos, los aminoácidos, y secundarios tales como antibióticos, por ejemplo penicilinas y cefalosporinas. Estos productos son el resultado de la combinación de las rutas bioquímicas que involucran varios genes fungosos de interés. Los metabolitos primarios y secundarios fungosos y los procedimientos para producir estos metabolitos en los organismos fungosos ya han sido descritos por Mattey M., The Production of Organic Acids, Current Reviews in Biotechnology, 12, 87-132 (1992) . Los ejemplos de la producción de los metabolitos secundarios ya ha sido descrita por Penalva y colaboradores, The Optimization of Penicillin Biosynthesis in Fungi, Trends in Biotechnology 16, 483-489 (1998) .

EJEMPLOS EJEMPLOS DE LAS DETERMINACIONES DE LA BIOMASA Y LA VISCOSIDAD Los siguientes intervalos de los datos de los parámetros operativos han sido determinados para las fermentaciones fungosas utilizando tres diferentes organismos fungosos. Los tres organismos fungosos comparados son: Tri choderma longibrachia tum (inicialmente T. reesei), Aspergillus niger y Chrysosporium lucknowense (UV18-25) . Viscosidad: La viscosidad es determinada sobre un viscosímetro de Brookfield LVF utilizando el adaptador de muestra pequeño y el husillo número 31. Se activa la bomba de circulación del agua 5 minutos previo al uso del viscosímetro para equilibrar la camisa de agua. La temperatura del agua del baño debe ser de 30 °C.

Se obtiene una muestra fresca del caldo de fermentación y se colocan 10 ml del caldo en el husillo de la muestra pequeña. Se selecciona la velocidad del husillo para dar una lectura en el intervalo de 10-80. Se esperan cuatro (4) minutos y se toma la lectura de la escala del viscosímetro. Se multiplica la lectura por el factor dado posteriormente para dar la viscosidad en centipoises (cP) . Velocidad del Husillo Factor de Multiplicación 6 50 12 25 30 10 60 5 Los siguientes intervalos de la viscosidad han sido determinados para las fermentaciones utilizando el organismo fungoso especificado utilizando el procedimiento anterior: Viscosidad en cP T. longibrachium 200 - 600 U. niger 1,500-2,000 V. lucknowense (UV18-25) LT 10 Biomasa: La biomasa se determinó por el siguiente procedimiento: Se prepesa el papel filtro de 5.5 cm (Whatman 54) es un disco de pesada de aluminio. Se filtran 5.0 ml del caldo total a través del papel de 5.5 cm sobre un embudo de Buchner, se lava la torta del filtro con 10 ml de agua desionizada, se coloca la torta lavada y se filtra en una cacerola de pesada y se seca toda la noche a 60 °C. Se seca el acabado a 100 °C durante 1 hora, luego se coloca en un desecador para que se enfríe. Se mide el peso del material seco. La biomasa total (g/l) es igual a la diferencia entre los pesos inicial y final multiplicada por 200. Los siguientes intervalos de la biomasa han sido determinados para las fermentaciones utilizando el organismo fungoso especificado usando el procedimiento anterior: Biomasa en g/l T. longibrachium 2.5 - 5 U. niger 5 - 10 V. lucknowense (UV18-25) 0.5 - 1 Proteína: Los niveles de proteína fueron determinados utilizando el Procedimiento de Ensayo BioRad de Sigma Company. Los niveles de la proteína fueron más elevados para el Chrysospori um.

Los datos presentados anteriormente representan los valores determinados a las 48 horas en el proceso de fermentación hasta que la fermentación finaliza; todos los valores de Aspergillus y Trichoderma son para los organismos fungosos relevantes comercialmente y reflejan los datos comerciales reales. Una cepa fungosa tal como C. lucknowense (UV18-25) tiene la ventaja de que la viscosidad baja permite el uso de la entrada de energía y el cizallamiento inferior en la fermentación para satisfacer las demandas de oxígeno para aquellos casos en donde la tensión de cizallamiento sobre el producto pueda ser perjudicial para la productividad debida al daño físico de la molécula del producto. La producción de la biomasa inferior a una producción de la proteína elevada indica un organismo más eficiente en la conversión del medio de la fermentación al producto. Por consiguiente, el Chrysosporium proporciona mejores datos de la biomasa y la viscosidad mientras que también se suministra por lo menos tanta proteína, y en efecto mucha más proteína que los dos sistemas utilizados comercialmente los cuales obviamente son mejores que para las cepas de Aspergillus o Trichoderma reesei depositadas típicamente en las colecciones públicas generales. La producción de proteína elevada con la concentración de la biomasa baja producida por C. lucknowense (UV18-25) podría permitir el desarrollo de las condiciones de fermentación con múltiplos más elevados de incremento en la biomasa, si una biomasa creciente conduce a una productividad incrementada, para el producto deseado antes de que alcance las condiciones de fermentación limitantes. Los niveles elevados presentes de la biomasa y la viscosidad producidos por T. longibrachiatum y A. niger restringen el incremento de la biomasa porque los niveles presentes de la biomasa y la viscosidad están cerca de las condiciones de la fermentación práctica limitativa.

EJEMPLOS DE TRANSFORMACIÓN QUE COMPARAN CHRYSOSPORIUM, TRICHODERMA Y TOLYPOCLADIUM GEODES Dos cepas Cl de Chrysosporium no transformadas y una cepa de referencia de Trichoderma reesei fueron transformadas sobre dos medios (Gs pH 6.8 y agar Pridham, PA, pH 6.8). Para probar el nivel de la resistencia a los antibióticos las esporas fueron colectadas desde placas de PDA de 7 días de envejecimiento. Las placas selectivas fueron incubadas a 32 °C y evaluadas después de 2, 4 y 5 días. Se continuó con que las cepas NG7C-19 y UV18-25 de C-1 claramente tienen un nivel de resistencia basal bajo tanto para la fleomicina como la higromicina. Este nivel es comparable con aquel para una cepa de laboratorio utilizada comúnmente T. reesei . Por consiguiente existe una indicación clara de que estos dos marcadores seleccionables fungosos estándares pueden ser utilizados también en las cepas de Chrysosporium. Los problemas con otros marcadores seleccionables fungosos estándares no deben ser esperados. La selección de las cepas de Chrysosporium transformadas con Sh-ble (resistencia a la fleomicina) fue llevada a cabo exitosamente a 50 µg/ml. Este también fue el nivel de selección utilizado para T. reesei que muestra por consiguiente que la selección diferencial puede ser lograda fácilmente en Chrysosporium. Los mismos comentarios son válidos para las cepas transformadas con la resistencia a la hygromicina a un nivel de 150 µg/ml.

Tabla C La técnica de transformación de los protoplastos fue utilizada sobre Chrysosporium basado en la tecnología de transformación fungosa aplicada más generalmente. Todas las esporas de una placa de PDA de 90 mm fueron recuperadas en 8 ml de ICI y se transfirieron hacia un recipiente de agitación del medio de ICI de 50 ml para la incubación durante 15 horas a 35 °C y 200 rpm. Después de esto el cultivo fue centrifugado, las pildoras o microesferas fueron lavadas en MnP, se llevaron de nuevo en solución en 10 ml de MnP y 10 mg/ml de Caylase C3 y se incubó durante 30 minutos a 35 °C con agitación (150 rpm). La solución fue filtrada y el filtrado fue sometido a centrifugación durante 10 minutos a 3500 rpm. Las microesferas fueron lavadas con 10 ml de MnPCa2+. Esta fue centrifugada durante 10 minutos a 25 °C. Luego se agregaron 50 microlitros de MPC frío. La mezcla fue mantenida sobre hielo durante 30 minutos después de los cual se agregan 2.5 ml de PMC. Después de 15 minutos a temperatura ambiente se mezclan 500 microlitros de los protoplastos tratados con 3 ml de MnR Soft y se colocó inmediatamente en placas sobre una placa de MnR que contiene fleomicina o higromicina como el agente de selección. Después de la incubación durante cinco días a 30 °C los transformantes fueron analizados (los clones llegaron a ser visibles después de 48 horas) . La eficiencia de la transformación fue determinada utilizando 10 microgramos del plásmido de referencia pAN8-l19. Los resultados son presentados en la siguiente Tabla D.

Tabla D: Eficiencia de la transformación (utilizando 10 µg del plásmido pAN8-l de referencia) Los resultados muestran que la viabilidad de los transformantes de Chrysosporium es superior a aquella del Trichoderma . La transformabilidad de las cepas es comparable y por consiguiente el número de transformantes obtenido en un experimento está considerado como 4 veces más elevado para Chrysosporium que para T. reesei . Por consiguiente el sistema de transformación de Chrysosporium no solamente iguala el sistema de T. reesei utilizado comúnmente, sino que aún lo supera. Esta mejora puede probar que es especialmente útil para los vectores que son menos eficientes en la transformación que pAN8-l. Los ejemplos de tales vectores de transformación menos eficientes son los vectores portadores de las proteínas para la producción de las proteínas no fungosas las cuales generalmente producen 10 veces más pocos transformantes . Un número de otros vectores de transformación y expresión fueron construidos con las secuencias que codifican la proteína de Chrysosporium homologa y también con las secuencias de codificación de la proteína heteróloga para su uso en los experimentos de transformación con Chrysospori um. Los mapas de los vectores son provistos en las Figuras 6-11. Las proteínas homologas que van a ser expresadas fueron seleccionadas del grupo de celulasas producidas por Chrysosporium y consistieron de la endoglucanasa 6 la cual pertenece a la familia 6 (PM 43 kDa) y la proteína heteróloga fue la endoglucanasa 3 la cual pertenece a la familia 12 (PM 25 kDa) de Penicillim. El pF6g comprende el fragmento del promotor de la endoglucanasa 6 de Chrysosporium enlazada a la secuencia de la señal de la endoglucanasa 6 en un marco con el marco de lectura abierta de la endoglucanasa 6 seguido por la secuencia del terminador de la endoglucanasa 6. La selección del transformante es llevada a cabo utilizando la cotransformación con un vector seleccionable. El pUT1150 comprende el promotor de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei enlazado a la secuencia de la señal de la endoglucanasa 6 en el marco con el marco de lectura abierta de la endoglucanasa 6 seguido por la secuencia terminadora de la celobiohidrolasa de T. reesei . Además este vector lleva un segundo cásete de expresión con un marcador de la selección, es decir el gen con resistencia a la fleomicina (gen Sh-ble) . El pUT1152 comprende el promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa A de Aspergillus nidulans enlazado a la secuencia de la señal de la endoglucanasa 6 en el marco con el marco de lectura abierta de la endoglucanasa 6 seguido por la secuencia terminadora de la antranilato sintasa (trpC) de A. nidulans . Además este vector lleva un segundo cásete de expresión con un marcador de la selección es decir el gen de resistencia a la fleomicina (gen de Sh-ble) . El pUT1155 comprende un promotor de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de A. nidulans enlazado a la secuencia de la señal de la celobiohidrolasa de Trichoderma reesei en el marco con la proteína portadora Sh-ble la cual a su vez está enlazada en el marco al marco de lectura abierta de la endoglucanasa 6 seguido por la secuencia terminadora trpC de A. nidulans . Este vector utiliza la tecnología de la proteína portadora fusionada a la proteína de interés la cual se sabe que mejora mucho la secreción de la proteína de interés.

El pUT1160 comprende el promotor de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Aspergill us nidulans enlazado a la secuencia de la señal de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei en el marco con la proteína portadora Sh-ble la cual a su vez está enlazada en el marco con el marco de lectura abierta de la endoglucanasa 3 de Penicillim seguido por la secuencia terminadora de trpC de A. nidulans . El ?UT1162 comprende el promotor de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei enlazado a la secuencia de la señal de la endoglucanasa 3 en el marco con el marco de lectura abierta de la endoglucanasa 3 de Penicillim seguido por la secuencia terminadora de la celobiohidrolasa de T. reesei . Además este vector lleva un segundo cásete de expresión con un marcador de la selección es decir el gen con resistencia a la fleomicina (gen Sh-ble) .

Tabla E: Transformaciones comparativas La Tabla E muestra los resultados de la transformación tanto de UV18-25 de Chrysosporium como de Tolypocladium geodes. El protocolo de transformación utilizado se describe en la sección de la transformación heteróloga.

EJEMPLOS DE LA EXPRESIÓN HETEROLOGA Y HOMOLOGA DE LOS TRANSFORMANTES DE CHRYSOSPORIUM Las cepas Cl (NG7C-19 y/o UV18-25) han sido probadas para verificar su capacidad para secretar varias proteínas heterólogas: una proteína bacteriana (la proteína con resistencia a la fleomicina de Streptoallotei chus hindustanus, Sh ble) , una proteína fungosa (xilanasa II de Trichoderma reesei , XYN2) y una proteína humana (la lisozima humana, HLZ) . Los detalles del proceso son como sigue: [1] Secreción de Cl de la proteina con resistencia a la fleomicina de Streptoalloteichus Ixindustanus (Sh ble) . Las cepas Cl de NG7C-19 y UV18-25 han sido transformadas por el plásmido pUT720x. Este vector presenta el siguiente cásete de expresión fungosa. promotor de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Aspergillus nidulans (gpdA) 2 Una secuencia de la señal de la celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei sintética (cbhl)1'3 un gen con resistencia a la fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus Sh ble4 el terminador de la triptófano-sintasa de Aspergillus nidulans (trpC)5 El vector también lleva el gen de beta-galactamasa (bla) y el origen de replicación de E. coli del plásmido pUCld6. El mapa del plásmido detallado es provisto en la Figura 2. Los protoplastos de Cl fueron transformados de acuerdo con Durand y colaboradores7 adaptados a Cl (la composición del medio y las soluciones se da en otra parte) : Todas las esporas de una placa de PDA de 90 mm de la cepa de Cl no transformada fueron recuperadas en 8 ml de IC1 y se transfirieron dentro de un recipiente de agitación con 50 ml del medio IC1 para incubación 15 horas a 35 °C y 150 rpm. Después de esto, el cultivo fue centrifugado descendentemente, las microesferas se lavaron en MnP, se resolvieron en 10 ml de MnP + 10 mg/ml de Caylase C3, y se incubaron 30 minutos a 35 °C con agitación (150 rpm). La solución se filtró y el filtrado se centrifugó 10 minutos a 3500 rpm. Las microesferas fueron lavadas con 10 ml de MnPCa2+. Esta solución fue centrifugada descendentemente 10 minutos a 3500 rpm y las microesferas fueron recibidas en 1 ml de MnPCa2+. 10 µg del ADN de pUT720 fueron agregados a 200 µl de la solución del protoplasto y se incubaron 10 minutos a temperatura ambiente (~20 °C) . Luego se agregaron 50 µl de MPC frío. La mezcla fue mantenida en hielo durante 30 minutos después de lo cual se agregan 2.5 ml de PMC. Después de 15 minutos a temperatura ambiente se mezclan 500 µl de los protoplastos tratados con 3 ml de MnR Soft y se colocan inmediatamente en placas sobre un placa de MnR que contiene la fleomicina (50µg/ml a pH 6.5) como un agente de selección. Después de 5 días de incubación a 30 °C, los transformantes fueron analizados (los clones empezaron a ser visibles después de 48 horas) . La producción de Sh ble de los transformantes de Cl (clones resistentes a la fleomicina) fue analizada como sigue: Los transformantes primarios fueron colocados con un palillo de dientes en placas de GS+fleomicina (5µg/ml) y se hicieron crecer durante 5 días a 32 °C para la verificación de la resistencia. Cada clon de resistencia legitimada fue subclonado sobre placas de GS. Dos subclones por transformante fueron utilizados para inocular las placas de PDA para dar esporas para el inicio del cultivo líquido. Los cultivos líquidos en IC1 se hicieron crecer 5 días a 27 °C (agitación a 200 rpm) . Luego, los cultivos fueron centrifugados (5000 g, 10 minutos) y 500 µl del sobrenadante fueron colectados. A partir de estas muestras, las proteínas fueron precipitadas con TCA y se volvieron a suspender en un Amortiguador de la Muestra de Western a 4 mg/ml de las proteínas totales (Método Lowry8) . 10 µl (aproximadamente 40 µg de las proteínas totales) fueron cargadas sobre un gel de SDS/acrilamida al 12% y se corrieron (sistema Mini Trans-Blot de BioRad) . El manchado de Western se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones de BioRad (membrana de 0.2 µm de Schleicher & Schull) utilizando el antisuero de anti-Sh ble de conejo (Cayla Cat. Ref. #ANTI-0010) como el anticuerpo primario. Los resultados son mostrados en la Figura 1 y la Tabla F: Tabla F: Niveles de producción estimados de Sh ble en Cl Estos datos muestran que: 1) Las señales de traducción/transcripción heterólogas de pUT720 son funcionales en Chrysospori um . 2) La secuencia de la señal heteróloga de pUT720 es funcional en Chrysosporium. 3) El Chrysosporium puede ser utilizado como un huésped para la secreción de una proteína bacteriana heteróloga. [2] Secreción de Cl del lisozima humano (HLZ) .

