NO316388B1 - Rekombinant DNA-molekyl fra Aspergillus niger, og en ekspresjonskassett ogen hybridvektor inneholdende denne - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører genetisk engineering og tilveiebringer nye

rekombinante DNA-molekyler omfattende DNA-sekvenser kodende for proteiner med galakturonase- eller polygalakturonaseaktivitet og/eller promoter, signal og/elter transkripsjonene terminatorsekvenser naturlig bundet dertil De nye DNA-molekyler er nyttige for konstruksjon av ekspresjonskassetter og hybndvektorer for produksjon av polygalakturonaser eller ekspresjon av fremmede gener i filamentøse sopp

Til tross for at det innen genetisk engineenngstekmkker eksisterer mange polypeptidekspresjonssystemer for prokaryote og eukaryote verter er det nødvendig med nye systemer som har fordeler i forhold til tidligere systemer

Meget anvendte verter er prokaryote Eschenchia coli og eukaryote gjærorganismer, f eks Saccharomyces cerevisiae, der et stort antall forskjellige ekspresjonshybndvektorer, for det meste plasmider, er blitt utviklet Ulempen med E coli-verter er at de ikke kan glykosylere polypeptider og at intracellulær ekspresjon av fremmede peptider fører til akkumulasjon innenfor vertscellen og forhindring av ytterligere vekst Gjærorgamsmene glykosylerer,

men som E coli så utskiller de ikke polypeptidene, unntatt av små, i nænngsmediet, men inn i penplasmaområdet Høyere eukaryote verter såsom pattedyrcancerceller kan glykosylere og utskille i nænngsmediet, men dyrking av slike er langsom og kostbar og faren for at onkogene nukleinsyrer kan bli isolert sammen med ønskede peptidet eksisterer

I søken etter andre verter er filamentøse sopp, såsom Neurospora crassa, Aspergillus

nidulans og Aspergillus niger også blitt undersøkt Anvendelse derav ved genetisk engineenngs-teknikker har gått langsomt på grunn av mangel på et hensiktsmessig transformasjonssystem I kontrast til Saccharomyces cerevisiae inneholder filamentøs sopp ikke plasmider som kan bh anvendt for innføring av fremmede gener og fenotypisk seleksjon Det er derimot mulig å transformere filamentøse sopp med fremmede plasmider inneholdende et selekterbart markørgen De fleste vektorer som er blitt beskrevet inntil nå

for filamentøse sopp rephkerer ikke autonomt, som de til gjær, men blir integrert inn i soppkromosomet Denne hendelsen skjer vanligvis ved en lavere frekvens Integrerende transformasjon gjør transformantene mitotisk meget stabile, selv under ikke-selektive tilstander Stabil integrasjon av mer enn 100 kopier er blitt rapportert

Første vektor for filamentøs sopp som er blitt beskrevet inneholdt qa-2-genet til

Neurospora crassa som selekterbar markør (Case, M E, Schweizer, M , Kushner, S R og Giles,NH (1979) Proe Nati Acad Sei USA 76, 5259-5263, Case, M E (1982) i Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollander, A, DeMoss, D, Kaplan, S,

Komsky, J, Savage, D, og Wolfe, R S , eds), s 87-100, Plenum)

I Aspergillus mdulans som har en seksuell syklus og som derfor kan bh utsatt for klassisk genetiske manipulasjoner er både negative og positive seleksjonssysterner blitt beskrevet (Ballance et al BBRC 112,284,1983, Tilburn et al Gene 26, 205, 1983, Yelton et al PNAS81,1470,1984, Yelton og Timberlake J Cell Biochem Suppl 9C, 1985, Johnstone et al EMBO J 4,1307, 1983, Tilburn et al Gene 26,205,1983, Wernars et al, Curr Genet 9, 361,1985, Kelly, J M et al, EMBO J 4,475,1985)

Sammenlignet med N crassa eller A mdulans er A niger en viktigere organisme idet den blir meget anvendt til industriell produksjon av enzymer, f eks for anvendelse i matvareindustnen A niger er kjent for å utskille forskjellige hydrolytiske enzymer, f eks glukoamylase, a -amylase, pektinase, cellulase, B-glukanase, B-galaktosidase, nannginase, pentosanase, sur protease og hgnase, idet glukoamylase og pektmasekomplekset er det mest viktige

A niger har ingen kjent seksuell syklus Mutasjoner kan derfor ikke bh innført via meiotisk rekombinasjon Ved klassisk mutasjon og seleksjonsprosedyrer er betydelig stammeforbednnger for utskilling av hydrolytiske enzymer blitt oppnådd

Av genene til A niger-enzymene er bare de fra glukoamylase (Boel et al EMBO J 3, 1581,1984) og alkohol- og aldehyddehydrogenase (WO 86/06097) sammen med deres promoter og signalsekvenser blitt karakterisert og anvendt i transformasjonsekspenmenter med A mdulans og A niger

Som seleksjonsmarkører for A niger er heterologt amds-gen (Kelly og Hynes, EMBO J 4, 475, 1985), og argB-genet (Buxton et al, Gene 37, 207, 1985, EP 184 438, WO 86/06097), begge tilveiebragt fra A mdulans blitt anvendt

A niger er den mest viktige organismen for industriell produksjon av pektindegraderende enzymer, f eks polygalakturonaser, pektinlyaser eller pektinesteraser Pektiner er polygalakturonider med høy molekylvekt (20000-40000 D) bestående av a-1,4-glykosidbundete D-galakturonsyrepolymerer Noen av uronsyregruppene er forestret med metanol som kan bh splittet ved hjelp av pektinesterase Pektiner forekommer i naturen som bestanddeler av høyere planteceller, hvor de er knyttet til cellulosemolekyler hovedsakelig funnet i primært cellevev og midtre lamella Blandt de rikeste kildene til pektin er sitron og appelsinskall, som inneholder omtrent 30% av dette polysakkaridet Pektinenzymene nedbryter karbohydratpolymersubstratet enten ved hydrolyse av a-1,4-glykosidbmdingen (endo- og ekso-polygalakturonase) eller ved transeliminasjon (pektinlyaser) førende til et mettet og til et ct-4,5-umettet poly- eller ohgogalakturonid Det systematiske navnet til endo-polygalakturonase er (poly-(l,4-a-D-galakturonid)glycanhydrolase (EC 3 2 1 15) og av ekso-polygalakturonase er (poly-(l,4-a-D-galakturonid))-galakturnohydroIase (EC 3 2 1 67) Et annet relevant pektinnedbrytende galakturonaseenzym er rhamnogalakturonase som hydrolyserer bindinger mellom a-D-galakturonate og L-rhamnose

Idet pektinlyaser er spesifikke for svært forestrede pektiner, hydrolyserer polygalakturonaser lite forestrede pektiner Den kombinerte virkningen av pektinesteraser og polygalakturonaser kan også depolymensere svært forestrede pektiner

Anvendelser av polygalakturonase og enzymblandinger derav i frukt og grønnsaksprosessenng (tabell 1) er blitt utviklet fra oppnnnehge anvendelser av pektiske enzymer for behandling av bløte frukter for å forsikre høye utbytter av juice og pigmenter ved pressing og for klargjøring av råpressede juicer Tekniske enzympreparater som anvendes for disse prosessene inneholder pektinesteraser, polygalaturonaser og pektinlyaser i varierende mengder sammen med andre enzymer som arabinaser, galaktanser, xylanaser, 13-1,4-glukanaser, glykosidaserogproteaser

Sopp-pektinasepreparater inneholdende hovedsakelig endopolygalakturonase og som er fh for pektmesterase blir anvendt som oppbløtmngsenzymer for produksjon av fruktkjøttnektarer som har en bløtere konsistens og har høyere innhold av oppløselige faste stoffer, pigmenter og næringsstoffer enn produkter fremstilt ved en mekanisk-termisk prosess

Tilstedeværelse av pektinesterase kan lett overføre oppbløtningsaktiviteten til en ren polygalakturonase til celle-nedbrytningsaktivitet på grunn av den generelle depolymen-senngsaktiviteten til pektinesterase/polygalakturonasekombinasjonen

Gjennom anvendelse av pektiske og cellulolytiske enzymer kan celleveggene til fruktkjøtt bli nedbrutt til nesten fullstendig flytendegjønng Tilstedeværelse av både endo-og ekso-fl-1,4-glukanaser (cellulaser) samt pektiske enzymer er viktige (ref 31)

Polygalakturonase og enzymblandinger derav er også nyttige for flytendegjønng og forsuknng av biomasse, f eks for produksjon av fermenterbare polysakkander fra planteceller (ref 33) eller for modifisenng av pektiner (for oversikt se ref 32) Polygalakturonaser i kombinasjon med xylanaser er også nyttige i papirmasseindustnen blant annet (ref 44)

IA niger blir proteinene til pektisk kompleks ikke uttrykt kontinuerlig Under induserende betingelser ved anvendelse av pektin eller nedbrytmngsprodukter derav uttrykker A niger ovennevnte enzymer, når andre karbonkilder, så som glukose eller sukrose, er vekstbegrensende I overflatekulturer forblir pektiske enzymer assosiert med den ytre celleveggen

Både Rexovå-Benkovå og Markovic (ref 29) og Rombouts og Pilnik (ref 15) besknver et antall polygalakturonaser tilveiebragt fra Aspergillus niger og andre sopp, samt fra baktener og planter, som ble beskrevet som renset Men på grunn av at ingen strukturelle data er blitt gitt er det enda nødvendig med enkelt-polygalakturonase med høy spesifikk aktivitet De bør fortrinnsvis være rene nok for å kunne bestemme deres aminosyresekvenser

Nedenfor blir polygalakturonaser også betegnet PG

Hensikten med foreliggende oppfinnelse er rensede enkelt-PG enten fra naturlig eller

transformerte verter

Foreliggende oppfinnelse er basert på rensing og delvis strukturell bestemming av enkelt-PG, f eks PGI, II, IIIA, UIB, IV, spesielt PGI som tillater fremstilling av DNA-prober kodende for relevante deler av proteinet

En hensikt med foreliggende oppfinnelse er å screene og isolere ved hjelp av DNA-prober, DNA-sekvenser kodende for PGI, eventuelt sammen med pre- og postsekvenser derav, fra et genbibhotek til A niger En ytterligere hensikt er å identifisere ytterligere PG-gener ved hybridisering av deler av PGI-genet (betegnet pgal) med et genbibhotek fra en soppstamme, f eks A niger

Ytterligere hensikter er rekombinante DNA-molekyler kodende for polygalakturonase-genekspresjonskassetter som omfatter et strukturelt gen av en polygalakturonase, eventuelt med intronsekvenser, og/eller regulatonske sekvenser til et PG-gen, f eks promoter, signal og/eller transknpsjonelle terminatorsekvenser Ytterligere rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen er f eks hybndvektorer omfattende DNA avledet fra et PG-gen ifølge oppfinnelsen

Ytterligere hensikter er verter, spesielt filamentøse sopp, f eks Aspergillus-verter, transformert med nevnte vektorer, fremgangsmåter for fremstilling av rekombinante DNA-molekyler og transformerte verter og anvendelse av rekombinante DNA-molekyler for fremstilling av nye ekspresjonskassetter eller hybride vektorer

En hensikt med foreliggende oppfinnelse er også overproduksjon av PG, for eksempel i Aspergillus-arter, og produksjon av enkelt-PG som ikke er kontaminert med annen PG, eller av forutbestemte kunstige blandinger derav

En annen hensikt vedrører produksjon av et hvilket som helst heterologt protein der det strukturelle genet kan bh uttrykt under kontroll av foreliggende rekombinante PG DNA

Forskjellige hensikter med oppfinnelsen vil bh klarere fra følgende detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Rekombinante DNA- molekyler

Foreliggende oppfinnelse vedrører et rekombinant DNA-molekyl, kjennetegnet ved at det omfatter en DNA-sekvens utvalgt fra

a) Aspergillus niger DNA-innskuddet pGW1900,

b) en DNA-sekvens som hydbndiserer med den kodende region for det modne GPI som

omfatter et DNA-innskudd ifølge a) og som omfatter et strukturelt gen for et polypeptid

med galakturonase- eller polygalakturonaseaktivitet med de fysiokjemiske egenskaper til PGI, og eventuelt en promoter, en kodende region for en signalsekvens og/eller en transknpsjonsterminator

c) et derivat av en DNA-sekvens definert i a) eller b), som omfatter et strukturelt gen for et polypeptid med galakturonase- eller polygalakturonaseaktivitet som har de fysiokjemiske

egenskaper til PGI, og eventuelt en promoter, en kodende region for en signalsekvens og/eller en transknpsjonstermminator, eller

d) en DNA-sekvens som koder for det modne PGI eller en signalsekvens av denne og som er degenerert innenfor betydningen av den genetiske kode med hensyn på en DNA-sekvens

ifølge a), b) eller c)

Plasmidet og pGW1900 er innbefattet i E coh-stammen DH5aF'/pGW1900, deponert til Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM)

Polypeptider med polygalakturonaseaktivitet er hen også referert til som polygalakturonaser (PGs) Denne betegnelsen omfatter også fragmenter eller mutanter av naturlig forekommende polygalakturonaser som har opprettholdt enzymatisk aktivitet Betegnelsen polygalakturonase eller PG anvendt hen omfatter også andre galakturonaser som har ohgo- eller polysakkand omfattende galakturonat, f eks ohgogalakturonase som substrat, f eks ohgogalakturonase som spalter en oligogalaturonat eller rhamnogalakturonase som spalter en kopolymer av rhamnose og galakturonat, eller fragmentet eller mutanter derav som har beholdt enzymatisk aktivitet Et "lederpeptid" antas å være sekvensen av et prepro-PG som blir kuttet av i løpet av dannelsen av modent PG Et "signalpeptid" blir kuttet av i et første tnnn av "signalpeptidase" i endoplasmatisk retikulum

Et rekombinant DNA-molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter for eksempel Aspergillus niger DNA-innskudd til pGW1900

8,6 kbp lange A mger N400-innskuddet til pGW1900 (se fig 3) rekker fra BamHI-setet i kartposisjon 1 opp til BamHI-setet i omtrentlig kartposisjon 8600 angitt i figur 3 DNA-sekvensen som rekker fra omtrent kartposisjon 6280 opp til omtrent 3880 er angitt i sekvensen oppført under SEQ ID NO 1

Promoterregionen til 8,6 kbp-innskuddet rekker opp til posisjon 9101 DNA-sekvensen med SEQ JD No 1 Den kodende regionen for 31 aminosyre-lange lederpeptidet til prepro-PGI rekker fra posisjon 910 opp til posisjon 1002 Signalpeptidet blir kodet av nukleotidene 910 til 963 Den kodende regionen for modent PGI begynner i posisjon 1003 og rekker opp til 2127 Den transknpsjonelle terminatorregionen begynner i posisjon 2131

DNA-sekvenser kodende for PGI avledet fra A niger N400-innskuddet til pGW1900 hybndiserer under "homologe" betingelser med den kodende regionen til PGI-genet eller av et fragment derav avledet fra A niger N400 DNA-sekvenser som er minst delvis homologe med A niger N400 PGI-kodende regionen og koder for et protein med PG-aktivitet er medlemmer av PG-genfamilien Et medlem av PG-genfamilien som bare hybndiserer under "heterologe" betingelser kan være et annet PG-gen fra A mger N400 enn PGI eller et annet PG-gen fra en PG-produserende soppstamme forskjellig fra A niger N400 En slik soppstamme kan være avledet for eksempel fra Aspergillusart, f eks A japonicus, A oryzae, A mdulans, eller en A mger-stamme forskjellig fra N400, Tnchoderma art, Botrytis art, Sclerotima art, Fusanum art eller annen fytopatogenisk sopp samt fra gjær, for eksempel fra PG-produserende Kluyveromycesart, såsom K fragihs Et foretrukket eksempel på en slik stamme er A niger NW756 PG-genfamilien ifølge oppfinnelsen omfatter derfor genene kodende for PGI, avledet fra en Aspergillusart, dvs A niger, mest foretrukket fra stamme N400 eller NW 756, men også fra andre PG-produserende soppstammer Medlemmer av PG-genfamilien er betegnet "PG-gener"

Protemprodukter av medlemmer fra PG-genfamihen omfatter enzymer ("galakturonaser") som kan spalte oligo- eller polysakkander omfattende galaturonat, f eks ohgogalakturonase, rhamnogalakturonase eller spesielt polygalakturonase

En konvensjonell hybndisenngsprosedyre er f eks beskrevet av Benton og Davis (ref 7) Homologe og heterologe hybndisenngsbetingelser er mer presist definert nedenfor

Betegnelsen "derivat" anvendt i sammenheng med de nye DNA-sekvenser ifølge oppfinnelsen skal omfatte større denvater inneholdende flankerende sekvenser, fragmenter av nevnte DNA-sekvenser og mutanter, spesielt kunstige mutanter

Større denvater av de nye DNA-sekvensene er de som kan spaltes fra A niger-genomet og som omfatter DNA-sekvenser som hybndiserer til den kodende regionen for moden PGI bestående av Aspergillus niger DNA-innskuddet til pGW1900, som koder for et polypeptid med polygalakturonaseaktivitet, og som kan inneholde den samme eller annen promoter, signal-og/eller transknpsjonelle terminatorsekvenser som Aspergillus niger DNA-lnnskuddet til PGW1900 Slike denvater kan finnes i et genomisk bibliotek til A niger N400 eller NW756 tilveiebragt ved fragmentenng av nukleinsyrene, behandling av fragmentene med et egnet restnksjonsenzym, f eks EcoRI, BamHI eller Hindlll, ligenng inn i en egnet vetkor, f eks lambda fag eller plasmid pBR322, kloning, f eks i E coli, og utspaltmng på nytt med et egnet restnksjonsenzym

Et foretrukket eksempel for et denvat av en DNA-sekvens hybndiserende med den kodende regionen til A niger N400 PGI under "heterologe" betingelser er et innskudd eller fragment derav av en vektor valgt fra gruppen av vektorer bestående av XPG-A9, -A 10, - A43, -B4, -B35, -B36, -Cl, -C16, -C20, -C37, -D8, -DU, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, - G27, -X31 og -Y33, pGW1756 og pGW1910 Den sistnevnte omfatter det strukturelle genet pgaC kodende for A mger N400 PGC avledet fra ccPG-C20 Stammene NW756 og NW400 er derfor ikke nært beslektede og kan høre til forskjellige arter av filamentøse sopp A mger N400 PGI-strukturelle genet kan dermed spesifikt hybndisere under heterologe betingelser også med PG-genene hl andre arter Plasmid pGW1756 består av et omtrent 4000 bp langt pEMBLl 8-vektorfragment og et omtrent 5500 bp langt A niger NW756 DNA-fragment pGW1756 er deponert til DSM

Plasmid pGW1910 (figur 7) består av et omtrent 7800 bp langt innskudd avledet fra XPG-C20 og vektor pUC9 Innenfor A niger N400-innskuddet er polygalakturonasegenet pgaC beliggende DNA-sekvensen til nesten hele pgaC-genet er angitt i sekvenshsten under SEQ ID NO 4

Denvater av hybndiserende DNA-sekvenser ifølge oppfinnelsen omfatter samme promoter, signal og/eller transknpsjonell terminatorsekvens som i pGW1900, eller en annen promoter, signal og/eller transknpsjonell terminatorsekvens som kan bh avledet fra et annet gen av polygalakturonasegenfamilien Videre kan en hvilken som helst annen promoter, signal og/eller transknpsjonell terminatorsekvens bh knyttet til hybndiserende

DNA-sekvenser avhengig av verten hvor ønsket PG blir uttrykt

Mange forskjellige promotersignalsekvenser og transkri<p>sjonene termmatorer kan bh anvendt Promotere er vanligvis tilgjengelig fra 5' ikke-kodende regioner fra prokaryote, eukaryote eller virale gener, mens transknpsjonelle termmatorer er tilgjengelige fra 3'-lkke-kodende regioner Signalsekvenser kan bh tilveiebragt fra 5-kodende regionen til preproteiner som blir introdusert inn i utskillelsesveien til cellen Eksempler på promotere er angitt nedenfor

En signalsekvens i sammenheng med foreliggende oppfinnelse er en DNA-sekvens kodende for et signalpeptid eller et lederpeptid fra et prepro-PG ifølge oppfinnelsen

