ES2678450T3

ES2678450T3 - Sistema de producción de proteínas en Chrysosporium lucknowense

Info

Publication number: ES2678450T3
Application number: ES10709080.5T
Authority: ES
Inventors: Peter J. Punt; Richard Paul Burlingame; Christine M. Pynnonen; Phillip T. Olson; Jan Wery; Johannes Heinrich Visser; Mark A. Emalfarb; Jacob Visser; Jan Cornelis Verdoes
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2009-03-16
Filing date: 2010-03-16
Publication date: 2018-08-10
Anticipated expiration: 2030-03-16
Also published as: IL247068A0; ES2845200T3; BRPI1009488A2; US20120107856A1; IL215116A; EP2408910B1; DK2408910T3; MX2011009636A; EP2408910A2; WO2010107303A2; DK3421597T3; CN102421895A; US9175296B2; WO2010107303A3; EP3421597B1; CA2755417C; IL215116A0; BRPI1009488B1; US10415045B2; CN102421895B

Abstract

Cepa huésped fúngica de Myceliophthora thermophila, designada originalmente como Chrysosporium lucknowense, que es W1L depositada en el CBS con el número de acceso 122189 o W1L 100.1 depositada en el CBS con el número de acceso 122190.

Description

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DESCRIPCION

Sistema de producción de proteínas en Chrysosporium lucknowense

[0001] La presente invención se refiere a una cepa huésped fúngica de Chrysosporium lucknowense. La invención se refiere, asimismo, a un método para la producción homóloga y/o heteróloga de una proteína pura con una pureza superior a un 75 %, a un método para la producción de mezclas de proteínas artificiales y a un método para el cribado simplificado de cepas que expresan funcionalmente una enzima deseada. La exposición se refiere, además, a una secuencia promotora aislada adecuada para el control transcripcional de la expresión de genes en Chrysosporium lucknowense y a un método para aislar una cepa huésped fúngica de Chrysosporium lucknowense, donde la secreción de proteasas es inferior a un 20 % de la secreción de proteasas de la cepa de Chrysosporium lucknowense UV 18-25.

[0002] Se ha demostrado que los hongos son huéspedes excelentes para la producción de una variedad de enzimas. Cepas como Aspergillus, Trichoderma, Penicillium y recientemente el hongo Chrysosporium lucknowense C1, han sido aplicadas en la producción industrial de una amplia gama de enzimas. Se han desarrollado cepas superproductoras que secretan hasta 100 g/L o más proteína en el caldo de fermentación (véase, p. ej., en Hans Visser et al., Abstracts, J. of Biotechnology, S211-S241 (2007) o en el documento WO 2008/073914). La gran capacidad de secreción de proteínas de estos hongos los convierten en huéspedes preferidos para la producción orientada a enzimas específicas o mezclas de enzimas. Sin embargo, normalmente, estos huéspedes secretan una mezcla de muchas enzimas distintas, y convierten el producto de proteína crudo en impreciso y producen, además de la actividad enzimática deseada, una gama de actividades irrelevantes o incluso contraproducentes. Esto también se aplica a la utilización de dichos huéspedes fúngicos para la producción de actividades enzimáticas específicas mediante la sobreexpresión de genes seleccionados por medio de enfoques de modificación genética. También en estos casos, la enzima diana constituirá solamente una parte menor de la proteína total secretada. Un sistema de producción microbiana capaz de secretar grandes cantidades de una enzima específica sin la presencia de grandes niveles de otras proteínas sería muy deseable. Permitiría el cribado simplificado de los huéspedes que expresan funcionalmente una enzima deseada. Permitiría la producción de enzima relativamente pura. También permitiría la purificación a gran escala simplificada de la enzima deseada. Estas ventajas contribuirían enormemente a, por ejemplo, la generación fácil de mezclas enzimáticas artificiales adaptadas para distintas aplicaciones, por ejemplo, la hidrólisis de biomasa vegetal (biocombustibles y productos químicos), el acabado de textiles, aplicaciones en la industria del papel y de la pasta de papel.

La producción relativamente limpia de enzimas extracelulares específicas en grandes niveles por microorganismos que no secretan intrínsecamente grandes niveles de proteína sería un enfoque no preferido. La capacidad de secreción de enzimas limitada de dichos organismos evitaría un nivel de producción elevado de la enzima de interés.

El objeto de la presente invención comprende el aislamiento de los mutantes de una cepa fúngica con gran capacidad de secreción que, de forma inesperada, ya no producen grandes niveles de muchas proteínas no deseadas, al tiempo que mantienen buenas características de crecimiento y disposición para la modificación genética. Estas cepas mutantes deberían ser capaces de funcionar como huésped para la producción a gran nivel de enzimas específicas.

Con el fin de alcanzar el objeto deseado de la invención, la invención da a conocer una cepa huésped fúngica tal y como se define en cualquiera de la reivindicaciones 1-4 establecidas en el presente documento. La cepa de Chrysosporium lucknowense UV 18-25 se ha descrito en la solicitud de patente internacional WO 0020555. Preferiblemente, la secreción de una o varias del grupo que consiste en la proteasa endógena, la p-glucanasa endógena y la celobiohidrolasa endógena de la cepa huésped fúngica de acuerdo con la invención es inferior a un 20 %, más preferiblemente inferior a un 15 %, más preferiblemente inferior a un 10 %, especialmente inferior a un 5 %, más especialmente inferior a un 1 %, y aún más especialmente inferior a un 0,5 % o un 0,1 % de la secreción de proteasa endógena, p-glucanasa endógena y celobiohidrolasa endógena, respectivamente de la cepa de Chrysosporium lucknowense UV 18-25. Todos los porcentajes mencionados se aplican a la secreción de proteasa, p-glucanasa y celobiohidrolasa, independientemente.

Preferiblemente, las cepas de aucerdo con la presente invención se caracterizan también por que la secreción de celobiohidrolasa endógena 1 (Cbh1) está ausente. Más preferiblemente, la cepa de acuerdo con la presente invención es la cepa W1L, depositada en el Centraal Bureau Schimmelcultures (CBS) con el número de acceso 122189 o W1L#100.1, depositada en el CBS con el número de acceso 122190.

Más preferiblemente, de las cepas de acuerdo con la presente invención, se ha alterado el gen que codifica la endoquitinasa 1 (chi1). Más preferiblemente, uno o varios genes seleccionados del grupo que consiste en aquellos que codifican la proteasa alcalina 1 (alp1), la proteasa alcalina 2 (alp2), la proteinasa A (pep4), la p- glucanasa (Gla1), la exoquitinasa (Chi2) y la laminarinasa (Lam1) se han alterado. Especialmente, las cepas de acuerdo con la invención son W1L#100.1Aalp1Apyr5 o W1L#100.1Aalp1Achi1Apyr5.

La invención también se refiere a un método para la producción homóloga y/o heteróloga de una proteína pura con una pureza superior a un 75 %, preferiblemente superior a un 80 %, más preferiblemente superior a un 85, 90 o 95 %, que comprende la expresión de un gen que codifica dicha proteína en una cepa de acuerdo con la invención. Especialmente, la invención da a conocer un método para la producción de mezclas de proteínas

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artificiales que comprende la expresión de genes que codifican cada una de dichas proteínas de la mezcla en una cepa de acuerdo con la invención. De esta manera, pueden prepararse mezclas de proteínas para distintas aplicaciones, por ejemplo, para la hidrólisis de biomasa vegetal (biocombustibles y productos químicos), el acabado de textiles, aplicaciones en la industria del papel y de la pasta de papel). Asimismo, la invención da a conocer un método para el cribado simplificado de cepas que expresan funcionalmente una enzima deseada mediante la aplicación de cepas de acuerdo con la presente invención. Se expone una secuencia promotora aislada adecuada para el control transcripcional de la expresión de genes en Chrysosporium lucknowense, seleccionada del grupo que consiste en

a. el promotor de chi1(0.8) que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO 25,

b. el promotor de chi1(1.8) que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO 26,

c. el promotor de hexl que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO 27,

d. el promotor de xyl6 que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO 28, y

e. el promotor de gla que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO 29 o una parte de la misma transcripcionalmente activa.

[0003] También se dan a conocer un gen quimérico que comprende dicha secuencia promotora y un huésped que comprende dicho promotor y gen quimérico. Finalmente, se ha dado a conocer un método para aislar una cepa huésped fúngica de Chrysosporium lucknowense, donde la celulasa y la secreción de proteasas es inferior a un 20 % de la celulasa, respectivamente la secreción de proteasas de la cepa de Chrysosporium lucknowense UV 18-25, que comprende las etapas de

(i) colocar Chrysosporium lucknowense en placas de celulosa hinchada por ácido (ASC, por sus siglas en inglés),

(ii) seleccionar al menos una colonia que presenta una zona clara de celulosa reducida,

(iii) colocar la cepa seleccionada en la etapa (ii) en placas de leche desnatada, y

(iv) seleccionar al menos una colonia que presenta un halo de degradación de proteínas reducido. Preferiblemente, este método también comprende las etapas de mutagénesis antes de las etapas (i) y/o (iii).

