KR0179653B1 - 진균 발현 시스템 - Google Patents

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Abstract

내용 없음

Description

진균 발현 시스템
제1도는 PGII유전자의 일부를 암호화하는 DNA 프로브 HR6195 및 HR6196을 병용하여 하이브리드화시킴으로써 아스퍼질러스나이거의 게놈성 라이브러리로부터 수득한 파아지 λD 및 λE의 EcoRI 단편에 대한 부분제한지도이다.
제2도는 pGW1800의 부분제한지도이다.
제3도는 pGW1900의 부분제한지도이다.
제4도는 플라스미드 pGII-IFN119 및 pGIIss-IFN AM119에 대한 클로닝 방법도이다.
제5도는 폴리머라제 쇄 반응(PCR)법을 사용하여, 각각 pGII-IFN AM 119 및 pGIIss-IFN AM119를 작제하기 위한 DNA 삽입체 DNA5 및 DNA6의 단계적 작제도이다.
제6도는 pGW1756의 부분제한지도이다.
제7도는 pGW1910의 부분제한지도이다.
본 발명은 유전공학 분야에 관한 것이며, 폴리갈락투로나제 활성을 지닌 단백질 및/또는 천연적으로 이에 연결된 프로모터, 시그날 및/또는 전사종결서열을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 신규한 DNA 분자를 제공한다. 이 신규한 DNA 분자는 폴리갈락투로나제 생산을 위한 발현 카세트의 작제 또는 사상균 중에서 외래 유전자를 발현시키는데 유용하다.
비록 유전공학기술에서 원핵 및 진핵 숙주에 대한 다양한 폴리펩타이드 발현 시스템이 이미 공지되어 있긴 하지만, 여전히 전술한 시스템보다 나은 신규한 시스템이 요구되고 있다.
대단히 광범위하게 사용되는 숙주는 원핵 에스셰리키아콜라이(Escherichiacoli)와 진핵 효모(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애: Saccharomyces cerevisiae)이며, 이들에 대해 수 많은 상이한 발현 하이브리드 벡터(대부분 플라스미드)가 개발된바 있다. 이, 콜라이 숙주의 결점은 이들이 폴리펩타이드를 글리코실화시킬 수 없으며 외래 펩타이드의 세포내 발현은 숙주 세포내 축적을 유발하여 더 이상의 생장을 방해한다는 점이다. 그러나 효모는 이, 콜라이와 달리 글리코실화를 수행할 수 있어 소량을 제외하고는 영양배지 중에 폴리펩타이드를 분비하지 않고 주변 세포질 공간에 분비한다. 포유동물 암세포와 같은 고등한 진핵 숙주들은 글리코실화를 할 수 있으며 영양배지로 분비할 수도 있으나, 이의 배양은 더디고 비용이 많이 들며, 목적하는 펩타이드와 함께 발암성 핵산이 분리될 위험성이 존재한다.
다른 숙주의 연구에서, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)와 같은 사상균이 조사된 바 있다. 이들의 유전공학 기술에 대한 적용은, 적절한 형질전환 시스템의 결여로 지지부진해 왔다. 사카로마이세스 세레비지애와 달리 사상균은 외래 유전자 도입 및 표현형 선택에 사용될 수 있는 플라스미드를 함유하고 있지 않다. 그러나, 선택성 마커 유전자를 함유한 외래 플라스미드로 사상균을 형질전환시키는 것은 가능하다. 사상균에 대해 지금까지 기술된 대부분의 벡터들은 효모에서의 경우처럼 능동적으로 복제되지 않으나 진균 염색체에 통합된다. 이런 일은 일반적으로 낮은 빈도로 발생한다. 그러나, 통합에 의한 형질전환은, 비록 비-선택적 조건하일지라도 형질전환체가 유사 분열적으로 대단히 안정되게 한다. 100 카피물 이상의 안정한 통합이 보고된 바 있다.
기술된 사상균에 대한 첫번째 벡터는 선택성 마커로서 뉴로스포라 크라사의 qa-2 유전자를 함유한다[참조 문헌: Case, M. E., Schweizer, M., Kushner, S. R. and Giles, N. H. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259-5263; Case, M. E. (1982) in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollander, A., DeMoss, D, Kaplan, S., Konisky, J., Savage, D. and Wolfe, R. S., eds), pp. 87-100, Plenum].
성주기(sex cycle)를 가지고 있음으로써 고전적인 유전자 조작을 가할 수 있는 에이. 니둘란스에서 음성적 및 양성적 선별 시스템이 기술된 바 있다[참조 문헌: Ballance et al. BBRC112, 284, 1983; Tilburn et al. Gene 26, 295. 1983; Yelton et al, PNAS 81, 1470, 1984; Yelton and Timberlake J, Cell. Biochem. Suppl. 9C, 173, 1985; Jhonstone et al. EMBO J. 4, 1307, 1983; Tilburn et al. Gene 26, 205, 1983; Wernars et al., Curr. Genet. 9, 361, 1985; Kelly. J. M. et al., EMBO J. 4, 475, 1985].
엔, 크라사 또는 에이, 니둘란스에 비해 에이. 나이거는, 식품 산업에 사용하기 위한 공업적 효소 생산에 광범위하게 사용되는 바와 같이 훨씬 중요한 생물체이다. 에이. 나이거는 예를 들어, 글루코아밀라제, α-아밀라제, 펙티나제, 셀룰라제, β-글루카나제, β-갈락토시다제, 나링지나제, 펜토사나제, 산프로테아제 및 리그나제 등의 다양한 가수분해 효소를 분비하는 것으로 공지되어 있고 글루코아밀라제 및 펙티나제 복합물이 가장 중요한 것이다.
에이. 나이거는 공지된 성주기가 없다. 그러므로, 돌연 변이가 유사 분열적 재조합을 통해 도입될 수 없다. 그러나, 가수분해 효소의 분비에 있어서 고전적 돌연변이 및 선별방법에 의해 광범위한 균주 개량이 달성되었다.
에이. 나이거 효소의 유전자중에서 이들의 프로모터 및 시그날 서열과 함께 글루코아밀라제[참조 문헌: Boel et al. EMBO J. 3, 1581, 1984]와 알콜 및 알데하이드 데하이드로게나제(WO 86/06097)가 특징화되어진 바 있으며 에이. 니둘란스 및 에이. 나이거를 사용한 형질전환 실험에 사용된 바 있다.
에이. 나이거에 대한 선별 마커로서 둘다 에이. 니둘란스로부터 수득된 이종 amds 유전자[참조 문헌: Kelly and Hynes. EMBO J. 4, 475, 1985] 및 arg B 유전자[참조 문헌: Buxton et al., Gene 37, 207, 1985; EP 184438; WO 86/06097]이 사용된 바 있다.
에이. 나이거는 예를 들어, 폴리갈락투로나제, 펙틴 리아제 또는 펙틴 에스테라제와 같이, 펙틴 분해 효소를 공업적으로 생산하는데 가장 중요한 생물체이다. 펙틴은 α-1, 4-글리코시드 결합으로 결합돤 D-갈락투론산 중합체로 이루어진, 고분자량(20000-40000D)의 폴리갈락투로니드이다. 일부의 우론산 그룹은 메탄올로 에스테르화되며 이는 펙틴 에스테라제에 의해 분해될 수 있다. 펙틴은 천연적으로 고등 식물세포의 구성 요소로 존재하며, 여기에서 이들은 주로 일차세표벽과 간질층(middle lamella)에서 발견되는 셀룰로즈 분자에 결합해 있다. 가장 풍부한 펙틴원 중의 하나는 레몬과 오렌지 껍질이며, 약 30%의 상기 다당류를 함유한다. 펙틴 효소는, α-1, 4-글리코시드 결합(엔도- 및 엑소-폴리 갈라투로나제)을 가수분해하거나 또는 포화 및 α-4, 5 불포화 폴리- 또는 올리고갈락투로니드를 생성시키게 되는 트랜스제거(펙틴 리아제)에 의해 탄수화물 중합체 기질을 분해시킨다. 엔도-폴리갈락투로나제의 분류명(systematic name)은 (폴리-(1, 4-α-D-갈락투로니드))글리칸 하이드롤라제(EC 3.2.1.15)이고 엑소-폴리갈록투로나제의 분류명은(폴리-(1, 4-α-D-갈락투로니드) 갈락투로하이드롤라제(EC 3.2.1.67)이다. 펙틴을 분해시키는 다른 갈락투로나제 효소는 람노갈락투로나제가 있으며 이는 α-D-갈락투로네이트와 L-람노스 사이의 결합을 가수분해한다.
펙틴 리아제가 고도로 에스테르화된 펙틴에 대해 특이적이거나, 폴리갈락투로나제는 적게 에스테르화된 펙틴을 가수분해시킨다. 펙틴 에스테라제와 폴리갈락투로나제의 협동작용에 의해 고도로 에스테르화된 펙틴을 해중합화시킬 수 있다.
과일 및 야채 가공중 폴리갈락투로나제 및 이의 효소 혼합물의 적용(표 1)은, 연한 과일을 처리하여 압착시 쥬스와 색소의 고수율 보장 및 원료 압착 쥬스의 청정화를 위한 펙틴 효소의 사용으로부터 개발됐다. 이런 공정에 사용하기 위한 기술적 효소 제제는 펙틴 에스테라제, 폴리갈락투로나제 및 아라비나나제, 갈락타나제, 자일라나제, β-1, 4-글루카나제, 글리코시다제 및 프로테아제와 같은 다른 효소와 함께 다양한 양의 펙틴 리아제를 포함한다.
주로 엔도폴리갈락투로나제를 함유하며 펙틴 에스테라제가 없는 진균 펙티나제 제제는, 기계적인-열처리 공정에 의해 제조된 제품에 비해 부드러운 밀도를 가지고, 가용성 고형물, 색소 및 영양소의 함량이 훨씬 높은 걸죽한 넥타(pulpy nectar) 제조에 유용한 연화효소(macerating enzyme)로 사용된다.
Figure kpo00002
펙틴 에스테라제/폴리갈락투로나제 배합의 일반적인 해중합화 활성 때문에, 펙틴 에스테라제의 존재는 순수한 폴리갈락투로나제의 연화활성을 세포분해 활성으로 쉽게 전환 시킬 수 있다.
펙틴 및 셀룰로스 분해성 효소의 사용을 통해 과일 펄프의 세포벽이 거의 완전한 액화 단계까지 분해될 수 있다. 펙틴 효소뿐만 아니라, 엔도- 및 엑소-β-1, 4-글루카나제(셀룰라제) 모두의 존재가 필수적이다(참조 문헌 31).
폴리갈락투로나제 및 이들 효소 혼합물은 또한, 예를 들어 식물 세포로부터 발효가능한 다당류의 제조(참조 문헌 33) 또는 펙틴의 개질(참조 문헌 32)을 위한, 생체량의 액화 및 당화에 유용하다. 자일라나제와 배합된 폴리갈락투로나제는 또한 예를 들어 제지펄프 공업에 유용하다(참조 문헌 44).
에이. 나이거에서 펙틴 복합체의 단백질은 구성적으로 발현되지 않는다. 에이. 나이거는 펙틴 또는 이의 분해산물을 이용한 유도조건하에서 다른 탄소원 즉, 글루코스 또는 슈크로스가 생장을 제한하는 경우에 상기 언급한 효소를 발현시킨다. 표면 배양에서 펙틴 효소는 세포외벽과 결합하여 잔류하는 경향이있다.
Rexov
Figure kpo00003
BenKov
Figure kpo00004
와 Markovic(참조 문헌 29) 및 Rimbouts와 Pilnik(참조 문헌 15) 모두는, 세균과 식물체로부터 수득한 것 외에도 에이. 나이거 및 다른 진균으로부터 수득한 정제된 것으로서의 다수의 폴리갈락투로나제를 기술하고 있다. 그러나, 어떤 구조적 데이터도 주어지지 않아 고도의 특이적 활성을 갖는 하나의 폴리갈락투로나제가 요구되고 있다. 유리하게 이들은 아미노산 서열을 결정하기에 충분하도록 순수해야만 한다. 이후로, 폴리갈락투로나제들은 PG로 칭한다.
[발명의 목적]
본 발명의 목적은 천연 또는 형질전환된 숙주 세포로부터 정제된 단독 PG이다.
본 발명은, 단백질의 상응하는 부분을 암호화하는 DNA 프로브의 합성을 허용하는, 단독의 PG들 즉, PGI, II, IIIA, IIIA, IV 특히 PGI 또는 PGII의 정체 및 부분적인 구조의 결정에 기초를 두고 있다.
본 발명의 목적은, 에이. 나이거의 유전자 라이브러리로부터, DNA 프로브에 의해 궁극적으로 이의 전- 및 후-서열과 함께 PGII 또는 PGI을 암호화한 DNA 서열을 스크리닝 및 분리하는데 있다. 또 다른 목적은, 진균균주 즉, 에이. 나이거의 유전자 라이브러리와 PGII 유전자(pgaII 로 명명) 또는 PGI 유전자(pgaI으로 명명)의 부분과의 하이브리드화에 의해 또다른 PG 유전자를 동정하는데 있다.
또 다른 목적은, 임의로 인트론 서열과 함께 폴리갈락투로나제의 구조 유전자 및/또는 PG 유전자의 조절서열(즉, 프로모터, 시그널 및/또는 전사종결서열)을 지니는, 폴리갈락투로나제 유전자 발현 카세트는 암호화하는 제조합 DNA 분자들이다. 본 발명의 또다른 재조합 DNA 분자들은, 예를 들어, 본 발명의 PG 유전자로부터 유래된 DNA를 포함하는 하이브리드 벡터들이다.
또 다른 목적들은 상기 벡터로 형질전환시킨 숙주, 특히 사상균(예: 아스퍼질러스) 숙주, 재조합 DNA 분자와 형질전환된 숙주의 제조방법 및 신규한 발현 카세트 또는 하이브리드벡터의 제조를 위한 재조합 DNA 분자의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 또한 예를 들어, 아스퍼질러스 종에서 PG의 과잉제조 및 다른 PG에 오염되지 않은 단독 PG 또는 예정된 이들의 인조혼합물의 제조에 관한 것이다.
다른 목적은 구조 유전자가 본 발명의 재조합 PG DNA 조절하에 발현될 수 있는 모든 이종 단백질의 제조에 관한 것이다.
본 발명의 여러가지 주제들은 하기의 본 발명의 상세한 기술로부터 좀더 분명해질 것이다.
[발명의 상세한 설명]
[재조합 DNA 분자]
본 발명은,
a) pGW1800 또는 pGW1900의 에이. 나이거 DNA 삽입체,
b) a)의 DNA 삽입체에 포함된 온전한 PGII 또는 PGI에 대한 암호화 영역에 하이브리드화 되며 폴리갈락투로나제 활성을 가지는 폴리펩타이드에 대한 구조 유전자, 및 임의로 프로모터, 시그날 또는 리더 펩타이드를 암호화한 영역 및/또는 이의 전사 터미네이터를 포함하는 DNA 서열,
c) a) 또는 b)에 정의된 DNA 서열의 유도체 또는
d) 온전한 PG 또는 시그날 펩타이드 또는 이의 리더 펩타이드를 암호화하며 a), b) 또는 c)의 DNA 서열에 대한 유전 암호의 의미내에서 변성된 DNA 서열 중에서 선택된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다.
보다 특히, 본 발명은,
a) pGW1800의 에이. 나이거 DNA 삽입체,
b) a)의 DNA 삽입체에 포함된 온전한 PGII에 대한 암호화 영역에 하이브리드화되어 있으며 폴리갈락투로나제 활성을 가지는 폴리펩타이드에 대한 구조 유전자, 및 임의로 프로모터, 시그날 또는 리더 펩타이드를 암호화하는 영역 및/또는 이의 검사 터미네이터를 포함하는 DNA 서열,
c) a) 또는 b)에서 정의된 DNA 서열의 유도체, 또는
d) 온전한 PG 또는 시그날 펩타이드 또는 이의 리더 펩타이드를 암호화하며 a), b) 또는 c)의 DNA 서열에 대한 유전암호의 의미내에서 변성된 DNA 서열 중에서 선택된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자, 또는
a) pGW1900의 에이. 나이거 DNA 삽입체,
b) a) DNA 삽입체에 포함된 온전한 PGI에 대한 암호화 영역에 하이브리드화되며 폴리갈락투로나제 활성을 가지는 폴리펩타이드에 대한 구조유전자, 및 임의로 프로모터, 시그날 또는 리더 펩타이드를 암호화한 영역 및/또는 이의 전사 터미네이터를 포함하는 DNA 서열,
c) a) 또는 b)에서 정의된 DNA 서열의 유도체 또는
d) 온전한 PG 또는 시그날 펩타이드 또는 이의 리더 펩타이드를 암호화하며 a), b) 또는 c)의 DNA 서열에 대한 유전 암호의 의미내에서 변성된, DNA 서열 중에서 선택된 재조합 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다.
플라스미드 pGW1800 및 pGW1900은 각각 이. 콜라이 균주 JM109/pG1800 및 DH5αF'/pGW1900 내에 포함되어 있으며 DSM(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen)에 기탁되어 있다.
폴리갈락투로나제 활성을 가진 폴리펩타이드는 본원에서 폴리갈락투로나제(PG)로도 부른다. 이 용어는 또한 효소 활성을 유지하고 있는 천연적으로 발생하는 폴리갈락투로나제의 단편 또는 돌연변이체까지도 포함한다. 본원에 사용된 폴리갈락투로나제 또는 PG란 용어는 기질로서 갈락투로네이트를 포함하는 올리고-또는 폴리사카라이드를 갖는 다른 갈락투로나제, 예를 들어, 올리고갈락투로네이트를 본해시키는 올리고갈락투로나제 또는 람노즈와 갈락투로네이트의 공중합체를 분해시키는 람노갈락투로나제, 또는 효소 활성을 지닌 이들의 단편 또는 돌연변이체를 포함한다. 리더 펩타이드는 온전한 PG 생성 중에 절단되는 prepro-PG의 서열을 나타낸다. 시그날 펩타이드는 소포체 내에서 첫번째 단계로 시그날 펩티다제에 의해 절단된다.
예를 들어, 본 발명의 재조합 DNA 분자는 pGW1800 또는pGW1900의 에이. 나이거 DNA 삽입체를 포함한다.
pGW1800의 길이가 4.1kb인 에어. 나이거 N400 삽입체(참조 제2도)는 XbaI 제한 위치(제한 지도 위치 1)에서 EcoRI 제한 위치(제한 지도 위치 4100)까지 이른다. 이 삽입체는, prepro-PGII에 대한 암호화 영역뿐만 아니라, 인트론을 포함한 프로모터 및 PGII 유전자 pgaII의 전사 터미네이터 영역을 포함한다. 제2도에 나타낸 대략 유전자 제한지도 위치 1 내의 XbaI 위치에서 출발하고 제2도에 나타낸 대략 유전자 제한지도 3050 위치 중의 PvuII 위치에서 종결된 pgaII를 포함하는 에이. 나이거 삽입체 단편의 DNA 서열이 결정되었고 이는 서열확인번호(SEQ ID No. : Sequence Identifcation Number) 2로서 서열리스트에 나타나 있다.
pgaII의 프로모터 영역은 서열확인번호 2와 함께 상기 DNA 서열의 위치 1357까지 확장되어 있다. prepro-PGII의 리더펩타이드에 대한 암호화 영역은 위치 1357부터 위치 1437까지 걸쳐 있다. 시그날 펩타이드는 뉴클레오타이드 1357로부터 1419까지에 의해 암호화되어 있다. 온전한 PGII에 대한 암호화 영역은 위치 1438 부터 위치 2494까지에 이른다. 그 다음에는 위치 2499에서 출발하는 전사 터미네이터 영역이 뒤따른다.
8.6Kbp 길이의 pGW1900의 에어. 나이거 N400 삽입체(참조 제3도)는 제3도에 나타낸 바와 같이 유전자 위치 1중의 BamHI 위치부터 대략 유전자 지도 위치 8600까지 걸쳐 있다. 지도 위치 약 6280 부터 약 3880 까지 걸쳐 있는 DNA 서열은 서열확인번호 1의 서열 리스트 중에 주어져 있다.
8.6Kbp 삽입체의 프로모터 영역은 서열확인번호 1과 함께 DNA 서열 위치 910까지 걸쳐 있다. prepro-PGI의 31개 아미노산 길이의 리더 펩타이드에 대한 암호화 영역은 위치 910부터 위치 1002까지 걸쳐 있다. 시그날 펩타이드는 910 내지 963 사이의 뉴클레오타이드에 의해 암호화되어 있다. 온전한 PGI에 대한 암호화 영역은 이치 1003에서 출발하여 2127까지 걸쳐 있다. 전사 터미네이터 영역은 위치 2131에서 시작된다.
pGW1900 또는 pGW1800의 에이. 나이거 N400 삽입체로 부터 유래된 PGI 또는 PGII를 암호화하는 DNA 서열은, 동질적 조건하에서 각각 PGI 또는 PGII 유전자의 암호화 영역 또는 에이. 나이거 N400으로부터 유래된 이들 단편의 암호화 영역과 하이브리드화 된다. 최소한 에이. 나이거 N400 PGI 또는 PGII 암호화 영역과 부분적으로 동질적이고 PG 활성을 갖는 단백질을 암호화한 DNA 서열은 PG 유전자 부류의 구성원이다. 단지 부분적으로만 동질성인 DNA 서열은 동질적 조건보다 덜 엄격한 소위 이질성 조건하에서 에이. 나이거 N400 PGI 또는 PGII 유래된 서열과 하이브리드화한다. 단지 이질적 조건 하에서만 하이브리드화하는 PG 유전자 부류의 구성원은 PGI 또는 PGII 유전자 이외의 에이. 나이거 N400의 다른 PG 유전자일 수 있거나, 에이. 나이거 N400이 아닌 PG 생성 진균 균주의 PGI, PGII 또는 상이한 PG 유전자일 수 있다. 이러한 진균 균주는 예를 들어, 아스퍼질러스종(예: 에이. 자포니쿠스, 에이. 오리재, 에이. 니둘란스) 또는 N400 이외의 에이. 나이거 균주, 트리코데마종, 보트리티스종, 스클레로티니아종, 푸사리움 종 또는 식물 병원성 진균류 뿐만 아니라 효모 예를 들어, 케이. 플라질리스(Kluyveromyces fragils)와 같은 PG 생성 클루이베로마이세스 종으로부터 유래될 수 있다. 이런 균주의 바람직한 예는 에이. 나이거 NW756이다. 따라서, 본 발명에 따른 PG 유전자는 우선적으로는 아스퍼질러스 종으로부터 유래된 것, 보다 우선적으로는 에이. 나이거, 가장 우선적으로는 균주 N400 또는 NW756으로부터 유래된 PGI, PGII, PGIIIA, PGIIIB, PGIV 및 다른 PG들을 암호화한 유전자를 포함 하지만, 다른 PG 생성 진균 균주로부터 유래된 것도 포함하고 있다. PG 유전자 부류의 구성원을 PG 유전자로 부른다.
PG 유전자 부류의 구성원 단백질 생성물에는 효소(갈락투로나제)가 포함되며 이는 갈락투로네이트를 함유하는 올리고- 또는 다당류를 분해시키는데, 올리고갈락투로나제, 람노갈락투로나제 또는 특히 폴리갈락투로나제가 이에 포함된다.
통상적인 하이브리드화 과정은 문헌[참조: Benton and Davis(참조 문헌 7)]에 기술되어 있다. 동질적 및 이질적 하이브리드화 조건은 이후에 상세히 기술한다.
본 발명의 신규한 DNA 서열과 관련하여 사용된 용어 유도체는 플랭킹 서열들인 상기 DNA 서열 및 돌연변이체의 단편 특히, 인위적 돌연변이체의 단편을 포함하는 보다 큰 유도체를 포함하는 것으로 의도된다.
신규한 DNA 서열의 보다 큰 유도체들은 에이. 나이거 게놈으로부터 절단해낼 수 있는 것들이며, 폴리갈락투로나제 활성을 지니는 폴리펩타이드를 암호화하고, PGW1800 또는 PGW1900의 에이. 나이거 DNA 삽입체와 동일하거나 상이한 프로모터, 시그날 및/또는 전사 터미네이터 서열을 함유할 수 있는 PGW1800 또는 PGW1900의 아스퍼질러스 나이거 DNA 삽입체에 포함된 온전한 PGII 또는 PGI를 암호화한 영역과 하이브리드화된 DNA 서열을 포함한다. 이런 유도체들은 핵산을 단편화시키고, 이 단편을 적절한 제한 효소인 EcoRI, BamHI 또는 HindIII로 처리하고, 다시 적절한 벡터인 λ파지 또는 플라스미드 pBR322에 연결시키고 이. 콜라이 내로 클로닝시키며 적절한 제한 효소로 절단하여 수득한 에이. 나이거 N400 또는 NW756의 게놈성 라이브러리에서 발견할 수 있다.
이질성조건하에서 에이. 나이거 N400 PGI 또는 PGII 유전자의 암호화 영역과 하이브리드되는 DNA 서열 유도체의 바람직한 예는 λPG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35, -B36, -C1, -C16, -C20, -C37. -D8, -D11. -D12, -E6, -E38, -F5 -G17, -G27, -X31 및 =Y33, pGW1756 및 pGW1910 로 이루어진 벡터 그룹으로부터 선택된 벡터의 삽입체 또는 이의 단편이다. 후자의 하나는 λPG-C20으로부터 유래된 에이. 나이거 NW400 PGC를 암호화하는 구조 유전자 pgaC를 포함한다. pGW1756(제6도)은 에이. 나이거 N400 PGII 유전자와 다른 제한 분해 패턴 및 DNA 서열(참조:서열확인번호 3)을 나타내는 에이. 나이거 NW756 유래된 PGII 유전자를 함유한다. 따라서, 균주 NW756 및 N400은 서로 밀접하게 연관되어 있는 것은 아니며 사상진균의 서로다른 종인 것으로 여겨진다. 그러므로, 에이. 나이거 N400 PGI 또는 PGII 구조 유전자는 특히 이질적 조건하에서도 다른 종의 PG 유전자와 특이적으로 하이브리드될 수 있다.
플라스미드 pGW1756은 약 4000bp 길이의 pEMBL18 벡터 단편 약 5500bp 길이의 에이. 나이거 NW756 DNA 단편으로 구성되어 있다. PGII를 암호화한 유전자 pgaII는 약 3300bp 길이의 HincII 제한 단편내에 위치한다. pGW1756은 DSM에 기탁하였다.
서열확인번호 3을 갖는 DNA 서열내 889번 뉴클레오타이드까지 연장된 에이. 나이거 NW756 pgaII의 프로모터 영역은 서열 리스트 중에 나타내었다. prepro-PGII의 리더 펩타이드를 암호화한 영역은 위치 890 부터 970까지 걸쳐 있으나 시그날 펩타이드는 890 내지 952번 뉴클레오타이드에 의해 암호화되어 있다. 온전한 단백질을 암호화하는 영역은 뉴클레오타이드 971부터 시작하여 위치 2028에서의 정지 코돈에서 끝나며 하나의 인트론을 함유하는 것 같다. 암호화 영역 뒤에는 위치 2031에서 출발하는 전사 터미네이터 영역이 있다.
플라스미드 pGW1910(제7도)은 λPG-C20으로부터 유래된 약 7800bp 길이의 삽입체 및 벡터 pUC9으로 이루어져 있다. 에이. 나이거 N400 삽입체내에는 폴리갈락투로나제 유전자 pgaC가 위치해 있다. 거의 전체 pgaC 유전자의 DNA 서열이 다음 서열확인번호 4의 서열 리스트에 나타나 있다.
에이. 나이거 N400 pgaC의 프로모터는 663번 뉴클레오타이드 전방까지 뻗쳐 있다. pgaC에 의해 암호화된 prepro-PG의 리더 펩타이드는 대략 663번 뉴클레오타이드로부터 782번 뉴클레오타이드까지 걸쳐 있으며 시그날 펩타이드를 암호화하고 있는 663번 내지 710번 DNA 서열을 포함하고 있다. 완전한 PG는 783번부터 1995번 뉴클레오타이드까지 걸쳐있는 서열에 의해 암호화되어 있고 여러가지 인트론을 포함한다. 전사 터미네이터 영역은 1999번 위치에 있는 종결 코돈후 부터 시작된다.
본 발명에 포함되는 하이브리드화 DNA 서열의 유도체들은 pGW1800 또는 pGW1900에서와 동일한 프로모터, 시그날 및/또는 전사 터미네이터 서열을 포함하거나 또는 폴리갈락투로나제 유전자 부류의 다른 유전자로부터 유래될 수 있는 다른 프로모터, 시그날 및/또는 전사 터미네이터 서열을 포함한다. 또한, 다른 어떤 프로모터, 시그날 및/또는 전사 터미네이터 서열은, 목적하는 PG가 발현되는 숙주에 따라서, 하이브리드화 DNA 서열에 결합할 수 있다.
다양한 프로모터 시그날 펩타이드 및 전사 터미네이터가 사용될 수 있다. 프로모터들은 통상적으로 원핵, 진핵 생물 및 바이러스 유전자의 5' 비암호화 영역으로부터 유용하지만, 전사 터미네이터는 3' 비암호화 영역으로부터 유용할 수 있다. 시그날 서열은 세포내의 분비 경로로 도입된 프레 단백질(preprotein)의 5' 암호화 영역에서 수득할 수 있다. 프로모터의 예는 다음에 예로 들고 있다.
본 발명과 관련한 시그날 서열은 본 발명의 prepro-PG의 시그날 펩타이드 또는 리더 펩타이드를 암호화한 DNA 서열이다.
본 발명에 따른 의미에서 플랭킹 서열은 또한 DNA 단편이며 이는 게놈 중에서 PG 유전자를 플랭킹하는 서열로부터 유래된 것은 아니다. 이러한 플랭킹 서열은 예를 들어, 조절 기능 즉, 프로모터 기능을 가지며, 폴리펩타이드 즉, 구조 유전자를 가지거나 또는 조절 서열과 구조유전자를 정확한 판독프레임 또는 거리내에 있도록 하는 링커, 또는 발현 플라스미드의 작제에 사용되는 파아지나 플라스미드와 같은 벡터로 부터 유래된 서열이다. 이러한 플랭킹 서열은 발현 카세트 또는 융합 유전자를 생성시킬 수 있다.
신규한 DNA와 관련하여 사용할때 단편(fragment)이란 커다란 유도체의 단편을 포함하는 것, 특히 프로모터, 시그날, 구조 또는 전사 터미네이터 기능을 가지는 것들을 포함한다. 이들은 2개의 제한 부위사이까지 연장될 수 있다.
바람직한 DNA 단편들은 prepro-PG의 리더 또는 시그날 펩타이드를 암호화하거나 또는 폴리갈락투로나제 활성을 가진 폴리펩타이드를 암호화한 프로모터 영역을 함유하거나 또는 전사 터미네이터 영역을 함유한 것들이다. 따라서, 본 발명의 DNA 서열은 또한 상기 단편의 어떠한 조합 즉, 프로모터 및/또는 리더 또는 시그날 펩타이드 및/또는 PG 및/또는 전사 터미네이터 등을 암호화한 영역들을 포함한 것들이다.
PG 프로모터 영역을 포함하는 단편은 DNA 서열 내에서 prepro-PG 구조 유전자 전방에서 약 2000까지 걸쳐 있으며, 바람직하게는 약 500 내지 1400 뉴클레오타이드 상부까지 달해 있다. 프로모터 영역은 RNA 폴리머라제 뿐만 아니라 조절 단백질에 결합한다.
PGI 유전자의 프로모터 영역을 포함하고 있는 단편 pgaI은 예를 들어, 서열 확인번호 1 서열의 1번부터 909번 위치까지 확장되어 있다. 에이. 나이거 N400의 PGII 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 단편 pgaII은 예를 들어, 서열확인 번호 2 서열의 위치 1부터 1356번 위치까지에 걸쳐 있다. pGW1756의 에이. 나이거 NW756 삽입체 중에서 pgaII의 프로모터 영역을 함유하는 단편은 예를 들어, 서열확인번호 3 서열의 1번부터 889번 위치까지 걸쳐 있다. pGW1910의 에이. 나이거 삽입체내에서, pgaC의 프로모터 영역을 함유하는 단편은 서열확인번호 4 서열의 1번부터 662번 위치까지에 걸쳐 있다.
prepro-PG의 리더 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 단편은 예를 들어 프로모터의 끝부터 온전한 단백질을 암호화한 서열의 시발점까지 사이에 존재한다. 시그날 펩타이드에 대한 암호화 영역은 상응하는 리더 펩타이드의 것보다 짧다. 이는 또한 프로모터의 말단에서 출발하여 시그날 펩티다제 분해 위치에 대한 암호화 영역에 이른다. 에이. 나이 N400 prepro-PGII에서 리더 팹타이드는 27개 아미노산을 함유한다. 리더 펩타이드를 암호화한 DNA 단편은 서열확인번호 2 서열의 예를 들어, 1357번 위치의 ATG 코돈으로부터 DNA 서열의 1429번 위치에 있는 XhoI 분해 위치에 까지 이른다. prepro-PGI에서 리더 펩타이드는 31개의 아미노산을 지닌다. 이 리더 펩타이드를 암호화한 DNA 단편은 예를 들어 서열확인번호 1의 DNA 서열의 910번 내지 1002번 위치 사이에 위치한다. 에이. 나이거 NW756 prepro-PGII의 리더 펩타이드는 27개의 아미노산을 가지고 있으므로 리더 펩타이드를 암호화한 DNA 단편은 서열 확인번호 3 서열의 DNA 서열 내에서 889번 내지 971번 위치 사이에 위치한 81-bp 길이의 DNA 단편이다. 에이. 나이거 N400의 pgaC 생성물의 약 40개 아미노산 리더 펩타이드를 암호화한 DNA 단편은, 서열확인번호 4 서열의 663번 내지 782번 위치에 이른다.
각각의 시그날 펩타이드를 암호화한 영역은 다음의 DNA 단편상에 위치한다; 서열확인번호 1중 염기 911번 내지 963번 사이, 서열확인번호 2중 1358번 내지 1419번 사이, 서열확인번호 3중 890번 내지 952번 및 서열확인번호 4중 663번 내지 710번 사이.
온전한 PGI에 대한 전체 암호화 영역을 함유하는 단편은, 예를 들어, 서열확인번호 1 서열의 1003번 부터 2127번 위치에 달한다. 에이. 나이거 N400 PGII에 대한 전체 암호화 영역을 함유하는 단편은, 예를 들어, 서열확인번호 2 서열의 1430번부터 2497번 위치에 까지 달한다. 온전한 에이. 나이거 NW756 PGII는, 예를 들어, 서열확인번호 3 서열의 953번 내지 2027번 위치에 걸친 DNA 단편에 의해 암호화되어 있으며, 온전한 pgaC 유전자 생성물은 예를 들어, 서열확인번호 4 서열의 염기 782번 및 1996 사이에 위치한 DNA 단편에 암호화되어 있다. 그러나, 보다 짧은 단편 또한, PG 활성을 유지하는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
PGII 또는 PGI 뿐만 아니라 다른 PG들의 구조유전자들은, 다른 다수의 진균 유전자와 같이 인트론을 함유할 수도 있다. 그러나, 본 발명의 범위에 포함된 것은 인트론 없는 PG의 구조 유전자이다. 즉, 이러한 것들은 게놈성 DNA 서열로서 인트론을 함유하지 않으며 또한 이들은 cDNA로부터도 수득할 수 있다.
전사 터미네이터 영역을 함유하는 단편은 예를 들어, PG에 대한 암호화 영역의 말단에 있는 정지코돈(즉, TAA, TAG 또는 TGA)으로부터 300 내지 2000개, 우선적으로는 하부 방향으로 약 500 내지 1000개 염기쌍에 이른다.
이러한 단편은 예를 들어, 서열확인번호 1 서열의 염기 위치 2131번에서 2495번에 까지, 서열확인번호 2 서열의 2498번에서 3031번까지, 서열확인번호 3 서열의 2031번에서 3047번까지 및 서열 확인번호 4 서열의 1999번에서 2304번까지에 이른다.
그러나, 전술한 단편들은 천연적으로 5' 플랭킹된 서열까지 연장되거나 또는 5' 또는 3' 말단에서 단축될 수 있고 그럼에도 불구하고 프로모터 또는 전사 터미네이터 활성을 유지할 수 있거나 또는 암호화된 펩타이드가 시그날 펩타이드 또는 갈락투로나제 활성을 지닐 수 있다. 이런 단편들 역시 본 발명의 범주에 속한다.
지금까지의 단편들은 링커를 함유하거나 또는 링커에 의해 플랭킹될 수 있으며, 이러한 링커는 다른 DNA 분자에 대한 성공적인 연결을 제공하고/하거나, 조절기능을 가졌거나 프로모터 및 구조 유전자 등을 암호화한 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 단편을 정확한 판독프레임 또는 판독거리내 있도록 한다.
상기 단편에 대해 적합한 링커들은, 단편이 연결될 DNA의 제한 부위에 끼워지는 DNA 서열을 지닌다. 이들은 예정된 제한 부위를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 서열의 돌연변이체는 천연적으로 발생하는 돌연변이체이다. 본 발명은 또한, 유사하거나 동일한 소수성 프로필을 가지는 시그날 또는 리더 펩타이드 영역을 암호화한 천연 또는 합성 돌연변이체를 함유하는데, 여기에서 극성 아미노산인 히스티딘(Hδ+), 티로신(yδ-) 및 아르기닌(Rδ+)에 대한 코돈은 유사한 극성을 띤 다른 아미노산으로 대체되어 있고, 소수성 아미노산 알라닌(A), 루이신(L) 및 트레오닌(T)들은 다른 소수성 아미노산에대한 코돈으로 대체되었다. 예를 들어, 양으로 하전된 티로신에 대한 코돈은 아르기닌에 대한 코돈으로(또는 그의 역으로) 대치되었으며, 음으로 하전된 티로신에 대한 코돈은 글루타메이트 또는 아스파르테이트로 대체되고/되거나 트레오닌, 프롤린, 발린, 이소루이신, 루이신, 메티오는 또는 페닐알라닌 등에 대한 코돈중 하나로 비극성, 소수성의 알라닌에 대한 코돈을 대체시켰다.