Flankerende sekvenser innenfor betydningen av oppfinnelsen er også DNA-fragmenter som ikke er avledet fra sekvenser som flankerer et PG-gen i genomet Slike flankerende sekvenser har regulatonske funksjoner, f eks promoterfunksjon, eller koder for et polypeptid, f eks et strukturelt gen, eller er hnkere som putter regulatonske sekvenser og strukturelle gener inn i nktig leseramme eller avstand, eller sekvenser avledet fra en vektor, f eks en fag eller et plasmid, anvendt ved konstruksjon av ekspresjonsplasmid Slike flankerende sekvenser kan gi opphav til ekspresjonskassetter eller fusjonsgener

Betegnelsen "fragment" anvendt i sammenheng med det nye DNA har til hensikt å omfatte også fragmenter fra større denvater, spesielt de som har beholdt promoter, signal, strukturell eller transknpsjonelle terminatorfunksjoner De kan strekke seg mellom to restnksjonsseter

Foretrukne DNA-fragmenter er de som inneholder en promoterregion, kodende for en leder eller et signalpeptid fra et prepro-PG, eller kodende for et polypeptid med polygalakturonaseaktivitet, eller inneholdende en transknpsjonell terminatorregion En DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen er dermed også silkes om inneholder en hvilken som helst kombinasjon av nevnte fragmenter, f eks som inneholder en promoter, og/eller en kodende region for en leder eller et signalpeptid og/eller for et PG og/eller en transknpsjonell terminator, og lignende

Et fragment omfattende en PG-promoterregion rekker inn i DNA-sekvensen før et prepro-PG strukturelt gen opp til omtrent 2000, fortnnnsvis opp til omtrent 500 til 1400 nukleotider oppstrøms En promoterregion binder RNA-polymerase samt regulatonske proteiner

Et fragment omfattende en promoterregion av PGI-genet pgal rekker, for eksempel, fra posisjon 1 opp til 909 av sekvensen med SEQ ID NO 1

Et fragment omfattende DNA-sekvensen kodende for lederpeptidet til et prepro-PG strekker seg for eksempel mellom enden av promoteren og begynnelsen av sekvensen kodende for modent protein En kodende region for et signalpeptid er kortere enn for tilsvarende lederpeptid Den begynner også ved slutten av promoteren og strekker seg til en kodende region for et signalpeptidasespaltningssete I prepro-PGI har lederpeptidet 31 aminosyrer Et DNA-fragment kodende for dette lederpeptidet strekker seg for eksempel mellom posisjonene 910 og 1002 av DNA-sekvensen med SEQ JD NO 1

Kodende regioner for signalpeptider er for eksempel beliggende på følgende DNA-fragment Baseposisjonene 911 til 9631 SEQ ID NO 1

Et fragment omfattende hele kodende regionen for moden PGI strekker seg for eksempel fra posisjon 1003 opp til posisjon 2127 av sekvensen med SEQ ID NO 1

Strukturelle gener til PGI samt til andre PG kan inneholde introner slik som mange soppgener Innbefattet innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse er imidlertid også intron-frie strukturelle gener til PG, f eks slike som ikke inneholder introner som genomisk DNA-sekvens eller også slike som kan bh tilveiebragt fra cDNA

Et fragment omfattende en transknpsjonell terminatorregion rekker for eksempel fra et stoppkodon, f eks TAA, TAG eller TG A, i enden av den kodende regionen for et PG, opp til omtrent 300 til 2000, fortnnnsvis opp til omtrent 500 til 1000 basepar i nedstrømsretmng

Et slikt fragment rekker for eksempel fra baseposisjon 2131 opp til 2495 av sekvensen med

SEQ ID NO 1

Fragmentene nevnt ovenfor kan denmot bh utvidet med naturlige 5'-flankerende sekvenser eller de kan bh forkortet ved 5' eller 3'-enden og til tross for dette beholde promoter og transknpsjonell terminatoraktivitet, eller polypeptidene som blir kodet kan beholde signalpeptid eller galakturonaseaktivitet Slike fragmenter er også innbefattet innenfor rammen av oppfinnelsen

Fragmentene nevnt ovenfor kan inneholde eller kan bh flankert av hnkere som tilveiebringer vellykket binding til andre DNA-molekyler og/eller putte DNA-fragmenter som har regulatonske funksjoner eller som koder for et polypeptid, f eks promoter og strukturelt gen, mn i nktig leseramme eller avstand

Egnede hnkere til fragmentene ovenfor har en DNA-sekvens som passer inn i restnksjonssetet til DNA som fragmentet er bundet til De kan inneholde et forutbestemt restnksjonssete

Mutanter av en DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen er f eks naturlig forekommende mutanter Oppfinnelsen omfatter også naturlige og syntetiske mutanter av den kodende

regionen for signal eller lederpeptider med en lignende eller identisk hydrofobisitetsprofil, f eks der kodonene for polare aminosyrene hisbdin (H <+>), tyrosin (Y ~) og arginin (R <+>) blir utvekslet med kodoner for andre aminosyrer som har lignende ladninger, og hydrofobe aminosyrene alanin (A), leucin (L) og treonin (T), blir erstattet av kodoner for andre hydrofobe aminosyrer For eksempel kan kodonet for positivt ladet lysm bh erstattet med et kodon for arginin og vice versa, kodonet for negativt ladet tyrosin ved et kodon for glutamat eller aspartet, og/eller kodonet for ikke-polar, hydrofob alanin med et hvilket som helst av kodonene for treonin, prohn, valin, isoleucin, leucin, metiomn eller fenylalamn og lignende

Et rekombinant DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen omfatter også DNA-sekvenser som blir dannet innenfor betydningen av den genetiske koden der et ubegrenset antall nukleotider blir erstattet med andre nukleotider uten å forandre aminosyresekvensen som de koder for Slike degenererte DNA-sekvenser kan være nyttige på grunn av deres forskjellige restnksjonsseter eller på grunn av foretrukken kodonanvendelse i en bestemt vert

Et rekombinant DNA-molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter fortnnnsvis Aspergillus niger DNA-innskudd av en hybnd vektor valgt fra gruppen av hybndvektorer bestående av pGW1800, pGW1900, pGW1756, pGW1910, *.PG-A9, XPG-A10, X?G-A43, X.PG-B4, XPG-B35, X PG-B36, A.PG-C1, AXJ-C16, XPG-C20, APG-C37, APG-D8, ytPG-Dl 1, A.PG-D12, X PG-E6, APG-E38, a.PG-F5, A.PG-G17, XPG-G27, A.PG-X31 og JJ<>>G-Y33 eller et fragment derav omfattende en promoterregion av et PG-gen, eller en kodende region for et signalpeptid, lederpeptid, prepro-PG, PG eller et fragment av PG med polygalakturonaseaktivitet, eller en transknpsjonell terminatorregion til et PG-gen Selve innskuddene er også innbefattet i foreliggende oppfinnelse

Oppfinnelsen vedrører også en ekspresjonskassett kjennetegnet ved at den omfatter et

rekombinant DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen

Betegnelsen "ekspresjonskassett" betyr en DNA-sekvens som kan uttrykke et polypeptid og som omfatter en promoter, om ønskelig en signalsekvens, videre et strukturelt gen, om ønskelig, en transknpsjonell terminator og eventuelt en transknpsjonell enhancer, nbosomalt bindingssete og/eller ytterligere regulatonske sekvenser

I en ekspresjonskassett ifølge oppfinnelsen kan PG-genavledete funksjonelle fragmenter bh kombinert med funksjonelle fragmenter avledet fra andre gener

Forskjellige promotersekvenser kan bh anvendt, avhengig av naturen til vertscellen Promotere som er sterke og på samme tid bra regulerte er de mest nyttige Sekvenser for initiering av translasjon er for eksempel Smne-Dalgarno-sekvenser Sekvenser som er nødvendige for mitienng og terminenng av transknpsjonen og for stabihsenng av mRNA er vanligvis tilgjengelig fra ikke-kodende 5'-regioner og 3'-regioner, respektivt, fra viralt eller eukaryotisk cDNA, f eks fra ekspresjonsverten

Eksempler på promotere er XPjj, XPr, E coli lac, trp, tac, gjær TRP1-, ADHI-, ADHII-, PH03-, PH05-, eller glykolytiske promotere så som promoteren til enolase, glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, 3-fosfoglyseratkinase (PGK), heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosforfruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyceratmutase, pyruvatkinase, tnsefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase og glukokinasegener, eller promotere avledet fra eukaryote vimser, f eks SV40, Rous sarcomavirus, adenovirus 2, bovint papillomavirus, papovavirus, cytomegalovirus avledete promotere eller pattedyrceller avledete promotere, f eks fra actin, collagen, myosin eller 6-globingenet De eukaryote promotere kan bli kombinert med enhancersekvenser så som gjæroppstrømsaktiverende sekvenser (UAS) eller virale eller cellulære enhancere så som cytomegalovirus IE enhancere, SV40 enhancere, lmmunglobuhngenenhancer eller andre

Enhancere er transknpsjonsstimulerende DNA-sekvenser, f eks avledet fra vimser så som Simian-virus, polyomavirus, bovint papillomavirus eller Moloney sarcomavirus, eller med genomisk oppnnnelse En enhancersekvens kan også være avledet fra ekstrakromosomalt nbosomalt DNA fra Physarum polycephalum (PCT/EP 8500278) eller den kan være oppstrøms aktivenngssete fra syrefosfatase PH05-genet (EP søkn nr 86 111 820 6), eller PH05, trp, PH05-GAPDH-hybnd (EP søkn nr 86 111 820 6), eller lignende promoter Signalsekvenser kan for eksempel være en presekvensert eller sekretonsk leder som leder sekresjon av polypeptider eller lignende En signalsekvens er for eksempel et signal eller lederpeptid av prepro-PGI, prepro-PGII eller prepro-PGC Ytterligere signalsekvenser er kjent fra litteraturen, f eks de beskrevet av von Heyne, G, Nucleic Acids Res 14,4683

(1986)

Strukturelle gener i denne sammenheng er bortsett fra de som koder PGI er også de som koder for andre PG eller denvater, spesielt fragmenter, med PG-aktivitet eller andre

Aspergillus-gener og strukturelle gener med oppnnnelse fra viruser, prokaryote celler eller eukaryote celler og som kan være avledet fra genomisk DNA eller fra cDNA preparert via mRNA-veien eller kan bh fremstilt kjemisk, kodende for forskjellige nyttige polypeptider, inkludert glykosylerte polypeptider, spesielt fra høyere eukaryoter, spesielt pattedyr, så som de med oppnnnelse fra dyr eller spesielt mennesker, så som enzymer som for eksempel kan bh anvendt for produksjon av nænngsstoffer og for utførelse av enzymatiske reaksjoner i kjemi eller polypeptider, so er nyttige og verdifulle for behandling av mennesker og dyresykdommer eller for forhindring derav, for eksempel hormoner, polypeptider med immunmodulatonsk, anti-viral og anti-tumoregenskaper, antistoffer, virale antigener, vaksiner, koagulasjonsfaktorer, matvarer og lignende

Eksempler på slike strukturelle gener er f eks de som koder for hormoner så som sekretin, tymosin, relaksin, kalsitonin, luteiniserende hormon, paratyroidhormon, adrenokortikotropin, melanocyt-stimulerende hormon, B-hpotropin, urogastron eller insulin, vekstfaktorer, så som epidermal vekstfaktor, lnsuhn-hgnende vekstfaktor (IGF), f eks IGF-I og IGF-II, mastcellevekstfaktor, nervevekstfaktor, gha avledet nerve-cellevekstfaktor, eller transformerende vekstfaktor (TGF) så som TGFfl, veksthormoner, så som humane eller bovine veksthormoner, interleukin, så som interleukm-1 eller -2, human makrofagmigrerende inhibitonsk faktor (MIF), mterferoner, så som human ct-interferon, for eksempel interferon- aA, ctB, ctD eller aF, 13-interferon, y-interferon eller et hybndinterferon, for eksempel et aA- aD- eller et aB- aD-hybndinterferon, spesielt hybndrnterferon BDBB, proteinaseinhibitorer så som ai-antitrypsin, SLPI og lignende, hepatittvirusantigener så som hepatitt B-virus overflate eller kjerneantigen eller hepatitt A virusantigen, eller hepatitt ikkeA-ikkeB antigen, plasminogenaktivatorer, så som vevsplasminogenaktivator eller urokinase, svulstnekrosefaktor, somatostatin, remn, B-endorfin, lmmunoglobuliner, såsom lett og/eller tungkjeder av immunoglobulin D, E eller G, eller humane-musehybndimmunoglobuliner, lmmunoglobuhnbindingsfaktorer, så som immunoglobulin E bindingsfaktor, kalsitonin, humant kalsitonin-relatert peptid, blodkoagulerende faktorer, så som faktor ] X eller VIIIc, erytropoietin, eghn, så som eglm C, hirudin, desulfatohirudin, så som desulfatohirudinvanant HVI, HV2 eller PA, human superoksiddismutase, viral tymidinkmase, 13-laktamase, glukoseisomerase Foretrukne gener er de som koder for et humant _-interferon eller hybndinterferon, spesielt hybndinterferon BDBB, human vevsplasminogenaktivator (t-PA), hepatitt B* virusoverflateantigen (HBVsAg), lnsuhnhgnende vekstfaktor I og II, eghn C og desulfatohirudin, f eks variant HIVI I hybndvektorene ifølge foreliggende oppfinnelse er foreliggende promoter og/eller signalsekvens operabelt bundet til polypeptidkodende region for å forsikre effektiv ekspresjon av polypeptidet

Oppfinnelsen vedrører også en hybndvektor kjennetegnet ved at den omfatter et rekombinant DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen

De er også nyttige for kloning og/eller ekspresjon i verter, så som bakterier, sopp eller dyreceller

Slike hybndvektorer kan være avledet fra en hvilken som helst vektor som er nyttig innen området genetisk engineenng, så som fra virus, fag, kosmider, plasmider eller kromosomal DNA, så som denvater fra SV40, Herpes-viruser, Papillomaviruser, Retroviruser, Baculoviruser, fag X , f eks NM 989 eller EMBL4, eller fag Ml 3, f eks M13mp8 fag DNA (ref 15) hneransert ved BamHI-spaltning, baktenelle plasmider, f eks pBR322, pUC18, eller gjærplasmider, f eks gjær 2u plasmid, eller også kromosomalt DNA, avledet f eks fra filamentøs sopp så som Aspergillus art, f eks A niger, for eksempel de som er tilveiebragt i EP 184 438, eller et defekt virus, fag eller plasmid i nærvær av en hjelpervirus, et fag eller et plasmid som muliggjør replikasjon av nevnte defekte virus, fag eller plasmid, f eks M13(+)KS-vektor i nærvær av f eks M14K07 hjelperfag

Hybndvektorene ifølge oppfinnelsen tilveiebnnger replikasjon og eventuelt ekspresjon av en ønsket DNA i en egnet vert, enten som et ekstrakromosomalt element eller ved integrasjon i vertskromosomet Flere mulige vektorsystemer er tilgjengelige for integrasjon og ekspresjon av klonet DNA ifølge oppfinnelsen I pnnsippet er alle vektorer som rephkerer og/eller uttrykker et ønsket polypeptidgen innbefattet i en ekspresjonskassett ifølge oppfinnelsen i den valgte verten egnede Vektoren blir valgt avhengig av vertscellene som skal bh anvendt for transformasjon Generelt kan slike vertsceller være prokaryote eller eukaryote mikroorganismer så som baktener, sopp, så som gjær eller filamentøse sopp, eller celler med høyere eukaryotoppnnnelse så som vertebrater, f eks pattedyr, celler Egnede vertsceller vil bh diskutert i detalj nedenfor I pnnsippet omfatter hybndvektorene ifølge oppfinnelsen DNA som definert ovenfor, et rephkasjonsongo eller en autonomt rephkerende sekvens, dominante markørsekvenser, eventuelt ekspresjons-kontrollsekvenser essensielle for transkripsjon og translasjon av ønsket DNA og eventuelt for utskilling av ønsket produkt og eventuelt ytterligere restnksjonsseter

Et replikasjonsongo eller en autonomt rephkerende sekvens (et DNA-element som utviser autonomt rephkerende evner på ekstrakromosomale elementer) er tilveiebragt enten ved konstruksjon av vektoren for å omfatte en eksogen oppnnnelse så som avledet fra Simianvirus (SV 40) eller annen viral kilde, eller ved vertscellekromosomale mekanismer

En hybnd vektor ifølge oppfinnelsen kan inneholde selektive markører avhengig av verten som skal bh transformert, selektert og klonet Et hvilket som helst markørgen kan bh anvendt som letter seleksjon av transformanter forårsaket av fenotypisk ekspresjon av markøren Egnede markører er spesielt de som uttrykker antibiotikaresistens, f eks mot tetracykhn eller ampicilhn, eller i når det gjelder auksotrofe soppmutanter, gener med komplementvertslesjoner Tilsvarende gener utviser for eksempel resistens overfor antibiotika cycloheksimid, eller tilveiebnnger prototrofi i en auksotrof gjærmutant, for eksempel ura3, leu2, his3 eller trpl-genet Det er også mulig å anvende som markører strukturelle gener som er assosiert med et autonomt rephkerende segment forutsatt at verten som skal bh transformert er auksotroft for produktet uttrykt ved markøren

Av spesiell viktighet er markørgener som komplement A niger vertslesjoner, så som argB-genet kodende for ornitin karbomoyltransferase, f eks avledet fra A niger eller A mdulans (EP 184 438), eller A mdulans DNA-fragmenter homologe med N crassa pyr4-genet (ref 27)

Foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse er hybndvektorer omfattende en ekspresjonskassett ifølge oppfinnelsen, f eks slike som omfatter det strukturelle genet og/eller promoteren og/eller DNA-sekvensen kodende for en leder eller et signalpeptid og/eller transknpsjonell terminator avledet fra et PG-gen ifølge oppfinnelsen

Eksempler på hybndvektorer omfattende en ekspresjonskassett kan være pGW1800, pGW1900, pGW1910, pGII-IFN AM119, pGIIss-IFN AMI 19, pGW1756, A.PG-A10, X.PG-A43, *J>G-D8 og XPG-D11

Gjenstand for oppfinnelsen er ikke bare et rekombinant DNA-molekyl omfattende et PG-gen avledet innskudd definert ovenfor, men også et DNA-molekyl omfattende et PG-gen eller et funksjonelt fragment derav, f eks slike som omfatter promotere, kodende region for signalpeptid, lederpeptid eller et protein med PG-aktivitet eller transknpsjonell terminatorregion som kan bli isolert fra en PG-produserende soppstamme, for eksempel fra Aspergillus art, f eks A japomcus, A oryzae, A mdulans, A niger, Tnchoderma art, Botrytis art, Sclerotinia art, Fusanum art, eller andre fytopatogene sopp samt fra gjær, for eksempel fra PG-produserende Kluyveromyces art så som K fragilis Foretrukket er DNA-molekyler isoert fra A niger

DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen og denvater derav, inkludert fragmentene, kan bh anvendt for screening av DNA-genbibhotek eller mRNA for ytterligere lignende DNA eller mRNA

Fremgangsmåter for preparenng av rekombinante DNA-molekyler

Fremgangsmåter for fremstilling av et rekombinant DNA-molekyl definert ovenfor omfatter dyrking av en vert transformert med et slikt rekombinant DNA-molekyl eller fremstilling av det ved en in vitro syntese

Dyrking av verter blir utført i et konvensjonelt nænngsmedium som kan bh supplementert med eller tappet for kjemiske forbindelser som muliggjør negativ eller positiv seleksjon av transformantene, dvs slike verter som inneholder det ønskede DNA-molekylet sammen med en seleksjonsmarkør, fra lkke-transformanter, dvs slike verter som mangler det ønskede DNA-molekylet

Hvilke som helst transformerbare verter som er nyttige innenfor fagområdet kan bh anvendt, f eks baktener, så som E coli, sopp, så som Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, eller spesielt filamentøse sopp, så som Aspergillus, f eks A mdulans, A oryzae, A carbonatirus, A awamon og spesielt A mger En foretrukket vert er A niger An8, en mutant som mangler pyrA-genet, som beskrevet ytterligere nedenfor eller A niger N593 Transformasjon av vertene ble utført ved konvensjonelle metoder

