DD297448A5 - Fungal expression system - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Molekuel mit der Codierung fuer eine Polygalacturonase-Expressionskassette (PG-Expressionskassette), die das Strukturgen einer PG und/oder entsprechende Regulationssequenzen umfaszt, oder Hybridvektoren, welche eine von einem PG-Gen abgeleitete DNA umfassen, auszerdem transformierte Wirte, vor allem Fadenpilze, Methoden zur Herstellung dieser rekombinanten DNA-Molekuele und transformierten Wirte und zur Herstellung von Polypeptiden mit Hilfe dieser DNA und dieser Wirte, gereinigten Einzel-PG von natuerlichen oder transformierten Wirten, die Herstellung von Gemischen von PG, wahlweise mit anderen Enzymen, und die Verwendung der PG oder deren Gemische in der Industrie.{rekombinantes DNA-Molekuel; Codierung fuer eine Polygalacturonase-Expressionskassette; Strukturgen einer Polygalacturonase; Hybridvektoren; transformierte Wirte; Fadenpilze; Polypeptide; Verfahren; Herstellung; Verwendung; Industrie}
Description
Hierzu 8 Seiten Zeichnungen
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik und schafft neuartige DNA-Moleküle, welche DNA-Folgen mit der Codierung für Proteine mit Polygalacturonase-Aktivität und/oder die Promotor-, Signal- und/oder Transkriptionsterminatorfolgen, welche natürlich an diese gekoppelt sind, umfaßt. Die neuartigen DNA-Moleküle sind bei der Schaffung von Expressionskassetten für die Produktion von Polygalacturonasen oder die Expression von Fremdgenen in Fadenpilzen von Nutzen.
-6- 297 448 Charakteristik des bekannten Standes der Technik
die eine große Zahl von unterschiedlichen Expressionshybridvektoren, meistens Plasmide, entwickelt wurde. Die Nachteile der
glycosylieren, aber ebenso wie E. coil sekretieren sie die Polypeptide, von kleinen abgesehen, nicht in das Nährmedium, sondernin den periplasmatischen Raum. Höhere eukaryotische Wirte, wie Krebszellen von Säugetieren, sind zum Glycosylieren und zur
zusammen mit dem gewünschten Peptid oncogene Nukleinsäuren isoliert werden.
untersucht. Ihre Anwendung in gentechnischen Verfahren war langsamer, vor allem auf Grund des Fehlens entsprechender
beschriebenen Vektoren replizieren nicht wie die Hefen autonom, sondern werden in das Pilzchromosom integriert. Dieses
als einhundert Kopien berichtet.
sowohl negative als auch positive Selektionssysteme beschrieben (Bailance u.a., BBRC112,284,1983; Tilburn u.a., Gene 26,205,1983; Yelton u.a., PNAS 81,1470,1984; Yelton und Timberlake, J. Cell. Biochem. Suppl. 9C, 173,1985; Johnstone u.a.,
wichtigsten sind.
hydrolytischen Enzymen erreicht.
(Buxton u.a., Gene 37,207,1985; EP 184438; WO 86/06097), die beide von A. nidulans gewonnen wurden, eingesetzt.
a-i/i-glycosidisch gebundenen D-Galacturonsäurepolymeren bestehen. Einige der Uronsäuregruppen sind mit Methanolverestert, die durch Pectinesterase abgespalten werden können. Pectine kommen in der Natur als Bestandteile höherer Pflanzenvor, wo sie an Cellulosemoleküle gebunden sind, die vor allem in der Primärzellwand und der mittleren Lamelle gefundenwerden. Zu den reichsten Quellen für Pectin gehören Zitronen- und Orangenschale, die etwa 30% dieses Polysaccharidsenthalten. Pectinenzyme bauen das Kohlenhydratpolymersubstrat entweder durch Hydrolyse der a-1,4-glycosidischen Bindung(Endo- und Exo-Polygalacturonasen) oder durch Transeleminierung (Pectinlyasen), die zu einem gesättigten und zu einema-4,5-ungesättigten Poly- oder Oligogalacturonid führt, ab. Der systematische Name von Endo-Polygalacturonase ist (Poly-(1,4-a-D-Ga!acturonid))Glycanhydrolase (EC 3.2.1.15) und von Exo-Polygalacturonase (Poly-(1,4-a-D-Ga!acturonid))-galacturononhydrolase (EC 3.2.1.67). Ein anderes relevantes, pectinabbauendes Galacturonase-Enzym ist
der ursprünglichen Verwendung von Pectinonzymen für die Behandlung von weichen Früchten zur Gewährleistung einer hohen
unteriichiedlichen Mengen, zusammen mit anderen Enzymen, wie Arabinanasen, Galactanasen, Xylanasen, ß-1,4-Glucanasen,
als mazerierende Enzyme für die Herstellung von fruchtigeren Nektaren eingesetzt, die eine glattere Konsistenz und einenhöheren Gehalt an löslichen Feststoffen, Pigmenten und Nährstoffen als Erzeugnisse haben, die nach einem mecnanischthermischen Verfahren hergestelt werden.
und/oder Pectinlyase Klären von Säften, Saft-/Ölextraktion, Zitronenschalenöl,
Waschung von Zitruspulpe Pectinesterase/Polygalacturonase/ Pectinl^ase + (Hemi-)Cellulasen Verflüssigung, klare/trübe Säfte
beispielsweise für die Produktion von termentierbaron Polysacchariden aus Pflanzenzellen (Ref. 33) oder für die Modifikation von
niger unter Verwendung von Pectin oder dessen Abbauprcdukten die oben genannten Enzyme aus, wenn andere
gereinigt beschrieben werden. Da jedoch keine strukturellen Daten gegeben werden, bleibt die Notwendigkeit von
ihrer Aminosäuresequenzen möglich ist.
insbesondere PGI oder PGII, was die Synthese von DNA-Sonden mit der Codierung für relevante Teile des Proteins ermöglicht.
(als pgal bezeichnet) mit einer Genbank von einem Pilzstamm, z. B. A. nlger, zu identifizieren.
vorliegenden rekombinanten PG-DNA ausgeprägt werden kann.
a) dem Aspergillus niger-DNA-Einschub von pGW1800 oder pGW1900,
b) einer DNA-Sequenz, welche auf den codierenden Bereich für die reife PGII oder PGI, der durch einen DNA-Einschub von a) umfaßt wird, hybridisiert und welche ein Strukturgen für ein Polypeptid mit Polygalacturonase-Aktivität und wahlweise einen Promotor, einen codierenden Bereich für ein Signal-oder Leader-Peptid und/oder einen Transkriptionsterminator davon umfaßt,
c) einem Derivat einer DNA-Sequenz, wie sie in a) oder b) definiert wurde, oder
d) einer DNA-Sequenz, die für eine reife PG oder deren Signalpeptid oder Leader-Peptid codiert und die in dem Sinne des genetischen Codes mit Bezug auf eine DNA-Sequenz von a), b) oder c) degeneriert ist.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, welches eine DNA-Sequenz umfaßt, die ausgewählt wird aus
a) dem AspergillusNlger-DNA-Einschub von pGW 1800,
b) einer DNA-Sequenz, welche auf den codierenden Bereich für die reife PGII, der durch den DNA-Einschub von a) umfaßt wird, hybridisiert und welche ein Strukturgen für ein Polypeptid mit Polygalacturonaseaktivität und wahlweise einen Promotor, einen codierenden Bereich für ein Signal- oder Leader-Peptid und/oder einen Transkriptionsterminator davon umfaßt,
c) einem Derivat einer in a) oder b) definierten DNA-Sequenz oder
d) einer DNA-Sequenz, die für eine reife PG oder deren Signalpeptid oder Leader-Peptid codiert und welche im Sinne des genetischen Codes mit Bezug auf eine DNA-Sequenz von a), b) oder c) dageneriert ist,oder ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die ausgewählt wird aus
a) dem Asperglllusniger-Einschub von pGW 1900,
b) einer DNA-Sequenz, die auf den codierenden Bereich für die reife PGI, die durch den DNA-Einschub von a) umfaßt wird, hybridisiert und welche ein Strukturgen für ein Polypeptid mit Polygalacturciase-Aktivität und wahlweise einen Promotor, einen codieronden Bereich für ein Signal- oder Leader-Peptid und/oder einen Transkriptionsterminator davon umfaßt,
c) einem Derivat einer in a) oder b) definierten DNA-Sequenz oder
d) einer DNA-Sequenz, die für eine reife PG oder deren Signalpeptid oder Leader-Peptid codiert und welche im Sinne des genetischen Codes mit Bezug auf eine DNA-Sequenz von a), b) oder c) degeneriert ist.
der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM) hinterlegt wurden.
auch Fragmente oder Mutanten der natürlichen vorkommenden Polygalacturonasen ein, die ihre enzymatische Aktivitätbeibehalten haben. Die Begriffe Polygalacturonase oder PG1 die hier verwendet werden, schließen auch andere Galacturonasenein, welche als Substrat ein Oligo- oder Polysaccharid haben, das Galacturonat aufweist, z. B. Oligogalacturonase, die ein
deren Fragmente oder Mutanten, die ihre enzymatische Aktivität beibehalten haben. Ein „Leader-Peptid" ist als eine Sequenzeiner Präpro-PG zu verstehen, die während der Bildung einer reifen PG abgeschnitten wird. Ein „Signalpeptid" wird durch die„Signalpeptidase" im endoplasmatischen Retikulum in einem ersten Schritt abgeschnitten.
pG W1800 oder pG W1900.
bis zum EcoRI-Restriktionsort (Kartenposition 4100). Dieser Einschub umfaßt den Promotor und den
bestimmt und wird in der Sequenzaufstellung unter der Sequenzidentifizierungszahl (SEQ ID NO) 2 dargestellt.