본 발명에 따른 재조합 DNA 분자는 또한, 무제한 수의 뉴클레오타이드가 이들이 암호화한 아미노산 서열에 변화를 일으키지 않는 다른 뉴클레오타이드에 의해 대치된다는, 유전암호 측면의 의미내에서 변성된, DNA 서열을 포함한다. 이러한 변성된 DNA 서열은 이들의 서로 상이한 제한 부위 또는 특정 숙주에서의 바람직한 코돈 사용으로 인해 유용할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 DNA 분자는 바람직하게는 pGW1800, pGW1900, pGW1750, pGW1910, λPG-A9, λPG-A10, λPG-A43, λPG-B4, λPG-B35, λPG-B36, λPG-C1, λPG-C16, λPG-C20, λPG-37, λPG-D8, λPG-D11, λPG-D12, λPG-E6, λPG-E38, λPG-F5, λPG-G17, λPG-C27, λPG-X31 및 λPG-Y33으로 이루어진 하이브리드 벡터의 그룹에서 선택된 하이브리드 벡터의 에이. 나이거 DNA 삽입체를 함유하거나, 또는 PG 유전자이 프로모터 영역, 또는 시그날 펩타이드, 리더 펩타이드, prepro-PG, PG 또는 폴리갈락투로나제 활성을 가지는 PG의 잔편을 암호화한 영역 또는 PG 유전자의 전사 터미네이터 영역을 함유하는 이의 단편을 함유한다. 삽입체 자체도 본 발명으로 커버된다.
본 발명은 또한, 프로모터 영역, 리더 또는 시그날 펩타이드, 본 발명에 따른 구조 유전자 및/또는 전사 터미네이터 영역을 암호화한 DNA 단편을 포함하는 발현 카세트인 재조합 DNA 분자, 바람직하게는 상기 언급한 벡터의 그룹으로부터 선택된 벡터로부터 유래된 재조합 DNA 분자에 관한 것이다.
발현 카세트란 용어는 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있으며 프로모터, 필요에 따라 시그날 서열, 추가로 구조 유전자, 필요할 경우, 전사 터미네이터 및 임의로 전사 인헨서, 라이보좀 결합 부위 및/또는 추가 조절 서열을 포함하는 DNA 서열을 의미한다.
본 발명의 발현 카세트 중에서, PG 유전자 기원 작용성 단편은 다른 유전자로부터 유래된 작용성 단편들과 결합할 수 있다.
다양한 프로모터 서열들이 숙주세포의 특성에 따라 사용될 수 있다. 강하고 동시에 잘 조절되는 프로모터가 가장 유용하다. 해독 개시를 위한 서열은 예를 들어, 샤인-달가노 서열(Shine-Dalgarno)이다. 전사의 개시와 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열은, 통상적으로 각각 바이러스 또는 진핵세포 cDNA(예를 들면, 발현숙주로부터)의 비암호화 5'-영역 및 3'-영역으로부터 활용할 수 있다.
프로모터의 예로는 λPL, λPR, 이. 콜라이 Iac, trp, tac, 효모 TRP 1. ADHI-, ADHII-, PHO3-, PHO5- 또는 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포푸락토 키나제, 글루코시-6-인산 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제 유전자와 같은 당분해성 프로모터 또는 SV40, Rous 육종 바이러스, 아데노 바이러스2, 소 유두종 바이러스, 파포바바이러스 등의 진핵성 바이러스로부터 기원된 프로모터, 거대 세포증 바이러스 유래된 프로모터 또는 포유동물 세포(액틴, 콜라겐, 미오신 또는 β-글로빈 유전자)기원 프로모터가 있다. 진핵세포성 프로모터는 효모 상부 활성화 서열(UAS) 또는 사이토메갈로바이러스 IE 인헨서와 같은 바이러스성 또는 세포성 인헨서, SV40 인헨서, 면역글로불린 유전자 인헨서 또는 기타의 인헨서 서열과 결합할 수 있다.
인헨서는 예를 들면, 시미안 바이러스, 폴리오마바이러스, 소 유두종 바이러스 또는 원숭이 육종 바이러스로 부터 유래하거나 또는 게놈성 기원의 전사-촉진 DNA 서열이다. 인헨서 서열은 파사룸 폴리세팔룸(Physarum polycephalum(PCT/EP 8500 278)의 염색체의 리보좀 DNA로부터 유래될 수 있거나, 또는 산 포스파타제 PH05유전자(EP Appl, No. 86 111 820.6) 또는 PG 05, trp, PH05-GAPDH 하이브리드(Ep Appl, Mo. 86 111 820.6) 또는 기타 프로모터로 부터의 상부 활성화 부위일 수 있다.
시그날 서열은 예를 들어, 프레서열(pesequence) 또는 폴리펩타이드 등을 분비하도록 지시하는 분비 리더일 수 있다. 예를 들어, 시그날 서열은 prepro-PGI, prepro-PGII 또는 prepro-PGC의 시그날 서열 또는 리더 펩타이드이다. 또 다른 시그날 서열들은 문헌에 공지되어 있다[참조 문헌: von Heijne, G., Nucleic Acid Res. 14. 4683 (1986)].
이런 관점에서 PGI 또는 PGII를 암호화한 것을 제외하고, 구조 유전자들은 다른 PG를 암호화한 것, PG 활성 또는 다른 아스퍼질러스 유전자를 갖는 이의 유도체, 특히 단편 및 바이러스, 원핵 또는 진핵세포로부터 기원하며, 게놈성 DNA 또는 mRNA를 통해 제조된 cDNA로부터 유래되거나 또는 화학적으로 합성될 수 있고, 예를 들어, 영양물질 및 화학에서 효소반응을 수행하기 위한 목적에 사용될 수 있는 효소와 같은, 고등 진핵, 특히 포유동물 (예: 동물 또는 특히 사람) 기원의 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 또는 예를 들어, 호르몬, 면역 조절기능을 갖는 폴리펩타이드, 항바이러스 및 항망 특성, 항체, 바이러스 항원, 백신, 응괴 인자, 식품 등과 같이 사람 및 동물질환의 치료 또는 이의 예방에 유용한 폴리펩타이드를 포함하는 광범위하게 유용한 폴리펩타이드를 암호화하는 구조유전자이다.
이런 구조 유전자의 예로서는 세크레틴, 티모신, 릴렉신, 칼시토닌, 황체형성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 아드레노코르티코트로핀, 멜라닌세포-자극 호르몬, β-리포트로핀, 우로가스트론 또는 인슐린과 같은 호르몬; 표피 생장 인자, 인슐린-유사 생장인자(IGF 즉, IGF-I 및 IGF-II), 유방 세포생장인자, 신경생장인자, 글리아 유래된 신경세포생장인자 또는 TGFβ와 같은 형질전환 생장 인자(TGF)와 같은 생장인자; 사람 또는 소의 성정호르몬과 같은 성장호르몬; 인터루킨-1 또는 -2와 같은 인터루킨; 사람 대식세포 이동 억제인자(MIF); 사람 α-인터페론(예를 들어, 인터페론-αA, αB, αD 또는 αF), β-인터페론, γ-인터페론 또는 하이브리드 인터페론(예를 들면, αA-αD 또는 αB-αD-하이브리드 인터페론), 특히 하이브리드 인터페론 BDBB와 같은 인터페론; α1-안티트립신, SLPI등과 같은 프로테이나제 억제제; B형 간염 바이러스 표면 항원, B형 간염 바이러스 핵 항원, A형 간명 바이러스 항원 또는 비A-비-B형 간염 항원과 같은 간염 바이러스 항원; 조직 플라스미노겐 활성화제 또는 우로키나제와 같은 플라스미노겐 활성화제; 종양괴사인자; 소마토스틴; 레닌; β-엔돌핀; 면역글로불린 D, E 또는 G의 경쇄 및/또는 중쇄, 또는 사람-마우스 하이브리드 면역글로불린과 같은 면역글로불린; 면역글로불린 E-결합인자와 같은 면역글로불린 결합인다; 칼시토닌; 사람 칼시토닌-관련된 펩타이드; 인자 IX 또는 VIIIc와 같은 혈액 응고 인자; 에리트로포이에틴; 에글린 C와 같은 에글린; 히루딘; 데설페이토히루딘 변이체, HV1, HV2, 또는 PA와 같은 데설페이토 히루딘; 사람 슈퍼옥사이드 디스뮤타제; 바이러스 티미딘키나제; β-락타마제, 글루코스 이소머라제 등을 암호화한 유전자 등이 있다. 바람직한 유전자들은 사람 α-인터페론 또는 하이브리드 인터페론 특히, 하이브리드 인터페론 BDBB, 사람 조직 플라스 미노겐 활성화제(t-PA), B형 간염 바이러스 표면 항원(HBVsAg), 인슐린-유사 생장 인자 I 및 II, 에글린 C 및 데설페이토히루딘(예: 변이체 HV1)등을 암호화한 유전자이다. 본 발명의 하이브리드 벡터 중에서, 본 발명의 프로모터 및/또는 시그날 서열은 폴리펩타이드 암호화 영역에 작동 가능하게 연결되어 효과적으로 폴리펩타이드를 발현하도록 한다.
본 발명은 또는 재조합 벡터이며 별도로 하이브리드 벡터로 부르는,
a) pGW1800 또는 pGW1900의 에이. 나이거 DNA 삽입체,
b) a)의 DNA 삽입체가 함유하고 있는 온전한 PGII 또는 PGI에 대한 암호화 영역과 하이브리드된 DNA 서열,
c) a) 또는 b)에서 규정된 DNA 서열의 유도체 또는
d) 온전한 PG 또는 이의 시그날 펩타이드 또는 리더 펩타이드를 암호화하며 유전암호의 의미내에서 변성된 상기 a), b) 또는 c)의 DNA 서열 중에서 선택된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다.
이들은 세균, 진균 또는 동물세포와 같은 숙주 내에서의 클로닝 및/또는 발현에 유용하다.
이러한 하이브리드 벡터들은, 바이러스, 파아지, 코스미드, 플라스미드 또는 염색체 DNA로부터 유래된 유전 공학 분야에서 유용한 모든 벡터, 즉, SV40의 유도체, 헤르페스-바이러스, 유두종 바이러스, 레트로바이러스, 바쿨로바이러스, 파지λ(NM989 또는 EMBL4) 또는 BamHI 분해로 선형화한 파아지 M13(M13mp8 파지 DNA)(참조 문헌 15)의 유도체; 세균 플라스미드(pBR322, pUC18) 또는 효모 플라스미드(효모 2μ 플라스미드) 또는 아스퍼질러스종(에이. 나이거)과 같은 사상진균으로부터 유래된 염색체 DNA(예: EP 184 438에 의해 제공된 것); 또는 결핍성 바이러스, 파아지 또는 플라스미드의 복제를 허용하는 헬퍼 바이러스 파아지 또는 플라스미드의 존재하에서의 상기 결핍성 바이러스, 파아지 또는 플라스미드[예: M14K07 헬퍼 파아지 존재 하의 M13(+)KS벡터]와 같이 유전공학의 분야에서 유용한 어떤 벡터로부터 유래될 수도 있다.
본 발명의 하이브리드 벡터들은 적절한 숙주 중에서 염색체외성 성분으로서 또는 숙주 염색체내의 통합에 의해, 목적하는 DNA를 복제 및 임의로 발현시킬수 있다. 본 발명의 클로닝된 DNA의 통합 및 발현에는 여러가지 가능한 벡터 시스템이 유용하다. 원칙적으로, 선택된 숙주 중에서 본 발명의 발현 카세트 중에 포함된 목적하는 폴리펩타이드 유전자를 복제하고/하거나 발현시키는 모든 벡터들이 적합하다. 벡터는 형질전환에 상정된 숙주세포에 따라 선택된다. 일반적으로, 이러한 숙주 세포는 세균 또는 진균(예: 효모 또는 사상 진균)과 같은 원핵 또는 진핵 미생물, 또는 예를 들어 척추동물(예: 포유동물 세포)와 같은 고등진핵세포 기원의 세포일 수 있다. 하기에 적절한 숙주세포가 언급될 것이다. 원칙적으로, 본 발명의 하이브리드 벡터들은 상기 정의한 바와 같은 DNA, 복제 오리진 또는 자체적으로 복제되는 서열, 우성 마커 서열, 임의로 목적하는 DNA의 전사 및 해독, 임의로, 목적하는 생성물 분비에 필수적인 발현 조절 서열 및 임의로 추가의 제한부위를 포함한다.
복제 또는 자발적으로 복제되는 서열의 오리진(염색체외성 성분에 자발적으로 복제하는 능력을 부여하는 DNA 성분)은 시미안 바이러스(SV40) 또는 다른 바이러스원으로부터 유래된 것과 같은 외인성 오리진을 포함하는 벡터의 작제에 의해서 또는 숙주세포 염색체성 기작에 의해 제공된다.
본 발명의 발명 분자의 하이브리드 벡터는 형질전환, 선별 및 클로닝될 숙주에 따라 선택적인 마커를 함유할 수 있다. 마커의 표현형 발현에 따른 형질전환체의 선별을 촉진하는 어떠한 마커 유전자라도 사용될 수 있다. 적절한 마커들은 특히 항생제 내성(예: 테트라사이클린 또는 암피실린내성)을 발현하는 것 또는 영양 요구성 진균 돌연변이체의 경우, 숙주 장애를 보충하는 유전자이다. 상응하는 유전자들은 예를 들어, 항생제 사이클로헥시마이드에 대한 내성을 부여하거나 또는 영양 요구성 효모 돌연변이체에 있어서 독립 영양성을 제공하며 예로는 ura3, leu2, his3 또는 trp1 유전자가 있다. 만일 형질전환될 숙주가 마커에 의해 발현되는 생성물에 대해 영양 요구성이라면 자발적으로 복제되는 단편과 관련된 구조 유전자를 마커로 사용하는 것 또한 가능하다.
특히 중요한 것은, 엔. 크라사 pyr4 유전자(참조 문헌 27)에 동질적인 에이. 나이거 또는 에이. 니둘란스(EP 184 438) 또는 에이. 니둘란스 DNA 단편으로부터 유래된, 오르니틴 카바모일 트랜스퍼라제를 암호화한 argB 유전자와 같은, 에이. 나이거 숙주 장해에 보충적인 마커 유전자들이다.
본 발명의 바람직한 양태들은, 구조 유전자 및/또는 프로모터 및/또는 리더 또는 시그날 펩타이드를 암호화한 DNA 서열 및/또는 본 발명의 PG 유전자로부터 유래된 전사 터미네이터 등을 함유하는, 본 발명에 발현 카세트를 포함하는 하이브리드 벡터들이다.
본 발명의 발현카세트를 포함하는 하이브리드 벡터들의 예에는 pGW1800, pGW1900, pGW1910, pGII-IFN AM119, pGIIss-IFN AM119, pGW1756, λPG-A10, λPG-A43, λPG-D8 및 λPG-D11 등이 있다.
본 발명의 주제는 상기 정의한 PG 유전자 유래 삽입체를 포함하는 재조합 DNA 분자뿐 아니라 PG 유전자 또는 이의 작용성 단편을 포함하는 DNA 분자 즉, 프로모터를 포함하며, 시그날 팹타이드, 리더 펩타이드 또는 PG 활성을 갖는 단백질 또는 아스퍼질러스종[에이. 자포니쿠스(A. japonicus), 에이. 오리재(A. oryzae), 에이. 니둘란스(A. nidulans), 에이. 나이거(A. niger)], 트리코데마종(Trichoderma spec.), 보트리티스종(Botrytis spec.), 스클레로티니아종(Sclerotinia spec.), 푸사리움종(Fusarium spec.) 또는 기타 식물병원성 진균 및 효모[예: PG를 생성하는 클루이베로마이세스종(Kluyveromyces spec.) 예를 들면, 케이. 프라질리스(K. frahilis)]로부터 분리될 수 있는 전사 터미네이터 영역을 포함하는 DNA 분자에 있다.
단편을 포함한 본 발명의 DNA 분자 및 이의 유도체는, 또다른 유사한 DNA 또는 mRNA에 대한 DNA 유전자 라이브러리 또는 mRNA의 스크리닝에 사용될 수 있다.
[재조합 DNA 분자의 제조방법]
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 재조합 DNA 분자를 사용하여 형질전환시킨 숙주를 배양하거나 또는 시험관내에서 제조함을 포함하는 상기 정의한 재조합 DNA 분자의 제조방법에 관한 것이다.
숙주의 배양은, 형질전환체(즉, 선별 마커와 함께 목적하는 DNA 분자를 함유하는 숙주)를 비-형질전환체(즉, 목적하는 DNA 분자가 결핍된 숙주)로부터 음성 또는 양성 선별을 허용하는 화합물을 보충하거나 결핍시킬 수 있는 통상적인 영양배지 중에서 수행한다.
예를 들어, 세균(이. 콜라이), 진균[사카로마이세스 세레비지에, 클로이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)] 또는 아스퍼질러스[에이. 니둘란스, 에이. 오리재, 에이. 카보나리우스(A. carbonarius), 에이. 아와모리(A. awamori) 및 특히 에이. 나이거]와 같은 특정 사싱진균 등의 모든 형질전환 가능한 숙주가 본 기술에 사용될 수 있다. 바람직한 숙주는 하기에 기술된 바와 같이 pyrA 유전자가 결여된 돌연변이인 에이. 나이거 An8 또는 에이. 나이거 N593이다. 상기 숙주의 형질전환은 통상적 방법으로 수행한다.
본 발명의 재조합 DNA 중에 포함된 DNA 서열은 폴리갈락투로나제를 발현시키는 진균의 게놈으로부터 수득할 수 있거나, 또는 예를 들어, 본 발명의 재조합 DNA를 사용하여 형질전환시킨 숙주와 배양시키거나, 필요한 경우 이로부터 목적하는 DNA 서열을 분리하거나 또는, 뉴클레오타이드 축합을 통한 화학합성으로 제조할 수 있다.
특히, 상기 DNA는
a) 적절한 진균세포로부테 게놈성 DNA를 분리하고 예를 들어, DNA 프로브 또는 적절한 발현 시스템을 사용하고 원하는 폴리펩타이드의 발현을 위해 스크리닝하여 목적하는 DNA를 선별하거나 또는.
b) 적절한 진균세포로부터 mRNA를 분리하고, 예를 들어, DNA 프로브와 하이브리드화시키거나 또는 적절한 발현 시스템 중에서 발현시켜 목적하는 mRNA를 선별하고, 목적하는 폴리펩타이드의 발현을 위해 스크리닝시켜 상기 mRNA에 상보적인 일본쇄 cDNA를 제조한 후 그로부터 이본쇄 cDNA를 제조하거나 또는,
c) cDNA 라이브러리로부터 cDNA를 분리하고 예를 들어, DNA 프로브 또는 적절한 발현 시스템을 사용하여 목적하는 cDNA를 선별하고, 목적하는 폴리펩타이드의 발현을 위해 스크리닝 하고/하거나
d) a), b) 또는 c) 단계의 이본쇄 DNA를 적절한 벡터 내에 통합시키고,
e) 수득된 하이브리드 벡터로 적절한 숙주세포를 형질 전환시키고,
f) 형질전환되지 않은 숙주세포로부터 목적하는 DNA를 함유하는 형질전환된 숙주세포를 선별하고 필요한 경우. 형질전횐돤 숙주세포를 증식시키며,
g) 목적하는 DNA를 분리하고/하거나 이 DNA를 돌연변이체 또는 이의 단편으로 전환시켜 제조할 수 있다.
게놈성 DNA는 분리하여 목적 DNA에 대하여 스크리닝할 수 있다(단계 a), 게놈성 DNA는 PG 활성을 지닌 단백질을 발현하는 적합한 진균 균주로부터 분리한다. 게놈성 DNA 라이브러리는 적합한 제한 엔도뉴클레아제로 분해한 다음 설정된 방법에 따라 적절한 벡터내로 도입시킴으로써 제조한다. 게놈성 DNA 라이브러리는 후술되는 바와같이 DNA 프로브로 스크리닝하거나, 적절한 발현 시스템 내에서 발현시키고 수득한 폴리펩타이드를 통상적인 방법으로 스크리닝한다. 게놈성 라이브러리로부터 본 발명의 DNA 분자를 분리하는 상세한 설명은 이하에서 기술된다.
공지의 방법을 사용하여 적절한 세포로부터 폴리아데닐화된 mRNA(단계 b)를 분리한다. 분리 방법에는 예를 들면, 세척제 및 리보뉴클레아제 억제제 예를 들면, 헤파린, 구아니디늄 이소 티오시아네이트 또는 머캅토에탄올의 존재하에 균질화시키고 임의로는 염 및 완충 용액, 세척제 및/또는 양이온 킬레이트화제의 존재하에 적절한 클로로포름-페놀 혼합물로 mRNA를 추출한 다음 잔류하는 수성의 염-함유상으로부터 에탄올, 이소프로판올 등으로 mRNA를 침전시키는 과정이 포함된다. 분리된 mRNA는 염화세슘 구배에서 원심분리한 다음 에탄올 침전 및/또는 크로마토그래피법, 예를 들면, 친화성 크로마토그래피, 예를 들면 올리고(dT) 셀룰로스 또는 올리고(U)세파로스에서의 크로마토그래피에 의하여 더 정제할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 정제된 전체 mRNA는 예를 들면, 선형 슈크로스 구배중 구배 원심분리 또는 예를 들면, 아가로스겔에서의 적합한 크기별 분획화 컬럼상의 크로마토그래피에 의하여 크기별로 분획화된다.
목적 mRNA는 mRNA를 DNA 프로브로 직접 스크리닝하거나 적절한 세포 또는 무세포 시스템에서 해독시키고 수득한 폴리팹타이드를 스크리닝함으로써 선별할 수 있다.
목적하는 mRNA의 선별은 바람직하게는 DNA 하이드리드화 프로브를 사용하여 추가 해독 단계를 피함으로써 달성된다. 적합한 DNA 프로브는 17개 이상의 뉴클레오타이드로 이루어진 공지된 뉴클레오타이드 서열의 DNA, 예를 들면, 합성 DNA, 목적한 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA에서 유도된 cDNA, 또는 천연의 공급원 또는 유전공학처리된 미생물에서 분리된 인접한 DNA 서열을 포함하는 게놈성 DNA 단편이다.
합성 DNA 프로브는 후술되는 공지의 방법, 바람직하게는 고체상 포스포트리에스테르, 포스파이트 트리에스테르 또는 포스포르아미다이트법을 사용하는 단계적 축합, 예를 들면 포스포트 트리에스테르법에 의한 디뉴클레오타이드 커플링 단위의 축합에 의하여 합성된다. 이러한 방법은 문헌[참조: Y. IKe et al, Nucleic Acids Research 11. 477, 1983]에 기술된 적절한 축합 단계에서 보호된 형태의 2, 3 또는 4개의 뉴클레오타이드 dA, dC, dG 및/또는 dT, 또는 이의 상응하는 디뉴클레오타이드 커플링 단위의 혼합물을 사용하여 목적 올리고뉴클레오타이드 혼합물의 합성에 적용된다.
하이브리드화를 위해, DNA 프로브를 예를 들면, 익히 공지된 키나제 반응에 의하요 방사능 표지한다. 크기별로 분획화된 mRNA와 표지물을 함유하는 DNA 프로브와의 하이브리드화는 공지된 방법에 따라, 즉 보조제(예: 칼슘 킬레이트제, 점도 조절 화합물, 단백질, 비-동질성 DNA등)를 함유하는 완충액 및 염 용액중, 선별적인 하이브리드화에 유리한 온도 예를 들면, 0 내지 80℃, 예를 들면, 25 내지 50℃ 또는 65℃부근, 바람직하게는 하이브리드화 이본쇄 DNA 융점보다 20℃ 낮은 온도 부근에서 수행한다.
분획화된 mRNA는 세포, 예를 들면, 개구리 난모세포 또는 무세포 시스템 예를 들면, 망상적혈구 용해물 또는 밀 배 추출물내에서 해독시킬 수 있다. 수득된 폴리펩타이드는 효소 활성에 대하여 또는 천연 폴리펩타이드에 대하여 발생된 항체와의 반응(예: 면역 검정, 방사 면역검정, 효소 면역검정 또는 형광성 마커를 사용한 면역검정)으로 스크리닝 한다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 이와같은 면역검정 및 제조방법은 본 분야에 익히 공지되어 있고 이에 따라 적용된다.
선별된 mRNA 주형으로부터 일본쇄 상보성 DNA(cDNA)를 제조하는 방법은 일본쇄 DNA로부터 이본쇄 DNA를 제조하는 방법과 같이 본 분야에 익히 공지되어 있다. mRNA 주형을 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트, 임의로는 방사능 표지된 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트(반응 결과를 스크리닝할 수 있도록 하기 위하여), mRNA의 폴리(A)테일과 하이브리드화하는 올리고-dT 잔기와 같은 프라이머 서열 및 예를 들면, 조류 골수아구증 바이러스(AMV)의 역전사 효소와 같은 적합한 효소의 혼합물과 함께 배양한다. 주형 mRNA를 예를 들면 알칼리성 가수분해로 분해한 후, cDNA를 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 적합한 효소의 혼합물과 배양하여 이본쇄 DNA를 수득한다. 적합한 효소는 예를 들면, 역전사효소, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편 또는 T4 DNA 폴리머라제이다. 통상적으로는 일본쇄 cDNA에 의하여 자발적으로 형성된 헤어핀 루프 구조는 제2 본쇄의 합성을 위한 프라이머로서 작용한다. 이와같은 헤어핀 구조는 S1 뉴클레아제로 분해하여 제거한다. 달리는, 일본쇄 DNA의 3'-말단을 mRNA 주형의 가수분해 및 제2 cDNA 본쇄의 계속되는 합성에 앞서 단일 중합체성 데옥시뉴클레오타이드 테일로 먼저 연장시킨다.
이와 다른 방법으로, 이본쇄 cDNA는 cDNA 라이브러리로 부터 분리하고 목적 cDNA에 대하여 스크리닝한다(단계 c). cDNA 라이브러리는 전술한 바와같이 적절한 세포로부터 mRNA를 분리하고 이로부터 일본쇄 및 이본쇄 cDNA를 제조함으로써 작제된다. 본 cDNA를 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여 설정된 방법에 따라 λ파아지, 예를 들면 λ샤론(charon) 4A 또는 λgtII에 도입시키나. 니트로셀룰로스막상에 복제시킨 cDNA 라이브러리는 전술한 DNA 프로브를 사용하여 스크리닝하거나 적절한 발현 시스템에서 발현시키고 수득한 폴리펩타이드는 목적 화합물에 특이적인 항체와의 반응에 대하여 스크리닝한다.
이본쇄 cDNA 또는 게놈성 DNA를 적절한 벡터에 도입시키기 위한 각종 방법이 본 분야에 공지되어 있다(단계 d). 예를 들면, 상보성 단일 중합체 트랙을 상응하는 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 말단 데옥시뉴클레오티틸 트랜스퍼라제 같은 효소의 존재하에 항온처리함으로써 이본쇄 DNA 및 벡터 DNA에 첨가할 수 있다. 이어서, 벡터 및 이본쇄 DNA는 상보성 단일중합체 테일간에 염기를 짝지움으로써 결합시키고 리가제 등의 특이적 결합 효소를 사용하여 최종적으로 연결시킨다. 다른 가능한 방법은 합성 링커를 이본쇄 DNA의 말단에 첨가하거나 이본쇄 DNA를 평활 말단 또는 스태거드-말단(staggered-end)연결에 의하여 벡터내로 도입시키는 것이다. 적절한 벡터는 이하에서 상세히 논의될 것이다.
수득한 하이브리드 베터로 적절한 숙주 세포를 형질전환시키고(단계 e) 형질전환된 세포를 선별 및 조작하는 과정(단계 f)은 본 분야에 익히 공지되어 있다. 이러한 방법의 예는 이하에서 추가로 제시된다. 하이브리드 벡터 및 숙주 세포는 DNA의 생성 또는 목적 폴리펩타이드의 생성에 특히 적합할 수 있다.
본 발명에 따른 목적 DNA, 이의 돌연변이체 및 단편의 분리 과정은 본 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 페놀 및/또는 클로로포름으로 추출함으로써 달성된다. 임의로는, DNA는 돌연변이 유발제로 처리하여 돌연변이체를 수득하거나 제한 효소로 분해하여 단편을 수득하고 하나 또는 두 말단 모두를 변형시켜 벡터내로의 이입을 촉진시키고 개입 서열 등을 제거시킴으로써 추가로 조작할 수 있다.
본 발명에 따른 DNA의 뉴클레오타이드 서열은 공지된 방법 예를 들면, 말단-표지된 DNA를 사용하는 맥삼-길버트법(Maxam-Gilbert method) 또는 생거의 디데옥시 쇄 종결법을 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 PG 유전자 서열도 통상적인 방법에 따라 시험관 내 합성으로 제조할 수 있다. 시험관내 합성은 PG 발현 카세트의 소단편, 예를 들면, 프로모터 또는 시그날 펩타이드를 암호화하는 PG 유전자, 예를 들면 전술한 DNA 분자, 특히 λ-클론 또는 이의 돌연변이체에 포함된 PG 유전자의 PGI, PGII 또는 pgaC 유전자의 DNA 서열을 제조하는 데에 특히 적용할 수 있다.
DNA 합성에 적합한 방법은 문헌[참조: S.A. Narang, Tetrahedron 39. 3. 1983]에 요약되어 있다. 공지된 합성 기술을 사용함으로써 길이가 120 염기이하인 폴리뉴클레오타이드를 우수한 수율, 고순도로써 비교적 단시간에 제조한다. 적당히 보호된 뉴클레오타이드를 포스포디에스테르법][참조 문헌: K.L. Agarwal et al., Angew, Chemie 84, 489, 1972], 더 효율적인 포스포트리에스테르법[참조 문헌:C.B Reese, Tetrahedron 34, 3143, 1972], 포스파이트 트리에스테르법[참조 문헌: R.L. Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 98, 3655, 1976] 또는 포스포아미다이트법[참조 문헌: S.L. Beaucage and M.H. Carruthers, Tetrahedron 22, 1859, 1981]을 사용하여 상호 연결시킨다, 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드의 합성과정은 뉴클레오타이드 쇄를 적당한 중합체에 결합시키는 고체상법에 의하여 단순화시킬 수 있다. 링크등[참조 문헌: H. Rink et al., Nucl. Acids Research 12. 6369, 1984]의 방법은 개개의 뉴클레오타이드 대신에 트리뉴클레오타이드를 사용하고 이들을 고체상 합성시 포스포트리에스테르법에 의하여 연결시킨다. 즉, 폴리뉴클레오타이드는 단시간에 우수한 수율로 제조될 수 있다. 실질적인 이본쇄 DNA는 염기 짝짓기에 의하여 정확한 배열로 서로 유지되고 효소 DNA리가제에 의하여 화학적으로 연결된 두 DNA 본쇄로부터 화학적으로 제조된 오우버랩된 올리고뉴클레오타이드로부터 효소를 사용하여 제조한다.
다른 가능한 방법에는 두 DNA 본쇄로 부터 오우버랩된 단일 올리고뉴클레오타이드를 4종류의 요구되는 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 존재하에 DNA 포리머라제, 예를 들면, DNA 폴리머라제 I, 즉 폴리머라제 1 또는 T4 DNA 폴리머라제의 클레나우 단편 또는 AMV(조류 골수아구증 바이러스)역전사 효소와 함께 항온처리하는 과정이 포함된다. 이에 따라 2개의 올리고뉴클레오타이드는 염기-짝 짓기에 의하여 정확한 배열로 서로 유지되고 효소를 사용하여 요구되는 뉴클레오타이드로 보충하여 완전한 이본쇄 DNA를 수득한다[참조 문헌: S.A. Narang et al., Anal. Biochem. 121, 356, 1982].
하기에 게놈성 라이브러리로부터 본 발명에 따른 재조합 DNA 분자를 제조하는 방법 및 PG 유전자 계통의 구성원을 동정하기 위한 이종 하이브리드화 조건을 더욱 상세히 기술한다.
게놈성 라이브러리는 에이. 나이거 균주의 게놈성 DNA, 예를 들면, NW756 또는 N400을 예를 들면 Sau3AI 또는 MboI로 부분 분해하고 고분자량 DNA 단편을 적절한 숙주 벡터, 예를 들면, 이. 콜라이 플라스미드 pUN121 또는 λ벡터 예를 들면 EMBL4 내에서 클로닝시킴으로써 제조할 수 있다.
목적 PG를 생성하는 기타 진균, 예를 들면, 아스퍼질러스 종, 예를 들면, 에이. 자포니쿠스, 에이. 오리재, 에이. 니둘란스, 에이. 나이거, 트리코데마종, 보트리티스종, 스클레로티니아종, 푸사리움종 또는 기타 식물병원성 진균 및 효모, 예를 들면 케이. 프라질리스와 같은 PG 생성 클루이베로마이세스종이 게놈성 라이브러리 공급원으로 사용될 수 있고 기타 적절한 벡터, 예를 들면 전술한 벡터는 단편에 대한 수용체로서 사용될 수 있다.
PG-암호화 DNA 서열에 대한 게놈성 라이브러리를 성공적으로 스크리닝하기 위해서는 DNA 프로브를 하이브리드화하는 과정이 필요하다. DNA 프로브는 목적 PG의 아미노산 서열 또는 이의 일부를 알고 있거나 목적 PG 유전자와 하이브리드화하는 다른 PG 유전자 또는 이의 일부를 알고 있거나 목적 PG 유전자와 하이브리드화하는 다른 PG 유전자 또는 이의 일부를 알고 있는 경우 합성 DNA 프로브일 수 있다. PG 서열 또는 PG 유전자 또는 이들의 일부 모두 본 발명 이전까지는 알려져있지 않았으므로, PG의 정제, PG의 N-말단 서열의 구조 측정 및 유용한 DNA 프로브의 제조와 관련한 문제가 본 발명에 이르러 처음으로 해결되었다.
본 발명의 PG를 정제하기 위해서는 이를 함유하는 어떠한 공급원도 사용될 수 있다. 예를 들면, 에이. 나이거로부터 수득된 효소 혼합물과 같은 조 공급원, 예를 들면, 시판되고있는 펙틴용해 효소 혼합물은, 라피다제(Rapidase
Figure kpo00005
)가 공급원으로 사용될 수 있다.
정제 과정은 통상적인 정제 방법, 예를 들면, 염석, 탈염, 상이한 염 형태로 재침전, 크로마토그래피, 예를 들면, 가교결합된 알기네이트 상에서와 같은 친화성 크로마토그래피, DEAE-세파덱스 또는 세파로스 컬럼 상에서와 같은 이온 교환 크로마토그래피, 세파크릴 컬럼 상에서와 같은 겔 투과 크로마토그래피, SDS-폴리아크릴아미드 겔, 등전점 포커싱 등을 사용한 전기영동 또는 이들의 조합방법에 따른다.
본 발명에서, PGI, PGII, PGIIIA, PGIIIB 및 PGIV는 라피다제로부터 순수한 형태로 분리된다. 전술한 PG는 다음과 같은 물리화학적 특성이 있는 엔도-폴리갈락투로나제(E.C. 3.2.1.15)이다; PGI은 상대분자량(Mr)이 55K이고 등전점(IEP)이 3.2 내지 3.5이며 효소 활성에 대한 최적 pH가 4.9이다. PGII의 경우 Mr이 38K이고 IEP는 4.6 내지 5.9이며 최적 pH는 4.8이며; PGIIIA의 경우 Mr은 57K이고 IEP는 3.3이며 최적 pH는 4.3이며 PGIIIB의 경우 Mr은 57K이고 IEP는 3.3이지만 최적 pH는 4.5이다. 최종적으로, PGIV는 Mr은 59K이고 IEP는 3.7이며 최적 pH는 4.8이다. 주어진 Mr 값은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의하여 측정하고 IEP 값은 박층 등전 포커싱으로 측정한다.
PGI의 N-말단 서열분석 결과는 서열 ala1-ser-thr-X4-thr5-phe-thr-ser-ala9를 PGI의 21 kDa BrCN 단편의 N-말단 서열분석은 서열 ala-ser-thr-X4-thr-phe-thr-ser-ala-ser-glu(즉, PGI의 N-말단 서열)을; 및 5.5 kDa BrCN-단편의 서열분석은 서열 ala-asp-gly-ala-val-ile-asp-gly-asp-gly-ser을 나타낸다.
PGII의 N-말단 서열분석은 서열 asp1-ser-X3-thr-phe5-thr-thr-ala-ala-ala10-ala-lys-ala12을; 및 17kDa의 BrCN-단편의 N-말단 서열분석은 서열; ala-phe-ser-val-gin-ala-asn-asp-ile-thr-phe을 나타낸다.
서열중의 X3및 X4는 확인되지 않았다.
PGI의 5.5 kDa BrCN 단편의 아미노산 서열을 기초로하여 다음과 같은 올리고뉴클레오타이드 혼합물이 합성된다.