En DNA-sekvens innbefattet i et rekombinant DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen kan bh tilveiebrakt fra genomet til en sopp som uttrykker polygalakturonase, eller kan bh preparert for eksempel ved dyrking av en vert som er transformert med et rekombinant DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen og, om nødvendig, isolenng av den ønskede DNA-sekvensen denfra, eller ved kjemisk syntese gjennom nukleotidkondensasjon Slike DNA kan spesielt bh fremstilt ved

a) isolenng av genomisk DNA fra egnede soppceller, og selektenng av ønsket DNA, f eks ved anvendelse av en DNA-probe eller ved anvendelse av et egnet ekspresjonssystem og

screening for ekspresjon av det ønskede polypeptidet, eller

b) isolenng av mRNA fra egnede soppceller, selektenng av ønsket mRNA, f eks ved hybndisenng med en DNA-probe eller ved ekspresjon i et egnet ekspresjonssystem og

screemng for ekspresjon av ønsket polypeptid, preparenng av enkelttrådet cDNA komplementært med det til mRNA, deretter dobbelttrådet cDNA denfra, eller

c) isolenng av cDNA fra et cDNA-bibhotek og selektenng av ønsket cDNA, f eks ved anvendelse av en DNA-probe eller ved anvendelse av et egnet ekspresjonssystem og

screening for ekspresjon av ønsket polypeptid, eller/og

d) lnkorporenng av dobbelttrådet DNA ifølge tnnn a), b) eller c) inn i en hensiktsmessig vektor,

e) transformenng av hensiktsmessige vertsceller med den tilveiebrakte hybndvektoren,

f) selektenng av transformerte vertsceller som inneholder ønsket DNA fra utransformerte

vertsceller og multiphsering av transformerte vertsceller, og når nødvendig

g) isolenng av ønsket DNA og/eller omdanning av DNA til en mutant eller et fragment derav

Genomisk DNA kan bh isolert og screenet for ønsket DNA (tnnn a) Genomisk DNA bhr lsolert fra egnede soppstamme-uttrykkende proteiner med PG-aktivitet Et genomisk DNA-bibhotek blir preparert denfra ved spaltning med egnede restnksjonsendonukleaser og lnkorporenng inn i egnede vektorer ifølge etablerte prosedyrer Det genomiske DNA-biblioteket blir screenet med en DNA-probe som beskrevet nedenfor, eller uttrykt i et egnet ekspresjonssystem og tilveiebragte polypeptider blir screenet på konvensjonell måte En detaljert besknvelse av isolenng av et DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen fra et genomisk bibliotek er angitt nedenfor

Polyadenylert messenger RNA (tnnn b) blir isolert fra egnede celler, ved hjelp av kjente fremgangsmåter Fremgangsmåtene for isolenng omfatter for eksempel homogenisenng i nærvær av en detergent og en nbonukleaseinhibitor, f eks hepann, guanidiniumisotiocyanat eller merkaptoetanol, ekstrahenng av mRNA med egnede kloroform-fenolblandinger, eventuelt i nærvær av salt og bufferoppløsmnger, detergenter og/eller kationgelaterende midler, og presipitenng av mRNA fra den gjenværende vandige, salt-inneholdende fasen med etanol, lsopropanol eller lignende Isolert mRNA kan bli ytterligere renset ved sentnfugenng i en cesiurnklondgradient etterfulgt av etanolpresipitasjon og/eller ved kromatografiske fremgangsmåter, f eks affinitetskromatografi, f eks kromatografi på ohgo(dT) cellulose eller en oligo (U) sepharose Slikt renset totalt mRNA blir fortrinnsvis fraksjonert ifølge størrelse ved gradientsentnfugenng, f eks i en lineær sukrosegradient, eller kromatografi på egnede størrelsesfraksjonenngskolonner, f eks på agarosegeler

Ønsket mRNA blir valgt ved screening av mRNA direkte med en DNA-probe, eller ved translasjon i egnede celler eller celle-fne systemer og screening av tilveiebragte polypeptider

Seleksjon av ønsket mRNA blir fortnnnsvis oppnådd ved anvendelse av en DNA-hybndisenngsprobe, for derved å unngå ytterligere translasjonstnnn Egnede DNA-prober er DNA med en kjent nukleotidsekvens bestående av minst 17 nukleotider, for eksempel syntetisk DNA, cDNA avledet fra mRNA kodende for ønskede polypeptider, eller genomiske DNA-fragmenter omfattende f eks ved siden av liggende DNA-sekvenser som blir isolert fra en naturlig kilde eller fra en genmodifisert mikroorganisme

Syntetiske DNA-prober blir syntetisert ifølge kjente fremgangsmåter som angitt nedenfor, fortnnnsvis ved trinnvis kondensasjon ved anvendelse av fastfase fosfotnester, fosfitttnester, eller fosforamiditmetoden, f eks kondensasjon av dmukleotidkoblingenheter ved fosfotnestermetoden Disse metodene er tilpasset syntese av blandinger av ønskede ohgonukleotider ved anvendelse av blandinger av to, tre eller fire nukleotider dA, dC, dG og /eller dT i beskyttet form eller tilsvarende dinukleotidskoblingsenheter i hensiktsmessige kondensasjonstnnn som beskrevet av Y Ike et al (Nucleic Acids Research 11,477, 1983)

For hybndisenng blir DNA-probene merket, f eks radioaktivt merket ved velkjent kinasereaksjon Hybndisenng av størrelses-fraksjonert mRNA med DNA-prober inneholdende en markør blir utført ifølge velkjente prosedyrer, dvs i buffer og saltoppløsninger inneholdende tilsetningsstoffer, f eks kalsiumchelatorer, viskositetsregulerende forbindelser, proteiner, ikke-homologt DNA og lignende, ved temperaturer som fremmer selektiv hybndisasjon, f eks mellom 0°C og 80°C, for eksempel mellom 25°C og 50°C eller rundt 65°C, fortnnnsvis ved rundt 20°C lavere enn

hybnd dobbelttrådet DNA-smeltetemperaturen

Fraksjonert mRNA kan bh translatert i celler, f eks froskeoocytter eller i cellefrie systemer, f eks i retikulocyttlysater eller hvetekimekstrakter De oppnådde polypeptidene blir screenet for enzymatisk aktivitet eller for reaksjon med antistoffer dannet mot det native polypeptidet, f eks i en immunanalyse, for eksempel radioimmunanalyse, enzym-lmmunanalyse eller immunanalyse med fluorescensmarkører Slike lmmunanalyser og preparenng av polyklonale og monoklonale antistoffer er velkjent innenfor fagområdet og blir anvendt deretter

Preparenng av et enkelttrådet komplementært DNA (cDNA) fra selektert mRNA-templat er velkjent innenfor fagområdet, så som fremstilling av et dobbelttrådet DNA fra et enkelttrådet DNA mRNA-templatet blir inkubert med en blanding av deoksynukleosidtnfosfater, eventuelt radioaktivt merkede deoksynukleotidtnfosfater (for å kunne screene resultatet av reaksjonen), en pnmersekvens så som et ohgo-dT residie hybndiserende med poly(A)-halen til mRNA og et egnet enzym så som en revers transknptase f eks fra avian myeloblastosisvirus (AMV) Etter degradering av templat mRNA f eks ved alkalisk hydrolyse blir cDNA inkubert med en blanding av deoksynukleosidtnfosfater og et egnet enzym for å tilveiebnnge et dobbelttrådet DNA Egnede enzymer omfatter blandt andre en revers transknptase, Klenowfragmentet til E coli DNA polymerase I eller T4 DNA-polymerase Vanligvis virker en hårnål-loopstruktur som blir dannet spontant ved enkelttrådet cDNA som en pnmer for syntese av den andre tråden Denne hårnålstrukturen blir fjernet ved spaltning med Sl-nuklease Alternativt blir 3'-enden til enkelttrådet DNA først utvidet ved homopolymenske deoksynukleotidhaler før hydrolyse av mRNA-templatet og påfølgende syntese av den andre cDNA-tråden

I alternativet blir dobbelttrådet cDNA isolert fra et cDNA-bibhotek og screenet for ønsket cDNA (tnnn c) cDNA-bibhoteket blir konstruert ved isolenng av mRNA fra egnede celler, og preparenng av enkelttrådet og dobbelttrådet cDNA denfra som beskrevet ovenfor Dette cDNA blir spaltet med egnede restnksjonsendonukleaser og inkorporert inn i X fag, f eks X charon 4A eller X gt 11 ifølge etablerte prosedyrer cDNA-bibhotek rephkert på nitrocellulosemembraner blir screenet ved anvendelse av en DNA-probe som beskrevet ovenfor, eller uttrykt i et egnet ekspresjonssystem og oppnådde polypeptider screenet for reaksjon med et antistoff spesifikt for de ønskede forbindelsene

Forskjellige fremgangsmåter er kjent innenfor fagområdet for lnkorporenng av dobbelttrådet cDNA eller genomisk DNA mn i en hensiktsmessig vektor (tnnn d) For eksempel kan komplementære homopolymertrakter bh tilsatt til dobbelttrådet DNA og vektor-DNA ved inkubasjon i nærvær av tilsvarende deoksynukleosidtnfosfater og et enzym så som terminal deoksynukleotidyltransferase Vektoren og dobbelttrådet DNA ble deretter koblet ved basepanng mellom komplementære homopolymere haler og til slutt ligert ved spesifikke koblingsenzymer så som hgase Andre muligheter er addisjon av syntetiske hnkere til termini av dobbelttrådet DNA eller inkorporering av dobbelttrådet DNA inn i vektoren ved butt- eller overhengende-endehgenng Hensiktsmessige vektorer blir diskutert i detalj nedenfor

Transformasjon av hensiktsmessige vertsceller med den oppnådde hybndvektoren (tnnn e) og seleksjon og multiplikasjon av transformerte vertsceller (tnnn f) er velkjent innenfor fagområdet Eksempler på slike fremgangsmåter er gitt nedenfor Hybndvektorer og vertsceller kan være spesielt egnet for produksjon av DNA, eller for produksjon av ønskede polypeptider

Isolenng av DNA ifølge oppfinnelsen blir oppnådd ved fremgangsmåter som er kjent innenfor fagområdet, f eks ekstraksjon med fenol og/eller kloroform Eventuelt kan DNA bh ytterligere manipulert f eks ved behandling med mutagene midler for å oppnå mutanter, eller ved spaltning med restnksjonsenzymer for å oppnå fragmenter, modifisering av en eller begge termini for å lette lnkorporenng mn i vektoren, fjerning av mellomliggende sekvenser og lignende

Nukleotidsekvensen til et DNA ifølge oppfinnelsen kan bh bestemt ved i seg selv kjente metoder, f eks ved Maxam-Gilbertmetoden ved anvendelse av endemerket DNA eller ved dideoksykjedeterminenngsmetoden til Sanger

PG-gensekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bh preparert ved en in vitro syntese ifølge konvensjonelle metoder In vitro-syntese er spesielt anvendbart for preparenng av mindre fragmenter av en PG-ekspresjonskassett, f eks DNA-sekvenser til et PG-gen kodende for en promoter eller et signalpeptid, for eksempel for PGI av et PG-gen innbefattet i et DNA-molekyl definert ovenfor, spesielt i Vkloner, eller en mutant derav

Egnede metoder for syntese av DNA er blitt presentert i sammensatt form av S A Narang (Tetrahedron 39, 3,1983) Kjente syntesetekmkker muliggjør preparenng av polynukleotider opp Ul 120 baser i lengde, i godt utbytte, høy renhet og i løpet av relativt kort tid Hensiktsmessig beskyttede nukleotider blir linket med hverandre ved fosfodiestermetoden (K L Agarwal et al, Angew Chemie 84,489,1972), den mer effektive fosfotnestermetoden (C B Reese, Tetrahedron 34,3143,1972), fosfitt-tnestermetoden (R L Letsinger et al, J Am Chem Soc 98,3655,1976) eller fosforamiditt-metoden (S L Beaucage og M H Carruthers, Tetrahedron 22,1859, 1981) Forenkling av syntesen av oh<g>onukleotider og polynukleotider blir gjort mulig ved fastfasemetoden, der nukleohdkjedene er bundet Ul en egnet polymer H Rink et al (Nucl Acids Research 12, 6369,1984) anvender tnnukleotider istedenfor individuelle nukleotider og binder dem ved fosfotnestermetoden i fastfase-syntesen Et polynukleotid kan dermed bh fremstilt på kort tid og med godt utbytte Det aktuelle dobbelttrådete DNA blir bygget opp enzymaUsk fra kjemisk preparerte overlappende ohgonukleotider fra begge DNA-trådene, som blir holdt sammen i riktig arrangement ved basepanng og blir deretter kjemisk bundet ved enzymet DNA-hgase En annen mulighet omfatter inkubenng av overlappende enkelte ohgonukleoUder fra to DNA-tråder i nærvær av de fire nødvendige deoksynukleosidtnfosfatene med en DNA-polymerase, f eks DNA-polymerase I, Klenowfragmentet til polymerase I eller T4 DNA-polymerase, eller med AMV (avian myeloblastosis-virus) revers transknptase De to ohgonukleotidene blir dermed holdt sammen i nktig arrangement ved basepanng og blir supplementert med nødvendige nukleotider av enzymer for å tilveiebringe et fullstendig dobbelttrådet DNA (S A Narang et al, Anal Biochem 121, 356,1982)

Nedenfor blir fremstilling av et rekombinant DNA-molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse fra et genomisk bibliotek og homologe og heterologe hybndisenngsbeUngelser for identifisenng av medlemmer av PG-genfamilien beskrevet i mer detaljert

Et genomisk bibliotek kan bh fremstilt f eks ved delvis spaltning av genomisk DNA fra en A niger-stamme, f eks NW756 eller N400, med f eks Sau3 AI eller Mbol, og kloning av DNA-fragmentene med høy molekylvekt i en egnet vertsvektor, f eks E coh-plasmid pUN121 eller en lambdavektor, f eks EMBL4

Andre soppstammer som produserer ønsket PG, for eksempel Aspergillus art, f eks A japonicus, A oryzae, A mdulans, A mger, Tnchoderma art, Botrytis art, Sclrotinia art, Fusanum art, eller andre fytopatogemske sopp så vel som gjær, for eksempel PG-produserende Kluyveromycesart så som K fragihs kan virke som kilde for genomisk bibliotek og andre egnede vektorer, f eks de som er nevnt ovenfor, kan bh anvendt som mottagere av fragmentene

For på en vellykket måte å screene det genomiske biblioteket for DNA-sekvenser kodende for PG er det nødvendig med en hybndiserende DNA-probe Dette kan være en syntetisk

DNA-probe dersom aminosyresekvensen eller del derav av ønsket PG er kjent, eller et annet PG-gen eller en del derav, som hybndiserer til et ønsket PG-gen På grunn av at hverken en PG-sekvens eller et PG-gen eller del derav var kjent før oppfinnelsen ble problemene med rensing av PG, strukturbestemming av N-terminalsekvens til et PG og preparenng av nyttige DNA-prober først løst

For rensing av foreliggende PG kan en hvilken kilde som inneholder den bh anvendt For eksempel kan råkilder så som enzymblandinger tilveiebrakt fra Aspergillus niger, så som Rapidase, en kommersielt tilgjengelig blanding av pektinolytiske enzymer, virke som kilde

Rensingen følger konvensjonelle rensmngsmetoder, så som utsalting, avsalting, represipitasjon i form av et annet salt, kromatografi, f eks affinitetskromatografi så som et kryssbundet alginat, lonebyttekromatografi, f eks på en DEAE-Sephadex eller Sepharose-kolonne, gelpermeasjonskromatografi, f eks på en Sepharyl-kolonne, elektroforese f eks med SDS-polyakrylamidgel, isoelektnsk fokusenng og lignende, eller ved hvilken som helst kombinasjon derav

PGI ifølge foreliggende oppfinnelse og PGI, PGII, PGIIIA, PGIIIB og PGIV ble isolert i en ren form fra Rapidase Nevnte PG er endopolygalakturonaser (E C 3 21 15) med følgende fysisk-kjemiske egenskaper PGI har en Mv på 55 K, et isoelektnsk punkt (IEP) på mellom 3,2 og 3,5 og et pH-optimum for enzymatisk aktivitet på 4,9 Verdiene for PGII er Mv 38K, IEP mellom 4,6 og 5,9, et pH-optimum 4,8, PGIIIA har Mv 57K, IEP 3,3 og et pH-optimum på 4,3, PGIIIB har også 57K og IEP 3,3, men pH-optimum er 4,5 PGIV har en Mv 59K, IEP 3,7 og pH-optimum 4,8 Mv-verdiene blir angitt ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese, IEP-verdiene ved tynnsjikts-isoelektnsk fokusenng N-terminal sekvensenng av PGI viste følgende sekvens

alal -ser-thr-X^-thrS-phe-thr-ser-ala^

N-terminal sekvensenng av et 21 kDa BrCN-fragment av PGI viste sekvensen ala-ser-thr-X^-thr-phe-thr-ser-ala-ser-glu,

dvs N-terminal sekvens til PGI, og sekvensenng av et 5,5 kDa BrCN-fragment viste sekvensen

ala-asp-gly-ala-val-ile-asp-gly-asp-gly-ser

Basert på aminosyresekvensen til 5,5 kDa BrCN-fragmentet til PGI ble følgende oligonukleotidblanding syntetisert

Basert på aminosyresekvensen til 17 kDa BrCN-fragmentet til PGII ble følgende to oligonukleotidblandinger syntetisert

I sekvensene til oligonukleohdene er I mosin, Ri er T eller C, R2 er A eller G og R3 er T, C eller A

Blandingene ble radioaktivt merket og anvendt for å screene et genomisk bibliotek til Aspergillus niger N400 for PGI og PGII-genene, respektivt

Identifiserte gener eller genfragmenter ble deretter sekvensert ifølge konvensjonelle fremgangsmåter Sekvensene til PGI til A niger N400 blir representert ved sekvensene med SEQ ID NO 1, angitt 1 sekvenslisten

For screening blir DNA-probene radioaktivt merket ved fremgangsmåter som er kjent innenfor fagområdet, f eks ved anvendelse av _ <32p_>ATP og T4-kinase eller _<32>p<->dATP og E coli DNA-polymerase I, avhengig av probetypen som blir anvendt Vertsmikroorganismer som inneholder nukleinsyrene ifølge foreliggende oppfinnelsen som et innskudd blir identifisert ved hybndisenng med merket DNA-probe på filterrephkaene

til genbiblioteket

Kloner som viser en hybndisenngsrespons til en eller flere DNA-prober blir isolert og amplifisert

Hybndisenngsbetingelsene som blir anvendt er konvensjonelle og kan være mer eller mindre stringente

Stnngentbetingelsene er slike hvorved bare DNA-sekvenser med en høy grad av homologi kan hybndisere ("homologe" hybndisenngsbetingelser) Under "heterologe" eller mindre stringente betingelser, kan også beslektede DNA-sekvenser med en lavere grad av homologi hybndisere Stnngentheten til hybndisenngen blir for eksempel influert av hybndisenngs-temperaturen og vasketemperaturen, formamid eller saltkonsentrasjon, G+C-innhold til DNA, lengde av hybndisenngstiden og lengden på DNA-proben Illustrerende men ikke begrensende eksempler på "homologe" og "heterologe" hybndisenngsbetingelser er gitt nedenfor i eksemplene

Ved anvendelse av en eller flere DNA-prober avledet fra PGI spesielt slike som omfatter i den minste del av de kodende regionene derav, hybndiserende kloner avledet fra et genomisk bibliotek, f eks A niger, fortnnnsvis A mger N400 eller A niger NW756, kan bh identifisert og delt inn i forskjellige klasser basert på deres grad av homologi og på grunnlag av hybndiserende restnksjonsfragmenter observert Eksempler på foretrukne kloner avledet fra et A niger N400-bibhotek er A.PG-A9, -A 10, -A43, -B4, -B35, -B36, - Cl, -C16, -C20, -C37, -D8, -Dl 1, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 og Y33 Fremstilling derav er beskrevet i detalj nedenfor i eksemplene Et eksempel på en foretrukket klon avledet fira A niger NW756 er plasmid pGWl 756

Disse klonene samt plasmidene pGW1800, pGW1803, pGW1900, pGW1902 og pGW1910 kan bh anvendt for å fremstille andre rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen, spesielt slike som inneholder fragmenter av PG-gensekvensene innbefattet hen Nevnte andre rekombinante DNA-molekyler blir preparert på konvensjonell måte ved anvendelse av konvensjonelle restnksjonsenzymer, hnkere, hgenng, amphfikasjon og isolenngsprosesser Ekspresjonsvektorene blir fortnnnsvis fremstilt som kan være pro-eller eukaryote vektorer eller skyttelvektorer for propagenng både i pro- og eukaryote celler Eksempler for konstruksjon av slike skyttelvektorer er velkjent innenfor fagområdet Ekspresjonsvektorer kan inneholde homologe eller heterologe gener Eksempler på slike gener er gitt nedenfor