[0004] Si en esta patente los huéspedes se definen mediante la comparación del nivel de producción de diversas enzimas con la cepa de Chrysosporium lucknowense UV 18-25, es evidente que la producción de una y de la misma enzima en el huésped ha de compararse con la de la cepa de Chrysosporium lucknowense UV 18-25.

[0005] Las proteínas mencionadas en esta presente patente como, por ejemplo, la proteasa, la p-glucanasa, la celobiohidrolasa, la proteinasa A, la p- glucanasa, la exoquitinasa y la laminarinasa, se han definido según se describe en el documento WO 2009/0918537 en nombre de Dyadic International INC.

[0006] Con el fin de hacer hincapié en las ventajas que proporciona la presente invención, esta se refiere al aislamiento de huéspedes fúngicos novedosos que han perdido su capacidad intrínseca de secretar altos niveles de una variedad de proteínas de fondo, al tiempo que mantienen la capacidad de secretar altos niveles de solamente unas pocas actividades enzimáticas. La invención también se refiere a la utilización de estos huéspedes para producir enzimas específicas en niveles elevados sin la coproducción de niveles elevados de proteínas no específicas. Además, la invención se refiere a la generación de mezclas de enzimas artificiales definidas y adaptadas para distintas aplicaciones.

[0007] La invención se esclarecerá mediante los ejemplos no limitativos siguientes.

[0008] Leyendas de las figuras mencionadas:

Figura 1: Muestras de medio de UV18-25, W1L tipo salvaje, W1D tipo salvaje y los mutantes de proteasa W1L#100.1, W1D#50.g y W1D#100.b en SDS-PAGE. Estas cepas se cultivaron en medio #1 (medio de baja densidad con celulosa) durante 282 horas, con la excepción de la hilera 8, que es una muestra en medio #2 (alta densidad). La muestra de medio de la hilera 1 se diluyó 2 veces y la muestra de medio de la hilera 8 se diluyó 4 veces.

Figura 2: Muestras de medio de cultivo en matraz de agitación de cepa C1 W1L#100.1 y derivados. Hilera 1, W1L#100.1; hilera 2, W1L#100.1Achi1; hilera 3, W1L#100.1Aalp1; hilera 4, W1L#100.1Aalp1Achi1.

Figura 3: Vector de clonación cósmido pAopyrGcosarp1.

Figura 4: Plásmido pCHI4.8. Se muestra el plásmido, que se aisló del clon de E.coli #5. Este plásmido se utilizó en la construcción de los vectores de expresión del gen de cepa blanca.

Figura 5: Sobreexpresión de chi1 por medio de la introducción de copias del gen chi1 adicionales en W1L#100.1. Hilera 1, W1L#100.1 cepa de tipo salvaje (control); hilera 3, W1L#100.1[chi+/pyr5]#3; hilera 4, W1L#100.1[chi+/pyr5]#9; hilera 5, W1L#100.1[chi+/pyr5]#17.

Figura 6: Plásmido Pcbh1-glaA(II)-Tcbh1. Este plásmido se utilizó en la construcción de los vectores de expresión del gen de cepa blanca.

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Figura 7: El vector de expresión del gen pPchi1(1.8)-Tcbh1 Notl.

Figura 8: Un mapa esquemático del vector de expresión del gen pCRS-pPchi1(1.8)-Tcbh1.

Figura 9: Análisis SDS-PAGE de las muestras de sobrenadante de cultivo de W1L#100.L Aalp1Apyr5 (B2), y cepas transformantes de expresión CL10518 de W1L#100.L Aalp1Apyr5 (B3, B4). La flecha indica la posición de CL10518.

Figura 10: Análisis SDS-PAGE de las muestras de sobrenadante de cultivo de W1L#100.L Aalp1Apyr5 (D1), y de cepas transformantes de expresión de cbh2 de W1L#100.L Aalp1Apyr5 (D3-D5). La flecha indica la posición de CBH2.

Figura 11: Análisis SDS-PAGE de las muestras de sobrenadante de cultivo de W1L#100.L Aalp1Apyr5 transformadas con pyr5 solamente (C) y de cepas transformantes de expresión de pgx de W1L#100.L Aalp1Achi1Apyr5 (1, 2).

Figura 12: Análisis SDS-PAGE de las muestras de sobrenadante de cultivo de W1L#100.L Aalp1Achi1Apyr5 transformadas con xyll (31, 34) y con xyllAcbd. Las flechas indican las bandas de proteína que representan las variantes de xilanasa respectivas.

Figura 13: Análisis SDS-PAGE de las muestras de sobrenadante de cultivo de W1L#100.L Aalp1Achi1Apyr5 transformadas con medio con marcador selectivo solamente (71) y con abn2 (68-70), M, marcador.

Figura 14: Análisis de transformantes chi1. #1, cepa de control (transformada con marcador selectivo pyr5 solamente). M, marcador. #65, transformante chi1. La flecha señala la banda de proteína Chi1.

Figura 15: Gel de proteína de Aspergillus niger heterólogo purificado PGII producido por C1. M, proteínas marcadoras. Los pesos moleculares de 3 proteínas marcadoras se indican a la izquierda del gel. Hilera 1, PGII purificado.

Ejemplos

Ejemplo 1: Aislamiento de mutantes C1 con actividad de celulasa considerablemente reducida (cepas blancas).

[0009] La cepa C1 UV-18-25 (descrita en el documento WO/2000/020555) se mutó mediante la utilización de luz ultravioleta para producir la cepa UV26-2 (apéndice 1 de los ejemplos). UV26-2 presentaba grandes zonas claras en placas de ASC (celulosa hinchada por ácido), lo que indicaba la sobreproducción de celulasa.

[0010] UV26-2 no era un mutante estable y las manchas sucesivas de UV26-2 dieron lugar a la generación de mutantes negativos de celulasa, tal y como se muestra mediante la ausencia de zonas claras en las placas de ASC. Estas colonias presentaban una esporulación mejorada y un color blanco, mientras que las colonias productoras de celulasa normales tenían un color crema y no presentaban esporulación en las placas de ASC.

[0011] Se cogieron dos colonias blancas (UV26-2W1 y UV26-2W2) de las placas de ASC, junto con dos colonias normales y se analizó la producción de celulasa mediante la utilización de un procedimiento de cribado con matraz de agitación. Las colonias blancas produjeron 6 y 4 U/ml de actividad de celulasa de AzoCMC, mientras que las dos colonias normales produjeron 278 y 294 U/ml de actividad de celulasa. Esto confirmó que las colonias blancas eran mutantes negativos de celulasa.

Ejemplo 2: Aislamiento y análisis de cepas deficientes de proteasa de UV26-2W1L y UV26-2W1D.

[0012] La purificación de la cepa UV26-2W1 en placas de medio RM-ASP (apéndice 2 de los ejemplos) dio lugar a la identificación de 2 tipos de colonias: colonias con esporas de color claro, tal como UV 18-25 (UV26-2W1L, también indicado como cepa W1L) y colonias con esporas de color oscuro (rosa) (UV26-2W1D, también indicado como cepa W1D).

[0013] En experimentos adicionales, se irradiaron lotes de esporas tanto de W1L como de W1D con radiación ultravioleta (apéndice 1 de los ejemplos) y se utilizaron en un procedimiento de selección directa de mutantes deficientes de proteasa (Braaksma et al., 2008). Se analizaron clones positivos en placas de leche desnatada para observar su actividad de proteasa.

[0014] Después de diversas series de purificación y selección en placas de leche desnatada, se seleccionaron dos mutantes de W1L (W1L#50.c y W1L#100.1) y tres mutantes de W1D (W1D#50.g, W1D#50.n y W1D#100.b) con un halo reducido en placas de leche desnatada para su cultivo en ensayos de degradación in vitro. En un primer experimento de cultivo, estos mutantes y sus cepas madre se cultivaron en medio #2 apéndice 1 de los ejemplos) durante 240 horas a 35 °C. Al parecer, la baja actividad de celulasa en estas cepas no permitió el crecimiento en medio basado en celulosa de densidad alta. En otros experimentos de cultivo, se cultivaron W1L#50.c, W1L#100.1, W1D#50.g y W1D#100.b, y sus originales en medio de celulosa de densidad baja (#1) y alta (#2) durante 240 horas a 35 °C. También se tomó UV 18-25 como control. Las cepas madre 2W1D, 2W1L y

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UV 18-25 también se cultivaron en medio #2. Ni la cepa W1L ni la W1D crecieron en medio de celulosa de densidad alta #2. En medio #1 se pudo observar un buen crecimiento de las cepas "blancas" y sus mutantes deficientes de proteasa, aunque la celulosa en el medio apenas fue utilizada por las cepas "blancas". De forma inesperada, se observó que la cepa madre UV26-2W1D, que presentaba un fenotipo de crecimiento inestable en placas de agar, sí que utilizó la celulosa en el medio.