Las cepas NG7C-19 y UV18-25 de Cl han sido transformadas por el plásmido pUT970G9. Este vector presenta el siguiente cásete de expresión fungosa: promotor de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Aspergillus nidulans (gpdA)2 una secuencia de la señal de la celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei sintética (cbhl) 1'3 - un gen con resistencia a la fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus Sh ble4 utilizado como portador-proteína un dominio de la articulación de glucoamilasa (glaA2) de Aspergillus niger clonado a partir del plásmido pAN56-211,12 un péptido enlazador (LGERK) que caracteriza un sitio de la proteasa semejante a KEX21 un gen de lisozima humana sintética (hlz)10 el terminador de la triptófano-sintasa de Aspergill us nidulans (trpC)5 El vector también lleva el gen de beta-galactamasa (bla) y el origen de replicación de E. coli del plásmido pUCld6. El mapa del plásmido detallado es provisto en la Figura 3. Los protoplastos fueron transformados con el plásmido pUT970G siguiendo el mismo procedimiento ya descrito en el ejemplo 1. La proteína de la fusión (Sh ble: .-articulación GAM::HLZ) es funcional con respecto a la resistencia a la fleomicina permitiendo por consiguiente una selección facilitada de los transformantes de Cl . Además, el nivel de resistencia a la fleomicina se correlaciona de manera general con el nivel de la expresión de hlz. La producción de HLZ de los transformantes de Cl (clones resistentes a la fleomicina) fue analizada por el ensayo de actividad de la lisozima como sigue: los transformantes primarios fueron transladados por medio de un palillo de dientes a placas de GS+fleomicina (5 µg/ml) (verificación de la resistencia) y también sobre las placas LYSO (detección de la actividad de HLZ por la visualización de la zona de despeje1'10) . Las placas se hicieron crecer durante 5 días a 32 °C. Cada clon validado fue subclonado sobre las placas LYSO. Dos subclones por transformante fueron utilizados para inocular las placas de PDA para dar las esporas para el inicio del cultivo líquido. Los cultivos del líquido en IC1 se hicieron crecer 5 días a 27 °C (agitación a 180 rpm) . Luego, los cultivos fueron centrifugados (5000 g, 10 minutos) . A partir de estos ejemplos, la actividad de la lisozima fue medida de acuerdo con Morsky y colaboradores 13 Estos datos muestran que: 1) Los puntos 1 y 2 del ejemplo 1 son confirmados, 2) Sh ble es funcional en el Chrysosporium como marcador de la resistencia. 3) Sh ble es funcional en Chrysospori um como el portador-proteína . 4) El sitio de segmentación de la proteasa semejante a KEX2 es funcional en Chrysosporium (de otra manera HLZ no podría ser activo) . 5) El Chrysosporium puede ser utilizado como el huésped para la secreción de una proteína de mamífero heteróloga. [3] Secreción de Cl de la xilanasa II de Trichoderma reesei (XYN2) .

La cepa UV18-25 de Cl ha sido transformada por los plásmidos pUT1064 y pUT1065. PUT1064 representa los dos casetes de expresión fungosa siguientes: Promotor del gen 1 de control de la ruta transversal de Neurospora crassa (cpc-1)14 - un gen con resistencia a la fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus Sh ble4 el terminador de la triptófano-sintasa de Aspergillus nidulans (trpC)5 El segundo cásete es el cásete de producción de la xilanasa: Promotor cbhl de la cepa TR2 de T. reesei15 Gen xyn2 de la cepa TR2 de T. reesei (incluyendo su secuencia de la señal)16 Terminador de cbhl de la cepa TR2 de T. reesei15 El vector también lleva un origen de replicación de E. coli del plásmido pUC196. El mapa detallado del plásmido es provisto en la Figura 4. PUT1065 presenta el siguiente cásete de expresión fungosa: - promotor de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Aspergillus nidulans (gpdA)2 Una secuencia de la señal de la celobiohidrolasa I de T. reesei sintética (cbhl)1'3 un gen con resistencia a la fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus Sh ble4 utilizado como el portador-proteína10 Un péptido enlazador (SGERK) que caracteriza un sitio de segmentación de la proteasa semejante a KEX21 un gen de la cepa TR2xyn2 de T. reesei (sin la secuencia de la señal)16 el terminador de la triptófano-sintasa de A. nidulans (trpC)5 El vector también lleva el gen de beta-galactamasa (bla) y un origen de replicación de E. coli del plásmido pUCld6. El mapa del plásmido detallado es provisto en la Figura 5. Los protoplastos de Cl fueron transformados con el plásmido pUT1064 o pUT1065 siguiendo el mismo procedimiento ya descrito en el ejemplo 1. La proteína de fusión en el plásmido pUT1065 (Sh ble :: XYN2) es funcional con respecto a la resistencia a la fleomicina permitiendo por consiguiente la selección facilitada de los transformantes de Cl. Además, el nivel de resistencia a la fleomicina se correlaciona de manera general con el nivel de la expresión de xyn2. En pUT1064, el xyn2 fue clonado con su propia secuencia de la señal. La producción de xilanasa de los transformantes de Cl (clones resistentes a la fleomicina) fue analizada por el ensayo de la actividad de la xilanasa como sigue: los transformantes primarios fueron transportados con un palillo de dientes a placas de GS+fleomicina (5 µg/ml) (verificación de la resistencia) y también sobre las placas XYLAN (detección de la actividad de la xilanasa por la visualización de la zona de despeje17) . Las placas se hicieron crecer durante 5 días a 32 °C. Cada clon validado fue subclonado sobre las placas XYLAN. Dos subclones por transformante fueron utilizados para inocular las placas de PDA para dar las esporas para el inicio del cultivo líquido. Los cultivos líquidos en IC1 + 5 g/l de KPhatalete se hicieron crecer 5 días a 27 °C (agitación a 180 rpm) . Luego, los cultivos fueron centrifugados (5000 g, 10 minutos) . A partir de estas muestras, la actividad de la xilanasa fue medida por la Técnica de DNS de acuerdo con Miller y colaboradores 18 Tabla H: Niveles de producción de XYN2 activos en Cl (mejores productores) Estos datos muestran que: 1) Los puntos 1 a 4 del ejemplo 2 son confirmados, 2) Cl puede ser utilizado como el huésped para la secreción de una proteína fungosa heteróloga. [4] También se ilustran los datos de la expresión del UV18-25 transformado en donde la tabla 1 muestra los resultados para los plásmidos con los cuales la transformación es llevada a cabo. La Tabla muestra buenos niveles de expresión para la endoglucanasa y la celobiohidrolasa utilizando las secuencias reguladoras de la expresión heteróloga y las secuencias de la señal pero también con las secuencias de regulación de la expresión homologa y las secuencias de la señal. Los detalles de los diversos plásmidos pueden ser derivados en cualquier parte en la descripción y de las Figuras. La producción ocurre a pH alcalino a una temperatura de 35 °C.

Tabla I: Datos de la expresión de la cepa de UV18-25 transformada Condiciones del cultivo (recipiente de agitación) : 88h, 35 °C, 230 rpm • todas las Figuras anteriores son en relación con el % con respecto a la cepa UV18-25 original Apéndice para los Ejemplos: Medios Medio de Transformación; Base de Mandéis: Medio de MnP: KH2P04 2.0 g/i Base de Mandéis con (NH4)2S04 1.4 g/i Peptona 1 g/l MgS04.7H20 0.3 g/i MES 2 g/l CaCl2 0.3 g/i Sucrosa 100 g/l Oligoelementos 1.0 ml/1 ajuste del pH a 5 MnR MnP CA2+: MnP+sucrosa 130 g/i Medio MnP + Extracto de levadura 2.5 g/i CaCl2 2H20 50 mM Glucosa 2.5 g/i Ajuste del pH a 6.5 Agar 15 g/l MnR Soft: MnR con solamente 7.5 g/l de agar.

MPC: CaCl2 50 mM pH 5.8 MOPS 10 mM PEG 40 % Para la selección y el cultivo GS: Glucosa 10 g/l Biosoyase 5 g/l [Merieux] Agar 15 g/l pH debe ser 6.8 PDA: Agar de Papa 39 g/l [Difco] Dextrosa el pH debe ser 5.5 MPG: Base de Mandéis con K.Phtalate 5 g/l Glucosa 30 g/l Extracto de 5 g/l levadura El medio de regeneración (MnR) suplementado con 50 µg/ml de fleomicina o 100-150 µg/ml de higromicina es utilizado para seleccionar los transformantes. El medio de GS, suplementado con 5 µg/ml de fleomicina es utilizado para confirmar la resistencia de los antibióticos. El PDA es un medio completo para el crecimiento rápido y una buena esporulación. Los medios líquidos son inoculados con 1/20 de la suspensión de esporas (todas las esporas de una placa de PDA de 90 mm en 5 ml de Tween al 0.1%). Tales cultivos se hacen crecer a 27 °C en recipientes de agitación (200 rpm) .