(SEQ ID NO) 2. Der codierende Bereich für das Leader-Peptid der Präpro-PGII erstreckt sich von der Position 1357 bis zur Position
1437. Das Signalpeptid wird durch die Nukleotide 1357 bis 1419 codiert. Der codierende Bereich für die reife PGII erstreckt sichvon der Position 1438 bis zur Position 2494. Daran schließt sich de' Transkriptionsterminatorbereich an, der bei Position 2499beginnt.
zum BamHI-Ort in der angenäherten Kartenposition 8600, der in der Abb. 3 angegeben wird. Die DNA-Sequenz, die sich von etwader Kartenposition 6280 bis zu etwa 3880 erstreckt, wird in der Sequenzaufstellung unter SEQ ID NO. 1 gegeben.
codierende Bereich für das 31 Aminosäuren lange Leader-Peptid der Präpro-PGI erstreckt sich von der Position 910 bis zur
an der Position 1003 und erstreckt sich bis zu 2127. Der Transkriptionsterminatorbereich beginnt in der Position 2131.
abgeleitet wurden, hybridisieren unter „homologen Bedingungen" mit dem codierenden Bereich des PGI- bzw. PGII-Gens odereinem Fragment von diesen, das von A. nlger N 400 abgeleitet wurde. DNA-Sequenzen, die wenigstens teilweise homolog zum
unter sogenannten „heterologen Bedingungen", die weniger streng als die „homologen Bedingungen" sind. Ein Glied der
oder PGII-Gen oder ein PGI-, PGII- oder unterschiedliches PG-Gen eines anderen PG-produzierenden Pilzstammes als A.nlger
oder anderen phytopathogenen Pilzen sowie von Hefe, beispielsweise von PG-produzierenden Kluyveromyces spec, wie
sind. Glieder der PG-Genfamilie werden als „PG-Gene" bezeichnet.
welche Galacturonat aufweisen, spalten können, z. B. Oligogalacturonase, Rhamnogalacturonase oder insbesondere
heterologe Hybridisierungsbedingungen genauer definiert.
größere Derivate einschließen, welche flankierende Sequenzen enthalten, Fragmente dieser DNA-Sequenzen und Mutanten, vorallem künstliche Mutanten.
und sie umfassen DNA-Sequenzen, welche an den codierenden Bereich für reife PGII oder PGI hybridisieren, die durch den
der Nucleinsäuren, Behandlung der Fragmente mit einem geeigneten Restriktionsenzym, z. B. EcoRI, BamHI oder Hindill,
-PGII-Gen unter „heterologen" Bedingungen hybridisiert, ist ein Einschub eines Vektors oder dessen Fragment, welcher aus der
-E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 und -Y33, pGW1756 und pGW1910. Der Letztgenannte umfaßt das Strukturgen pgaC, welches
unterscheiden. Die Stämme NW756 und NW400 sind also nicht eng miteinander verwandt und könnten zu unterschiedlichen
der Sequenzaufstellung gegeben wird. Der codierende Bereich für das Leader-Peptid das Präpro-PGII erstreckt sich vermutlichvon Position 890 bis zu Position 970, während das Signalpeptid durch die Nucleotide 890 bis 952 codier· wird. Der codierende
ein Intron. An den codierenden Bereich schließt sich der Transkriptionsterminatorbereich an, der mit der Position 2031 beginnt.
ganzen pgaC-Gen wird in der Sequenzaufstellung unter SEQ ID NO. 4 gegeben.
wird, erstreckt sich vermutlich von Nucleotid 663 bis zu 782 und schließt die DNA-Sequenz von 663 bis 710 ein, welche das
gleiche Promotor-, Signal- und/oder Transkriptionsterminatorsequenz wie in pGW1800 oder wie in pGW 1900 oder eine andere
abgeleitet werden kann. Außerdem kann den hybridisierenden DNA-Sequenzen in Abhängigkeit vom Wirt, in welchem diegewünschte PG ausgeprägt werden soll, jede andere Promotor-, Signal- und/oder Transkriptionsterminatorsequenz hinzugefügtwerden.
stehen in der Regel von ö'-nichtcodierenden Bereichen von prokaryotischen, eukaryotischen oder Viralgenen zur Verfügung,während Transkriptionsterminatoren von 3'-nichtcodierenden Bereichen zur Verfügung stehen. Signalsequenzen können vonden 5'-codierenden Bereichen von Präproteinen gewonnen werden, die in die sekretorische Bahn der Zelle eingebracht werden.
ein PG-Gen im Genom flankieren. Diese flankierenden Sequenzen haben beispielsweise Regulationsfunktionen, z.B. eine
größeren Derivaten eingeschlossen sind, besonders solchen, die Promotor-, Signal-, Struktur- oder
codieren oder ein Polypeptid mit Polygalacturonase-Aktivität codieren oder einen Transkriptionsterminatorbereich enthalten.
welche einen Promotor- und/oder einen codierenden Bereich für ein Leader- oder Signalpeptid und/oder für eine PG und/odereinen Transkriptionsterminator und ähnliches enthalten.
zu etwa 2000, vorzugsweise bis zu etwa 500 bis 1400 Nucleotide stromaufwärts. Ein Promotorbereich bindet RNA-Polymerasewie auch Regulationsproteine.
umfaßt, erstreckt sich beispielsweise von Position 1 bis zu Position 1356 der Sequenz mit der SEQ ID NO. 2. Bei einem A. nlger-NW756-Einschub von pGW1756 erstreckt sich ein Fragment, das den Promotorbereich von pgall umfaßt, beispielsweise von Position 1 bis zu Position 889 der Sequenz mit der SEQ ID NO. 3. Im A. niger-Einschub von pGW 1910 erstreckt sich ein Fragment, das den Promotorbereich von pgaC umfaßt, von der Position 1 bis zur Position 662 der Sequenz mit der SEQ ID NO. 4. Ein Fragment, welches die DNA-Sequenzcodierung für ein Leader-Peptid einer Präpro-PG enthält, erstreckt sich beispielsweise zwischen dem Ende des Promotors und dem Beginn der Sequenz, welche reifes Protein codiert. Ein codierender Bereich für ein Signalpeptid ist kürzer als der für das entsprechende Leader-Peptid. Er beginnt ebenfalls am Ende des Promotors und erstreckt sich bis zu einem codierenden Bereich für eine Signalpeptidasespaltstelle. Bei einer A. nlger N 400-Präpro-PGII umfaßt das Leader-Peptid 27 Aminosäuren. Ein DNA-Fragment, welches das Leader-Peptid codiert, erstreckt sich beispielsweise vom ATG-Couon in der Position 1357 bis zur Xhol-Spaltstelle in der Position 1429 der DNA-Sequenz mit der SEQ ID NO. 2. Bei der Präpro-PGI hat das Leader-Peptid 31 Aminosäuren. Ein DNA-Fragment mit der Codierung für dieses Leader-Peptid erstreckt sich beispielsweise zwischen den Positionen 910 und 1002 der DNA-Sequenz mit der SEQ ID NO. 1. Das Leader-Peptid der A.nlger-NW756-Präpro-PGII hat vermutlich 27 Aminosäuren, und folglich ist das DNA-Fragment, welches das Leader-Peptid codiert, das 81 bp lange DNA-Fragment, das sich zwischen den Positionen 889 und 971 in der DNA-Sequenz mit der SEQ ID NO. 3 erstreckt. Das DNA-Fragment, welches das vermutlich 40 Aminosäuren große Leader-Peptid des pgaC-Genproduktes von A. niger-N400 codiert, erstreckt sich von der Basenposition 663 bis zu 782 der Sequenz mit der SEQ ID NO. 4. Die codierenden Bereiche für die entsprechenden Signalpeptide befinden sich beispielsweise auf den folgenden DNA-Fragmenten: Basenpositionen 911 bis 963 bei SEQ ID NO. 1,1358 bis 1419 bei SEQ ID NO. 2,890 bis 962 bei SEQ ID NO. 3 und 663 bis 710 bei SEQ ID NO. 4.
Ein Fragment, welches den gesamten codierenden Bereich für die reife PGI umfaßt, erstreckt sich beispielsweise von Position 1003 bis zu Position 2127 der Sequenz mit der SEQ ID NO. 1. Ein Fragment, welches den gesamten codierenden Bereich für die reife A. nlger-N 400-PGII umfaßt, eratreckt sich beispielsweise von Position 1430 bis zu 2497 der Sequenz mit der SEQID NO. 2. Reife A.nlgar-NW756-PGII wird beispielsweise durch das DNA-Fragment codiert, welches sich von Position 953 bis 2027 der Sequenz mit der SEQ ID NO. 3 erstreckt, und das reife pgaC-Genprodukt wird beispielsweise durch das DNA-Fragment codiert, das sich zwischen den Basen No. 782 und 1996 der Sequenz mit der SEQ ID NO. 4 erstreckt. Aber auch kürzere Fragmente können Polypeptide, welche PG-Aktivität beibehalten, codieren.
Die Strukturgene von PGII oder PGI sowie von anderen PG können, wie viele Pilzgene, Introns enthalten. In den Rahmen der vorliegenden Erfindung sind jedoch auch intronfreie Strukturgene von PG einbezogen, z.B. solche, dia Introns nicht als genomische DNA-Sequenz enthalten oder auch solche, die von cDNA gewonnen werden können.
Ein Fragment, das einen Transkriptionsterminatorbereich umfaßt, erstreckt sich beispielsweise von einem Stoppcodon, z. B. TAA, TAG oder TGA, am Ende des codierenden Bereichs für eine PG, bis zu etwa 300 bis 2000, vorzugsweise bis zu etwa 500 bis 1000 Basenpaaren stromabwärts.
Ein solches Fragment erstreckt sich beispielsweise von Basenposition 2131 bis zu 2495 der Sequenz mit der SEQ ID NO. 1, von 2498 bis 3031 in der Sequenz mit der SEQ ID NO. 2, von 2031 bis 3047 in der Sequenz mit der SEQ ID NO. 3 und von 1999 bis 2304 in der Sequenz mit der SEQ ID NO. 4.