Innskudd av rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen eller fragmenter derav kan bli tilveiebrakt på konvensjonell måte, f eks etter spaltning av rekombinant DNA med egnede restriksjonsenzymer og isolenng av ønskede DNA-fragmenter etter agarosegelelektroforese

Mutanter av DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen, spesielt PG-gensekvensene, inneholdende nye restnksjonsseter kan også bh preparert, f eks in vitro ved sete-rettet mutagenese, ifølge konvensjonelle fremgangsmåter (se oversiktsartikkelen til M J Zoller og M Smith, Methods Enzymol 100,468 (1983), D Botstein og D Shortle, Science 229, 1193 (1985) eller K Norns et al, Nucl Acids Res 11, 5103 (1983))

Oppfinnelsen vedrører også hybndvektorer omfattende rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen for ekspresjon av et strukturelt gen

Transformerte verter

Oppfinnelsen vedrører videre en ekspresjonskassett Transformerte vertsceller for amphfisenng av rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen eller spesielt for utvikling av en ekspresjonskassett ifølge oppfinnelsen besknves

Eksempler på egnede verter, spesielt for amphfisenng av rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen, er mikroorganismer som mangler eller har lite restnksjonsenzymer eller modifikasjonsenzymer, så som baktener, spesielt stammer av Eschenchia coli, for eksempel E cohX1776,E cohY1090,E cohW3110,E coli HB101/LM1035, E cohJA 221, E coh DH5_F, JM109, MH1 eller HB101, eller E coli K12-stamme, Bacillus subhhs, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus og andre, og gjær, for eksempel Saccharomyces cerevisiae så som S cerevisiae GRF18 Andre egnede vertsceller er celler fra høyere organismer, spesielt etablerte kontinuerlig humane eller dyrecellehnjer, f eks humane embryomske lungefibroblaster LI 32, humane mahngtmelanoma Bowes-celler, HeLa-celler, SV40-virus transformerte nyreceller fra Afrikansk grønn ape COS-7 eller kinesisk hamsterovane (CHO) celler

Eksempler på egnede verter for uttrykking av en ekspresjonskassett ifølge oppfinnelsen er cellene nevnt ovenfor og spesielt filamentøse sopp, f eks Penicillum, Cephalosponum eller fortnnnsvis Aspergillus art, f eks A carbonanus, A awamon eller fortnnnsvis A niger, A mdulans eller A oryzae

Foretrukne transformerte verter er E coli MH1 transformert med pGWl 800 eller pGW1803,E cohJM109 transformert med pGW1800 eller pGW1803,E cohDH5_F transformert med pGW1900, 1902,1756 eller 1910, pGH-IFN AMI 19 eller pGIss-IFN AMI 19, Aspergillus mger An8 eller N593 eller Aspergillus mdulans transformert med pGI-IFN AMI 19 eller pGIss-IFN AMI 19 og eventuelt med seleksjonsmarkørplasmid pCG59D7

En fremgangsmåte for fremstilling av slike transformanter omfatter behandling av en egnet vertscelle under transformerende betingelser med et rekombinant DNA-molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse, spesielt en hybndvektor ifølge oppfinnelsen eventuelt sammen med et seleksjonsmarkørgen og eventuelt selektenng av transformanter

Transformasjon av mikroorganismer blir utført ifølge konvensjonelle fremgangsmåter som beskrevet 1 litteraturen, for eksempel for S cerevisiae (A Hinnen et al, Proe Nati Acad Sei USA, 75,1929, 1978), for B subtihs (Anagnostopoulos et al, J Bactenol 81,741, 1961) og for E coh (M Mandel et al, J Mol Biol 53,159, 1970)

Transformasjonsprosedyren til E coh-celler omfatter derfor for eksempel Ca^<+ >forbehandling av cellene for å muliggjøre DNA-opptak, og inkubasjon med hybndvektor Påfølgende seleksjon av transformerte celler kan f eks bh oppnådd ved overfønng av cellene til et selektivt vekstmedium som muliggjør separasjon av transformerte celler fra foreldreceller avhengig av naturen til markørsekvensen til vektor-DNA Et vekstmedium blir fortnnnsvis anvendt som ikke muliggjør vekst av celler som ikke inneholder vektoren Transformasjon av gjær omfatter f eks hinnene med enzymatisk fjerning av gjærcellevegger ved hjelp av glukosidaser, behandling av oppnådde sferoplaster med vektoren 1 nærvær av polyetylenglykol og Ca<2+> ioner og regenerenng av celleveggen ved nedsenking av sfæroplastene 1 agar Regenerenngsagaren blir fortnnnsvis preparert på en måte som tillater regenerenng og seleksjon av transformerte celler som beskrevet ovenfor på samme tid

Transformasjon av celler av høyere eukaryot oppnnnelse, så som pattedyrcellehnjer, blir fortnnnsvis oppnådd ved transfeksjon Transfeksjon blir utført ved konvensjonelle teknikker, så som kalsiumfosfatpresipitasjon, mikroinjeksjon, proteoplastfusjon, elektroporasjon, dvs innføring av DNA ved hjelp av en kort elektnsk puls som forbigående øker permabihteten til cellemembranen, eller 1 nærvær av hjelpeforbindelser så som dietylaminoetyldekstran, dimetylsulfoksid, glycerol eller polyetylenglykol, og lignende Etter transfeksjonsprosedyren blir transfekterte celler identifisert og selektert f eks ved dyrking i et selektivt medium valgt avhengig av egenskapene til seleksjonsmarkøren, for eksempel standard kulturmedium så som Dulbecco's modifiserte Eagle-medium (DMEM), minimalt essensielt medium, RPMI1640 medium og lignende, inneholdende f eks korresponderende antibiotika

Transformerte vertsceller blir dyrket ved fremgangsmåter som er kjent innenfor fagområdet i et flytende medium inneholdende simulerbare kilder av karbon, f eks karbohydrater så som glukose eller laktose, nitrogen, f eks aminosyrer, peptider, proteiner eller degradenngsproduktene så som peptoner, ammoniumsalter eller lignende, og uorganiske salter, f eks sulfater, fosfater og/eller karbonater av natnum, kalium, magnesium og kalsium Mediet inneholder videre for eksempel vekst-fremmende forbindelser, så som sporelementer, for eksempel jern, sink, mangan og lignende

Mediet er fortnnnsvis valgt på en slik måte at det utøves et seleksjonstrykk og forhindrer vekst av celler som ikke er blitt transformert eller har mistet hybndvektoren Et antibiotikum blir derfor f eks tilsatt til mediet dersom hybndvektoren inneholder et antibiotikaresistensgen som markør Dersom en vertscelle blir anvendt som er auksotrof i en essensiell aminosyre mens hybndvektoren inneholder et gen kodende for et enzym som supplementerer defekten i verten, blir et minimalmedium som mangler nevnte aminosyre anvendt for å dyrke transformerte celler

Celler av høyere eukaryot oppnnnelse så som pattedyrceller blir dyrket under vevskulturbetingelser ved anvendelse av kommersielt tilgjengelig medier, for eksempel Dulbecco's modifiserte Eaglemedium (DMEM), minimalessensielt medium, RPMI 1640 medium og lignende som nevnt ovenfor, eventuelt tilsatt med vekstfremmende forbindelser og/eller pattedyrsera Teknikker for celledyrking og vevskulturbetingelser er velkjent innenfor fagområdet og omfatter homogen suspensjonskultur, f eks i en lufthevingsreaktor eller i en kontinuerlig rørereaktor, eller immobilisert eller innesluttet cellekultur, f eks i hule fibre, mikrokapsler, på agarosemikroperler, porøse glassperler, keramiske beholdere eller andre mikrobærere

Dyrking blir oppnådd ved prosesser som er velkjent innenfor fagområdet Dyrkingsbetingelsene, så som temperatur, pH-verdi til mediet og fermentenngstid, blir valgt slik at et maksimalt titer av polypeptidet eller denvatet ifølge oppfinnelsen blir oppnådd En E coli eller gjærstamme blir fortnnnsvis dyrket under aerobe betingelser ved nedsenking av kulturen med nsting eller omrønng ved en temperatur på omtrent 20°C til 40°C, fortnnnsvis ved omtrent 30°C, og en pH-verdi på 4 til 8, fortnnnsvis ved omtrent pH7, i omtrent 4 Ul 30 tuner, fortnnnsvis Ul maksimale utbytter av polypeptidet eller denvatet ifølge oppfinnelsen blir nådd

For å muliggjøre seleksjon av transformert fra ufransformerte celler blir DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen som bærer en seleksjonsmarkør, eller alternativt cellene kotransformert med en annen vektor inneholdende slik markør Som i andre systemer er en slik seleksjonsmarkør et uttrykkbart, strukturelt gen, der det uttrykte polypeptidet (et enzym) tilveiebnnger resistens overfor forbindelser som er toksiske for mottakerorganismen eller som fullfører enzymsystemet til en mutant som mangler et slikt essensielt polypeptid Slike markørgener som er egnede for seleksjon av transformerte filamentøse soppceller er for eksempel de kjente qa-2, pyrG, pyr4, trpC, amdS eller argB-genene

Som beskrevet i EP 278 355 ble et markørgen betegnet pyrA isolert fra det genomiske biblioteket til A niger, som er beslektet med og har lignende funksjon som pyrG til A mdulans og pyr4 til N crassa som produserer enzymorotidin 5-fosfatdekarboksylase Enzymet katalyserer dekarboksylenng av orotidin 5'-fosfat Ul undylsyre (undin 5-fosfat) og også av fluro-orotinsyre til toksisk fluro-undin En E coli klon inneholdende pyrA-genet ble identifisert ved hybndisenng med 1,1 kb HindllT fragmentet til pDJB2 (ref 25) inneholdende del av pyr4-genet DNA fra et hvilket som helst annet pyr-gen kodende for orotidin-5'-fosfatdekarboksylase kan denmot bh anvendt Fra en positiv klon betegnet E coli B75183/pCG59D7, ble plasmid pCG59D7, omfattende pyrA-genet, isolert og anvendt for kotransformasjon av en A niger pyrA~ mutant En slik pyrA~ er defekt i oroUdin 5'-fosfatdekarboksylasegenet og kan derfor ikke produsere det tilsvarende enzymet Slik mutant ble separert ved behandling av komdiosporene til A mger N756 under muterende UV-bestrålning og kolonier som overlever i nærvær av fluor-orotinsyre og undin blir selektert Kolomer som overlever i nærvær av fluor-oroUnsyre og fravær av undin blir eliminert Gjenværende undin-krevende mutanter, ifølge deres evne til å være transformerbare, hører Ul to komplementenngsgrupper pyrA og pyrB representert ved mutantene An8 og AnlO De blir behandlet i form av protoplaster derav under transformerende betingelser med pyrA inneholdende plasmid pCG59D7 Bare An8-koloniene ble funnet å bh transformert og å inneholde pyrA-genet som vist ved hybndisenngsevnen til spaltet DNA derav med DNA til pUN 121

Fremstillin<g> av <p>olypeptider

PoIypepUder ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved en fremgangsmåte kjennetegnet ved at et homologt eller heterologt strukturelt gen, for eksempel med slik betydning som angitt ovenfor, skutt inn i en ekspresjonskassett ifølge oppfinnelsen uttrykkes i en egnet transformert vert ifølge konvensjonelle fremgangsmåter Om nødvendig blir polypeptidet isolert på konvensjonell måte Avhengig av konstruksjonen av ekspresjonskassetten blir produktene enten produsert eller, dersom en signalsekvens er til stede, produsert og utskilt Vanligvis er ekspresjonskassetten innbefattet i en hybndvektor, men kan også bh integrert inn i vertsgenomet etter transformasjon

En egnet vert er for eksempel en sopp, f eks en filamentøs sopp, spesielt en Aspergillus-stamme, dersom en promoter avledet fra et PG-gen ifølge oppfinnelsen eller annen promoter avledet fra filamentøs sopp blir anvendt for uttrykking av et homologt eller heterologt strukturelt gen Dersom denmot andre promotere blir anvendt, for eksempel slik avledet fra prokaryoter eller høyere eukaryoter, er andre verter egnede, for eksempel baktener så som E coli eller høyere eukaryote celler

Promoterene til PG-genene til A niger er induserbare i A mger-cellen, dvs ekspresjon av det strukturelle genet knyttet der til, f eks det strukturelle genet kodende for et PG eller et annet fremmed gen, blir indusert ved tilsetning av pektin eller pektindegradenngsprodukter til mediet I nærvær av tilstrekkelig glukose er promoteren denmot ikke induserbar, dersom en A niger-stamme, f eks An8 eller N593 blir anvendt som vert Dette betyr at gener

under kontroll av en A niger PG-promoter blir "katabolitt-repressert" i A niger Hvis denmot en annen Aspergillus-stamme blir anvendt, fortnnnsvis A oryzae eller mest foretrukket A mdulans, blir et gen under kontroll av en A mger PG-promoter uttrykt konshtutivt, dvs også i fravær av pektin og/eller i nærvær av glukose Det kan derfor være fordelaktig å uttrykke genene under kontroll av en A niger PG-promoter i en Aspergillus-vert forskjellig fra A niger, fortnnnsvis A oryzae eller mest foretrukket A mdulans, på grunn av at for eksempel glukose istedenfor pektin kan bh tilsatt til nænngsmediet som energi og karbonkilde i løpet av ekspresjon av et ønsket gen

Dersom en promoter som ikke er avledet fra et PG-gen ifølge foreliggende oppfinnelse blir

anvendt for konstruksjon av en ekspresjonskassett ifølge oppfinnelsen, f eks omfattende et strukturelt gen kodende for et PG, kan andre verter bh anvendt som ekspresjons verter Egnede verter avhenger av promoteren som blir anvendt og er f eks baktener så som E coli, eller gjær, så som S cerevisiae eller Kluyveromyces lactis Egnede verter og promotere for fremstilling av polypeptider ifølge oppfinnelsen er også egnede for transfor-masjonen angitt ovenfor

Det er nå mulig å overuttrykke et eller flere ønskede PG, hvorved forskjellige metoder kan anvendes Et renset enkelt PG kan bh fremstilt ved å utsette en pektinolytisk enzymblanding inneholdende et PG for konvensjonelle rensningsmetoder En annen metode for produksjon av et enkelt PG, fortrinnsvis PGI, PGII eller produktet til pgaC-genet, er kjennetegnet ved at en egnet vert som ikke kan uttrykke PG eller som uttrykker PG i lav mengde eller som ikke uttrykker PG under induksjonsbetingelsene blir anvendt for det innførte PG-genet, blir transformert med en hybndvektor omfattende et strukturelt gen kodende for et PG, f eks PGI, PGII eller pgaC-genprodukt, eller et fragment av et PG med PG-aktivitet, og at nevnte strukturelle gen blir uttrykt Dersom en vert som ikke kan uttrykke PG blir anvendt kan respektive enkle PG bh oppnådd i ren form, det betyr ikke kontaminert av noen andre PG Det er også mulig å produsere forbestemte blandinger av PG, eventuelt sammen med andre enzymer, med uttrykkmg i en transformert vert ikke bare et enkelt med mer enn et ønsket PG-gen, eventuelt sammen med gener kodende for andre enzymer Forutbestemte blandinger kan også bh tilveiebrakt ved uttrykking av en eller flere ønskede gener for PG og/eller andre enzymer, f eks for pektinesteraser, pektinlyaser, cellulaser, blandede endo-glukanaser, hemicellulaser, xylanaser, arabinaser, galaktanaser, a- og J3-glykodidaser, og lignende, i en vertsstamme, eventuelt en med en viss bakgrunn i enzymproduksj on

Forutbestemte blandinger av enzymer kan også bh oppnådd ved avbryting av bestemte PG-gener i verten ved "gen-avbrytmg" som er en teknologi som er velkjent innenfor fagområdet, ved anvendelse av isolerte PG-gener ifølge oppfinnelsen

En vert som ikke kan uttrykke PG er enten en mikroorganisme som ikke har et tilsvarende gen, f eks PG" Aspergillus-stamme, en annen PG"lkke-Aspergillussopp eller en hvilken som helst annen PG" eukaryot eller prokaryot celle, eller en Aspergillus-stamme, f eks A oryzae eller A mdulans, der ekspresjon av endogene PG-gener er undertrykt i et hensiktsmessig kondisjonert vekstmedium, f eks er "katabohtt hemmet" og/eller ikke indusert, mens den eksogene PG-promoteren operabelt bundet med det ønskede PG-strukturelle genet, f eks en A niger-avledet promoter, er aktivert under disse betingelsene eller der PG-genet er kondensert til en annen promoter

Andre promotere og stammer som er egnet for fremstilling av PG er samme som angitt ovenfor i besknvelsen av ekspresjonskassettene

Polypeptider og sammensetninger

Enkelt PG renset fra en pektinolytisk enzymblanding, fortnnnsvis fra en Aspergillus niger-avledet pektinolytisk enzymblanding, spesielt fra Rapidase, og PG kodet av en DNA-sekvens ifølge foreliggende oppfinnelse og denvater derav med PG-aktivitet, spesielt dersom produsert i en egnet vert transformert med en ekspresjonshybndvektor kodende for slik PG eller derivat derav med PG-aktivitet, og fysiologisk akseptable salter derav er også gjenstand for foreliggende oppfinnelse Spesielt foretrukket er PGI av Aspergillus mger, i renset form

Videre kan det frembringes enzymatiske sammensetninger omfattende en eller flere av et slikt enkelt PG og/eller et derivat derav med PG-aktivitet og/eller biologisk akseptable salter derav eventuelt i en forutbestemt kombinasjon med en eller flere egnede enzymer som har annen enn PG-aktivitet

Enzymer som har andre enn PG-aktivitet egnet for fremstilling av nevnte enzymatiske sammensetninger er degraderende og modifiserende plantecelleveggpolymerer Slike enzymer er f eks pektinesteraser, pektinlyaser, cellulaser, blandede endo-glukanaser, hemicellulaser, xylanaser, arabinaser, galaktanaser, a- og B-glykodidaser og lignende

Enkle PG ifølge oppfinnelsen og/eller denvater derav med PG-aktivitet eller enzymatiske sammensetninger som omfatter slik PG eller denvat er nyttig f eks for klargjønng av grønnsaks-og fruktjuice, for fremming av juice-utbyttet i grønnsaks- eller fruktjuiceproduksjon og presseutbyttet til olje-inneholdende frø eller frukter, for stabihsenng av grønnsaks- eller fruktjuice, for reduksjon av viskositeten til grønnsaksjuice eller fruktjuice, for flytendegjønng av biomasse, for oppmaling, for forsterking av naturlige produktekstraksjoner som naturlige pigmenter, aromaer, smak, for valonsasjon av biomasse, mat eller tilførsler, for åforbedre utbyttet av cellulosefibre i papirmassedannelse og lignende

De mest foretrukne utførelsesformene ifølge oppfinnelsen er de som er beskrevet nedenfor i eksemplene

Kort besknvelse av figurene

Figur 1 Delvis restnksjonskart av EcoRI-fragmentene til fagene X D og XE

tilveiebragt fra et genomisk bibliotek fra A niger ved hybndisenng med kombinerte DNA-prober HR6195 og HR6196 kodende for del av PGH-genet Tallene angir omtrent avstand i kbp fra EcoRI-setene på høyre hånd

Figur 2 Delvis restnksjonskart til pGWl 800 Plasmidet inneholder DNA fra vektor pEMBL18 og 4,1 Kbp Xbal-EcoRI-innskuddet tilveiebrakt fra fag XE som omfatter A niger N400 PGII-genet Aper ampicillinresistensgenet og pilene angir A mger avledet DNA