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE Cl El proceso para la obtención de varias proteínas se describe como que son un número de características de las proteínas. Las tablas A, B y J proporcionan detalles del esquema de purificación y de las actividades. El aislamiento ocurre a partir del filtrado del cultivo de Chrysosporium utilizando la cromatografía de intercambio de iones DEAE-Toyopearl análogamente al método descrito en WO 98/15633, el cual es incorporado aquí para referencia. La fracción no unida (F 60-31 CF) obtenida de esta cromatografía fue purificada utilizando la cromatografía de intercambio de iones Macro Prep Q después del equilibrio al pH de 7.6. La fracción no unida (NBNB) fue agrupada y las proteínas unidas fueron eluidas en el gradiente de NaCl 0-1 M. La fracción de NBNB proporcionó bandas de proteína mayores de 19, 30, 35 y 46 kD y una menor de 51 kD. En la proteína del gradiente de NaCl de 0-1 M los picos fueron eluidos de varias fracciones. Las fracciones 39-41 incluyeron las proteínas de 28, 36 y 60 kD, las fracciones 44-48 incluyeron las de 28, 45 y 66 kD como las bandas de proteína mayores con las proteínas de 33, 36, 55, 60 y 67 kD, las fracciones 49-51 dieron las proteínas de 30, 36, 56 y 68 kD y la fracción de 52-59 incluyó las proteínas de 33 y 55 kD mayores y las proteínas de 28 y 36 kD menores. La fracción NBNB agrupada fue purificada adicionalmente por cromatografía hidrofóbica sobre Fenil Superosa. La fracción de NBNB fue equilibrada con la solución amortiguadora de Na-fosfato 0.03 M de pH 7.0, que contiene (NH )2S0 1.2 M y se aplicó a una columna. Las proteínas absorbidas fueron eluidas en un gradiente de (NH4)2S04 1.2-0.6 M. Por consiguiente la xilanasa homogénea con el PM de 30 y 51 KD y pl de 9.1 y 8.7 respectivamente fue obtenida como lo fue una proteasa de 30 kD con pl de 8.9. Las xilanasas no poseen una actividad de celobiosa de MUF y por consiguiente son xilanasas verdaderas. La xilanasa de 30 kD alcalina (pl 9.1) poseyó una actividad elevada dentro de un intervalo de pH muy amplio desde 5-8 manteniendo 65% de la actividad máxima a pH 9-10; la misma es un elemento de la familia de la xilanasa F; sus secuencias de aminoácidos y nucleótidos parciales son mostradas en la SEC ID No. 5. La secuencia de aminoácidos parcial mostrada corresponde a aproximadamente los aminoácidos 50-170 desde la terminal o extremo N de la proteína madura. Las xilanasas de acuerdo con la invención tienen al menos 60%, preferentemente al menos 70%, más preferentemente al menos 80% de identidad de la secuencia de la secuencia de aminoácidos parcial de la SEC ID No. 5. El promotor de xilanasa correspondiente, el cual es una modalidad preferida de la invención, puede ser identificado utilizando la secuencia de nucleótidos parcial de la SEC ID No. 5. La xilanasa de 51 kD (pl 8.7) poseyó una actividad máxima a pH 6 y retuvo al menos 70 % de su actividad a pH 7.5 y la misma retuvo al menos 50% de su actividad a pH 8.0. La misma no fue muy estable con solamente 15 % de la actividad a pH 5.5 y 4% a pH 7.5. La constante de Michaelis hacia el xilano de abedul fue de 4.2 g/l para la xilanasa de 30 kD y 3.4 g/l para la xilanasa de 51 kD. La temperatura óptima fue elevada e igual a 70 °C para ambas xilanasas. La actividad de la proteasa de 30 kD medida hacia las proteínas de la fracción de NBNB parece que va a ser igual a 0.4 x 10_3 unidades/ml a 50 °C y pH 7, 90 kD. La fracción exhibió una actividad hacia la caseína teñida de 0.4 unidades arbitrarias/mg (pH 7). La adición de urea como el agente caotrópico condujo a un incremento de 2-3 veces en la actividad de la proteasa. El efecto de la proteasa sobre la actividad de la xilanasa fue significativa. Solamente 30% de la actividad de la xilanasa permaneció a pH 10.3 y 50 °C después de 30 minutos de incubación. A pH 8, permaneció una actividad de la xilanasa del 95%. La adición de LAS condujo a un reducción dramática de la actividad de la xilanasa a pH 8 y 10.3 con solamente 50% de la actividad de la xilanasa después de 10 minutos de incubación con o sin el PMSF del inhibidor de la proteasa. La proteasa de 30 kD fue alcalina con un pH óptimo a pH 10-11. La actividad es inhibida por el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y no por el ácido yodoacético, la pepstatina A y EDTA lo cual la caracteriza como una proteasa del tipo de la serina. La proteasa no es activa hacia las proteínas de Cl a pH neutral y 50 °C sin agentes caotrópicos. El incremento del pH y la adición de los agentes caotrópicos tales corao LAS, SDS y urea incrementan significativamente la proteólisis. Las fracciones 39-41 fueron purificadas por cromatografía hidrofóbica sobre fenol superosa. Las fracciones fueron equilibradas con solución amortiguadora de fosfato Na al 0.03M a pH 7.2 que contiene (NH4)2S04 al 1.5 M y se aplicó a una columna. Las proteínas adsorbidas fueron eluidas en el gradiente de (NH )2S0 de 1.5-0. Por consiguiente la xilanasa homogénea con PM de 60 kD y pl de 4.7 fue obtenida. Esta xilanasa poseyó actividades hacia el xilano, la MUF-celobiosida, la MUF-xilosida y la MUF-lactosida. Esta xilanasa probablemente pertenece a la familia 10 (familia F) . Esta xilanasa fue estable a un pH desde 5 hasta 8 durante 24 horas y retuvo más del 80% de actividad a 50 °C. La misma retuvo 70% de la actividad a pH 5-7 a 60 °C. La misma mantuvo 80% de actividad durante 5 horas y 35% durante 24 horas a 50 °C y pH 9. A pH 10, se retuvo 60% de la actividad a 50 °C y 0.5 horas de incubación. Después de 5 horas de incubación a pH 8 y 60 °C, 45% de la actividad se encontró que disminuye a 0 después de 24 horas. La misma tuvo un pH óptimo dentro del intervalo de pH de 6-7 y mantuvo 70% de la actividad a pH 9 y 50% de su actividad a pH 9.5. La constante de Michaelis hacia el xilano del abedul fue de 0.5 g/l. La temperatura óptima fue elevada e igual a 80 °C. Las fracciones 44-48 fueron purificadas entonces por enfocamiento por cromatografía sobre un aparato Mono P. Un gradiente del pH desde 7.63-5.96 fue utilizado para la elución de las proteínas. Como un resultado la endoglucanasa de 45 kD fue aislada con un pl de 6. La endo de 45 kD tuvo una actividad máxima a pH 5 hacia el CMC y a pH 5-7 hacia RBB-CMC. La endo de 45 kD retuvo 70% de su actividad máxima hacia CMC a pH 6.5 y 70% de su actividad máxima hacia RBB-CMC fue retenida a pH 7.0; 50% de su actividad máxima hacia CMC fue retenida a pH 7 y 50% de su actividad máxima hacia RBB-CMC fue retenida a pH 8. La constante de Michaelis hacia CMC fue de 4.8 g/l. La temperatura óptima fue elevada e igual a 80 °C. Otras proteínas de 28, 33, 36, 55, 60 y 66 kD fueron mezcladas y eluídas conjuntamente. Las fracciones 52-58 fueron purificadas por enfocamiento por cromatografía sobre Mono P también con un gradiente de pH de 7.6-4.5. La endoglucanasa de 55 kD individual con pl de 4.9 fue obtenida. La endo de 55 kD fue neutral. La misma tiene un pH óptimo amplio desde 4.5-6 y 70% de la actividad fue retenida a un pH de 7.0 tanto para CMC como RBB-CMC y 50 % de la actividad fue retenida a un pH de 8 tanto para CMC como RBB-CMC. La constante de Michaelis hacia el CMC fue de 1 g/l. La temperatura óptima fue elevada e igual a 80 °C. Un número de fracciones también retuvieron proteínas con PM de 28, 33 y 36 kD. Las proteínas de 45, 48 y 100 kD fueron aisladas de la fracción de DEAE Toyopearl unida de la muestra concentrada con UF de F 60-8 del cultivo de Chrysosporium de las fracciones 50-53 utilizando la cromatografía Macro Prep Q. Las fracciones 50-53 fueron equilibradas con la solución amortiguadora de HCl imidazol 0.03 M, pH 5.75 y fueron aplicadas a una columna y las proteínas adsorbidas fueron eluidas en el gradiente de NaCl de 0.1-0.25 M durante 4 h. Como un resultado las proteínas de 45 kD (pl 4.2), 48 kD (pl 4.4) y 100 kD (pl 4.5) fueron aisladas en estados homogéneos (Figura 17). La proteína de 45 kD es supuestamente una alfa beta-galactosidasa en virtud de su actividad hacia la p-nitrofenil alfa-galactosida y p-nitrofenil beta-galactosida. El pH óptimo fue de 4.5, 70% de la actividad fue mantenida a pH 5.7 y 50% de su actividad fue retenida a pH 6.8. La temperatura óptima fue de 60 °C (Figura 18). La proteína de 48 kD fue una celobiohidrolasa que tiene una actividad elevada hacia la p-nitrofenil beta-glucosida y también las actividades hacia la MUF celobiosida, la MUF lactosida y el butirato de p-nitrofenilo. La proteína de 48 kD tuvo un pH óptimo de 5 hacia CMC y 5-6 hacia RBB-CMC (Figura 19) . La proteína de 100 kD con pl de 4.5 poseyó una actividad solamente hacia el butirato de p-nitrofenilo. La misma es probablemente una esterasa pero no es una esterasa de feruloilo porque la misma no tuvo una actividad contra el éster metílico del ácido ferúlico. La misma tuvo un pH neutral/alcalino (pH 8-9) y una temperatura óptima de 55-60 °C (Figuras 20, 21) . La proteasa de 90 kD con pl de 4.2 fue aislada de la fracción unida y la actividad medida hacia las proteínas de la fracción de NBNB parece que va a ser igual a 12 x 10_3 unidades/ml a 50 °C y pH de 7.90 kD. La fracción exhibió una actividad hacia la caseína seca de 0.01 unidades arbitrarias/mg (pH 7) . La adición de la urea como el agente caotrópico condujo a un incremento de 2-3 veces de la actividad de la proteasa como lo hizo la adición de LAS tanto a pH 7 como 9 (50 °C) . La proteasa de 90 kD fue neutral con el pH óptimo a pH 8. La actividad es inhibida por el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y no por el ácido yodoacético, la pepstatina A y el EDTA lo cual la caracteriza como una proteasa del tipo de la serina. También se aislaron de la fracción unida la endoglucanasa de 43 kD con pl de 4.2 (fracciones 33-37) y la endoglucanasa de 25 kD con pl de 4.1 (fracciones 39-43), la celobiosa de 55 kD con pl de 4.9 (fracciones 39-43) y la poligalacturonasa de 65 kD con pl de 4.4 (fracciones 39-43). Las endoglucanasas no poseen actividad hacia el avicel o la celobiosida MUF y poseyó una actividad elevada hacia MC, RBB-CMC, CMC41, el beta-glucano y la endoglucanasa. La endo de 25 kD no redujo la glucosa a partir de CMC y la endo de 43 kD lo hizo. Ninguna glucosa fue formada a partir del avicel. El pH óptimo para la proteína de 43 kD fue de 4.5 con la actividad máxima del 70% mantenida a pH 7.2 y 50% a pH 8. La endo de 43 kD mantuvo 70% de actividad a pH 5 y 6 durante 25 horas de incubación. La misma mantuvo solamente 10% a pH 7 durante este período de incubación. La endo de 25 kD tuvo un pH óptimo de la actividad a pH 5 hacia CMC y el pH óptimo amplio de la actividad hacia RBB-CMC con 70% de la actividad máxima que es mantenida a pH 9 y con 50% de la actividad máxima que está a pH 10. La misma mantuvo 100% de la actividad a pH 5 y 6 y 80% a pH 7, 8, 8.6 y 9.6 durante 120 horas de incubación. La endo de 25 kD tuvo una temperatura óptima de la actividad a 70 °C. La endo de 43 kD tuvo una temperatura óptima de la actividad a 60 °C. Las constantes de Michaelis hacia CMC fueron de 62 y 12.7 g/l para las endo de 25 y 43 kD respectivamente. La poli-galacturonasa es una pectinasa. La constante de Michaelis hacia PGA fue de 3.8 g/l. El pH óptimo de la actividad de PGU está dentro del intervalo de pH de 5-7 y la T óptima dentro de 50-65 °C.

Los genes que codifican las proteínas de C. lucknowense fueron obtenidos utilizando la PCR y se caracterizaron por el análisis de la secuencia. Los genes completos correspondientes fueron obtenidos por la selección de las bibliotecas de los genes (parciales) utilizando los fragmentos de PCR aislados. El gen completo de la endoglucanasa de 43 kD (EG6, Familia 6) de la cepa Cl ha sido clonado, secuenciado y analizado (incluyendo la región promotora de 2.5 kb y la región terminadora de 0.5 kb) . Sus secuencias de nucleótidos y aminoácidos son mostradas en la SEC. ID No. 1. El peso molecular predicho de la proteína madura es de 39,427 Da y la pl predicha es de 4.53, tales valores corresponden bien con los valores medidos. El análisis del alineamiento de las proteínas con otras hidrolasas de glicosilo de la familia 6.2 muestra que la C1-EG6 no incluyó el análisis de la Homología del dominio de unión de la celulosa (CBD) utilizando el programa SwissProt SAMBA (algoritmo de Smith & Waterman, penalidad de Gap (Hueco) de 12/2, alineamiento 10, matriz Blosum62) muestra que C1-EG6 tiene 51.6% de identidad con Fusarium oxysporum EG-B (sobre 376 aminoácidos), 51.0 % de identidad con CBH3 de Agaricus bisporus (sobre 353 aminoácidos), y 50.7 % de identidad con Trichoderma reesei CBH2 (sobre 367 aminoácidos) . La secuencia de la señal supuesta corre desde Met 1 hasta Arg 28. El promotor contiene varios sitios de unión de CreA potenciales, de modo que es muy probable que este promotor podría estar sometido a la represión de la glucosa en una cepa fungosa con la regulación de CreA de trabajo. De manera similar, el gen completo de la endoglucanasa de 25 kD (EG5, Familia 45) de la cepa Cl ha sido clonado, secuenciado y analizado (incluyendo la región promotora de 3.3 kb y la región terminadora de 0.7 kb) . Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos son mostradas en la SEC ID No. 2. El peso molecular predicho de la proteína madura es de 21,858 Da y el pl predicho es de 4.66, tales valores corresponden bien con los valores medidos. Esta es la endoglucanasa fungosa más pequeña conocida hasta la fecha. El análisis del alineamiento de las proteínas con otras hidrolasas de glucosilo de la familia 45 muestra que la C1-EG5 no incluye un dominio de unión de la celulosa (CBD) , ni un dominio de cohesina/dockerina. El análisis de la homología utilizando el programa NCBI-BLASTP2 (penalidad de Gap (Hueco) de 11/1, alineamiento 10, matriz Blosum62) muestra que la proteína homologa más cercana a C1-EG5 es Fusarium oxysporum EG-K con 63% de identidad. La secuencia de la señal supuesta corre desde Met 1 hasta Ala 18. El promotor contiene muchos sitios de unión de CreA potenciales, de modo que es muy probable que este promotor podría estar sometido a la represión de la glucosa en una cepa fungosa con el trabajo de regulación de CreA. Además, una endoglucanasa adicional fue encontrada por PCR con base en el análisis de la homología de las celulasas de la familia 12. Las secuencias de los aminoácidos y los nucleótidos parciales de esta endoglucanasa adicional (EG3, Familia 12) se da en la SEC ID No.3. La proteína de 55kD fue una celobiohidrolasa (referida aquí como CBH1) con actividad contra la MUF-celobiosida, MUF lactosida, FP y avicel, también contra la ß-glucosida de p-nitrofenilo, la celobiosa y la lactosida de p-nitrofenilo. Su actividad hacia la MUF celobiosida es inhibida por la celobiosa. La constante de la inhibición de 0.4 mM fue determinada. La constante de Michaelis hacia la MUF celobiosida fue de 0.14 mM, hacia la MUF lactosida fue de 4 mM y hacia el CMC fue de 3.6 g/l. El pH óptimo es más bien amplio desde 4.5 hasta 7. 50 % de la actividad máxima hacia CMC y 80% de la actividad hacia RBB-CMC es mantenida a pH 8. 70-80 % de la actividad dentro de pH 5-8 es mantenida durante 25 horas de incubación. La temperatura óptima es de 60-70 °C. La CBHI es probablemente un elemento de la familia 7 de la celobiohidrolasa; sus secuencias de nucleótidos y aminoácidos parciales son mostradas en la SEC ID No. 4. La secuencia de aminoácidos parcial mostrada corresponde aproximadamente a los aminoácidos 300-450 del extremo o terminal N de la proteína madura. Una celobiohidrolasa de acuerdo con la invención tiene al menos 60%, preferentemente al menos 70%, aún más preferentemente al menos 80 % de identidad de la secuencia, de la secuencia de aminoácidos parcial de la SEC ID No. 4. El promotor de CBH correspondiente, el cual es una modalidad preferida de la invención, puede ser identificado utilizando la secuencia de nucleótidos parcial de la SEC ID No. 4. Un efecto sinergístico fue observado entre la endo de 25 kD y la CBH de 55 kD durante la hidrólisis del avicel. El coeficiente de sinergismo fue máximo a la relación de la endo de 25 kD con respecto a la CBH de 55 kD de 80:20. La Ksyn fue de 1.3 en su punto máximo.

K3 L? o las Tablas A, B y J ilustran los detalles de lo anterior.

Tabla J Esquema de purificación Purificación de las muestras de F 60-8 (conc. con UF) y F 60-31 Filtrado del cultivo Cromatografía de ED E&&ÉAEEE---TTToyopearl El nivel de expresión de cinco genes de Chrysosporium principales fue estudiado por el análisis de Northern. Varias cepas del C. l ucknowense se hicieron crecer en un medio rico que contiene el medio farmacéutico con celulosa y lactosa (medio 1) o el medio rico que contiene el medio farmacéutico y glucosa (medio 2) a 33 °C. Después de 48 horas, el micelio fue colectado y el ARN fue aislado. El ARN fue hibridizado con 5 diferentes sondas: EG5, EG6, EG3, XylF y CBH. Después de la exposición, los manchados de Northern fueron colocados como rayas o bandas e hibrizados nuevamente con una sonda para el ribosoma L3 como un control para la cantidad del ARNm sobre la mancha. Muchas cepas mostraron una respuesta muy elevada hacia el CBH y una respuesta elevada hacia el XylF en el medio 1; en el medio 2, la mitad de la cepa mostró una respuesta elevada hacia todos los genes, y la otra mitad mostró una respuesta baja. El orden de la fuerza de la expresión se dedujo de estos datos como CBH>XylF>EG5>EG3>EG6. Las Tablas A, B y J ilustran los detalles de lo anterior.