[0015] Las muestras de medio de la cepa madre W1L mostraron menos actividad de proteasa en placas de leche desnatada en comparación con las muestras de medio de la cepa madre W1D y UV18-25 (tabla 1). Esto difiere de lo que se observó cuando las cepas se cultivaron directamente en placas de leche desnatada. En ese caso, pudo detectarse un gran halo alrededor de la colonia de UV18-25 y de W1L después de 72 horas de crecimiento a 30 °C, mientras que un pequeño halo sólo pudo detectarse después de 144 horas para W1D. Las muestras de medio de mutante de proteasa W1D #50.g presentaban un halo más pequeño en placas de leche hasta 162 horas de cultivo. Después de 186 horas de cultivo, los halos eran similares a los observados en relación con su cepa madre.

Tabla 1: Análisis de medio de cepas madre W1L y W1D y sus mutantes de proteasa seleccionados: W1L#100.0, W1D#50.g y W1D#100.b. UV18-25 se tomó como control. También se determinaron las actividades de proteasa de muestras de medio de W1L, W1L#100.1 y W1L#100.1Aalp1. Estas cepas se cultivaron en medio #1 (baja celulosa / lactosa / pharmamedia). El pH se midió y el medio se manchó en placas de leche desnatada para determinar su actividad de proteasa. El tamaño relativo del halo es una medida para la actividad de proteasa en el medio. nd, no determinado

: Tamaño de halo relativo (h de cultivo) Actividad de proteasa

Cepa: 114 138 162 186 210 240 282 U/ml

Original de W1L: + + + + + + + + + + + + + + 943

W1L#100.1: + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 119

W1L#100.1Aalp1: nd nd nd nd nd nd nd 46

Original de W1D: + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + nd

W1D#50.g: - - - + + + + + + + + nd

W1D#100.b: + + + + + + + + + + + + + + nd

UV18-25: + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + nd

[0016] El análisis de 282 horas de muestras de medio de estas cepas en geles de SDS-PAGE mostró que las "cepas blancas" produjeron mucha menos proteína que UV18-25 (Fig. 1). En particular, las dos proteínas principales 50/70 kDa (Cbh1) estaban ausentes en estos sobrenadantes de cultivo. En las cepas blancas, las proteínas "principales" tienen un tamaño de 75 y 45 kDa. Estas proteínas están presentes en medio de UV 18-25 como proteínas secundarias.

[0017] De este primer cribado de mutantes sin proteasa en un fondo de UV26-2W1, se seleccionaron las cepas W1D#50.g y W1L#100.1 para posteriores análisis.

Ejemplo 3: Comparación de actividades enzimáticas extracelulares entre UV 18-25 y W1L#100.1.

[0018] Se determinaron las actividades enzimáticas en el contenido de proteína extracelular de muestras de UV18-25 y W1L#100.1 (tabla 2). A partir de estos datos, se concluyó que W1L#100.1 secreta muy poca actividad de celulasa específica (menos de un 1 % de UV18-25) y presenta muy poca o ninguna actividad de proteasa detectable en comparación con UV 18-25.

Tabla 2: Actividades específicas de muestras (U/mg de proteína). Las actividades de proteasa se midieron a 3

valores de pH distintos

Actividades: UV18-25 W1L#100.1

CMCase (celulasa): 6,20 0,04

Beta-glucanasa: 10,2 0,53

Celobiohidrolasa: 0,72 0,09

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Actividades: UV18-25 W1L#100.1

Proteasa (pH 5): 0,06 0,03

Proteasa (pH 7): 0,05 0,00

Proteasa (pH 9): 0,04 0,00

[0019] Asimismo, también se redujo el nivel de hidrolasas que tienen otras especificidades de sustrato (p. ej., hemicelulosa).

Ejemplo 4: Reducción adicional de nivel de proteína: identificación de proteínas principales.

[0020] Tal y como se ha descrito anteriormente, la cepa blanca carece del espectro de enzima celulolítica extracelular en comparación con su cepa madre. Por lo tanto, el contenido de proteína extracelular en cultivos de cepa blanca, tal y como se analiza mediante SDS-PAGE, es bajo. Esta característica de la cepa es ventajosa con respecto a la producción y purificación de proteínas, puesto que la cantidad relativa de cualquier proteína diana expresada en dicha cepa será alta. Asimismo, la (casi) ausencia de actividad de celulasa convierte a la cepa blanca en una cepa huésped ideal para probar celulasas nuevas o modificadas. Lo mismo se aplica a las xilanasas, puesto que no se pudo detectar una actividad de xilanasa importante.

[0021] Para reducir más el nivel de fondo de proteína, diversas bandas de proteína principales presentes en un gel de SDS-PAGE de una W1L#100.1 y cultivos de cepa derivados se escindieron e identificaron mediante secuenciación N-terminal y/o análisis MS-MS. La proteína más abundante era la endoquitinasa Chi1 (identificador de gen: CL06081, péptidos MVYDYAG, MpIYGRS, y MFXEASA). Otras proteínas principales se identificaron como glucoamilasa (Glal, CL09507, péptidos TGGWSVvWpVLK (SEQ iD No 1) y VVGSSSEL(I)GNWDTGR (SEQ ID No 2)), exoquitinasa (Chi2, CL00367, péptidos TIDAMAWSK (SEQ ID No 3), NFLPVADILR (SEQ ID No 4), GAYHPSQTYSPEDVEK (SEQ ID No 5), y SWQLVYQHDPTAGLTAEEAK (SEQ ID No 6) y una laminarinasa (Lam1, CL08253, péptidos PQYESAGSVVPSSFLSVR (SEQ ID No 7) y VSGQVELTDFLVSTQGR (SEQ ID No 8). También se ha identificado una proteasa alcalina Alp1 (CL04253) en caldo de cultivo de W1L#100.1. Alp1 degrada proteínas extracelulares y puede degradar proteínas de interés.

Ejemplo 5: Reducción adicional del nivel de proteína: alteración de los genes chi1, chi2, glaí y lamí

[0022] El vector pChi3-4 (véase el ejemplo 9, aislamiento del gen codificador de la endoquitinasa 1) se utilizó para la construcción del vector de alteración de gen. Un fragmento de 1.1 -kb MscI/StuI se reemplazó por el marcador selectivo amdS-rep o el marcador selectivo pyr5-rep, y dio lugar a los vectores pAchií-amdS y pAchií- pyr5, respectivamente. El fragmento de alteración Achií-amdS se aisló de pAchií-amdS por digestión con EcoRI. El fragmento de alteración Achií-pyr5 se aisló de pAchií-pyr5 por digestión con Smal. La transformación de la cepa W1L#100.1 Apyr5#172-12 mediante la utilización de los fragmentos de alteración dio lugar a 215 transformantes Achií-pyr5 y a 32 transformantes Achií-amdS. Todos los transformantes obtenidos se purificaron y se analizaron con hibridación de colonias. El análisis de Southern de estos transformantes confirmó el aislamiento de un transformante W1L #100.1 con un gen chi alterado (W1L#100.1 Apyr5Achií-pyr5#46 (pyr5+)).

[0023] Se llevaron a cabo cultivos en matraz de agitación en medio C1 de baja densidad a partir de una selección de cepas mutantes de W1L#100.1Apyr5Achií. Se analizaron las muestras en SDS-PAGE para analizar los perfiles proteicos en relación con la ausencia de proteína Chi1 (Fig. 2, hilera 2 frente a hilera 1). Tal y como se muestra, no se observa ninguna proteína 45 kDa Chi1 en la cepa mutante Achií.

[0024] Las proteínas extracelulares restantes más prominentes en cepa blanca W1L#100.1Aalp1Achi1 y cepas derivadas corresponden a glucoamilasa (Gla1), exoquitinasa (Chi2) y laminarinasa (Lam1). Estas enzimas se purificaron a partir del medio de cultivo. Las actividades enzimáticas de estas proteínas se verificaron mediante la utilización (entre otros) de almidón, quitosano y laminarina, respectivamente, como sustratos. Asimismo, datos de análisis de espectometría de masas (véase ejemplo 4) combinados con datos de secuencia de genoma de C1, revelaron los genes correspondientes. Con el fin de reducir aún más el fondo de proteína extracelular, los genes codificadores de Gla1, Chi2 y Lam1 se alteraron y, de esta manera, se inactivaron. La alteración se basó en el intercambio del promotor de genes y parte de la secuencia codificadora 5' mediante un marcador selectivo amdS por medio de recombinación homóloga con aproximadamente 1,5 kpb en dirección 5' y en dirección 3' de secuencias que flanquean estos promotores de genes y parte de la secuencia codificadora 5'. Los vectores de alteración de genes, por lo tanto, contenían el casete de expresión de amdS más estas secuencias genéticas homólogas flanqueadoras de 1,5 kb. Las cepas blancas W1L#100.1 AalpíAchií y las cepas derivadas se transformaron con los vectores de alteración de genes glaí, chi2 y lamí y los transformantes se cribaron para obtener el genotipo correcto mediante la utilización de RCP. Por lo tanto, se obtuvieron cepas blancas con una composición/un contenido de proteína extracelular más reducido. Las proteínas diana producidas por estas cepas eran más del 80 % puras en el líquido de cultivo acelular crudo.