Figure kpo00006
PGII의 17kDa BrCN-단편의 아미노산 서열을 기초로하여 다음과 같은 두종류의 올리고뉴클레오타이드 혼합물이 합성된다.
Figure kpo00007
올리고뉴클레오타이드 서열에서 I는 이노신이고, R1은 T 또는 C이며, R2는 A 또는 G이며 R3는 T, C 또는 A이다.
혼합물을 방사능 표지하며 PGI 및 PGII 유전자 각각에 대한 에이. 나이거 N400의 게놈성 라이브러리를 스크리닝하는데에 사용한다.
이어서, 동정된 유전자 또는 유전자 단편을 통상적인 방법에 따라 서열 분석한다. 에이. 나이거 N400의 PGI 및 PGII 유전자의 서열은 서열확인번호 1 및 2를 갖는 서열로 나타내며 각각 서열 목록에 나타냈다.
스크리닝을 위해서는 DNA 프로브를 사용되 프로브의 유형에 따라 예를 들면, γ32P-APT 및 T4 키나제 또는 α32P-dATP 및 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I를 사용하여 본 분야에 공지된 방법으로 방사능 표지한다. 삽입물로서 본 발명의 핵산을 함유하는 숙주 미생물은 유전자 라이브러리의 필터 레플리카 상에서 표지된 DNA 프로브와 하이브리드화시킴으로써 동정해낸다.
하나 이상의 DNA 프로브에 대해 하이브리드화 반응을 보이는 클론을 분리하여 증폭시킨다.
사용된 하이브리드화조건은 통상적이며 다소 엄격할 수 있다.
엄격한 조건은 고도로 상동성인 DNA 서열만이 하이브리드화할 수 있는 조건이다(상동성 하이브리드화 조건). 이질성 또는 덜 엄격한 조건하에서는, 상동성이 비교적 낮은 이질성의 관련된 DNA 서열도 하이브리드화될 수 있다. 하이브리드화의 엄격성은 예를 들면, 하이브리드화 및 세척온도, 포름아미드 또는 염 농도 DNA의 G + C 함량, 하이브리드화 시간의 길이 및 DNA 프로브의 길이에 영향을 받는다. 상동성 및 이질성 하이브리드화 조건은 이하의 실시예에서 예를 들어 설명한 것이며 이로써 제한되지는 않는다.
PGI 또는 PGII 유전자, 특히 이들의 암호화 영역의 적어도 일부를 포함한 것으로부터 유도된 하나 이상의 DNA 프로브를 사용함으로써, 예를 들면, 에이. 나이거, 바람직하게는 에이. 나이거 N400 또는 에이. 나이거, NW756의 게놈성 라이브러리로부터 유도된 하이브리드화 클론을 이들의 상동성정도 및 관찰된 하이브리드화 제한 단편을 기초로하여 동정 및 상이한 부류로 세분할 수 있다. 에이. 나이거 N400 라이브러리로부터 유도된 바람직한 클론의 예는 λPG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35, -B36, -C1, -C16, -C20, -C37, -D8, -D11, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31, 및 -Y33이다. 이들의 제조방법은 실시예에서 상세히 기술된다. 에이. 나이거 NW756으로부터 유도된 바람직한 클론에 대한 예는 플라스미드 pGW1756이다.
이들 클론 뿐만 아니라 플라스미드 pGW1800, pGW1803, pGW1900, pGW1902 및 pGW1910를 사용하여, 본 발명의 기타 재조합 DNA 분자, 특히 자체내에 포함된 PG 유전자 서열의 단편을 함유하는 분자를 제조할 수 있다. 전술한 기타 재조합 DNA 분자는 통상적인 제한 효소, 링커, 연결, 증폭 및 분리 방법을 적용하여 통상적인 방법으로 제조한다. 우선적으로, 원핵 세포 및 진핵 세포 모두에서 증폭시키기 위한 원핵 세포성 또는 진핵 세포성 벡터 또는 셔틀 벡터일 수 있는 발현 벡터를 제조한다. 이러한 셔틀 벡터의 작제 방법에 대한 예는 본 분야에 익히 공지되어 있다. 발현벡터는 상동성 또는 이질성 유전자일 수 있다. 이러한 유전자의 예는 이하에서 기술된다.
본 발명에 따른 재조합 DNA 분자 또는 이의 단편 삽입물은 통상적인 방법 예를 들면, 재조합 DNA를 적절한 제한 효소로 절단한 다음 아가로스 겔 전기 영동 후 목적 DNA 단편을 분리해냄으로써 수득할 수 있다.
새로운 제한 부위를 함유하는 본 발명의 DNA 분자, 특히 PG 유전자 서열의 돌연변이체는 통상적인 방법에 따라 부위-지시된 돌연변이 유발에 의하여 시험관내에서 제조할 수 있다[참조 문헌: review article of M.J.Zoller and M. Smith. Methods Enzymol. 100, 468 (1983), D.Botstein and D. Shortle, Science 229, 1193 (1985) or K.Norris et al., Nucl.Acids Res. 11, 5103 (1983)].
본 발명은 또한 구조 유전자 발현용 하이브리드 벡터를 제조하기 위한 본 발명의 재조합 DNA 분자의 용도에 관한 것이다.
[형질전환된 숙주]
추가로, 본 발명은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 증폭시키거나 특히 본 발명의 재조합 DNA 분자에 함유된 발현 카세트를 발현시키기 위한 형질전환된 숙주 관한 것이다.
특히 본 발명의 재조합 DNA 분자를 증폭시키기 위한 적합한 숙주의 예는 제한 효소 또는 변형 효소가 결핍되었거나 불충분한 미생물, 예를 들어 세균, 특히 이. 콜라이 균주, 예를 들면, 이. 콜라이 X1776, 이. 콜라이 Y1090, 이. 콜라이 W3110, 이. 콜라이 HB191/LM1035, 이. 콜라이 JA221, 이. 콜라이 DH 5α 또는 우선적으로는이. 콜라이 DH5αF', JM109, MH1 또는 HB101 또는 이. 콜라이 K12 균주, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 슈도모나스(Pseudomonas), 헤모필루스(Haemophilus), 스트렙토코커스 등 및, 효모, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 GRF18 같은 사카로마이세스 세레비지애이다. 추가의 적합한 숙주 세포는 고등 유기체의 세포, 특히 확립된 연속성 사람 또는 동물 세포주, 예를 들면, 사람 폐 배아 섬유 아세포 L132, 사람의 악성 흑색종 보웨스(Bowes)세포, 헬라 세포, 아프리카 녹색 원숭이 COS-7의 SV40 바이러스 형질전환된 신장세포 또는 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
본 발명의 발현 카세트를 발현시키기 위한 적절한 숙주의 예는 전술한 세포 및 특히 사상 전균, 예를 들면, 페니실리움(Penicillium), 세팔로스포리움(Cephalosporium) 또는 우선적으로는 아스퍼질러스종, 예를 들면, 에이. 카보나리우스, 에이. 아와모리 또는 우선적으로는 에이. 나이거, 에이. 니둘란스 또는 에이. 오리재이다.
바람직한 형질전환된 숙주는 pGW1800 또는 pGW1803으로 형질전환시킨 이. 콜라이 MH1, pGW1800 또는 pGW1803으로 형질 전환시킨 이. 콜라이 JM109, pGW1900, 1902, 1756 또는 1910, PGII-IFN AM119 또는 PGIIss-IFN AM119로 형질전환시킨 이. 콜라이 DH5αF', PGII-IFN AM119 또는 PGIIss_IFN AM119 및 임의로 선별 마커 플라스미드 pCG59D7으로 형질전환시킨 에이. 나이거 An8 또는 N593 또는 에이. 니둘란스이다.
본 발명은 또한 적합한 숙주 세포를 형질전환 조건하에 본 발명의 재조합 DNA 분자, 특히 본 발명의 하이브리드 벡터로 임의로는 선별 마커 유전자와 함께 처리하고 임의로 형질전환체를 선별함을 포함하여, 전술한 형질전환체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
미생물의 형질 전환은 예를 들면 사카로마이세스 세레비지애[참조 문헌: A.Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 1929, 1978], 바실러스 서브틸리스[참조 문헌: Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81, 741, 1961] 및 이. 콜라이[참조 문헌: M. Mandel et al., J.Mol. Biol. 53, 159, 1970]등 문헌에 기술된 바와 같이 통상적인 방법에 따라 수행 한다.
따라서, 이. 콜라이 세포의 형질전환 과정에는 예를 들면, DNA를 흡수하도록 하기 위해 세포를 Ca2+로 예비처리하고 하이브리드 벡터와 배양하는 것이 포함된다. 계속되는 형질전환된 세포의 선별 과정은 예를 들면, 세포를 벡터 DNA의 마커 서열의 특성에 따라 모세포로부터 형질전환된 세포를 분리시키는 선별 생장 배지로 옮김으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는, 벡터를 함유하지 않는 세포의 생장을 허용하지 않는 생장 배지를 사용한다. 효모의 형질전환은 예를 들면, 글루코시다제를 사용하여 효모 세포벽을 효소적으로 제거하고 수득된 스페로플라스트(spheroplast)를 폴리에틸렌 글리콜 및 Ca2+이온 존재하에 벡터로 처리한 다음 스페로플라스트를 한천에 봉매시켜 세포벽을 재생시키는 단계가 포함된다. 바람직하게는, 재생 한천은 전술한 바와 같이 형질 전환된 세포의 재생 및 선별이 동시에 허용되도록하는 방식으로 제조한다.
포유루 세포주 같은 고등 진핵세포 기원 세포의 형질 전환은 바람직하게는 형질 감염에 의하여 달성한다. 형질감염은 통상적인 기술, 예를 들면 칼슘 포스페이트 침전, 미세주사, 원형질체 융합, 일렉트로포레이션(electroporation), 즉 세포막의 투과성을 일시적으로 증가시키는 짧은 전기 펄스에 의한 DNA의 도입 또는 디에틸아미노에틸덱스트란, 디메틸 설폭사이드, 글리세롤 또는 폴리에틸렌 글리콜 등의 조력 화합물의 존재하에 수행한다. 형질 감염을 수행한 후, 형질감염된 세포는 선별 마커의 특성에 따라 선택된 선별 배지, 예를 들면 상응하는 항생물질을 함유하는 둘베코 변형 이글배지(DMEM), 최소 필수배지, RPMI 1640 배지 등의 표준 배양 배지에서 배양함으로써 동정 및 선별한다.
형질전환된 숙주 세포는 예를 들면, 글루코스 또는 락토스 등의 탄수화물, 질소 동화원, 예를 들면 아미노산, 펩타이드, 단백질 또는 이들의 분해 생성물(예: 펩톤, 암모늄염등) 및 무기염, 예를 들면, 설페이트, 포스페이트 및/또는 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘의 카보네이트를 함유하는 액체 배지에서 본 분야에 공지된 방법으로 배양한다. 배지는 또한 예를 들면, 미량 원소와 같은 성장-촉진물질, 예를 들면 철, 아연, 망간등을 함유한다.
배지는 바람직하게는 선별압을 발휘하도록 선택되며 형질 전환되지 않았거나 하이브리드 벡터를 상실한 세포의 성장을 방지하도록 선택된다. 즉, 예를 들면, 하이브리드 벡터를 상실한 세포의 성장을 방지하도록 선택된다. 즉, 예를 들면, 하이브리드 벡터가 마커로서 항생물질 내성 유전자를 함유하는 경우 배지에 항생물질을 첨가한다. 예를 들어, 하이브리드 벡터가 숙주의 결합을 보완 하는 요소를 암호화하는 유전자를 함유하든 안하든간에 필수 아미노산에 있어서 영양요구성인 숙주 세포를 사용하는 경우, 전술한 아미노산이 결핍된 최소배지를 사용하여 형질 전환된 세포를 배양한다.
포유류 세포같은 고등 진핵세포 기원의 세포는 시판배지, 예를 들면, 생장 촉진 물질 및/또는 포유류 혈청을 임의로 보충한 전술한 둘베로 변형 이글배지(DMEM), 최소 필수배지, RPMI1640 배지 등을 사용하여 조직 배양 조건하에 생장시킨다. 조직배양 조건하에 세포 배양하기 위한 기술은 본 분야에 익히 공지되어 있으며 예를 들면, 에어리프트 반응기(airlift reactor) 또는 연속 교반 반응기내 균질 현탁 배양 또는 예를 들면, 할로우(hollow) 섬유, 마이크로캅셀내, 아가로스 마이크로비이드, 다공성 유리 비이드, 세라믹 카트리지 또는 기타 '미세담체상에서의 고정 세포 배양 또는 포획 세포 배양(entrapped cell cultre)이 포함된다.
배양은 본 분야에 공지된 과정에 따라 수행한다. 온도, 배지의 pH 값 및 발효 시간등의 배양 조건은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 유도체의 최대 역가가 수득되도록 선택한다. 즉, 이. 콜라이 또는 효모 균주는 바람직하게는 호기성 조건하에 약 20 내지 40℃, 바람직하게는 약 30℃ 및 pH 4 내지 8, 바람직하게는, 약 7 에서 약 4 내지 30시간 동안 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 유도체의 수율이 최대에 도달할 때까지 진탕 또는 교반하면서 침지 배양으로 배양한다.
형질전환되지 않은 세포로부터 형질전환된 세포를 선별하기 위하여, 본 발명의 DNA 분자는 선별 마커를 함유하거나 이와는 달리 세포를 이러한 마커를 함유하는 제2 벡터로 동시 형질감염시킨다. 선별 마커가 발현성 구조 유전자인 다른 시스템에서와 같이, 상기(효소)의 발현되 폴리펩타이드는 수용 유기체에 유독한 화합물에 대한 내성을 제공하거나 이러한 필수 폴리펩타이드를 결손하고 있는 돌연변이체의 효소 시스템을 완전하게 한다. 형질전환된 사상 진균 세포의 선별에 적합한 이러한 마커 유전자는 예를 들면, 공지된 qa-2, pyrG, pyr4, trpC, amdS 또는 argB 유전자이다.
유럽 특허 제278,355호에 기술된 바와 같이 pyrA로 명명된 마커 유전자가 에이. 나이거의 게놈성 라이브러리로부터 분리되었는데 이는 에이. 니둘란스의 pyrG 및 엔 크라사의 pyr4와 관련이 있고 유사한 기능이 있으므로 즉, 효소 오로티딘 5'-포스페이트 데카복실라제를 생성한다. 이러한 효소는 오로티딘 5'-포스페이트의 우리딜산(우리딘 5'-포스페이트)으로의 탈카복실화를 촉매하며 플루오로-오로트산의 유독성 플루오로-우리딘 으로의 탈카복실화도 촉매한다. pyrA 유전자를 함유하는 이. 콜라이 클론은 pyr4 유전자의 일부를 함유하는 pDJB2(잠조 25)의 1.1kb HindIII 단편과 하이브리드화시켜 동정한다. 그러나, 오로티딘-5'-포스페이트 데카복실라제를 암호화하는 어떠한 기타 pyr 유전자의 DNA도 사용될 수 있다. 이. 콜라이 B75183/pCG 59D7으로 명명된 양성 클론으로부터, pyrA 유전자를 함유하는 플라스미드 pCG59D7을 분리하여 에이. 나이거 pyrA-돌연변이체의 동시형질전환에 사용한다. 이와 같은 pyrA-돌연변이체는 오로티딘 5'-포스페이트 데카복실라제 유전자가 결손되어 있으므로 이에 상응하는 효소를 생성할 수 없다. 이러한 돌연변이체는 돌연변이를 유발하는 UV 조사하에 에이. 나이거 N756의 분생 포자를 처리하여 제조하고 플루오로오로트산 및 우리딘의 존재하에 생존하는 콜로니를 선별한다. 플루오로오로트산의 존재 및 우리딘의 부재하에 생존하는 콜로니는 제거한다. 형질전환될 수 있는 능력에 따라 두개의 상호보완 그룹 pyrA 및 pyrB에 속하는, 나머지 우리딘-요구 돌연변이체를 각각 돌연변이체 An8 및 An10으로 나타낸다. 이들을 형질전환 조건하에 플라스미드 pCH59D7을 함유하는 pyrA를 사용하여 원형질체 형태로 처리한다. 이의 분해된 DNA와 pUN 121의 DNA와의 하이브리드화 능력에 의해 입증된 바와 같이 An8 콜로니 만이 형질전환되어 pyrA 유전자를 함유하는 것으로 밝혀졌다.
[폴리펩타이드의 제조]
본 발명은 또한 예를 들면 전술한 바와 같이 본 발명의 발현 카세트에 삽입된 상동성 또는 이질성 구조 유전자를 통상적인 방법에 따라 적절한 형질전환 숙주에서 발현시킴을 특징으로 하여 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 필요하다면, 폴리펩타이드를 통상적인 방법에 따라 분리한다. 발현 카세트의 작제에 따라 생성물이 생성되거나, 시그날 서열이 존재하는 경우에는 생성 및 분비된다. 통상적으로, 발현 카세트는 하이브리드 벡터에 포함되어 있지만 형질전환 후에 숙주 게놈에 통합될 수도 있다.
본 발명의 PG 유전자에서 유도된 프로모터 또는 사상진균에서 유래된 다른 프로모터가 상동성 또는 이질성 구조 유전자의 발현에 사용되는 경우, 적합한 숙주는 예를 들면 진균, 예를 들면 사상 진균, 특히 아스퍼질러스 균주이다. 그러나, 예를 들어, 원핵세포 또는 고등 진핵세포에서 유도된 다른 프로모터가 사용될 경우, 기타의 숙주, 예를 들면, 이. 콜라이 같은 세균 또는 고등 진핵세포가 각각 적합하다.
에이. 나이거의 PG 유전자의 프로모터는 에이. 나이거 세포에서 유도가능하다. 즉, 이에 결합된 구조 유전자, 예를 들면, PG를 암호화하는 구조 유전자 또는 기타이질성 유전자의 발현은 펙틴 또는 펙틴 분해산물을 배지에 첨가함으로써 유도 된다. 그러나, 충분한 글루코스의 존재하에서, 에이. 나이거 균주, 예를 들면 An8 또는 N593을 숙주로 사용할 경우, 프로모터는 유도성이 아니다. 이러한 결과는 에이. 나이거 PG 프로모터의 조절하에 있는 유전자가 에이. 나이거에서 동화산물 억제됨을 의미한다. 그러나, 다른 에이. 균주, 바람직하게는 에이 오리재, 가장 바람직하게는 에이. 니둘란스를 사용하는 경우, 에이. 나이거 PG 프로모터 조절하에 있는 유전자도 펙틴의 부재하 및/또는 글루코즈의 존재하에 구성적으로 발현된다. 따라서, 예를 들면, 목적 유전자를 발현시키는 동안 에너지 및 탄소원으로서 펙틴 대신 글루코스를 영양배지에 첨가할 수 있기 때문에 에이. 나이거, 바람직하게는 에이. 오리재, 가장 바람직하게는 에이. 니둘란스 이외의 아스퍼질러스 숙주에서 에이. 나이거 PG 프로모터의 조절하에 있는 유전자를 발현시키는 것이 유리할 수 있다.
본 발명의 PG 유전자로부터 유도되지 않은 프로모터를 예를 들면, PG를 암호화하는 구조 유전자를 포함하는 본 발명의 발현 카세트를 작제하는 데에 사용하는 경우에는 다른 숙주를 발현 숙주로 사용할 수 있다. 적합한 숙주는 사용된 프로모터에 좌우되고 예를 들면 이. 콜라이 같은 세균 ㄸㅛ는 에스. 세레비지애 또는 클루이베로마이세스 락티스 같은 효모이다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 제조에 적합한 숙주 및 프로모터는 또한 전술한 형질전환과정에 적합한 것들이다.
본 발명에 이르러 하나 이상의 목적 PG를 과발현시킬 수 있으며 각종 방법을 적용할 수 있다. 정제된 단일 PG는 PG를 함유하는 펙틴용해효소 혼합물을 통상적인 정제방법에 적용시켜 제조할 수 있다. 단일 PG, 바람직하게는 PGI, PGII 또는 pagC 유전자 산물을 생산하기 위한 다른 방법은 어떠한 PG로 발현할 수 없거나 PG를 소량 발현하거나 도입된 PG 유전자에 대하여 사용된 유도 조건하에서 PG를 발현하지 않는 숙주 세포를 PG, 예를 들면, PGI, PGII 또는 pgaC 유전자 산물 또는 PG 활성이 있는 PG 단편을 암호화하는 구조 유전자를 함유하는 하이브리드 벡터로 형질전환시켜 전술한 구조 유전자를 발현시킴을 특징으로 한다. 어떠한 PG로 발현할 수 없는 숙주를 사용할 경우, 각각의 단일 PG는 어떠한 기타 PG에 의해서도 오염되지 않은 순수한 형태로 수득될 수 있다. 또한, 형질전환 숙주내에서 하나뿐만 아니라 그 이상의 목적 PG 유전자를 임의로는 다른 효소를 암호화하는 유전자와 함께 발현 시킴으로써 PG의 예측된 혼합물을 임의로는 다른 효소와 함께 생성시킬 수 있다. 예측된 혼합물은 또한 예를 들면, 펙틴 에스테라제, 펙틴 리아제. 셀룰라제, 혼합된 엔도-글루카나제, 헤미셀루라제, 크실라나제, 아라비나제, 갈락타나제, α- 및 β-글리코시다제에 대한 하나 이상의 목적 유전자를 숙주 균주내에서 임의로는 효소 생성에 있어서 특정의 백그라운드로 발현시킴으로써 수득될 수 있다.
효소의 예측 혼합물은 본 발명의 분리된 PG 유전자를 사용하여, 본 분야에 익히 공지된 기술인 유전자 파괴법(gene disruption)에 의하여 특정의 PG 유전자를 숙주내에서 파괴시킴으로써 수득할 수 있다.
어떠한 PG도 발현시킬 수 없는 숙주는 상응하는 유전자를 함유하지 않는 미생물, 예를 들면, PG 아스퍼질러스 균주, 다른 PG 비-아스퍼질러스 진균 또는 기타 PG 진핵 또는 윈핵세포이거나 내인성 PG 유전자의 발현이 적절히 조건화된 생장 배지 에서 억제되고, 예를 들면 동화물 억제 되고/되거나 비유도 되고, 반면에 목적 PG 구조유전자와 작동적으로 연결된 외인성 PG 프로모터 예를 들면, 에이. 나이거 유래된 프로모터가 이러한 조건하에서 활성이거나 PG 유전자가 다른 프로모터와 융합되어 있는 아스퍼질러스 균주, 예를 들면, 에이. 오리재 또는 에이. 니둘란스이다.
PG의 제조에 적합한 기타의 프로모터 및 균주는 발현 카세트의 설명에서 전술한 바와 동일하다.
[폴리펩타이드 및 조성물]
펙틴 용해 효소 혼합물, 바람직하게는 에이. 나이거 유도된 펙틴 용해 효소 혼합물, 특히 라피다제
Figure kpo00008
로부터 정제된 단일 PG 및 특히 이러한 PG 또는 PG 활성이 있는 이의 유도체를 암호화하는 발현 하이브리로 벡터로 형질전환된 적합한 숙주내에서 생성되는 경우 본 발명에 따른 DNA 서열에 의해 암호화된 PG 및 PG 활성이 있는 이의 유도체, 및 이의 생리학적으로 허용되는 염이 본 발명에 포함된다. 특히, 바람직한것은 정제된 형태의 에이. 나이거의 PGI, PGII, PGIIIA, PGIIIB 및 PGIV이다. 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의하여 제조된 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 이러한 PG 및/또는 PG 활성이 있는 이의 유도체 및/또는 이의 생물학적으로 허용되는 염을 임의로는 PG 활성이 없는 하나 이상의 적합한 효소와의 예측된 혼합물 형태로 함유하는 효소 조성물에 관한 것이다.
PG 이외의 활성을 갖는 전술한 효소 조성물의 제조에 적합한 효소는 식물 세포벽 중합체를 분해 및 변형시킨다. 이러한 효소는 예를 들면, 펙틴 에스테라제, 펙틴 리아제, 셀룰라제, 혼합된 엔도-글루카나제, 헤미셀룰라제, 크실라나제, 아라비나제, 갈락타나제, α- 및 β-글리코시다제 등이다.
본 발명은 추가로 통상적인 방법으로 효소 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
식물 물질의 가공에 있어서 단일 PG 및/또는 PG 활성을 갖는 이의 유도체 및/또는 효소 조성물의 용도 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 단일 PG 및/또는 PG 활성을 갖는 이의 유도체 또는 이러한 PG 또는 유도체를 함유하는 조성물은 채소 또는 과일 쥬스의 청정화, 채소 또는 과일 쥬스 생산에 있어서의 쥬스 수율 및 오일-함유 종자 또는 과일의 압착 수율의 증진, 채소 및 과일쥬스의 안정화, 채소 또는 과일 쥬스의 점도 감소, 생체량의 액화. 침연, 천연 색소, 향기 및 풍미 등의 천연 산물 추출 증진, 생체량, 식량 또는 사료의 가격 안정, 제지 펄프 제조 등에서 셀룰로스 섬유이 회수율 향상에 유용하다.
본 발명의 가장 바람직한 양태는 이하의 실시예에서 기술된다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 PGII 유전자의 일부를 암호화 하는 DNA 프로브 HR 6195 및 HR 6196을 병용하여 하이브리드시켜 에이. 나이거의 게놈성 라이브러리로부터 수득한 파아지 λD 및 λE의 EcoRI 단편에 대한 부분 제한지도이다. 숫자는 오른쪽 EcoRI 부위로부터 kbp로 나타낸 대략적인 거리를 나타낸다.
제2도는 pGW1800의 부분제한지도이다. 이 플라스미드는 벡터 pEMBL18의 DNA 및 에이. 나이거 N400 PGII 유전자를 포함하는 파아지 λE로부터 수득된 4.1kbp XbaI-EcoRI 삽입체를 함유한다. Ap는 암피실린 내성 유전자이고 화살표는 에이. 나이거 유도된 DNA를 나타낸다.
제3도는 pGW1900의 부분 제한지도이다. 이는 pUC9 벡터 및 파아지 pGI-λ7의 8.6kbp BamHI 단편으로 구성되어 있다.
제4도는 플라스미드 pGII-IFN AM119 및 pGIIss-IFN AM119에 대한 클로닝 방법을 나타내는 도면이다.
제5도는 폴리머라제 쇄반응(PCR)법을 사용하여, 각각 pGII-IFN AM119 및 pGIIss-IFN AM119를 작제하기 위한 DNA 삽입체 DNA5 및 DNA6의 단계적 작제도이다.
제6도는 pGW1756의 부분제한지도이다. pGW1756은 벡터 pEMBL 18중에 삽입된 에이. 나이서 NW756 폴리갈락투로나제 II 유전자를 함유하는 5.5kbp XhoI-BgIII 단편이다. 벡터 내의 제한 부위는 나타내지 않았다. 단편의 전자 XhoI 및 BgIII 부위가 나타나 있으나, 이들은 각각 벡터의 SalI 및 BamHI 부위에 삽입됨으로써 파괴된다.
제7도는 pGW1910의 부분제한지도이다. pGW1910은 벡터 pUC 9의 BamHI 부위에 삽입된 λ파아지 λPG-C20의 7.8kbp Bal II 단편이다.
PGC(pgaC) 유전자를 암호화하는 에이. 나이거 N400 유전자의 대략적인 위치를 나타내었다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하나 이로써 제한되지는 않는다.
사용된 약어의 의미는 다음과 같다.
Figure kpo00009
[완충액, 배지, 시약]
Figure kpo00010
최소배지 1ℓ; 1.5g KH2PO4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4·7H2O, 0.9mg ZnSO4·7H2O, 0.2mg MnCl2·4H2O, 0.06mg CoCl2·6H2O, 0.06mg CuSO4·5H2O, 0.29mg CaCl2·62H2O, 0.2mg FeSO4·7H2O, 텍스트에 명시된 질소 및 탄소원 또는 6g NaNO3및 10g 글루코스/ℓ(이들 공급원이 구체적으로 언급되지 않은 경우), NaOH로 pH 6.0으로조절.
완전 배지 6g NaNO3및 10g 글루코스/ℓ + ℓ당 2g 트립티카제 펩톤(BBL), 1g 카사미노산(Difco), 1g 효모 추출액(BBL), 효모로 부터의 0.5g 리보핵산 나트륨염(ICN, Cleveland, U.S.A), 2㎖ 비타민 용액을 함유한 최소 배지·NaOH로 pH 6.0으로 조절.
비타민 용액 100㎖당 10㎎ 티아민, 100㎎ 리보플라빈, 10㎎ 판토텐산, 2㎎ 바이오틴, 10㎎ p-아미노벤조산, 100㎎ 니코틴아미드, 50㎎ 피리독신-HCl
Figure kpo00011
다음의 균주가 사용된다;
Figure kpo00012
Figure kpo00013
다음의 벡터가 사용되었다;
[pGW613]
본 벡터는 문헌[참고: Goosen et al.(ref. 13)]에 기술 되어 있다.
[M13mp 파아지]
M13mp18 및 M13mp19 벡터[참조 문헌: Norrander el al., ref. 24]는 일본쇄 DNA 박테이로파아지 M13의 유도체이고 DNA 단편의 다양한 폴리링커 부위에서의 클로닝을 허용하며 두가지 가능한 배향에서 동일한 제한 단편을 클로닝 되도록함으로써 DNA 서열 분석을 촉진하도록 설계된다. 이들 벡터에 클로닝된 서열은 서열분석반응 또는 표준 올리고데옥시리보 뉴클레오타이드 프라이머 및 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편을 사용한 일본쇄 프로브 제조용 주형으로서 용이하게 사용될 수 있다. 벡터 DNA는 이. 콜라이 lac-오페론 프로모터와 β-갈락토시다제의 처음 145개 아미노산의 유전 정보를 함유한다. 다수의 제한 부위를 함유하는 폴리링커 서열을 lacZ 서열에 삽입시킨다, 폴리링커는 lacZ 판독 프레임을 보유하고 벡터는 lacZa 숙주 균주의 대립 유전자 상호 보완을 유발하여 IPTG 및 X-gal을 함유하는 플레이트 상에 청색 플라그를 생성한다. 판독 프레임을 파괴하거나 달리는 lacZa 펩타이드의 발현을 방해하는 삽입물을 함유하는 재조합 파아지는 무색 플라그로서 나타난다.
[pGW635]
본 플라스미드는 pGW613의 보다 짧은 버젼물이다. 이는 또한 pyrA 유전자를 함유한다[참조 문헌:Goosen et al.(ref 42)].
[EMBL4]
EMBL4는 9 내지 23kbp의 클로닝능을 갖는 λ 치환 벡터이다[참조 문헌:Frischauf et al., ref. 9]. 이는 λ암과 비-필수 스터퍼 영역(Stuffer region) 사이에 다수의 클로닝 영역을 함유한다. 이는 문제의 외래 DNA가 삽입됨에 따라 벡터 암에 대한 스터퍼의 재연결이 감소되도록 하는 방법으로 다중 제한 효소 분해를 허용한다. 벡터는 또한 spi 표현형을 이용하여 재조합체의 직접적인 선별을 제공한다[참조 문헌: Zissler et al., ref. 21].
[pEMBL18 및 pEMBL19]
이들 플라스미드는 문헌[참조: Dente et al., refs. 10, 22, 23]에 기술되어 있다.
[실시예 1]
[폴리갈락투로나제의 분리 및 특징화]
[실시예 1.1]
[폴리갈락투로나제 I, II, IIIA, IIIB 및 IV의 정제]
효소 활성은 변형된 페리시아나이드 시험[참조 문헌: Robyt et al., ref. 3]을 사용하여 문헌[참조: Rozie et al., ref. 2]에 기술된 바와 같이 이하에서 수득된 효소 분획에서 측정한다.
에이. 나이거로부터 수득된 펙틴 용해 효소의 시판 혼합물인 라피다제
Figure kpo00014
(Gist-brocades, Seclin, France)로부터 폴리갈락투로나제 I, II, IIIA, IIIB 및 IV를 정제한다. 50g의 조 효소 분말(Lot-No, K2B 078)을 190㎖의 20mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 3.6)에 용해시키고 25000g에서 10분간 원심 분리하여 고형분을 제거하며 동일 완충액 중에 평형시킨 세파덱스 G-50 컬럼(5 x 90㎝)상에서 탈염시킨다.
정제 과정의 제1 단계는 롬바우트 등(ref. 1)에 의하여 기술된 바와 같이 제조한 가교결합된 알기네이트를 사용하는 친화성 크로마토그래피 단계이다. 베드용적이 5.2㎎/g인 가교결합된 알기네이트도 20mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 3.6)(컬럼크기 2.5 x 30㎝)으로 평형시킨다. 탈염된 효소를 컬럼에 부하한 다음 pH가 각각 4.2 및 5.6인 100mM 나트륨 아세테이트 완충액(각각 400㎖)을 적용하여 세척한다. PGI 및 PGII는 알기네이트 매트릭스에 흡착되는 반면 PGIIIA, IIIb 및 IV는 흡착되지 않는다.
[실시예 1.1.1]
[PGI 및 PGII의 정제]
가교결합된 알기네이트 컬럼으로부터의 흡착된 PGI 및 PGII 단백질을 전술한 문헌[참조: Rombouts et al., ref. 1]에 기술한 방법을 약간 변형시킨, 100mM 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 5.6)중 염화나트륨 선형 구배(0 내지 1M)에 의하여 용출시킨다. PGI은 약 0.5M NaCl로 PGII와 동시 용출된다.
PGI 및 PGII를 포함하는 효소 분획을 20mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.7)에 대하여 투석한 다음 동일 완충액 중에 평형시킨 DEAE-세파텍스 A-50 컬럼(2.5 x 30㎝)에 걸어준다. NaCl 선형 구배(0 내지 0.6M)를 사용하여 효소를 용출시킨다. PGI은 약 0.3M NaCl에서, PGII는 약 0.2M에서 용출된다. PGI 및 PGII를 함유하는 효소 분획을 별도로 수집하여 20mM 비스 트리스 HCl 완충액(pH5.8)에 대하여 투석시키고 동일 완충액에서 평형시킨 DEAE-세파로스 고속 유동 컬럼 상에서 크로마토그래피한다. NaCl 구배를 적용할 경우, PGII는 약 129mM 염화나트륨에서, PGI은 약 250mM에서 용출된다. PGI 또는 PGII를 함유하는 활성 효소 분획을 농축시켜 20mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.7)에 대하여 투석한 후에 상기 완충액중 1M 염화나트륨으로 용출시킴 으로써 소형 DEAE-세파로스 고속 유동 컬럼 상에서 최종 용적이 25㎖가 되게 한다. 각각의 두 효소 PGI 및 PGII의 최종 정제 과정은 0.1M 나트륨 아세테이트(pH 4.2)중 세파크릴 S 200(1.6 x 90㎝)상에서 겔 투과 크로마토그래피하여 달성한다.
PGII는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시 단일 밴드로 나타나며 겉보기 분자량은 38kDa이다. 고유 활성은 0.075M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.2)에서 측정된 단백질 ㎎당 2760U이다. 등전 포커싱을 하는 경우 효소는 미세이질성을 나타 낸다. 대략 pH 5.2에서 뚜렷하게 나타난 주요 성분 외에도, 다수의 부수적인 밴드가 pH 4.6 냐자 5,9 범위에서 관찰된다.
PGI 또한 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시 단일밴드로 나타난다. 이 효소의 겉보기 분자량은 55kDa이다. 특이 활성은 0.075M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.2)에서 측정한 단백질 ㎎당 550U이다. 등전 포커싱을 하는 경우 본 효소도 미세이질성으로 나타난다. pH 3.2 내지 3.5 범위에서 몇몇 밴드가 관찰된다.
[실시예 1.1.2]
[PGIIIA, PGIIIB 및 IV의 정제]
비결합된 PG를 함유하는 가교결합된 알기네이트 컬럼(실시예 1.1)의 용출물의 pH를 1M 수산화나트륨으로 5.7로 조절하고 0.02M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.7)에 평형시킨 DEAE-세파덱스 A-50 컬럼(2.5 x 30㎝)상에 부하시킨다. 효소를 직선 염화나트륨 선형 구배(0 내지 1M)를 이용하여 DEAE-세파덱스 컬럼으로부터 용출시킨다. PGIV는 0.38M 염화나트륨에서 용출되고 PGIIIA 및 PGIIIB는 0.5M에서 동시 용출된다.
각각의두 효소 분획 5㎖를 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.2)중 세파크릴 S-200 컬럼(1.6 x 90㎝)상에서 탈염시킨다. 활성 분획을 모아서 증류수로 5회 희석시키고 0.02M 비스-트리스/HCl 완충액(5.8)에 평형시킨 MONO Q 컬럼(Pharmacia Fine Chemicals 제조, Uppsala, Sweden)상에 부하 시킨다. 20㎖ 염화나트륨 선형 구배(0.1 내지 0.4M)에 적용할 때 PGIV는 0.32M 염화나트륨에서 용출되는 반면 PGIIIA 및 IIIB는 0.4M 염화나트륨에서 동시용출된다.
두 효소 본획 모두를 전술한 조건하에 MONO Q 컬럼 상에서 별도로 재 크로마토그래피한다. PG 활성이 있는 분획을 모아서 0.025M 피페라진/HCl(pH 6.0)에 대하여 투석한 다음 동일 완충액에 평형시킨 MONO P 컬럼(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)상에 걸어준다. 컬럼을 10%(v/v) 폴리 완충액 74(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)(pH 3.0)을 사용하여 0.75㎖/min의 유속으로 겔 투과 크로마토그래피하여 달성한다.
컬럼은 다음의 단백질 표준물을 사용하여 보정한다; 소 혈청 알부민(68kDa); 난 알부민(45kDa) 및 카이모트립시노겐 A(25kDa).