Die vorstehend genannten Fragmente können jedoch durch die natürlich 5'-flankierenden Sequenzen erweitert werden, oder sie können am 5'- oder 3'-Ende verkürzt werden und können trotzdem ihre Promotor- oder Transkriptionsterminatoraktivität beibehalten, oder die codierten Polypeptide können Signalpeptid- oder Galacturonase-Aktivität beibehalten. Auch diese Fragmente sind in den Rahmen der Erfindung einbezogen.
Die vorstehend genannten Fragmente können Linker enthalten oder durch Linker flankiert werden, welche für eine erfolgreiche Kopplung an andere DNA-Moleküle sorgen und/oder DNA-Fragmente mit Regulationsfunktionen oder der Codierung für ein Polypeptid, z. B. Promotor- und Strukturgen, in das korrekte Leseraster oder Abstand bringen können.
Geeignete Linker für die oben genannten Fragmente haben eine DNA-Sequenz, welche in den Restriktionsort der DNA paßt, mit welcher das Fragment gekoppelt werden soll. Sie können einen im voraus bestimmten Rostriktionsort enthalten. Mutanten einer DNA-Sequenz der Erfindung sind z. B. natürlich vorkommende Mutanten. Die Erfindung umfaßt auch natürliche oder synthetische Mutanten des coierenden Bereichs für die Signal- oderteader-Peptide mit einem ähnlichen oder identischen Hydrophobizitätsprofil, z. B. solche, bei denen die Codone für die polaren Aminosäuren Histidin (H6+), Tyrosin (Y9') und Arginin (R5+) durch Codone für andere Aminosäuren mit ähnlichen Ladungen ausgetauscht sind, und die hydrophoben Aminosäuren Alanin (A), Leucin (L) und (T) Threonin durch Codone für andere hydrophobe Aminosäuren ersetzt sind. Beispielsweise kann der Codon für das positiv geladene Lysin durch einen Codon für Arginin ersetzt werden und umgekehrt, der Codon für das negativ geladene Tyrosin durch einen Codon für Glutamat oder Aspartat und/oder der Codon für das nichtpolare, hydrophob» Alanin durch einen der Codone für Threonin, Prolin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin und ähnliches. Ein rekombinantes DNA-Molekül der Erfindung umfaßt tuch DNA-Sequenzen, die im Sinne des genetischen Codes dahingehend degeneriert sind, daß eine unbegrenzte Zahl von Nucleotiden durch andere Nucleotide ersetzt wird, ohne die Aminosäurefolge zu ändern, welche sie codieren. Derartige degenerierte DNA-Folgen können auf Grund ihrer unterschiedlichen Restriktionsorte oder auf Grund einer bevorzugten Codonnutzung bei einem bestimmten Wirt von Nutzen sein.
Ein recombinantes DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung umfaßt vorzugsweise den Aspergillus nlger-DNA-Einschub eines Hybridvektors, der aus der Gruppe von Hybridvektoren ausgewählt wird, die besteht aus pGW1800, pGW1900, pGW1756, pGW1910, XPG-A9, XPG-A10, XPG-A43, XPH-B4, XPG-B35, APG-B36, XPG-C1, XPG-C16, XPG-C20, XPG-C37, XPG-D8, XPG-D11, XPG-D12, XPG-E6, XPG-E38, XPG-F5, XPG-G17, XPG- G27, XPG-X31 und XPG-Y33 oder einem Fragment davon, das einen Promotorbereich von einem PG-Gen umfaßt, oder einen codierenden Bereich für ein Signalpeptid, Leader-Peptid, Präpro-PG, PG oder ein Fragment einer PG mit Polygalacturonase-Aktivität oder einen Transkriptionsterminatorbereich sinos PG-Gens. Die Einschübe selbst werden auch durch die vorliegende Erfindung erfaßt.
Die Erfindung betrifft auch rekombinante DNA-Moleküle, welche Expressionskassetten sind, die einen Promotorbereich umfassen, ein DNA-Fragment, welches ein Leader- oder Signalpeptid codiert, ein Strukturgen und/oder einen Transkriptionsterminatorbereich der Erfindung, vorzugsweise solche, die von einem Vektor abgeleitet wurden, der aus der oben genannten Gruppe von Vektoren ausgewählt wurde
Unter dem Begriff „Expressionskassette" versteht man eine DNA-Sequenz, die zum Ausprägen eines Polypeptids in der Lage ist
und einen Promotor, auf Wunsch eine Signalsequenz, außerdem ein Strukturgen, auf Wunsch einen Transkriptionsterminator und wahlweise einen Transkriptionsverstärker, ribosomale Bindungsstelle und/oder weitere Regulationssequenzen umfaßt. In einer Expressionskassette der Erfindung können die PG-genabgeleiteten funktioneilen Fragmente mit funktioneilen Fragmenten, die von anderen Genen abgeleitet wurden, kombiniert werden.
Es kann eine breite Vielfalt von Promotorsequenzen in Abhängigkeit von der Natur der Wirtszelle eingesetzt werden. Am nützlichsten sind Promotoren, die stark und gleichzeitig gut reguliert sind. Sequenzen für die Initiierung der Translation sind beispielsweise Shine-Dalgarno-Sequenzen. Sequenzen» die für die Initiierung und Termination der Transkription und für die Stabilisierung der mRNA notwendig sind, stehen im allgemeinen aus den nichtcodierenden 5'-Bereichen bzw. 3'-Bereichen von Viren- oder eukaryotischen cDNA, z. B. vom Expressionswirt, zur Verfügung.
Beispiele für Promotoren sind APL, XPr, E. coil Iac, trp, tac, Hefe-TRP 1 -, ADHI-, ADHII-, PHO 3-, PHO 5- oder glycolytische Promotoren, wie der Promotor von Enolase-, GlyceraldehydO-phosphatdehydrogenase-, 3-Phosphogryceratkinase- (PGK-), Hexokinase-, Pyruvatdecarboxylase-, Phosphofructokinase-, Glucose-e-phosphatisomerase-, S-Phosphoglyceratmutase-, Pyruvatkinase-, Triosephosphatisomerase-, Phosphoglucoseisomerase- und Glucokinase-Genen, oder Promotoren, die von eukaryotischen Viren abgeleitet wurden, z. B. vom SV40, Rous-Sarcomvirus, Adenovirus 2, Rinderpapillomvirus, Papovavirus, Cytomgalovirus abgeleitete Promotoren oder von Säugetierzellen abgeleitete Promotoren, z. B. das Actin-, Collagen-, Myosin oder ß-Globin-Gen. Die eukaryotischen Promotoren können mit verstärkenden Sequenzen kombiniert werden, wie den stromaufwärts aktivierenden Sequenzen (UAS) von Hefe, oder Viren- oder Zellenverstärkungselementen, wie den Cytomgalovirus-IE-Verstärkungselementeri, SV40-Verstärkern-, Immunoglobulingenverstärkungselementen oder anderen. Verstärker sind transkriptionsstimulierende DNA-Sequenzen, die z. B. von Viren wie dem Simian-Virus, dem Polyom-Virus, dem Rinder-Papillom-Virus oder dem Moloney-Sarcom-Virus abgeleitet wurden oder genomischen Ursprungs sind. Eine Verstärkersequenz kann auch von der extrachromosomalen Ribosomal-DNA von Physarum polycephalum (PCT/EP 8500278) abgeleitet werden, oder sie kann die Stromaufwärtsaktivierungsstelle des Säurephosphatase-PHO 5-Gens (EP ApI. No.86111820.6) oder der PHO 5-, trp-, PHO5-GAPDH-Hybrid (EP Appl. No.86111820.6) oder ein ähnlicher Promotor sein. Signalsequenzen können beispielsweise eine Vorsequenz oder ein sekretorisches Leader-Element sein, welche die Sekretion des Polypeptid steuern, oder ähnliches. Eine Signalsequenz ist beispielsweise ein Signal oder ein Leader-Peptid der Präpro-PGI, Propro-PGII oder Präpro-PGC. Weitere Signalsoquenzen sind aus der Literatur bekannt, z. B. der von Heijne, G., Nucleic Acids Res. 14,4683 (1986), zusammengestellten.