Ejemplo 6: Reducción adicional de actividad de proteasa: alteración orientada a genes que codifican proteasas.

[0025] En general, los genes que codifican proteasas se alteraron mediante la utilización de fragmentos de ADN de alteración que contenían marcadores selectivos (amdS, pyr4 o pyr5) flanqueados por aproximadamente fragmentos de ADN de 1,5 kb homólogos a regiones en dirección 5' y en dirección 3' del gen que se ha de 5 alterar. Tras la introducción de estos fragmentos de ADN de alteración en el huésped blanco, una recombinación homóloga intercambió el gen que se había de alterar por el fragmento de marcador selectivo. Se seleccionaron, por lo tanto, transformantes correspondientes. Los genes que se alteraron de esta manera, bien codificaron actividades de proteasa desventajosas (con respecto a la estabilidad de proteínas diana), por ejemplo, alpl, alp2, pep4) o proteína de fondo significativa (chi1) o iban a utilizarse como marcador selectivo (pyr4, pyr5). Por medio 10 de este enfoque, se han construido numerosas cepas C1 que pueden utilizarse como huéspedes para la expresión de proteínas diana (tabla 3).

Tabla 3: Cepa W1L y derivados.

W1L

W1L SUIR#S2 6.14

W1 L SUIR#S2 6S

W1L#100.1

W1L# 100.1 Apyr5

W1L# 100.1 Aalp1

W1L# 100.1 Aalp1 Apyr5

W1 L# 100.1 Apep4 Apyr5

W1L# 100.1 Aalp1 Apep4

W1L# 100.1 Aalp1 Apep4 Apyr5

W1L# 100.1 Aalp1 Aalp2 Apyr5

W1 L#100.1 Achi1

W1L# 100.1 Aalp1 Achi1

W1L#100.1 Aalp1 Achi1 Apyr5

W1L#100.1 Aalp1 Achi1 Aalp2

W1L# 100.1 Aalp1 Achi1 Aalp2 Apyr5

W1L#100.1 Aalp1 Achi1 Apep4

W1L# 100.1 Aalp1 Achi1 Agla1 Alam1 Achi2Apyr5

Ejemplo 7: Identificación de promotores fuertes para la expresión de genes: gen codificador de quitinasa (chi1).

[0026] Se aislaron varias bandas de proteína principales de muestras de fermentación de W1L#100.1 cultivadas 15 en medio de celulosa de baja densidad con el fin de identificar y aislar promotores fuertes que pueden utilizarse

para la expresión de genes en la cepa W1L y sus derivados. La secuenciación N-terminal de una mezcla de péptidos obtenida después del tratamiento de CNBr de la proteína principal de W1L#100.1 de 45 kDa dio lugar a la identificación de cuatro péptidos diferentes. Tres de estos péptidos (MVYAG, MPIYGRS y MFXEASA) presentaban homología con una endoquitinasa de Aphanocladium album/Trichoderma harzianum (CHI_APHAL 20 P32470).

[0027] A partir de 3 de estas secuencias peptídicas, se diseñaron cebadores con el fin de obtener fragmentos de RCP que contenían una parte del gen codificador de endoquitinasa (tabla 4). Los cebadores de RCP se diseñaron a partir de la utilización de codón preferida de C1.

Tabla 4: Los cebadores diseñados de endoquitinasa putativa en base a la utilización de codón de C1.

Cebador: Región Posición Secuencia deducida

Endochitpep1C: MVYDYAG (SEQ ID No 9) 240 aa ATGGTSTACGACTACGCBGG (SEQ ID No 10)

Endochitpep2C Endochitpep2revC: MPIYGRS(S EQ ID No 11) 290 aa ATGCCSATCTACGGYCG (SEQ ID No 12) CGRCCGTAGATSGGCAT (SEQ ID No 13)

Endochitpep3revC: MFXEASA(S EQ ID No 14) 380 aa GCSSWVGCCTCCCAGAACA T(SEQ ID No 15)

Cebador basado en una región homóloga conservada de endoquitinasa:

Endochit3c: DGIDIDWEV (SEQ ID 160 aa GAYGGYATCGAYRTSGAYTGGG

: No 16) (SEQ ID No 17)

[0028] Las reacciones de RCP con estos cebadores se llevaron a cabo mediante la utilización de ADN cromosómico de UV18-25 como ADN plantilla. Los fragmentos de RCP se clonaron y el análisis de secuencia

5 mostró que uno de los fragmentos de RCP clonados obtenidos con Endochitpep1c y Endochitpep2revc (173 pb) contenía una parte de un gen codificador de endoquitinasa (chil). El análisis de hibridación del ADN cromosómico de BamHI y HindIII digeridos por UV 18-25 con este fragmento de chi1 como sonda presentaba una señal de hibridación clara que confirmaba que el fragmento de RCP procedía de ADN de C1. Este fragmento se utilizó para clonar el gen completo de la genoteca de cósmidos C1 ordenados. La secuencia de fragmento (SEQ ID No 10 18) era la siguiente:

ATGGGCTACGACTACGCCGGCTCGTGGAGCACCGCGGCGGGACACCAGGCCA

ACCTGTACCCGACCGCCGACGCGGGCAGGACGCCCTTCTCGACCGACAAGGC

CCTGTCCGACTACGTCGCCGCCGGCGTCGACCCGGCCAAGATCGTGCTCGGC

ATGCCCATCTACGGCCG

Ejemplo 8: Construcción de una biblioteca de cósmidos ordenados de UV18-25 de Chrysosoorium lucknowense en E.coli.

[0029] Para la construcción de la biblioteca de cósmidos C1, se utilizó el vector de clonación cósmido comercial 15 pAOpyrGcosarp1 (Fig. 3). Este vector porta el marcador selectivo pyrG de Aspergillus oryzae, que permite la

transformación de una amplia gama de cepas fúngicas. Asimismo, para la transformación sumamente eficiente de diversas especies de Aspergillus (para la que se dispone de una gran colección de cepas mutantes para la clonación complementaria del gen C1 correspondiente) el replicador AMA1 está presente en este vector. Un sitio de clonación de BamHI único permite la clonación de ADN genómico Sau3A parcialmente digerido de la cepa de 20 Chrysosporium UV 18-25.

[0030] Una biblioteca de cósmidos de UV 18-25 fue construida en E. coli y almacenada como soluciones de glicerol a -80 °C. El tamaño de inserción medio era 20-35 kb. En total, se obtuvieron 6800 clones, lo que representa una cobertura genómica de aproximadamente 5 veces. Para ordenar estos clones en placas de 384 pocillos, se colocaron las disoluciones de las soluciones de glicerol en placas de agar con caldo de lisogenia, que

25 contenían ampicilina. Se cogieron manualmente 7680 colonias individuales y se inocularon en veinte placas de

384 pocillos. Estas veinte placas de 384 pocillos representan la biblioteca de cósmidos ordenados de UV 18-25 en E. coli.

[0031] Las colonias individuales en las veinte placas de 384 pocillos se mancharon en filtros de nailon (Hybond), mediante la utilización de una herramienta de alfiler Staccato 384 (Zymarks). La biblioteca de cósmidos

30 ordenados se manchó en octuplicado (en total, 160 filtros). Estos filtros se colocaron en placas de medio de

ampicilina con caldo de lisogenia y se incubaron a 37 °C para permitir que crecieran colonias en los filtros. Posteriormente, las colonias fueron lisadas y el ADN cósmido se unió a los filtros mediante la utilización de procedimientos estándar.

Ejemplo 9: Aislamiento del gen codificador de la endoquitinasa 1 (chi1).

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[0032] El fragmento de RCP de chil de 173 pb se utilizó como sonda etiquetada radiactiva para la hibridación de filtros duplicados de la biblioteca de cósmidos. La hibridación de la genoteca de cósmidos mediante la utilización de este fragmento de chil dio lugar a 3 clones positivos. Se aisló el ADN de estos clones y se llevó a cabo un análisis de restricción seguido de un análisis de Southern. Un fragmento de HindIII de 4,8 kb y un fragmento de BglII de 3,4 kb mostraron hibridación mediante la utilización de la sonda de chil. Los fragmentos de HindIII de 4,8 kb y de BglII de 3,4 kb que contenían el gen de chil se aislaron y se subclonaron en pMTL24, lo que dio lugar a los vectores pCHI4.8 (Fig. 4) y pChi3-4, respectivamente. Posteriormente, un subclon de BglII se utilizó para el análisis de secuencia con el fin de obtener más datos de secuencia. Se obtuvo la secuencia del gen completo de chil de UV18-25. El tamaño del gen de chil es 1529 pb, donde están presentes 2 intrones de 111 pb y 138 pb.