겔 투과 크로마토그래피에 의한 PGIV의 겉보기 분자량은 53kDa이다. PGIV는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시 단일 밴드로 나타나고 15% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동으로 측정한 겉보기 분자량이 59kDa이다. 고유활성은 0.075M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.2)에서 측정한 단백질 mg당 780U이다. 등전 포커싱을 수행할 경우 효소는 pH 3.7에서 뚜렷한 단일 밴드가 나타난다.
PGIV에 대하여 기술한 바와 같은 동일한 조건하에서, PGIIIA 및 PGIIIB를 함유하는 활성 분획을 보정된 TSK G 3000 SW 컬럼 상에서 겔 투과 크로마토그래피하면 겉보기 분자량이 각각 32 및 52kDa인 두 효소가 분리된다. 그러나, SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동(15% 폴리아크릴아미드 겔)시 두 효소는 57kDa의 동일 분자량을 갖는 단일 밴드로 나타난다. PGIIIA 및 IIIB는 0.075M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.2)에서 측정한 특이 활성이 각각 150 및 250U/mg 단백질이다. 등전 포커싱에 따르면 두 효소는 pH 3.3에서 뚜렷한 단일 밴드를 나타낸다.
[실시예 1.2]
[폴리갈락투로나제의 특성 및 이의 면역학적 관계의 비교]
50g 라피다제(Gist-brocades, S
Figure kpo00015
clin, France)를 출발 물질을 사용하여 실시예 1.1에서 기술한 바와 같이 5 종류의 엔도폴리갈락투로나제를 정제한다. 이들 정제된 단백질의 특성을 표 2에 요약하였다.
Figure kpo00016
PGII가 훨씬 작은 단백질(38kDa)로 나타나는 것을 제외 하고는 모든 정제 효소의 겉보기 분자량은 15% SDS-폴리 아크릴아미드 겔 상에서 55 내지 59kDa 범위로 나타난다. PGII의 특성은 기타 폴리갈락투로나제에 대하여 측정한 저 등전점과는 달리 비교적 고 등전점으로 나타난다. 모든 폴리갈락투로나제의 최적 pH는 동일한 범위(4.3 내지 4.9)이다.
정제된 PGI 및 PGII 에 대한 특이적 항체는 문헌[참조: Uitzetter, ref. 36]에 기술된 면역화 도식에 따라 뉴질랜드산 화이트 래빗에서 상승한다.
2종의 항혈청과 5정의 정제된 폴리갈락투로나제 간의 가교 반응성을 다음에 개략된 바와 같이 모니터링한다. 0.4 내지 1.0㎍의 정제된 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 부하하고 전기영동한 후 문헌[참조: Bowen et al., ref. 37]에 기술된 방법을 사용하여 겔로부터 니트로셀룰로스 막으로 옮긴다. 니트로셀룰로스 블롯을 특이적 항혈청과 배양한 다음 퍼옥시다제 표시된 염소 안티-래빗 lgG로 염색시키며 이 과정은 문헌[참조: Uitzetter, ref. 36]에 따라 수행한다. PGI 특이 항혈청과 배양하는 경우 PGI 및 PGIIIA, IIIB 및 IV에 대하여 강력한 시그날이 나타났다. PGII는 상기 항체에 대하여 다소 약한 시그날을 나타낸다. 블롯과 PGII 특이적 항혈청을 배양시키면 PGII에 대한 고강도 밴드가 생성되지만 다른 4종의 폴리갈락투로나제에 대해서는 약한 밴드만이 나타난다.
[실시예 1.3]
[폴리갈락투로나제 II의 시아노겐 브로마이드 단편의 아미노산 서열 결정]
약 100㎍의 PGII를 150㎕ 70% 포름산에 용해시키고 고체 시아노겐 브로마이드를 100배 mol 과량으로 메티오닌(4잔기/효소분자)에 가한다. 반응 혼합물을 밀폐된 반응 바이알내 실온에서 24시간 동안 연속 교반한다. 24시간 후에 물을 가하고 제제를 N로 플러싱 하여 건조시킨다. 본 단계를 반복하여 포름산을 제거한다.
15% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동한 후 약 10개의 개별적인 밴드를 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색할 수 있다. 이들은 불완전하게 절단된 단편 및 완전하게 절단된 단편을 나타낸다. 분자량이 38kDa인 온전한 단백질 외에도 다음과 같은 밴드가 관찰된다; 33, 30, 27, 19, 17, 12, 10, 7.5, 6 및 6kDa. 24시간의 반응시간 도중 일정한 간격으로 샘플을 취하여 SDS-폴리 아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석함으로써 나타난 부분 및 최종 반응 생성물의 배열 및 상호간에 대한 이들의 위치가결정된다. 17kDa 단편은 내부 단편인 반면 5kDa 단편은 C-말단 또는 N-말단에 위치한다. 이어서, 24시간 처리한 단편을 문헌[참조: Matsudaira et al., ref 4]에 기술된 방법에 따라, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막인 이모빌론-P(Immobilon-P)(Millipore제조)상에 블롯팅한다. 3개의 단편, 즉 17kDa 내부 단편 및 두개의 소단편(5 및 6kDa)을 가스상 서열 분석에 사용한다.
아미노산 서열은 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 120A PTH 분석기와 온-라인으로 연결된 어플라이드 바이오시스템즈 모델 470A 단백질 서열분석기를 사용하여 결정한다. 0.5 내지 1nmol의 특정 펩타이드를 함유하는 막 단편을 세척하여 가스상 서열 분석기상에 걸어준 다음 아몬스[참조 문헌: Amons, ref. 5]에 의해 기술된 프로그램에 따라 서열 분석을 수행한다.
5kDa 단편의 경우 다음과 같은 서열이 수득된다;
Figure kpo00017
3 위치(X)에서는 어떠한 아미노산도 검출되지 않는다. 단백질을 미리 S-피리딜에틸화시킨 경우 사용된 서열분석 프로그램은 시스테인 잔기만을 탐지하므로, 3 위치는 시스테인일 수 있다는 것이 가능하다[참조 문헌: Amons, ref. 5]. 12 위치 및 13 위치에서 미량의 ala이 괄호로 나타낸 바와 같이 나타났다. 12 위치에서의 미량은 전술한 단계에서의 불완전한 반응으로부터 기인함이 명백하며 13 위치에서의 ala의 약한 시그날은 펩타이드의 13위치에 있는 아미노산 ala를 나타낸다.
17kDa 단편의 서열은 다음과 같다;
Figure kpo00018
괄호로 나타낸 바와 같이 마지막 두 단계에서 관찰된 이소루이신 및 트레오닌의 자취는 전 단계에서의 불완전한 반응에 기인함이 명백하다.
[실시예 1.4]
[폴리갈락투로나제 I의 N-말단부의 아미노산 서열 결정]
실시예 1.1.1에 따라 정제된 100㎍의 PGI을 1ℓ 리포어 여과수에 대하여 3회 투석하고 동결건조한다. 아미노산 서열을 실시예 1.3에서 기술한 바와 같이 결정한다. 다음과 같은 N-말단 아미노산 서열이 효소에 대하여 결정된다.
Figure kpo00019
단백질내의 시스테인 잔기는 변형되지 않았으며 따라서 검출되지 않는다. 시스테인은 서열의 4 위치(X)에서 나타나는 듯하다. PGI의 N-말단 아미노산 서열은 라피다제로부터 분리된 PGII의 5kDa 시아노겐 브로마이드 단편(실시예 1.3)의 아미노산 서열 및 에이. 나이거 형질전환체 N593/pGW1800-27로부터 분리한 PGII(실시예 6.3)의 N-말단 아미노산 서열과 상동성을 나타낸다. 이러한 상동성은 시스테인이 PGI 및 PGII 서열의 4 및 3 위치에 각각 존재한다는 가정하에 다음의 도식으로 개략 된다;
Figure kpo00020
폴리갈락투로나제 II 서열에서 위치 2의 세린 잔기와 위치 3의 가정된 시스테인 잔기 사이의 빈 공간은 두 서열을 일직선으로 정렬시키기위해 도입되었다.
PGI 서열의 8 위치에 있는 세린 잔기는 PGII 서열의 상응하는 위치(7 위치)에는 존재하지 않지만 후자의 경우 유사한 유형의 아미노산, 즉 작은 하이드록실 아미노산(트레오닌)이 존재한다.
즉, PGI 및 PGII의 N-말단 아미노산 서열은 상동성을 나타내지만 동일하지는 않다. 차이점은 이들이 단일 유전자 산물의 부분 변형, 예를 들면, 부분 단백질 분해의 결과일 수 없다는 점이다. 즉 PGI 및 PGII는 동일 계통의 상이한 유전자에 의하여 암호화 된다고 결론지을 수 있다.
[실시예 1.5]
[폴리갈락투로나제 I의 시아노겐 브로마이드 단편의 아미노산 서열 결정]
약 100㎍의 PGI을 150㎕의70% 포름산에 용해시키고 고체 시아노겐 브로마이드를 첨가하여 실시예 1.3에서 기술한 바와 같이 단백질의 단편을 제조한다. 효소 분자당 4개의 메티오닌 잔기가 존재한다. 15% SDS-폴리아크릴아미드-겔에서 전기영동하고 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색한 후에 분자량이 39.5, 35, 21, 19.5 및 5.5kDa인 주요밴드가 관찰된다.
실시예 1.3에서 기술한 바와 동일한 장비 및 방법을 이용하여 21 및 5.5 kDa 단편을 서열분석한다.
21kDa 단편에 대한 서열은 다음과 같다;
Figure kpo00021
시스테인은 실시예 1.3 및 1.4에서 기술한 바와 유사하게 서열의 4 위치(X)에 존재하는 듯하다. 21kDa 단편의 서열은 실시예 1.4에 기술된 온전한 PGI 단백질의 N-말단 아미노산 서열과 동일하다.
5.5kDa 단편의 서열의 다음과 같다;
Figure kpo00022
이들 서열 데이터로부터 5.5kDa 단편이 단백질의 N-말단과 상응하지 않다는 결론이 내려진다.
[실시예 1.6]
[트립신처리 펩타이드의 아미노산 서열 결정]
PGII를 0.5%(v/v) 포름산에 대해 투석하여 부분적으로 변성시키고 이어서 동결건조시킨다, 효소(1㎎)를 1㎖의 0.2M N-에틸 모르폴리노아세테이트 완충액)pH 8.0)에 현탁시킨 다음 PGII에 대하여 1:50의 몰비로 가한 트립신(Sigma 제조)과 37℃에서 항온처리한다. 24시간 후에 아세트산을 가하여 분해를 중단시킨다(최종 농도 30%). 분해물을 동결건조시킨다. 분해물 샘플을 2.5mM 디티오트레이톨을 함유하는 0.1% 트리플로오로 아세트산에 용해시키고 37℃에서 1시간 이상 유지시킨다. 트립신 처리 펩타이드(100 내지 200㎍의 단백질을 함유하는 100㎕ 샘플)를 뉴클레오실(Nucleosil) C-18 컬럼(4.6 x 150㎜)(Supelco) 및 비닥 가드(Vydac guard) 컬럼(Chrompack)이 장착된 스펙트라 피직스(Spectra Physics) SP 8000 HPLC를 사용하여 분리한다. 25℃의 컬럼 온도, 2㎖/min의 유속 및 구배를 적용하는데, 이는 50분에 걸쳐 100% 용매 A(물중 0.1% TFA)에서 50% 용매 A + 50% 용매 B(물중 0.1% TFA)로 변화한다. 펩타이드를 214nm에서의 UV흡광도로 검출한다. 분해도중 나중에 방출되는 펩타이드중 하나는 약 21% 아세토니트릴중 크로마토그램에서 별개의 피크로부터 잘 분리되는 것으로 나타난다. 이러한 펩타이드를 25℃에서 건조 공기로 플러싱하여 건조시킨 다음 서열분석한다.
실시예 1.4에서 기술한 방법에 따라 아미노산 서열을 결정 한다. 서열은 다음과 같다;
Figure kpo00023
[실시예 2]
[에이. 나이거의 게놈성 라이브러리의 작제]
[실시예 2.1]
[에이. 나이거 N400으로부터 고분자량 DNA의 분리]
에이. 나이거 균주 N400의 분생포자를 200㎖ 최소 배지에 최종 포자밀도 106포자/㎖가 되게 접종하고 뉴 브룬스위크(New Brunswick) 회전 진탕기를 사용하여 300rpm, 28℃에서 24시간 동안 1ℓ들이 삼각 플라스크에서 진탕시킨다. 미라클로쓰(Myracloth)가 달린 부크너 깔때기를 사용하여 균사체를 여과로 수거하고 차가운 멸균 염수로 세척한 다음 액체 질소 중에 동결시켜 -60℃에서 보관하거나 직접 사용한다. 게놈성 라이브러리를 제조하기 위하여 DNA의 분리에 사용된 방법은 문헌[참조: Yelton et al., ref. 18]에 기술된 방법을 토대로 한다.
라이브러리 작제를 위하여, 10g의 균사체를 브라운(Braun) 마이크로-막 분해기내 액체 질소 중에 1g을 분쇄한다. 분쇄된 균사체를 200㎖ 추출 완충액(50mM EDTA, pH 8.5, 0.2% SDS) 및 200㎕ 디에틸피로카보네이트를 함유하는 1ℓ들이 멸균 삼각 플라스크에 옮긴다. 혼합물을 서서히 실온으로 가온하고 간헐적으로 진탕시키면서 20분간 68℃로 가열한다. 현탁액을 실온으로 냉각한 다음 12000 x g에서 15분간 원심분리한다. 1/16 용적을 8M 칼륨 아세테이트 용액(pH 4.2)을 상등액에 가하고 혼합물을 얼음 위에 1시간 동안 방치한다. 침전물을 원심분리(20분:16000xg; 4℃)로 제거한다. 15분간 얼음 위에서 0.6용적의 이소프로판올과 항온 처리함으로써 상동액으로부터 핵산을 침전시킨다. 침전된 핵산을 원심분리(10분, 6000xg, 4℃)로 수거하여 70% 에탄올로 세척한 다음 잠깐 동안 건조 시킨다. 펠렛을 20㎍/㎖ RNase A(Boehringer, Mannheim 제조)를 함유하는 10㎖ TE 중에 현탁시키고 37℃에서 15분간 항온처리한다. DNA를 37℃에서 1시간 동안 뉴클레아제 비함유 프로나제(1㎎/㎖ 최종농도)(Kochlight, Coinbrook)로 처리한다. TE 완충액중의 프로나제 원액은 뉴클레아제를 분해시키기 위하여 37℃에서 1시간 동안 예비 항온처리한 효소 20㎎/㎖를 함유한다.
85.g CsCl을 수득된 DNA 용액 9㎖에 용해시키고 0.2㎖ 10㎎/㎖ 에티듐 브로마이드를 가한 다음 이 용액을 베크만(Beckman) SW41 로터내 33000rpm에서 60시간 또는 베크만 50 Ti로터내 45000rpm에서 40시간 동안 원심분리한다. DNA 밴드를 수거하고 물 중의 NaCl 포화 용액으로 평형시킨 이소프로판올로 수희 추출하여 에티듐 브로마이드를 제거한다. 5용적의 TE를 가하고 DNA 용액을 순차적으로 TE 포화 페놀, 페놀/클로로포름/이소아밀알콜 25:24:1 및 클로로포름/이소아밀알콜 24:1로 처리한다. 0.1용적의 3M 나트륨 아세테이트(pH 5.2), 2.5용적의 에탄올을 가하고 -20℃에서 밤새 항온처리하여 DNA를 침전시킨다. 침전물을 원심분리(1h. 30,000xg, 4℃)로 수거하고 70% 에탄올로 세척한 다음 건조시키고 400㎕ TE에 용해시킨다.
[실시예 2.2]
[MboI를 사용한 에이. 나이거 N400 DNA의 부분분해 및 단편의 분리]
13.6 및 23kDa 사이의 DNA 단편을 최대량으로 생성하는 MboI 농도를 시험하기 위해서, 1㎍ 분량의 에이. 나이거 N400 DNA를 공급자가 추천하는 적절한 완충액 중에서 10㎕ 용적내 37℃에서 1시간 동안 MboI를 감소하는 양(0.5 내지 0.001U)으로 분해한다. 1㎕ 0.25M EDTA를 가하여 반응을 정지시키고 1㎍/㎖ 에티듐 브로마이드를 함유하는 TBE 완충액 중의 0.6% 아가로스겔 상에 부하시킨다.
편리한 사이즈 마커는 λDNA 및 BgIII로 분해한 49, 22.8, 13.6, 9.8, 2.3kbp 및 육안으로 볼 수 없는 0.45kbp 단편을 생성하는 λDNA의 혼합물이다. 목적하는 13.6 내지 23kbp 단편을 고수율로 생성하는데에 요구되는 MboI 농도는 약 0.02U/㎍ DNA이다. 따라서, 총 용적 2㎖중의 200㎍의 DNA를 분해하고, 효소를 가한 직후 20개의 동등한 분취량으로 세분한다. 37℃에서 1시간 경과후 분해물을 얼음위에 놓는다. 겔 상에 전개시켜 1㎕ 샘플을 적당히 분해되었는지 체크한 후에, EDTA를 최종 농도 25mM까지 가하고 효소를 65℃에서 10분간 가열하여 열-불활성화시킨 다음 샘플을 모아서 DNA를 침전, 세척, 건조시키고 400㎕ TE에 용해시킨다.
단편 DNA를 0.4% 예비 아가로스 겔(중심 웰 120 x 1.5㎜) 상에 분리시킨다. BaIII로 분해한 λDNA는 4℃ 및 40V(3V/㎝) 에서 전기영동시 부분분해된 DNA 단편의 크기를 측정하기 위한 마커로서 사용한다. 정확한 크기의 단편을 함유하는 겔 영역을 겔로부터 절단해내고 100V에서 2 내지 3시간 동안 2㎖ TBE중 멸균 투석 튜브 중의 겔로부터 DNA를 전기용출시킨다. 전류를 30초간 역류 시키고 DNA를 함유하는 완충액을 수거한다. 이어서, 단편을 에탄올 침전에 의하여 농축시키고 100μ 1 TE에 용해시킨다.
[실시예 2.3]
[벡터 DNA의 제조 및 EMBL4로 에이. 나이거 N400의 고분자량 DNA 단편의 클로닝]
에이. 나이거 균주 N400의 게놈성 라이브러리를 λ벡터 EMBL4중에 작제한다. 9 내지 23kbp 클로닝능을 갖는 벡터는 문헌[참조: Frischauf et al., ref. 9 및 Karn et al., ref. 19]에 기술되어 있으며 시판된다(Promega Biotech Inc. 제조). 게놈의 상이한 부분으로부터기원하는 이중 삽입물을 피하기 위하여, 길이가 13.6kbp인 최소 단편을 클로닝용으로 사용한다.
10㎍의 λEMBL4 DNA를 공급자에 의해 권장되는 완충액중 37℃에서 2시간동안 100㎕ 용적으로 50 단위의 BanHI을 사용하여 완전히분해한다. 효소를 65℃에서 10분간 불활성화 시킨다. NaCl 농도를 150mM로 상승시키고 50 단위의 SalI을 가한 다음 37℃에서 추가로 2시간 동안 계속 항온처리한다. EDTA를 25mM 이 되게 가하고 효소를(65℃에서 10분간 가열하여) 불활성화시킨 후에, 용액을 등용적의 페놀(TE 포화), 페놀/클로로포름/이소아밀알콜 25:24:1, 및 클로로포름/이소아밀알콜(24:1)로 추출한다. BanHI/SalI 폴리링커 소단편을 제거하기 위하여, DNA를 0.1용적의 3M 나트륨 아세테이트(pH 5.2)를 가한 후 0.6용적의 이소프로판올로 침전시킨다. 얼음 위에서 15분 및 4℃, 12000xg에서 15분간 원심분리한 후, 침전물을 70% 에탄올로 철저히 세척하고 건조시킨 다음 40㎕ TE에 용해시킨다.
[실시예 2.4]
[게놈성 에이. 나이거 N400 DNA 단편의 연결 및 시험관내 패키징]
실시예 2.3에 따라 제조한 벡터의 cos 부위를 연결반응에 앞서 어닐링시키는 것이 필수적이다. 100mM 트리스-HCl(pH 7.5) 및 10mM MgCl 중의 벡터를 65℃에서 10분간 가열한 다음 42℃에서 1시간 동안 어닐링시킨다. 시험 연결반응으로부터, 벡터: 단편의 비 약 1:1(중량 기준)이 재조합체를 가장 많이 생성하는 것으로 밝혀졌다. 연결반응은 최종용적 100㎕중 9.5㎍의 벡터 및 10㎍의 DNA 단편을 사용하여 50Mm 트리스 HCl(pH 7.5), 10mM MgCl2, 10mM DTT 및 1mM ATP 중에서 수행한다. DNA 리가제 (BRL)를 0.5U/㎍ DNA농도로 가하고 연결 혼합물을 14℃에서 밤새 배양한다. 연결반응을 시험하기 위하여, 연결된 DNA 샘플을 아가로스 겔 상에서 전개시킨다. 또한, 대조군으로서 0.5㎍의 벡터를 5㎕ 용적으로 단편의 첨가 없이 연결시킨다.
대용적의 연결 혼합물을 에탄올 침전으로 농축하고 시험관내 패키징에 앞서서 20㎕ TE에 용해시킨다. 시험관내 패키징 과정은 DNA 1㎍을 패키징하기 위하여 10㎕분량을 사용하는 제조업자의 지시에 따라 프로메가 패카진(Promega Packgene) 추출물을 사용하여 수행한다. 추출물로 제공된 1㎍의 고분자량 대조군 파아지 λcI857 Sam7을 대조군으로서 별도로 패키징한다. 패키징한 후에, 500㎕의 파아지 용액 완충액(PSB) 및 5㎕의 클로로포름을 가한다. 재조합 파아지 스톡을 4℃에서 보관한다. 수득딘 라이브러리를 두개의 독립된 연결 시험으로부터 작제한다.
[실시예 2.5]
[에이. 나이거 균주 N400 게놈성 라이브러리의 적정 및 증폭]
이. 콜라이 NM539 세포를 흡광도(600nm)가 1.0이 되도록 0.2% 말토스, 10mM MgSO4및 1mM CaCl2를 함유하는 LB 배지에 생장시킨다. 0.2㎖ 분획의 상기 배양액을 PSB 중의 적절한 파아지 희석액 0.1㎖에 가한다. 37℃에서 20분간 파아지를 흡착시킨 후 45℃의 3㎖ 0.6% LB 상단-한천(top-agar)을 가하고, 혼합물을 LB 한천 판상에 플레이팅한 다음 이들을 37℃에서 밤새 배양한다. 파아지 현탁액 ㎖당 플라그 형성 단위(pfu)의 수는 실시예 1.4에 따라 제조된 두 파아지 스톡에 대해 각각 12 x 105및 4.2 x 105pfu/㎖ 였다. 단편이 없는 대조군 연결 반응으로부터 계산된 백그라운드(각각 17% 및 40%)를 뺀 후의 재조합체의 절대수는 6 x 105개이다. 재조합체에 함유된 DNA는 에이. 나이거 게놈 200개 이상에 해당한다.
라이브러리를 증폭시키기 위하여, 80㎕ 분힉의 두 파아지 스톡을 사용하여 LB 한천 평판상의 LB 상단-한천에 플레이팅한 후 37℃에서 밤새 배양한 이. 콜라이 NM539 세포를 감염시킨다. 실온에서 1시간 동안 5㎖ PSB/평판으로 평판을 온화하게 진탕시킴으로써 아가로스로부터 파아지를 용출시킨다. PSB를 수거하여 원심 분리(6000xg에서 10분간)하여 세균을 제거하고 클로로포름(최종농도 0.5%가 되게)을 가한다. 이이서, 거의 동일한 정도로 증폭된 2개의 파아지 스톡을 혼합하고(40㎖ 스톡), 적정(8 x 109pfu/㎖) 및 4℃에서 보관한다.
[실시예 3]
[폴라갈락투로나제와 관련된 핵산에 대한 에이. 나이거의 게놈성 라이브러리의 스크리닝]
[실시예 3.1]
[폴리갈락투로나제 II의 17kDa 시아노겐브로마이드 단편을 암호화하는 올리고뉴클레오타이드 혼합물의 합성]
실시예 2에 따라 제조된 에이. 나이거의 게놈성 라이브러리를 선별하기 위한 올리고뉴클레오타이드는 어플라이드바이오시스템(모델 380 B) 올리고뉴클레오타이드 합성기로 포스포르아미다이트 법[참조: M.H. Caruthers, ref. 8]을 사용하여 합성한다. 실시예 1.2에서 기술한 17kDa 시아노겐 브로마이드 단편은 내부적으로 위치한 펩타이드이다. 따라서, 실시예 1.4에서 결정된 아미노산 서열은 N-말단에서 메티오닌 잔기로 연장시킬 수 있다. 합성된 올리고뉴클레오타이드는 유전자 코드의 변성을 감안할 때 복합 혼합물이다. 기술적인 이유로 해서, 혼합물 중의 뉴클레오타이드의 수를 감소시키는 것이 필요하다. 10 및 11 위치에서 TG 및 AC 같이 잘못 조합된 올리고뉴클레오타이드를 배제하고 혼합물의 크기를 제한하기 위하여, 암호화 본쇄 중의 서열에 상응하는 올리고뉴클레오타이드의 2개 독립된 혼합물을 유전자 코드의 변성을 감안하여 합성한다. 필요한 올리고뉴클레오타이드의 수는 합성된 29량체의 4개의 상이한 위치에 불안정한 염기로서 이노신을 도입시킴으로써 더욱 감소되며 따라서 각 혼합물은 16개의 상이한 올리고뉴클레오타이드로 이루어진다[참조: Ohtska et al., ref. 16]. HR6195 및 HR6196 으로 명명된 두 혼합물은 다음의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를 나타내며 조성은 다음과 같다;
Figure kpo00024
상기에서,
I는 이노신이고,
R1은 T 또는 C이며,
R2는 A 또는 G이다.
[실시예 3.2]
[폴리갈락투로나제 I의 5.5kDa 시아노겐 브로마이드를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드 혼합물의 합성]
실시예 1.5에서 기술한 5.5kDa 시아노겐 브로마이드 단편은 CNBr 절단에 의해 제조된 내부적으로 위치하는 펩타이드이다. 따라서, 이의 아미노산 서열은 N-말단에서 메티오닌 잔기로 연장시킬 수 있다. 필요한 올리고뉴클레오타이드의 수는 합성된 32량체의 5개의 상이한 위치에 불안정한 염기로서 이노신을 도입시킴으로써 감소시킨다.
이렇게 함으로써 혼합물은 24개의 상이한 올리고뉴클레오타이드로 제한된다. HR6298로 명명된 이 혼합물은 다음과 같은 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를 나타내며 조성은 다음과 같다;
Figure kpo00025
상기식에서,
I는 이노신이고,
R1은 T 또는 C이며,
R2는 T, C 또는 A이다.
[실시예 3.3]
[올리고뉴클레오타이드의32P-표지]
동결건조된 올리고뉴클레오타이드 혼합물 HR6195, HR6196 및 HR6298을 29μM 농도로 증류수에 용해시킨다. 이들 용액의 샘플을 10배 희석시켜 반응 혼합물을 제조한다. 반응 혼합물은 50mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 5mM DTT, 0.1mM EDTA 및 0.1mM 스퍼미딘인 50㎕ 키나제 완충액[참조 문헌: Maniatis, et al., ref. 6, page 122]중의 20pmol HR6196과의 20pmol 올리고뉴클레오타이드 혼합물 HR6195 또는 40pmol HR6298 단독, 34pmol의 [γ-32P]-ATP(NEN, 6000 Ci/mmol) 및 30단위의 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(BRL)로 이루어진다. 37℃에서 30분간 항온 처리한다. 4㎕의 0.5M EDTA(pH 8.)를 가하여 반응을 중단한다. 반응 혼합물은 게놈성 라이브러리를 선별하거나(실시예 3.4) 써던 블롯을 프로브화하기 위하여(실시예 3.6) 정제하지 않고 사용한다.
[실시예 3.4]
[에이. 나이거 N400 라이브러리의 스크리닝]
전술한 에이. 나이거 균주 N400(실시예 2)의 게놈성 라이브러리 일부를 SM에 희석시키고 각기 약 2000pfu를 함유하는 0.1㎖ 분량을 플레이팅 한다. 숙주세포는 0.2% 말토스가 보충된 LB 배지 50㎖에 LB 배지중 이. 콜라이 NM539의 밤새 배양액 0.5㎖을 접종하고 갈렌캠프(Gallenkemp) 궤도 진탕기상 37℃에서, 250rpm으로 4시간 동안진탕시키고 0.5㎖ 1M MgSO4및 0.5㎖ CaCl2를 가한다. 이들 세포의 0.2㎖ 분취량을 파아지 현탁액 0.1㎖와 각각 혼합하고 이들 혼합물을 실온에서 30분간 배양한다. 이어서, 47℃에서 LM 배지 중의 0.7% 아가로스 3㎖를 가하고 짧게 와동시킨 다음 LM 한천 평면상에 즉시 플레이팅한다. 평판을 37℃에서 밤새 배양하고 4℃에서 2시간 동안 냉각시킨다.
각각의 평판으로부터 두개의 레플리카를 벤튼 및 데이비스 플라그 하이브리드화 법(ref. 7)에 따라제조한다. 제1 필터(Schleicher and Schuell BA 85)를 평판의 상단에 1분간 놓고 제2 레플리카는 2분간 놓아둔 다음 레플리카의 위치를 인디아 잉크를 사용하여 표시한다. 필터를 제거한 후 이들을 100㎖의 변성 용액(1M NaCl, 0.5M NaOH)을 함유하는 디쉬에 0.5분, 이어서 100㎖ 중화 용액(0.5M 트리스 0HCl pH 7.5, 1.5M NaCl)을 함유하는 디쉬에 1분간 놓아둔다. 필터를 3 x SSC를 함유하는 디쉬에 옮긴 다음 장갑낀 손으로 부드럽게 문질러서 세균 조각을 제거하고 3 x SSC로 세정한다. 필터를 블롯팅하고 실온에서 10분간 건조시킨 다음 80℃에서 2시간 동안 오븐내 와트만 3MM 페이퍼상에서 가열처리한다.
가열처리한 필터를 3 x SSC로 습윤시키고 상기 용액에서 1시간 동안 실온으로 세척한 다음 올리고뉴클레오타이드 혼합물 HR6195 및 HR6196을 사용할 경우에는 2 x SSC로 및 올리고뉴클레오타이드 혼합물 HR298을 사용하는 경우에는 1 x SSC로 이루어지고 추가로 10 X 덴하르트(0.2% BSA, Boehringer 분획 V; 0.2% Ficoll 400. Pharmacia, 0.2% 폴리비닐피롤리돈-10, Sigma), 0.1% SDS 및 0.1㎎/㎖ 전단되고 새로 변성시킨 청어 정자 DNA로 이루어진 250㎖ 예열(65℃)시킨 예비하이브리드화 혼합물을 함유하는 디쉬에 옮긴다. 예비 하이브리드화 과정은 진탕 수조내 65℃에서 5시간 동안 수행한다. 이어서, 필터를 청어 정자 DNA가 없는 것을 제외하고는 예비하이브리드화 혼합물과 동일한 250㎖의 예열(65℃)시킨 하이브리드화 혼합물 중에 30분간 1회 세척한다. 이어서, 필터를 미리 표지한 합한 올리고 뉴클레오타이드 혼합물 HR6195 및 HR6196(실시예 3.1) 또는 표지된 혼합물 HR6298를 새로 가한 150㎖의 예열(65℃)시킨 하이브리드화 혼합물을 함유하는 상이한 디쉬에 넣는다.
HR6195 및 HR6196을 사용하는 경우, 디쉬는 65℃에서 진탕수조에 넣고 온도계를 47℃로 조절한 다음 하이브리드화 과정을 14시간 동안 진행한다. 필터를 47℃에서 30분간 250㎖ 예열(47℃)시킨 하이브리드화 혼합물에서 1회 세척한 다음 각각 45분간 250㎖ 2 x SSC를 2번 교환하면서 실온에서 세척한다. 250㎖의 예열(63℃)시킨 6 x SSC, 0.05% 나트륨 피로포스페이트를 함유하는 디쉬에 필터를 옮김으로써 엄격한 세척을 실시한 후 진탕수조내 63℃에서 30분간 항온처리한다. 이어서 필터를 실온에서 각각 30분간 2 SSC를 2회 교환하면서 세적한다. 필터를 공기 중에서 건조시키고 와트만 3MM 페이퍼 지지체상에 고정시킨 다음 플라스틱 랩으로 씌우고 강화 스크리닝을 사용하여 -60℃에서 3일간 코닥 XAR5 필름에 노출시킨다.
이와 같은 방법으로, 스크리닝한 6개의 평판으로부터 6개의 양성 시그날을 수득한다. 잉크 마커를 사용하여 오토래디오그램상에 평판을 조심스럽게 위치시킴으로써 멸균 파스 퇴ㄹ 피펫으로양성 플라크를 펀칭해낸다. 양성 플라크를 함유하는 한천 조각을 1㎖ SM에 가하고 2.5㎕의 클로로포름을 가한다. 파아지를 간헐적으로 와동시키면서 1시간 동안 실온에서 한천으로부터 확산하도록 한후 4℃에서 밤새 배양한다. 한천 및 세균 세포 조각을 5분간 원심분리하여 제거하고 2.5㎕의 클로로포름을 가하며 파아지 스톡을 4℃에서 보관 한다.
양성 클론을 λC 내지 λG 및 λI로 명명한다. 파아지가 고밀도로 플레이팅됨으로써 양성 플라그는 이들을 저밀도로 플레이팅하고 레플라카 플레이팅의 완전한 과정을 반복하며 하이브리드화 한 다음 양성 플라그를 선택함으로써 2회 정제한다.
올리고뉴클레오타이드 혼합물 HR6298을 사용하는 경우, 디쉬를 65℃에서 진탕 수조에 넣고 온도를 52℃로 조절한 다음 14시간 동안 하이브리드화시킨다. 이어서, 필터를 52℃에서 30분간 250㎖의 예열(52℃)시킨 하이브리드화 혼합물에서 1회 세척하고 이어서 실온에서 각각 45분간 250㎖ 2 x SSC를 2회 교환해주면서 세척한다. 계속해서, 250㎖의 예열(64℃)된 4 x SCC, 0.05%(w/v) 나트륨 피로포스페이트를 함유하는 디쉬에 필터를 옮김으로써 엄격히 세척한 다음 이를 64℃에서 0.5시간 동안 진탕수조에서 항온처리한다. 이어서, 필터를 각각 30분간 2 x SSC를 2회 교환해주면서 실온에서 세척한다. 필터를 공기 중에서 건조시키고 와트만 3MM 페이퍼의 지지체상에 고정시킨 다음 플라스틱 랩으로 씌우고 강화 스크리닝을 사용하여 -60℃에서 3일간 코닥 XAR5 필름에 노출시킨다.
이와 같은 방법으로, 스크리닝한 6개의 평판으로부터 9개의 양성 시그날을 수득한다. 잉크 마커를 사용하여 자가 방사선그래프상에 평판을 조심스럽게 위치시켜 멸균 파스퇴르피펫으로 양성 플라크를 펀칭해낸다. 양성 플라크를 함유하는 한천 조각을 1㎖ SM에 가하고 2.5㎕의 클로로포름을 가한다. 파아지를 1시간동안 간헐적으로 와동시킴에 의해 실온에서 한천으로부터 확산시킨 다음 4℃에서 밤새 배양한다. 한천 및 세균 세포 조각을 5분간 원심분리하여 제거하고 2.5㎕의 클로로포름을 가한 다음 파아지 스톡을 4℃에서 보관한다.
양성 클론은 PGI-λ1내지 9로 명명한다. 양성 플라그는 이들을 60℃에서 수행한 하이브리드화에 대한 이질성 프로브로서 pGW1803(실시예 3.8 참조)의 1.2kbp BamHI/EcoRI 단편을 사용하여 저밀도로 플레이팅하는 한편 60℃의 2 x SCC에서 세척 과정을 수행함으로써 추가 정제한다.
[실시예 3.5]
[λDNA의 분리]
재조합 클론으로부터 DNA를 분리하기 위하여, 파아지를 우선 증폭시킨다. 이와 같은 목적을 위하여, 이. 콜라이 LE392 숙주세포를 10mM MgSO4및 0.2% 말토스로 보충한 LB-배지중에 흡광도(600nm) 1.0까지 생장시킨다. 이어서, 정제된 파아지 스톡 50㎕를 실시예 2.5에서 기술한 바와 같이 별도로 플레이팅한다. 37℃에서 밤새 배양한 후 5㎖ SM을 평판 전반에 걸쳐 화산시키고 온화하게 진탕시키면서 2시간 동안 배양함으로써 비합치성 평판으로부터 파아지를 용출시킨다. 용출된 파아지를 수거하고 0.1㎖ 클로로포름을 가한다.혼합물을 짧게 와동시키고 원심분리로 세포 파편을 제거한다. 상동액을 회수하고 클로로포름을 0.3%가 되게 가한 다음 생성된 평판 용해물을 4℃에서 보관한다.