Descripción de las Figuras La Figura 1 es un manchado de Western como se describió en los ejemplos. La Figura 2 es un mapa de pUT720.

La Figura 3 es un mapa de pUT970G. La Figura 4 es un mapa de pUT1064. La Figura 5 es un mapa de pUT1065. La Figura 6 es un mapa de pF6g. La Figura 7 es un mapa de pUT1150. La Figura 8 es un mapa de pUT1152. La Figura 9 es un mapa de pUT1155. La Figura 10 es un mapa de pUT1160. La Figura 11 es un mapa de pUT1162. La Figura 12: cromatografía de intercambio de iones sobre Macro Prep Q de la fracción NB después de DEAE-Toyopearl de la muestra de F-60-31 CF. Las Figuras 13a-e: dependencias del pH de la actividad de las enzimas a partir de las fracciones de NB de la muestra de F-60-31 CF. Las Figuras 14a-d: Estabilidad de las enzimas de la fracción NB de la muestra de F-60-31 CF a pH 5.5 y 7.5 (60 °C) . Las Figuras 15a-b: Estabilidad del pH a 60 °C y 50 °C de Xyl de 60 kD (pl 4.7) de la fracción de NB de la muestra F-60-31. Las Figuras 16a-e: Dependencias de la temperatura de las enzimas de la fracción NB de la muestra F-60-31.

La Figura 17: Cromatografía de intercambio de iones sobre Macro Prep Q de las fracciones 50-53 unidas después de DEAE-Toyopearl de la muestra F-60-8. Las Figuras 18a-b: Dependencias del pH y la temperatura de la actividad de la a-galactosidasa de la muestra concentrada con UF de F-60-8. La Figura 19: dependencias del pH de la actividad de CBH de 48 kD (pl 4.4) de las fracciones unidas de la muestra concentrada con UF de F-60-8. La Figura 20: Dependencias de la temperatura de la actividad hacia el butirato de p-nitrofenilo de la muestra concentrada con UF de F-60-8. La Figura 21: Dependencias del pH de la actividad hacia el butirato de p-nitrofenilo de la muestra concentrada con UF de F-60-8. La Figura 22: cursos del pH de las actividades de las proteasas de 30 kD (pl 8.9) y 90 kD (pl 4.2) hacia las proteínas de Cl (50 °C, 30 minutos de incubación) . Las Figuras 23a-d: Efecto de la proteasa * alcalina" de 30 kD (pl 8.9) sobre la actividad de la xilanasa de la fracción de NBNB (Macro Prep Q) de 60-31 CF a 50°. Las Figuras 24a-f: Efecto de la proteasa ""neutral" de 90 kD (pl 4.2) sobre la actividad de CMCase de las proteínas en la fracción #44-45 unida (DEAE-Toyopearl) de la muestra concentrada con UV de F 60-8 a 50 °C.

La Figura 25: Hidrólisis completa del ácido poligalacturónico por la poligalacturonasa de 65 kD (pl 4.4); 50 °C, pH 4.5; concentración pf PGA = 5 g/l, concentración de la proteína = 0.1 g/l. Las Figuras 26a-b: Dependencias de la temperatura y del pH de la actividad de poligalacturonasa de la muestra concentrada con UF de F-60-43. La Figura 27: Inhibición de la actividad hacia la MUF-celobiosida por la celobiosida para 55 kD CBH (pl 4.4): pH 4.5, 40 °C. La Figura 28: Efecto sinergístico entre la Endo de 25 kD (pl 4.1) y la CBH de 55 kD (pl 4.4) hacia el avicel (40 °C, pH 5, 25 minutos) . Las Figuras 29a-d: Hidrólisis completa de CMC (a) y avicel (b) por las enzimas aisladas de las fracciones unidas de la muestra concentrada con UF de F-60-8 (50 °C, pH 5) : concentración de CMC y avicel - 5 g/l, concentración de la Endo de 25 kD = 0.01 g/l, concentración de la Endo de 43 kD = 0.02 g/l; Endo de 1-25 kD (pl 4.1), Endo de 2-43 kD (pl 4.2). Las Figuras 30a-d: Hidrólisis completa de CMC (1) y avicel (2) por CBH de 55 kD (pl 4.4) sin (a) y con (b) glucono-d-lactona (50 °C, pH 4.5) : concentración de CMC y avicel = 5 g/l, concentración de la proteína = 0.1 g/l, concentración de la glucono-d-lactona = 5 g/l.

Las Figuras 31a-b: La dependencia del pH es de las actividades de la CMCase y RBB-CMCase de las enzimas aisladas de la muestra concentrada con UF de F-60-8: Endo de 1-25 kD (pl 4.1), Endo de 2-43 kD (pl 4.2). La Figura 32: Dependencias del pH de las actividades de CMCase y RBB-CMCase de la CBH de 55 kD (pl 4.4) . Las Figuras 33a-c: dependencias de la temperatura de la actividad de CMCase (pH 4.5) de las enzimas aisladas de las fracciones unidas de la muestra concentrada con UF de F- 60-8: CBH de 1-55 kD (pl 4.4), Endo de 2-25 kD (pl 4.1), Endo de 3-43 kD (pl 4.2) . Las Figuras 34a-c: Estabilidad del pH (50 °C) de las enzimas aisladas de las fracciones unidas de la muestra concentrada con UF de F-60-8: CBH de 1-55 kD (pl 4.4), Endo de 2-25 kD (pl 4.1), Endo de 3-43 kD (pl 4.2). La Figura 35: Adsorción de las enzimas aisladas de las fracciones unidas de la muestra concentrada con UF de F-60-8.

Referencias (Los contenidos de las mismas son incorporados) 1. Calméis T.P., Martin F., Durand H., y Tiraby G. (1991) Proteolytic events in the processing of secreted proteins in fungi . J Biotechnol 17(1): p. 51-66. 2. Punt P.J., Dinge anse M.A., Jacobs-Meijsing B.J., Powels P.H., y van den Hondel C.A. (1988) Isola tion and characterization of the glyceraldehyde-3-phospha te dehydrogenase gene of Aspergillus nidulans. Gene 69(1): p. 49-57. 3. Shoemaker S., Schweickart V., Ladner M., Gelfand D., Kwok S., Myambo K., e Innis M. (1983) Molecular Cloning of exo- cellobiohydrolase I derived from Trichoderma reesei strain L27. Bio/Technology Oct. : 691-696. 4. Drocourt D., Calméis T., Reynes J.P., Barón M., y Tiraby G. (1990) Cassettes of the Streptoalloteichus hindustanus ble gene for transformation of lower and higher eukaryotes to phleomycin resistance . Nucleic Acids Res 18(13): p. 4009. 5. Mullaney E.J., Hamer J.E., Roberti K.A., Yelton M.M., y Timberlake W.E. (1985) Primary structure of the trpC gene from Aspergillus nidulans . Mol Gen Genet 199(1): p.37-45, 6. Yanisch-Perron C, Vieira J., y Messing J. (1987) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene 33:103- 119. 7. Durand H., Barón M., Calméis T., y Tiraby G. (1988) Classical and molecular genetics applied to Trichoderma reesei for the selection of improved cellulolytic industrial strains, en Biochemistry and genetics of cellulose degrada tion, J.P. Aubert, Editor. Academic Press. P.135-151. 8. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., y Randall R.J. (1951) Protein measurements wi th the folin phenol reagent . J. Biol. Chem. 7:193-265. 9. Pariche M., Bousson J.C., Barón M., y Tiraby G. Development of heterologous protein secretion systems in filamentous fungi . en 3rd European Conference on Fungal Geneti cs . 1996. Münster, Alemania. 10. Barón M., Tiraby G., Calméis T., Pariche M. , y Durand H. (1992) Efficient secretion of human lysozyme fused to the Sh ble phleomycin resistance protein by the fungus Tolypocladium geodes . J. Biotechnol 24(3):p. 253-266. 11. Jeenes D.J., Marczinke B., MacKenzie D.A., y Archer D.B. (1993) A truncated glucoamylase gene fusión for heterologous protein secretion from Aspergillus niger. FEMS Microbiol. Lett. 107(2-3): p. 267-271. 12. Stone P.J., Makoff A.J., Parish J.H., y Radford A. (1993) Cloning and sequence-analysis of the glucoamylase gene of neurospora -crassa . Current Genetics 24(3): p. 205-211. 13. Mórsky P. (1983) Turbidimetric determina tion of lysozyme wi th Micrococcus lysodeikti cus cells : Reexamina tion of reaction condi tions . Analytical Biochem. 128:77-85. 14. Paluh J.L., Orbach M.J., Legerton T.L., y Yanofsky C. (1988) The cross-pa thway control gene of Neurospora crassa , cpc-1 , encodes a protein similar to GCN4 of yeast and the DNA-binding domain of the oncogene v-jun-encoded protein . Proc Nati. Acad Sci U S A 85(11): p-3728-32. . Nakari T., Onnela M.L., limen M., Nevalainen K., y Penttilá M. (1994) Fungal promotors active in the presence of glucose, Patent #WO 94/04673, Alko. . Torronen A., Mach R.L., Messner R., González R., Kalkkinen N., Harkki A., y Kubicek C.P. (1992) The two major xylanases from Trichoderma reesei : characteriza tion of both enzymes and genes . Biotechnology (N Y) 10(11): p. 1461-5.