Ejemplo 10: Sobreexpresión de la endoquitinasa en W1L#100.1.

[0033] Para la sobreexpresión de la endoquitinasa, se aisló el fragmento de BglII de 3,4 kb que contenía el gen de chil de pChi3-4. Se generaron cepas multicopia de chil putativas en W1L#100.1Apyr5 mediante la cotransformación del fragmento de chil de BglII de 3,4 kb y un fragmento de selección de pyr5 y transformantes correctos fueron confirmados mediante hibridación de colonias. Se llevaron a cabo cultivos en matraz de agitación en medio C1 de baja densidad a partir de una selección de cepas multicopia W1L#100.1 chi1. Se analizaron las muestras en SDS-PAGE para analizar los perfiles proteicos en relación con la sobreproducción de Chi1 (Fig. 5). Tres de las cepas multicopia de chi1 (hileras 3, 4, 5) muestran una banda de 45 kDa más fuerte en comparación con la cepa madre (hilera 1), lo que indica una sobreexpresión de quitinasa y la utilidad del promotor de chil para una expresión de genes fuerte.

[0034] Por lo tanto, un vector de clonación por expresión C1 general (pPchi1(0.8)-Tcbh1 NotI) fue construido con el promotor de chi (Pchi) para dirigir la sobreexpresión de los genes clonados. Inicialmente, se eliminó el sitio EcoRI en dirección 5' en Pchil en pCHI#4.8 mediante una digestión por EcoRI parcial y el tratamiento del fragmento lineal, y Klenow produjo pCHI1#4.8AEcoRI. De este vector, se clonó el fragmento SacI-SphI de 1,9 kb en el sitio correspondiente de pPcbh1-glaA(II)-Tcbh1 (Fig. 6). En el vector resultante, pPchi-Tcbhl NotI#7.1, los genes diana pueden insertarse en los sitios NcoI-EcoRI. Los casetes de expresión para la transformación en cepas C1 pueden aislarse de estos constructos como fragmentos NotI.

[0035] La secuencia promotora de chi1 de 0,8 kb en pCHI#4.8 podría ser más que suficiente para impulsar la expresión de chil. Sin embargo, también se generó un promotor de chi1 más largo mediante la amplificación del fragmento a PstI-HindIII (en dirección 5' del sitio HindIII en la posición -775 en relación con el codón de inicio ATG), mediante la utilización de uno de los clones cósmidos positivos identificados anteriormente como ADN plantilla. El fragmento resultante se clonó en pGEM-T-Easy y se secuenció. De este plásmido, se aisló y se clonó el fragmento de PstI-HindIII en los sitios correspondientes de pPchi1-xyl1-Tcbh1, lo que produjo pPchi1(1.8)-xyl1- Tcbh1, donde el tamaño de promotor es 1,8 kb. El fragmento también se clonó en el sitio correspondiente de pPchil-Tcbhl NotI#7.1, lo que produjo el vector de expresión general pPchi1(1.8)-Tcbh1 NotI (Fig. 7).

[0036] Los niveles de expresión de genes dirigidos por el promotor de quitinasa extendido (Pchi1(1.8)) y por el promotor de quitinasa utilizado inicialmente (Pchi1 (0.8)) se compararon mediante la expresión de dos genes indicadores, xyl1 y alp1. Se generaron transformantes de cepa blanca que, bien expresaban xyll (codificador de una xilanasa) o alp1 (codificador de una proteasa alcalina) (tabla 5).

Tabla 5: Comparación de los promotores de Pchi1 cortos y extendidos en términos de nivel de expresión de proteínas indicadoras. La actividad indicadora, la actividad de xilanasa se expresa como U/ml y la actividad de proteasa alcalina como U/mg de proteína. A = W1L#100.1[Pchi1(0,8)-a1p1/pyr5]#9, B = W1L#100.1[Pchi1(1,8)- alpl1pyr5]#22, C = W1L#100.1Aalp1[Pchi1-xyl1]#95, D = W1L#100.1Aalp1[Pchi1(1.8)-xyl1]#A7.

Indicador: Actividad indicadora de Pchi 1 0,8 kb Actividad indicadora de Pchi 1 1,8 kb

Alp1 (R19): 0,7 (A) 1,9 (B)

Xyl1 (R14): 122 (C) 1175(D)

[0037] De forma sorprendente, la expresión de genes indicadores era mayor en el caso del promotor de chi1 extendido (1,8 kb), lo que indica que se necesitan las regiones en dirección 5' adicionales. En conclusión, se desarrolló un sistema de expresión basado en Pchil para la expresión de alto nivel de genes en cepas C1 blancas.

Ejemplo 11: Identificación de otros promotores fuertes para la expresión de genes.

[0038] Se utilizó un enfoque diferente para buscar promotores fuertes mediante la utilización de la detección cuantitativa de niveles de ARN mensajero a partir de ARN de W1L o de W1L#100.1 Las muestras de ARN se aislaron de micelio, del que se tomaron muestras en diferentes puntos temporales durante un proceso de fermentación por lote alimentado. Se identificó la expresión fuerte o más fuerte de una cantidad de genes. Para

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verificar el nivel de expresión de estos genes, las muestras de ARN también se separaron en gel, se mancharon y se hibridaron en sondas específicas para estos genes (tabla 6).

Tabla 6: Cuantificación de las señales de expresión de los distintos genes en fermentaciones por lote alimentado controladas. Las señales de hibridación en sonda se cuantificaron mediante la utilización de un densitómetro. La señal de la sonda en la transferencia de Northern estaba relacionada con la señal de esta sonda en una transferencia de Southern de ADN genómico de C1. Por lo tanto, los valores de la tabla representan el nivel de señal de hibridación de la transferencia de Northern en relación con el nivel de señal de hibridación de la transferencia de Southern (que se establece en 1). Las secuencias genéticas se proporcionan a continuación.

Cepa/alimentación: chil pep4 his2a hex1 bgl1 xyl6 cbhl

W1L / alucosa

Lote: 0 4 2 21 0 0,3 0

Día 1 alimentación: 47 5 3 15 8 1 0

Día 2 alimentación: 52 3 3 17 8 1 0

Wb1L#100.1 / xilosa

Lote: 0 0,2 2 12 0 0 0

Día 1 alimentación: 40 3 2 12 3 19 0

Día 2 alimentación: 36 4 6 17 5 21 0

W1L#100.1 / glucosa

Lote: 0 0,1 3 23 0 0,1 0

Día 1 alimentación: 61 0,5 2 17 7 0,2 0

Día 2 alimentación: 59 0,2 2 14 6 1 0

[0039] El promotor de cbhl, que es un promotor fuerte en cepas de UV18-25, no es activo en las cepas blancas. El promotor de chi1 era el más fuerte tanto en condiciones de alimentación con glucosa como con xilosa. El promotor de hex1 es un promotor constitutivo fuerte durante todas las fases de fermentación y tanto en condiciones de alimentación con azúcar. El promotor de xyl6 es muy activo solamente en condiciones de alimentación con xilosa. Los promotores de pep4, his2a y bgl1 son moderadamente activos. Para la expresión de genes de alto nivel en las cepas blancas, los promotores de chi1, hex1 y xyl6 son muy útiles. Los promotores alternativos que también proporcionan una expresión fuerte son aquellos de los genes pep4, his2a y bgl1. Experimentos de transferencia de Northern adicionales también indicaron que los promotores de los genes xyl 4 y xyl8 pueden utilizarse para la expresión de genes de alto nivel en las cepas blancas cuando se cultivan en xilosa. Se ha demostrado que la glucoamilasa (Gla1, identificador de gen: CL09507) es una proteína principal en cepas C1 blancas. El promotor de gla1 es, por lo tanto, también un buen candidato para su utilización para la expresión de alto nivel de genes de interés en cepas blancas. Se demostró que la glucoamilasa era muy abundante en una cepa blanca cultivada en presencia de almidón. Esto indicó que el promotor de gla1 es fuerte e inducible por almidón y sus productos de degradación, como la maltosa.

[0040] Las secuencias nucleotídicas de Pchi1(0.8), Pchi1(1.8), Phex1, Pxyl6 y Pglal se proporcionan a continuación. Ha de observarse que los codones de inicio de ATG de las regiones codificadoras correspondientes se proporcionan en negrita y en cursiva.

Ejemplo 12: Sistema de expresión de genes de cepa blanca

[0041] Se diseñaron dos vectores de expresión para la expresión de genes en W1L y derivados: pPchi1(1.8)- Tcbhl NotI era como se ha descrito anteriormente. De forma adicional, pCRS Pchi1-Tcbh1 (Fig. 8) fue construido mediante la colocación de la secuencia de repetición de C1 delante del promotor de Pchi1 en pPchi1(1.8)-Tcbh1 NotI. Estos vectores se han diseñado de tal forma que también pueden combinarse, dando lugar a un único vector que contiene diversos casetes de expresión. Los diversos casetes pueden escindirse del vector como un fragmento de ADN lineal único.