파아지 DNA 분리를 위한 출발물질로서 거의 합치성인 플레이트를 수득하기 위하여, 10㎕ 분량의 평판 용해물을 이. 콜라이 LE 392 숙주 세포와 플레이팅한다. 37℃에서 밤새 배양한 후 아가로스 상부층을 3개의 거의 합치성인 평판으로부터 긁어낸다. 이들 층을 합하여 20㎖ SM 및 0.4㎖ 클로로포름을 가하고 생성된 혼합물을 37℃에서 30분간 진탕시킨다. 세포 파편 및 아가로스를 원심분리로 제거하고 상등액을 제거한 다음 이의 용적을 SM을 사용하여 18㎖로 조절한다. SM 중의 동용적의 2M NaCl, 20% PEG 6000(BDH, Poole, GB)을 가하고 용액을 혼합한 다음 얼음 위에 놓는다. 75분 후에 4℃, 12000xg에서 20분간 원심분리시켜 펠렛화한다. 상등액을 따라내고 잔류 액체를 크리넥스 티슈로 제거한다. 펠렛을 3㎖ SM에 재현탁시키고 계속해서 3㎖ 클로로포름으로 추출한다. 수성상을 37℃에서 20분간 RNase A(67㎍/㎖) 및 DNase I(33㎍/㎖)로 처리한다. 이어서, 이 혼합물을 2㎖ 페놀을 가하고 와동시키며 1㎖ 클로로포름을 가하고 다시 와동시킨 다음 원심분리로 2개의 상을 분리함으로써 추출시킨다. 수성상을 각각 3㎖의 페놀/클로로포름(1:1) 및 3㎖의 클로로포름으로 2회 더 추출시킨다. 이어서, 0.3㎖ 3M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2) 및 6㎖ 에탄올을 순차적으로 가하여 수성층으로부터 DNA를 침전시킨다. 이 혼합물을 4℃에서 16시간 동안 방치하고 원심분리(10분, 12000xg, 4℃)로 DNA를 회수한다. 펠렛을 04.㎖ TE 완충액에 용해시키고 RNase A를 가하여 200㎍/㎖가 되게 한 다음 37℃에서 1시간 동안 항온처리한다. 38㎕ 3M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2) 및 0.8㎖ 에탄올을 4℃에서 1시간 동안 첨가하여 DNA를 침전시킨다. DNA를 원심분리로 회수하고 계속해서 TE 완충액 100㎕에 용해시킨다.
[실시예 3.6]
[에이. 나이거 N400 PGII 및 PGI λ콜론의 제한분석]
PGII 유전자 서열을 함유하는 양성 파아지로부터, 추가 분석을 위해 λD 및 λE를 선별한다. 먼제, 제한 효소 분석에 의해 두 파아지가 에이. 나이거 게놈의 동일 영역으로부터 유도된 삽입물을 함유함을 확립한 다음 λE의 부분 제한 지도를 작제한다.
2㎍의 파아지 DNA를 0.8㎎/㎖ RNase A 존재하여 공급자(BRL) 추천에 따라 완충액중 37℃에서 3시간 동안 100㎕ 용적으로 20 단위의 EcoRI 또는 BamHI 또는 이들 효소를 병용하여 분해한다. 이어서, 10㎕의 3M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2)을 가하고 혼합물을 80㎕의 클로로포름으로 추출한다. 250㎕의 에탄올을 가하여 수성상으로부터 DNA를 침전시키고 혼합물을 1시간 동안 얼음 위에 놓는다. 원심분리로 DNA를 수거하고 25㎕의 1X 샘플 완충액에 용해시킨 다음 65℃에서 10분간 가열한다. 샘플을 사이즈마커로서 HindIII로 분해한 1㎍의 λDNA(BRL)을 사용하여 0.7% 아가로스 겔상에서 수행한다. 겔은 폴라로이드 667 필름을 사용하여 UV 투광기 상에서 촬영한다. DNA를 문헌[참조: 'Maniatis et al. pp. 382-386; ref. 6]에 기술된 바와 같이 써던(Southern, 1975) 방법에 따라 니트로 셀룰로스 막(Schleicher Schuell BA85)에 옮긴다. 이어서, 막을 가열하고 실시예 3.3에서 기술한 바와 같이 혼합 및 표지시킨 올리고뉴클레오타이드 혼합물 HR6195 및 HR6196과 하이브리드화 시킨다.
이미 알고있는 마커 밴드와 비교하여 사진 촬영 및 자가 방사선그래프로부터 단편의 길이를 계산해낸다. 파아지 λD 및 λE로부터 분리된 DNA를 EcoRI, BamHI 및 이들 효소 혼합물을 각각 사용하여 분해한 후에 수득된 5kbp 이하의 단편의 크기를 각각 표 III에 나타냈다. 사용된 전기영동 시스템의 해상력 으로는 좀 더 큰 단편을 비교하는 데에는 별 의미가 없다. 표 III에 나타낸, EcoRI 분해물의 감소된 강도를 갖는 몇몇 밴드가 존재하는 것으로부터 판단해 볼때, EcoRI은 DNA를 완전하게 분해시키지 않았다. EcoRI/BamHI 이중 분해물에는 존재하지만 단일 분해물 중 하나에는 존재하지 않는 단편은 동일한 크기 범위의 BamHI 단편과 비교하여 필적할만한 강도를 나타낸다. 따라서, 이들은 완전히 분해된 생성물을 나타내야 한다. 합한 올리고 뉴클레오타이드 혼합물 HR6195 및 HR6196과 하이브리드화되는 단편은, λE의 경우에 있어서, BamHI 분해시 10kbp 보다 큰 단편, 7.4kbp EcoRI 단편 및 EcoRI 분해시 10kbp 보다 큰 단편 및 2.8kbp 단편 뿐만 아니라 BamHI/EcoRI 이중분해시 10kbp 보다 큰 단편이다.
λD의 경우, 합한 올리고뉴클레오타이드 혼합물 HR6195 및 HR6196과 하이브리드화되는 단편은; BamHI 분해시 10kbp 보다 큰 단편, 5.8kbp 단편 및 EcoRI 분해시 10kbp 보다 큰 단편 및 1.2kbp 단편 뿐만 아니라 BamHI/EcoRI 이중 분해시 10kbp 보다 큰 단편이다. 더 많은 단편이 예를 들면, EcoRI 분해로 관찰 되는 경우, 비교적 큰 단편은 부분 분해에 의해 야기된 생성물로 간주된다. 올리고뉴클레오타이드 혼합물을 사용하여 λD 및 λE로부터 수득된 동일한 크기의 단편의 하이브리드화는 관찰 되지 않는다.
전술한 바와 같이 파아지 λD 및 λE 간의 차이점으로 부터, 파아지 λD와 λE가 동일하지 않은 것으로 결론지워진다. 그러나, 표 III은 λD와 λE에서 크기가 동일한 2개의 EcoRI 단편, 3개의 BamHI 단편 및 4개 이상의 BamHI-EcoRI 단편을 나타내고 있다. 벡터내에 아스퍼질러스 DNA의 단편을 삽입시키기 위하여 사용된 BamHI 부위, 이들 BamHI 부위를 플랭킹함으로써 삽입물을 플랭킹하는 EcoRI 부위를 제외하고는 벡터가 EcoRI 또는 BamHI 부위를 함유하지 않으므로 이들 단편은 이들 파아지의 삽입물로부터 기원되어야 한다[참조 문헌: Frischauf et al., ref. 9]. 따라서, 파아지 λD 및 λE의 삽입물은 에이. 나이거 게놈의 동일영역으로부터 유도된 것으로 결론지어진다. λD로부터의 관련된 하이브리드화 BamHI-EcoRI 단편이 λE로부터의 상응하는 단편보다 작다(1.2kbp:2.8kbp)는 사실 및 제한 패턴에서의 관찰된 차이점이 클로닝 인공물에 의한 결과가 아니라는 가정하에서, λD의 하이브리드화 1.2kbp BamHI-EcoRI 단편의 EcoRI 부위는 에이. 나이거 DNA로 유도된 것이 아니라 상기 파아지의 삽입물을 플랭킹해주는 EcoRI 부위 중 하나이다. 또한, 올리고뉴클레오타이드 혼합물과 하이브리드화하는 서열을 능가하여 λD의 삽입물이 한 방향으로 1.2kbp 정도 연장된다. 게다가, 올리고뉴클레오타이드 혼합물과 하이브리드화하는 λE의 서열이 하이브리드화하는 2.8kbp BamHI-EcoRI 단편의 경계에 있는 BamHI 부위로부터 1.2kbp 내에 존재하는 것으로 추론된다(제1도).
Figure kpo00026
λE의 부분제한 지도를 작제하기 위하여, 파아지 DNA를 EcoRI, XbaI, HindIII 및 이들 효소의 모든 가능한 조합을 이용하여 분해한다. 이러한 과정은 2단계로 수행한다. 먼저, 6㎍의 DNA를 공급자(BRL)에 의해 권장된 완충액 + RNase A(2㎎/㎖)를 함유하는 200㎕ 용적 중에서, 200U의 EcoRI의 존재 또는 부재하에 37℃에서 105분간 항온처리한다. 이어서, 반응 혼합물을 100㎕ 페놀/클로로포름(1:1)에 이어 100㎕ 클로로포름으로 추출한다. 0.1 용적의 3M 나트륨아세테이트 완충액 및 2용적의 에탄올을 가하여 수성상으로부터 DNA를 침전시킨다. 얼음 위에서 10분간 방치한 후 침전물을 원심분리로 수거한다. 펠렛을 공기건조시키고 100㎕ TE 완충액에 용해시킨다. 이어서, 이들 용액을 제한 효소의 부재하에(EcoRI 분해 물질만 사용) 또는 HindIII, XbaI의 존재하에 또는 이들 효소의 병용 하에 후속 배양에 사용한다. 배양은 10㎕의 적절한 DNA 용액, RNase A(2㎎/㎖), 10U의 적절한 제한효소 및 공급자(BRL)에 의해 권장된 완충액을 함유하는 20㎕ 용적으로 37℃에서 2시간 동안 수행한다. 5배 농축한 샘플 완충액을 5㎕ 가하여 항온처리를 정지시키고 계속해서 샘플을 전술한 바와 같이 분석한다.
자가방사선 그래프상에서 10kbp 초과의 단일 하이브리드화 밴드가 HiniIII, XbaI 또는 이들 두 효소를 병용한 분해물에서 검출된다. 비록 강도는 비교적 낮지만 거의 동일한 크기의 밴드가 모든 기타 분해물에 존재하는데 이는 효소가 DNA를 완전하게 분해하지 않았음을 나타낸다. EcoRI 분해시 두번째 및 가장 강력하게 하이브리드화하는 밴드는 7.4kbp 단편을 나타난대. 이 또한 분완전한 분해를 나타내는데 이러한 밴드는, 비록 강도는 좀더 낮지만, EcoRI 및 제2 효소를 사용한 분해물에 존재한다. 추가로, EcoRI/HindIII 2중분해 및 EcoRI/HindIII/XbaI 3중분해는 3.6kbp의 하이브리드화 단편을 생성한다. 4.1kbp 하이브리드화 단편이 EcoRI 및 XbaI 효소에 의한 2중 분해물에서 검출된다. 상기 단편은 또한 효소 EcoRI, HindIII 및 XbaI에 의한 3중 분해물에 존재하지만 강도는 매우 낮다. 후자의 경우, 4.1kbp 단편은 부분분해 생성물로서 간주된다.
혼합된 올리고뉴클레오타이드 혼합물 HR6195 및 HR6196과 하이브리드화하는 7.4kbp EcoRI 단편은 효소 XbaI, HindIII 또는 BanHI중 하나로 절단할 수 있고 이들 효소의 절단부위 위치는 제1도에 도시한 바와 같아야 하는 것으로 결론지워진다. 제1도는 부분 제한지도일 뿐이며 예를 들면, 7.4kbp EcoRI 단편은 여전히 효소 HindIII, XbaI 및 BamHI중 어느 하나에 대한 하나 이상의 절단부위를 함유할 수 있지만 그러한 경우에 혼합된 올리고뉴클레오타이드 혼합물 HR6195 및 HR6196과 하이브리드화하는 특정 서열에 가장 근접한 부위만 나타난다.
파아지 λD의 경우 어떠한 XbaI 또는 HindIII 분해도 수행되지 않지만 XbaI 및 HindIII 제한부위는 파아지 λE에서와 같이 위치한다고 가정된다.
PGI 유전자 서열을 함유하는 9개의 양성 클론으로부터 추가의 분석을 위하여 4개의 파아지 PGI-λ4, λ4, λ6 및 λ7을 선별한다. 먼저, 파아지가 에이. 나이거 게놈의 동일 영역으로부터 유도된 삽입물을 함유하는 것으로 확립한 다음 파아지 D 및 E를 함유하는 PGII 유전자 서열에 대하여 전술한 바와 같이 λ5의 부분 제한 지도를 작제한다. DNA를 효소 공급자에 의하여 권장된 제한효소(표 IV)를 사용하여 분해한다. 단편을 전술한 바와 같이 아가로스 겔상에 분리하고 니트로셀룰로스에 블롯팅한다. 이어서, 막을 굽고 PGII를 암호화하는 구조 유전자의 닉-해독된 1.2kbp BamHI/EcoRI 단편과 하이브리드시킨다. 이 단편은 실시예 3.8에서 기술한 플라스미드 pGW1803으로부터 유래된다. 단편을 아가로스 겔의 절편으로부터 분리하고 50ng의 단편을 문헌[참조: Maniatis et al., pp 109-112; ref. 6]에 기술된 바와 같이 닉-해독한다.
이를 하이브리드화 혼합물에 가하기에 앞서 닉-해독된 DNA를 비등수조내에서 10분간 변성처리한다. 니트로셀룰로스 필터를 예비 하이브리드화 및 하이브리드화 온도가 60℃인 것을 제외하고는 실시예 3.8에서기술한 방사능 프로브와 하이브리드화시킨다. 이이서, 막을 일련의 예비가온한 완충액을 사용하여 60℃에서 세척한다. 먼저 막을 6 x SSC로 세정하고 하이브리드화 완충액중 0.5시간 동안 2회 세척한다. 이어서, 필터를 완충액당 30분간 4 x SSC 및 2 x SSC 에서 순차적이로 세척한다. 이들 완충액은 0.1% SDS 및 0.1 NaPOx 10HO 둘다를 함유한다. 최종 세척 후, 막을 0.1 x SSC에서 잠시 세정한 다음 건조시키고 계속해서 X-선 필름에 노출시킨다.
사용된 프로브는 PGII 프로모터 영역의 일부(200bp)와 암호화 서열의 대부분을 나타낸다. 기술된 하이브리드화 조건하에서, 이러한 프로브는 PGI 유전자 서열을 함유하는 앞에서 분리한 모든 파아지(실시예 3.4)에 대해 강한 시그날을 생성한다.
이미 알고있는 마커 밴드와 비교하여 사진 촬영 및 자가방사선그래프로부터 단편 길이를 계산해낸다. 하이브리드화 단편 및 이들의 대략적인 크기를 표 IV에 나타냈다.
Figure kpo00027
표 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 모든 파아지는 6.4kbp의 EcoRI 단편 및 2.0kbp 의 XhoI/EcoRI 단편을 함유하는 반면에 EcoRI/BamHI 이중분해에서도 6.4kbp 단편이 생성됨이 자명하다. 파아지 λ4. λ5 및 λ7도 BamHI(8.6kbp) 및 BamHI/BglII(7.5kbp)로 분해할 때 동일한 단편을 생성한다. 벡터는 아스퍼질러스 DNA 단편을 삽입하기 위해 사용된 BamHI 부위를 제외하고는 BamHI 부위를 함유하지 않는다[참조: Frischauf et al., ref. 9]. 다라서, 이들 세 파아지의 삽입물은 에이. 나이거 게놈의 동일영역으로부터 유도된 것으로 생각된다.
부분 제한지도를 작제하기 위하여 λ5 파아지 DNA를 KpnI, SmaI, SstI과 SalI 및 이들 효소와 배합된 BamHI로 분해한다. 또한, BglII/XhoI 분해물을 분석한다. 이들 모든 항온처리물을 SmaI(30℃)의 경우를 제외하고는 37℃에서 3시간동안 1㎍ 파아지 DNA를 함유하는 20㎕ 용적으로 항온처리한다. 60℃에서 PGII 프로브와 하이브리드화되는 단편을 표 5에 수록하였다.
Figure kpo00028
PGI-λ5의 제한지도를 하이브리드화 단편으로부터 디자인 할 수 있고 이로부터 폴리갈락투로나제 I을 암호화하는 유전자가 8.6kbp BamHI 단편상에 위치한다고 결론지을 수 있다.
[실시예 3.7]
[pGW1800 및 pGW1803의 작제]
파아지 λD 및 λE의 관련된 EcoRI-XbaI 제한 단편을 pEMBL벡터[참조 문헌: Dente and Cortese, ref. 10]에 삽입시킴으로써 각각 플라스미드 pGW1803 및 pGW1800을 생성시킨다.
제1도 및 실시예 3.5로부터, 파아지 λD가 파아지 λE의 4.1kbp EcoRI-XbaI 단편의 일부와 동일한 2.5kbp EcoRI-XbaI 단편을 함유해야 하는 것으로 추론된다. 6㎍의 λD DNA를 37℃에서 2시간 동안 BRL에 의해 추천한 완충액 + RNase A(1.5㎎/㎖)중 200㎕ 용적으로 60U의 XbaI로 분해한다. 이이서, NaCl 농도를 140mM 농도가 되게 조절하고 농축된 반응 완충액을 가하여 용적을 증가시키며 60U의 EcoRI을 가한 다음 230㎕ 용적으로 2.5시간 동안 계속 항온처리한다. 이어서, 반응 혼합물을 100㎕의 클로로포름으로 추출하고 DNA를 0.1용적의 3M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2) 및 2용적의 에탄올을 가하여 수성 상으로부터 침전시킨다. 4℃에서 16시간 동안 항온처리한 후 DNA를 원심분리하여 회수하고 펠렛을 공기 건조시키며 이이서 셈플 완충애에 용해시킨다. 제한 단편을 에티듐 브로마이드를 함유하는 0.5 x TBE 완충액중 0.6% 저융점 아가로스(BRL) 겔에서 분리한다. DNA 단편을 UV 광 하에 가시화하고 2.5kbp EcoRI-XbaI 단편을 함유하는 겔 절편을 분리한다.
파아지 λE DNA를 전술한 바와 같이 필수적으로 제한 효소 XbaI 및 EcoRI과 함께 항온처리한다. 클로로포름으로 추출한 다음 DNA를 침전시키고 원심분리로 펠렛화한 다음 동일 완충액에 용해시키고 1 x TBE 완충액중 0.6% 아가로스 겔 상에서 전기영동한다. 4.1kbp XbaI-EcoRI 단편을 함유하는 겔 절편을 회수하여 -20℃에서 보관한다. 실란 처리한 글라스 울의 플러그를 60㎕의 고 TE 완충액(100mM 트라스-HCl, pH 8.0, 10mM EDTA)을 함유하는 0.5㎖ 미세 원심분리 시험관의 바닥에 넣는다. 겔 박편을 해동시켜 시험관에 넣고 시험관을 액질 질소 중에 동결시킨다. 작은 관의 바닥에 작은 구멍을 뚫고 1.5㎖ 미세 원심분리 시험관에 넣고 겔 절편으로부터 완충액 및 DNA를 원심분리하여 수거한다. 겔 절편의 나머지를 50㎕의 고 TE 완충액에 재현탁시키고 이 현택액을 액체 질소 중에 다시 동결시킨 다음 완충액을 원심분리로 수거한다. 이어서, 용출물을 합하여 100㎕의 클로로포름을 추출한다. DNA를 수성상으로부터 침전시키고 원심분리로 수거한 다음 40㎕의 TE 완충액에 용해시킨다. DNA 농도는 대조용으로서 HindIII로 분해된 λDNA(BRL) 1㎍을 사용하여, 아가로스 겔 전기영동한 다음 UV 하에 밴드를 가시화함으로써 계산한다.
제공자(BRL)의 권장조건하에서 XbaI 및 EcoRI으로 순차적으로분해시켜 pEMBL18 및 pEMBL19 벡터를 제조한다. 클로로포름 용액으로부터 이소아밀 알콜을 제외시키고 DNA 침전에 사용된 온도가 4℃인 것을 제외하고는, 문헌[참조: Maniatis, ref. 6]에 기술된 방법에 따라 DNA를 페놀, 페놀/클로로포름(1:1) 및 클로로포름으로 추출하고 DNA를 에탄올로 침전시킨다.
DNA 단편을, BRL이 권장한 완충액 + ATP(1mM), 1.5U의 T4 DNA 리가제(BRL), 전술한 바와 같이 제조한 벡터 DNA 100ng 및 관련된 제한 단편을 함유하는 25㎕의 반응용적 중에서 적저한 벡터와 연결시킨다. XbaI 및 EcoRI 분해된 pEMBL18을 pGW1800 + 동물량의 정제된 λE의 4.1 XbaI-EcoRI 단편의 작제에 사용한다.
반응 혼합물을 16℃에서 16시간 동안 항온처리한 다음 125㎕의 증류수를 가하여 반응을 정지시키고 동결시킨다. XbaI 및 EcoRI 분해된 pEMBL19를 pGW1803의 작제에 사용한다. 이 경우, D의 2.5kbp XbaI-EcoRI 단편을 함유하는 아가로스 절편을 60℃에서 용융시키고 약 15ng의 DNA를 함유하는 4㎕를 11㎕의 중류수에 가한 다음 반응 혼합물의 다른 성분을 가한다. 20℃에서 14시간 동안 연결반응을 진행시키고 추가로 1 단위의 T4 DNA 리가제를 가한다. 추가로 7시간 동안 계속 반응시키고 전술한 바와 같이 반응을 정지시킨다.
얼음 위의 플라스크에 놓기 전에 이. 콜라이 DH5αF' 및 이. 콜라이 JM109를 0D가 각각 0.7 및 0.9가 되도록 생장시키는 것을 제외하고는, 50㎕의 생성된 연결 반응 혼합물을 사용하여 BRL M13 클로닝/디데옥시 서열분석 메뉴얼(pp. 30-33; ref. 11)에 기술된 바와 같이 이. 콜라이를 형질전환시킨다. 전자의 균주는 λD 단편과의 연결반응 혼합물을 사용하여 형질전환시키고 후자의 균주는 λE 단편과의 연결반응 혼합물을 사용하여 형질전환시킨다. 열 충격을 준 후에 세포를 얼음 위에서 2분간 항온처리하고 1㎖의 LB 배지를 가한 다음 세포를 37℃에서 1시간 동안 항온처리한다. 세포를 저속도 원심분리로 펠렛화하고 1㎖의 상등액을 제거한 다음 세포를 온화하게 재현탁시킨다. 이어서, 세포를 100㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 IPTG/X-gal 용액(=200㎕ HO, 2% X-gal을 함유하는 30㎕ 디메틸포름아미드 및 물중의 20㎕의 24㎎/㎖ IPTG 용액)을 도포시킨 LB 한천 평판에 플레이팅한다. 플레이트를 37℃에서 밤새 항온처리한다.
수개의 단일 백색 콜로니는 사용하여 0.1% 글루코스 및 75㎍/㎖ 암피실린을 보충한 LB 배지 중의 밤새 배양액을 제조한다. 이들 배양액을 사용하여 문헌[참조: Holmes and Quigley (ref. 12)]의 미니프렙 방법(miniprep method)에 따라 플라스미드를 분리한다. 플라스미드를 공급자(BRL)의 권고에 따라 RNase A(0.5㎎/㎖) 존재하에 수개의 제한 효소로 분해하고 생성물을 아가로스 겔상에서 분석한다. 예측된 크기의 XbaI-EcoRI, BamHI-EcoRI 및 HindIII 단편을 생성하는 플라스미드를 선별하고 이들을 함유하는 이. 콜라이 세포를 -20℃에서 클리세롤상에 유지시킨다.
2개의 새로운 플라스미드가 작제된다. pGW1800은 벡터 pEMBL18에 삽입된 파아지 λE의 4.1kbp XbaI-EcoRI 단편이다. pGW1803은 벡터 pEMBL19에 삽입된 파아지 λD의 2.5 kbp XbaI-EcoRI 단편이다.
[실시예 3.8]
[pGW1800 및 pGW1803의 제한분석]
pGW1800과 pGW1803간의 관계는 확장된 제한 분석에 의하여 확인된다. 혼합된 올리고뉴클레오타이드 HR6195 및 HR6196과 하이브리드화되는 특정 서열을 pGW1803의 특정 영역으로지정한다. 에이. 나이거 유래 DNA 단편의 결실 또는 연결 같은 클로닝 인공물의 부재는 플라스미드 pGW1800 및 에이. 나이거 N400 DNA로부터 수득된 각 제한 단편을 비교함으로써 확립된다.
pGW1800 및 pGW1803을 각각 이. 콜라이 균주 JM109 및 DH5αF'에 증식시키고 문헌[참조: Maniatis et al. (pp 90-91); ref. 6]에 기술된 바와 같이 0.1% 글루코스 및 100㎍/㎖ 암피실린을 보충한 LB 배지 중의 250㎖ 밤새 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 회수하고 최종적으로 TE 완충액에 재현탁시킨다. 에이. 나이거를 형질전환시키는데 pGW1800을 사용하므로 세슘클로라이드 구배에서 밴드화하여 정제한다. TE중 2.5㎖ DNA 용액에 3.3g CsCl 및 1㎖ 에티듐브로마이드(물 중의 10㎎/㎖)를 가한다. 20℃, 45000rpm에서 16시간 동안 벡크만
Figure kpo00029
VTi 65.2로부터 에서 원심분리한다. UV광하에서 육안으로 볼 수 있는 2개의 형광성 밴드중 공유적으로 폐환된 환상 플라스미드 DNA를 함유하는 아래의 밴드를 튜브 측면에 구멍을 내어 회수한다. DNA 용액(약 1㎖)을 수-포화 부탄올로 5회 추출하여 에티듐 브로마이드를 제거한다. 이어서, 용적을 물로 15㎖가 되게 조절하고 30㎖의 에탄올을 가하여 DNA를 침전시킨다, DNA를 원심분리로 수거한 다음 펠렛을 75% 에탄올로 1회 세척하고 이어서 TE 완충액에 용해시키고 -20℃에서 보관한다. pGW1803은 CsCl 구배로는 분리되지 않지만 더 고속 공정을 거치게 된다. RNase A를 4㎖ DNA 용액에 가하여 농도가 100㎍/㎖가 되게하고 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 다음 동용적의 페놀, 페놀/클로로포름(1:1) 및 클로로포름으로 추출한다. 이어서, DNA를 0.4㎖ 3M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2) 및 8㎖ 에탄올을 첨가하여 수성상으로부터 침전시킨다, DNA를 원심분리로 수거하고 생성된 펠렛을 75% 에탄올로 세척한 다음 공기중 건조시키고 이어서 TE 완충액 중에 용해시킨다.
식물 RNA 분리에 사용된 방법을 약간 변형시켜 에이. 나이거 DNA를 분리한다[참조: Slater, ref. 21]. 균사체를 염수로 세척하고 액체 질소 중에서 동결시키고 미세막 분해기 (Braun 제조)를 사용하여 2.5g을 파괴한다. 균사체 분말을 새로 제조한 추출 완충액으로 추출한다. 추출 완충액은 다음과 같이 제조한다; 5㎖ 트리-이소프로필나프탈렌 설폰산(TNS, 20㎎/㎖)를 5㎖ p-아미노살리실산(PAS)(120㎎/㎖) 및 2.5㎖ 5 x RNB 완충액(5 x RNB는 1ℓ(pH 8.5)중 121.1g 트리스, 73.04g NaCl 및 95.1EGTA를 함유한다)과 합한다. 7.5㎖ 페놀을 가한 후, 추출 완충액을 55℃에서 10분간 평형시킨다. 이어서, 따뜻한 완충액을 균사체 분말에 가하고 현탁액을 2분간 혼합한다. 이이서, 5㎖ 클로로포름을 가하고 2분간 혼합한다. 원심분리(10min, 10,000xg)로 상을 분리하고 수성상을 10㎖의 페놀/클로로포름(1:1)으로 1회 이상 추출한 다음 클로로포름으로 2회 추출한다.
수성상은 RNA와 DNA 모두를 함유한다. DNA를 실온에서 2용적의 에탄올로 침전시키고 원심분리(10분, 10,000xg)로 수거한 다음 멸균 증류수에 재용해시켜 2회 세척하고 에탄올로 다시 침전시킨다. RNase A(20㎍/㎖)를 최종 용액에 가하여 RNA를 제거한다.
pGW1800 및 pGW1803의 물리적 지도를 작제하기 위하여, 약 1㎍의 플라시미드 DNA, 1㎎/㎖ 농도의 RNase A(pGW1803의 경우에만), BLR이 권장한 적절한 완충액 및 10단위의 제한 효소를 함유하는 수개의 반응 혼합물을 제조하는 한편 각각의 반응 혼합물에 대해 상이한 효소를 선택한다. 몇몇 경우에는, 2개의 상이한 효소의 배합물을 선택하거나 플라스미드 DNA를 특정 효소 또는 효소 배합물로 제한 분해한 다음 나트륨 아세테이트 및 에탄올 존재하에 DNA를 침전시키고 계속해서 원심분리로 DNA를 재수거 한 다음 이를 제2 또는 제3 제한 효소에 대한 기질로서 사용한다. 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 다음 5배 농축된 샘플 완충액을 가하여 반응을 정지시키고 나서 반응 생성물을 TBE 완충액중 1% 아가로스 겔상에서 분석한다. 특정 단편의 계산된 크기로부터 고유한 XbaI 부위에서 임의로 선택된, 참조점에 대한 개별적인 제한 효소 부위의 위치를 추론해낸다. pGW1800의 제한지도를 제2도에 나타냈다. pGW1803의 에이. 나이거 유도된 DNA의 제한 지도(나타내지 않았음)는 1위치의 XbaI 부위부터 2000 위치의 HincII 부위까지 pGW1800의 지도와 동일하다. 그러나, pGW1803은 pGW1800의 2400 위치에 존재하는 BglII 부위를 함유하지 않는다. pGW1800의 0.4kbp HincII-BglII 단편은 에이. 나이거 유도된 삽입물 DNA의 말단에 위치한 pGW1803의 HincII-EcoRI 단편에서와 동일한 전기영동 이동성을 보인다. pGHW1803의 에이. 나이거 유도된 DNA는 1 위치의 XbaI 부위와 2400 위치의 BglII 부위(이를 포함하지 않으면서)에서 또는 이에 매우 인접한 위치 사이의 pGW1800의 에이. 나이거 유도된 DNA와 동일하다. 즉, 파아지 λD의 EcoRII-XbaI 단편의 추론된 크기, 2.5kbp(실시예 3.6)은 약간 과대 평가된 것이다.
합한 올리고뉴클레오타이드 혼합물 HR6195 및 HR6196과 하이브리드화하는 특정 서열의 위치를 찾아내기 위하여, pGW1803 DNA를 제한 분해하고 생성 단편을 전술한 바와 같이 분리한다. 이어서, 전술한 바와 같이 DNA를 니트로셀룰로스 막에 옮기고 합하여 표지시킨 올리고뉴클레오타이드 혼합물 HR6195 및 HR6196과 하이브리드화하는 단편은 HincII 분해시는 0.64kbp인 HincII 단편 및 NcoI/EcoRI 이중분해시는 0.62kbp인 NcoI/EcoRI 단편이다.합한 올리고뉴클레오타이드 혼합물 HR6195 및 HR6196과 하이브리드화하는 특이 서열은 pGW1800의 제한 지도상의 동일한 서열과 대응하게 상응하는 pGW1803의 제한지도의 1750위치의 NcoI 부위 및 2000 위치의 HincII 부위 상에 위치한다고 결론지워진다.
클로닝 인공물의 부재는 pGW1800으로부터의 제한 단편과 에이. 나이거 N400 DNA로부터 수득한 제한 단편과 비교하여 확립한다. pGW1800의 분해물은 전술한 바와 같이 제조한다. 균주 N400의 염색체 DNA의 분해물은 2㎍ DNA, 0.5㎎/㎖ RNase A, BRL에 의해 제공된 반응 완충액(XhoI, XbaI, EcoRV 및 BhlII에 대한 반응 완충액 2, KpnI에 대한 반응 완충액 4 및 EcoRI 및 SalI에 대한 반응 완충액 3) 및 사용된 각 제한 효소 80 단위로 이루어진 200㎕ 반응 용적중에 37℃에서 제조한다. 반응 혼합물은 2시간 동안 항온처리한 다음 100㎕의 클로로포름으로 추출한다. 계속해서, 20㎕의 3M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2) 및 0.5㎖ 에탄올을 가한 다음 얼음 위에 45분간 방치하여 DNA를 침전시킨다. 이어서, DNA를 원심분리로 재수거하여 공기 건조시킨다. DNA를 샘플 완충액 중에 용해 시키고 이들 샘플과 pGW1800의 분해물 및 λDNA 사이즈 마커를 TBE 완충액중 0.7% 아가로스 겔 상에 걸어준다. 전기영동한 후 생성 패턴을 기록하고 에이. 나이거 염색체 DNA 분해물 레인에 있는 DNA를 전술한 바와 같이 니트로셀룰로스 막으로 전달시킨다. 막을 가열 처리하고 두 부분으로 절단한 다음 상이한 프로브와 하이브리드화 시킨다.
하이브리드화에 사용된 프로브는 pGW1800의 닉-해독된 1.45kbp 및 2.05kbp EcoRV-BglII 단편이다. 단편을 전술한 바와 같이 아가로스 겔의 박편으로부터 분리하고 100ng의 단편을 문헌 [참조: Maniais et al., pp 109-112, ref. 6]에 기술된 바와 같이 개개의 반응에서 닉-해독한다. 하이브리드화 혼합물에 첨가하기 전에 닉-해독된 DNA를 10분간 비등 수조에서 변성시킨다.
가열 처리한 니트로셀룰로스 필터를 3 x SSC에 적시고 나서 6xSSC, 10mM EDTA, 0.1㎎/㎖의 새로 첨가한 전단처리 및 변성시킨 청어 정자 DNA, 0.1% Na4P2O7x 10 H2O, 0.5% SDS 및 5x 덴하르트(0.1% BSA, Boehringer 분획 X, 0.1% Ficoll 400, Pharmacia: 0.1 % 폴리비닐피롤리돈-10, Sigma)로 이루어진 100㎖의 예비 가온(68℃)한 하이브리드화 완충액을 함유하는 별도의 디쉬에 옮긴다. 예비하이브리드화는 진탕 수조내 68℃에서 2시간 동안 수행한 다음 하이브리드화 완충액을 새로운 완충액(75㎖)로 대치하고 계속해서 닉-해독된 프로브를 가한다. 68℃에서 16시간 이상 하이브리드화를 진행한다. 이어서, 모두 0.1% SDS 및 0.1% Na4P2O7x 10H2O를 함유하지만 SSC는 감소하는 양으로 함유하는 일련의 예비 가온한 완충액을 사용하여 막을 68℃에서 세척한다. 이어서, 필터를 완충액당 30분간 4 x SSC, 2 x SSC, 0.5 x SSC, 0.2 x SSC 및 0.1 x SSC에서 순차적으로 세척한다. 최종 세척 후 막을 잠시 0.1 x SSC에서 세정한 다음 건조시키고 계속해서 X-선 필름에 노출시킨다.
1.45kbp EcoRV-BglII 단편으로 프로브화한 막은 다음의 하이 브리드화 단편을 함유한다; XhoI 분해시 2.4kbp인 단편, KpnI 분해시 2.8kbp 및 1.2kbp인 단편 및 BglII/EcoRV 이중 분해시 1.3kbp인 단편, 2.05kbp EcoRV-BglII 단편으로 프로브화한 막은 다음의 단편을 함유한다; EcoRI/SalI 이중분해지 약 11kbp인 대형 단편, XhoI 분해시 2.3kbp 및 2.1kbp인 단편, XhoI/XbaI 이중분해시 2.3kbp 및 1.4kbp인 단편, KpnI 분해시 1.2kbp인 단편 및 EcoRV/BglII 이중분해시 2.0kbp인 단편.
4개의 하이브리드화 단편의 경우 pGW1800의 제한 지도로부터 존재 및 최소 크기만이 추론될 수 있으며, 즉 사용된 프로브와 상동인 단편이 추론되며 이의 한쪽 말단은 pGW1800에 존재하는 서열의 외부에 있다. 이들 단편은 2.05kbp EcoRV-BglII 프로브의 경우, EcoRI/SalI 분해시의 단편, XhoI 분해시 2.1kbp인 단편 및 KpnI 분해시 3.2kpb인 단편, 및 1.45kbp EcoRI-BglII 프로브의 경우, KpnI 분해시 2.8kbp인 단편이다. 이들 단편은 모두 pGW1800의 제한 지도로부터 추론된 최소 크기보다는 크다. 게놈성 에이. 나이거 DNA의 상이한 하이브리드화 단편은 pGW1800의 분해물에 존재하는 단편과 관계될 수 있으며 이들 모두는 pGW1800의 제한 지도로부터 추론된 크기에 매우 근접한 계산된 크기를 갖는다. pGW1800의 에이. 나이거 유래된 DNA는 에이. 나이거 N400 게놈의 일부를 충실히 나타낸다고 볼 수 있다.