Figur 3 Delvis restnksjonskart til pGW1900 Det består av pUC9-vektor og et

8,6 kbp BamHI-fragment fra fag PGI- XI

Figur 4 Kloningsstrategi til plasmidene pGII-IFN AMI 19 og pGIIss-JJN

AM119

Figur 5 Tnnnvis preparenng av DNA-innskuddene DNA5 og DNA6 for konstruksjon av pGII-EFN AMI 19 og pGIIss-IFN AMI 19, med polymerase kjedereaksjon (PCR) metoden Figur 6 Delvis restnksjonskart til pGW1756 pGW1756 er 5,5 kbp Xhol-Bglll-fragmentet som inneholder A niger NW756 polygalakturonase II-gemnnskuddet i vektor pEMBL18 Restnksjonssetene i vektoren er ikke vist Tidligere Xhol og Bglll-setene til fragmentet er også vist, men disse er blitt overbelagt ved innskudd i Sali og BamHI-setene, respektivt, av vektoren Figur 7 Delvis restnksjonskart til pGW1910 pGW1910 er 7,8 kbp Bglll-fragmentet til lambda fag XPG-C20 innskddet i BamHI-setet til vektor pUC9 Den omtrentehge beliggenheten til A niger N400-genet kodende for PGC (pgaC) genet er angitt

Følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen

Forkortelsene har følgende betydninger

Buffere, medier, reagens

Følgende stammer blir anvendt

Følgende vektorer blir anvendt

PGW613

Dette plasmidet er beskrevet av Goosen et al (ref 13)

M13mp fag

M13mpl8 og M13mpl9 vektorer (Norrander et al, ref 24) er denvater av enkelttrådet DNA baktenofag Ml3 og er angitt for å lette DNA-sekvensenng ved å muliggjøre klomng av DNA-fragmentene ved et allsidig polyhnkersete og kloning av samme restnksjonsfragment i begge mulige retninger Sekvenser klonet inn i disse vektorene kan lett bh anvendt som templater for sekvensenngsreaksjoner eller produksjon av enkelttrådete prober ved anvendelse av standard ohgodeoksynbonukleotidpnmer og klenofragmentet til E coli DNA-polymerase I Vektor-DNA inneholder E coli lac-operonpromoteren og genetisk informasjon til de første 145 aminosyrene av B-galaktosidase Polyhnkersekvensene inneholdende multiple restnksjonsseter blir skutt inn i lacZ-sekvensen Polylinkeren beholder lacZ-leserammen og vektoren gir allehsk komplementasjon til en LacZa vertsstamme, som gir blå plaque på plater inneholdende IPTG og X-gal Rekombinante fag inneholdende innskudd som ødelegger leserammen eller på annen måte interferer med ekspresjon av lacZa-peptidet sees som fargeløse plakk

pGW635

Plasmidet er en kortere versjon av pGW613 Det inneholder også pyrA-genet Det er beskrevet av Goosen et al (ref 42)

EMBL4

EMBL4 er en lambda-erstatmngsvektor med en kloningskapasitet på 9-23 kbp (Fnschauf et al, ref 9) Den inneholder en multippel klomngsregion mellom lambda-armene og uessensiell fyllregion Dette muliggjør multiple restriksjonsenzymspaltmnger og ble utført på en måte slik at rehgenng av fyllet til vektorarmene er redusert når fremmed DNA av interesse blir skutt inn Vektoren gjør også bruk av Spi-fenotypen for å tilveiebnnge en direkte seleksjon for rekombinanter (Zissler et al, ref 21)

pEMBL 18oepEMBL19

Disse plasmidene er blitt beskrevet av Dente et al (refs 10,22,23)

Eksempel 1 Isolenng og karaktensenng av polygalakturonase

Eksempel 1 1 Rensing av polvgalakturonasene I. II. HIA. ITIB og IV

Enzymaktiviteten blir bestemt i enzymfraksjonene tilveiebragt nedenfor som beskrevet før (Rozie et al, ref 2) ved anvendelse av en modifisert femcyanidtest (Robyt et al, ref 3)

Polygalakturonasene I, II, HIA, UIB og IV er renset fra Rapidase, en kommersiell tilgjengelig blanding av pektinolytiske enzymer tilveiebragt fra Aspergillus niger (Gist-brocades, Seclin, Frankrike) 50 g av råenzympulveret (Lot-Nr K2B 078) er løst opp 1190 ml av en 20 mM natnumacetatbuffer pH 3,6, sentrifugert 110 mm ved 25 000 g for åfjeme stoffer og bli avsaltet på en Sephadex G-50 kolonne (5 x 90 cm) ekvilibrert i samme buffer

Første trinnet i rensmngsprosedyren er et affimtetslromatografitrinn som anvender kryssbundet alginat som blir fremstilt som beskrevet i Rombouts et al (ref 1) Kryssbundet alginat som har et sjiktvolum på 5,2 ml/g blir også ekvilibrert med 20 mM natnumacetatbuffer pH 3,6 (kolonnedimensjonene 2,5 x 30 cm) Avsaltet enzym satt på kolonnen og deretter vasket ved apphsenng av en 100 mM natnumacetatbuffer pH 4,2 og pH 5,6, respektivt (400 ml av hver) Idet PGI og PGII adsorberer til alginatmatnsen, mens PG HIA, mb og IV ikke gjør dette

Eksempel 1 1 1 Rensin<g> av PGI og PGII

Adsorbert PGI og PGII-proteiner fra kryssbundet algmatkolonne blir eluert ved en hneæmatnumklondgradient (0-1 M) i en 100 mM natnumacetatbuffer ved pH 5,6 som er en viss modifikasjon av prosedyren anvendt før (Rombouts et al, ref 1) PGI elueres samtidig med en annen PG, nemlig PGII ved omtrent 0,5 M NaCl

Enzym fraksjonen omfattende PGI og PGII blir dialysert mot 20 mM natnumacetatbuffer pH 5,7 og applisert på en DEAE-Sephadex A-50 kolonne (2,5 x 30 cm) ekvilibrert i samme buffer Enzymene blir eluert ved anvendelse av en lineær NaCl-gradient (0-0,6 M) PGI eluerer ved omtrent 0,3 M NaCl, PGII ved omtrent 0,2 M Enzymfraksjonene inneholdende PGI og PGII blir samlet separat, dialysert mot 20 mM bis Tns HCl-buffer pH 5,8 og kromatografert på en DEAE-Sepharose Fast Flow-kolonne ekvilibrert i samme buffer Ved påfønng av en NaCl-gradient blir PGII eluert ved omtrent 120 mM natnumklond, PGI ved omtrent 250 mM Aktive enzymfraksjoner inneholdende PGI eller PGII blir konsentrert etter dialyse mot 20 mM natnumacetatbuffer pH 5,7 til et finalt volum på 25 ml på en liten DEAE-Sepharose Fast Flow-kolonne (1,6 x 10 cm) ved eluenng med 1 M natnumklond i denne bufferen Endelig rensing av hver av de to enzymene PGI og PGII blir oppnådd ved gelpermeasjonskromatografi på Sephacryl S200 (1,6 x 90 cm) i 0,1 M

natnumacetat pH 4,2

PGII viser et enkeltband ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese og har en tilsynelatende molekylvekt på 38kDa Den spesifikke aktivitet er 2760 U/mg til proteinet bestemt i 0,075 M natnumacetatbuffer pH 4,2 Ved iso-elektnsk fokusenng viser enzymet mikroheterogemsitet Bortsett fra en tydelig hovedkomponent ved omtrent pH 5,2, er et stort antall mindre bånd observert i pH-området mellom 4,6 og 5,9

PGI viser også et enkelt bånd ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese Dette enzymet har en tilsynelatende molekylvekt på 55 kDa Den spesifikke aktivitet er 550 U/mg til proteinet bestemt i 0,075 M natnumacetatbuffer pH 4,2 Ved iso-elektnsk fokusenng viser enzymet også mikro-heterogenesitet Flere bånd er observert i pH-området pH 3,2-3,5

Eksempel 1 1 2 Rensing av PGIIIA. PGIIIB oe IV

Effluent fra kryssbundet alginatkolonne (eksempel 1 1) inneholdende ubundet PG blir justert til pH 5,7 med 1 M natnumhydroksid og bhr belastet på en DEAE-Sephadex A-50 kolonne (2,5 x 30 cm), ekvilibrert i 0,02 M natnumacetatbuffer pH 5,7 Enzymene blir eluert fra DEAE-Sephadex-kolonnen med en lineær natnumklondgradient (0-1 M) PGIV eluerer ved 0,38 M natnumklond, PGITIA, PGIIIB koeluerer ved 0,5 M 5 ml av hver av de to enzymfraksjonene blir avsaltet på en Sephacryl S-200 kolonne (1,6 x 90 cm) 10,1 M natnumacetatbuffer pH 4,2 Aktive fraksjoner blir slått sammen, fortynnet fem ganger med destillert vann og applisert på en MONO Q kolonne (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svenge) ekvilibrert inn 10,02 M bis-Tns/HCl buffer pH 5,8 Ved påfønng av en 20 ml lineær natnumklondgradient (0,1 - 0,4 M), eluerer PGIV ved 0,32 M natnumklond, mens PG IIIA og IHB koeluerer ved 0,4 M natnumklond

Begge enzymfraksjonene blir separat rekromatografert på en MONO Q kolonne under betingelsene beskrevet ovenfor Fraksjoner inneholdende PG-aktivitet blir slått sammen, dialysert mot 0,025 M piperazin/HCl buffer pH 6,0 og applisert på en MONO P kolonne (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svenge) ekvilibrert i samme buffer Kolonnen blir eluert med 10% (v/v) polybuffer 74 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svenge) pH 3,0 ved en strømnmgshastighet på 0,75 ml/min

Endelig rensning blir oppnådd ved gelgjennomtrengmngskromatografi på en TSK G 3000 SW kolonne (0,75 x 30 cm) (LKB, Bromna, Svenge) ekvilibrert i 0,05 M natnumfosfatbuffer pH 6,2 ved en strømnmgshastighet på 0,5 ml/min

Kolonnen bhr kalibrert med følgende proteinstandarder bovint serum albumin (68 kDa), eggalbumin (45 kDa) og kymotrypsinogen A (25 kDa)

En tilsynelatende molekylvekt på 53 kDa blir bestemt for PGIV ved gelpermeasjonskromatografi PGIV viser et enkelt bånd ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese og har en tilsynelatende molekylvekt på 59 kDa bestemt ved elektroforese på en 15% polyakrylamidgel Den spesifikke aktiviteten er 780 U/mg av proteinet bestemt 10,075 M natnumacetatbuffer pH 4,2 Ved iso-elektnsk fokusenng viser enzymet et enkelt skarpt bånd ved pH 3,7

Gelpermeasjonskromatografi av aktive fraksjoner inneholdende PGIIIA og IHB på den kalibrerte TSK G 3000 SW kolonnen, under de samme betingelser som beskrevet for PGIV, resulterer i separasjon av to enzymer med tilsynelatende molekylvekter på 32 og 52 kDa Ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese (15% polyakrylamidgel), viser begge enzymene et enkelt bånd med en identisk molekylvekt på 57 kDa PGIIIA og UIB har en spesifikk aktivitet på henholdsvis 150 og 250 U/mg protein, bestemt 10,075 M natnumacetatbuffer pH 4,2 Ved iso-elektnsk fokusenng viste begge enzymene et enkelt skarpt bånd ved en pH-verdi på 3,3

Eksempel 1. 2 En sammenligning av e<g>enskapene til polygalakturonaser og deres immunologiske forhold

Begynnende med 50 g Rapidase (Gist-brocades, Séchn, Franknke) blir fem endopolygalakturonaser renset som beskrevet i eksempel 1 1 Egenskapene til disse rensede enzymene er oppsummert i tabell II

Alle rensede enzymene har en tilsynelatende molekylvekt på en 15% SDS-polyakrylamidgel i et område på 55-59 kDa, med unntagelse av PGII som fremkommer å være et mye mindre protein (38 kDa) Den spesielle naturen til PGII blir forsterket ved dets relativt høye isoelektnske punkt i kontrast til de lave isoelektnske punktverdiene bestemt for andre polygalakturonaser pH-optimum til alle polygalakturonasene er i samme området (4,3-4,9)

Spesifikke antistoffer mot renset PGI blir dannet i han-New Zealand hvite kaniner ifølge immumsenngsskjemaet beskrevet av Uitzetter (ref 36)

Kryssreaktiviteten mellom de to antisera og fem rensede polygalakturonaser blir registrert som angitt nedenfor 0,4-1,0 ug renset protein blir belastet på en 10% SDS-polyakrylamidgel og etter elektroforese overført fra gelen til en mtrocellulosemembran ved anvendelse av metoden beskrevet av Bowen et al (ref 37) Inkubasjon av nitrocelluloseblottet med spesifikt antisera etterfulgt av farging med peroksidasemerket geite-anti-kanin IgG blir utført ifølge Uitzetter (ref 36) Ved inkubasjon med PGI spesifikt antiserum blir et sterkt signal funnet for PGI og PG IIIA, MB og IV PGII gir et noe svakere signal med dette antistoffet Inkubasjon av blottet med PGII spesifikt antiserum resulterer i et høyt tetthetsbånd for PGII, men bare svakere bånd for de andre fire polygalakturonasene

Eksempel 1 3 Aminosvresekvensbestemmelse av N- teimmal del av polygalakturonase I 100 ug PGI renset ifølge eksempel 111 blir dialysert tre ganger mot 11 Milhpore filtrert vann og lyofihsert Aminosyresekvensen blir bestemt som beskrevet i eksempel 1 3 Følgende N-terminale aminosyresekvens er blitt bestemt for enzymet Cysteinresidiene i proteinet er ikke blitt modifisert og er dermed ikke blitt detektert Cystein oppstår i posisjon 4 (X) i sekvensen Den N-terminale aminosyresekvensen til PGI viser homologi med amiosyresekvensen til 5 kDa cyanogcnbromidfragmcntet til PGII som er blitt isolert fra Rapidase (eksempel 1 3) og med N-terminale aminosyresekvens til PGII isolert fra A niger transformant N593/pGW 1800-27 (eksempel 6 3) Denne homologien er skissert ifølge skjemaet, der det er antatt at cystem oppstår i posisjon 4 og 3 i PGI og PGII-sekvensene

Det åpne området mellom sennresidiet i posisjon 2 og antatte cysteinresidiet i posisjon 31 polygalakturonase II sekvensen blir ført inn for å oppstille begge sekvensene

Sennresidiet i posisjon 8 i PGI-sekvensen er ikke til stede i tilsvarende posisjon i PGII-sekvensen (posisjon 7), men i sistnevnte tilfelle er en lignende aminosyretype, dvs en liten hydroksylaminosyre (threomn) til stede

N-terminale aminosyresekvenser til PGI og PGII viser dermed homologi, men er ikke identiske Forskjellene er slik at disse ikke kan være et resultat av delvis modifikasjon av et produkt til et enkelt gen, så som blant annet ved delvis proteolytisk spaltning Det konkluderes med at PGI og PGII blir kodet av forskjellige gener av samme familie

Eksempel 1 4 Aminosvresekvensbestemmelse av cvanogenbromidfragmentene til polygalakturonase I

Omtrent 100 ug PGI blir løst opp 1150 ul 70% maursyre og fast cyanogenbromid blir tilsatt for å danne fragmenter av proteinet som beskrevet i eksempel 1 3 4 metioninresidier er tilstede per enzymmolekyl Etter elektroforese på 15% SDS-polyakrylamidgeler og farging med Coomassie Bnlhant Blå, blir hovedbånd observert som har en molekylvekt på 39,5, 35,21,19,5 og 5,5 kDa

21 og 5,5 kDa-fragmentene bhr sekvensert ved anvendelse av samme utstyr og prosedyrer som beskrevet i eksempel 1 3

Sekvensen til 21 kDa-fragmentet er

Cystein oppstår sannsynligvis i posisjon 4(X) til sekvensen hk det som er blitt beskrevet i eksmplene 1,3 og 1,4 Sekvensen til 21 kDa-fragmentet er identisk med den N-terminale aminosyresekvensen til det intakte PGI-proteinet beskrevet i eksempel 1 4

5,5 kDa-fragmentet har følgende sekvens

Det kan konkluderes fra disse sekvensdata at 5,5 kDa-fragmentet ikke er korresponderende med N-terminus til proteinet

Eksempel 2 Konstruksjon av genomisk bibliotek til Aspergillus niger

Eksempel 2 1 Isolasion av høymolekvlvekt DNA fra A mger N40Q

Comdiosporer fra Aspergillus mger-stamme N400 blir inokulert i 200 ml mimmalmedium i en endelig sporetetthet på 10^ sporer/ml og rystet 111 Erlenmeyers 1241 ved 28°C ved 300 rpm ved anvendelse av en New Brunswich roterende nstemaskin Mycelium blir høstet ved filtrering ved anvendelse av en Buchner-trakt med Myracloth, vasket med kaldt sterilt saltvann, frosset i flytende nitrogen og enten lagret ved -60°C eller anvendt direkte Fremgangsmåten anvendt for isolasjon av DNA for å fremstile det genomiske biblioteket er basert på prosedyren beskrevet av Yelton et al (ref 18)

For bibhotekkonstruksjon blir 10 g mycel malt i flytende nitrogen 11 g porsjoner i en

Braun mikro-dismembrator Det malte mycelet blir overført til en 11 stenl erlenmeyer, inneholdende 200 ml ekstraksjonsbuffer (50 mM EDTA pH 8,5,0,2% SDS) og 200 ul dietylpyrokarbonat Blandingen blir sakte oppvarmet til romtemperatur og deretter oppvarmet 120 mm til 68°C med risting av og til Suspensjonen blir avkjølt til romtemperatur og sentrifugert 115 min ved 12 000 x g 1/16 volum av en 8 M kahumacetatoppløsnig pH 4,2 blir tilsatt til supematanten og blandingen blir satt på is 111 Presipitatet blir fjernet ved sentnfugenng (20 min , 16 000 x g, 4°C) Nukleinsyrene blir presipitert fra supematanten ved en inkubasjon med 0,6 volum isopropanol på is 115 mm Presipitert nukleinsyre blir samlet ved sentnfugenng (10 mm, 6000 x g, 4°C), vasket med 70% etanol og så vidt tørket Pelleten blir suspendert 110 ml TE inneholdende 20 ug/ml Rnase A, (Boehnnger, Mannheim) og inkubert 115 min ved 37°C DNA blir behandlet med nukleasefn pronase (1 mg/ml final konsentrasjon) (Kochhght, Coinbrook) 111 ved 37°C Pronasestamoppløsningen i TE-buffer inneholder 20 mg/ml enzym som blir pre-lnkubert 111 ved 37°C for å spalte nukleasene

8,5 g CsCl blir oppløst 19 ml av DNA-oppløsmngen som er tilveiebragt, 0,2 ml 10 mg/ml etidium-bromid blir tilsatt og denne oppløsningen blir enten sentnfugert i en Beckman SW41-rotor 1601 ved 33 000 rpm, eller i en Beckman 50 Ti rotor 1401 ved 45 000 rpm DNA-båndet blir samlet og etidiumbromid blir fjernet ved multippel ekstraksjon med isopropanol ekvilibrert med en mettet oppløsning av NaCl i vann 5 volum TE blir tilsatt og DNA-oppløsmngen blir sekvensielt behandlet med TE mettet fenol, fenol/kloroform/isoamylalkohol 25 24 1 og kloroform/isoamylalkohol 24 1 DNA blir presipitert ved tilsetning av 0,1 volum 3 M natnumacetat pH 5,2,2,5 volum etanol og en inkubasjon over natt ved -20°C Presipitatet bin* samlet ved sentnfugenng (1 1,30 000 x g, 4°C), vasket med 70% etanol, tørket og oppløst 1400 ul TE

Eksempel 2 2 Delvis spaltning av A niger N400 DNA med Mbol oe isolenng av fragmentene

For å undersøke Mbol-konsentrasjonen som gir den største mengden av DNA-fragmentene mellom 13,6 og 23 kbp, blir 1 ug porsjoner av A mger N400 DNA spaltet i hensiktsmessig buffer som blir anbefalt av forhandleren med reduserende mengder Mbol (0,5-0,001 U) 11 t ved 37°C i et volum på 10 ul Reaksjonen blir stoppet ved tilsetning av 1 ul 0,25 M EDTA, og prøvene blir applisert på en 0,6% agarosegel i TBE-buffer, inneholdende 1 ug/ml etidiumbromid Hensiktsmessige størrelsesmarkører er en blanding av lambda DNA og lambda DNA spaltet med BgllL som tilveiebnnger bånd på 49,22,8, 13,6,9,8,2,3, kbp og en ikke synlig fragment på 0,45 kbp Mbol-konsentrasjonen som er nødvendig for å tilveiebnnge et høyt utbytte av ønskede 13,6-23 kbp fragmenter er omtrent 0,02 U/ug DNA 200 ug DNA i et totalt volum på 2 ml blir dermed spaltet, og fordelt 120 like aliquoter rett etter tilsetning av enzymet Etter 11 ved 37°C blir spaltet materiale plassert på is Etter sjekking av en 1 ul prøve for nktig spaltmng ved kjøring på en gel, blir EDTA tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 25 mM, enzymet blir varme-inaktivert ved 65°C 110 min, prøver slått sammen og DNA presipitert, vasket, tørket og løst opp 1400 ul TE