[0042] Muchos genes se han clonado y expresado en W1L o derivados. El procedimiento general fue el siguiente:

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- Se identificaron los genes mediante purificación y caracterización de los productos génicos (genética inversa) y/o minería genómica. Se amplificaron los genes mediante RCP o se sintetizaron químicamente. La amplificación de los genes mediante RCP se llevó a cabo mediante la utilización de polimerasas de ADN por medio de RCP de revisión (Phusion o Supertaq plus). Los genes amplificados se clonaron en vectores de clonación por RCP, es decir, pGEM-T-Easy (Promega) o pJet1 (Fermentas) y se secuenciaron para verificar la precisión de la secuencia. Posteriormente, los genes se liberaron del vector de clonación por RCP y se ligaron en los sitios NcoI y EcoRI del o de los vectores de expresión.

- Se tuvo un cuidado especial en el diseño de los cebadores de RCP. El codón de inicio de ATG del gen que se había de expresar era parte del sitio de restricción NcoI en los vectores de expresión de cepa blanca. Por lo tanto, los cebadores de RCP 5' (ATG) contenían sitios de restricción, que son compatibles con el sitio NcoI restringido del vector. Es decir, estos sitios eran NcoI (C^CATGG) o sitios compatibles que se cortan dentro del sitio de reconocimiento (BspHI, T^CATGA; PciI, A^CATGT) o sitios compatibles que se cortan fuera del sitio de reconocimiento (SsaI, GGTCTC(1/5); SspMI, ACCTGC(4/8); Esp3I, CGTCTC(1/5)).

- En algunos casos, los sitios de restricción sumados a los que iban a utilizarse para la clonación de los genes, se hallaron en los genes. En estos casos, los genes se amplificaron mediante RCP de fusión, donde se seleccionó que la fusión de los dos fragmentos de RCP ocurriera en el sitio de restricción adicional no deseado. El sitio de restricción no deseado se eliminó mediante la utilización de cebadores de fusión que contenían mutaciones de sustitución simples en la secuencia de sitio de restricción no deseada. En el caso de que el sitio de restricción no deseado estuviera presente en una región codificadora de proteínas, el nucleótido sustituido se seleccionó de tal manera que el codón mutante codificara el mismo aminoácido que el codón original.

- Los casetes de expresión se liberaron de la cadena principal de vector de ADN de E. coli por restricción de Notl. El casete de expresión se transformó, posteriormente, en derivados de W1L simultáneamente con un marcador selectivo, es decir, pyr5 o amdS en experimentos de cotransformación.

- Se seleccionaron transformantes positivos y de alta producción por SDS-PAGE o análisis de ensayo de enzimas del medio de crecimiento. Los mejores productores se aplicaron en fermentaciones para producir una gran cantidad del producto génico deseado.

- Las siguientes proteínas se han producido mediante la utilización del sistema de expresión de genes de cepa blanca y genes correspondientes

[0043] En el documento de solicitud de patente international WO 2009/018537 se han descrito:

Abf1, Abf2, Abn1, Axe1, Bgl1 (=Bgl3A), Cbh1, Cbh2, Cbh4, Chi1, Eg2, Eg5, FaeA1, FaeA2, FaeB2, Gall (=Gal53A), Gla1 (=Gla15A), Pme1, Xyl1, Xyl1(cd), Xyl2, Xyl3, Xyl3-cbd (=xyl3(cd)), Xyl4, Xyl5, Xyl6.

[0044] En el documento de solicitud de patente international WO 2009/033071 se han descrito los genes siguientes:

Abf3, Abn2, Abn3, Abn4, Abn5, Abn7, Abn9, Agu1, Axe2, Axe3, Bga2, Bxl1, Bxl2, Abf5 (antes conocido como Bxl3), GH61 (identificadores de genes: CL09768, CL10518, CL05022, CL04725, CL04750, CL06230, CL05366), Gln, Pgx1, Rga1, Rgx1, Xgll, Xyl7, Xyl8, Xyl9, Xyl10, Xyl11.

Alp1: La secuencia de ADN de Alp1 es proporcionada por SEQ ID NO 30. La secuencia de aminoácidos de Alp1 se proporciona en SEQ iD NO 31.

[0045] Se expresó el gen alp1 y Alp1 mostró actividad de proteasa (tabla 5). Se utilizó el "kit de detección colorimétrico de proteasa" (Sigma, número de producto PC0100) para determinar la actividad de proteasa de Alp1.

Ejemplo 13: Expresión de genes codificadores de proteínas de la familia GH61 en C1

[0046] Un gen codificador de la proteína GH61 (identificador CL10518) se sobreexpresó en cepas C1 W1L#100.L Aalp1Apyr5 y W1L#100.1Aalp1Achi1Apyr5. Se analizaron muestras de sobrenadante de cultivo mediante SDS-PAGE y se tiñeron bandas de proteína con azul brillante Coomassie (CBB, por sus siglas en inglés). La proteína CL10518 tiene un tamaño de ±26 kDa (Fig. 9). Se llevó a cabo una fermentación por lote alimentado, que produjo 13 g de proteínas por litro de filtrado de fermentación, a partir de un ensayo de determinación de proteínas por BCA.

[0047] El análisis funcional de esta proteína se ha descrito en la solicitud de patente internacional WO 2009/033071.

Ejemplo 14: Expresión de un gen codificador de celulasa en C1: cbh2.

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[0048] El gen codificador de CBH2 (identificador CL09854) se sobreexpresó en la cepa C1 W1L#100.L Aalp1Apyr5. Se analizaron muestras de sobrenadante de cultivo mediante SDS-PAGE y se tiñeron bandas de proteína con azul brillante Coomassie (CBB, por sus siglas en inglés). La proteína CBH2 migra a aproximadamente 55 kDa (Fig. 10). Se llevó a cabo una fermentación por lote alimentado estándar, que produjo 10 g de proteínas por litro de filtrado de fermentación, a partir de un ensayo de determinación de proteínas por BCA.

[0047] El análisis funcional de esta proteína se ha descrito en la solicitud de patente internacional WO 2009/018537.

Ejemplo 15: Expresión del gen codificador de la exopoligalacturonasa pgx en C1

[0050] El gen codificador de PGX (identificador CL10389) se sobreexpresó en la cepa C1 W1L#100.L Aalp1Achi1Apyr5. Se analizaron muestras de sobrenadante de cultivo mediante SDS-PAGE y se tiñeron bandas de proteína con azul brillante Coomassie (CBB, por sus siglas en inglés). La proteína PGX migra a aproximadamente 60 kDa (Fig. 11). Se llevó a cabo una fermentación por lote alimentado estándar, que produjo 9 g de proteína por litro de filtrado de fermentación, a partir de un ensayo de determinación de proteínas por BCA.

[0051] Se utilizó el siguiente ensayo para medir la actividad de poligalacturonasa. Mediante este ensayo se mide la cantidad de azúcares reductores liberados del ácido poligalacturónico (PGA, por sus siglas en inglés) mediante la acción de una poligalacturonasa. Una unidad de actividad se definió como 1 pmol de azúcares reductores liberados por minuto en las condiciones de reacción precisadas.

Reactivos

[0052]

- El tampón de acetato de sodio (0,2 M, pH 5,0) se prepara de la manera siguiente. 16,4 g de acetato de sodio anhidro o 27,2 g de acetato de sodio * 3H2 O se disuelven en agua destilada de tal forma que el volumen final de la solución sea 1000 mL (Solución A). En un matraz separado, se mezclan 12,0 g (11,44 mL) de ácido acético glacial con agua destilada para conseguir el volumen total de 1000 mL (Solución B). El tampón de acetato de sodio 0,2 M final, pH 5,0, se prepara mediante mezcla de la Solución A con Solución B hasta que el pH de la solución resultante sea igual a 5,0.

- El ácido poligalacturónico (PGA) se adquirió de Sigma (San Luis, EE. UU.).

- Reactivo A: 10 g de ácido p-hidroxibenzoico hidrazida (PAHBAH, por sus siglas en inglés) suspendidos en 60 mL de agua. Se añadieron 10 mL de ácido clorhídrico y se ajustó el volumen a 200 ml. Reactivo B: Se disolvieron 24,9 g de citrato trisódico en 500 ml de agua. Se añadieron 2,2 g de cloruro cálcico, así como 40 g de hidróxido de sodio. Se ajustó el volumen a 2 L con agua. Ambos reactivos se almacenaron a temperatura ambiente. Reactivo de trabajo: Se añadieron 10 ml de reactivo A a 90 ml de reactivo B. Esta solución se preparaba de nuevo cada día y se almacenaba en hielo entre cada uso.

[0053] Con la utilización de los reactivos anteriores, el ensayo se lleva a cabo tal y como se describe a continuación.