[실시예 3.9]
[pGW1900 및 pGW1902의 작제 및 이의 제한 분석]
PGII 암호화 서열과 하이브리드화하는 파아지 PGI-λ7의 8.6kbp BamHI 제한 단편(표 IV, 실시예 3.6)을 pUC9 벡터[참조 문헌: Vieira, J. and Messing, J., 1982, Gene 129, 259-268]에 삽입시키면 반대 배향으로 삽입물을 함유하는 플라스미드 pGW1900(제3도) 및 pGW1901이 생성된다. 5㎕ TE 완충액중 1.5㎍ PGI-λ7 DNA에 10mM 스톡 용액의 1㎕ 스퍼미딘, 20U BamHI, BRL이 권장한 반응 완충액 및 멸균 증류수를 최종 용적 30㎕가 되게 가한다. 분해된 샘플에 1/4(v/v) 부하 완충액을 가한다(부하 완충액 0.25% 브로모페놀 블루; 0.25% 크실렌 시아놀 및 H2O중 15% Ficoll 400), 에티듐 브로마이드(1㎍/㎖)를 함유하는 1 x TAE 완충액(ℓ당 50 x TAE 완충액=242g 트리스, 57.1㎖ 아세트산 및 100㎖ 0.5M EDTA(pH 8.0))중 0.6% 아가로스 겔 상에서 분리한다.
DNA 단편을 UV광하에 가시화하고 8.6kbp BamHI 단편을 함유하는 겔 절편을 분리한다. DNA 단편을 통상적인 방법에 따라 전기영동으로 분리한다. 100V에서 1시간 동안 용출시킨다. DNA를 수거하여 2배 용적의 에탄올로 침전시킨다. 에펜노르프 원심분리기에서 30분간 원심 분리한 후 침전물을 수거하고 스피드벡(Speedvac)에서 건조시킨 다음 10㎕ TE 완충액에서 용해시킨다. 벡터 pUC9(1㎍)을 총 반응 용적 20㎕에서 BRL이 추천하는 완충액을 사용하여 1.5시간 동안 10U BamHI을 사용하여 37℃에서 선형화시킨다. 이어서 1㎕ CIP 용액(약 2U)를 가하고 혼합물을 37℃에서 30분간 항온처리한다. 선형 벡터는 또한 전기 영동으로 제조한다. 이를 약 50ng/㎕의 DNA 농도에 상응하는 20㎕ TE 중에 용해시킨다.
연결반응에서, 1㎕의 선형화되고 CIP 처리한 pCU9 벡터(50ng) 및 4㎕의 BamHI 단편(약 100ng)을 적절한 리가제 완충액 중 1.2U T4DNA 리가제와 연결시킨다. 최종 반응물 용적은 10㎖이다. 반응을 14℃에서 14시간 동안 진행시키고 혼합물을 TE로 50㎕로 희석시킨다.
플라스그를 얼음 위에 놓기에 앞서 이. 콜라이 DH5αF'를 0D550값이 0.5 내지 0.7이 되도록 생장시키는 것을 제외하고는 BRL M13 클로닝/디데옥시 서열분석 메뉴얼(pp. 30-33; ref. 11)에 기술된 바와 같이 50㎕의 생성된 연결 반응 혼합물을 사용하여 이.콜라이를 형질전환시킨다. 열 충격시킨 후 세포를 얼음 위에서 2분간 배양하고 이어서 1㎖의 LB 배지를 가한 다음 세포를 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 세포를 저속도 원심분리로 펠렛화하고 1㎖의 상등액을 제거한 다음 세포를 온화하게 재현탁시킨다. 이어서, 세포를 100㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 LB 한천상에 플레이팅한 다음 그위에 IPTG/X-gal 용액(=200㎕ H2O, 2%X-gal을 함유하는 30㎕ 디메틸포름아미드 및 물중 24㎎/㎖ IPTG 용액 20㎕)을 도포시킨다. 평판을 37℃에서 밤새 배양한다. 몇몇 단일 백색 콜로니를 사용하여 0.1% 글루코스 및 75㎍/㎖ 암피실린을 보충한 LB 배지중의 밤새 배양액을 제조한다. 이들 배양액을 사용하여 문헌[참조: Holmes and Quigley (ref. 12)]의 방법에 따라 플라스미드를 분리한다. 플라스미드를 공급자(BRL)의 추천에 따라, RNase A(0.5㎎/㎖)의 존재하에 수종의 제한 효소를 사용하여 분해하고 생성물을 아가로스 겔 상에서 분석한다. 예상되는 크기의 BamHI 단편을 생성하는 플라스미드를 선별하고 이를 함유하는 이. 콜라이 세포를 -20℃에서 글리세롤 상에 유지시킨다. 삽입물을 반대 방향으로 함유하는 새로운 플라스미드 pGW1900(제3도)과 pGW1901을 추가의 실험에 사용한다.
pGW1900을 이. 콜라이 균주 DH5αF'에서 증식시키고 플라스미드 DNA를 문헌[참조: Maniatis et al. pp 90-91; ref. 6]에 기술된 바와 같이 0.1% 글루코스 및 100㎍/㎖ 암피실린을 보충한 LB 배지중 250㎖ 밤새 배양액으로부터 회수한 다음 TE 완충액에 최종 재현탁시킨다. pGW1900이 에이. 나이거의 형질 전환에 사용되므로 세슘 클로라이드 구배 중에서 밴드를 형성시켜 정제한다. TE중 2.5㎖ DNA 용액에 3.3g CsCl 및 1㎖ 에티듐 브로마이드(물중 10㎎/㎖)를 가한다. 20℃, 45000rpm에서 16시간 동안 벡크만
Figure kpo00030
VTi 65.2로터에서 원심분리한다. UV하에 가시화할 수 있는 두 형광성 밴드중 공유적으로 폐환된 환상 플라스미드 DNA를 함유하는 하부의 것을 튜브 측면을 천공하여 회수한다. DNA 용액(약 1㎖)을 물 포화된 부탄올로 5회 추출하여 에티듐 브로마이드를 제거한다. 이어서, 용적을 물로 15㎖가 되게 조절하고 30㎖의 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시킨다. DNA를 원심분리로 수거하고나서 펠렛을 75% 에탄올로 1회 세척한 다음 계속해서 TE 완충액 중에 용해시키고 -20℃에서 보관한다.
추가로, pGW1900 KpnI 분해물로부터 2.7kbp KpnI DNA 단편을 아가로스겔 박편으로부터 전기영동하여 분리하고 pEMBL18[참조 문헌: Dente Cortese. ref. 10]에 삽입시켜 각각 플라스미드 pGW1902(제4도) 및 pGW1903을 생성시킨다.
pGW1900 및 pGW1902의 물리적 지도를 작성하기 위하여, 약 1㎍의 플라스미드 DNA, BRL이 권장한 관련된 완충액 및 10 단위의 반응 효소 또는 두종의 상이한 제한 효소의 배합물을 함유하는 몇몇 반응 혼합물을 제조한다. 반응 생성물을 TAE 완충액중 1% 아가로스 겔 상에서 분석한다. 특정 단편의 계산된 크기로부터 각각 제3도 및 제4도에 나타낸 개개의 제한 효소 부위의 위치를 설정한다.
[실시예 3.10]
[에이. 나익 NW756의 폴리갈락투로나제 II 유전자 (pgaII)의 분자 클로닝]
프로브로서, 에이. 나이거 N400의 pgaII 유전자(즉, pGW1800의 1.2kbp BamHI-BglII 단편)을 사용하여 에이. 나이거 NW756의 게놈성 DNA를 써던 블롯 분석한다. 실시예 7.1에 기술된 바에 따라 2개의 변형물을 제조한다. 이 경우에 제한 효소는 에이. 나이거 N400 pgaII 유전자의 구조적 잔기내를 절단하는 효소가 선택되며 하이브리드화 조건은 더욱 엄격한, 즉 실시예 7.2에서 기술한 유사한 조건이다. 이렇게 함으로써 BamHI 분해물에서 3.3kbp의 단일 하이브리드화 단편이 검출된다. 이러한 하이브리드화 조건하에서 단일 서열이 검출 되고 따라서, 이 서열은 에이. 나이거 NW756의 pgaII 유전자로서 정의된다. 3.3kbp의 단일 하이브리드화 HincII 단편이 관찰되며 이는 구조 유전자에 HincII 부위가 없음을 나타낸다. 하이브리드화 XhoI-BglII 단편은 5.5kbp이다. 이러한 결과는 실시예 3.7에 나타낸 데이터 및 서열확인번호 2하에 서열 리스트에 나타낸 에이. 나이거 N400의 pgaII의 DNA 서열과 일치하지 않는다. 따라서, 에이. 나이거 NW756의 pgaII 유전자는 에이. 나이거 N400의 pgaII 유전자와 동일하지 않다고 결론내릴 수 있다.
에이. 나이거 NW756의 게놈성 라이브러리는 실시예 2의 균주 N400에 대하여 기술한 방법을 약간 변형시켜 작제한다. Sau2AI를 MboI 대신 사용하여 아스퍼질러스 DNA를 제한 분해한다. 균주 NW756의 라이브러리는 EMBL4(ref. 9)와 밀접하게 관련된 λ벡터 EMBL3 내에서 작제한다. 이미 BamHI 및 EcoRI으로 분해하고 포스파타제 처리한 EMBL3 DNA는 시판되고 있다(Promega 제조). 실시예 3.3에서 기술한 바와 같이 생성된 라이브러리의 일부를 플레이팅하고 플라그 리프트를 제조한다. 이어서 필터를 실시예 7.2에서 기술한 바와같은 유사한 조건을 사용하여 pGW1803의 1.2 kbp NamHI-EcoRI 단편과 하이브리드화시킨다. 향상 파아지를 재스크리닝 단계에서 정제하고 계속해서 실시예 3.4에서 기술한 바와 같이 이들 파아지의 DNA를 정제한다. 효소 BaIII 및 XhoI를 사용하여 DNA를 제한 분석한다. 이어서, 이러한 단편을 함유하는 양성 파아지중 하나의 5.5kbp XhoI-BglII 단편을 실시예 3.6에서 기술한 바와 같이 분리한다. 이어서, 상기 단편을 BamHI 및 SalI으로 분해한 pEMBL18과 연결 시키고 생성된 연결 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 JM109(실시예 3.6)를 형질전환시킨다. 이어서, 형질전환체를 실시예 7.3에서 기술한 바와 같이 이질적 조건하에서 콜로니 하이브리드화에 의하여 분석한다. 양성 클론의 플라스미드 DNA를 정제하고 계속해서 물리적 지도 작성에 사용한다(실시예 3.7).
pGW1756의 제한지도를 제6도에 나타냈다. pGW1756은 벡터 pEMBL18에 삽입된 에이. 나이거 NW756 pgaII 유전자를 함유하는 5.5kbp XhoI-BalII 단편이다.
[실시예 4]
[폴리갈락투로나제 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 결정]
[실시예 4.1]
[에이. 나이거 N400의 폴리갈락투로나제 II 유전자(pgaII)
pGW1800 및 pGW1803의 적합한 제한 단편을 아가로즈 겔 전기영동한 후에 분리하고 벡터에 대해 2 내지 10배 과량의 단편을 사용하여 M13mp18RF 및 M13mp19RF 벡터와 연결시킨다. 이. 콜라이 JM109의 형질전환은 전술한 바와 같이 수행하되 열 충격을 가한 후에 세포를 BRL M13 클로닝/디데옥시 서열 분석 메뉴얼(p34, ref. 11)에 기술한 바와 같이 즉시 플레이팅한다. 재조합 파아지로부터 일본쇄 DNA 주형을 분리하는 과정은 문헌 [참조: Ausubel et al., section 7. 3. 9; ref. 40]에 기술한 바와 같이 수행하는 한편 상등액 뿐만 아니라 세포도 수거하며 이들 세포를 계속해서 -20℃에서 글리세롤 배양물로서 보관한다.
M13mp18의 폴리링커에 삽입되 pGW1803의 2.4kbp XbaI-EcoRI 단편인 상기와 같이 수득한 클론중 하나를 조작하여 각각 HindIII PstI, BamHI 및 NcoI 부위로부터 서열분석 데이터를 수득할 수 있다. YT 배지중의 각각의 밤새 배양액을 이. 콜라이 JM109 및 적당한 클론으로부터 제조하며 후자의 경우 접종액으로서 글리세롤 배양액 일부를 사용한다. 이어서, 200㎖의 2 x YT 배지에서 0.4㎖의 JM109 배양액을 접종하고 상기 배양액을 궤도 진탕기내 37℃에서 2.5시간 동안 연속 배양한다. 이어서, 적당한 클론의 밤새 배양액 20㎖을 가하고 궤도 진탕기내에서 5시간 동안 계속 배양한다. 이어서, pGW1803에 대해 기술한 바와 같이 이들 세포로부터 복제된 DNA를 분리한다. 이어서, 상기 DNA를 각각 HindIII, PstI, BamHI 및 NcoI로 분해 한다. 이어서, BamHI 및 NcoI 분해된 DNA를 SalI로 분해하고 계속해서 페놀/클로로포름(1:1) 및 클로로포름으로 추출한 다음 에탄올 침전시킨다. 이어서, 문헌[참조: Maniatis et al. (p117; ref. 6)]에 기술된 바와 같이, 완충액중 5 단위의 T4 DNA 폴리머라제(BRL)를 사용하여 각각 0.1mM의 dCTP, dATP, dGTP 및 dTTP 존재하에 비-양립성 점성 말단을 충전시킨다. 25㎕ 용적의 반응 혼합물을 37℃에서 5분간 항온처리한 다음 5㎕의 0.5M EDTA(pH 8.0)를 가하고 계속해서 혼합물을 페놀 추출한다. 이와 같이 하여 수득된 4개의 DNA 제제에 존재하는 DNA 소단편을 0.7% 저융점 아가로스겔(BRL)에서 전기영동하여 제거하고 대형 단편을 함유하는 겔 박편을 분리한다. 계속해서 이들 DNA 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 폐환시킨다. 계속해서 생성된 연결 반응 혼합물을 사용하여 전술한 바와 같이 이. 콜라이 JM109를 형질전환시킨다.
BcII은 기질의 메틸화에 민감하므로 이. 콜라이 JM109 또는 이.콜라이 DH5αF'에서 분리한 플라스미드 DNA를 절단할 수 없다. 따라서, 앞에서 분리한 pGW1800 및 pGW1803을 사용하여 이. 콜라이 JM110[참조 문헌: Yanisch-Perron et al., ref. 29]를 형질전환시키고 이. 콜라이 JM110을 생장시키기 위해 사용된 모든 배지에 0.1% 카사미노산을 가하는 것을 제외하고는 플라스미드 DNA를 실시예 3.8에서 기술한 바와 같이 분리 한다. 이어서, 이. 콜라이 JM110으로부터 분리된 플라스미드 DNA를 사용하여 BclI 부위로부터 서열분석을 허용하는 아클론을 수득한다.
생성된 클론은 공급자가 권장하는 조건하에서 T7 기퀀싱(Sequencing
Figure kpo00031
) 키트(Pharmacia 제조)를 사용하여 서열분석 한다. 일부 경우에서는 이와같이 수득된 서열분석 데이터를 문헌[참조: Caruthers, ref. 8]의 방법에 따라 특정 올리고 뉴클레오타이드의 합성을 프로그래밍한다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 RH6425
Figure kpo00032
이어서 이들 올리고뉴클레오타이드는 적절한 주형에 대한 특정의 서열분석 프라이머로서 사용한다. 프라이머 HR6439는 M13 주형에 사용하는 경우 2개의 첨가된 서열분석 래더를 생성하므로 이러한 프라이머를 제조자(Pharmacia)의 지시에 따라 알칼리 변성된 pGW1800의 이본쇄 서열분석에 사용된다.
pGW1800 상에 위치한 PGII(pgaII)를 암호화 하는 유전자의 서열은 DNA의 두 본쇄로부터 수득된다. 하류 방향(1위치의 XbaI 부위로부터 약 3028 위치의 PruII 부위 방향의)으로서 서열 분석은 각각 XbaI(1), EcoRV(약 334), HindIII(약 557), PstI(약 827), BclI(dir 1056), BamHI(약 1158), HincII(약 1344 및 약 1974), KpnI(약 1565 및 약 2706), NcoI(약 1749) 및 BglII(약 2379) 부위로부터 수행하는 한편 프라이머 HR6425를 사용하여 BglII 부위의 영역을 서열 분석한다. 반대 방향으로의 서열 분석은 각각 PvuII(약 3028 및 약 1442), KpnI(약 2706 및 약 1565), BglII(약 2379), HincII(약 1974), BamHI(약 1158), BclI(약 1056), PstI(약 827), HindIII(약 557), 및 EcoRV(약 334) 부위로부터 수행하는 반면 프라이머 HR6439 및 HR6440을 사용하여 각각 HincII(약 1974) 및 KpnI(약 1565) 부위상에서 서열 분석한다.
pgaII의 서열은 서열확인번호 2로 서열 리스트에 나타냈다. 3031bp 서열은 pGW1800에서 1위치의 XbaI 부위의 처선째 뉴클레오타이드를 시작되고 pGW1800의 제한 지도에서 대략 3050 위치에 표시한 PvuII 부위의 최종 뉴클레오타이드로 끝난다. pgaII 유전자는 프로모터 영역의 1356개 뉴클레오타이드, 구조 부분의 1138개 뉴클레오타이드(52개 뉴클레오타이드의 수정된 인트론 포함) 및 전사 터미네이터 영억의 537 뉴클레오타이드를 포함한다.
시그날 서열 및 XhoI 절단 부위 바로 하류에 위치한 서열은 시스테인이 3위치에 존재할 것이라고 예상되는 폴리갈락투로나제 II의 5kDa 단편에 대해 수득한 서열과 완전히 일치하는 아미노산 서열을 암호화한다(실시예 1.3).
DNA 서열은 27개 아미노산의 리더 펩타이드를 암호화하고 완전한 단백질 서열 앞에 존재하는 최종 아미노산은 아르기닌이다.이러한 리더 펩타이드는 단백질 분해적 절단에 의하여 제거되어야 한다. 일반적으로 시그날 펩티다제 절단 부위가 아르기닌 잔기 바로 뒤와 하전된 아미노산 바로 뒤에서는 발견되지 않으므로[참조 문헌: von heijne; ref. 39], 리더 펩타이드는 적어도 두번의 단백질 분해 단계로 제거된다. 즉 리더 펩타이드는 prepro 서열을 나타낸다. 이러한 경우에서, 시그날 펩티다제는 pre-서열 또는 시그날-펩타이드를 절단하는 반면, 잔여 pro-서열은 다른 프로테아제에 의해 절단된다.
폴리갈락투로나제 II 구조 유전자는 아마도 대부분 1987 위치에서 2038 위치까지의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 하나의 인트론을 함유한다. 이러한 서열은 모든 3개의 가능한 판독 프레임내에 종결 코돈을 함유한다. 이러한 인트론의 존재로 인해, 수득된 단백질 서열분석 데이터(실시예 1)과 일치하는 방법으로 판독 프레임이 변화된다. 인트론 앞에 존재하는 판독 프레임은 시아노겐 브로마이드 단편의 아미노산 서열(실시예 1.3)에 의해 확인되는 반면 인트론 뒤에 존재하는 판독 프레임은 트립신 처리 펩타이드 TP4(실시예 1.5)의 아미노산 서열에 의하여 확인되며 이의 서열은 또한 2183 위치에서 2225 위치까지의 뉴클레오타이드 서열로부터 추론해낼 수 있다. 인트론의 5' 스플라이싱 부위, GTAAGC는 진균의 5' 스플라이싱 컨센수스 GTPuNGT와 유사한 반면, 3' 스플라이싱 부위 TAG는 진균의 3' 컨센수스 스플라이싱 부위 PyAG와 완전히 일치한다(ref. 41).
[실시예 4.2]
[에이. 나이거 N400의 폴리갈락투로나제 I(pgaI) 유전자]
적합한 제한 단편을 실시예 3.9에 기술한 바와 같이 아가로스 겔 전기영동한 후 pGW1900 및 pGW1902로 부터 분리한다. 이들을 BRL M13 클로닝/디데옥시 서열화 메뉴얼(ref. 11)에 따라 M13mp 18RF 및 M13mp 19RF 벡터에 연결시킨다. 파마시아 메뉴엘에 기술한 바와 같이 M13 클로닝/서열분석 시스템 용으로 컴퍼턴트 세포를 제조한다. 이. 콜라이 JM101의 형질 전환은 문헌[참조: Messing et al., ref 30]에 기술한 바와 같이 수행한다. 통상적인 방법(ref 11, pp. 29-34)에 따라 재조합 파아지로부터 일본쇄 DNA 주형을 분리한다. 생성된 클론은 공급자가 권장한 조건하에서 T7 서열 분석
Figure kpo00033
키트(Pharmacia, Uppsala, Sweden)를 사용하여 서열분석한다.
pGW1900은 지도의 대략적인 5750번 위치의 EcoRI 부위로부터 약 3790 위치에서 Hind III 부위에 근접하여 위치한 지도의 대략적인 3900 위치에서 CalI 부위까지를 서열분석한다. 문헌[참조: Caruthers, ref. 8]의 방법을 사용하여 수개의 올리고 뉴클레오타이드(304-307)을 합성한다. 이들 올리고뉴클레오타이드의 서열은 다음과 같다;
Figure kpo00034
이들은 관련 주형에 대한 특정의 서열분석 프라이머로서 사용된다.
올리고뉴클레오타이드 307은 T7 서열분석
Figure kpo00035
키트에 대한 공급자의 지시에 따라 알칼리 변성 처리한 pGW1900의 이본쇄 서열분석에 사용한다, pgaI 유전자의 전체 서열은 서열 리스트에 서열확인번호 1로 나타냈다. 서열은 두 본쇄로 수득한 서열분석 데이터에 기초하였다.
2495bp pgaI 서열은 pGW1900의 지도의 대략적인 6280 위치에서 EcoRI 부위의 첫번째 뉴클레오타이드로 시작하여 3880에 표시된 Hind III 부위에 근접한 Cla I 부위의 최종 뉴클레오타이드를 12개 뉴클레오타이드 지난후 종결된다. pgaI 서열은 52bp(인트론 A) 및 62bp(인트론 B)의 두 추정적인 인트론 및 전사 터미네이터 영역의 366개 뉴클레오타이드를 포함하여 프로모터 영역의 909개 뉴클레오타이드, 구조 부분의 1218 뉴클레오타이드를 포함한다.
온전한 폴리갈락투로나제 I(실시예 1.4) 및 21kDa 시아노겐 브로마이드 단편(실시예 1.5) 참조)에 대해 수득한 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 서열로 부터 유도될 수 있고 1003 위치에서 시작하는 아미노산 서열과 완전히 일치한다. DNA 서열은 따라서 31개 아미노산으로 이루어진 리더 펩타이드를 암호화하고 리신은 완전한 단백질로 출발하기 전의 최종 아미노산이다. 리더 펩타이드의 말단이 아르기닌 잔기인 PGII의 경우에서와 유사한 이유 때문에 상기 PGI 리더 펩타이드는 적어도 2회의 단백질 분해 단계에서 제거되는 prepro-서열을 나타낸다. 이 서열은 프로브로 사용된 올리고뉴클레오타이드 혼합물과 하이브르디화하고 뉴클레오탕드 서열의 1277 위치에서 개시된다. 실시예 1에서 기술한 바와 같은 5.5kDa 시아노겐 브로마이드 펩타이드 단편에 대해 측정한 N-말단 아미노산 서열과 뉴클레오타이드 서열을 기초로 예상한 아미노산 서열은 완전히 일치한다.
폴리갈락투로나제 I 구조 유전자는 2개의 인트론을 함유한다. 인트론 A는 1138 위치부터 1189 위치까지의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 5' 스플라이싱 부위 GTATGT는 진균의 5' 스플라이싱 부위 콘센수스 서열 GTPuNGT(ref. 41)와 일치하는 반면 lariat 서열 GC TAAC 및 3' 스플라이싱 TAG는 공지의 콘센수스 서열 Pu CT Pu AC 및 Py AG와 일치한다. 이러한 인트론 변화의 존재로 말미암아 판독 프레임은 좀더 떨어져 위치한 5.5kDa 시아노겐 브로마이드 단편으로 수득한 단백질 서열 데이터(실시예 1)와 일치하도록 변화된다. 제2 인트론(B)은 뉴클레오타이드 서열 1610 내지 1671까지 포함한다. lariat 서열 및 3' 스플라이싱 부위 모두는 공지의 콘센수스 서열과 알치한다. 5' 스플라이싱 부위 G C A C G A 는 콘센수스 서열 GT Pu NGT와는 일치하지 않지만, 5' 스플라이싱 부위의 GC 및 5'스플라이싱 부위에 대하셔 +6 위치의 A는 일부 다른 유전자에서 발견 된다(refs 41 and 43).
인트론 B의 존재는 다음의 주장에 기초한다.
a) 판독 프레임을 변화시켜 다른 두개의 판독 프레임에서 미성숙 정지가 일어나도록 한다.
b) pgaII 내의 인트론은 동일한 위치에서 나타나고 상기 인트론 Asn-Ser-Gly-Glu에 선행하는 아미노산 서열은 두 단백질에서 동일하다. 강력한 상동성 영역이 다음과 같은 추정 인트론 바로 뒤에 오는 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 아미노산 서열 사이에서 발견된다;
Figure kpo00036
[실시예 4.3]
[에이. 나이거 N400 폴리갈락투라나제들 사이의 상동성]
에이. 나이거로부터 분리된 폴리갈락투로나제 PGI 및 PGII는 실시예 1.2에서 기술한 바와 같이 동일한 반응을 촉매하며 면역학적으로 상호 관련이 있다.
이들 효소를 암호화하는 유전자는 pgaII 유전자를 사용하여 기타 폴리갈락투로나제 유전자가 실시예 7.2에서 기술한 바와 같이 게놈성 에이. 나이거 N400 라이브러리로부터 분리되므로 밀접히 관련되어 있다. 길이에 있어서 2잔기 정도만 상이한 완전한 효소의 추정된 PGI 및 PGII 아미노산 서열의 서열을 비교한 결과 커다란 상동성을 나타낸다. 이러한 데이터는 PG 암호화 유전자가 밀접히 관련되어 있음을 명백히 나타내며 폴리갈락투로나제 유전자 계열의 구성원임을 나타낸다.
[실시예 5]
[선별 마커로서 에이. 나이거 pyr A 유전자 및 동시형질전환 플라스미드로서 폴리갈락투로나제 I 또는 II 유전자를 함유하는 플라스미드를 사용하는 에이. 나이거의 동시형질감염]
[실시예 5.1]
[에이. 나이거의 형질전환에 사용된 폴라스미드의 증식 및 정제]
플라스미드 pGW613[참조 문헌: Goosen et al., ref. 13]의 짧은 버전이고 pyr A 유전자도 함유하는 플라스미드 pGW635와 폴리갈락투로나제 II 유전자를 함유하는 플라스미드 pGW1800을 각각 이. 콜라이 MH1 및 JM109에서 증식시킨다. 플라스미드 pGW1900을 이. 콜라이 DH5αF'에서 증식시킨다. 플라스미드 DNA를 문헌[참조: Maniatis et al. pp 90-91; ref. 6] 및 실시예 3.7에서 기술한 바와 같이 250㎖ 밤새 배양액으로 부터 회수한다.
[실시예 5.2]
[원형질체의 제조 및 우리딘 영양요구성 돌연변이체 에이. 나이거 균주 N593의 형질전환]
모 균주 N400의 유도체인 에이. 나이거 균주 N593(cspA, pyrA)은 문헌[참조: Goosen et al., ref 13]에 기술된 바와 같이 우리딘의 존재하에 효모내 독성 동족체 5-플루오로-오로트산 등에 대해 양성 선별로 수득한다[참조 문헌: Boeke et al., ref. 14].
0.5% 효모 추출액, 0.2% 카사미노산, 10mM 우리딘(Janssen Chemie 제조) 및 50mM 글루코스를 보충한 액체 최소 배지에 에이. 나이거 N593의 분생포자 106/㎖를 접종하고 뉴 브룬스위크 궤도 진탕기내 30℃에서 20시간 동안 배양한다. 미라클 로쓰를 통하여 균사체를 여과하여 수거하고 다음과 같은 조성의 등-삼투성 최소 배지(STC)로 세척한다; 1.33M 솔리톨, 10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 50mM CaCl2, 균사체 1g을 20㎖ STC에 재현탁시킨다. 150㎎의 필터-멸균한 노보짐(Novozym) 234(Novo industries 제조, Denmark)를 가하고 진탕기내 30℃, 95rpm에서 혼합물을 배양하여 균사체로부터 2시간에 걸쳐 원형질체를 방출시킨다. 글라스울 플러그가 달린 깔때기를 사용 하여 잔류 균사체로부터 여과에 의해 원형질체를 분리한다. 이어서, 냉 STC를 가하여 40㎖ 용적이 되게하고 혼합물을 얼음 위에 10분간 놓는다. 원형질체를 원심분리(10min, 2500rpm)로 회수하고 펠렛을 5㎖ STC에 재현탁시킨다. 원형질체를 한번더 펠렛화하고 최종적으로 1㎖ 냉 STC에 재현탁시킨다.
형질전환을 위하여 5 x 106원형질체를 200㎕로 취한 다음 1㎍ pGW635 및 20㎍ pGW1800 또는 pGW1900과 함께 배양한다. 플라스미드 DNA를 원형질체에 가한 후 50㎕ PCT(10mM 트리스-HCl pH 7.5, 50mM CaCl2, 25% PEG6000)을 가하고 배양 혼합물을 얼음위에 20분간 놓는다. 이어서, 추가로 2㎖ PCT를 가하고 혼합물을 실온에서 추가로 5분간 배양한다. 최종적으로, 4㎖ STC를 가하고 혼합한다. 상기 최종 형질전환 용액 1㎖ 분취량을 0.95M 슈크로스로 멸균시킨 4㎖ 액화 등-삼투성 MM 상단-한천과 혼합한다. 원형질체 혼합물을 동일한 등-삼투성 최소 배지를 함유하는 한천 평판에 즉시 플레이팅한 다음 30℃에서 배양한다. 적절한 대소 실험에는 플라스미드 DNA 없이 2.5mM 우리딘을 함유한 비-안정화된 최소 배지상에 유사하게 처리한 원형질체가 포함된다.
30℃에서 3일간 생장시킨 후, 포자를 형성하는 왕성하게 생장하는 형질전환체가 출현한다(150 형질전환체/㎍ pGW635). 이밖에도, 다수의 가정적인 불완전 형질전환체가 출현한다. pGW1800의 경우 300개의 형질전환체 및 pGW1900의 경우 약 100개의 형질전환체가 수득된다. pGW1800 및 pGW1900과의 각 형질전환체중 20개의 콜로니를 무작위로 선택하여 개개 형질 전환체의 포자를 취하여 50mM 글루코스 최소 배지에 별도로 플레이팅하여 단일 콜로니를 수득하고 이를 1회 이상 정제한 다음 계속해서 추가의 형질전환체 분석을 위한 포자를 증식시키는데 사용한다.
[실시예 5.3]
[고형 배지를 함유하는 펙틴상에서 (halo)를 형성하는 에이. 나이거 균주 N593의 폴리갈락투로나제 과생성 동시형질감염체의 선별]
실시예 5.2에서 기술한 바와 같이 수득한 pGW1800으로 형질전환된 약 200개의 콜로니 및 pGW1900으로 형질전환된 약 100개의 콜로니를 선행의 정제과정 없이 콜로니 스크리닝법에 의하여 폴리갈락투로나제 활성의 증가에 대하여 스크리닝한다. 스크리닝에 사용된 배지는 2%(w/v) 글루코스, 0.5% 사과 펙틴(에스테르화도 34.8%, Obipektin 제조, Bischoffszell) 최소 배지 염 및 포자 성분; 6g/ℓ NaNo3; 0.2% 효모 추출물; 0.2% 펩톤, 0.004% 트리톤 X-100 및 1.2% 한천으로 구성된다. 페트리디쉬의 중심에 접종한 다음 30℃에서 2일간 배양한다. 콜로니를 냉동기에 밤새 보관한다. 이어서, 평판의 표면을 5㎖의 0.05% 루테늄 레드 용액 층으로 염색하고 진탕시키면서 5분간 배양한다. 이어서 비결합 염료를 증류수로 추가로 5분간 세척하여제거한다. 이러한 조건하에서 폴리갈락투로나제의 생성은 형성된 할로의 크기로 나타낸다. 즉, 분석된 형질전환체중 50%가 야생형보다 보다 높은 폴리갈락투로나제 활성을 나타냈다.
고형 배지를 함유하는 펙틴상에 형성된 할로의 크기를 기초로 pGW1800 형질전환체의 20개 콜로니 및 pGW1900 형질 전환체중 7개의 콜로니를 선택하고 45시간 생장시킨후 이들 양성 콜로니로 2차 스크리닝한 후 각각의 형질전환체중 6개를 최종 선택하여 실시예 5.2에서 기술한 바와 같이 정제한다.
[실시예 5.4]
[폴리갈락투로나제 II 형질전환되 에이. 나이거 균주의 게놈 분석]
실시예 5.2 또는 5.3에 따라 수득한 형질전환체 및 모 야생형 균주 N402를, 0.5% 효모 추출액, 0.2% 카사미노산, 50mM 글루코스 및 NaNO3(6g/ℓ)를 보충한 액체 최소 배지에 배양한다. 30℃에서 18시간 동안 생장시킨 후 DNA를 추출하고 동시형질전환된 플라스미드 존재에 대해 분석한다. 에이. 나이거 DNA는 전술한 바와 같이 분리한다.
반응 혼합물에 가하기 전에 트리스 염기로 pH 7.5로 조절한, 50mM 트리스 -HCl(pH 8.0), 10mM MgCl2, 10mM NaCl 및 4mM 스퍼미딘으로 이루어진 200㎕의 반응 용적내 37℃에서 염색체 DNA(2㎍)을 분해한다. 20U의 EcoRI 및 SalI 모두를 가하고 반응 혼합물을 37℃에서 2시간 항온처리한다. 이어서, 추가로 두 효소 20U를 가하고 추가로 2시간 동안 항온처리한다. 계속해서 반응 혼합물(200㎕)를 100㎕ 클로로포름으로 추출한다. 계속해서, 1/10(v/v)의 3M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2) 및 2.5 용적의 에탄올을 가하여 수성상으로부터 DNA를 침전시킨다. 4℃에서 1시간 동안 항온처리하여 원심분리한 후 DNA 펠렛을 공기 건조시키고 20㎕ 샘플 완충액에 용해시킨다. EcoRI/Sal I으로 분해한, 형질전환체 및 에이. 나이거 N402의 DNA를 전술한 바와 같은 써던 블롯에 의해 PGII 프로브로서 pGW1800의 1.2kbp BamHI/BalII 단편과 하이브리드화시킴으로써 분석한다.
동시형질감염 빈도는 75% 이상인 것으로 나타났다. 다수의 9개 형질전환체를 써던 블롯팅으로 분석한다. 프로브는 큰 게놈 단편과 N402에서 하이브르디화된다. pGW1800 서열을 함유하는 형질전환체의 게놈성 블롯에서 4.1kbp EcoRI-Sal 삽입물이 발견돤다. 카피물 수에 따라 밴드의 강도는 다양하다. 분석된 경우, 야생형 유전자를 나타내는 게놈 단편이 항상 발견되며 이는 이종 통합을 나타낸다. 이하에서 N593/pGW1800-27로 명명된 에이. 나이거 형질전환체내 폴리갈락투로나제 II 생성의 분석 결과를 실시예(실시예 6)에 상세히 나타내었다. DNA 희석 시리즈로부터, 카피물 수는 적어도 20배인 것으로 평가된다. 야생형 하이브리드화 단편 및 4.1kbp 단편외에도 소수의 기타 부수적인 하이브리ㄷ화 단편이 본 균주에서 나타나는데 이는 유형 II 통합 또는 재배치의 경계 단편을 나타낸다.
[실시예 5.5]
[형질전환된 에이. 나이거 균주 및 에이. 나이거 N402에 의한 폴리갈락투로나제 II 생성]
실시예 5.2에서 기술한 20개의 pGW1800 형질전환체 및 실시예 5.3에서 기술한 6개의 pGW1800 형질전환체를 우레아(4.2g/ℓ), 1%(w/v) 사과 펙틴(d.e. 61.2%) 및 1%(w/v) 밀기울을 가한 최소 염 배지로 이루어진 배지에서 생장시킨다. 배양액을 갈렌캠프(Gallenkamp) 궤도 진탕기를 사용하여 250rpm, 30℃에서 43시간 동안 생장시켜 배양 여액을 수득한다. 균사체를 부크너 깔때기를 사용하여 미라클로쓰상에서 여과 제거한다.
이들 샘플의 PGII 함량은 바이오라드 지시 메뉴얼에 따라 알칼린 포스파타제 검출법을 사용하여 수행하는 웨스턴 블롯팅으로 시험한다. 웨스턴 블롯상의 시그날을 기초로 하여, 실시예 5.2에서 무작위로 수득한 20개의 형질전환체 가운데 70%가 에이. 나이거 N402보다 훨씬 더 많은 폴리갈락투로나제 II를 생성한다. 평판-스크리닝법(실시예 5.3)을 사용하여 할로-크기를 기준으로 선별한 형질전환체는 모두가 에이. 나이거 N402 보다 훨씬 더 많은 양의 효소를 생성한다.
에이. 나이거 균주 N402 및 3개의 형질 전환체 즉, N593/pGW1800-27, N593/pGW1800-30 및 N593/pGW1800-37을 폴리갈락투로나제 활성을 측정하기 위하여 선별한다. 후자의 3개 균주는 실시예 5.2에서 수득한 pGW1800 형질전환체의 세트로부터 생성된다.