O S ecuencias d e Chrys o s po r i um SEC ID NO . ^Familia 6) fue obtenida ñor PCR basado en el secuenciamiento de la proteína "Endo 43kD" C1 -EG6 "43kD" y el análisis de l? homología de las .celu?asas de la familia 6 -2508 GGATCCACACCTACCATACCGGATAGTATGCTACCCAAGTGACATAGG -2461 GTTGGTAAAGTAATACGAGAACTCAGAGAGCACTGCCCATATGGCTCGCCAATGACCTCA -2401 AGTGCCAGGTCAGCTTTGCGAGACAGACCTGAGCGCGTCGGATGTGTGACATGGAACGCG -2341 CCGGATCGCCTTGTTGATTAATTATAGGGAAGTAGCGAGGAAGGTTTCAGCAATTGACGT -2281 GAGCGTACATTAAAAGCTGTATGATTTCAGGAAGACGAGCCATGGACCAGGTTTCAAGGC -2221 TGAATGGCTTGACGACTTAAGCACCGAACGAGGAATGAAAGAATGAAAAGTGGGGGATCA -2161 creA TTCTGGCCCCTCCTCGTATGTCGAGTGTTAAAGAAGGCGGTTCTACGGAGGACCTAAAGA -2101 GCTCCAATTTGCTCTGTTGAGCTTAAGCCACATATCTCAAGATGAATACATGTCAGGCAT -2041 AGTCACCCTGATCTTGTTCATCAGTCCACACACTTTTCAGTTCAGCATGTTGATTCCTCA -1981 TCCATATCACTTTCCATTACTATCTCTTTATGTCCTTGGTCAAGACTCCAAGGAACCGAT -1921 AGGTGAGCATCGGTGAGGCTCCCTCAAGGTACCAAAGTAGCCATCATCACCGAGGTCTGG -1861 GAATGGCGCCGTGCCCGATCTGAGTCCTCCAACTCCACGGTACGACGACAGCACGTCACA -1801 o TTGACGCACCACGGTTGAACAAGCAGAGAGGGACACGTCTTGCTACGCGAATCCTGGCAC -1741 "° TGGATGGAGACGCGTGTGAGCAGGTTTCCGGAACCATGACGGCCTGGTCCGGCTTCTCGA -1681 ACAAAGAAGTGGAACACAAAAAGAACCGAAACGGAAACGCAGGCACGGCATCGACGACCG -1621 GATTGTCCCACGGGGACCTCGGCCAGTCAAGCGTTGCCCTGGCCGTCAGCTCCCTGGCGA -1561 CGGGGATTCAGCACATCTCACGTTATAGGCGACCTCATCCCCCTTCCGTCTTGTGCGGTC -1501 GTTGCTCCGTGCCGAGTACCCAGGCGTGCCGGGGCCTTTAGCCGGGGCGGAATCAGAGTC -1441 creA AAGATGCGGCCGAATTGGACGGCAGACGAAGTTTCGTAGAGGGTCATGATCGGCACTGAC -1381 GACACCCACCCCTGCGTGATCCCGTGGCCCTGGGCTGGGAATTGCCGGCTAATAATCTAC -1321 GGCTTAATAGATATGCACTTTGCACGCGGTGCAGATAAATAAGCTGTGGTTTCAAACACT -1261 GGCCTCCGTACTTTACCCACCAACTGCCGCTTAGCGCCGGGACCTGAGTCTTGGGAGTGC -1201 GCGGAGCGGCAGCCACCTCGGGTTAGCGTACACACGACGGCTGCATGCGGGGATGCCGCG -1141 creA TGCATGGCTTCATAGTGTACGACAGACCGTCAAGTCCAAATCTGGGTGATGCTTGATGAG -1081 creA ATGACAGCGAGCCCCGTCGGCGGCACCCCGGCTATGCATCGCGAATTGACAACACTCTCA -1021 GCTCTATTGCGACCCATCGGATAAAAGAAGAAGAAAAAAATGGACCTTGAGTACGGGCGT -961 CAGAAACCAAAAAAAAACTCCGGAACCAAATATGTCGGGCATGGCCGGGGTGAACGACCG -901 CTACTCCCCGTTCCCTTCTTCGCAAACAGAACGCTACAGAGGGTTTTCTGGTTTGTCAAA -841 GAGTTCGGAGGTCCTCTGCTCCGCGAATGCGTGGTGAACCCACCAGCAGCCATTGTTCTT -781 GCATGCGTGGCGGACCGTTAGCCGCTGATCGACATGGCGAGCTTCCCACCTCAGACCTGG -721 creA AGCAGACGGTTGCGAGGAGCAAGGGGCTGCCCTCCCCCTGACGGTCGGACCCCAATGACT -661 TCCCCAAACGGGGACATCGAGGGTCGTGCATGATGGTGGAAAGTAGTTGCAGTATGGGAA -601 GTACCCCGGGTTGCCAGGAACCGTTGTTCGGCCCCCCACATTTTCTCTCTGCCATGTCAA -541 CTGTGTGTCGTTCGAGAGTTCCTGGCTCCGGCCCCCCGTCCAATTCCCTAACGGGACCGC -481 creA > o GGGGCATCGCCTGTAACTAACTTCCAAATGAAGCCGGATATGAGGGAGGGAGATTGGATC -421 TGGCAAGCCAGCCATTCGCTGCGATCGGCACTCGTCCGTCAGCCCCGCAGTCCATATCCC -361 areA CAAAGGCAACTGCTCGGCGCGGCTCAAGTCTTCTTCGGAACGTCCAGCCCGAAGGCGCGC -301 GCCAGCACCGGCCCTATGTTCCTGATTGCGATCCTCGATCTCCAGAGACGGGTCACCTCG -241 CCTCGAGGACGGTGCAGGGGCATCGGCTTCGCTTCCTAGAGCTCCGGGCTGTGTGTGGTC -181 AAGGGGAGAAGGCGGCGGCGCCAAGGTGCGTCTCGGCGCACTCACCCATCGCCTTTACCC -121 CCCTCCCCCCCAGTATATAAAAGATGGCCATCGTCTCCTCGTCTGCTTGGGAAGAAAGGA -61 TCTCTCGACCATGCACCACAGCCTAGCTCTAACCCAGCTTGTCGTGTGTTGTTGCCCAGC -1 ini .transe ATGAAGTTCGTGCAGTCCGCCACCCTGGCGTTCGCCGCCACGGCCCTCGCTGCGCCCTCG +60 SEC de la M K F V Q S A T A F A A T A A A P S 20 Señal Supuesta CGCACGACTCCCCAGAAGCCCCGCCAGGCCTCGGCGGGCTGCGCGTCGGCCGTGACGCTC +120 R T T P Q K P R Q A S A G C A S A V T 40 GATGCCAGCACCAACGTGTTCCAGCAGTACACGCTGCACCCCAACAACTTCTACCGTGCC +180 D A S T N V F Q Q Y T L H P N N F Y A 60 GAGGTCGAGGCTGCCGCCGAGGCCATCTCCGACTCGGCGCTGGCCGAGAAGGCCCGCAAG +240 E V E A A A E A I S D S A L A E K A R K 80 GTCGCCGACGTCGGTACCTTCCTGTGGCTCGACACCATCGAGAACATTGGCCGGCTGGAG +300 V A D V G T F L W L D T I E N I G R L E 100 CCCGCGCTCGAGGACGTGCCCTGCGAGAACATCGTGGGTCTCGTCATCTACGACCTCCCG +360 P A L E D V P C E N I V G L V I Y D L P 120 GGCCGTGACTGCGCGGCCAAGGCCTCCAACGGCGAGCTCAAGGTCGGCGAGCTCGACAGG +420 G R D C A A K A S N G E L K V G E L D R 140 TACAAGACCGAGTACATCGACAgtgagttaaccctttgtggccccttcttttcccccgag +480 Intron 1 Y K T E Y I D 147 agagcgtctggttgagtggggttgtgagagagaaaatggggcgagcttaaagactgacgt +540 gttggc cgcagAGATCGCCGAGATCCTCAAGGCCCACTCCAACACGGCCTTCGCCCTCG +600 K I A E I L K A H S N T A F A L 163 TCATCGAGCCCGACTCGCTCCCCAACCTGGTCACCAATAGCGACCTGCAGACGTGCCAGC +660 V I E P D S L P N L V T N S D L Q T C Q 183 AGAGCGCTTCCGGCTACCGCGAGGGTGTCGCCTATGCCCTCAAGCAGCTCAACCTCCCCA +720 Q S A S G Y R E G V A Y A K Q L N L P 203 ACGTGGTCATGTACATCGATGCCGGCCACGGTGGCTGGCTCGGCTGGGACGCCAACCTCA +780 N V V M Y I D A G H G G W L G W D A N L 223 AGCCCGGCGCCCAGGAGCTCGCCAGCGTCTACAAGTCTGCTGGTTCGCCCTCGCAAGTCC +840 K P G A Q E L A S V Y K S A G S P S Q V 243 GCGGTATCTCCACCAACGTGGCTGGTTGGAACGCCTGgtaagacactctatgtCcccctc +900 Intron 2 R G I S T N V A G W N A W 256 gtcggtcaatggcgagcggaatggcgtgaaatgcatggtgctgacctttgatcttttccc +960 cctcctatagGGACCAGGAGCCCGGTGAGTTCTCGGACGCCTCGGATGCCCAGTACAACA +1020 D Q E P G E F S D A S D A Q Y N 272 AGTGCCAGAACGAGAAGATCTACATCAACACCTTTGGCGCTGAGCTCAAGTCTGCCGGCA +1080 K C Q N E K I Y I N T F G A E L K S A G 292 TGCCCAACCACGCCATCATCGACACTGGCCGCAACGGTGTCACCGGTCTCCGCGACGAGT +1140 P N H A I I D T G R N G V T G L R D E 312 GGGGTGACTGGTGCAACGTCAACGGCGCCGGCTTCGGTGTGCGCCCGACTGCCAACACTG +1200 W G D W C N V N G A G F G V R P T A N T 332 GCGACGAGCTCGCCGACGCCTTCGTGTGGGTCAAGCCCGGTGGCGAGTCCGACGGCACCA +1260 G D E L A D A F V W V K P G G E S D G T 352 GCGACTCGTCGGCGGCGCGCTACGACAGCTTCTGCGGCAAGCCCGACGCCTTCAAGCCCA +1320 S D S S A A R Y D S F C G K P D A F K P 372 GCCCCGAGGCCGGTACCTGGAACCAGGCCTACTTCGAGATGCTCCTCAAGAACGCCAACC +1380 S P E A G T W N Q A Y F E M L L K N A N 392 CGTCCTTCTAAGCTCCTCGACGGCTTCTTGCTGTCAGTCGCTCTGACGGTGGTGTGCTGG +1440 t49 P S F * 395 TGGTGCCCCTGCTCCTGCTGCTGCTGCTCCGCGGGGAGGGGAGGCAACGAAAATGAAGTC +1500 tl09 K O CTGCTTCAAAACAAAACAGAAACAAGCGAGGCGCGGTGCAATGGTCGTGCGTTCGTCTTT +1560 tl69 TTTCATGTTCCCTTCTAGTGTAGTAGTTTGATAGTCGTACATAAGGGGTTTCAGAACCGT +1620 t229 CTCTCTGTCTCGGTCTTTTTGCGAGTTGTTGCGACTCGTGATTATGGCCTTTGTTGCTCG +1680 t289 TTGCGGCAGAGTAGAACCACAGCGTGTTGGGGTAGCAGCTTGCTCCGTAGGACGTAGGGA +1740 t349 AACAACCTGAGACTCTGGAATTGCAGTCAGCCTGCGTCGCCCCTCTAGGAAACGAAGGGG +1800 t409 AGAACCAGTAGTGGCTGCAGCTTACAAACGCGAGCATGGTGAACATCTCCGAGAAAAGGG +1860 t469 AGGGATCC +1868 t477 BamHl SEC ID No. 2: Gen C1-?G5 "25kD" (Familia ¿+5), obtenido por PCR basado en el secuenciamiento de la proteína de "Endo 25kD" y el análisis de la homología de la familia 45 -3309 GCTTAGGAG -3301 AATCACGAGAAGCTAATTGGGCTCTATAGTATCCGACAAGATGACCCAGAGCGAGATTGA -3241 GGATCTCGAGGGAACCCTGAAGCAGAGCAGCAACAACGACACCAGCCTCCTCCGCGACCT -3181 GCTCGACAAGATTCCCGATGGCCTCCTCGGCGGCAACAACAAATCCAAGCTGGACGATAT -3121 CCAGAGCAACGCGCAGGCCGCGCAGATGGAGAACCTGAGCGTCTCGCCGCGGGAACCCGA -3061 GGAGCTGACCAGATACGTCCAGGAAGTGTTCCGTCAGATCATGCCCGCCATCAAGTTCCA -3001 TGACCAGCTTCTCCAGGACATCTCGGAGGCCATCGACAAGATCCCGGTGCTGCCCAAGAT -2941 TGTGGAGCAGCTGGAGGAGCAGATGTCCATCTTTGTATTCCAGATCATGGCCCCGTTCGT -2881 creA GGTTCCGCTTATCGAGCAGATCAAGAACGAGCTCGCGACTGGCTCCAGCGAGATCATCCA -2821 GAGCAGCAGGGCTGAGCAGCACAACGTCTTTGAGGACGACAACGCCACCGACCCGACTCA -2761 CTCGATGTTGGCCAAGGACCACTTTAGTAACGTAAAGCCGACCCTAATCAGAAGCTCGCA -2701 TGTAGAATTGAGTTAGACTGACGCGACTTGTTTCCCGTCTCTGTAGATCCTCAACGAGAT -2641 CGGCGGTCGCGCCGCCTCCAAGGTCGTCTCCTGGGTCGTCCCGCAGCTCATGGAGGCCTG -2581 GGACGATGACAGCGTCGACGTGGACCGCCTGCTTGACAAGATCATTTACGGAGTGTTCCA -2521 CCATCCCGCGCAGCGCACCATGGGCCCTGAGGGGGCGTCCGAGGGCCGGGAGCTCATCTT -2461 CAACATGGTGCGCGAGTGGTGGGAGGACATGAGCGACGGGCAGCGCGACGAGTACCGGGG -2401 creA CAAGCTGAGCCGCGAGGGAGTCGAGAGAGGCGACAACCACCGCGAGGGCCAGCACGACTG -2341 CGGCCACGGCTGCGGGGGCAAGCTCAAGATGCACAAGAACTTCCGGAACGAGGCGCCCCA -2281 creA GACGGTAGAGGACCAGATCGCGGGCGCCGCCGCGGAGGCCATCATGGGAGGCGTCAAGCA -2221 creA GGGCCTGTCGCAGGCCGTGCAGAACGCCGCCGGCCGCCAGGAGTCGTCGGAGAGCAGCGG -2161 CCTGGGTGGGTTCATCAGCAGCGTCGCGGGCGGCCTCCTGGGCGGCGCCCTCAAGAGGGA -2101 CGAGACAGAGTCGTACCAGGCCGGCGGCCGCACCGAGGACGGCGGGTACACGCAGACCAC -2041 GGCAAGGGCCCCTCGTCTCCGGTGCAGGCCTGCGACAAGAACGACAACCCGCTCAACGAC +180 G K G P S S P V Q A C D K N D N P L N D 60 GGCGGCTCCACCCGGTCCGGCTGCGACGCGGGCGGCAGCGCCTACATGTGCTCCTCCCAG +240 G G S T R S G C D A G G S A Y M C S S Q 80 AGCCCCTGGGCCGTCAGCGACGAGCTGTCGTACGGCTGGGCGGCCGTCAAGCTCGCCGGC +300 S P W A V S D E L S Y G W A A V K L A G 100 AGCTCCGAGTCGCAGTGGTGCTGCGCCTGCTACGAGCTGACCTTCACCAGCGGGCCGGTC +360 S S E S Q W C C A C Y E L T F T S G P V 120 GCGGGCAAGAAGATGATTGTGCAGGCGACCAACACCGGTGGCGACCTGGGCGACAACCAC +420 A G K K I v/ Q A T N T G G D G D N H 140 TTTGACCTGGCCgtgagttgcctccccttctccccggaccgctcagattagatgagatta +480 In ron 1 F D L A 144 gactttgctcgtaaatcggtccaagattcccttgactgaccaacaaacatcatacgggca +540 gATCCCCGGTGGCGGTGTCGGTATTTTCAACGgtaagctggtgcccccggacccctcccc +600 Intron 2 I P G G G V G I F N 154 ggacccctcccccttttcctccagcgagccgagttgggatcgccgagatcgagaactcac +660 acaacttctctctcgacagCCTGCACCGACCAGTACGGCGCTCCCCCGAACGGCTGGGGC +720 A C T D Q Y G A P P N G W G 168 GACCGCTACGGCGGCATCCATTCCAAGGAAGAGTGCGAATCCTTCCCGGAGGCCCTCAAG +780 D R Y G G I H S K E E C E S F P E A L K 188 CCCGGCTGCAACTGGCGCTTCGACTGgtacgttgctttgacataccggaacccaattcct +840 Intron 3 P G C N W R F D W 197 ccaacccccccccttttctcccccaactccgggggtagtcggaatgtcgcgactgaccct +900 atttcagGTTCCAAAACGCCGACAACCCGTCGGTCACCTTCCAGGAGGTGGCCTGCCCGT +960 F Q N A D N P S V T F Q E V A C P 214 to o CGGAGCTCACGTCCAAGAGCGGCTGCTCCCGTTAAGAGGGAAGAGAGGGGGCTGGAAGGA +1020 t25 S E L T S K S G C S R * 225 CCGAAAGATTCAACCTCTGCTCCTGCTGGGGAAGCTCGGGCGCGAGTGTGAAACTGGTGT +1080 t85 AAATATTGTGGCACACACAAGCTACTACAGTCCGTCTCGCCGTCCGGCTAACTAGCCTTG +1140 tl45 CTGCGGATCTGTCCATCTTCGGTCCGAACTGTCCGTTGCTGTTTTGGCTCGGTGCCTCAT +1200 t205 CTTCTCCCAACCTAGTCAAGAATGAATCGTGAGAGAGGCTGAGAGAGATAAGATCGACTT +1260 t265 CAGAAATCCAGGGTTGAAAGCAATAAAAAAAATTCCTGTGGGATGAATATCTCGTGATGC +1320 sitio polyA AACGACCCTCCTAGGAAACCTTGACGAAATTTGCTGACGGCAAATTCTTCAAAGACTCGT +1380 t385 TAACCGGTCGCCCGTAGTGGTCCTGTTGCCCCAATCCGTTTGTGTTGAAATGACATTGCG +1440 t445 CGTAACGCCGGACTCATATCAACTGCGTACCGAAAGCCAATCCCTCCCCAAACACGCCCT +1500 t505 CTCTAATAAGCTCTCCCAAACAAGACCTCTTGAGACAGAAAATACGCCCAGATGCTGAGG +1560 t565 ACTTGACAAGCCGGGGGGGGGGGGGGGCTTGTCAAGTGCAAAAACTTGCCCATTTCATGC +1620 t625 TGGTATCAAAAAAACAAAAAAAAAAAAAAACATTTCAAGTCGCGGATGCCCCATTTACAT +1680 t685 TGCTTGCGTGCGCCAATAGAAACTTGCAACACGTCAGTGTCATCTTGCACGCCTTGG +1737 t742 SEC ID No. 3 Fragmento del gen C1-EG3 (Familia 12) obtenido por PCR basado en el análisis de la homología de las celulasas de la familia 12 GAATTCGGGGATTACGAGCTAATGATCTGgtcag tt tt et tt cttt et cncttttcttttcttttcctttctcctgttttattttctta 100 g d y e l m i tccattgcttcgccctctttccttaaccctgctgactctctcttcttgtcaatgatactgtaatagGCTGGCGAGATTCGGCGACGTCTACCCCATCGGC 200 L A R F G D V Y P I G TCGTCCCAGGGCCACGTCAACGTGGCCGGCCAGGACTGGGAGCTGTGGACGGGCTTCAANGGNAACATGCGGGTCTACAGCTTCGTAGCGCCCANCCCC 299 S S Q G H V N V A G Q D W E L W T G F X G N M R V Y S F V A P X P CGCAACAGNTTCAGCGCCAACGTCAAGGACTTCTTCAACTATCTCCAGTCCAACCAGGGCTTCCCGGCCAGCAGCCAATACCTTCTCAAgtaaggagacga 400 r n x f s a n v k d f f n y l q s n q g f p a s s q y l l n? gatctcgaacagcataccatatatgcgtgcggtacaagtgcactaaccccctttt tcccgttcgcagtCTTCCAGTTCGGCACTG 487 to t Vi O SEC ID No. 4: Celobiohidrolasa CBH1 de Chrysosporium. TTTNGGGCGCCGTCTTACTCCTACCTTGCACCGTGATCGGCCAGTCGCGCTGCGAGGGCG 1 7 G A V L L L P C T V I G Q S R C E G ACTCGTGCGGCGGTACCTACAGCACCGACCGCTATGCCGGCATCTGCGACCCCGACGGAT 61 D S C G G T Y S T D R Y A G I C D P D G GCGACTTCAACTCGTACCGCCAGGGCAACAAGACCTTCTACGGCAAGGGCATGACGGTCG 121 C D F N S Y R Q G N K T F Y G K G M T V ACACGACCAAGAAGATCACGGTCGTCACCCAGTTCCTCAAGAACTCGGCCGGCGAGCTCT 181 D T T K K I T V V T Q F L K N S A G E L CCGAGATCAAGCGGTTCTACGTCCAGAACGGCAAGGTCATCCCCAACTCCGAGTCCACCA 241 S E I K R F Y V Q N G K V I P N S E S T TCCCGGGCGTCGAGGGCAACTCCATCACCCAGGACTGGTGCGACCGCCAGAAGGCCGCCT 301 I P G V E G N S I T Q D W C D R Q K A A TCGGCGACGTGACCGACTTCCAGGACAAGGGCGGCATGGTCCAGATGGGCAAGGCCCTCG 361 F G D V T D F Q D K G G M V Q M G K A L CGGGGCCCATGGTCCTCGTCATGTCCATATGGGACGACCACGCCAGTNAACA 421 A G P M V L V M S I W D D H A S ? SEC ID No. 5: Xilanasa F de Chrysospórium TGACCTTCTCCTCCTTCTCCCGAACAATAATAGATAATTACGAGCCGGTTCGAGGCTGAC 1 ATTGCGCGATTCTAGCGAGCCGCAATCAATTCAACTTTGCCAACGCCGACGCGGTTGTC 61 S R N Q F N F A N A D A V V AACTTTGCCCAGGCCAACGGCAAGCTCATCCGCGGCCACACCCTCCTCTGGCACTCTCAG 120 N F A Q A N G K L I R G H T L L W H S Q CTGCCGCAGTGGGTGCAGAACATCAACGACCGCAACACCTTGACCCAGGTCATCGAGAAC 180 L P Q W V Q N I N D R N T L T Q V I E N CACGTCACCACCCTTGTCACTCGCTACAAGGGCAAGATCCTCCACTGGGACGTCGTTAAC 240 H V T T L V T R Y K G K I L H W D V V N GAGATCTTTGCCGAGGACGGCTCGCTCCGCGACAGCGTCTTCAGCCGCGTCCTCGGCGAG 300 E I F A E D G S L R D S V F S R V L G E GACTTTGTCGGCATCGCCTTCCGCGCCGCCCGCGCCGCCGATCCCAACGCCAAGCTCTAC 360 D F V G I A F R A A R A A D P N A K L Y ATCAACGACTACAGGTCGACA 420 I N D Y R S T Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