Strukturgene sind in diesem Zusammenhang neben denen mit der Codierung für PGI oder PGII auch die mit der Codierung für andere PG oder Derivate, insbesondere Fragmente, mit PG-Äktivität oder andere Aspergillus-Gene und Strukturgene, die ihren Ursprung in Viren, prokaryotischen Zellen oder eukaryotischen Zellen haben und die von genomischer DNA oder von cDNA abgeleitet werden können, welche über die mRNA-Route hergestellt wurden oder chemisch synthetisiert werden können, mit der Codierung für eine breite Vielfalt von brauchbaren Polypeptiden, einschließlich glycosylierter Polypeptide, insbesondere von höherem eukaryotischem, vor allem Säugetier-, wie tierischem oder vor allem menschlichem Ursprung, wie Enzymen, die beispielsweise für die Herstellung von Lebensmitteln und für die Ausführung von enzymatischen Reaktionen in der Chemie eingesetzt werden können, oder Polypeptide, die nützlich und wertvoll für die Behandlung von menschlichen und tierischen Krankheiten oder für deren Verhinderung sind, beispielsweise Hormone, Polypeptide mit immunmodulatorischen, Antiviren- und Antitumoreigenschafton, Antikörper, Virenantigene, Vakzine, Gerinnungsfaktoren, Lebensmittel und ähnliches. Beispiele für solche Strukturgene sind z. B. die mit der Codierung für Hormone, wie Secretin, Thymosin, Relaxin, Calcitonin, luteinisierendes Hormon, Parathyroidhormon, Adrenocorticotropin, melanocytstimulierendes Hormon, ß-Lipotropin, Urogastron oder Insulin, Wachstumsfaktoren, wie epidermischer Wachstumsfaktor, insulinartiger Wachstunisfaktor (IGF), z. B. IGF-I und IGF-I), Mastzellenwachstumsfaktor, Nervenzellenwachstumsfaktor, gliaabgeleiteter Nervenzellenwachstumsfaktor, oder transformierender Wachstumsfaktor (TGF), wie TGFß, Wachstumshormone, wie menschliche oder Rinderwachstumshormone, Interleukin, wie lnterleukin-1 oder -2, menschlicher Makrophagemigrationsur.terbindungsfaktor (MIF), Interferone, wie das menschliche α-Interferon, beispielsweise Interferon-aA, -aB, -aD oder aF, ß-lnterferon, y-lnterferon oder ein Hybridinterferon, beispielsweise ein ciA-aD- oder ein aB-aD-Hybridinterferon, vor allem das Hybridinterferon BDBB, Proteinaseinhibitoren, wie a,-Antitrypsin, SLOI und ähnliche, Heptatitisvirusantigene, wie das Oberflächen- oder Kernantigen von Hepatitis-B-Virus oder das Hepatitis-A-Virusantigen oder das Hepatitis-Nicht-A-Nicht-B-Antigen, Plasminogenaktivatoren, wie der Gewebeplasminogenaktivator oder Urokinase, Tumornekrosefaktor, Somatostatin, Renin, ß-Endophin, Immunoglobuline, wie die leichte und/oder schwere Kette von Immunglobulin D, E oder G, oder Mensch-Maus-Hybrid-Immunglobuline, Immunglobulinbindungsfaktoren, wie der Immunglobulin-E-Bindungsfaktor, Calcitonin, dem menschlichen Calcitonin verwandtes Peptid, Blutgerinnungsfaktoren, wie Faktor IX oder VIIIc, Erythropoietin, Eglin, wie Eglin C, Hirudin, Desulfathirudin, wie Desulfathirudinvariante HV1, HV2 oder PA, menschliche Superoxiddismutase, Virenthymidinkinase, ß-Lactamase, Glucoseisomerase. Bevorzugte Gene sind die mit der Codierung für ein menschliches α-Interferon oder Hybridinterferon, besonders Hybridinterferon BDBB, den menschlichen Gewebeplasminogenaktivator (t-PA), das Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen (HBVsAg), die insulinartigen Wachstumsfaktoren I und II, Eglin C und Desulfathirudin, z. B. Variante HV1. Bei den Hybridvektoren der vorliegenden Erfindung ist die vorliegende Promotor- und/oder Signalsequenz operabel an den polypeptidcodierenden Bereich gekoppelt, um so die effektive Expression des Polypeptids zu gewährleisten. Die Erfindung betrifft auch rekombinante DNA-Moleküle, welche rekombinante Vektoren, auch als Hybridvektoren bezeichnet sind, die eine DNA-Sequenz umfassen, die ausgewählt wird aus t
a) dem Aspergillus nlger-DNA-Einschub von pGW 1800 oder pGW 1900,
b) einer DNA-Sequenz, welche an den codierenden Bereich für die reife PGII oder PGI hybridisiert, die durch einen DNA-Einschub von a) umfaßt wird,
c) einem Derivat einer in a) oder b) definierten DNA-Sequenz oder
d) einer DNA-Sequenz von a), b) oder c), weiche für eine reife PG oder deren Signalpeptid oder Leader-Peptid codiert und welche innerhalb der Bedeutung des genetischen Codes degeneriert ist.
Baculovirus, Phage λ, z.B. NM 939 oder EMBLM, oder Phage M13, z.B. M13mp8-Phage-DNA (Ref. 15), linearisiart durch BamHI-Digerieren, bakterielle Plasmide, ζ. B. pBR322, pUC 18, oder Hefe-Plasmide, z. B. Hefe-2 μ-Plasmid, oder auch chromosomaler DNA, die z.B. von Fadenpilzen, wie Asperglllus spec, abgeleitet wurde, z.B. A.niger, beispielsweise die durch EP 184438 beschriebenen, oder von einem defekten Virus, Phagen oder fiasmid bei Anwesenheit eines Helfervirus, -phagen oder -plasmids, was die Replikation dos defekten Virus, Phagen oder Plasmids ermöglicht, z. B. M13(+)KS-Vektor bei Anwesenheit von z.B. einem M14KO7-Helferphage·»
Die Hybridvektoren der Erfindung ermöglichen die Replikation und wahlweise die Expression einer gewünschten DNA in einem geeigneten Wirt, entweder als einem extrachromosomalon Element oder durch Integration in das Wirtschromosom. Verschiedene mögliche Vektorsysteme stehen für die Integration und Expression der klonierten DNA der Erfindung zur Verfugung. Im Prinzip sind alle Vektoren, welche ein gewünschtes Polypeptidgen, das in einer Expressionskassette der Erfindung in dem gewählten Wirt enthalten ist, replizieren und/oder ausprägen, geeignet. Der Vektor wird in Abhängigkeit von den für die Transformation vorgesehenen Wirtszellen ausgewählt. Im allgemeinen können diese Wirtszellen prokarvotische oder eukaryotische Mikroorganismen, wie Bakterien, Piize, Hefen oder Fadenpilze, oder Zellen von höherem eukaryotischem Ursprung, wie Wirbeltierzellen, ζ. B. Säugetierzellen, sein. Geeignete Wirtszellen werden unten detailliert behandelt. Im Prinzip umfassen die Hybridvektoren der Erfindung die DNA, wie sie vorstehend definiert wurde, einen Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz, dominante Marker-Sequenzen, wahlweise Expressionskontrollsequenzen, die wesentlich für die Transkription und Translation der gewünschten DNA und wahlweise für die Sekretion des gewünschten Produktes sind, und wahlweise zusätzliche Restriktionsorte.
Ein Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz (ein DNA-Element, das Fähigkeit der autonomen Replikation auf extrachromosomale Elemente überträgt) werden entweder durch eine solche Konstruktion des Vektors, daß dieser einen exogenen Ursprung, wie er beispielsweise vom Simian-Virus (SV40) oder einer anderen Virenquelle abgeleitet wird, enthält oder durch Chromosomenmechanismen der Wirtszelle geschaffen.
Ein Hybridvektor der erfindungsgemäßen Molekülo der vorliegenden Erfindung kann selektive Marker in Abhängigkeit von dem Wirt enthalten, der zu transformieren ist, ausgewählt und Moniert wird. Es kann jedes Marker-Gen verwendet werden, welches die Auswahl von Transformanten auf Grund der phänüiypischen Expression des Markers erleichtert. Geeignete Marker sind vor allem die, welche antibiotische Resistors: ausprägen, z. B. gegen Tetracyclin oder Ampicillin, oder bei auxotrophen Pilzmutanten Gene, welche Wirtsschäden komplementieren. Entsprechende Gene übertragen beispielsweise Resistenz gegenüber dem antibiotischen Cycloheximid oder sorgen für Prototrophie in einem auxotrophen Hefemutanten, beispielsweise das ure 3-, leu 2-, hls3- oder trp 1-Gen. Man kann als Marker auch Strukturgene einsetzen, die einem autonom replizierenden Segment zugeordnet sind, vorausgesetzt, daß der zu transformierende Wirt auxotroph für das Produkt ist, das durch den Marker ausgeprägt wird. Von besonderem Interesse sind Marker-Gene, die A. nlger-Wirtsschäden komplementieren, wie das argB-Gen mit der Codierung für Ornithincarbamoyitransferase, das z. B. von A. nlger oder A. nidulans (EP 184438) oder A.nidulans-DNA-Fragmenten abgeleitet wird, die homolog zum N.crassa pyr4-Gen sind (Ref.27).
Bevorzugte Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung sind Hybridvektoren, die eine Expressionskassette der Erfindung umfassen, z. B. die, welche das Strukturgen und/oder den Promotor und/oder die DNA-Sequenzcodierung für ein Leader- oder Signalpeptid und/oder den Transkriptionsterminator umfassen, abgeleitet von einem PG-Gen der Erfindung. Beispiele von Hybridvektoren, welche eine Expressionskassette der Erfindung umfassen, sind pGW 1800, pGW1900, pGW1910, pGII-lFNAMmpGllss-IFNAmiig.pGWiyee, XPG-AIO, XPG-A43,XPG-D8 und XPG-D11.
Gegenstand der Erfindung ist nicht nur ein rekombinantes DAN-Molekül, das einen von einem PG-Gen abgeleiteten Einschub umfaßt, wie das vorstehend definiert wurde, sondern auch ein DNA-Molekül,, das ein PG-Gen oder ein funktionelles Fragment von diesem umfaßt, z.B. die, welche einen Promotor, den codierenden Bereich für ein Signalpeptid, Leader-Peptid oder ein Protein mit PG-Aktivität oder den Transkriptionsterminatorbereich selbst umfassen, welches aus einem PG-produzierenden Pilzstamm isoliert werden kann, z. B. aus AsperglUus »{wc, beispielsweise A. japonlcus, A. oryzae, A. nidulans, A. nlger, Trlchoderma spec, Botrytls spec, Sclerotinla spec, Fusarlum Spec oder anderen phytopathogenen Pilzen sowie von Hefe, beispielsweise von PG-produzierenden Kluyveromyces spec, wie K.fragills. Bevorzugt werden DNA-Moleküle, die aus A. nlgor isoliert wurden.
Die DNA-Moleküle der Erfindung und deren Derivate, einschließlich der Fragmente, können zum Auslesen von DNA-Genbänken oder mRNA für weitere ähnliche DNA oder mRNA verwendet werden.
definiert wurde, welches die Züchtung eines Wirts umfaßt, der mit einem solchen rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist,oder dessen Herstellung durch eine In-vitro-Synthese.
chemische Verbindungen entzogen sein können, welche die negative oder positive Selektion der Transformanten ermöglichen,
d. h., der Wirte, welche das gewünschte DNA-Molekül zusammen mit einem Selektionsmarker enthalten, aus den
ein Mutant, dem das pyrA-Gen fehlt, wie unten beschrieben wird, oder A. nlgar N 593. Die Transformation der Wirte erfolgt nachherkömmlichen Methoden.
pilzausprägenden Polygalacturonase gewonnen werden oder kann beispielsweise durch Züchtung eines Wirts hergestelltwerden, der mit einem rekombinanten DNA-Molekül der Erfindung transformiert und, wenn erforderlich, aus diesem diegewünschte DNA-Sequenz isoliert werden kenn, oder durch chemische Synthese durch Nucleotidkondensation.