Muestra de enzimas

[0054]

- Se mezclaron 50 pL de PGA (10,0 mg/mL en 0,2 M de tampón de acetato de sodio pH 5,0) con 30 pL de tampón de acetato de sodio 0,2 M pH 5,0 y 20 pL de la muestra de enzimas y se incubó a 40 °C durante 75 minutos. A 25 pL de esta mezcla de reacción, se añadieron 125 pL de solución de trabajo. Se calentaron las muestras durante 5 minutos a 99 °C. Después de enfriarse, se analizaron las muestras midiendo la absorbancia a 410 nm (A410) como As (muestra de enzimas).

Blanco de sustrato

[0055]

- Se mezclaron 50 pL de PGA (10,0 mg/mL en 0,2 M de tampón de acetato de sodio pH 5,0) con 50 pL de tampón de acetato de sodio 0,2 M pH 5,0 y se incubó a 40 °C durante 75 minutos. A 25 pL de esta mezcla de reacción, se añadieron 125 pL de solución de trabajo. Se calentaron las muestras durante 5 minutos a 99 °C. Después de enfriarse, se analizaron las muestras midiendo la absorbancia a 410 nm (A410) como Asb (muestra de blanco de sustrato).

Cálculo de actividad

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[0056]

- La actividad se calcula de la manera siguiente: determinación de la actividad de poligalacturonasa por referencia a una curva patrón de ácido galacturónico.

Actividad (IU/ml) = AA410 / SC * DF

- donde AA4i0 = AS (muestra de enzimas) - ASB (blanco de sustrato), SC es la inclinación de la curva patrón y DF es el factor de dilución de enzimas.

[0057] Se determinó que la AA4i0 de Pgx1 (CL10389) era 0,78 con un DF de 1 por enzima producida en cultivos de placas de microtitulación. No se analizó la curva patrón, de manera que no puede calcularse una actividad fiable. La única conclusión que se puede extraer es que se determinó que la enzima era activa con respecto al ácido poligalacturónico y, por lo tanto, se sugiere que es una poligalacturonasa.

[0058] El análisis funcional de esta proteína se ha descrito en la solicitud de patente internacional WO 2009/033071.

Ejemplo 16: Expresión de un gen codificador de xilanasa con y sin su dominio vinculante carbohidrato en C1: Xyl1.

[0059] El gen codificador de Xyl1 (identificador CL00649) se sobreexpresó en la cepa C1 W1L#100.L Aalp1Achi1Apyr5. Se produjeron dos variantes de Xyl1: Xyll de longitud completa o Xyl1 sin su dominio vinculante carbohidrato (cbd, por sus siglas en inglés). Se analizaron muestras de sobrenadante de cultivo mediante SDS-PAGE y se tiñeron bandas de proteína con azul brillante Coomassie (CBB) (Fig. 12). La proteína Xyl1 migra a aproximadamente 40 kDa, mientras que su homólogo sin CBD migra a aproximadamente 30 kDa. Se llevaron a cabo fermentaciones por lote alimentado estándar, que produjeron hasta 33 g de proteína por litro de filtrado de fermentación, a partir de un ensayo de determinación de proteínas por Bradford. Las actividades de xilanasa de estos filtrados alcanzaron hasta 3.500 U/mL.

[0060] El ensayo siguiente se utiliza para medir la actividad de xilanasa con respecto al arabinoxilano de trigo azoico. Este sustrato es insoluble en soluciones tamponadas, pero se hidrata rápidamente para formar partículas de gel que se hidrolizan fácil y rápidamente mediante endo-xilanasas específicas que liberan fragmentos marcados con tinta solubles.

Reactivos

[0061]

- El arabinoxilano de trigo azoico (AZO-WAX) de Megazyme (Bray, Irlanda, Cat. # I-AWAXP) se utiliza como sustrato de ensayo. 1 g de AZO-WAX se suspende en 3 mL de etanol y se ajusta a 100 mL con tampón de acetato de sodio 0,2 M, pH 5,0 mediante la utilización de un agitador magnético. Se utiliza etanol 96 % para determinar la reacción enzimática.

[0062] Con la utilización de los reactivos anteriores, el ensayo se lleva a cabo tal y como se describe a

continuación:

Muestra de enzimas

[0063]

- Se precalentaron a 40 °C durante 10 minutos 0,2 mL de 10 mg/ml de solución madre de AZO-WAX. Esta solución madre precalentada se mezcló con 0,2 mL de la muestra de enzimas (precalentada a 40 °C durante 10 min) y se incubó a 40 °C durante 10 minutos. Después de exactamente 10 minutos de incubación, se añadió 1,0 mL de etanol 96 % y, a continuación, la absorbancia a 590 nm (A590) se midió como AS (muestra de enzimas).

Blanco de sustrato

5

10

15

20

25

30

35

40

45

- Se precalentaron a 40 °C durante 10 minutos 0,2 mL de 10 mg/ml de solución madre de AZO-WAX. Esta solución madre precalentada se mezcló con 200 ^l de tampón de acetato de sodio 0,2 M, pH 5,0 (precalentado a 40 °C durante 10 min) y se incubó a 40 °C durante 10 minutos. Después de exactamente 10 minutos de incubación, se añade 1,0 mL de etanol 96 % y, a continuación, la absorbancia a 590 nm (A590) se mide como Asb (blanco de sustrato).

Cálculo de actividad

[0065]

- La actividad se calcula de la manera siguiente: determinación de la actividad de endo-xilanasa por referencia a una curva patrón, producida a partir de una endo-xilanasa con actividad conocida con respecto a AZO-WAX.

Actividad (IU/ml) = AA590 / SC * DF

- donde AA590 = AS (muestra de enzimas) - ASB (blanco de sustrato), SC es la inclinación de la curva patrón y DF es el factor de dilución de enzimas.

[0066] El análisis funcional de esta proteína se ha descrito en la solicitud de patente internacional WO 2009/018537.

Ejemplo 17: Expresión del gen codificador de arabinosa 2 abn2 en C1

[0067] El gen codificador de Abn2 (identificador CL03602) se sobreexpresó en la cepa C1 W1L#100.L Aalp1Achi1Apyr5. Se analizaron muestras de sobrenadante de cultivo mediante SDS-PAGE y se tiñeron bandas de proteína con azul brillante Coomassie (CBB). La proteína Abn2 migra a aproximadamente 50 kDa (Fig. 13). Se llevó a cabo una fermentación por lote alimentado estándar, que produjo 7 g de proteína por litro de filtrado de fermentación, a partir de un ensayo de determinación de proteínas por BCA.

[0068] El análisis funcional de esta proteína se ha descrito en la solicitud de patente internacional WO 2009/033071.

Ejemplo 18: Expresión del gen codificador de endoquitinasa chi1 en C1

[0069] El gen codificador de Chi1 (identificador CL06081) se sobreexpresó en la cepa C1 W1L#100.L Aalp1Apyr5. Se analizaron muestras de sobrenadante de cultivo mediante SDS-PAGE y se tiñeron bandas de proteína con azul brillante Coomassie (CBB). La proteína Chi1 migra a aproximadamente 40 kDa (Fig. 14). Se llevó a cabo una fermentación por lote alimentado estándar, que produjo 12 g de proteína por litro de filtrado de fermentación, a partir de un ensayo de determinación de proteínas por BCA.

[0070] El análisis funcional de esta proteína se ha descrito en la solicitud de patente internacional WO 2009/018537.

Ejemplo 19: Expresión de un gen heterólogo: Poligalacturonasa II de Aspergillus niger.

[0071] El gen codificador de poligalacturonasa II de Aspergillus niger (número de acceso X58893) se expresó en la cepa C1 W1L#100.1Aalp1Achi1Apyr5. Tras la fermentación, se purificó la enzima mediante la utilización de cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaños. La endo-PGII purificada migró a aproximadamente 40 kDa en gel de SDS-PAGE (Fig. 15).

[0072] Esta enzima heteróloga era funcional, tal y como mostraba la actividad en ácido poligalacturónico mediante la utilización del ensayo siguiente.

Ensayo de azúcares reductores: Método PAHBAH

Soluciones madre:

[0073]

- Sustrato: 1 % (p/v) de ácido poligalacturónico en H2O.

- Reactivo A: Se añade ácido p-hidroxibenzoico hidrazida (PAHBAH) (10 gramos) a 60 ml de agua y se pone en suspensión. A esto, se le añaden 10 ml de HCl concentrado y se lleva el volumen a 200 ml. Reactivo B: Disolver citrato trisódico (24,9 g) en 500 ml de agua, añadir cloruro cálcico (2,20 g) y disolver, añadir hidróxido de sodio (40,0 g) y disolver. Ajustar el volumen a 2 litros. La solución debería ser clara. Almacenar ambos reactivos a temperatura ambiente. Reactivo de trabajo: añadir 10 ml de reactivo A a 90 ml de reactivo B. Preparar esta solución de nuevo cada día y almacenar en hielo entre cada uso.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ensayo:

[0074]

1. 50 |jL sustrato

2. 30 jl 0,2M HAc/NaOH pH 5,0

3. 20 jl muestra / enzima (microplaca no diluida; fermentador >20 x diluido)

4. Incubar a 37 °C durante 10 minutos

5. 25 jl mezcla de ensayo + 125 jl reactivo de trabajo (en microplaca de RCP) o 50 jl mezcla de ensayo + 250 jl reactivo de trabajo (en tubo de 1,5 ml)

6. Calentar a 99 °C durante 5 minutos en termociclador de RCP (microplaca de RCP) o en agua hirviendo (tubo de 1,5 ml).

7. Transferir 100 jl a microplaca NUNC y medir la extinción a 410 nm

Ejemplo 20: Generación de mezclas de enzimas artificiales para sacarificación de biomasa vegetal eficiente.