LISTADO DE LAS SECUENCIAS <110> Emalfarb, Marc A <120> Sistemas de Transformación en el campo de los huéspedes fungosos filamentosos <130> Chrysosporium <140> PCT/NL99/00618 <141> 1999-10-06 <150> PCT/EP98/06496 <151> 1998-10-06 <160> 16 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 4376 <212> ADN <213> Chrysosporium sp. <220> <221> CDS <222> (2509) .. (2949) <223> posición 147 de Xaa = Asp <220> <221> CDS <222> (3060) .. (3386) <223> posición 148 de Xaa = Lys <220> <221> CDS <222> (3480) .. (3899) <400> 1 ggatccacac ctaccatacc ggatagtatg ctacccaagt gacatagggt tggtaaagta 60 atacgagaac tcagagagca ctgcccatat ggctcgccaa tgacctcaag tgccaggtca 120 gctttgcgag acagacctga gcgcgtcgga tgtgtgacat ggaacgcgcc ggatcgcctt 180 gttgattaat tatagggaag tagcgaggaa ggtttcagca attgacgtga gcgt catta 240 aaagctgtat gatttcagga agacgagcca tggaccaggt ttcaaggctg aatqqcttga 300 cgacttaagc accgaacgag gaatgaaaga atgaaaagtg ggggatcatt ctggcccctc 360 ctcgtatgtc gagtgttaaa gaaggcggtt ctacggagga cctaaagagc tccaatttgc 420 tctgttgagc ttaagccaca tatctcaaga tgaatacatg tcaggcatag tcaccctgat 480 cttgttcatc agtccacaca cttttcagtt cagcatgttg attcctcatc catatcactt 540 tccattacta tctctttatg tccttggtca agactccaag gaaccgatag gtgagcatcg 600 gtgaggctcc ctcaaggtac caaagtagcc atcatcaccg aggtctggga atggcgccgt 660 gcccgatctg agtcctccaa ctccacggta cgacgacagc acgtcacatt gacgcaccac 720 ggttgaacaa gcagagaggg acacgtcttg ctacgcgaat cctggcactg gatggagacg 780 cgtgtgagca ggtttccgga accatgacgg cctggtccgg cttctcgaac aaagaagtgg 840 aacacaaaaa gaaccgaaac ggaaacgcag gcacggcatc gacgaccgga ttgtcccacg 900 gggacctcgg ccagtcaagc gttgccctgg ccgtcagctc cctggcgacg gggattcagc 960 acatctcacg ttataggcga cctcatcccc cttccgtctt gtgcggtcgt tgctccgtgc 1020 cgagtaccca ggcgtgccgg ggcctttagc cggggcggaa tcagagtcaa gatgcggccg 1080 aattggacgg cagacgaagt ttcgtagagg gtcatgatcg gcactgacga cacccacccc 1140 tgcgtgatcc cgtggccctg ggctgggaat tgccggctaa taatctacgg cttaatagat 1200 atgca?tttg cacgcggtgc agataaataa gctgtggttt caaacactgg cctccgtact 1260 ttacccacca actgccgctt agcgccggga cctgagtctt gggagtgcgc ggagcggcag 1320 ccacctcggg ttagcgtaca cacgacggct gcatgcgggg atgccgcgtg catggcttca 1380 tagtgtacga cagaccgtca agtccaaatc tgggtgatgc ttgatgagat gacagcgagc 1440 cccgtcggcg gcaccccggc tatgcatcgc gaattgacaa cactctcagc tctat gcga 1500 cccatcggat aaaagaagaa gaaaaaaatg gaccttgagt acgggcgtca gaaaccaaaa 1560 aaaaactccg gaaccaaata tgtcgggcat ggccggggtg aacgaccgct actccccgtt 1620 cccttcttcg caaacagaac gctacagagg gttttctggt ttgtcaaaga gttcggaggt 1680 cctctgctcc gcgaatgcgt ggtgaaccca ccagcagcca ttgttcttgc atgcgtggcg 1740 gaccgttagc cgctgatcga catggcgagc ttcccacctc agacctggag cagacggttg 1800 cgaggagcaa ggggctgccc tccccctgac ggtcggaccc caatgacttc cccaaacggg 1860 gacatcgagg gtcgtgcatg atggtggaaa gtagttgcag tatgggaagt accccgggtt 1920 gccaggaacc gttgttcggc cccccacatt ttctctctgc catgtcaact gtgtgtcgtt 1980 cgagagttcc tggctccggc cccccgtcca attccctaac gggaccgcgg ggcatcgcct 2040 gtaactaact tccaaatgaa gccggatatg agggagggag attggatctg gcaagccagc 2100 cattcgctgc gatcggcact cgtccgtcag ccccgcagtc catatcccca aaggcaactg 2160 ctcggcgcgg ctcaagtctt cttcggaacg tccagcccga aggcgcgcgc cagcaccggc 2220 cctatgttcc tgattgcgat cctcgatctc cagagacggg tcacctcgcc tcgaggacgg 2280 tgcaggggca tcggcttcgc ttcctagagc tccgggctgt gtgtggtcaa ggggagaagg 2340 cggcggcgcc aaggtgcgtc tcggcgcact cacccatcgc ctttaccccc ctccccccca 2400 gtatataaaa gatggccatc gtctcctcgt ctgcttggga agaaaggatc tctcgaccat 2460 gcaccacagc ctagctctaa cccagcttgt cgtgtgttgt tgcccagc atg aag ttc 2517 Met Lys Phe 1 gtg cag tcc gcc acc ctg gcg ttc gcc gcc acg gcc ctc gct gcg ecc 2565 Val Gln Ser Ala Thr Leu Ala Phe Ala Ala Thr Ala Leu Ala Ala Pro 5. 10 15 teg cgc acg act ecc cag aag ecc cgc cag gcc teg gcg ggc tgc gcg 2613 Ser Arg Thr Thr Pro Gln Lys Pro Arg Gln Ala Ser Ala Gly Cys Ala 20 25 30 35 teg gcc gtg acg ctc gat gcc age acc aac gtg ttc cag cag tac acg 2661 Ser Ala Val Thr Leu Asp Ala Ser Thr Asn Val Phe Gln Gln Tyr Thr 40 45 50 ctg cac ecc aac aac ttc tac cgt gcc gag gtc gag gct gcc gcc gag 2709 Leu His Pro Asn Asn Phe Tyr Arg Ala Glu Val Glu Ala Ala Ala Glu 55 60 65 gcc ate tcc gac teg gcg ctg gcc gag aag gcc cgc aag gtc gcc gac 2757 Ala lie Ser Asp Ser Ala Leu Ala Glu Lys Ala Arg Lys Val Ala Asp 70 75 80 gtc ggt acc ttc ctg tgg ctc gac acc ate gag aac att ggc cgg ctg 2805 Val Gly Thr Phe Leu Trp Leu Asp Thr lie Glu Asn lie Gly Arg Leu 85 90 95 gag ecc gcg ctc gag gac gtg ecc tgc gag aac ate gtg ggt ctc gtc 2853 Glu Pro Ala Leu Glu Asp Val Pro Cys Glu Asn lie Val Gly Leu Val 100 105 110 115 ate tac gac ctc ceg ggc cgt gac tgc gcg gcc aag gcc tcc aac ggc 2901 lie Tyr Asp Leu Pro Gly Arg Asp Cys ?la Ala Lys Ala Ser Asn Gly 120 125 130 gag ctc aag gtc ggc gag ctc gac agg tac aag acc gag tac ate gac 2949 Glu Leu Lys Val Gly Glu Leu Asp Arg Tyr Lys Thr Glu Tyr He Xaa 135 140 145 agtgagttaa ccctttgtgg ccccttcttt tcccccgaga gagcgtctgg ttgagtgggg 3009 ttgtgagaga gaaaatgggg cgagcttaaa gactgacgtg ttggctcgca gag ate 3065 Xaa He gcc gag ate ctc aag gcc cac tcc aac acg gcc ttc gcc ctc gtc ate 3113 Ala Glu He Leu Lys Ala His Ser Asn Thr Ala Phe Ala Leu Val He 150 155 160 165 gag ecc gac teg ctc ecc aac ctg gtc acc aat age gac ctg cag acg 3161 Glu Pro Asp Ser Leu Pro Asn Leu Val Thr Asn Ser Asp Leu Gln Thr 170 175 180 tgc cag cag age gct tcc ggc tac cgc gag ggt gtc gcc tat gcc ctc 3209 Cys Gln Gln Ser Ala Ser Gly Tyr Arg Glu Gly Val Ala Tyr Ala Leu 185 190 195 aag cag ctc aac ctc ecc aac gtg gtc atg tac ate gat gcc ggc cac 3257 Lys Gln Leu Asn Leu Pro Asn Val Val Met Tyr He Asp Ala Gly His 200 205 210 ggt ggc tgg ctc ggc tgg gac gcc aac ctc aag ecc ggc gcc cag gag 3305 Gly Gly Trp Leu Gly Trp Asp Ala Asn Leu Lys Pro Gly Ala Gln Glu 215 220 225 ctc gcc age gtc tac aag tet gct ggt teg ecc teg caá gtc cgc ggt 3353 Leu Ala Ser Val Tyr Lys Ser Ala Gly Ser Pro Ser Gln Val Arg Gly 230 235 240 245 ate tcc acc aac gtg gct ggt tgg aac gcc tgg taagacaetc tatgt-ccccc 3406 He Ser Thr Asn Val Ala Gly Trp Asn Ala Trp 250 255 tcgtcggtca atggcgagcg gaatggcgtg aaatgcatgg tgctgacctt tgatcttttc 3466 cccctcctat agg gac cag gag ecc ggt gag ttc teg gac gcc teg gat 3515 Asp Gln Glu Pro Gly Glu Phe Ser Asp Ala Ser A=p 260 265 gcc cag tac aac aag tgc cag aac gag aag ate tac ate aac acc ttt 3563 Ala Gln Tyr Asn Lys Cys Gln Asn Glu Lys He Tyr He Asn Thr Phe 270 275 280 ggc gct gag ctc aag tet gcc ggc atg ecc aac cac gcc ate ate gac 3611 Gly Ala Glu Leu Lys Ser Ala Gly Met Pro Asn His Ala He He ? µ 285 290 295 300 act ggc cgc aac ggt gtc acc ggt ctc cgc gac gag tgg ggt gac tgg 3659 Thr Gly Arg Asn Gly Val Thr Gly Leu Arg Asp Glu Trp Gly Asp Trp 305 310 315 tgc aac gtc aac ggc gcc ggc ttc ggt gtg cgc ceg act gcc aac <¡ c t 3707 Cys Asn Val Asn Gly Ala Gly Phe Gly Val Arg Pro Thr Ala Asn T r 320 325 330 ggc gac gag ctc gcc gac gcc ttc gtg tgg gtc aag ecc ggt ggc gag 3755 Gly Asp Glu Leu Ala Asp Ala Phe Val Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu 335 340 345 tcc gac ggc acc age gac teg teg gcg gcg cgc tac gac age ttc tgc 3803 Ser Asp Gly Thr Ser Asp Ser Ser Ala Ala Arg Tyr Asp Ser Phe Cys 350 355 360 ggc aag ecc gac gcc ttc aag ecc age ecc gag gcc ggt acc tgg aac 3851 Gly Lys Pro Asp Ala Phe Lys Pro Ser Pro Glu Ala Gly Thr Trp Asn 365 370 375 380 cag gcc tac ttc gag atg ctc ctc aag aac gcc aac ceg tcc ttc taa 3899 Gln Ala Tyr Phe Glu Met Leu Leu Lys Asn Ala Asn Pro Ser Phe 385 390 395 gctcctcgac ggcttcttgc tgtcagtcgc tctgacggtg gtgtgctggt ggtgeccctg 3959 ctcctgctgc tgctgctccg cggggagggg aggcaacgaa aatgaagtec tgcttcaaaa 4019 caaaacagaa acaagcgagg cgcggtgcaa tggtcgtgcg ttcgtctttt ttcatgttcc 4079 cttctagtgt agtagtttga tagtcgtaca taaggggttt cagaaccgtc tctctgtctc 4139 ggtctttttg cgagttgttg cgactcgtga ttatggcctt tgttgctcgt tgcggcagag 4199 tagaaccaca gcgtgttggg gtagcagctt gctccgtagg acgtagggaa acaaectgag 4259 actctggaat tgcagtcagc ctgcgtcgcc cctctaggaa acgaagggga gaaccagtag 4319 tggctgcagc ttacaaacgc gagcatggtg aacatctccg agaaaaggga gggatcc 4376 <210> 2 <211> O <212> PRT <213> Chrysosporium sp. <400> 2 <210> 3 <211> 0 <212> PRT <213> Chrysosporium sp. <400> 3 <210> 4 <211> 0 <212> PRT <213> Chrysosporium sp. <400> 4 <210> 5 <211> 5046 <212> ADN <213> Chrysosporium sp. <220> <221> CDS <222> (3310) .. (3741) <223> posición 144 de Xaa = Ala <220> <221> CDS <222> (3851) .. (3880) <223> Xaa 145 = He, Xaa 154 = Asn <220> <221> CDS <222> (3988) .. (4116) <223> Xaa 155 = Ala <220> <221> CDS <222> (4218) .. (4304) 00> 5 gcttaggaga atcacgagaa gctaattggg ctctatagta tccgacaaga tgacccagag 60 cgagattgag gatctcgagg gaaccctgaa gcagagcagc aacaacgaca ccagcctcct 120 ccgcgacctg ctcgacaaga ttcccgatgg cctcctcggc ggcaacaaca aatccaagct 180 ggacgatatc cagagcaacg cgcaggccgc gcagatggag aacctgagcg tctcgccgcg 240 ggaacccgag gagctgacca gatacgtcca ggaagtgttc cgtcagatca tgcccgccat 300 caagttccat gaccagcttc tccaggacat ctcggaggcc atcgacaaga tcccggtgct 360 gcccaagatt gtggagcagc tggaggagca gatgtccatc tttgtattcc agatcatggc 420 cccgttcgtg gttccgctta tegageagat caagaaegag ctcgcgactg gctccagcga 480 gatcatecag agcagcaggg ctgagcagca caacgtcttt gaggacgaca acgccaccga 540 cccgactcac tcgatgttgg ccaaggacca ctttagtaac gtaaagccga ccctaatcag 600 aagctcgcat gtagaattga gttagactga cgcgacttgt ttcccgtctc tgtagatcct 660 caaegagate ggcggtcgcg ccgcctccaa ggtcgtctcc tgggtcgtcc cgcagctcat 720 ggaggcctgg gacgatgaca gcgtcgacgt ggaccgcctg cttgacaaga tcatttacgg 780 agtgttccac catcccgcgc agcgcaccat gggccctgag ggggcgtccg agggccggga 840 gctcatcttc aacatggtgc gcgagtggtg ggaggacatg agcgacgggc agcgcgacga 900 gtaccggggc aagctgagcc gcgagggagt cgagagaggc gacaaccacc gcgagggcca 960 gcacgactgc ggccacggct gcgggggcaa gctcaagatg cacaagaact tccgqaacga 1020 ggcgccccag acggtagagg accagatcgc gggcgccgcc gcggaggcca tcatgggagg 1080 10 cgtcaagcag ggcctgtcgc aggccgtgca gaacgccgcc ggccgccagg agtcgtcgga 1140 gagcagcggc ctgggtgggt tcatcagcag cgtcgcgggc ggcctcctgg gcggcgccct 1200 caagagggac gagacagagt cgtaccaggc cggcggccgc accgaggacg gcgggtacac 1260 gcagaccacg accgagtacg gctactccgg aggccgctac ggccaggccc agtacacgga 1320 gacgcagtac ggcggcggcg gcggcggccg cagcgagtac cgccgctacg agcagcgcga 1380 ggatgatgac ggccgggtcc agagctacgg atacacggaa cagcgcaccg agacgcgcta 1440 cgacagctac tcgggtggct atggcggccg cgaggagacc agcagctatg gcggcggcgg 1500 cagcgcgagc gaatacattc gtagctccca gcagagtagc tacggtggca gcggctatgg 1560 cagtgggtac ggtcgtcgtg atgaagaaga gagcagcggc tatggaagtg gttacggtcg 1620 tcgtgatgaa gaggagagtg gtggttatgg tggcggctat ggccgccgtc aggaagaaga 1680 gagtagcagc tatggaagcg gttatggtcg tcgtcgtgat gaagaagaga gcggcggtta 1740 tggtggtggc tacggccgcc gtcaggaaga agagagtagc ggctatggaa gtggttacgg 1800 tcgtcgtgat gaagaaggga gcggcggtta tggtggtggc tacggccgcc gtcatgagga 1860 agagagcagt ggttacggca gcggctatgg tcgtcgccat gaagaggagg gcggtggcta 1920 cggcagtggt tacggccgcc ggcgcaacga cgaggaggaa gaggaggatg gcggacgccg 1980 gaggtggggt tactagggtg aactcttccg gccggtctct tgttgtgaac cttgctgttg 2040 catgggcagg accggtgcat catgaacagg acggtgcgct gtgttttttt tttctcgggg 2100 tcttgattgt