N593/pGW1800-30 및 N593/pGW1800-37 둘다 N593/pGW1800-27보다는 적은 수지만 다수 카피물 수의 pGW1800을 함유한다. 이 균주를 1%(w/v) 건조 및 분쇄한 사당무우 펄프를 첨가한 1% 펙틴배지(d.e. 61.2%)에서 전술한 조건을 사용하여 생장시킨다. 감소되는 당 및 PG 활성 억제인자를 제거하기 위하여 가교결합된 알기네이트를 사용하여 발효시킨 후 PGII를 부분 정제한다. 1㎖ 배양 여액을 1㎖ 20mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.2)으로 희석하고 이 완충액에서 평형시킨 층용적의 2㎖ 가교결합된 알기 네이트(5.2㎖/g)를 함유하는 소형 컬럼에 걸어준다. 이어서 이 컬럼을 4㎖ 나트륨 아세테이트 완충액으로 세척하고 1M NaCl을 가한 4㎖의 20mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.2)을 사용하여 컬럼으로부터 펄스 처리한다. 이어서 용출물중의 PG 활성을 전술한 바와 같이(ref. 2) 측정하고 수득된 값으로부터 배양 여액중의 PG 활성을 계산한다.
다음의 PG 활성은 접종 20시간 후 수득한 배양 여액에 대하여 계산하였다; 균주 N402, N593/pGW1800-30, N593/pGW1800-37 및 N593/pGW1800-27에 대해 각각 2.2, 5.6, 5.8 및 10.8 단위/㎖, 40시간후에 수득한 배양 여액에 대한 이들 값은 각각 2.8, 13.7, 16.4 및 30.9 단위/㎖ 순이다.
즉, pGW1800은 훨씬 높은 PG 활성을 생성하기 위하여 에이. 나이거를 형질전환시키는데 성공적으로 사용될 수 있는 것으로 보인다.
[실시예 5.6]
[형질전환시킨 에이. 나이거 균주 및 에이. 나이거 N402 및 N593에 의한 폴리갈락투로나제 I 제조]
실시예 5.2에서 기술한 17개의 pGW1900 형질전환체와 실시예 5.3에 기술한 6개의 pGW1900 형질 전환체 및 에이. 나이거 N402 및 N593의 pyr+형질전환체를 우레아(4.2g/ℓ), 1%(w/v) 사과 펙틴(d.e. 61.2%) 및 1%(w/v) 사탕무우 펄프를 가한 최소염 배지로 이루어진 배지에서 생장시킨다. 배양액을 갈렌캠프 궤도 진탕기를 사용하여 250rpm, 30℃에서 64시간 동안 생장시키고 20시간 및 39시간후 배양 여액간의 배양 여액 샘플을 취한다. 이들 샘플의 PGI 함량은 실시예 5.5에서 PGII 함량을 측정하는 바와 같이 웨스턴 블롯팅으로 검사한다.
웨스턴 블롯상의 시그날을 기초로 하여 시험된 23개의 형질전환체 가운데, 65%가 에이. 나이거 N402 보다 훨씬 더 많은 PGI을 생성한다. 할로-크기를 기준으로 선별한 형질전환체를 모두 에이. 나이거 N402 보다 훨씬 더 많은 양의 PGI을 생성하고 6개의 형질 전환체중 4개는 고생성자이다. 활성 측정 결과는 상기 배지에서 20시간 후의 활성이 39시간 후보다 높음을 나타 낸다. 12개의 상이한 PGI 형질전환된 에이. 나이거 균주를 볼때, 활성은 2.8 내지 7U/㎖에서 변하는 반면 형질전환되지 않은 대조군 균주 N402 및 에이. 나이거 N593/pGW635 형질전환체는 각각 0.5 및 0.8U/㎖를 생성한다. 이러한 활성은 적어도 두 PGI 및 PGII의 야생형 수준의 결과인 반면 형질전환체에서의 증가는 더 많은 PGI 발현의 결과이다.
[실시예 6]
[PGI 파생성 에이. 나이거 형질전환체 N593/pGW1800-27로부터 폴리갈락투로나제 II의 분리, 정제 및 특징화]
[실시예 6.1]
[폴리갈락투로나제 II를 제조하기 위한 배양조건]
실시예 5.4에서 기술한 에이. 나이거 PGII 형질전환체 N593/pGW1800-27을 페트리디쉬중 완전 배지상 30℃에서 3 내지 4일간 생장시켜 분생자를 생성시킨다. 분생자를 0.005% 트웬 80/평판을 함유하는 5㎖ 멸균 식염수에서 수집한다. 포자 현탁액을 그리핀 진탕기(Griffin shaker)에서 20분간 교반시키고 포자수를 센 다음 300㎖ 멸균 생장 배지를 함유하는 1ℓ들이 실리콘 처리한 삼극 플라스크에 106포자/㎖를 가한다. 이러한 배지는 질소원으로서 70mM 암모늄 클로라이드 및 탄소원으로서 1%(w/v)사과 펙틴(에스테르화도 61.2%) 및 1%(w/v) 사탕무우 펄프를 함유하는 최소 배지이다. 균사체를 갈렌캠프 궤도 진탕기를 사용하여 200rpm, 30℃에서 43시간 동안 생장시킨다. 생장시킨 후 균사체를 부크너 깔때기를 사용하는 미라클 로쓰를 통해 여과제거한다. 1N NaOH를 사용하여 배양 여액의 pH를 4.2로 조절한다. 0.02% 나트륨 아자이드를 모든 추가 단계에서 가하여 미생물 생장을 방지한다.
[실시예 6.2]
[에이, 나이거 형질전환체 N593/pGW1800-27로 부터 수득한 폴리갈락투로나제 II의 정제]
배양여액(약 2.5ℓ)을 20mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.2)으로 평형시킨 가교된 알기네이트 컬럼(2.5 x 25㎝)에 적용한다. 부하한 후, 컬럼을 평형 완충액의 일배드 용적, 20mM 아세테이트 완충액(pH 5.6)의 일 배드 용적, 전술한 완충액중 1200㎖ 염 선형 구배(0 내지 0.5M NaCl) 및 최종적으로 동일 완충액중 275㎖의 1M NaCl 용액으로 연속적으로 용출시킨다. 각 6㎖ 분획을 수집하여 실시예 1.1에서 기술한 바와 같이 이의 효소 활성에 대해 시험한다. 활성 분획의 중심부를 수거하여 20mM 비스 트리스 HCl 완충액(pH 6.0)에 대해 3회 투석한다. 그후 최종 효소 용액(4675㎖)를 동일 완충액으로 평형시킨 DEAE-세파로스 고속 컬럼(Pharmacia 제조)에 적용한다. 세척후, NaCl 구배를 동일 완충액에서 적용하고 폴리갈락투로나제 활성은 약 100mM 염화나트륨에서 용출된다. 활성 분획을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동으로 분석한다. PGII 함량이 높은 이들 분획을 수거하고(54㎖) 20mM 비스 트리스 HCl 완충액(pH 6.0)에 대해 투석하고 추가로 동일 완충액으로 평형시킨 모노 Q 컬럼(Pharmacia 제조)에서 정제한다. 부하 후, 효소는 염 구배(0 내지 1M NaCl)를 적용시켜 용출시킨다. 효소는 0.2 내지 0.26M 부의 염화나트륨 구배 및 0.26 내지 0.34M부의 구배와 상응하는 두개의 상이한 풀 A 및 B로 수집한다. 두 분획은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시 PGII에서와 동일한 위치에서 단일 단백질 밴드를 함유한다.
[실시예 6.3]
[폴리갈락투로나제 II의 N-말단부의 아미노산 서열 결정]
실시예 6.2에 따라 정제된 합한 풀 A와 B로 부터의 200㎍의 PGII를 1ℓ밀리포어 여과 증류수에 대해 3회 투석하고 동결건조시킨다. 아미노산 서열은 어플라이드 바이오 시스템즈(Applied Biosystems) 모델 470A 가스상 단백질 서열분석기를 사용하여 실시예 1.3에서 기술한 바와 같이 측정한다. 효소에 대하여 다음의 N-말단 아미노산 서열이 결정된다.
Figure kpo00037
단백질중의 시스테인 잔기는 변형되지 않으므로 검출되지 않는다. 이들은 서열의 3(X) 위치 및 18(X) 위치에서 나타나는 듯하다(실시예 1.3). 최종 3개의 아미노산 잔기는 저수준으로만 검출된다. 이러한 순수한 효소에 대해 수득된 서열은 PGII 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 추론된 PGII의 N-말단의 아미노산 서열에 정확하게 상응한다(참조: 실시예4 및 제4도, 식II). 상응하는 뉴클레오타이드 서열도 예상된 위치 즉 3 및 18번 잔기에서 시스테인 잔기를 나타낸다. 이러한 서열은 또한 5kDa 시아노겐 브로마이드 단편에 대해 측정한 서열(실시예 1.3)과 상응하므로 단백질의 N-말단에 상응한다.
[실시예 6.4]
[형질전환체 N593/pGW1800-27로부터 정제된 폴리갈락투로나제 II의 특성]
실시예 6.2에 따라 정제한 효소를 실시예 1.1에서 기술한 라피다제로부터 정제한 효소와 비교한다. 두 효소는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 38kDa의 동일한 겉보기 분자량을 나타내고 정제된 PGII에 대해 생성된 폴리클로날 항체와 동일하게 반응한다. PGII의 연속성 에피토프와만 반응하고 PGI, IIIA, IIIB 또는 IV와는 반응하지 않는 모노클로날 항체도 실시예 5.2에 따라 정제한 효소와 반응한다. 등전 포커싱시 실시예 6.1 및 6.2에 따라 생성되고 정제한 PGII는 PGII의 등전점(pI=5.2)과 동일한 pI 값에서 뚜렷한 밴드를 나타낸다. PGII의 미세이질성에 기인하여, pH 3 내지 7 또는 3 내지 10의 pH 구배를 사용할 때 좀 더 낮은 pI 값을 갖는 다수의 기타 밴드가 관찰된다. 실시예 6.1에 따라 제조된 PGII를 사용할 때 유사한 패턴이 수득된다.
[실시예 7]
[폴리갈락투로나제 II 유전자와 관련된 서열의 검출 및 분리]
[실시예 7.1]
[폴리갈락투로나제 II 유전자와 관련된 서열의 검출]
전술한 방법을 사용하여 에이. 나이거 NW756으로부터 DNA를 분리한다. DNA를 실시예 5.4에서 기술한 바와 같이 효소 BamHI, EcoRI 및 이들 효소의 배합물로 제한 분해한다. 이어서, DNA 단편을 0.6% 아가로스 겔 상에서 분리하고 실시예 3.7에서 기술한 바와 같이 니트로셀룰로스 막으로 이전한다. 가열 처리한 막을 문헌[참조: Church and Gilbert(ref. 38)]에 기술한 바와 같이 1% BSA(Boehringer 제조), 1mM EDTA, 0.5M 나트륨 포스페이트(pH 7.2)(ℓ당 89.0g의 Na2HPO4·2H2O 및 4㎖의 85% H3PO4로 이루어진 1M 모액을 첨가) 및 7% SDS로 이루어진 예비 가온한 하이브리드화 완충액중 60℃에서 2시간 동안 예비 하이브리드화시키고 여기에 전단처리 및 변성시킨 청어 정자 DNA를 0.1㎎/㎖ 농도로 새로이 첨가한다. 이어서, 실시예 3.7에서 기술한 바와 같이 제조된 pGW1800의 닉-해독된 1.2kbp BamHI-BglII 단편을 가하고 부드럽게 진탕시키면서 60℃에서 44시간 동안 하이브리드화 과정을 진행시킨다. 이어서, 막을 예비 가온한(60℃) 하이브리드화 완충액(청어 정자 DNA 비함유)에서 10분간 2회 세척한다. 이어서, 막을 5 x SSC, 0.1% SDS 및 0.1% Na4P4O7·10H2O로 이루어진 예비가온한 완충액중 60℃에서 20분간 2회 제거한다. 이어서, 막을 건조시키고 60℃에서 코닥 XAR5 필름에 3일간 노출시킨다.
이러한 조건하에서는 비특이성 하이브리드화가 관찰되지 않는데, 이는 하이브리드화 DNA 단편의 상당량의 표본의 부재 및 추가로 프로브와 λ사이즈 마커와의 하이브리드화의 부재에 따른 것이다. 각각의 레인에서 수개의 하이브리드화 밴드가 관찰되는 반면에 각각의 레인에서 하나의 밴드는 다른 밴드보다 훨씬 더 진하다. 이러한 뚜렷한 밴드는 BamHI 분해시 3.3kbp 단편, EcoRI 분해시 20kbp 및 BamHI/EcoRI 이중 분해시 3.3kbp 단편과 상응한다. 낮은 강도의 밴드는 BamHI 분해시 17, 9.5, 6.4 및 2.0kbp 단편, EcoRI 분해시 15, 12, 6.5 및 4.8 kbp 단편 및 BamHI/EcoRI 이중분해시 7.6, 6.4, 4.0, 3.7 및 2.0 kpb단편에 상응한다.
특이적 하이브리드화 시그날이 관찰된다는 사실로부터 에이. 나이거 N400의 PGII 유전자를 사용하여 에이. 나이거 NW756으로부터 수득한 DNA중의 특정 서열이 검출될 수 있다는 것이 뒷받침된다. 강력한 하이브리드화 시그날을 나타내는 단편은 PGII 유전자를 갖는 것으로 추측된다. 원리상, 제한 효소가 사용된 프로브와 상동이 영역의 말단내에 및 이에 근접하여 존재하는 DNA를 절단하는 경우 약하게 하이브리드화하는 단편이 생성될 수 있다. 그러나, 이러한 결과는 본 실시예에서 관찰되는 하이브리드화 대형 단편의 수를 완전하게 설명할 수 없다. 이에 따라 PGII 유전자와는 상동이지만 동일하지는 않은 특정 DNA 서열이 검출된다. 이들 DNA 서열은 상이한 PG 유전자일 것으로 추측되며 이는 PG가 단백질 수준에서 상동성을 갖다는 사실과 일치한다(실시예 1.4).
[실시예 7.2]
[폴리갈락투로나제 II 유전자와 관련된 유전자의 분리]
실시예 3.4에서 기술한 바와 같이 에이. 나이거 N400 라이브러리로 부터의 약 1 x 10 파아지를 이. 콜라이 LE392를 사용하여 5개의 평판상에 플레이팅한 각 평판으로부터 3개의 니트로셀룰로스 레플리카를 제조하는 반면, 3번째 필터는 평판의 상단에서 5분간 항온처리한다. 각 평판의 첫번째와 두번째 필터를 이질적으로 언급된 조건을 사용하여 처리한다. 세번째 필터를 상동적으로 언급된 엄격한 조건하에 처리한다. 여과기의 예비 하이브리드화, 하이브리드화 및 세척과정은 이질적 조건하에 60℃ 및 상동적 조건하에 68℃에서 수행한다. 가열 처리후 필터를 3 x SSC에 적신후 10 x 덴하르트(참조 실시예 3.4), 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 20mM EDTA(pH 8.0), 1m NaCl, 0.5% SDS 및 0.1% 나트륨 피로포스페이트로 이루어진 예비가온한 하이브리드화 완충액에서 2시간 동안 하이브리드화시키고 여기에 0.1㎎/㎖ 전단처리 및 변성시킨 청어 정자 DNA롤 새로 가한다. 이어서, 필터를 청어 정자 DNA를 포함하는 50㎖의 하이브리드화 완충액을 함유하는 플라스크에 한번에 옮겨 넣고 여기에 pGW800의 닉-해독된 1.2kbp BamHI-BalII 단편을 가한다. 40시간 동안 하이브리드화시킨 다음 상동적 또는 이질적 조건을 사용하여 필터를 세척한다. 상동적 세척조건은 다음과 같다; 필터를 2 x SSC, 0.1% SDS 및 0.1% 나트륨 피로포스페이트 중에서 0.5시간 동안 2회 및 이어서 0.2 x SSC, 0.1% SDS 및 0.1% 나트륨 피로포스페이트에서 0.5시간 동안 2회 세척한다. 이질적 조건은 다음과 같다; 필터를 하이브리드화 완충액 중에서 0.5시간 및 4 x SSC, 0.1% SDS 및 0.1 SDS 및 0.1% 나트륨 피로포스페이트 및 최종적으로 2 x SSC, 0.1% SDS 및 0.1% 나트륨 피로포스페이트 중에서 0.5시간 동안 2회 세척한다. 필터를 공기 건조시키고 강화 스크리닝을 사용하여 -60℃에서 3일간 코닥-XAR 5필름에 노출시킨다. 양성 시그날을 나타내는 파아지를 실시예 3.4에서 기술한 바와 같이 회수한다.
상동적 조건하에 처리한 필터상에서 7개의 양성 시그날이 관찰되는데 이들 시그날은 이즐적 조건하에 처리한 필터상의 상응하는 위치에서도 존재한다. 이들 시그날은 PGII 유전자를 함유하는 재조합 λ파아지로부터 생성되는 것으로 간주된다. 이들 시그날을 제외하고는, 30개의 양성 시그날이 이질적 조건 처리한 필터상에서 수득되고 이들 시그날은 두 필터의 상응하는 위치에서 존재한다. 이들 30개 시그날의 시그날 강도는 다양하다. 대다수의 이들 시그날은 PGII 유전자와 상이한 PG 유전자를 함유하는 파아지로부터 생성된 것으로 간주된다.
게놈성 에이. 나이거 N400 라이브러리는 2차 시기에 대해 스크리닝한다. 전술한 바와 같이 플라그 리프트를 제조한다. 사용된 온도를 제외하고는, 전술한 바와 같이 하이브리드화를 수행한다. 하이브리드화 및 세척은 평판으로부터 수득된 2개의 필터 중 하나에 대해 62℃에서 수행하는 반면 다른 필터는 68℃에서 하이브리드화하고 세척한다. 하이브리드화 후 필터를 62℃ 또는 68℃에서 고SSC(HSSC) 조건을 사용하여 세척한다. HSSC 조건은 다음과 같다; 필터를 4 x SCC에서 5분간 2회 세척한 다음 필터를 4 x SCC에서 0.5시간 동인 2회 및 계속해서 2 x SCC에서 0.5시간 동안 2회 세척하는데, 사용된 SSC 용액은 0.1% SDS 및 0.1% 나트륨 피로포스페이트도 함유한다.
68℃(상동적 하이브리드화 조건)에서 항온처리한 필터에서 62℃에서 항온처리한 필터의 상응하는 위치에서도 존재하는 강력한 5개의 시그날이 수득된다. 실시예 3.5에 따른 이들 파아지중 하나를 제한 분석한 결과 이러한 파아지는 PGII를 암호화하는 유전자(pgaII)가 위치하는 삽입체를 함유함을 나타낸다. 따라서, 이들 5개의 파아지는 모두 pgaII를 함유하는 것으로 생각된다. 또한, 62℃(이질적 하이브리드화 조건)에서 배양한 필터에는 68℃에서 배양한 상응한 필터에서는 하이브리드화되지 않거나 단지 약하게 하이브리드화되는 17개의 양성 시그날이 존재한다. 이들 17개 시그날의 강도는 다양하다.
pgaII를 함유하지 않는, 1차 스크리닝으로부터의 16개 파아지 및 2차 스크리닝으로부터의 10개 파아지를 추가 정제를 위해 선별한다. 이들 파아지를 이들의 초기 검출에 사용된 조건을 사용하여 정제한다. 성상확인된 파아지는 표 VII에 기재된 파아지 및 8개의 추가 파아지(2, 3, 7, 31, 33, 40, 41, 42번 파아지)이다. 1번부터 30번 파아지는 라이브러리의 1차 스크리닝에서 수득되고, 더 높은 번호의 파아지는 2차 스크리닝에서 수득되었다.
폴리갈락투로나제 I 유전자를 함유하는 파아지와 다른 폴리갈락투로나제 II 관련 서열을 함유하는 파아지를 구별하기 위하여, 선별된 파아지의 플라그 리프트를 pGW1900의 닉-해독 시킨 1.8kbp HindIII 단편(실시예 3.9)과 하이브리드화시킨다. 하이브리드화 과정은 62℃에서 하는 반면에, 모두 0.1% SDS 및 0.1% 나트륨 피로포스페이트(4 x SSC, 2 x SSC, 1 x SSC, 0.5 x SSC, 0.2 x SSC 및 0.1 x SSC;항온처리는 완충액당 30분간 한다)를 함유하는 SSC 완충액 시리즈를 사용하면서 세척과정도 62℃에서 수행한다. 이러한 조건을 이용하며, 파아지 2, 3, 7, 40, 41 및 42는 강력한 하이브리드화 시그날을 나타내어 파아지 PG I-λ7로 수득한 시그날에 필적하며, 후자의 파아지는 pgaI 유전자를 함유한다(실시예 3.6). 이들 파아지 중 하나에서 수득한 DNA를 제한 분석한 결과 이러한 파아지는 pgaI 유전자가 위치한 삽입물을 함유함을 나타낸다. 이들 6개의 파아지는 모두 pgaI 유전자를 함유하는 것으로 고려된다. 분석된 기타 파아지(1, 8, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 43)는, 존재할 경우 약한 하이브리드화 시그날만을 나타내므로 이들 파아지는 pgaI 유전자를 함유하지 않는다.
어떠한 파아지가 동일한 단편을 함유하는지를 밝히기 위하여, 실시예 3.5에서 기술한 바와 같이 표 VII에 표시되고 실시예 3.6에서 기술한 바와 같이 분해한 파아지로부터 DNA를 분리하고, 계속해서 생성 단편을 써던 블롯 분석으로 특징화한다. HinfI 및 HincII 분해 분석을 위하여, 겔의 아가로스 함량을 1%(w/v)로 증가시킨다. 써던 블롯을 pGW1803으로부터의 미리 닉-해독한 1.2kbp BamHI/EcoRI 단편과 60℃에서 하이브리드화하는 반면에 세척과정도 전술한 HSSC 조건을 사용하여 60℃에서 수행한다. 이들 파아지의 초기 분류에 유용한 것으로 밝혀진 제한 효소는 BamHI 및 BglII와 HinfI 및 HincII의 배합물이며 효소 HinfI 및 HincII는 별도로 사용한다. HincII 및 HinfI은 보통 소형 제한 단편을 생성하는데 상기와 같은 경우에서는 생성된 하이브리드화 단편이 pgaII 관련 서열 뿐만 아니라 EMBL4 벡터에서 유도된 DNA를 함유하는 기회를 최소화시킨다.
표 7에 나타낸 데이터로부터 대부분의 파아지 부류의 경우 몇몇 대표적인 파아지가 독립적으로 분리되었음을 명백히 알 수 있다. 모든 하이브리드화 시그날의 선별만이 초기 스크리닝시 취해졌다는 사실에서, 각 부류에 대해 관찰된 λ-파아지의 번호(부류 A: 3; B: 3; C: 4; D: 3; E: 2)는 상이한 유전자가 유사한 빈도로 관찰됨을 나타낸다. PGI 유전자의 경우에서 이러한 수는 좀 더 높고(분석된 26개의 파아지 중 6개) 반면에 파아지를 함유하는 PGII는 동일한 빈도(분석된 59개의 파아지중 12개)로 발견된다. G부류는 PG 유전자 또는 PGII 유전자로부터 유도된 두 프로브와 더욱 약하게 하이브리드화된다. 각각 17 및 27번 파아지에서 3.0 및 4.9kbp의 하이브리드화 단편 외에, 두 파아지에서동일하고 삽입물로부터 유도된 몇몇 비-하이브리드화 단편, 즉 5.6kbp, 5.1kbp, 1.45kbp 및 0.57kbp 단편이 BglII/BAMHI 분해시 검출된다. 또한, 두 파아지의 HincII 및 HinfI 분해물도 거의 동일하다.
본 실시예에서 분리된 파아지는 다음과 같이 재명명된다.
Figure kpo00039
[실시예 7.3]
[PGC 유전자(pgaC)의 아클로닝; pGW1910의 작제]
파아지 λPG-C20(실시예 7.2; 파아지 20, C 부류)를 BglII로 분해하고 생성 단편을 아가로스 겔 상에서 분리한다. 전술한 바와 같이(실시예 3.6) 하이브리드화 7.8kbp BalII를 함유하는 겔 박편을 회수하고 단편을 분리한다. BglII단편을 BamHI 분해하고 CIP(송아지 장 포스파타제) 처리한 pUC9와 연결시킨다. 연결반응 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 JM109(실시예 3.6)를 형질전환시킨다. 몇몇 생성된 백색 콜로니를 암피실린을 보충한 YT 한천에 도말한다. 밤새 생장시킨 후 콜로니를 니르토셀룰로스 필터에 흡착시킨다. 이어서, 필터위의 콜로니를 용해시키고 방출된 DNA를 문헌[참조: Maniatis et al., ref. 6: p. 314]에 기술된 바와 같이 가열 처리하여 고정시킨다. 가열 처리한 필터를 2 x SSC에 적시고 장갑낀 손으로 부드럽게 문질러서 세균 세포 조각을 제거한다.이어서, 필터를 실시예 7.2에서 기술한 이질적 조건(60℃, 2 x SSC로 세적)을 사용하여, pGW1803의 1.2kbp BamHI-EcoRI 단편과 하이브리드화시킨다. 양성 콜론을 선택하고 전술한 바와 같이 플라스미드 DNA를 정제한다. 이어서, 플라스미드 DNA를 제한 분석에 사용하여 물리적인 지도를 작성한다.
이러한 방법으로 새로운 플라스미드가 작제된다. pGW1910(제7도)는 벡터 pUC9의 BamHI 부위에 삽입된 파아지의 λPG-C20의 7.8kbp BalII 단편이다. 이러한 아클론은 파아지 λPG-C20의 하이브리드화 단편, 예를들면, 1.1kbp SmaI 및 1.6kbp KpnI 단편을 포함한다. pGW1910의 물리적 지동상의 이들 단편의 위치로부터 이러한 플라스미드가 완전한 PGC 유전자(pgaC)를 함유하는 것으로 추론된다.
[실시예 8]
[PGII 프로모터 조절하에서 사람 하이브리드 인터페론 BDBB의 발현]
[실시예 8.1]
[플라스미드 pGII-IFN AM119 전구체의 작제(제4도)]
플라스미드 pGW1800을 EcoRI으로 분해하고 하기와 같이 T4 폴리머라제로 처리한다. 이 DNA의 재연결 및 이. 콜라이 DH5αF'의 형질전환은 EcoRI 절단부위가 결실된 것을 제외하고는 pGW1800과 동일한 플라스미드 pGW1800-E의 분리를 허용 한다.
플라스미드 pGW1800-E를 BglII로 분해하고 50mM 트리스-HCl pH 8.0 및 50mM NaCl의 존재하에 65℃에서 1시간 동안 세균 알칼린 포스파타제(BRL)로 처리한다. 알칼린 포스파타제는 프로테이나제 K(Boehringer Mannheim)로 분해하여 불활성화시키고 페놀로 추출한다. 이어서, DNA를 에탄올 침전시키고 건조시킨 다음 물에 재용해시킨다. 이어서, 점성 말단을 아래와 같이 T4DNA 폴리머라제로 충전시킨다.
플라스미드 pJDB207-IFN AM119(EP 205 404)를 HindIII 및 ClaI로 분해한다. 이들 선형 단편의 점성 말단을 각각 0.1mM의 dCTP, dGTP, dATP 및 dTTP + 67mM 트리스-HCl(pH 7.5), 6.7mM MgCl2, 16.7mM(NH4)2SO4및 5mM DTT의 존재하에 37℃에서 30분간 T4 DNA 폴리머라제(Boehringer Mannheim)으로 충전시킨다. 65℃에서 5분간 가열하여 반응을 중단시킨다. 단편을 0.8%의 저 겔화온도의 아가로즈(BioRad 제조) 겔에서 분리하고 IFN AM119 암호화 영역을 포함하는 1kbp 단편을 절단한 다음 DNA를 Elutip D(Schleicher Schull) 컬럼 상에서 정제하고 에탄올 침전시킨다[참조 문헌: Schmitt 7 Lohen, ref. 34].
100ng의 IFN AM119 단편 및 제조된 pGW1800-E 벡터를 실온에서 2시간 동안 5㎕의 20mM 트리스-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM ATP 및 1 단위의 T4DNA 리가제(Boehringer Mannheim 제조) 중에서 함께 연결한다. 이 혼합물을 컴피턴트 이. 콜라이 DH5αF' 세포에 형질전환시킨다. 암피실린 내성 형질전환체를 이들의 플라스미드 DNA를 제한 분해하여 스크리닝함으로써 플라스미드 pGII-IFN AM119 전구체를 함유하는 것들을 동정한다.
[실시예 8.2]
[PCR을 이용한 정확한 pGII0IFN AM119 및 pGIIss-IFN A119 융합체의 생성(제4도 및 제5도)]
PCR 방법은 문헌[참조: R.M. Horton et al., ref. 35]에 기술되어 있고 제5도에 요약되어 있다.
pGW1800을 XbaI 분해로 선형화하고 에탄올로 침전시킨다. 물에 재현탁시킨 후, 100ng의 상기 DNA를 올리고뉴클레오타이드 A 및 B(제5도)를 사용하는 폴리머라제 쇄 반응(pCR)에 의해 25회 사이클(각각 94℃에서 1분, 40℃에서 2분 및 72℃에서 3분으로 이루어진)에 이어서 72℃에서 10분간 자동화 열 사이클러에서 증폭시킨다. 100pM의 각 올리고뉴클레오타이드 및 0.5㎕의 Taq 폴리머라제(Perkin Elmer Cetus 제조)를 공급자가 권장한 반응 완충액을 사용하여 100㎕ 용적으로 각 반응에 사용한다. DNA 1이 생성된다(제5도).
이와 유사하게 올리고뉴클레오타이드 A 및 C로 PGW1800을 처리하면 DNA 2가 생성된다.
이와 유사하게 pJDB207-IFN AM119를 BamHI으로 선형화하고 올리고뉴클레오타이드 D와 F 또는 E와 F로 pCR 반응시키면 각각 DNA 3 또는 DNA 4가 수득된다.
이들 반응 혼합물을 에탄올로 침전시키고 물에 재용해시킨 다음 분취량을 혼합물중 DNA 단편의 농도를 측정하기 위하여 겔 상에서 체크한다.
전술한 동일 조건을 사용하여 DNA 1 및 DNA 4를 올리고뉴클레오타이드 A 및 F와 PCR 반응시키면 DNA 5가 수득되고 DNA 2 및 DNA 3을 동일 올리고뉴클레오타이드와 PCR 반응시키면 DNA 6이 수득된다(제5도).
DNA 5는 BamHI 부위로 시작되고 EcoRI 부위로 종결되며 PGII 프로모터 단편에 연결된 본래의 출발 메티오닌 코돈과 완전한 하이브리드 인터페론 BDBB의 암호화 영역과의 온전한 프레임 융합물을 포함한다.
DNA 5의 BamHI-EcoRI 단편을 실시예 8.1에서 작제한 BamHI-EcoRI 절단 플라스미드 pGII-IFN AM119 전구체와 연결시켜 플라스미드 pGII-IFN AM119를 생성시킨다.
마찬가지로, 온전한 하이브리드 인터페론 BDBB를 암호화하는 영역으로 갖는 PGII 프로모터 단편에 연결된 PGII 시그날 서열의 완전한 프레임내 융합물을 함유하는 DNA 6의 BamHI-EcoRI 단편을 pGII-IFN AM119 전구체에 삽입시켜 플라스미드 pGIIss-IFN AM119를 수득한다.
[실시예 8.3]
[pCG59D7 및 pGIIss-IFN 또는 pGII-IFN을 사용한 에이. 나이거 돌연변이체 An8의 동시 형질전환]
우리딘 영양요구성 돌연변이체 An8( = DSM 3917. 유럽 특허원 제278 355)를 플라스미드 pCG59D7 및 pGIIss-IFN 또는 pGII-IFN AM119로 동시형질전환시켜 우리딘 독립 영양주를 수득한다.
에이. 나이거 An8의 분생포자를 전체적으로 포자를 형성할때까지 완전 배지내 28℃에서 4일간 생장 시킨다. 2 x 108개의 분생포자를 사용하여 1g/ℓ 아르기닌 및 우리딘으로 보충한 200㎖ 최소 배지에 접종한다.
29℃ 및 180rpm에서 20시간 동안 생장시킨 후, 미라클로쓰를 통해 균사체를 여과 수거하고 10㎖ 0.8M KCl, 50mM CaCl2로 2회 세척한 다음 20㎖ 0.8M KCl, 50mM CaCl2, 0.5㎎/㎖ Novozym 234(Novo Industries 제조)에 재현탁시킨다. 혼합물을 충분한 양의 원형질체가 방출(90 내지 120분후 현미경으로 검출) 될 때까지 진탕수조(30℃, 50rpm)에서 배양한다. 원형질체 현탁액을 깔때기내 글라스 울 플러그를 통해 여과시켜 균사체 조각을 제거한다. 원형질체를 실온에서 온화한 원심분리(10분, 2000rpm)에 의하여 펠렛팅하고 10㎖ 0.8M KCl, 50mM CaCl2로 2회 세척한다. 원형질체를 200 내지 500㎕의 0.8M KCl, 50mM CaCl2에 최종 재현탁시켜 1 x 108/㎖ 농도가 되게 한다.
형질전환을 위하여 200㎕ 분취량의 원형질체 현탁액을 5㎍의 pCG59D7 및 50㎍의 pGIss-IFN AM119 또는 pGII-IFN AM119 DNA, 50㎕의 PCT(10mM 트리스-HCl pH 7.5, 50mM CaCl2, 25% PEG6000)과 함께 배양한다. 배양 혼합물을 얼음 위에서, 20분간 방치한 후 추가로 2㎖의 PCT를 가하고 혼합물을 실온에서 추가로 5분간 배양한다. 4㎖ 0.8M KCl, 50mM CaCl2를 가하고 1㎖ 분취량의 최종 형질전환 용액을 0.8M KCl로 안정화시킨 액화 최소 한천 배지(최소배지 + 1g/ℓ 아르기닌 + 10g/ℓ 박토 한천(Difco 제조))와 혼합시킨다. 혼합물을 동일 배지의 한천 평판에 즉시 붓고 30℃에서 배양한다.
28℃에서 2 내지 3일간 생장시킨 후, 수백개의 작고 불완전 것으로 추측되는 형질 전환체의 백그라운드 생장상에 왕성하게 생장하고 포자를 형성하는 콜로니로서 안정한 형질 전환체가 출현한다.
[실시예 8.4]
[PGII 프로모터 조절하에 있는 하이브리드-인터페론 BDBB 유전자의 발현]
동시 형질전환 실험의 형질전환체(실시예 8.3)를 선택하여 인터페론 발현에 대해 분석한다. 인터페론 활성은 사람 CCL-23 세포 및 챌린지 바이러스로서 수포성 구내염 바이러스(VSV)를 사용하여 문헌[참조: J.A. Armstrong, Appl. Microbiol. 21, 732 (1971)]의 방법에 따라 측정한다.
형질전환체로부터의 분생포자를 개별적으로 50㎖의 예비 배양 배지(Pectin Slow Set L(Unipectin, SA, Redon, France) 3g/ℓ, NH4Cl22g/ℓ, KH2PO40.5g/ℓ, NaCl 0.5g/ℓ, Mg2SO4·7H2O 0.5g/ℓ, Ca2SO4·2H2O 0.5g/ℓ, pH 7.0, 1% 아르기닌)에 예비 배양한다. 예비 배양액을 250rpm 및 28℃에서 72시간 동안 배양한다. 10%의 예비배양액을 사용하여 50㎖의 주 배양 배지(대두 소맥분 20g/ℓ, 펙틴 Slow Set 5g/ℓ, 1% 아르기닌)를 접종시킨다. 배양액을 250rpm, 28℃에서 72 내지 96시간 동안 생장시킨다.
다양한 시간대(매 20시간 마다)에서 샘플을 취하여 세포를 원심분리로 펠렛팅하고 동결건조 및 건조 분쇄로 파괴한다. 상등액 및 세포 추출물 모두를 전술한 바와 같이 인터페론 활성에 대해 시험한다. 매우 큰 인터페론 활성이 pGIss-IFN AM119를 함유하는 형질전환체에서 배지로 분비되는 것으로 나타난 반면 pGII-IFN AM119를 함유하는 형질전환체의 경우 주로 세포 추출물에 존재한다.
[실시예 9]
[형질전환된 에이. 니둘란스 균주에 의한 폴리갈락투로나제 I 및 폴리갈락투로나제 II의 생성]
[실시예 9.1]
[에이. 니둘란스 G191 이. 콜라이 MH1의 형질전환에 사용된 플라스미드의 증식 및 정제]
pGW635를 이. 콜라이 MH1에서 pGW1800를 JM109에서 및 PGW1900를 DH5αF'에서 증식시킨다.
[실시예 9.2]
[우리딘 영양요구성 에이. 니둘란스 돌연변이체 원형질체 및 형질전환체의 제조]
에이. 니둘란스 돌연변이체 균주 G191(pyrG. pabaA1. fwA1. uaY9)는 문헌[참조: Ballance and Turner, 1985 (ref. 27)]에 기술된바 있다.
배지 ℓ당 2㎎의 p-아미노벤조에이트를 가하는 것을 제외하고는, 균사체를 37℃에서 및 에이. 나이거에 대하여 기술한 바와 같이(실시예 5.2) 생장시킨다. 원형질체를 에이. 나이거에 대하여 기술한 방법에 따라 제조한다. 형질 전환을 위하여 5 x 106개의 원형질체를 200㎕ STC에 취한 다음 1㎍ pGW635 및 20㎍ pGW1800 또는 25㎍ pGW1900과 함께 배양한다. 플레이트를 37℃에서 3일간 배양한다.
약 50개의 형질전환체/㎍ pGW635를 동시 형질감염 실험으로 수득하고 각 실험에서 20개의 형질전환체를 50mM 글루코스 최소 배지상에서 추가 정제한다. 계속해서, 이들 균주를 사용하여 추가 분석을 위해 포자를 증식시킨다.