Fragmentert DNA blir separert på en 0,4% preparativ agarosegel (midtbrønn 120 x 1,5 mm) Lambda DNA spaltet med Bglll blir anvendt som markør for å bestemme størrelsen på de delvis spaltede DNA-fragmentene ved elektroforese ved 4°C og 40 V (3 V/cm) Gelregionen inneholdende fragmentene med riktig størrelse blir kuttet ut av gelen og DNA blir elektroeluert fra gelen i et sterilt dialyserør 12 ml TBE12-31 ved 100 V Strømmen blir reversert i 30 s, og buffer inneholdende DNA blir samlet Fragmentene blir deretter konsentrert ved etanolpresipitermg og løst opp 1100 ul TE

Eksempel 2 3 Pre<p>arerin<g> av vektor DNA og kloning av høymolekvlvekt DNA-fragmenter fra A ru<g>er N400 inn i EMBL4

Det genomiske biblioteket til A niger-stamme N400 blir konstruert i lambdavektor EMBL4 Vektoren som har en klomngskapasitet på 9-23 kbp, er beskrevet av Fnschauf et al (ref 9) og Kam et al (ref 19) og er blitt kjøpt fra Promega Biotech Inc For å unngå dobbelte innskudd som har oppnnnelse fra forskjellige deler av genomet blir en minimal fragmentlengde på 13,6 kbp anvendt for kloning

10 ug lambda EMBL4 DNA blir fullstendig spaltet med 50 enheter BamHI i bufferen anbefalt av fremstilleren i et volum på 100 ul 121 ved 37°C Enzymet blir inaktivert 110 min ved 65°C NaCl-konsentrasjonen blir hevet til 150 mM og 50 enheter Sali blir tilsatt og inkubasjonen ved 37°C blir fortsatt i ytterligere 21 Etter tilsetning av EDTA til 25 mM og inaktivenng av enzymet (oppvarming 110 min ved 65°C) blir oppløsningen ekstrahert med like volum fenol (TE-mettet), fenol/kloroform/isoamylalkohol 24 24 1, og kloroform/isoamylalkohol (24 1) For å eliminere de små BamHI/Sall-polyhnkerfragmentene blir DNA presipitert med 0,6 volum isopropanol etter tilsetning av 0,1 vol 3 M natnumacetat pH 5,2 Etter 15 min på is og 15 min sentnfugenng ved 12 000 x g ved 4°C blir presipitatet vasket grundig med 70% etanol, tørket og løst opp 140 ul TE

Eksempel 2 4 Ligenng og in vitro pakkin<g> av <g>enomiske A niger N400 DNA- fragmenter Det er essensielt at cos-setene til vektoren fremstilt ifølge eksempel 2 3 blir sammensmeltet før hgenngsreaksjonen Vektoren 1100 mM Tns-HCl pH 7,5 og 10 mM MgCl2 blir oppvarmet 110 min ved 65°C og deretter sammensmeltet 111 ved 42°C Fra testhgennger blir et forhold mellom vektor og fragmenter på omtrent 1 1 (i vekt) funnet å gi meste rekombinanter Ligenngen foregikk i 50 mM Tns-HCl pH 7,5,10 mM MgCtø, 10 mM DTT og 1 mM ATP, ved anvendelse 9,5 ug vektor og 10 ug DNA-fragmenter i et totalt volum på 100 ul DNA-hgase (BRL) blir tilsatt i en konsentrasjon på 0,5 U/ug DNA og hgenngsblandingen blir inkubert over natt ved 14°C For åteste for h<g>ering blir en prøve av ligert DNA analysert på en agarosegel Også som en kontroll blir 0,5 ug av vektoren ligert uten tilsetning av fragmentene i et 5 ul volum

Det store volumet ligenngsblanding blir konsentrert ved etanolpresipitasjon og løst opp i 20 ul TE før m vitro pakking In vitro-pakkingen blir utført med Promega Packagen ekstrakter ifølge instruksjonene til forhandlerene ved anvendelse av 10 ul porsjoner for å pakke 1 ug DNA 1 ug av høymolekylvektkontrollfaglambda cI857 Sam 7, tilført med ekstraktene, blir separat pakket som en kontroll Etter pakking blir 500 ul fagoppløsningsbuffer (PSB) og 5 ul kloroform tilsatt Rekombinante fagstamløsmnger kan bh lagret ved 4°C Biblioteket som blir oppnådd blir konstruert fra to separate hgenngsekspenmenter

Eksempel 2 5 Titrenng og amplifikasion av A niger stamme N400 <g>enomisk bibliotek

E coli NM539 blir dyrket i LB-medium inneholdende 0,2% maltose, 10 mM MgS04 og 1 mM CaCl2 til en optimal tetthet (600 nm) på 1,0 0,2 ml ahquoter av denne kulturen blir tilsatt til 0,1 ml av en hensiktsmessig fagfortynmng i PSB Etter adsorpsjon av fagene 120 min ved 37°C blir 3 ml 0,6% LB topp-agar med en temperatur på 45°C tilsatt, blandingen blir sådd ut på LB-agarskåler og disse inkubert over natt ved 37°C Antall plaquedannende enheter (pfu) per ml fagsuspensjon er 12x10^ og 4,2x10^ pfu/ml for to fagstamløsmnger preparert ifølge eksempel 1 4 Etter subtrahenng av bakgrunnen som blir beregnet fra kontroll-hgennger uten fragmenter (17% og 40% respektivt) er det absolutte antallet rekombinanter 6x10^ DNA innbefattet i rekombinantene er ekvivalent til mer enn 200 av Aspergillus niger-genomene

For å amplifisere biblioteket blir 80 ul ahquoter av begge fagstamløsningene anvendt for å infisere E coli NM539-cellene som blir sådd ut på LB topp-agarose på LB-agarskåler og deretter inkubert over natt ved 37°C Fagene blir eluert fra agarosen ved forsiktig risting av platene med 5 ml PSB per plate 111 ved romtemperatur PSB blir samlet, sentrifugert (10 mm ved 6000 xg) for å fjerne baktener og kloroform blir tilsatt (0,5% final konsentrasjon) Begge fagstamløsningene, som er amplifisert omtrent i samme grad, blir deretter blandet (40 ml lager), titrert (8xl0<9> pfu/ml) og lagret ved 4°C

Eksempel 3 Screening av det <g>enomiske biblioteket til A niger for nukleinsyrer relatert til polygalakturonaser

Eksempel 3 1 Syntese av en ohgonukleotidblanding kodende for 5 5 kDa cvano<g>enbromidfragmentet til polygalakturonase I

5 5 kDa cyanogenbromidfragmentet beskrevet i eksempel 1 5 er et indre beliggende peptid som blir preparert ved CNBr-spaltmng Aminosyresekvensen derav kan dermed bh utvidet ved N-terminus med et metiomnresidie Antall ohgonukleotider som er nødvendige blir redusert ved innføring av inosin som "wobble"-base i fem forskjellige posisjoner av 32-meren som bhr syntetisert

Dette begrenser blandingen til 24 forskjellige ohgonukleotider Blandingen, betegnet HR 6298, representerer DNA kodende for følgende aminosyresekvens og har følgende sammensetning

Eksempel 3 2 32 p. mer] tmg av ohgonukleotider

Lyofiliserte ohgonukleotidblandingene HR6195, HR6196 og HR6298 blir oppløst i destillert vann i konsentrasjoner på 29 uM Prøver av disse oppløsmngene blir fortynnet 10 ganger for å danne reaksjonsblandingen Reaksjonsblandmgen består av enten 20 pmol ohgonukleotidblanding HR6195 sammen med 20 pmol HR6196 eller av 40 pmol HR6298 alene, 34 pmol [ v-32P]-ATP (NEN, 6000 Ci/mmol), og 30 enheter T4 polynukleotidkinase (BRL) i 50 ul kinasebuffer, som er 50 mM Tns-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2,5 mM DTT, 0,1 mM EDTA og 0,1 mM spermidin (Mamatis, et al, ref 6, s 122) Inkubasjonen blir utført ved 37°C 130 min Reaksjonen blir stoppet ved tilsetning av 4 ul 0,5 M EDTA (pH 8,0) Reaksjonsblandingene blir anvendt uten rensing for screening av det genomiske biblioteket (eksempel 3 4) eller probing av Southern blots (eksempel 3 6)

Eksempel 3 3 Screening av A niger N400 bibliotek

En del av det genomiske biblioteket til Aspergillus niger-stamme N400 beskrevet ovenfor (Eksempel 2) blir fortynnet i SM og 0,1 ml porsjoner som hver inneholder omtrent 2000 pfu blir sådd ut Vertsceller blir preparert ved inokulering av 50 ml LB-medium supplementert med 0,2% maltose med 0,5 ml av en over natt kultur av E coli NM539 i LB-medium, nstmg i 41 ved 250 rpm på en Gallenkamp orbital-nster ved 37PC, etterfulgt av tilsetning av 0,5 ml 1 M MgSC>4 og 0,5 ml 0,5 M CaCl2 0,2 ml ahquoter av disse cellene blir hver blandet med en 0,1 ml porsjon av fagsuspensjonen og disse blandingene blir inkubert ved romtemperatur i en halv time Deretter blir 3 ml av 0,7% agarose i LM-medium ved 47°C tilsatt, raskt blandet og øyeblikkelig sådd ut på LM-agarskåler Skålene blir inkubert over natt ved 37°C og avkjølt 121 ved 4°C

Fra hver plate blir to replikas dannet ifølge Benton og Davis plaquehybndisenngsmetode (ref 7) Det første filteret (Schleicher og Schuell BA85) blir plassert på toppen av platen i 1 min, andre replika 12 min og posisjonen til replikaene blir markert ved anvendelse av India-blekk Etter fjerning av filtrene blir de plassert i en skål inneholdende 100 ml av en denaturenngsoppløsning (1 M NaCl, 0,5 M NaOH) i 0,5 min, og deretter 11 min 1100 ml nøytraliseringsoppløsning (0,5 M Tns-HCl pH 7,5,1,5 M NaCl) Filtrene blir overført til en skål inneholdende 3xSSC, blir forsiktet skrubbet med en behansket hånd for å fjerne baktenerester og skylt med 3xSSC Filtrene blir blottet, tørket 110 min ved romtemperatur og bakt på Whatman 3 MM papir i en ovn ved 80°C 12 t

Bakte filtere blir fuktet i 3xSSC, vasket i denne oppløsningen 111 ved romtemperatur og deretter overført til en skål inneholdende 250 ml foroppvarmet (65°C) prehybndiser-mgsblanding som består av 2xSSC dersom ohgonukleotidblandingen HR6195 og HR6196 blir anvendt og lxSSC dersom ohgonukleotidblandingen HR6298 blir anvendt, videre bestående av 10x Denhardfs (0,2 % BSA, Boehnnger fraksjon V, 0,2% Ficoll 400, Pharmacia, 0,2% poIyvinylpyrrolidon-10, Sigma), 0,1% SDS og 0,1 mg/ml skåret og nylig denaturert laksesperm DNA Prehybridisenng blir utført i 5 t ved 65°C i et nstevannbad Deretter blir filtrene vasket en gang i en halv time 1250 ml forvarmet (65°C) hybndisenngsblanding, som er identisk til prehybndisenngsblandingen, med unntagelse av utelatelse av laksesperm DNA Deretter blir filtrene plassert i en annen skål inneholdende 150 ml forvarmet (65°C) hybndisenngsblanding der tidligere merkede kombinerte ohgonukleotidblandingen HR6195 og HR6196 (Eksempel 3 1) eller den merkede blandingen HR6298 er nylig blitt tilsatt

Dersom HR6195 og HR6196 blir anvendt, blir skålen plassert i et nstevannbad ved 65°C, termostaten justert til 47£>C og hybndisenngen blir utført 1161 Filtrene blir vasket en gang i 250 ml forvarmet (47°C) hybndisenngsblanding i en halv time ved 47°C, etterfulgt av vask ved romtemperatur i to skift av 250 ml 2xSSC, hver 145 min En stnngent vask blir utført ved å overføre filtrene hl en skål inneholdende 250 ml forvarmet (63°C) 6xSSC, 0,05% natnumpyrofosfat, og dertter inkubert 130 mm i et nstevannbad ved 63°C Deretter blir filtrene vasket ved romtemperatur med to skift av 2xSSC, 130 min hver Filtrene blir tørket i luft, fiksert på en bærer av Whatman 3MM-papir, dekket med plastomslag og utsatt for Kodak XAR5 film i tre dager ved -60°C, ved anvendelse av en intensiverende skjerm

På denne måten blir 6 positive signaler oppnådd fra seks screenede plater Positive plakk blir tatt ut med en stenl Pasteur-pipette ved forsiktig å plassere platene på autoradiogrammet ved anvendelse av blekkmarkører Stykkene av agar inneholdende positive plakk blir tilsatt til 1 ml SM og 2,5 ul kloroform blir tilsatt Fagene blir latt diffundere i agaren ved romtemperatur 111 med nsting av og til og deretter inkubert over natt ved 4°C Agar og baktenelt cellerester blir fjernet ved sentnfugenng i 5 min, 2,5 ul kloroform blir tilsatt og fagstamløsningene lagret ved 4°C

Positive kloner blir betegnet XC til XG og XI Disse fagene blir sådd ut ved høy tetthet, positive plakk blir renset to ganger ved utsåing av disse i lav tetthet og ved gjentagelse av den fullstendige prosedyren med rephkaplating, hybndisenng og plukking av positive plakk

Dersom ohgonukleotidblandingen HR6298 blir anvendt blir skålen plassert i nstevannbad ved 65°C, termostaten blir justert til 52°C og hybndisenngen blir utført 1141 Deretter blir filtrene vasket en gang i 250 ml forvarmet (52°C) hybndisenngsblanding i en halv tune ved 52°C etterfulgt av vask ved romtemperatur i to skift av 250 ml 2 x SSC hver 145 min Deretter blir den stnngente vaskingen utført ved å overføre filtrene til en skål inneholdende 250 ml forvarmet (64°C) 4 x SSC, 0,05% (w/v) natnumpyrofosfat og deretter inkubenng i 0,5 11 et nstevannbad ved 64°C Deretter bivr filtrene vasket ved romtemperatur med to skift av 2xSSC, 130 min hver Filtrene blir tørket i luft, fiksert på en bærer av Whatman 3MM papir, dekket med plastomslag og utsatt for Kodak XAR5-film 13 dager ved -60°C, ved anvendelse av en intensiverende skjerm

På denne måten blir ni positive signaler tilveiebrakt fra de seks screenede platene Positive plakk blir tatt ut med en stenl Pasteurpipette ved forsiktig å plassere platene på autoradiogrammet ved anvendelse av blekkmarkører Agarstykkene inneholdende positive plakk blir tilsatt til 1 ml SM og 2,5 pl kloroform blir tilsatt Fagene får diffundere i agaren ved romtemperatur 111 med vorteksing av og til og deretter inkubert over natt ved 4°C Agar og baktenecellerester blir fjernet ved sentnfugenng i 5 mm og 2,5 ul kloroform blir tilsatt og fagstamløsningene lagret ved 4°C

Positive kloner blir betegnet PG I- X1-9 Positive plakk blir videre renset ved utsåing av disse i lav tetthet ved anvendelse av 1,2 kbp BamHI/EcoRI-fragmentet til pGW1803 (se eksempel 3 8) som en heterolog probe for hybndisenng som blir utført ved 60°C, mens vaskingen blir utført i 2 x SSC, også ved 60°C

Eksempel 3 4 Isolasjon av lambda DNA

For å isolere DNA fra rekombinante kloner blir fagene først amplifisert For dette blir E coli LE392-vertsceller dyrket til en optisk tetthet (600 nm) på 1,01 LB-medium supplementert med 10 mM MgSo4 og 0,2% maltose Deretter blir 50 ul av lagrene av rensede fag separat sådd ut som beskrevet i eksempel 2,5 Etter en ovematt-inkubasjon ved 37°C blir fagene eluert fra ikke-konfluente skåler ved spredning av 5 ml SM over skålene og inkubenng i to timer med forsiktig nsting Eluerte fag blir høstet og 0,1 kloroform tilsatt Blandingen blir forsiktig blandet og cellerester fjernet ved sentnfugenng Supematantene blir isolert, kloroform tilsatt til 0,3% og det resulterende platelysatet blir lagret ved 4°C

For å oppnå nesten konfluente skåler som utgangsmatenale for isolenng av fag DNA blir 10 pl porsjoner av platelysatene sådd ut med E coli LE392 vertsceller Etter overnatt inkubasjon ved 37°C blir agarosetopplaget skrapet av fra tre nesten konfluente skåler Disse lagene blir kombinert, 20 ml SM og 0,4 ml kloroform blir tilsatt og den resulterende blandingen blir nstet ved 37°C i 30 min Cellulær debns og agarose blir fjernet ved sentnfugenng, supematanten isolert og volumet justert til 18 ml med SM Et likt volum 2 M NaCl, 20% PEG6000 (BDH, Poole, GB) i SM blir tilsatt og oppløsningene blandet og plassert på is Etter 75 min blir fagene pelletert ved sentnfugenng 120 min ved 12000 x g ved 4°C Supematanten blir dekantert og gjenværende væske fjernet med et Kleenex-ark Pelleten blir resuspendert i 3 ml SM og deretter ekstrahert med 3 ml kloroform Den vandige fasen blir behandlet med RNase A (67 ug/ml) og DNase I (33 ug/ml) i 20 min ved 37°C Deretter blir denne blandingen ekstrahert ved tilsetning av 2 ml fenol, nsting, tilsetting av 1 ml kloroform, nstsing på ny og separenng av de to fasene ved sentnfugenng Den vandige fasen blir ekstrahert ytterligere to ganger med 3 ml fenol/kloroform (1 1) og 3 ml kloroform Deretter blir DNA presipitert fra den vandige fasen ved sekvensiell tilsetning av 0,3 ml 3 M natnumacetatbuffer (pH 5,2) og 3 ml etanol Denne blandingen blir latt stå ved 4°C 1161 og deretter blir DNA isolert ved sentnfugenng (10 min, 12000 x g, 4°C) Pelleten blir løst opp 10,4 ml TE-buffer, RNase A blir tilsatt til 200 ug/ml, og inkubert ved 37°C i l t DNA blir presipitert, ved tilsetning av 38 ul 3 M natnumacetatbuffer (pH 5,2) og 0,8 ml etanol ved 4°C i 11 DNA blir isolert ved sentnfugenng og deretter løst opp i 100 pl TE-buffer

Eksempel 3 5 Restnksionsanalvse av A niger N400 PGI lambdakloner Fra de ni positive klonene, som inneholder PGI-gensekvensene, blir de fire fagene PGI-X4, X5, X6 og XI valgt for ytterligere analyse Det blir først bekreftet at fagene inneholder innskudd avledet fra samme region av A niger-genomet og deretter blir et delvis restnksjonskart av X5 dannet som beskrevet ovenfor for PGII-gensekvensen inneholdende fagene D og E DNA blir spaltet med restnksjonsenzymene (for enzymene se tabell IV) som anbefalt av enzymforhandlerene Fragmentene blir separert på en agarosegel og blottet på nitrocellulose som beskrevet ovenfor Deretter blir membranen bakt og hybndisert med et tidligere mck-translatert 1,2 Kb BamHI/EcoRI fragment av det strukturelle genet kodende for PG II Dette fragmentet er avledet fra plasmid pGW1803 som er beskrevet i eksempel 3,8 Fragmentet er isolert fra biter av en agarosegel og 50 ng av fragmentet er mck-translatert som beskrevet av Mamatis et al (s 109-112, ref 6) Før tilsetning av dette til hybndisenngsblandingen blir mck-translatert DNA denaturert 110 min i et kokende vannbad Nitrocellulosefiltrene blir hybndisert med radioaktiv probe som beskrevet i eksempel 3,8 med unntagelse av at prehybndisenngen og hybndisenngstemperaturen er 60°C Deretter blir membranene vasket ved 60°C ved anvendelse av en sene foroppvarmede buffere Først blir membranene skylt i 6 x SSC og vasket to ganger i 0,5 11 hybndisenngsbufferen Deretter blir filtrene vasket etter hverandre 14 x SSC og 2 x SSC i 30 min per buffer Disse bufrene inneholder både 0,1% SDS og 0,1% NA4P2O7XIOH2O Etter siste vask blir membranene skylt 1 0,lxSSC og deretter tørket og utsatt for røntgenfilm Den anvendte proben representerer en liten del av PGII-promoterregionen (200 bp) og en stor del av den kodende sekvensen Under hybndisenngsbetingelsene beskrevet gir denne proben sterke signaler med alle fagene isolert ovenfor (se eksempel 3 4) inneholdende PGI-gensekvenser