ttgttgaatc tcccttttcg aggatacgag ctctctcggg gacgaataga 2160 tgaaggcaat ctgacagatt tgctctcaaa aaaagactga tatctcttcc accatgcact 2220 gtatgtacat tacatacatt atccccctcc actggattcg cacaacggaa agcaatggcg 2280 cgctgattca agaaccatca gggctgtcat tggcttgttt tgtgccgtgg ccgcqgtgac 2340 gcccactatg actctctggg caggcggcaa ctgggtgcca gatatattaa tccgqggcat 2400 agcgcatatc ttccttgatt tgtagagtac tagtacacta acccccttct ccacitgggg 2460 ccactgttcg gtagatctgc ccgaagtgca agtgcggggg gggccaaact aggt.iatatc 2520 11 ctcccgctct cccgagtgcg cggactaacc gtcattgctc ccagaggctt gcactctatc 2580 gcaggccttt tccaataagg atggggcgtt cggcggtgat gatgecggtc gtgcggggca 2640 tacggggagg gtagatagaa aataacgacg ctggtgtttt ggagagggga gggggactat 2700 taggggaggg aaatacaggg gcagggggtg agacgggtga cgttccggcg gaacctcgcg 2760 cttgtcaaac aagcagccct gttaggttgc tetagactag tgtacataca tacatatgta 2820 catactgtat gtactgcaca tactttaact tggtgcttcc ctgtgagccg ccaggaacat 2880 cacaactgca agcggaaaag gccccatata cggggcggct tgtcgggatg gctcccccct 2940 tcggaacggg tctgacttcc gaggatttta cctgcttcat ttgggtattc tgcgatggcc 3000 tgttcaaccc ttcccctggc cgaaccgttt cttggctcga tcctagtgta cactacacta 3060 ctcgtagact gcctgcccga cgatccgcgg gaacgggcca ggagtgtgga gtggagaegg 3120 gcggcggtga tgtcgtgtaa ttaaatatat aagtgagagt gttttttgac tgccccgggt 3180 tctggtagtt gaagggaagt tegatgetet ctgctgtcgt cgctctcgtc gctctcgtcg 3240 gcatcctcca tccgtccgcc tttgataacc cgctccccga ctcagtcaag aegaegeata 3300 cttggcacc atg cat ctc tcc gcc acc acc ggg ttc ctc gcc ctc ceg gcc 3351 Met His Leu Ser Ala Thr Thr Gly Phe Leu Ala Leu Pro Ala 1 5 10 ctg gcc ctg gcc cag ctc teg ggc age ggc cag acg acc cgg tac tgg 3399 Leu Ala Leu Ala Gln Leu Ser Gly Ser Gly Gln Thr Thr Arg Tyr Trp 15 20 25 30 gac tgc tgc aag ceg age tgc gcc tgg ecc ggc aag ggc ecc teg tet 3447 Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ser Ser 35 40 45 ceg gtg cag gcc tgc gac aag aac gac aac ceg ctc aac gac ggc ggc 3495 Pro Val Gln Ala Cys Asp Lys Asn Asp Asn Pro Leu Asn Asp Gly Gly 50 55 60 tcc acc cgg tcc ggc tgc gac gcg ggc ggc age gcc tac atg tgc tcc 3543 Ser Thr Arg Ser Gly Cys Asp Ala Gly Gly Ser Ala Tyr Met Cys Ser 65 70 75 tcc cag age ecc tgg gcc gtc age gac gag ctg teg tac ggc tgg gcg 3591 12 Ser Gln Ser Pro Trp Ala Val Ser Asp Glu Leu Ser Tyr Gly Trp Ala 80 85 90 gcc gtc aag ctc gcc ggc age tcc gag teg cag tgg tgc tgc gcc tgc 3639 Ala Val Lys Leu Ala Gly Ser Ser Glu Ser Gln Trp Cys Cys Ala Cys 95 100 105 110 tac gag ctg acc ttc acc age ggg ceg gtc gcg ggc aag aag atg att 3687 Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met He 115 120 125 gtg cag gcg acc aac acc ggt ggc gac ctg ggc gac aac cac ttt gac 3735 Val Gln Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asp Asn His Phe Asp 130 135 140 ctg gcc gtgagttgcc tccccttctc cccggaccgc tcagattaga tgagattaga 3791 Leu Xaa ctttgctcgt aaatcggtcc aagattccct tgactgacca acaaacatca tacgggcag 3850 ate ecc ggt ggc ggt gtc ggt att ttc aac ggtaagctgg tgcccccgqn 3900 Xaa Pro Gly Gly Gly Val Gly He Phe Xaa 145 150 cccctccccg gacccctccc ccttttcctc cagcgagccg agttgggatc gccgcigatcg 3960 agaactcaca caacttctct ctcgaca gcc tgc acc gac cag tac ggc gct ecc 4014 Xaa Cys Thr Asp Gln Tyr Gly Ala Pro 155 160 ceg aac ggc tgg ggc gac cgc tac ggc ggc ate cat tcc aag gaa gag 4062 Pro Asn Gly Trp Gly Asp Arg Tyr Gly Gly He His Ser Lys Glu Glu 165 170 175 tgc gaa tcc ttc ceg gag gcc ctc aag ecc ggc tgc aac tgg cgc ttc 4110 Cys Glu Ser Phe Pro Glu Ala Leu Lys Pro Gly Cys Asn Trp Arg Phe 180 185 190 195 gac tgg tacgttgctt tgacataccg gaaeccaatt cctccaaccc cccccct v.tt 4166 Asp Trp ctcccccaac tccgggggta gtcggaatgt cgcgactgac cctatttcag g ttc; caá 4223 Pho Gln aac gcc gac aac ceg teg gtc acc ttc cag gag gtg gcc tgc ceg teg 4271 Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Thr Phe Gln Glu Val Ala Cys Pro Ser 200 205 210 215 13 gag ctc acg tcc aag age ggc tgc tcc cgt taa gagggaagag agggggctgg 4324 Glu Leu Thr Ser Lys Ser Gly Cys Ser Arg 220 225 aaggaccgaa agattcaacc tctgctcctg ctggggaagc tcgggcgcga gtgtgaaact 4384 ggtgtaaata ttgtggcaca cacaagctac tacagtccgt ctcgccgtcc ggctaactag 4444 ccttgctgcg gatctgtcca tcttcggtcc gaactgtccg ttgctgtttt ggctcggtgc 4504 ctcatcttct cccaacctag tcaagaatga atcgtgagag aggctgagag agataagatc 4564 gacttcagaa atccagggtt gaaagcaata aaaaaaattc ctgtgggatg aatatctcgt 4624 gatgeaaega ccctcctagg aaaccttgac gaaatttgct gacggcaaat tcttcaaaga 4684 ctcgttaacc ggtcgcccgt agtggtcctg ttgccccaat ccgtttgtgt tgaaatgaca 4744 ttgcgcgtaa cgccggactc atatcaactg cgtaccgaaa gccaatccct ccccaaacac 4804 gccctctcta ataagetetc ccaaacaaga cctcttgaga cagaaaatac gcccagatgc 4864 tgaggacttg acaagccggg gggggggggg ggcttgtcaa gtgcaaaaac ttgcccattt 4924 catgctggta tcaaaaaaac aaaaaaaaaa aaaaacattt caagtcgcgg atgccccatt 4984 tacattgctt gcgtgcgcca atagaaactt gcaacacgtc agtgtcatct tgcacgcctt 5044 99 5046 <210> 6 <211> 0 <212> PRT <213> Chrysosporium sp. <400> 6 <210> 7 14 <211> O <212> PRT <213> Chrysosporium sp. <400> 7 <210> 8 <211> 0 <212> PRT <213> Chrysosporium sp. <400> 8 <210> 9 <211> 0 <212> PRT <213> Chrysosporium sp. <400> 9 <210> 10 <211> 487 <212> ADN <213> Chrysosporium sp. <220> <221> CDS <222> (7) .. (30) <220> <221> CDS <222> (168) .. (386) <223> Xaa 40 = Gly, Xaa 39, 51 y 55 = desconocido <400> 10 gaattc ggg gat tac gag cta atg ate tgg tcagtttttt ttttcttttt 50 Gly Asp Tyr Glu Leu Met He Trp 1 5 tcttttcttc ncttttcttt tetttteett tctcctgttt tattttctta tccattgctt 110 cgccctcttt ccttaaccct gctgactctc tcttcttgtc aatgatactg taatagg 167 ctg gcg aga ttc ggc gac gtc tac ecc ate ggc teg tcc cag ggc cac 215 Leu Ala Arg Phe Gly Asp Val Tyr Pro He Gly Ser Ser Gln Gly His 10' 15 20 gtc aac gtg gcc ggc cag gac tgg gag ctg tgg acg ggc ttc aan ggn 263 Val Asn Val Ala Gly Gln Asp Trp Glu Leu Trp Thr Gly Phe Xad Xaa 30 35 40 aac atg cgg gtc tac age ttc gta gcg ecc anc ecc cgc aac agn ttc 311 Asn Met Arg Val Tyr Ser Phe Val Ala Pro Xaa Pro Arg Asn Xaa Phe 45 50 55 age gcc aac gtc aag gac ttc ttc aac tat ctc cag tcc aac cag ggc 359 Ser Ala Asn Val Lys Asp Phe Phe Asn Tyr Leu Gln Ser Asn Gln Gly 60 65 70 ttc ceg gcc age age caá tac ctt ctc aagtaaggag aegagatetc 406 Phe Pro Ala Ser Ser Gln Tyr Leu Leu 75 80 16 gaacagcata ccatatatgc gtgcggtaca agtgcactaa cccccttttt ttcccgttcg 466 cagtcttcca gttcggcact g 487 <210> H <211> 8 <212> PRT <213> Chrysosporium sp . <400> 11 Gly Asp Tyr Glu Leu Met He Trp 1 5 <210> 12 <211> 73 <212> PRT <213> Chrysosporium sp. <400> 12 Leu Ala Arg Phe Gly Asp Val Tyr Pro He Gly Ser Ser Gln Gly His 1 5 10 15 Val Asn Val Ala Gly Gln Asp Trp Glu Leu Trp Thr Gly Phe Xaa Xaa 20 25 30 Asn Met Arg Val Tyr Ser Phe Val Ala Pro Xaa Pro Arg Asn Xaa Phe 35 40 45 17 Ser Ala Asn Val Lys Asp Phe Phe Asn Tyr Leu Gln Ser Asn Gln Gly 50 55 60 Phe Pro Ala Ser Ser Gln Tyr Leu Leu 65 70 <210> 13 <211> 472 <212> ADN <213> Chrysosporium sp. <220> <221> CDS <222> (6) .. (467) <400> 13 tttng ggc gcc gtc tta ctc cta cct tgc acc gtg ate ggc cag teg cgc 50 Gly Ala Val Leu Leu Leu Pro Cys Thr Val He Gly Gln Ser Arg ' 1 5 10 15 tgc gag ggc gac teg tgc ggc ggt acc tac age acc gac cgc tat gcc 98 Cys Glu Gly Asp Ser Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Thr Asp Arg Tyr Ala 20 25 30 ggc ate tgc gac ecc gac gga tgc gac ttc aac teg tac cgc cag ggc 146 Gly He Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Ser Tyr Arg Gln Gly 35 40 45 aac aag acc ttc tac ggc aag ggc atg acg gtc gac acg acc aag aag 194 Asn Lys Thr Phe Tyr Gly Lys Gly Met Thr Val Asp Thr Thr Lys Lys 50 55 60 ate acg gtc gtc acc cag ttc ctc aag aac teg gcc ggc gag ctc tcc 242 He Thr Val Val Thr Gln Phe Leu Lys Asn Ser Ala Gly Glu Leu Ser 65 70 75 18 gag ate aag cgg ttc tac gtc cag aac ggc aag gtc ate ecc aac tcc 290 Glu He Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val He Pro Asn Ser 80 85 90 95 gag tcc acc ate ceg ggc gtc gag ggc aac tcc ate acc cag gac tgg 338 Glu Ser Thr He Pro Gly Val Glu Gly Asn Ser He Thr Gln Asp Trp 100 105 110 tgc gac cgc cag aag gcc gcc ttc ggc gac gtg acc gac ttc cag gac 386 Cys Asp Arg Gln Lys Ala Ala Phe Gly Asp Val Thr Asp Phe Gln Asp 115 120 125 aag ggc ggc atg gtc cag atg ggc aag gcc ctc gcg ggg ecc atg gtc 434 Lys Gly Gly Met Val Gln Met Gly Lys Ala Leu Ala Gly Pro Met Val 130 135 140 ctc gtc atg tcc ata tgg gac gac cac gcc agt naaca Leu Val Met Ser He Trp Asp Asp His Ala Ser 145 150 <210> 14 <211> 154 <212> PRT <213> Chrysosporium sp. <400> 14 Gly Ala Val Leu Leu Leu Pro Cys Thr Val He Gly Gln Ser Arg Cys 1 5 10 15 Glu Gly Asp Ser Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Thr Asp Arg Tyr Ala Gly 20 25 30 He Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Ser Tyr Arg Gln Gly Asn 35 40 45 19 Lys Thr Phe Tyr Gly Lys Gly Met Thr Val Asp Thr Thr Lys Lys He 50 55 60 Thr Val Val Thr Gln Phe Leu Lys Asn Ser Ala Gly Glu Leu Ser Glu 65 70 75 80 He Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val He Pro Asn Ser Glu 85 90 95 Ser Thr He Pro Gly Val Glu Gly Asn Ser He Thr Gln Asp Trp Cys 100 105 110 Asp Arg Gln Lys Ala Ala Phe Gly Asp Val Thr Asp Phe Gln Asp Lys 115 120 125 Gly Gly Met Val Gln Met Gly Lys Ala Leu Ala Gly Pro Met Val Leu 130 135 140 Val Met Ser He Trp Asp Asp His Ala Ser 145 150 <210> 15 <211> 440 <212> ADN <213> Chrysosporium sp. <220> <221> CDS <222> (78) .. (440) <400> 15 tgaccttctc ctccttctcc cgaacaataa tagataatta egagecggtt cgaggctgac 60 attgcgcgat tetageg age cgc aat caá ttc aac ttt gcc aac gcc gac 110 Ser Arg Asn Gln Phe Asn Phe Ala Asn Ala Asp 1 5 10 20 gcg gtt gtc aac ttt gcc cag gcc aac ggc aag ctc ate cgc ggc cac 158 Ala Val Val Asn Phe Ala Gln Ala Asn Gly Lys Leu He Arg Gly His 15 20 25 acc ctc ctc tgg cac tet cag ctg ceg cag tgg gtg cag aac ate aac 206 Thr Leu Leu Trp His Ser Gln Leu Pro Gln Trp Val Gln Asn He Asn 30 35 40 gac cgc aac acc ttg acc cag gtc ate gag aac cac gtc acc acc ctt 254 Asp Arg Asn Thr Leu Thr Gln Val He Glu Asn His Val Thr Thr Leu 45 50 55 gtc act cgc tac aag ggc aag ate ctc cac tgg gac gtc gtt aac gag 302 Val Thr Arg Tyr Lys Gly Lys He Leu His Trp Asp Val Val Asn Glu 60 65 70 75 ate ttt gcc gag gac ggc teg ctc cgc gac age gtc ttc age cgc gtc 350 He Phe Ala Glu Asp Gly Ser Leu Arg Asp Ser Val Phe Ser Arg Val 80 85 90 ctc ggc gag gac ttt gtc ggc ate gcc ttc cgc gcc gcc cgc gcc gcc 398 Leu Gly Glu Asp Phe Val Gly He Ala Phe Arg Ala Ala Arg Ala Ala 95 100 105 gat ecc aac gcc aag ctc tac ate aac gac tac agg teg acá 440 Asp Pro Asn Ala Lys Leu Tyr He Asn Asp Tyr Arg Ser Thr 110 115 120 <210> 16 <211> 101 <212> PRT <213> Chrysosporium sp . <400> 16 21 Gly Lys Leu He Arg Gly His Thr Leu Leu Trp His Ser Gln Leu Pro 1 5 10 15 Gln Trp Val Gln Asn He Asn Asp Arg Asn Thr Leu Thr Gln Val He 20 25 30 Glu Asn His Val Thr Thr Leu Val Thr Arg Tyr Lys Gly Lys He Leu 35 40 45 His Trp Asp Val Val Asn Glu He Phe Ala Glu Asp Gly Ser Leu Arg 50 55 60 Asp Ser Val Phe Ser Arg Val Leu Gly Glu Asp Phe Val Gly He Ala 65 70 75 80 Phe Arg Ala Ala Arg Ala Ala Asp Pro Asn Ala Lys Leu Tyr He Asn 85 90 95 sp Tyr Arg Ser Thr 100