Im einzelnen können diese DNA hergestellt werden durch
a) Isolierung von genomischer DNA aus geeigneten Pilzzellen und Auswahl der gewünschten DNA, z. B. unter Verwendung einer DNA-Sonde oder unter Verwendung eines geeigneten Expressionssystems und Auslesen auf Expression des gewünschten Polypeptide, oder
b) Isolierung von mRNA aus geeigneten Pilzzellen, Auswahl der gewünschten mRNA, z.B. durch Hybridisieren mit einer DNA-Sonde oder durch Expression in einem geeigneten Expressionssystem und Auslesen nach Expression des gewünschten Polypeptids, Herstellung von einzelsträngiger cDNA, die komplementär zu dieser mRNA ist, dann daraus doppelstrangiger cDNA, oder
c) Isolieren von cDNA aus einer cDNA-Bank und Auswahl der gewünschten cDNA, z. B. unter Verwendung einer DNA-Sondo oder unter Verwendung eines geeigneten Expressionssystems und Auslesen nach der Expression des gewünschten Polypeptids, und/oder
d) Einbezieheh der c'oppelsträ ngigen DNA aus Schritt a), b) oder c) in einen angemessenen Vektor,
e) Transformation geeigneter Wirtszellen mit dem gewonnenen Hybridvektor,
f) Selektion von transformierten Wirtszellen, welche die gewünschte DNA enthalten, von untransformierten Wirtszellen und Vervielfältigung der transformierten Wirtszellan und, wenn erforderlich,
g) Isolieren der gewünschten DNA und/oder Umwandlung der DNA in einen. Mutanten oder dessen Fragment.
Genomische DNA kann isoliert und auf die gewünschte DNA geprüft werden (Schritt a). Genomische DNA wird aus geeigneten Pilzstammexpressionsproteinen mit PG-Aktivität isoliert. Daraus wird durch Digerieren mit geeigneten Restriktionsendonucleasen und Einbeziehung in geeignete Vektoren nach bekannten Verfahren eine genomische DNA-Bank hergestellt. Die genomische DNA-Bank wird mit einer DNA-Sonde geprüft, wie das spä.er beschrieben wird, oder in einem geeigneten Expressionssystem ausgeprägt und die g owonnenen Polypeptide auf herkömmliche Weise geprüft. Eine detaillierte Beschreibung der Isolierung eines DNA-Moleküls der Erfindung aus einer genomischen Bank wird unten gegeben. Polyadenylierte Messenger-RNA (Schritt b) wird aus den geeigneten Zellen nach bekannten Methoden isoliert. Die Isolierungsmethoden schließen beispielsweise die Homogenisierung bei Anwesenheit eines Detergenten und eines Ribonucleaseinhibitors, z.B. Heparin, Guanidiniumisothiocyanat oder Mercaptoethanol, die Extraktion der mRNA mit geeigneten Chloroform-Phenol-Gemischen, wahlweise bei Anwesenheit von Salz- und Pufferlösungen, Detergenten und/oder Kationchelatbildnern, und das Ausfällen der mRNA aus der restlichen wäßrigen, salzhaltigen Phase mit Ethanol, Isopropanol oder ähnlichen ein. Die isolierte mRNA kann weiter gereinigt werden durch Zentrifugieren in einem Cesiumchloridgradienten, gefolgt von der Ethanolausfällung, und/oder durch chromatographische Methoden, z. B. Affinitätschromatographie, beispielsweise Chromatographie auf OligofdT j-Cellulose oder auf Oligo(U)-Sepharose. Vorzugsweise wird diese gereinigte Gesamt-mRNA nach der Größe durch Gradientenzentrifugieren, z.B. in einem linearen Sucrosegradienten, oder durch Chromatographie auf geeigneten Größenfraktionierungssäulen, z. B. auf Agarosegelen, fraktioniert.
Die gewünschte mRNA wird durch direktes Prüfen der mRNA mit einer DNA-Sonde oder durch Translation in geeignete Zellen oder zellfreie Systeme und Prüfen der gewonnenen Polypeptide selektiert.
Die Selektion der gewünschten mRNA wird vorzugsweise unter Anwendung einer DNA-Hybridisierungssondeerreicht, wodurch der zusätzliche Schritt der Translation vermieden wird. Geeignete DNA-Sonden sind DNA von bekannter Nucleotidsequenz, die aus wenigstens 17 Nucleotiden bestehen, beispielsweise synthetische DNA, cDNA, die von mRNA mit Codierung für die gewünschten Polypeptide abgeleitet wurden, oder genomische DNA-Fragmente, die z. B. angrenzende DNA-Sequenzen umfassen, die aus jiner natürlichen Quelle oder von einem gentechnisch manipulierten Mikroorganismus isoliert wurden. Synthetische DNA-Sonden werden nach bekannten Methoden symbolisiert, wie sie nachstehend ausführlicher dargestellt werden, vorzugsweise durch schrittweise Kondensation unter Anwendung der Festphasenphosphotriester-, -phosphittriester- oder Phosphoramiditmethode, z. B. die Kondensation von Dinucleotidkopplungseinheiten nach der Phosphotriestermethode. Diese Methoden sind der Synthese von Gemischen der gewünschten Oligonuclaotide durch Verwendung von Gemischen aus zwei, drei oder vier Nucleotiden dA, dC, dG und/oder dT in geschützter Form oder der entsprechenden Dinucleotidkopplungseinheiten in dem angemessenen Kondensationsschritt angepaßt, wie das von Y. Ike u.a. (Nucleic Acids Research 11,477,1983) beschrieben wird.
Zur Hybridisierung werden die DNA-Sonden markiert, z. B. durch die allgemein bekannte Kinasereaktion radioaktiv markiert. Die Hybridisierung der größenfraktionierten mRNA mit DNA-Sonden, welche eine Markierung enthalten, erfolgt nach bekannten Verfahren, d. h. in Puffer- und Salzlösungen, welche Zusätze enthalten, z. B. Calciumchelatbildner, Viskositätsregulationsverbindungen, Proteine, nichthomologe DNA und ähnliche, bei Temperaturen, welche die selektive Hybridisierung begünstigen, z. B. zwischen O0C und 80°C, beispielsweise zwischen 250C und 500C oder um 65°C, vorzugsweise um etwa 20°C unter der doppelsträngigen Hybrid-DNA-Schmelztemperatur.
Fraktionierte mRNA kann in Zellen, z. B. Froschoozyten, oder in zellfreie Systeme, z. B. in Raticulocytlysate oder Weizenkeimextrakte, translatiert werden. Die gewonnenen Polypeptide werden auf enzymatische Aktivität oder auf Reaktion mit Antikörpern, gezogen im Vergleich zum nativen Poiypeptid, z. B. in einem Immunoassay, geprüft, beispielsweise Radioimmunoassay, Enzymimmunoassay und Immunoassay mit fluoreszierenden Markern. Derartige Immunoassays und die Herstellung von polyklohalen und monoklonalen Antikörpern sind in Fachkreicen allgemein bekannt und werden entsprechend angewendet.
Die Herstellung einer einzelsträngigen komplementären DNA (cDNA) aus der ausgewählten mRNA-Matrize ist in Fachkreisen allgemein bekannt, das gleiche gilt für die Herstellung einer doppelsträngigen DNA aus einer einzelsträngigen DNA. Die mRNA-Matrize wird mit einem Gemisch von Deoxynucleosidtriphosphaten, wahlweise radioaktiv markierten Deoxynucleosidtriphosphaten (um in der Lage zu sein, das Ergebnis der Reaktion zu prüfen), einer Starter-Sequenz, wie einem Oligo-dT-Rest, der mit dem Poly(A)-Schwanz der mRNA hybridisiert, und einem geeigneten Enzym, wie einer Umkehrtranskriptase, z. B. von dem Vogel-Myeloblastosevirus (AMV), inkubiert. Nach dem Abbau der Matrizen-mRNA, z. B. durch alkalische Hydrolyse, wird die cDNA mit einem Gemisch von Deoxynucleosidtriphosphaten und einem geeigneten Enzym inkubiert, um eine doppelsträngigo DNA zu ergeben. Geeignete Enzyme sind beispielsweise eine Umkehrtranskriptase, das Klenow- Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I oder T4-DNA-Polymerase. In der Regel wirkt eine Haarnadelschleifenstruktur,
die spontan von der einzelsträngigen cDNA gebildet wird, als Starter für die Synthese des zweiten Strangs. Diese Haarnadelstruktur wird durch Digerieren mit S1 -Nuclease entfernt. Als Alternative dazu wird zuerst das 3'-Ende der einzelsträngiyen DNA durch homopolymere Deoxynucleotidschwänze vor der Hydrolyse der mRNA-Matrize und anschließende Synthese des zweiten cDNA-Stranges erweitert.
Bei der Alternative wird doppelstränglge cDNA aus einer cDNA-Bank isoliert und auf die gewünschte cDNA geprüft (Schritt c). Die cDNA-Bank wird durch Isolieren von mRNA aus geeigneten Zellen und aus diesen Herstellen von einzelsträngiger und doppelsträngiger cDNA, wie das oben beschrieben wurde, aufgebaut. Diese cDNA wird mit geeigneten Restriktionsendonucleason aufgeschlossen und in einen λ-Phagen einbezogen, z.B. λ-Charon 4A oder Xgt 11, wobei die herkömmlichen Verfahren angewendet werden. Die auf Nitrocellulosemembranen replizierte cDNA-Bank wird unter Verwendung einer DNA-Sonde geprüft, wie das oben beschrieben wurds, oder in einem geeigneten Expressionssystem ausgeprägt, und die gewonnenen Polypeptide werden auf Reaktion rr'. einem für die gewünschten Verbindungen spezifischen Antikörper geprüft.