Fragmentlengdene blir beregnet fra fotografier og autoradiogrammer ved sammenligning med kjente markørbånd I tabell IV er hybndiserende fragmenter og deres omtrentehge størrelser angitt

Tabell IV

Omtrentehg størrelse på hybndiserende fragmenter (kbp) tilveiebragt etter spaltning av DNA isolert fra PG I X.4-7 med restnksjonsenzymene EcoRI, BamHI, Xhol og kombinasjoner av disse enzymene samt med amHI/Bglll Fra tabell IV fremgår det at alle fagene inneholder et EcoRI-fragment på 6,4 kbp og et XhoI/EcoRI-fragment på 2,0 kbp mens en EcoRI/BamHI-dobbeltspaltning også resulterer i et 6,4 kbp fragment Fagene 14, 15 og 11 har også identiske fragmenter når spaltet med BamHI (8,6 kbp) og BamHI/Bglll (7,5 kbp) Vektoren inneholder ikke BamHI-seter med unntagelse av BamHI-seter anvendt for innskudd av fragmentene fra Aspergillus DNA (Fnschauf et al, ref 9) Innskuddene til disse tre fagene blir derfor betraktet å være avledet fra samme region av A niger-genomet

For å konstruere et delvis restnksjonskart blir 15 fag DNA også spaltet med KpnL Smal, Sstl og Sali og med BamHI i kombinasjon med disse enzymene Et Bglll/XhoI-spaltning blir analysert Alle disse inkubasjonene ble også utført i 3 t ved 37°C, med unntagelse av Smal (30°C), i et volum på 20 pl inneholdende 1 ug fag DNA

Fragmenter hybndiserende med PGII-proben ved 60°C er listet i tabell V

Et restnksjonskart av PG I- X5 kan bh konstruert fra hybndisenngsfragmentene hvor det fremgår at genet kodende for polygalakturonase I er beliggende på 8,6 kbp BamHI-

fragmentet

Eksempel 3 7 Konstruksjon av pGW1900 og pGW1902 og restnksionsanalvser

8,6 kbp BamHI-restnksjonsfragmentet til fag PGI-_7 som hybndiserer med PGII kodende sekvenser (se tabell IV, eksempel 3,6) blir skutt inn i pUC9-vektoren (Vieira, J og Messing, J , 1982, Gene 19,259-268) resulterende i plasmidene pGWl900 (se figur 3) og pGW1901 som har innskuddet i motsatt onentenng Til 1,5 ug PGI-_7 DNA 15 pl TE-

buffer blir 1 pl spermidin fra en 10 mM stamoppløsning, 20 U BamHI, reaksjonsbuffer anbefalt av BRL og stenlt destillert vann tilsatt til et finalt volum på 30 pl Til spaltede prøver blir en kvart (v/v) applisenngsbuffer (apphsenngsbuffer = 0,25% bromfenol blå,

0,25% xylencyanol og 15% Ficoll 4001 H2O) Reaksjonsrfagmentene blir separert på en 0,6% agarosegel 11 x TAE-buffer inneholdende etidiumbromid (1 ug/ml) (50 x TAE

buffer = 242 g Tns, 57,1 ml eddiksyer og 100 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 per liter) DNA-fragmentene blir visualisert under UV-lys og en gelbit inneholdende 8,6 kbp BamHI-fragmentet blir isolert DNA-fragmentene blir elektroforetisk isolert ifølge konvensjonelle metoder Eluenng blir utført ved 100 V1 løpet av 11 DNA blir samlet og presipitert med 2

vol etanol Etter sentnfugenng 1 en Eppendorf sentnfuge 1 30 min blir presipitatet samlet, tørket 1 en Speedvac og løst opp 110 pl TE-buffer Vektor pUC9 (1 pg) blir hneansert ved anvendelse av 10 U BamHI 1 37°C 1 løpet av 1,5 t ved anvendelse av anbefalt BRL-buffer 1

et totalt reaksjonsvolum på 20 pl Deretter blir 1 pl CIP oppløsning (omtrent 2 U) tilsatt og blandingen inkubert 1 30 min ved 37°C Den lineanserte vektoren blir også dannet ved elektroforese Den blir løst opp 120 pl TE som tilsvarer en DNA-konsentrasjon på omtrent 50 ng/pl

I hgenngsreaksjonen blir en pl av hneansert og CIP-behandlet pUC9-vektor (50 ng) og 4

pl BamHI-fragment (omtrent 100 ng) ligert med 1,2 U T4 DNA-hgase 1 hensiksmessig hgasebuffer Det endelige reaksjonsvolumet er 10 ml Reaksjonen blir fortsatt 1141 ved 14°C og deretter blir blandingen fortynnet med TE til 50 pl

50 pl av resulterende hgenngsreaksjonsblandinger blir anvendt for å transformere E coli som beskrevet 1 BRL Ml3 klonmg/dideoksy sekvensenngsmanualen (s 30-33, ref 11)

med unntagelse av at E coli DH5aF blir dyrket til en OD55Q-verdi på 0,5 hl 0,7 før

plassering av flaskene på is Etter varmesjokk blir cellene inkubert på is 12 min og deretter blir 1 ml LB-medium tilsatt og cellene inkubert ved 37°C 111 Cellene blir pelletert ved lav sentnfugenngshashghet, 1 ml av supematanten blir fjernet og cellene forsiktig resuspendert Deretter blir cellene sådd ut på LB agarskåler inneholdende 100 pg/ml ampicilhn og hvorpå en IPTG/X-galoppløsnmg (= 200 pl H2O, 30 pl dimetylformamidinneholdende 2% X-gal og 20 pl av en 24 mg/ml IPTG-oppløsmng 1 vann) var blitt spredd Skålene ble inkubert over natt ved 37°C Flere hvite enkeltkolomer blir anvendt for å danne over natt kulturer 1 LB-medium supplementert med 0,1% glukose og 75 pg/ml ampicillin Disse kulturene blir anvendt for å isolere plasmid, ved anvendelse av miniprep-metoden til Holmes og Quigley (ref 12) Plasmidene blir spaltet med flere restriksjonsenzymer, ifølge anbefalingene til forhandleren (BRL) og 1 nærvær av RNase A (0,5 mg/ml), og produktene blir analysert på en agarosegel Plasmider som gir opphav til BamHI-fragmenter med ventet størrelse blir valgt og E coh-celler som inneholder disse blir holdt på glycerol ved -20°C De nye plasmidene pGW1900 (vist 1 figur 3) og pGW1901 inneholdende innskuddet 1 motsatt retning blir anvendt for ytterligere ekspenmenter

pGW1900 blir propagert 1 E coh-stamme DH5aF' og plasmid DNA blir isolert fra 250 ml ovematt-kulturer 1 LB-medium supplementert med 0,1% glukose og 100 pg/ml ampicillin som beskrevet av Mamatis et al (s 90-91, ref 6) og til slutt resuspendert 1 TE-buffer På grunn av at pGW1900 også blir anvendt for å transformere A niger blir det renset ved bånddannelse 1 en cesiumklondgradient Til 2,5 ml DNA-oppløsmng 1 TE blir 3,3 g CsCl og 1 ml etidiumbromid (10 mg/ml 1 vann) tilsatt Sentnfugenngen blir utført 1 en Beckman VTi 65,2 rotor ved 20°C 1161 ved 45 000 rpm Av de to fluorescens-båndene synlig under UV-lys blir den nederste inneholdende kovalenthg lukket sirkulært plasmid DNA isolert ved sidepunktenng av røret DNA-oppløsmngen (omtrent 1 ml) blir ekstrahert 5 ganger med vannmettet butanol for å fjerne etidiumbromidet Deretter blir volumet justert til 15 ml med vann og DNA blir presipitert ved tilsetning av 30 ml etanol DNA blir samlet ved sentnfugenng og deretter blir pelleten vasket en gang med 75% etanol og deretter løst opp 1 TE-buffer og lagret ved -20°C

Fra en pGW1900 Kpnl-spaltning blir 1 tillegg et 2,7 kbp Kpnl DNA-fragment elektroforetisk isolert fra en agarosegelbit og skutt inn 1 pEMBLl 8 (Dente & Cortese, ref 10) resulterende 1 plasmidene pGW1902 (se figur 4) og pGW1903

For å konstruere et fysisk kart av pGW1900 og pGW1902 blir flere reaksjonsblandinger som inneholder omtrent 1 pg plasmid-DNA, relevant buffer som anbefalt av BRL og 10 enheter av et restnksjonsenzym eller en kombinasjon av to forskjellige restnksjonsenzymer, preparert Reaksjonsproduktene blir analysert på 1% agarosegeler i TAE-buffer Fra den beregnede størrelsen til spesifikke fragmenter blir posisjonen hl individuelle restnksjonsenzymseter i figur 3 og 4, respektivt, bestemt Eksempel 4 Bestemmelse av nukleohdsekvensen til polygalakturonaseeenene

Eksempel 4 1 Pol<y>galakturonase I ( pgaD genet til A niger N400

Egnede restnksjonsrfagmenter blir isolert fra pGW1900 og pGW1902 etter agarosegelelektroforese som beskrevet i eksempel 3 9 Disse blir ligert inn i M13mpl8RF og M13mpl9RF vektorer ifølge BRL M13 klomng/dideoksysekvensenngsmanual (ref 11) Kompetente celler blir dannet som beskrevet i Pharmacia Manual for Ml3 kloning/sekvensenngssystemet Transformasjon av E coli JM101 blir utført som beskrevet av Messing et al, ref 30 Isolenng av enkelttrådete DNA-templater fra rekombinante fag følger konvensjonelle metoder (f eks ref 11, s 29-34) Resulterende kloner blir sekvensert ved anvendelse av T7 sekvensenngs<TM> fot fra Pharmacia (Uppsala, Svenge) ved anvendelse av betingelsene anbefalt av forhandleren

pGW1900 blir sekvensert fra EcoRI-setet ved dets omtrentehge kartposisjon 5750 Ul Clal-setet ved dets omtrentehge kartposisjon 3900 som er beliggende nære ved Hindlll-setet i posisjon 3790 Flere ohgonukleotider (304-307) blir syntetisert ved anvendelse av metoden Ul Caruthers (ref 8) Disse ohgonukleotidene har følgende sekvenser

De blir anvendt som spesifikke sekvensenngspnmere for relevante templater

Ohgonukleotidnummer 307 blir anvendt for dobbelttrådet sekvensenng av alkalidenaturert pGW1900 ifølge forhandlerens instruksjoner for T7-sekvensenngs^<M> kit Hele sekvensen av pgal-genet er angitt i sekvenshsten under SEQ ID NO 1 Sekvensen er basert på sekvensenngsdata tilveiebragt med begge trådene

2495 bp pgal-sekvensen begynner med det første nukleohdet hl EcoRI-setet ved omtrentehg kartposisjon 62801 pGW1900 og slutter 12 nukleotider etter siste nukleotid Ul Clal-setet nære Hindlll-setet angitt ved 3880 pgal-sekvenesn omfatter 909 nukleotider av

promoterregionen, 1218 nukleotider av den strukturelle delen, inkludert to antatte introner på 52 bp (intron A) og 62 bp (intron B), og 366 nukleotider av den transknpsjonelle terminatorregionen

Aminosyresekvensene tilveiebragt fra moden polygalakturonase I (se eksempel 1 4) og for 21 kDa cyanogenbromidfragment (eksempel 1 5) er i fullstendig samsvar med en aminosyresekvens som kan bli avledet fra nukleotidsekvensen og som begynner i posisjon 1003 DNA-sekvensen koder for et lerpeptid på 31 aminosyrer, der lysin er siste aminosyre før det modne proteinet begynner Av lignende grunner som angitt i tilfellet PGII hvor lederpeptidet slutter med et argininresidie representerer dette PGI-lederpeptidet en prepro-sekvens som også blir fjernet i minst to proteolytiske tnnn Sekvensen som hybndiserer med ohgonukleotidblandingen anvendt som probe og begynner i posisjon 12771 nukleotidsekvensen Det er fullt samsvar mellom den N-termmale aminosyresekvensen bestemt for 5 5 kDa cyanogenbromidpeptidfragmentet som beskrevet i eksempel 1 og antatt aminosyresekvens basert på nukleotidsekvens

Polygalakturonase I strukturelle genet inneholder to mtroner Intron A omfatter nukleotidsekvensen fra posisjon 1138 til 1189 5'-spleisesetet G T A T G T er i samsvar med sopp 5-spleisesetet konsensussekvens GT Pu NGT (ref 41) mens "lanat"-sekvensen GC TAAC og 3'-spleisesetet TAG også er i samsvar med kjente konsensussekvenser Pu CT Pu AC og Py AG Tilstedeværelse av dette intronet forandrer leserammen på en måte som er i samsvar med proteinsekvensdata tilveiebragt med et mere distalt beliggende 5,5 kDa cyanogenbromidfragment (se eksempel 1) Det andre intronet (B), omfatter nukleotidsekvensen 1610 opp til 1671 Både "lanat"-sekvensen og 3'-spleisesetet er i samsvar med kjente konsensussekvenser 5'-spleisesetet G C A C G A er ikke i samsvar med konsensussekvensen GT Pu NGT, men GC ved 5-spleisesetet samt en A i posisjon +6 med hensyn på 5'-spleisesetet er blitt funnet i noen andre gener (ref 41 og 43)

Tilstedeværelse av intron B er basert på følgende argumenter

a) Det forandrer leserammen mens i de andre to leserammene oppstår premature stopp

b) Intronet i pgall oppstår i samme posisjon og aminosyresekvensen som går foran dette intronet Asn - Ser - Gly - Glu er identiske i begge proteinene En region med sterk homologi finnes også mellom amiosyresekvensene avledet fra nukleotidsekvensene rett etter det antatte intronet

Eksempel 4 2 Homologi mellom A ruger N40Q polygalakturonase

Polygalakturonasene PGI og PGII isolert fra A mger katalyserer samme reaksjon og er immunologisk beslektede med hverandre, som beskrevet i eksempel 1 2

Genene kodene for disse enzymer er også nært beslektet på grunn av at med pgall-genet blir andre polygalakturonasegener isolert fra et genomisk A niger N400 bibliotek som beskrevet i eksempel 7 2 En sekvenssammenhgnmg av antatt PGI og PGII aminosyresekvenser til modne enzymer som har 2 residier forskjellig lengde viser en stor grad av homologi Disse data viser tydelig at gener kodende for PG er nært beslektet og representerer medlemmer av polygalakturonsegenfamihen

Eksempel 5 Kotransformasion av A niger ved anvendelse av A niger pyr A-genet som seleksionsmarkør og et plasmid som inneholder polygalakturonase I eller II- genet som kotransformerende plasmid

Eksempel 5 1 Dyrking og rensing av plasmider anvendt til å transformere A niger Plasmid pGW635 som er en kortere versjon av pGW613 (Goosen et al ref 13) og som også inneholder pyrA-genet, og plasmid pGWl 800, som inneholder polygalakturonase II-genet, blir dyrket i E coli MH1 og JM109 Plasmid pGW1900 blir dyrket i E coli DH5ctF Plasmid DNA blir isolert fra 250 ml over nattkulturer som beskrevet i Maniatis et al (s 90-91, ref 6) og i eksempel 3 7

Eksempel 5 2 Preparenng av protoplaster og transformasjon av undinauksotrofmutant A nigerstamme N593

A nigerstamme N593 (cspA, pyrA) som er et derivat av den parentale stammen N400 er blitt tilveiebragt ved positiv seleksjon mot toksisk analog 5-fluor-orotinsyre som i gjær (Boeke et al, ref 14) i nærvær av undin som beskrevet av Goosen et al (ref 13)

Flytende minimalmedium supplementert med 0,5% gjærekstrakt, 0,2% casaminosyrer, 10 mM undin (Janssen Chemie) og 50 mM glukose blir inokulert med 10^ komdiosporer av A niger N593 per ml og inkubert 1201 ved 30°C i en New Brunswich orbitalnster Mycelium blir høstet ved filtrenng, gjennom Miraklede, vasket med iso-osmetisk minimalmedium (STC) med følgende sammensetning 1,33 M sorbitol, 10 mM Tns-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2 En mengde på 1 g mycelium blir resuspendert 120 ml STC Protoplaster blir frigjort fra mycelet i løpet av 2 ved tilsetting av 150 mg filter-stenlisert Novozym 234 (Novo Industnes, Danmark) og inkubenng av blandingen ved 30°C i en

nster ved 95 rpm Protoplastene blir separert fra gjenværende mycelium ved filtrenng ved anvendelse av en trakt med en plugg av glassull Deretter blir kald STC tilsatt til et volum på 40 ml og blandingen plassert på is 110 min Protoplastene blir isolert ved sentnfugenng (10 min, 2500 rpm) og pelleten blir resuspendert i 5 ml STC Protoplastene blir pelletert en gang til og til slutt resuspendert 11 ml kald STC

For transformasjon blir 5 x IO<6> protoplaster tatt opp i 200 pl som deretter blir inkubert sammen med 1 pg pGW635 og 20 pg pGWl 800 eller pGW1900 Etter tilsetning av plasmid DNA til protoplastene blir 50 pl PCT (10 mM Tns-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2, 25% PEG6000) tilsatt og lnkubasjonsblandingen holdt på is 120 min Deretter blir ytterligere 2 ml PCT tilsatt og blandingen inkubert i ytterligere 5 min ved romtemperatur Til slutt blir 4 ml STC tilsatt og blandet Ahquoter på 1 ml av denne endelige transformasjonsoppløsningen blir blandet med 4 ml flytende iso-osmotisk MM topp-agar stabilisert av 0,95 M sukrose Protoplastblandingen blir øyeblikkelig sådd ut på agarskåler inneholdende samme iso-osmotiske minimalmedium og disse blir inkubert ved 30°C Hensiktsmessige kontrollekspenmenter omfatter protoplaster behandlet på lignende måte uten plasmid DNA og på lkke-stabihsert minimalmedium med 2,5 mM undin

Etter 3 dagers vekst ved 30°C fremkom voksende transformanter som sporulerer (150 transformanter/Ug pGW635) Bortsett fra dette fremkom et stort antall sannsynligvis aborterende transformanter Omtrent 300 transformanter blir oppnådd med pGWl 800 og omtrent 100 med pGW1900 Av hver av transformantene med pGW1800 og pGW1900 blir tyve kolonier plukket tilfeldig, sporer av individuelle transformanter tatt ut og sådd separat på 50 mM glukoseminimalmedium for å tilveiebringe enkeltkolomer som blir renset en gang til og deretter anvendt for å propagere sporer for ytterligere transformant-analyser

Eksempel 5 3 Seleksion av polyealakturonaseover<p>roduserende ko- transformanter av A niger- stamme N593 ved halo- dannelse på <p>ektininneholdende fast medium Omtrent 200 kolonier transformert med pGWl 800 og omtrent 100 transformert med pGW1900 tilveiebragt som beskrevet i eksempel 5 2 er blitt screenet for en økning i polygalakturonase-aktivitet ved en koloniscreeningsprosedyre uten etterfølgende rensing Mediet anvendt for screening består av 2% (w/v) glukose, 0,5% eplepektin (34,8% grad forestnng, Obipektin, Bischoffszell) minimalmediumsalt og sporeelementer, 6 g/l NaN03, 0,2 % gjærekstrakt, 0,2% pepton, 0,004 % Tnton X-100 og 1,2 % agar Petnskålen blir inokulert i sentrum og inkubert i 2 dager ved 30°C Kolonier blir lagret over natt i kulde Deretter blir overflaten av skålene farget ved tilsetning av et lag 5 ml av en 0,05 % ruthenium rød oppløsning, som blir inkubert i 5 min med nsting Ubundet farge blir deretter fjernet ved vasking med destillert vann i ytterligere 5 min Produksjon av polygalakturonase under disse betingelsene er angitt ved størrelsen på nngen som blir dannet Omtrent 50% av transformantene analysert har en polygalakturonseaktivitet som er høyere enn villtypen