[0075] Se creó una mezcla de enzimas artificial mediante la mezcla de proteína cruda de C1 UV18-25Aalp1 con

proteína cruda de cepas blancas que expresan C1-p-glucosidasa Bgl1, C1-arabinofuranosidasa Abf3 y Abn7, C1- xilanasa Xyl2 y C1-p-xilosidasa Bxl1, siendo W1L#100.LAalp1Apyr5[Bgl1/pyr5], W1L#100.LAalp1Achi1Apyr5[Abf3/pyr5], W1L#100.LAalp1Achi1Apyr5[Abn7/pyr5],

W1L#100.LAalp1Apyr5[Xyl2/pyr5] y W1L#100.LAalp1Achi1[Bxl1/AmdS], respectivamente. La proporción de los distintos componentes en una base de proteínas era 10 (UV18-25Aalp1): 1 (proteínas de cepa blanca).

[0076] La eficacia de sacarificación de la proteína cruda de UV18-25Aalp1 sola se evaluó en sustrato de salvado de trigo y se comparó con la eficacia de la mezcla artificial. Se utilizaron 10 mg de proteína/g de materia seca de salvado de trigo. Las condiciones eran las siguientes: temperatura 50 °C, pH 5,0, tiempo 72 horas.

[0077] Se demostró que la mezcla de enzimas de UV18-25Aalp1 sola liberaba aproximadamente un 30 % de la glucosa, aproximadamente un 5 % de la xilosa y un 12 % de la arabinosa del salvado de trigo. La mezcla artificial liberó al menos un 60 % de la glucosa, un 60 % de la xilosa y un 25 % de la arabinosa del salvado de trigo.

Ejemplo 21: Construcción de genotecas en cepa C1 blanca W1L#100.1Aalp1Ach¡1Apvr5 y cribado de xilanasas.

[0078] Se construyó una genoteca de ADN genómico de cepa C1 UV18-25 en cepa C1 W1L#100.1Aalp1Achi1 Apyr5 con métodos previamente descritos en Verdoes et al. (2007). Se cribó la biblioteca con respecto a la actividad de xilanasa, tal y como se describe en el ejemplo 4 del capítulo 4, lo que produjo diversos clones positivos que expresaban distintas xilanasas. El análisis SDS-PAGE reveló la presencia de bandas de proteína adicionales en los clones positivos. El análisis por RCP mediante la utilización de distintas combinaciones de cebador a partir de la secuencia de las xilanasas C1 conocidas y la secuencia de vector reveló la presencia de 3 C1-xilanasas distintas. Este resultado se confirmó mediante análisis de Southern.

Apéndice 1 de los ejemplos: Procedimiento de mutación UV para cepas C1

[0079]

1. Extender cepa madre en placas con PDA (agar de dextrosa de patata) e incubar a 35 °C durante 14 días para obtener esporas.

2. Limpiar las esporas en 0,9 % de solución salina y filtrar a través de algodón para eliminar los micelios. Diluir la suspensión de esporas resultante a 1x106 esporas/ml mediante la utilización de solución salina. Obtener una pequeña alícuota de suspensión de esporas, diluir en solución salina y extender la placa a PDA para determinar el recuento de esporas viable inicial.

3. Añadir 10 ml de suspensión de esporas a una placa de Petri de vidrio esterilizado que contiene un clip y remover en una placa de agitación magnética. Quitar la tapa de vidrio e irradiar con luz ultravioleta para obtener un 90-99,9 % de muerte. Utilizar una lámpara Pen-Ray como fuente de luz ultravioleta (254 nm) y calentarla durante al menos 10 minutos antes de irradiar la suspensión de esporas.

4. Extender la placa en placas de ASC selectivas (apéndice 2 de los ejemplos) con las luces de la estancia apagadas, mediante la utilización de un volumen para obtener menos de 30 colonias en cada placa.

5. Invertir las placas, colocar en bolsas de plástico rojas e incubar a 30 °C durante 6-7 días para su cultivo y para permitir que se desarrollen zonas claras.

6. Determinar % de muerte para la mutación como diferencia entre el recuento de placas viable inicial y un recuento de placas en PDA después de la irradiación UV.

Apéndice 2 de los ejemplos: Medios

Placas de agar de ASC selectivas

Componente: Cantidad

Agua desionizada: 800 ml

K2HPO4: 1,0 g

KCl: 0,1 g

NaCl: 0,1 g

MgSO4-7H2O: 0,3 g

FeCla-6H2O: 0,016 g

(NH4)2SO4: 1,9 g

20 g/l ASC: 200 ml

Agar noble: 15 g

[0081] Ajustar el pH a 7,5 con HCl y esterilizar 30 minutos a 121 °C. Después de la esterilización, añadir 20 ml de 25 g/l de DOC (ácido deoxicólico) filtrado estérilmente. Verter aproximadamente 20 ml/placa. Extender esporas 5 mutadas por UV en placas de ASC e incubar durante 7-14 días para dar lugar al crecimiento de colonias y al aclarado de celulosa.

Medio RM-ASP

Componente: Cantidad

Peptona Bacto: 2 g

Extracto de levadura Bacto: 1 g

50x AspA (+N): 20 mL

Glucosa: 10 g

1000X oligoelementos: 1 mL

MgSO4-7 H2O: 0,493 g

Agua: Obtener un volumen total de 1 L.

[0082] Ajustar el pH a 6,5 antes de la desinfección en autoclave. Esterilizar la glucosa por separado como 50 % de solución.

50x AspA (+N)

Componente: Cantidad

NaNOa (o (NH4)2SO4): 300 (o 233) g

KCl: 26 g

KH2PO4: 76 g

KOH 10 N: 22,5 mL

50x AspA (+N)

Componente: Cantidad

Agua: Obtener un volumen total de 1 L.

1000x oligoelementos

Componente: Cantidad

ZnSO4-7H2O: 2,2 g

H3BO4: 1,1 g

MnSO4-H2O: 0,427 g

FeSO4-7H2O: 0,5 g

COCl2-6H2O: 0,17 g

CuSO4-5H2O: 0,16 g

Na2MoO4-2H2O: 0,15 g

EDTA: 5 g

Agua: Obtener un volumen total de 100 mL.

Medios de celulosa de baja y alta densidad

Componente (g/L): Medio de celulosa de baja densidad (#1) Medio de celulosa de alta densidad (#2)

BisTris: 15,7 15,7

K2HPO4: 0,22 0,66

KH2PO4: 0,08 0,24

(NH4)2SO4: 4 12

Na3CitratoH2O: 4 12

MgS04-7H2O: 0,03 0,09

CaCl2: 0,4 0,8

Extracto de levadura: 0,05 0,15

Pharmamedia: 5 15

LactosaH2O: 5 15

Celulosa: 20 80

Ajustar el pH a 7,0.

secuencia de chil: véase el documento WO 2009/018537.

5 Secuencia de ADN de pep4 (SEQ ID No 19):

Claims

REIVINDICACIONES

1. Cepa huésped fúngica de Myceliophthora thermophila, designada originalmente como Chrysosporium lucknowense, que es W1L depositada en el CBS con el número de acceso 122189 o W1L#100.1 depositada en el CBS con el número de acceso 122190.

5 2. Cepa de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada además por que el gen codificador de la

endoquitinasa 1 (chil) se ha alterado.
3. Cepa de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizada además por que uno o varios genes seleccionados del grupo que consiste en aquellos que codifican la proteasa alcalina 1 (alpl), la proteasa alcalina 2 (alp2), la proteinasa A (pep4), la glucoamilasa (Gla1), la exoquitinasa (Chi2) y la laminarinasa

10 (Lam1) se han alterado.
4. Cepa de acuerdo con la reivindicación 3, que es W1L#100.1Aalp1Apyr5 o W1L#100.1Aalp1Achi1Apyr5.
5. Método para la producción homóloga y/o heteróloga de una proteína pura con una pureza superior a un 75 %, que comprende la expresión de un gen codificador de dicha proteína en la cepa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

15 6. Método para la producción de mezclas de proteínas artificiales que comprende la expresión de genes

codificadores de cada una de dichas proteínas en una cepa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Método para el cribado simplificado de cepas que expresan funcionalmente una enzima deseada mediante la aplicación de cepas tal y como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

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Fig. 1

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Fig.3

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Fig.4

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Fig. 6

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Fig.7

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Fig.8

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