In Fachkreisen ist eine Vielzahl von Methoden für die Einbeziehung von doppelsträngiger cDNA oder genomischer DNA in einen angemessenen Vektor bekannt (Schritt d). Beispielsweise können komplementäre Homopolymertrakte der doppelsträngigen DNA und der Vektor-DNA durch Inkubation bei Anwesenheit der entsprechenden Deoxynucleosidtriphosphate und eines Enzyms, wie der Terminaldeoxynucleotidyltransferase, zugesetzt werden. Die Vektor- und Doppelstrang-DNA werden dann durch Basenpaarung zwischen den komplementär on homopolymeren Enden verbunden und schließlich durch spezifische Verbindungsenzyme, wie Ligasen, ligiert. Andere Möglichkeiten sind der Zusatz synthetischer Linker zu den Enden der Doppelstrang-DNA oder die Einbeziehung der Doppelstrang-DNA in den Vektor durch Ligalion stumpfer oder gestaffelter Enden. Passende Vektoren werden unten ausführlich behandelt.
Die Transformation der passenden Wirtszellen mit dem gewonnenen Hybridvektor (Schritt e) und die Auswahl und Vervielfältigung der transformierten Wirtszellen (Schritt f) sind in Fachkreisen allgemein bekannt. Beispiele für diese Methoden werden unten gegeben. Hybridvektoren und Wirtsze'.len können für die Produktion von DNA oder auch für die Produktion der sonst gewünschten Polypeptide besonders geeignet sein.
Die Isolierung der gewünschten DNA, von deren Mutanten und Fragmenten nach der Erfindung erfolgt nach den in Fachkreisen bekannten Mothoden, z. B. durch Extraktion mit Phenol und/oder Chloroform. Wahlweise kann die DNA weiter manipuliert werden, z. B. durch Behandlung mit mutagenen Mitteln, um Mutanten herzustellen, odor durch Aufschließen mit Restrifctionsenzymen, um Fragmente tu erhalten, einen oder beide Termini zur Erleichterung der Einbeziehung in den Vektor zu modifizieren, Intervening-Sequenzen zu beseitigen und ähnliches.
Die Nucleot'dsequonz einer DNA nach der Erfindung kann nach den bekannten Methoden bestimmt werden, z. B. nach der Maxam-Gilbert-Methode, die mit endmarkierter DNA arbeitet, oder nach der Dideoxykettenterminationsmethode von Sanger. PG-Gensequenzen nach der vorliegenden Erfindung können auch durch eine In-vitro-Synthese nach herkömmlichen Methoden hergestellt werden. Die In-vitro-Synthese kann vor allem für die Herstellung von kleine/enTragmenten einer PG-Expressionskassette verwendet werden, z. B. der DNA-Sequenzen eines PG-Gens mit d^r Codierung für einen Promotor oder ein Signalpeptid, beispielsweise das PGI-, PGII- oder pgaC-Gen, eines PG-Gens, das in einem DNA-Molekül, wie es vorstehend definiert wurde, enthalten ist, insbesondere in den λ-Klonen oder einem Mutanten davon.
Geeignete Methoden für die Synthese von DNA wurden in zusammenfassender Form von S.A. Narang (Tetrahedron 39,3,1983) gegeben. Die bekannten Syntheseverfahren erlauben die Herstellung von Polynucleotiden mit einer Länge bis zu 120 Basen mit diner guten Ausbeute, hoher Reinheit und in verhältnismäßig kurzer Zeit. In geeigneter Weise geschützte Nucleotide werden miteinander nach der Phosphodiestermethode (K.L. Agarwal u.a., Angew. Chemie 84,489,1972), der effektiveren Phosphotriestermetho&e (C. B. Resse, Tetrahedron 34,3143,1972), der Phosphittriestermethode (R. L. Letsinger u. a., J. Am. Chem. Soc. 98,3655,1976) oder der Phosphoramiditmethode (S. L. Beaucage und M. H. Curruthers, Tetrahedron 22,1859,1981) verbunden. Die Vereinfachung der Synthese der Oligonucleotide und Polynucleotide wird durch die Festphasenmethode ermöglicht, bei welcher die Nucleotidketten an ein geeignetes Polymer gebunden werden. H. Rink u. a. (Nucl. Acids Research 12, 6369,1984) verwenden anstelle von einzelnen Nucleotiden Trinucleotide und verbinden sie durch die Phosphotriestermethode in der Festphasensynthese. Auf diese Weise kann ein Polynucleotid in kurzer Zeit und mit guter Ausbeute hergestellt werden. Die eigentliche Doppelstrang-DNA wird enzymatisch aus chemisch hergestellten, überlappenden Oligonucleotiden von beiden DNA-Strängen hergestellt, die in der korrekten Anordnung durch Basenpaarung zusammengehalten und dann chemisch durch die Enzym-DNA-Ligase verbunden werden.
Eine andere Möglichkeit umfaßt die Inkubation von überlappenden einzelnen Oligonucleotiden von den beiden DNA-Strängen bei Anwesenheit der vier erforderlichen Deoxynucleosidtriphosphate mit einer DNA-Polymerase, z. B. DN A-Polymerase I, dem 'Klenow-Fragment von Polymerase I oder T%-DNA-Polymerase, oder mit einer AMV-Umkehrtranskriptase (Vogel-Myeloblastosevirus-Umkehrtranskriptase). Die beiden Oligonucleotide werden dadurch in der korrekten Anordnung durch Basenpaarung gehalten und mit den erforderlichen Nucleotiden durch das Enzym ergänzt, um eine komplette Doppelstrang-DNA zu ergeben (S.A.Narang u.a.. Anal. Biochem. 121,356,1982).
Nachstehend werden die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moluküls der vorliegenden Erfindung aus einer genomischen Bank und homologe und heterologe Hybridisierungsbedingungen für die Identifizierung der Glieder der PG-Genfamilie ausführlicher beschrieben.
Eine genomische Bank kann hergestellt werden z. B. durch partielles Aufschließen der genomischen DNA eines A. nlger-Stammes, z.B. NW756 oder N401), mit z.B. Sau3AI oder Mbol und Klonieren der hoci molekulargewichtigen DNA-Fragmente in einen geeigneten Wirtsvektor, ü.B. dasE.coll-PlasmidpUB121 oder einen Lambda-Vi ktor, z. B. EMBLA4. Andere Pilzstämme, welche die gewünschten PG produzieren, z. B. Asperglllus spec, ζ. B. A. japonlcus, A.orvzae, A. nldulans, A. nlger, Trlchoderma spec, Botivtls spec, Sclerotin!» spec, Fusarlum spec, oder ar dere phytopathogene Pilze, sowie Hefe, beispielsweise PG-produzierende Kluyveromycea spec, wie K.fragilis, können als Quelie für die genomische Bank dienen, und andere geeignete Vektoren, z. B. die oben genannten, können als Rezipienten für die Fragmente genutzt werden. Um die Genombank erfolgreich nach D1 JA-Sequenzen mit der Codierung für PG prüfen zu können, ist eine hybridisierende DNA-Sonde notwendig. Das kann eine synthetische DNA-Sonde sein, wenn die Aminosäui esequenz oder ein Teil dieser für die gewünschte PG bekannt ist, oder ein anderes PG-Gen oder dessen Teil, die an das gewünschte PG-Gen hybridisieren. Da vor der Erfindung weder eine PG-Sequenz noch ein PG-Gen oder dessen Teil bekannt waren, wurdenzuerst die Probleme der Reinigung von PG, der Strukturbestimmung der N-Terminalsequenz einer PG und die Herstellung von brauchbaren DNA-Sonden gelöst.
Für die Reinigung der vorliegenden PG kann jede Quelle, In der sie enthalten sind, genutzt werden. Beispielsweise können Rohquellen, wie die Enzymgemische, die von Aspergillus nlger gewonnen werden, wie Rapidase·, ein kommerziell erhältliches Gemisch von pektinolyt'cchen Enzymen, als Quelle dienen.
Die Reinigung erfolgt nach herkömmlichen Reinigungsmethoden, wie Aussalzen, Entsalzen, erneutes Ausfällen in Form eines unterschiedlichen Salzes, Chromatographie, z. B. Affinitätschromatographie, wie auf einem vernetzten Alginat, lonenaustauschchromatographie, z. B. auf einer DEAE-Sephadex- oder Sepharose-Säule, Gelpermeationschromatographie, z. B. auf einer Sephacrylsäule, Elektrophorese, z. B. mit SDS-Polyacrylamldgel, isoelektrische Fokussierung und ähnliche oder beliebige Kombinationen der genannten.
In der vorliegenden Erfindung wurden PGI, PGII, PGIIIA, PHIIIB und PGIV In reiner Form aus Rapidase· isoliert. Die genannten PG sind Endo-Polygalacturonasen (E.C. 3.2.1.15) mit folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften: PGI hat einen Mr-Wert von 55 K, einen isoelektrischen Punkt (IEP) zwischen 3,2 und 3,5 und ein pH-Wert-Optimum für die enzymatische Aktivität von 4,9. Die Werte für PGII sind Mr von 38K, lEPzwischen 4,6 und 5,9, pH-Wert-Optimum von 4,8; PGIIIA hat die Werte von Mr gleich 57 K, IEP von 3,3 und pH-Wert-Optimum von 4,3; PGIIIB hat auch 57 K und einen IEP von 3,3, das pH-Wert-Optimum aber beträgt 4,5. Schließlich hat PGIV einen Mr-Wert von 59K, einen IEP von 3,7 und ein pH-Wert-Optimum von 4,8. Die gegebenen Mr-Werte werden durch SDS-Polyacrylamldgelelektrophorese bestimmt, die IEP-Werte durch isoelektrische Dünnschichtfokussierung. Die N-Terminalsequenzierung von PGI zeigte folgende Sequenz auf:
ala'-ser-thr-X4-thre-phe-thr-ser-ala9 Die N-Terminalsequenzierung eines 21 kDa-BrCN-Fragmentes von PGI zeigte diese Sequenz auf:
ala-ser-thr-X4-thr-phe-thr-ser-ala-ser-glu, d. h., die N-Terminalsequenz von PGI und die Sequenzierung eines 5,5kDa-BrCN-Fragmentes enthüllte die Sequenz
ala-asp-gyl-ala-vaMle-asp-gly-asp-gly-ser
Die N-Terminalsequenzierung von PGII enthüllte die Sequenz
asp'-ser-X3-thr-phe6-thr-thr-ala-ala-ala10-ala-lys-ala12 und ein BrCN-Fragment von 17 kDa die Sequenz
ala-phe-ser-val-gln-ala-asn-asp-ile-thr-phe.