Claims (29)

119

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una cepa de Chrysosporium mutante obtenida por la mutagénesis in vi tro o métodos recombinantes, la cepa está caracterizada porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de interés, la secuencia de ácidos nucleicos está enlazada operativamente a una región de regulación de la expresión y opcionalmente a una secuencia de la señal de secreción, la cepa mutante expresa el polipéptido de interés a un nivel más elevado que la cepa no mutante correspondiente bajo las mismas condiciones. 2. Una cepa de Chrysosporium mutante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el mutante que es obtenido por los métodos recombinantes comprende la introducción estable de al menos una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga seleccionada de las secuencias de los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido heterólogo, las secuencias de la señal heteróloga y las secuencias de regulación de la expresión heteróloga.

3. Una cepa de Chrysosporium mutante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el polipéptido de interés es un polipéptido heterólogo de origen 120 vegetal, animal (incluyendo el ser humano), las algas, las bacterias, las arquebacterias o de origen fungoso.

4. Una cepa de Chrysosporium de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque el polipéptido de interés es un polipéptido homólogo el cual es expresado a un nivel más elevado que en la cepa no mutante correspondiente bajo las mismas condiciones.

5. Una cepa de Chrysosporium mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque el polipéptido de interés se selecciona de las enzimas degradantes de los carbohidratos, las proteasas, las lipasas, las esterasas, otras hidrolasas, las oxidorreductasas y las transferasas.

6. Una cepa de Chrysospori um mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque el polipéptido de interés se selecciona de las enzimas fungosas que permiten la (sobre) producción de los metabolitos primarios, incluyendo los ácidos orgánicos, y los metabolitos secundarios, incluyendo los antibióticos.

7. Una cepa de Chrysosporium mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque el polipéptido de interés exhibe una actividad y/o estabilidad óptima a un pH arriba de 6, y/o tiene más del 70% de su actividad y/o estabilidad a un pH arriba de 6. 121

8. Una cepa de Chrysosporium mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque comprende una secuencia de la señal heteróloga.

9. Una cepa de Chrysospori um mutante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque comprende una secuencia de la señal fungosa, por ejemplo de ascomiceto.

10. Una cepa de Chrysosporium mutante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la secuencia de la señal fungosa es una secuencia de la señal de una celulasa, ß-galactosidasa, xilanasa, pectinasa, esterasa. Proteasa, amilasa, poligalacturonasa o hidrofobina.

11. Una cepa de Chrysosporium mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque además comprende un marcador seleccionable, tal como un marcador que confiere resistencia a un fármaco o para el alivio de un defecto nutricional.

12. Una cepa de Chrysosporium mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende una región de regulación de la expresión heteróloga, preferentemente una secuencia de regulación de la expresión fungosa. 122

13. Una cepa de Chrysosporium mutante de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la región de regulación de la expresión comprendida es un promotor inducible.

14. Una cepa de Chrysosporium mutante de conformidad con las reivindicaciones 12 o 13, caracterizada porque la región de regulación de la expresión comprende un promotor de celobiohidrolasa fungosa, gluco-amilasa, gliceraldehido fosfato deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa A, alcohol deshidrogenasa R, fosfoglicerato, proteinasa aspártica, lipasa, beta-galactosidasa, hidrofobina, proteasa, amilasa, xilanasa, pectinasa, esterasa, endo-glucanasa o poligalacturonasa .

15. Una cepa de Chrysospori um mutante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el mutante es obtenido por los pasos de la mutagénesis que incluyen al menos una de la mutagénesis irradiada con rayos UV y química, que comprende preferentemente un primer paso de irradiación con rayos UV, un paso de tratamiento con N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina y un segundo paso de irradiación con rayos UV.

16. Una cepa de Chrysospori um mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el mutante es derivado de 123 Chrysosporium lucknowense, especialmente de la cepa Cl de C. lucknowense (VKM F-3500 D) .

17. Una cepa de Chrysosporium mutante de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el mutante que corresponde a, o porque es derivado de una de las cepas mutantes UV13-6 (VKM F-3632 D) , NG7C-19 (VKM F-3633 D) , y UV18-25 (VKM F-3631 D) de Chrysosporium lucknowense. '

18. Una cepa de Chrysosporium mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la cepa exhibe una biomasa de menos de la mitad de aquella de Trichoderma reesei , con el Trichoderma en el cultivo que exhibe una viscosidad de 200-600 cP cuando se cultiva bajo condiciones óptimas equivalentes.

19. Una cepa de Chrysosporium mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la cepa produce al menos la cantidad de la celulasa en moles por litro como se produjo por cualquiera de las cepas Cl mutantes de Chrysosporium l ucknowense, (VKM F-3500 D) , UV13-6 (VKM F-3632 D) , NG7C-19 (VKM F-3633 D) , y UV18-25 (VKM F-3631 D) .

20. Una cepa de Chrysosporium mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la cepa produce menos proteasa que la producida por la cepa 1 (VKM F-3500 D) de 124 Chrysosporium lucknowense, preferentemente menos de la mitad de la cantidad producida por la cepa Cl.

21. Una construcción de ácidos nucleicos, caracterizada porque comprende una región reguladora de la expresión del ácido nucleico derivada de una cepa de Chrysosporium mutante obtenida por mutagénesis in vi tro o métodos recombinantes, preferentemente de Cl (VKM F-3500 D) o UV18-25 (VKM F-3631 D) de C. lucknowense, enlazada operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido.

22. Una construcción de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la región reguladora de la expresión comprende una secuencia promotora asociada con la expresión de la celulasa o la expresión de la xilanasa, preferentemente una secuencia promotora de la celobiohidrolasa (CBH1) .

23. Una cepa microbiana recombinante, preferentemente una cepa fungosa, caracterizada porque contiene una construcción de ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 21 o 22, y capaz de expresar el polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de codificación.

24. Un método de producción de un polipéptido de interés, el método está caracterizado porque comprende cultivar una cepa de conformidad con cualquiera de las 125 reivindicaciones 1-20 y 23 bajo las condiciones que permiten la expresión y preferentemente la secreción de la proteína o polipéptido y la recuperación del polipéptido de interés producido subsiguientemente.

25. Un método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque además comprende un paso de segmentación de un precursor de dicho polipéptido en el polipéptido o precursor de interés, preferentemente una segmentación con una proteasa semejante a Kex-2, cualquier proteasa formada por parejas de aminoácidos básicos o Kex-2.

26. Un método de conformidad con las reivindicaciones 24 o 25, caracterizado porque el cultivo ocurre a un pH en el intervalo de 6-9, y/o a una temperatura entre 25 y 43 °C.

27. Un método de producción de una cepa de Chrysosporium mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizado porque comprende introducir establemente una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido heterólogo u homólogo dentro de una cepa de Chrysospori um, la secuencia de los ácidos nucleicos es capaz de ser enlazada operativamente a una región de regulación de la expresión, la introducción ocurre de una manera conocida per se para transformar los hongos filamentosos. 126

28. Un método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el método de transformación es el método de transformación de los protoplastos.

29. Una xilanasa de Chrysosporium de la familia de la xilanasa F, caracterizada porque tiene una pl de 9.1, un PM de aproximadamente 30 kD por SDS PAGE, y porque tiene al menos 75 % de identidad de los aminoácidos sobre una extensión de 120 aminoácidos con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No. 5.