[실시예 9.3]
[형질 전환된 에이. 니둘란스 균주에 의한 폴리갈락투로나제 I 및 II 생성의 웨스턴 블롯 분석]
동시 형질전환 플라스미드로서 pGW1800을 사용하여 실시예 5.2에 따라 수득한 동시 형질감염체를, 2㎎/ℓ p-아미노벤조에이트, 질소원으로서 7.5g/ℓ NH4NO3및 1%(w/v) 사과 펙틴(d.e. 61.2%) + 탄소원으로서 사탕무우 펄프를 사용하는 75㎖ 최소 배지에 출발물질로 105분생 포자/㎖를 사용하여 함침 생장시킨다. 갈렌캠프 궤도 진탕기를 250rpm에서 사용하고 생장 온도를 30℃에서 유지시킨다.
샘플을 생장 43시간 및 68시간 후 취하여 원심분리하고 상등액을 0.02%(w/v) 나트륨 아자이드를 함유하는 5mM 나트륨 포스페이트 완충액(pH 6.5)에 대하여 4℃에서 밤새 투석한다. 이들 샘플의 PGII 함량 분석은 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅(page 69 참조)으로 검사한다. 대조군으로서 사용된 에이. 니둘란스 샘플은 모노클로날 항체로 실험한 바와 같이 PGII 교차-반응성 물질을 함유하지 않는다.
분석된 20개의 형질전환체는 모두 폴리갈락투로나제 II를 생성하지만 양은 상이한 형질 전환체간에 다양하다. 예상된 분자량(38kDa)의 주요 밴드외에도 대부분 분해 생성물을 나타내는 여러개의 저분자량 소밴드가 관찰된다. 대부분의 효소를 생성하는 형질전환체는 에이. 니둘란스 G191/pGW1800-13이다. 상이한 생장 배지를 사용하는 이러한 형질전환체의 폴리갈락투로나제 활성을 표 VIII에 나타낸 바와 같이 수용체 균주의 활성과 비교하였다.
Figure kpo00040
형질전환체 G191/pGW1800-13은 펙틴계 물질의 부재하에서 PGII를 고수준으로 합성하므로, 수득된 다른 에이. 니둘란스 G191/pGW1800 형질전환체의 pGII 생성도 추가로 분석할 수 있다. 이를 위해 19개 형질전환체 및 G191/pGW635-1을 최소 배지염으로 이루어진 배지에서 질소원으로서 0.4% NHCl 및 탄소원으로서 5% 글루코스를 사용하고 고농도로 첨가된 포스페이트(15g/ℓ KHPO)로 생장시킨다. 배양 여액을 46 및 69시간 후에 수득한 후 배양 여액을 미리 농축 및 투석하지 않고 웨스턴 블롯팅 모노클로날 항체와의 프로브화에 의해 분석한다. 19개의 에이. 니둘란스 G191/pGW1800중 17개 이상이 글루코스 배치 상에서 PGII를 합성하는 반면에, 에이. 니둘란스 G191/pGW635-1로는 어떠한 시그날도 수득되지 않았다. 명백한 시그날이 수득된다는 사실은 비농축 여액 및 모노클로날 항체를 사용할 경우 비-형질전환된 균주의 배양 여액의 웨스턴 블롯상에서 단지 미약한 PGII 시그날만이 수득되므로 실시예 5.5에서 기술한 바와 같은 폴리갈락투로나제 유도 조건하에서 생장시킨 에이. 나이거 N402에 비해 높은 발현 수준임을 의미한다. 전술한 배지를 사용하되 탄소원으로 5% 글루코스 대신 1% 사탕무우 펄프 및 1% 펙틴을 사용한 PGII 생성 에이. 나이거 G191/pGW1800-13 및 6개의 다른 G191/pGW1800 형질전환체도 전술한 바와 같이 분석한다. 에이. 니둘란스 G191/pGW1800-13과는 달리, 이들 6개의 형질 전환체는 펙틴 및 사탕무우 펄프를 함유하는 배지 상에서 훨씬 더 많은 양의 PGII를 생성하는 반면 에이. 니둘란스 G191/pGW635-1로는 어떠한 시그날도 발견되지 않았다.
동시형질전환 플라스미드로서 pGW1900을 사용하여 실시예 9.2에 따라 수득한 동시형질전환체를 두개의 상이한 배지상에서 생장 시킨다. 첫번째 배지는 NHCl(4.0g/ℓ), 1%(w/v) 사과 펙틴(d.e. 61.2%) 및 1%(w?v) 사탕 무우 펄프를 첨가한 고 함량 포스페이트 최소염 배지로 이루어진 반면에 일부 형질전환체는 NH4Cl 대신 우레아(4.2g/ℓ)를 질소원으로 함유하는 상기 배지에서도 생장 한다. 전술한 저 함량 포스페이트 최소배지(page 28)와의 차이점은 ℓ당 1.5g 대신 15g의 KHPO를 사용한다는 점이다. 두번째 배지도 0.1% 효모 추출물, 질소 및 탄소원으로서 NHCl(10g/ℓ) 및 3%(w?v) 글루코스를 첨가한 고 함량 포스페이트 최소 염 배지로 이루어진다. 두 배지에서 2㎎/ℓ p-아미노벤조에이트를 가한다, 배양액은 갈렌캠프 궤도 진탕기를 사용하여 30℃, 250rpm에서 42시간 동안 생장시키고 배양 여액 샘플을 20 및 42시간 후에 취한다. 유사한 조건하에서 형질전환체로서 생장 시킨 에이. 니둘란스 G191의 웨스턴 블롯에서, 정제된 폴리갈락투로나제 I에 대해 증가한 폴리클로날 항체와 가교반응하는 단백질이 전혀 또는 극소량만이 검출되었다. 형질전환체의 75%의 배양 여액에서 PGI은 상당수준으로 검출된다.
복합 배지중에 우레아 대신 NHCl 및 고 함량의 포스페이트를 사용할 경우, 생성되는 폴리갈락투로나제 I의 단백질 분해 반응이 현저히 감소한다. 웨스턴 블롯팅 결과 및 활성측정을 기초로 하여 형질전환체 G191 pGW1900-6는 PGI 고유활성이 550U/㎎ 이므로 표 VI에 나타낸 바와 같이 효소 1g/ℓ이상 생성하는 것으로 평가된다(참조: Kester and Visser, 1990).
Figure kpo00041
각각 폴리갈락투로나제 I 및 IIF를 암호화하는 pgaI 및 pgaII 유전자는, 고유전자 용량으로 다중 카피의 형질전환체에서 조차도 글루콧-함유 배지상에서 애이. 나이거에서는 발현되지 않는다. 각각 균주 G191/pGW1900-6 및 G191/pGW1900-10 등 및 G191/pGW1800-13 및 G191/pGW1800-20 등의 에이. 니둘란스 형질전환체내 에이. 나이거 유전자의 발현은 그러나 에이. 니둘란스에 있어서, 이들 유전자의 동화 산물 억제가 억제된다는 것을 나타낸다. 이러한 현상은 이들 상이한 아스퍼질러스 종간에 동화 산물 억제 시스템이 있어서 상이한 특이성이 있음을 의미한다. 이러한 사실은, 숙주 자체의 폴리갈락투로나제의 발현을 회피하는 조건하에서 에이. 니둘란스와 같은 상이한 숙주내에서 특정의 에이. 나이거 폴리갈락투로나제 유전자를 발현시키는데 이용할 수 있다. 이와 같이 하여 수득된 폴리갈락투로나제 효소는 실제적으로 순수하다.
[실시예 10]
[에이. 니둘란스 형질전환체 G191/pGW1800-13으로 부터 수득한 폴리갈락투로나제 II의 분리, 정제 및 특징화]
[실시예 10.1]
[형질전환체 G191/pGW1800-13을 사용한 PGII의 제조]
에이. 니둘란스 형질전환체 G191/pGW1800-13을 1.5g/ℓ 대신에 15g/ℓ KHPO가 사용된 것을 제외하고, 실시예 5.3에 기술된 바와 같이 조성된, 1% 사탕무우 펄프와 1% 펙틴 배지 100㎖ 배양물 중에서 생장시킨다. 유사하게, 이 형질전환체는, 탄소원으로서 5% 또는 1% 글루코스를 사용하여 최소 배지 상에서 낮은 수준 및 높은 수준의 포스페이트 모두에서 생장시킨다. 이들 배지들은 에이. 나이거 N402중에서 어떠한 검출 가능한 폴리갈락투로나제 II도 생성하지 않으나, 에이. 니둘란스 G191 자체도 역시 실시예 9.3에 기술된 바와 같이 PGII를 생성시킬 수 없다.
배양 샘플에서, 5% 글루코스 및 고 농도 포스페이트 약 860U/㎖을 사용하여 72시간후 에이. 니둘란스 형질전환체 G191/pGW1800-13의 여과물을 취한다. 860U/㎖의 PG 활성도가 관측되며 낮은 포스페이트를 사용하면 이 양은 550U/㎖이다. 감소된 수준은 1% 글루코스를 사용할때 나타나며 높은 포스페이트는 주로 48시간 후 탄소원이 점차 소모될 때 단백질의 턴오버(turnover)가 증가되기 때문이다. 1%글루코스 및 낮은 포스페이트 경우, 생산 수준은 전체 배양기간에 걸쳐 낮에 유지된다. 5% 글루코스 및 고 함량 포스페이트를 사용하여 배양 여과물 ℓ당 수득한 단백질의 양은 약 1g/ℓ이다. SS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 형질전환체의 배양 여과물이 에이. 나이거 PGII의 분자량에 상응하는 하나의 단백질 밴드를 함유함을 나타내고 있다.
[실시예 10.2]
[에이. 니둘란스 형질전환체 G191/pGW1800-13의 배양 여액으로 부터 수득한 PGII의 분리 및 정제]
pH 약 4.9인 배양 여액(약 2ℓ)을 증류수로 5배 희석시키고 2N NaOH를 사용하여 pH를 6.0으로 한다. 효소를 농축시키기 위해, 이 용액을 20mM 인산칼륨 완충액(pH 6.0)으로 예비 평형시킨 600㎖의 세파텍스-A50에 부하하고 이는 유동율을 크게 하는 부크너 깔때기에 담아둔다. 모든 효소 활성은 이온 교환 물질에 흡착되고 동일한 완충액 중에서 1M NaCl을 사용하여 용출시켜 300㎖로 수거한다(회수율:65%). 그후 효소 용액을 10mM 비스트리스 완충액(pH 6.0)에 대해 투석하고 동일한 완충액으로 평형시킨 세파로스 DEAE 고속유동컬럼(60㎖ 베드 용적)에 부하한다. 효소 활성을, 약 0.15M NaCl 중의 완충액중 0 내지 0.5M NaCl 구배에 적용시켜 용출시킨다(총 회수율: 57%).
[실시예 10.3]
[에이. 니둘란스 형질전환체 에이. 니둘란스 G191/pGW1800-13의 배양 여액으로 부터 정제한 PGII의 특성]
실시예 10.2에 따라 정제한 PGII를, 실시예 1.1(PGII-케이스)에서 기술된 바와 같이 라피다제로부터 정제한 효소와 비교하였다. 두 효소는 SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 동등한 겉보기 분자량 38kDa를 가지며 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체와 동일하게 반응한다(참조: 실시예 6.4). 등전점 포커싱에 따라, 에이. 니둘란스 형질전환체에 의해 생성되고 실시예 10.2에 따라 정제된 PGII는 주밴드(pI 5.2)를 제외하고 단지 하나의 소 밴드만이 발견되었기 때문에 에이. 나이거에 의해 생성된 효소에 비해 훨씬 적인 미세이질성을 갖는다.
두 효소의 역학특성은 변형시킨 페리시아나이드 시험을 사용하여, 폴리갈락투로네이트의 농도를 0.2 내지 1㎎/㎖ 사이에서 변화시키면서, 25℃, pH 4.2의 0.075M 나트륨 아세테이트에서, 폴리갈락투로나제 활성을 측정하여 비교하였다. 라파다제로부터의 에이. 나이거 PGII에 대한 Vmax는, Km이 0.8㎎/㎖ 폴리갈락투로네이트(USB)를 가지는, 2760U 단백질(㎎)이다. 형질 전환체로부터 유도된 PGII에서 Vmax 값은 약간 높아 3480U의 단백질(㎎)이었고 반면 Km 값은 동일했다. 마지막으로 에이. 니둘란스 형질전환체로부터 정제된 PGII를 실시예 1.3(PGII-케이스)에 따라 시아노겐 브로마이드로 처리하였다. 이것은 라피다제로부터 정제된 PGII에서 관찰된 단편의 패턴과 동일함을 나타낸다.
[실시예 11]
[형질전환된 에이. 나이거 N593균주 중에서 에이. 나이거 NW756의 PGII 유전자 발현]
pGW635를 선택성 벡터로 사용하여 pGW1756(실시예 3.10)을 에이. 나이거 N593을 형질전환시키는데 사용한다(실시예 5.2)참조). 임의로 채취한 8개 형질전환체를 정제하고 또 다른 분석에 사용한다. 이들을 염화암모늄(4.0g/ℓ), 1% 펙틴(d.e. 61.2) 및 1% 건조 및 분쇄시킨 사탕수수 펄프를 가한 액체 최소 염 배지에서 실시예 5.5에 기술된 조건을 사용하여 생장시킨다. 형질전환체의 배양물 여액내로 PGII의 과잉 생산은, PGII 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 알수 있다. 2개의 PGII 과잉생산 형질전환체(N593/pGW1756-6 및 N593/pGW1756-7)가 선별되었고 이들 균주 및 대조군 균주 N402(참조 실시예 5.5)는 상기 기술된 조건을 사용하여 다시 생장시킨다. 접종 44시간 후 배양 여액을 수득하고 기술된(참고문헌 2) 바와 같이 조여과물 중에서 폴리갈락투로나제 활성을 측정하고, 효소 반응 혼합물은 50mM 나트륨 아세테이트를 사용하여 pH 4.8로 완충시킨다.
이 결과는 또한 pGW1756상의 pgaII 유전자가 작동성이며, 이 플라스미드가 폴리갈락투로나제 활성을 과잉 발현시키도록 에이. 나이거를 형질전환시키는데 사용될 수 있음을 나타내고 있다.
[실시예 12]
[형질전환된 에이. 니둘란스 균주에 의한 폴리갈락투로나제 C 생산]
에이. 나이거 N400의 pgaC 유전자를 지니고 있는 플라스미드 pGW1910(실시예 7.3 참조)을, 실시예 9.2에 기술된 바와 같이 에이. 니둘란스 G191을 우리딘 자가영양체로 형질전환시키도록 디자인된 실험에서 동시 형질전환용 플라스미드로 사용한다. 생성된 형질전환체중 10개를 정제하고 이어서 또다른 분석을 위한 포자 증식에 사용한다.이들 균주 및 G191/pGW635-1은, 2㎎/㎖ p-아미노벤조에이트, 질소원으로 4.0g/ℓ NHCl, 1% 사탕무우 펄프 및 탄소원으로서 1% 펙틴 및 고 농도(15g/ℓ)의 포스페이트(KHPO)으로 보충시킨 액체 최소 염 배지 중에서 생장시킨다. 접종은 10 포자/㎖로 하고, 250rpm에서 갈렌캠프 궤도 진탕기중 30℃에서 배양한다. 접종 65시간후 배양 여액을 수득하고, 이를 예비 정제 또는 농축시킴 없이 바로 분석한다. 웨스턴 블롯물은 PGI 및 PGII에 대한 항체 혼합물과 함께 배양시킨다(실시예 1.2). 활성 측정(참조 문헌 2)은 0.25% 폴리갈락투론산(USB)을 함유하는 50mM 나트륨아세테이트 완충액(pH 4.9) 중에서 수행한다.
웨스턴 블롯의 결과, 수득된 대다수의 형질전환체는 많은 양의 폴리갈락투로나제 C(pGC)를 생산한다. 이런 결과는 형질 전환체 및 대조 균주(pGW635로 형질전환시킨 에이. 니둘란스 G191)의 상등액에서 PG 활성을 측정함으로써 확신할 수 있다.
[실시예 13]
[형질전환시킨 에이. 니둘란스 균주내에서 에이. 나이거 pgaA 및 pgaD 유전자의 발현]
pgaI, pgaII 및 pgaC 유전자외에 에이. 나이거의 폴라갈락투로나제 유전자 부류의 다른 구성 요소(실시예 7.2)가 에이. 니둘란스를 형질전환시키는데 사용되었다. 본 실시예에서 플라스미드 벡터중의 아클론 대신 파지 λ내의 클론이 사용되었다.
파지 λDNA는 실시예 3.5에 기술된 바와 같이 플레이트 분해물로부터 제조되고 페놀과 클로로포름으로 한번 더 추출한다. 동시형질전환 실험을 위해 약 20㎍의 λDNA가 사용되었으며, 이 DNA는 같은 부류의 2파아지(즉, λPG-A43과 배합한 λPG-A10 또는 λPG-D11과 배합한 λPG-D8)로부터 수득한 양과 같았다. 에이. 니둘란스 G191의 동시형질전환은 실시예 9.2와 같이 수행하며 반면 대조군은 별도로 pGW1900 및 λPGI-7로 동시형질전환시킨다. 상기 기술된 바와 같이 제조된 λ 파지 DNA를 사용하면 세슘클로라이드 구배중에서 밴드화하여 정제한 플라스미드 DNA와 비교할때 형질전환 빈도가 낮아졌다.
관련 형질전환체는 실시예 12에서의 pGW1910 형질전환체에 대해 기술한 바와 같이 정제 및 분석한다. 이 경우 형질 전환체 역시 탄소원으로서 3% 글루코스를 포함하는 배지중에 생장시킨다(고 함량의 포스페이트, 0.1% 효모추출물, 1% 염화암모늄).
형질전환체 에이. 니둘란스 G191/λA-1 및 G191/λD-1이 각각 상기 언급된 PG-A 및 PG-D 파아지 부류를 사용하여 수득된 바 있다. 접종 65시간후 사탕무우펄프/펙틴 배지의 배양 여과물 중의 폴리갈락투로나제의 활성은 대조균주 G191/pGW635-1에서 보다 훨씬 높았다. 따라서, 부류 A 내지 D 중에 존재하는 pgaII 관련된 서열은 폴리갈락투로나제 활성을 가진 단백질을 암호화한다. 웨스턴 블롯에 근거하여 이들 유전자 생성물인, 폴리갈락투로나제 A 및 폴리갈락투로나제 D는 각각 PGI과 유사한 전기영동적 이동성을 가지고 이동한다고 결론지을 수 있다.
에이. 니둘란스 G191/λA-1은 탄소원으로서 글루코스를 갖는 배지 중에서도 폴리갈락투로나제 A를 생성시킨다.
[살시예 14]
[형질전환된 에이. 니둘란스 균주중에서 하이브리드 인터페론의 발현]
동시형질전환 실험을 위해 대략 20㎍의 플라스미드 DNA pGII-IFN AM119 또는 pGIIss-IFN AM119가 사용된다. 에이. 니둘란스 G191의 동시형질전환은 실시예 9.2와 같이 수행한다.
관련된 형질전환체는 실시예 8.4의 형질전환체에 대해 기술한 바와 같이 정제 및 분석한다. 이때 형질 전환체는 또한 탄소원으로서 3% 글루코스를 함유한 배지(고 함량 포스페이트, 0.1% 효모 추출물, 1% 염화암모늄)중에서 생장시킨다.
다양한 시간대에(매 20시간) 샘플을 취하고 세포를 원심 분리시켜 펠렛화하고 동결건조로 파괴시켜 건조 분쇄한다. 상등액과 세포 추출물 모두 기솔된 바와 같이, 인터페론 활성에 대해 시험한다. 인터페론 활성의 대부분은 pGIIss-IFN AM119를 지니고 있는 형질전환체 중에서 배지로 분비되는 것으로 발견된 반면 PGII-IFN AM119를 지니는 형질전환체에서 이들은 주로 세포 추출물 중에 있는데 이는 글루코스만이 탄소원으로 사용될때, 에이. 니둘란스는 pGII-IFN AM119 또는 pGIIss-IFN AM119로부터 IFN을 생산한다는 것을 나타낸다.
[실시예 15]
[폴리갈락투로나제 II 및 폴리갈락투로나제 I의 침연 특성]
오이 조직의 새포 분리물을 사용하여 에이. 나이거 폴리갈락투로나제의 침연 활성도를 분석한다. 가계에서 오이를 구입하고 에탄올에 적신 티슈로 껍질을 문질러 닦아 오염을 제거하거나 자벨(Javel) 수(약국 등급 0.5% 과염소산나트륨에 희석)에 1시간 동안 띄워 놓는다. 그후 오이를 자르고 절단된 오이의 속을 파낸다. 만들어진 두개의 오이 절편(액 12g)을, 앞서 폴리갈락투로나제를 가하거나 가하지 않은 25㎖의 침연 완충액을 함유한 100㎖ 삼각플라스크에 넣는다. 30℃의 수욕중에서 부드럽게 한 방향으로 진탕하며 24시간 계속 배양시킨다. 플라스크를 나안 검사한다. 완전한 침연은 다음 조건에 부합한다; i) 현미경 검경에서 나타나는 바와 같이 오이의 껍질은 필수적으로 붙어있는 조직이 없고 ii) 침연 완충액은 점차 심하게 혼탁되며, iii) 현미경 검경에 의해 판정하여 온전한 것으로 나타나는 바와 같이 높은 비율의 이탈세포에 의해 제시되는 것과 같이 세포 분리와 침연 완충액의 높은 탁도와의 사이에는 양성의 상관 관계가 있다.
실시예 1에 기술한 바와같이 제조된 폴리갈락투로나제 1I, 및 폴라갈락투로나제 I을 상이한 완충액에서 시험한다. 침연 완충액 A(MBA)는 pH 4.8의 50mM 나트륨아세테이트이다. 침연 완충액 B(MBB)는 포스페이트-시트레이트 완충액이다[참조: Ishii (1976), Phytopathology 66, pp. 281-289). MBB는 0.1M 시트르산과 0.1M NaHPO용액을 목적하는 pH값 4.5가 수득될 까때지 혼합하여 제조하고, 그후 등용적의 증류수를 가하며 이어서 10㎎/㎖의 농축핵을 사용하여 소혈청 알부민을 가하여 최종농도가 10㎎/25㎖로 되게 한다.
MBA중의 1㎍ 폴리갈락투로나제 II를 사용하여 오이조직을 24시간 내에 완전히 침연시킨다. 이 완충액 내에서 오이조직은 폴리갈락투로나제 부재 또는 1㎍ 폴리갈락투로나제 I의 존재하에 침연되지 않는다. MBB 중에서 오이조직의 침연 작용은 폴리갈락투로나제 부재 또는 각각 폴리갈락투로나제 I 또는 폴리갈락투로나제 II 10㎍ 존재하에 시험한다. 또한, 효소 부재하에 또는 폴리갈락투로나제 I 존재하에 침연이 관찰되지 않으나, 폴리갈락투로나제 II는 오이조직을 완전하게 침연 시킨다, 실시예 10에서 제조된 PGII 역시 침연 특성을 가진다.
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Figure kpo00043
Figure kpo00044
Figure kpo00045
[서열 리스트]
[서열확인번호 1]
서열유형 : 상응하는 폴리펩타이드를 갖는 뉴클레오타이드
서열길이 : 2495개 염기쌍
본쇄형 : 이본쇄
형태 : 선형
분자형 : 게놈성
공급미생물 : 아스퍼질러스 나이거 N400
직접적인 실험용 공급원 : 플라스미드 pGW1900 (DSM5866)
특징 : 아스퍼질러스 나이거 N400 prepro-폴리갈락투로나제I을 암호화하는 유전자 pgaI
1번부터 909번까지 : 프로모터 영역
901번부터 963번까지 : PGI 시그날펩타이드 암호화 영역
901번부터 1002번까지 : PGI prepro서열 암호화 영역
1003번부터 2127번까지 : 온전한 PGI 암호화 영역
1138번부터 1189번까지 : 인트론
1610번부터 1671번까지 : 인트론
2138번부터 2130번까지 : 정지코돈
2131번부터 2495번까지 : 3'비-암호화 영역, 전사터미네이터 영역의 일부
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Figure kpo00047
Figure kpo00048
Figure kpo00049
Figure kpo00050
Figure kpo00051
[서열확인번호 2]
서열유형 : 상응하는 폴리펩타이드를 갖는 뉴클레오타이드
서열길이 : 3031개 염기쌍
본쇄형 : 이본쇄
형태 : 선형
분자형 : 게놈성
공급미생물 : 아스퍼질러스 나이거 N400
직접적인 실험용 공급원 : 플라스미드 pGW1800 (DSM5505)
특징 : 아스퍼질러스 나이거 N400 prepro-폴리갈락투로나제II을 암호화하는 유전자 pgaII
1번부터 1356번까지 : 프로모터 영역
1357번부터 1419번까지 : PGII 시그날펩타이드 암호화 영역
1357번부터 1437번까지 : PGII prepro서열 암호화 영역
1438번부터 2494번까지 : 온전한 PGII 암호화 영역
1987번부터 2038번까지 : 인트론
2495번부터 2497번까지 : 정지코돈
2498번부터 3031번까지 : 3'비-암호화 영역, 전사터미네이터 영역의 일부
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Figure kpo00053
Figure kpo00054
Figure kpo00055
Figure kpo00056
Figure kpo00057
[서열확인번호 3]
서열유형 : 상응하는 폴리펩타이드를 갖는 뉴클레오타이드
서열길이 : 3047개 염기쌍
본쇄형 : 이본쇄
형태 : 선형
분자형 : 게놈성
공급미생물 : 아스퍼질러스 나이거 NW756
직접적인 실험용 공급원 : 플라스미드 pGW1756 (DSM5942)
특징 : 아스퍼질러스 나이거 N756 prepro-폴리갈락투로나제II을 암호화하는 유전자 pgaII
1번부터 889번까지 : 프로모터 영역
80번부터 952번까지 : PGII 시그날펩타이드 암호화 영역
890번부터 970번까지 : PGII prepro서열에 대한 추정적인 암호화 영역
971번부터 2027번까지 : 온전한 PGII에 대한 추정적인 암호화 영역
1520번부터 1571번까지 : 인트론
2028번부터 2030번까지 : 정지코돈
2031번부터 3047번까지 : 3'비-암호화 영역, 전사터미네이터 영역의 일부
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Figure kpo00059
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Figure kpo00061
Figure kpo00062
Figure kpo00063
[서열확인번호 4]
서열유형 : 상응하는 폴리펩타이드를 갖는 뉴클레오타이드
서열길이 : 2304
본쇄형 : 이본쇄
형태 : 선형
분자형 : 게놈성
공급미생물 : 아스퍼질러스 나이거 N400
직접적인 실험용 공급원 : pGW1910 (DSM5943)
특징 : 아스퍼질러스 나이거 N400 prepro-폴리갈락투로나제C을 암호화하는 유전자 pgaC
1번부터 662번까지 : 프로모터 영역
663번부터 710번까지 : PGC 시그날펩타이드 암호화 영역
663번부터 782번까지 : PGC prepro서열에 대한 추정적인 암호화 영역
783번부터 1995번까지 : 온전한 PGC에 대한 추정적인 암호화 영역
972번부터 1001번까지 : 인트론
1428번부터 1483번까지 : 인트론
1614번부터 1666번까지 : 인트론
1996번부터 1998번까지 : 정지코돈
1999번부터 2304번까지 : 3'비-암호화 영역, 전사터미네이터 영역의 일부
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Figure kpo00065
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Claims (28)

  1. a) pGW1800 또는 pGW1900의 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) DNA 삽입체, b) a)의 DNA 삽입체에 포함된 온전한 PGI 또는 PGII를 암호화하는 영역과 하이브리드화되고 갈락투로나제 또는 폴리갈락투로나제 활성을 갖는 폴리펩타이드에 대한 구조 유전자를 포함하며 임의로 프로모터, 시그날 또는 리더 펩타이드를 암호화하는 영역 및/또는 전사 터미네이터를 포함하는 DNA 서열, c) a) 또는 b)에서 정의한 DNA 서열의 유도체, 또는 d) 온전한 PG, 또는 이의 시그날 펩타이드 또는 리더 펩타이드를 암호화하고 a), b) 또는 c)의 DNA 서열에 대한 유전자 코드의 의미내에서 변성된 DNA 서열 중에서 선택되는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  2. 제1항에 있어서, pGW1800 또는 pGW1900의 에이. 나이거 DNA 삽입체를 포함하는 재조합 DNA 분자.
  3. 제1항에 있어서, pGW1800 또는 pGW1900의 DNA 삽입체에 포함된 온전한 PGI 또는 PGII를 암호화하는 영역과 하이브리드화되고 갈락투로나제 또는 폴리갈락투로나제 활성을 갖는 폴리펩타이드 및/또는 시그날 또는 리더 펩타이드를 암호화하고/하거나 프로모터 활성 및/또는 전사 터미네이터 활성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  4. 제1항에 있어서, pGW1800 또는 pGW1900의 에이. 나이거 DNA 삽입체의 유도체, 또는 pGW1800 또는 pGW1900의 DNA 삽입체에 포함된 온전한 PGI 또는 PGII를 암호화하는 영역과 하이브리드화되고 갈락투로나제 또는 폴리갈락투로나제 활성을 갖는 폴리펩타이드 및/또는 시그날 또는 리더 펩타이드를 암호화하고/하거나 프로모터 활성 및/또는 전사 터미네이터 활성을 갖는 DNA 서열의 유도체를 포함하는 재조합 DNA 분자.
  5. 제4항에 있어서, λPG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35. -B36, -C1, -C16, -C20, -C37, -D8, -D11, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 및 -Y33, pGW1756, pGW1910, pGW1800, pGW1900 및 pGW1756로 이루어진 벡터 그룹 중에서 선택된 벡터 삽입체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  6. 제4항에 있어서, pGW1800 또는 pGW1900의 에이. 나이거 삽입체로부터 유래된 DNA 단편, 또는 상기 DNA 삽입체중 하나에 포함되는 온전한 PI 또는 PGII를 암호화하는 영역과 하이브리드화되고 구조 유전자 및/또는 리더 또는 시그날 펩타이드를 암호화하고/하거나 프로모터 활성 및/또는 전사 터미네이터 활성을 갖는 서열을 포함하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  7. 제6항에 있어서, λPG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35. -B36, -C1, -C16, -C20, -C37, -D8, -D11, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 및 -Y33, pGW1910, pGW1800, pGW1900 및 pGW1756으로 이루어진 벡터 그룹으로부터 선택된 벡터 삽입체로부터 유래된 프로모터 활성을 갖는 DNA 단편을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  8. 제6항에 있어서, λPG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35. -B36, -C1, -C16, -C20, -C37, -D8, -D11, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 및 -Y33, pGW1910, pGW1800, pGW1900 및 pGW1756으로 이루어진 벡터 그룹으로부터 선택된 벡터 삽입체로부터 유래된 리더 펩타이드를 암호화하는 DNA 단편을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  9. 제6항에 있어서, λPG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35. -B36, -C1, -C16, -C20, -C37, -D8, -D11, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 및 -Y33, pGW1910, pGW1800, pGW1900 및 pGW1756으로 이루어진 벡터 그룹으로부터 선택된 벡터 삽입체로부터 유래된 시그날 펩타이드를 암호화하는 DNA 단편을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  10. 제6항에 있어서, λPG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35. -B36, -C1, -C16, -C20, -C37, -D8, -D11, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 및 -Y33, pGW1910, pGW1800, pGW1900 및 pGW1756으로 이루어진 벡터 그룹으로부터 선택된 벡터 삽입체로부터 유래된 전사 터미네이터 활성을 갖는 DNA 단편을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  11. 제6항에 있어서, λPG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35. -B36, -C1, -C16, -C20, -C37, -D8, -D11, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 및 -Y33, pGW1910, pGW1800, pGW1900 및 pGW1756으로 이루어진 벡터 그룹으로부터 선택된 벡터 삽입체로부터 유래된, 갈락투로나제 또는 폴리갈락투로나제에 대한 구조 유전자, 또는 갈락투로나제 또는 폴리갈락투로나제 활성을 갖는 이의 단편을 암호화하는 DNA 단편을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  12. 제1항에 있어서, 발현 카세트인 재조합 DNA 분자.
  13. 제1항에 있어서, 하이브리드 벡터인 재조합 DNA 분자.
  14. 제13항에 있어서, pGW1800, pGW1900, pGW1756, pGW1910, λPG-A9, λPG-A10, λPG-A43,λPG -B4, λPG-B35. λPG-B36, λPG-C1, λPG -C16, λPG-C20, λPG-C37, λPG-D8, λPG-D11, λPG-D12, λPG-E6, λPG-E38, λPG-F5, λPG-G17, λPG-G27, λPG-X31 및 λPG-Y33로 이루어진 벡터 그룹으로부터 선택된 재조합 DNA 분자.
  15. PG-생성 사상 진균 균주로 부터 분리된 PG에 대한 유전자 또는 이의 작용성 단편을 포함하는 DNA 분자
  16. 제15항에 있어서, 아스퍼질러스종으로부터 분리된 DNA 분자.
  17. 제15항에 있어서, PG 유전자의 프로모터 영역, 시그날 펩타이드, 리더 펩타이드, prepro-PG, PG 또는 갈락투로나제 또는 폴리갈락투로나제 활성을 갖는 PG 단편을 암호화하는 영역 또는 PG 유전자의 전사 터미네이터 영역을 포함하는, pGW1800, pGW1900, pGW1756, pGW1910, λPG-A9, λPG-A10, λPG-A43,λPG -B4, λPG-B35. λPG-B36, λPG-C1, λPG -C16, λPG-C20, λPG-C37, λPG-D8, λPG-D11, λPG-D12, λPG-E6, λPG-E38, λPG-F5, λPG-G17, λPG-G27, λPG-X31 및 λPG-Y33로 이루어진 하이브리드 벡터 그룹으로부터 선택된 하이브리드 벡터의 삽입체 또는 이의 단편인 DNA 분자.
  18. a) 적합한 진균 세포로 부터 게놈성 DNA를 분리하고, DNA 프로브 또는 적합한 발현 시스템을 사용하여 목적하는 DNA를 선별한 다음 목적하는 폴리펩타이드의 발현에 대해 스크리닝하거나, a) 적합한 진균 세포로부터 mRNA를 분리하고, 목적하는 mRNA를 DNA 프롭와 하이브리드화시키거나 적합한 발현 시스템에서 발현시킴으로써 선별하고, 목적하는 폴리펩타이드의 발현에 대해 스크리닝하여, 이 mRNA와 상보적인 일본쇄 cDNA를 제조한 다음 이로부터 이본쇄 cDNA를 제조하거나, c) cDNA 라이브러리로부터 cDNA를 분리하고, DNA 프로브 또는 적합한 발현 시스템을 사용하여 목적하는 cDNA를 선별한 다음 목적하는 폴리펩타이드의 발현에 대해 스크리닝하고/하거나, d) 단계 a), b) 또는 c)의 이본쇄 DNA를 적절한 벡터에 혼합시키고, e) 이로써 수득된 하이브리드 벡터로 적절한 숙주 세포를 형질전환시키며, f) 형질전환되지 않은 숙주 세포로부터 목적하는 DNA를 함유하는 형질전환된 숙주 세포를 선별하거나 형질전환된 숙주 세포를 증식시키고, 필요한 경우 g) 목적하는 DNA를 분리하고/하거나 이러한 DNA를 돌연변이체 또는 이의 단편으로 전환시킴을 포함하여, 제1항에 따른 재조합 DNA 분짜 또는 제15항에 따른 DNA 분자를 제조하는 방법.
  19. 제1항에 따른 재조합 DNA 분자로 형질전환시킨 숙주.
  20. 적합한 숙주 세포를 형질전환 조건하에서 선별 마커 유전자와 함께 제1항에 따른 재조합 DNA 분자로 처리하고, 임의로 형질전환체를 선별함을 포함하여, 제19항에 따른 형질전환시킨 숙주를 제조하는 방법.
  21. 제12항에 따른 발현 카세트에 삽입된 구조 유전자를 통상적인 방법에 따라 적합한 형질전환된 숙주에서 발현시키고, 임의로 폴리펩타이드를 통상적인 방법으로 분리시킴을 포함하는, 폴리펩타이드의 제조방법.
  22. 제21항에 있어서, 에이. 나이거 균주가 숙주로서 사용되는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 에이. 니둘란스(A. nidulans) 균주가 숙주로서 사용되는 방법.
  24. 제21항에 있어서, 구조 유전자가 하이브리드 인터페론 BDBB를 암호화하는 방법.
  25. 제21항에 있어서, 구조 유전자가 갈락투로나제 또는 폴리갈락투로나제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하며 제1항에 따른 DNA 서열로 부터 유래되는 방법.
  26. 제1항에 따른 DNA 서열에 의하여 암호화된 단일 갈락투로나제 또는 폴리갈락투로나제, 또는 갈락투로나제 또는 폴리갈락투로나제 활성을 갖는 이들의 유도체 및 생물학적으로 허용되는 이의 염.
  27. 제26항에 따른 단일 갈락투로나제 또는 폴리갈락투로나제, 또는 이의 혼합물을 임의로 PG 활성 이외의 활성을 갖는 하나 이상의 효소와의 예정된 배합물 형태로 포함하는 효소 조성물.
  28. 식물 재료 가공에 있어서 제26항에 따른 단일 갈락투로나제 또는 폴리갈락투로나제, 또는 제27항에 따른 효소 조성물의 용도.
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