X3 und X* in den Sequenzen wurden zu diesem Zeitpunkt nicht identifiziert.
Auf der Grundlage der Aminosäuresequenz des BrCN-Fragmenteszu 5,SkDa von PGl wurde das folgende Oligonucleotidgemisch synthetisiert:
metalaaspglyalsval
HR 6298 5' (d) ATGGCIGAr1GGIGCIGTI ileaspglyaspgly ATR3GAR1GGIGAr1GG 3'
Auf der Grundlage der Aminosäuresequenz des BrCN-Fragmentes zu 17 kDa von PGII wurden die beiden folgenden Oligonucleotidgemische synthetisiert:
met ala phe ser val gin ala HR 6195 5' (d) ATG GCITTR1TCIGTICAR2 GCI KR 6196 5' (d! ATG GCITTR, AGIGTI CARj GCI
asn asp He
HR 6195 AAR, GAR, AT 3' HR 6196 AAR, GAR, AT 3'
In den Sequenzen der Oligonucleotide ist I Inosin, R1 ist T oder C, R2 ist A oder G und R3 ist T, C oder A.
Die Gemische wurden radioaktiv markiert und zum Prüfen einer Genombank von Aspergillus nlger N400 auf PGI bzw. PGII verwendet.
Die identifizierten Gene oder Genfragmente werden dann nach herkömmlichen Mitteln sequenziert. Die Sequenzen der PGf- und PGII-Gene von A. nlger N 400 werden durch die Sequenzen mit den SEQ ID NO. 1 bzw. 2 dargestellt, die in der Sequenzaufstellung gegeben werden.
Zu Prüfungszwecken werden die DNA-Sonden nach den in Fachkreisen bekannten Methoden radioaktiv markiert, z. B. durch Verwendung von Y32P-ATP und T4-Kinase oder a32P-dATP und E.coll-DNA-PoIymerase I, in Abhängigkeit vom Typ der verwendeten Sonde. Wirtsorganismen, die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung als einen Einschub tragen, werden durch Hybridisierung mit der markierten DNA-Sonde auf Filterrepliken der Genbank identifiziert.
Klone, die eine Hybridisationsreaktion aufweisen gegenüber einer oder mehreren DNA-Sonden, werden isoliert und amplifiziert.
Die angewendeten Hybridisationsbedingungen sind die herkömmlichen, sie können mehr oder weniger streng sein.
Strenge Bedingungen sind die, unter denen nur DNA-Sequenzen mit einem höheren Grad an Homologie hybridisieren können („homologe" Hybridisationsbedingungen). Unter „heterologen" oder weniger strengen Bedingungen können auch verwandte DNA-Sequenzen mit einem niedrigeren Grad an Homologie hybridisieren. Die Strenge der Hybridisation wird beispielsweise beeinflußt durch Hybridisations- und Waschtemperatur, Formamid- oder Salzkonzentration, G + C-Gehalt der DNA, Länge der
Hybridisationszeit und Länge der DNA-Sonde. Illustrative, aber nicht einschränkende Beispiele für „homologe" und ,,heterologe" Hybridisationsbedingungen werden unten in den Beispielen gegeben.
Unter Verwendung von einer oder mehreren der DNA-Sonden, die von dem PGI- oder PGII-Gen abgeleitet wurden, insbesondere solchen, die wenigstens einen Teil von deren codierenden Bereichen umfassen, können hybridisierende Klone, die von einer Genombank, z. B. von A. nlger, vorzugsweise von A. nlger N400 oder A. niger NW756, abgeleitet wurden, identifiziert und in verschiedene Klassen auf der Grundlage ihres Grades an Homologie und auf der Grundlage der beobachteten hybridisierenden Restriktionsfragmente eingeteilt werden. Beispiele von bevorzugten Klonen, die von einer A.nlger-N400-Bank abgeleitet wurden, sind XPG-A9,-A10,-A43,-64,-635,-836,-01,-016,-C 20,-C 37,-D8,-D11,-D12,-E 6,-E 38,-F5,-G17,-X31 und-Y33.
Ihre Herstellung wird unten i ι den Beispielen ausführlicher beschrieben. Ein Beispiel für einen bevorzugten Klon, der von
A. nlger-NW756 abgeleitet v/urde, ist das Plasmid pGW 1756.
Diese Klone sowie die Plasmide pGW1800, pGW1803, pGW1900, pGW1902 und pGW1910 können zur Herstellung anderer rekombinanter DNA-Moleküle der Erfindung verwendet werden, insbesondere solche, welche Fragmente der darin eingeschlossenen PG-Gensequenzen enthalten. Diese anderen rekombinanten DNA-Moleküle werden auf herkömmliche Weise unter Einsatz herkömmlicher Restriktionsenzyme, Linker, von Ligations-, Amplifikations- und Isolierungsprozessen hergestellt.
Vorzugsweise werden Exprossionsvektoren hergestellt, die pro- oder eukaryotische Vektoren oder bifunktionelle Plasmide für die Vermehrung in pro- und eukaryotischen Zellen sein können. Beispiele für den Aufbau solcher bifunktionellen Plasmide sind in Fachkreisen allgemein bekannt. Die Expressionsvektoren können homologe oder heterologe Gene enthalten. Beispiele für solche Gene werden nachstehend gegeben.
Die Einschübe der rekombinanten DNA-Moleküle der Erfindung oder deren Fragmente können auf herkömmliche Weise gewonnen werden, z. B. nach dem Spalten der rekombinanten DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen und Isolierung der gewünschten DNA-Fragmente nach Agarosegelelektrophorese.
Mutanten der DNA-Moleküle der Erfindung, besonders die PG-Gensequenzen, die neue Restriktionsorte enthalten, können ebenfalls hergestellt werden, beispielsweise in vitro durch ortsspezifische Mutagenese, nach herkömmlichen Methoden (siehe Übersichtsartikel von M. J." ^!!er und M. Smith, Methods, Enzymol. 100,468 [1983], D. Botstein und D. Shortle, Science 229,1193 [1985) oder K.Norri: -.ά., duel. Acids Res. 11,5103 [1983]).
Die Erfindung betrifft auch den Einsatz der rekombinanten DNA-Moleküle der Erfindung für die Herstellung von Hybridvektoren für die Expression eines Strukturgens.
Transformierte Wirte
Außerdem betrifft die Erfindung transformierte Wirtszellen für das Amplifizieren der rekombinanten DNA-Moleküle der Erfindung oder besonders für die Ausprägung einer Expressionskassette, die in einem rekombinanten DNA-Molekül der Erfindung eingeschlossen ist.
Beispiele für geeignete Wirte, besonders für das Amplifizieren der rekombinanten DNA-Moleküle der Erfindung, sind Mikroorganismen, deren Restriktionsenzyme oder Modifikationsenzyme fehlen oder nur im geringen Maße zu eigen sind, beispielsweise Bakterien, besonders Stämme von Escherichla coil, beispielsweise E.culi W3110, E. coll HB101/LM1035, E.coll JA221, E. coil DH5a oder vorzugsweise E. coil DH5O.F', JM109, MH1 oder HB101, oder der E. coli-Stamm K12, Bacillus subtilis.
Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus und andere, und Hefen, beispielsweise Saccharomyces cerevislae, wie S.cerevlslaeGRF18. Außerdem sind geeignete Wirtszellen Zellen von höheren Organismen, insbesondere feststehende kontinuierliche menschliche oder tierische Zellinien, z. B. Lungenfibroblasten des menschlichen Embryos L132, menschliche Bowes-Zellen des malignen Melanoms, HeLa-Zellen, durch den SV40-Virus transformierte Nierenzellen der afrikanischen Grünen Meerkatze COS-7 oder Eierstockzellen (CHO) des Chinesischen Hamsters.
Beispiele für geeignete Wirte zum Ausprägen einer Expressionskassette der Erfindung sind die vorstehend genannten Zellen, und insbesondere sind es Fadenpilze, beispielsweise Penicllllum, Cephalosporium oder vorzugsweise Asperglllus spec, ζ. Β.
A. carbonarlus, A. awamori oder vorzugsweise A. nlger, A. nldulans oder A. oryzae.
Bevorzugte transformierte Wirte sind E.coll MH1, transformiert mit pGW 1800 oder pGW1803, E. coil JM109, transformiert mit pGW1800 oder pGW1803, E.coll DH5 F', transformiert mit pGW 1900,1902,1657 oder 1910, pGII-IFN AM 119 oder pGllss-IFN AM 119, Asperglllus niger An8 oder N593 oder Asperglllus nldulans, transformiert mit pGII-IFN-AM 119 oder pGllss-iFN AM 199 und wahlweise mit dem Selektionsmarkerplasmid pCG 59D.
Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur Herstellung solcher Transformanten, welche die Behandlung einer geeigneten Wirtszelle unter transformierenden Bedingungen mit einem rekombinanten DNA-Molekül der Erfindung, insbesondere einem Hybridvektor der Erfindung, wahlweise zusammen mit einem Selektionsmarkergen, und wahlweise die Auswahl der Transformanten umfaßt.
Die Transformation von Mikroorganismen wird nach herkömmlichen Methoden ausgeführt, wie sie in der Literatur beschrieben werden, beispielsweise für S.cerevisiae (A.Hinnen u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75,1929,1978), für B.subtilis (Anagnosiopoulos u. a., J. Bacteriol. 81,741,1961) und für E. coil (M. Mandel u. a„ J.Mol. Biol. 53,159,1970).