Syv kolonier av pGW1900 transformanter blir plukket på grunnlag av størrelse på nngen som blir dannet på pektininneholdende fast medium og etter en andre screening med disse positive kolomene etter vekst 145 t, blir 6 av hver av transformantene til slutt plukket og renset som beskrevet i eksempel 5 2

Eksempel 5 4 Pol<y>galakturonase I- produksjon ved transformerte A niger- stammer og ved A niger N402ogN593

Sytten av pGW1900-transformantene beskrevet i eksempel 5 2 og seks av pGW1900-transformantene beskrevet i eksempel 5 3, samt A mger N402 og en pyr<+->transformant av N593 blir dyrket i et medium som består av et mimmalsaltmedium der urea (4,2 g/l), 1%

(w/v) eplepektin (dvs 61,2%) og 1% sukkerroemasse er blitt tilsatt Kulturene blir dyrket i 641 ved 30°C ved anvendelse av en Gallenkamp-orbitalnster ved 250 rpm og innimellomprøver av kulturfiltratet blir tatt etter 201 og 391 PGI-innholdet i disse prøvene blir undersøkt som PGII-innholdet i eksempel 5 5 ved Western-blotting

På grunnlag av signalene på Western-blotter blandt 23 transformanter som ble undersøkt produserer 65% betraktelig mere PG I enn A niger N402 Transformanter selektert på grunnlag av nngstørrelse produserer alle mere PGI enn A niger N402 og fire ut av seks transformanter er høyt produserende Aktivitetsmålmgene angir at i dette mediet er aktiviteten etter 201 høyere enn etter 391 Ser man på 12 forskjellige PGI-transformerte A niger-stammer vanerer aktiviteten mellom 28 og 7 U/ml mens utransformerte kontrollstamme N402 og en A mger N593/pGW635-transformant produserer henholdsvis 0,5 og 0,8 U/ml Denne aktiviteten er minst resultatet av viUtypemvåene av både PGI og PGII mens økning i transformantene er et resultat av mere PGI-ekspresjon

Eksempel 6 Subklomng av PGC- genet ( pgaQ konstruksjon av pGW1910

Fag XPG-C20 (eksempel 7 2, fag 20, klasse C) blir spaltet med Bglll, og resulterende fragmenter separert på en agarosegel Gelbitene som inneholder hybndiserende 7,8 kbp Bgin blir isolert og fragmentet blir deretter isolert som beskrevet (eksempel 3 6) Bglll-fragmentet blir ligert inn i BamHI-spaltmngen og CIP (kalve tarmfosfatase) behandlet pUC9 Ligenngsreaksjonsblandingen blir anvendt for å transformere E cohJM109 (eksempel 3 6) Flere av de resulterende hvite koloniene blir streket ut på YT-agar supplementert med ampicillin Etter dyrking over natt blir koloniene adsorbert på et nitrocellulosefilter Koloniene på filteret blir deretter lysert og frigjort DNA fiksert ved baking som beskrevet av Mamatis et al (ref 6, s 314) Bakte filtere blir fuktet i 2xSSC og de blir forsiktig skrubbet med en behansket hånd for å fjerne baktenelt celledebns Filtrene blir deretter hybndisert med 1,2 kbp BamHI-EcoRI fragment til pGW1803, ved anvendelse av heterologe betingelser beskrevet i eksempel 7 2 (60°C, vaskinger med 2xSSC) En positiv klon blir valgt og plasmid DNA renset som beskrevet ovenfor Plasmid DNA blir deretter anvendt for restnksjonsanalyse for å konstruere et fysisk kart

På denne måten er et nytt plasmid blitt konstruert pGW1910 (fig 7) er 7,8 kbp Bglll-fragmentet av fag X.PG-C20 skutt inn i BamHI-setet til vektor pUC9 Denne subklonen omfatter hybndisenngsfragmentene til fag XPG-C20, f eks 1,1 kbp Smal og 1,6 kbp Kpnl-fragmentene Fra beliggenheten til disse fragmentene på det fysiske kartet til pGW1910 fremkommer det at dette plasmidet inneholder det fullstendige PGC-genet

(PgaC)

Til forskjellige tider (hver 20 time) blir prøver tatt ut, celler pelletert ved sentnfugenng og åpnet ved frysetørking og tørrmahng Supernatant og celleekstrakter blir begge testet for lnterferonaktivitet som beskrevet (overfor) Hovedmengden av interferonaktiviteten blir funnet utskilt i mediet i transformanter inneholdende pGIss-IFN AMI 19, mens i transformanter som inneholder pGII-IFN AMI 19 er den hovedsakelig i celleekstraktet

Eksempel 7 Pol<yg>alakturonase I og polygalakturonase Fl produksion ved transformerte A nidulans- stammer

Eksempel 7 1 Dyrking og rensing av plasmider anvendt for å transformere A mdulans G191 E coh MH1

pGW635 bhr dyrket i E coli MH1, pGW18001JM109 og PGW19001 DH5<xF

Eksempel 7 2 Preparenng av protoplaster og transformasion av undinauksotrof A mdulansmutant

A nidulans-mutantstamme G191 (pyrG, pabaAl, fwAl, uaY9) er blitt beskrevet av Ballance og Turner, 1985 (ref 27)

Mycelet blir dyrket ved 37°C og ytterligere som beskrevet for A mger (se eksempel 5 2) med unntagelse av at 2 mg p-aminobenzoat blir tilsatt per liter medium Protoplaster blir preparert ifølge prosedyren beskrevet for A niger For transformasjon blir 5 x 10^ protoplaster tatt opp 1200 pl STC, som deretter blir inkubert sammen med 1 pg pGW635 og 20 pg pGW1800 eller 25 pg pGW1900 Skåler blir inkubert 13 dager ved 37°C

Omtrent 50 transformanter/<p>g pGW635 blir tilveiebragt i konformasjonsekspenmentet, og i hvert eksperiment blir 20 transformanter ytterligere renset på 50 mM glukoseminimalmedium Disse stammene blir deretter anvendt for å dyrke sporer for ytterligere analyser

Eksempel 7 3 Wester blot- analvse av polygalakturonase I ved transformerte A nidulans-stammer

Kotransformantene tilveiebragt ifølge eksempel 9 2 ved anvendelse av pGW1900 som kotransformerende plasmid blir dyrket på to forskjellige media Det første mediet består av et høyfosfat minimalsaltmedium der NH4CI (4,0 g/l), 1% (w/v) eplepektin (dvs 61,2%) og 1% (w/v) sukkerroemasse blir tilsatt, mens noen transformanter også blir dyrket 1 dette mediet med urea (4,2 g/l) som nitrogenkilde istedenfor NH4CI Forskjellen med det tidligere lavt fosfatmimmalmediet (ovenfor) er at 15 g KH2PO4 per liter blir anvendt istedenfor 1,5 g Det andre mediet består også av et høyt fosfat mimmal-saltmedium der 0,1% gjærekstrakt, NH4CI (10 g/l) og 3% (w/v) glukose blir tilsatt som nitrogen og karbonkilde I begge medier blir 2 mg/l p-amino-benzoat tilsatt Kulturene blir dyrket 1421 ved 30°C ved anvendelse av en Gallenkamp orbitalnster ved 250 rpm og prøver av kulturfiltratet blir tatt ut etter 201 og 421 I Western-blots til A mdulans Gl 91, dyrket under lignende betingelser som transformantene, blir noe ikke eller meget lite protein detektert som kryss-reagerer med polyklonalt antistoff dannet mot renset polygalakturonase I I kulturfiltratet blir 75% av transformantenes PGI detektert 1 signifikante mvåer

Ved anvendelse av NH4CI istedenfor urea og høy fosfat også 1 kompleksmedium, reduserer den proteolytiske degradenngen av polygalakturonase I som blir produsert betraktelig På grunnlag av Western-blott-resultater og aktivitetsmåhnger estimeres transformant Gl 91 pGW 1900-6 til å produsere over 1 g enzym per liter som angitt i tabell VI på grunn av at den spesifikke aktiviteten til PG I er 550 U/mg (Kester og Visser, 1990)

Tabell VI Polygalakturonaseaktivitetene til kulturfiltratene til A mdulans transformant G191/pGW1900-6 og til kontrollstamme G191/pGW635-l Stammene blir dyrket ved inokulering av 10^ sporer/ml ved 30°C minimalmedium ved anvendelse av N- og C-kilder som angitt og høy fosfat (15 g KH2PO4/I)

pgal-genet kodende for polygalakturonase I blir ikke uttrykt 1A niger 1 glukoseinneholdende medium, selv 1 multikopitransformanter med en høy gendose Ekspresjon av disse A niger-genene 1A mdulans-transformanter som 1 stammene G191/pGW1900-6 og G191/pGW1900-10, angir denmot at 1A mdulans blir katabohtt-represjon av disse genene omgått Dette impliserer forskjellige spesifisiteter 1 katabolitt-represjonssystemet blandt disse forskjellige Aspergillus-artene Dette kan bh anvendt for å uttrykke et bestemt A mger polygalakturonase-gen 1 en annen vert som A mdulans under betingelser som unngår ekspresjon av polygalakturonaser av selve verten Polygalakturonase-enzymene oppnådd på denne måten er omtrent rene

Eksempel 8 Pol<y>galakturonase C- produksion ved transformerte A mdulans- stammer Plasmid pGW1910 inneholdende pgaC-genet til A mger N400 (eksempel 7 3) blir anvendt som kotransformerende plasmid i et ekspenment konstruert for å transformere A mdulans G191 til undinprototrofi, som beskrevet i eksempel 9 2 Ti av resulterende transformanter blir renset og deretter anvendt for å propagere sporer for ytterligere analyser Disse stammene og G191/pGW635-l blir dyrket i et flytende minimalsaltmedium supplementert med 2 mg/ml p-aminobenzoat, 4,0 g/l NH4CI som mtrogenkilde, 1% sukkerroemasse og 1% pektin som karbonkilde, med fosfat tilsatt 1 høy konsentrasjon (15 g/1 KH2PO4) Inokulasjon er ved 10^ sporer/ml og inkubasjon er ved 30°C 1 en Gallenkamp orbital-nster ved 250 rpm Kulturfiltrater blir tilveiebragt 65 t etter inokulasjon og filtratene blir deretter analysert, uten på forhånd rensing eller konsentrenng Western-blots blir inkubert med en

blanding av antistoffer dannet mot PGI og PGII (eksempel 1 2) Aktivitetsmålinger (ref 2) blir utført 1 en 50 mM natnumacetatbuffer pH 4,8 inneholdende 0,25 % polygalakturonsyre

(USB)

På grunnlag av Westernblotting produserer de fremste av de oppnådde transformantene høye mengder polygalakturonase C (PGC) Dette resultatet er bekreftet ved måling av PG-aktiviteten 1 supematanten til transformanter og til en kontrollstamme (A mdulans Gl91 transformert med pGW635)

Eksempel 9 Eks<p>resjon av A niger pga A og pgaD- genene 1 transformerte A mdulans-stammer

I tillegg til pgal, pgall og pgaC-genene blir andre medlemmer av polygalakturonase-genfamihen til A niger (eksempel 7 29 anvendt for å transformere A mdulans I foreliggende eksempel blir kloner 1 fag X anvendt istedenfor subkloner derav 1 en plasmidvektor

Fag X DNA blir preparert fra platelysater som beskrevet 1 eksempel 3 5 og blir deretter ekstrahert en gang til med fenol og kloroform For et kotransformasjonsekspenment blir omtrent 20 pg X DNA anvendt, og DNA er 1 omtrent like mengder tilveiebragt fra 2 fag fra samme klasse (f eks X.PG-A101 kombinasjon med A.PG-A43 eller XPG-D8 1 kombinasjon med X.PG-D11) Kotransformasjon av A mdulans G191 blir utført som beskrevet 1 eksempel 9 2, mens kontrollene nå omfatter kotransformasjoner med pGW1900 og XPGI-7, separat Ved anvendelse av Xfag DNA preparert som beskrevet ovenfor, er transformasjonsfrekvensene lavere sammenlignet med plasmid DNA renset ved bånddannelse 1 cesiumklondgradienter

Relevante transformanter blir renset og analysert som beskrevet for pGW1910 transformantene i eksempel 12 1 dette tilfellet blir transformantene også dyrket i et medium inneholdende 3% glukose som karbonkilde (høyfosfat, 0,1% gjærekstrakt, 1% ammoniumklorid)

Transformantene A mdulans Gl91/lambdaA-l og G191/lambdaD-l er blitt tilveiebragt ved anvendelse av kalsse PG-A og PG-D-fagene nevnt ovenfor Polygalakturonaseaktivitetene i kulturfiltratene til roemasse/pektinmedium ved 65 t etter inokulasjon var betraktelig høyere enn i kontrollstammen G191/pGW635-l pgall-relaterte sekvenser tilstede i klasse A og D-fagene koder dermed for proteiner med polygalakturonase-aktivitet På grunnlag av Westem-blot blir det konkludert at disse genproduktene, henholdsvis polygalakturonase A og polygalakturonase D, migrerer med en lignende elektroforetisk mobilitet som PGI

A mdulans G191/lambda A-I produserer polygalakturonase A også i medium med glukose som karbonkilde

Eksempel 10 Ekspresjon av h<y>bndinterferon i transformerte A mdulans- stammer

I et kotransformasjonsekspenment blir omtrent 20 pg plasmid DNA pGII-IFN AMI 19 eller pGIIss-IFN AMI 19 anvendt Kotransformasjon av A mdulans Gl91 blir utført som beskrevet i eksempel 9 2

Relevante transformanter blir renset og analysert som beskrevet for transformantene i eksempel 8 4 1 dette tilfellet blir transformantene også dyrket på et medium inneholdende 3% glukose som karbonkilde (høyfosfat, 0,1% gjærekstrakt, 1% ammoniumklond)

Ved forskjellige tidspunkter (hver 20 time) blir prøver tatt ut, cellene pelletert ved sentnfugenng og åpnet ved frysetørking og tørrmaling Supematant og celleekstrakter blir begge undersøkt for lnterferonaktivitet som beskrevet (ovenfor) Hovedmengden av interferon-aktiviteten finnes utskilt i mediet i transformanter inneholdende pGIIss-IFN AMI 19 mens i transformanter inneholdende pGII-IFN AMI 19 er det hovedsakelig i celleekstraktet som indikerer at A mdulans produserer IFN fra pGII-IFN AMI 19 eller pGIIss-IFN AMI 19 når glukose blir anvendt som eneste karbonkilde

Eksempel 11 Macerenngsegenskapene til <p>olygalakturonase I

Celleseparasjon av agurkvev blir anvendt for å analysere macerenngsaktiviteten til A niger polygalakturonaser En agurkfrukt blir forhandlet i en butikk og overflaten blir deretter dekontaminert ved tørking med et håndkle bløt gjort i etanol eller ved flytmg 1111 Javel-vann (handelskvahtet, fortynnet til 0,5% natnumhypoklontt) Agurken blir deretter spaltet opp og den bløte indre delen av bitene blir fjernet To av bitene (omtrent 12 g) blir plassert i en 100 ml Erlenmeyer-flaske inneholdende 25 ml macereringsbuffer der polygalakturonase er på forhånd blitt tilsatt, eller ikke Den følgende inkubasjonen er i 241 med forsiktig enrettet nsting i et vannbad innstilt på 30°C Flaskene blir deretter inspisert visuelt Fullstendig macerenng oppfyller følgende kntener (i) skallet hl agurkfrukten er vesentlig fri for adhererende vev, som angitt ved makroskopisk undersøking, u) macerenngsbufferen er blitt meget turbid, ni) det er en positiv korrelasjon mellom celleseparasjon og høy turbiditet hl macerenngsbufferen, som angitt ved en høy proporsjon av løse celler som fremkommer å være hele ifølge mikroskopisk visuahsenng

Polygalakturonase I fremstilt som beskrevet i eksempel 1 ble undersøkt i forskjellige buffere Macerenngsbuffer A (MBA) er 50 mM natnumacetat pH 4,8 Macerenngsbuffer

B (MBB) er en fosfat-citratbuffer, (Ishu (1976), Phytopathology 66, s 281-289) MBB blir fremstilt ved blanding av 0,1 M sitronsyre og 0,1 M Na2HPC<4 oppløsninger helt til ønsket pH-verdi på 4,5 blir oppnådd, og deretter blir et likt volum destillert vann tilsatt og deretter bovint serumalbumin til en final konsentrasjon på 10 mg/25 ml ved anvendelse av en

konsentrert oppløsning på 10 mg/ml

Agurkvev blir fullstendig macerert i løpet av 241, ved anvendelse av 1 pg polygalakturonase II i MBA I denne bufferen blir agurkvevet ikke macerert i fravær av polygalakturonase eller i nærvær av 1 pg polygalakturonase I Macerenng av agurkvev i MBB blir undersøkt i fravær av polygalakturonase eller i nærvær av 10 pg polygalakturonase I eller polygalakturonase II Macerenng blir her igjen ikke observert i fravær av enzymet eller i nærvær av polygalakturonase I, mens polygalakturonase II macererer agurkvevet fullstendig PGII fremstilt ifølge eksempel 10 har også macerenngs-egenskaper

REFERANSER

Deponerte mikroor<g>anismer

Følgende mikroorganismer og fag er deponert hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM), MAscheroder Weg 16, D-330 Braunschweig

Claims (10)

1 Rekombinant DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens utvalgt fra a) Aspergillus niger DNA-innskuddet til pGW1900, b) en DNA-sekvens som hybndiserer med den kodende region for det modne PGI som omfatter et DNA-innskudd ifølge a) og som omfatter et strukturelt gen for et polypeptid med galakturonase- eller polygalakturonaseaktivitet med de fysiokjemiske egenskaper til PGI, og eventuelt en promoter, en kodende region for en signalsekvens og/eller en transknpsjonsterminator, c) et denvat av en DNA-sekvens definert i a) eller b), som omfatter et strukturelt gen for et polypeptid med galakturonase- eller polygalakturonaseaktivitet som har de fysiokjemiske egenskaper til PGI, og eventuelt en promoter, en kodende region for en signalsekvens og/eller en transknpsjonsterminator, eller d) en DNA-sekvens som koder for det modne PGI eller en signalsekvens av denne og som er degenerert innenfor betydningen av den genetiske kode med hensyn på en DNA-sekvens ifølge a), b) eller c)

2 Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som hybndiserer med den kodende region for det modne PGI som omfatter et DNA-innskudd til PGWl900 og som koder for et polypeptid med galakturonase eller polygalakturonaseaktivitet, promoter, signal eller lederpeptid og/eller transknpsjonsterminator

3 Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert ved at det omfatter et denvat av Aspergillus mger DNA-innskudd til pGW1900, eller av en DNA-sekvens som hybndiserer med den kodende regionen for modent PGI omfattet av et DNA-innskudd til pGW1900 og som koder for et polypeptid med galakturonase- eller av polygalakturonaseaktivitet, promoter, signal eller lederpeptid og/eller transknpsj onsterminator

4 Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 2 eller 3, karakterisert ved at det omfatter et DNA-fragment som koder for promoteren til PGI, som strekker seg fra posisjon 1 til 909 av DNA-sekvensen SEQ ID No 1

5 Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 2 eller 3, karakterisert ved at det omfatter et DNA-fragment som koder for et lederpeptid som strekker seg fra posisjon 901 til 1002 av DNA-sekvensen SEQ ID No 1

6 Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 2 eller 3 som koder for et polypeptid med galakturonase- eller polygalakturonaseaktivitet, karakterisert ved at det omfatter et DNA-fragment som strekker seg fra posisjon 1003 til 2127 av DNA-sekvensen SEQ ID No 1

7 Ekspresjonskassett karakterisert ved at den omfatter et rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av de foregående krav

8 Hybndvektor karakterisert ved at den omfatter et rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av de foregående krav

9 DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det omfatter et gen for PGI eller et funksjonelt fragment av dette som er isolert fra en PGI-produserende soppstamme

10 DNA-molekyl ifølge krav 9, karakterisert ved at det er isolert fra Aspergillus spee