Demzufolge schließt das Transformationsverfahren von E. coli-Zellen beispielsweisee die Ca2+-Vorbehandlung der Zellen ein, so daß die DNA-Aufnahme ermöglicht wird und die Inkubation mit dem Hybridvektor. Die anschließende Selektion der transformierten Zellen kann beispielsweise durch Transferieren der Zellen auf ein selektives Wachstumsmedium erreicht werden, welches die Trennung der transformierten Zellen von den Elternzellen in Abhängigkeit von der Natur der Markersequenz der Vektor-DNA ermöglicht. Vorzugsweise wird ein Wachstumsmedium verwendet, welches das Wachstum von Zellen, die den Vektor nicht enthalten, nicht zuläßt. Die Transformation von Hefe umfaßt beispielsweise die Schritte der enzymatischen Entfernung der Hefezellwand durch Glucosidasen, der Behandlung der gewonnenen Sphäroplaste mit dem Vektor bei Anwesenheit von Polyethylenglycol- und Ca2+-lonen und der Regenerierung der Zellwand durch Einbettung der Sphäroplaste in Agar. Vorzugsweise wird der Agar auf eine Weise hergestellt, der die Regenerierung und die Selektion der transformierten Zellen, wie sie oben beschrieben wurde, zur gleichen Zeit erlaubt.
Die Transformation von Zellen mit höherem eukaryotischen Ursprung, beispielsweise Säugetierzellinien, wird vorzugsweise durch Transfektion erreicht. Transfektion wird nach herkömmlichen Methoden ausgeführt, beispielsweise Calciumphosphatausfällung, Mikroinjektion, Protoplastfusion, Elektroporation, d. h. Einführung der DNA durch einen kurzen elektrischen Impuls, der vorübergehend die Durchlässigkeit der Zellmembran erhöht, oder bei Vorhandensein von Helferverbindungen, wie Diethylaminoethyldextran, Dimethylsulfoxid, Glycerol oder Polyethylenglycol, und ähnlichen. Nach
dem Transfektionsverfahren werden die transfizierten Zellen identifiziert und ausgewählt, z. B. durch Züchtung in einem selektiven Medium, das in Abhängigkeit von der Art des Selektionsmarkers ausgewählt wird, beispielsweise Standardkulturmedien, wie modifiziertes Eagle-Medium von Dulbecco (DMEM), Minimalmedium, RPMI-1640-Medium und ähnliche, die z. B. das entsprechende Antibiotikum enthalten.
Die transformierten Wirtszellen werden nach den in Fachkreisen bekannten Methoden in einem flüssigen Medium gezüchtet, das assimilierbare Kohlenstoffquellen enthält, z. B. Kohlehydrate, wie Glucose oder Lactose, Stickstoff, z. B. Aminosäuren, Peptide, Proteine oder deren Abbauprodukte, wie Peptone, Ammoniumsalze oder ähnliche, und anorganische Salze, z. B. Sulfate, Phosphate und/oder Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium. Das Medium enthält außerdem beispielsweise wachstumsfördernde Substanzen, wie Spurenelemente, beispielsweise Eisen, Zink, Mangan und ähnliche. Das Medium wird vorzugsweise so gewählt, daß es einen Selektionsdruck ausübt und das Wachstum von Zellen verhindert, die nicht transformiert wurden oder den Hybridvektor verloren haben. So wird dem Medium beispielsweise ein Antibiotikum zugesetzt, wenn der Hybridvektor ein antibiotisches Resistenzgen als Marker enthält. Wenn beispielsweise eine Wirtszelle verwendet wird, die in einer essentiellen Aminosäure auxotroph ist, während der Hybridvektor ein Gen mit der Codierung für ein Enzym enthält, welches den Wirtsdefekt ergänzt, wird zur Züchtung der transformierten Zellen ein Minimalmedium verwendet, dem diese Aminosäure fehlt.
Zellen von höherem eukaryotischem Ursprung, wie Säugetierzellen, werden unter Gewebekulturbedingungen unter Verwendung kommerziell erhältlicher Medien gezogen, beispielsweise dem oben genannten modifizierten Eagle-Medium von Dulbecco (DMEM), dem Minimalmediiim, dem RPMI-1640-Medium und ähnlichen, wahlweise vervollständigt mit wachstumsfördernden Substanzen und/oder Säugerseren. Techniken zur Zellkultivierung unter Gewebekulturbedingungen sind in Fachkreisen allgemein bekannt und schließen die homogene Suspensionskultur, z. B. in einem Airlift-Reaktor oder in einem Dauerrührreaktor, oder die immobilisierte oder eingeschlossene Zellkultur, z. B. in Hohlfasern, Mikrokapseln, auf Agarose-Mikroperlen, porösen Glasperlen, Keramikhülsen oder anderen Mikroträgern, ein.
Die Kultur erfolgt nach Prozessen, die in Fachkreisen bekannt sind. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert des Mediums und Fermentierungszeit, werden so gewählt, daß ein maximaler Titer des Polypeptids oder Derivats der Erfindung gewonnen wird. So wird ein E. coil- oder ein Hefestamm vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durch Submerskultur unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 20°C bis 40eC, vorzugsweise bei etwa 3O0C, und einem pH-Wert von 4 bis 8, vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 7, für die Dauer von etwa 4 bis 30 Stunden, vorzugsweise bis zum Erreichen einer maximalen Ausbeute des Polypeptids oder Derivats der Erfindung, gezogen.
Um die Selektion der transformierten von nichttransformierten Zellen zu ermöglichen, tragen die DNA-Moleküle der Erfindung einen Selektionsmarker oder, als Alternative dazu, die Zellen werden mit einem zweiten Vektor, der einen solchen Marker enthält, cotransformiert. Wie in anderen Systemen ist ein solcher Selektionsmarker ein expressierbares Strukturgen, dessen ausgeprägtes Polypeptid (ein Enzym) Resistenz gegenüber Verbindungen vermittelt, welche toxisch für den Rezipientenorganismus sind, oder welches das Enzymsystem eines Mutanten ergänzt, dem ein solches essentielles Polypeptid fehlt. Solche Markergene, die für die Selektion von transformierten Fadenpilzzellen geeignet sind, sind beispielsweise die bekannten qa-2-, pyrG-, pyr4-, trpC-, amdS-, oder argB-Gene.
wie in EP278355 beschrieben wird, wurde ein Marker-Gen mit der Bezeichnung pyrA aus der Genombank von A.nlger isoliert, das mit pyrG von A. nldulans und pyr4 von N. crassa verwandt ist und eine ähnliche Funktion wie diese hat, nämlich die Produktion des Enzyms Orotidin-ö'-Phosphatdecarboxylase. Dieses Enzym katalysiert die Decarboxylierung des Orotidin-5'-phosphats zu Uridylsäure (Uridin-5'-phosphat) und auch von Fluor-orotinsäure zu dem toxischen Fluoruridin. Durch Hybridisierung mit dem 1,1 kb-Hind Ill-Frugment von pDJB2 (Ref. 25), das einen Teil des pyr4-Gens enthält, wurde ein E. coli-Klon identifiziert, der das pyrA-Gen enthält. Es kann jedoch DNA von jedem anderen pyr-Gen mit der Codierung für Orodin-5'-Phosphatdecarboxylase verwendet werden. Aus einem positiven Klon mit der Bezeichnung E.coliB75183/pCG59D7 wurde das Plasmid pCG59D7, welches das pyrA-Gen umfaßt, isoliert und für die Coiransformation eines A.nlger-pyrA~-Mutanten verwendet. Diesem pyrA'-f/utanten fehlt das Orotidin-5'-phosphatdecarboxylasegen, und er ir,t daher nicht in der Lage, das entsprechende Enzym zu produzieren. Ein solcher Mutant wurde durch Behandlung von Konidiosporen von A. niger N 756 unter mutierender UV-Bestrahlung hergestellt, und es werden dio Kolonien ausgewählt, die bei Anwesenheit von Fluor-Orotinsäure und Uridin überleben. Kolonien, die bei Anwesenheit von Fluor-orotinsäure und Fehlen von Uridin überleben, werden ausgeschaltet. Die verbleibenden uridinbedürfenden Mutanten gehören entsprechend ihrer Fähigkeit, transformierbar zu sein, zu zwei Komplementationsgruppen pyrA und pyrB, die durch die Mutanten An8 bzw. An 10 dargestellt werden. Sie werden in Form ihrer Protoplasten unter transformierenden Bedingungen mit dem pyrA-haltigen Plasmid pCG 59D7 behandelt. Es wurde festgestellt, daß nur die An 8-Kolonien transformiert waren und das pyrA-Gen enthielten, wie durch die hybridisierende Fähigkeit ihrer aufgeschlossenen DNA mit DNA von pUN 121 unter Beweis gestellt wird.
Die Erfindung betrifft außerdem eine Methode zur Herstellung von Polypeptiden, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß ein homologes oder heterologes Strukturgen, beispielsweise in dem oben definierten Sinne, eingefügt in eine Expressionskassette der Erfindung, nach herkömmlichen Methoden in einem in geeigneter Weise transformierten Wirt ausgeprägt wird. Wenn erforderlich, wird das Polypeptid auf herkömmliche Weise isoliert. In Abhängigkeit vom Aufbau der Expressionskassette, werden die Produkte entweder produziert oder, wenn eine Signalsequenz vorhanden ist, produziert und sekretiert. In der Regel ist die Expressionskassette in einem Hybridvektor enthalten, sie kann aber auch nach der Transformation in das Wirtsgenom integriert werden.
Ein geeigneter Wirt ist beispielsweise ein Pilz, z. B. ein Fadenpilz, besonders ein Aspergillus-Stamm, wenn ein Promotor, der von einem PG-Gen der Erfindung abgeleitet wurde, oder ein anderer Promotor, der von Fadenpilzen abgeleitet wurde, für die Expression eines homologen oder heterologen Strukturgens genutzt wird. Wenn jedoch andere Promotoren verwendet werden, beispielsweise solche, die von Prokaryoten oder höheren Eukaryoten abgeleitet wurden, sind andere Wirte geeignet, beispielsweise Bakterien, wie E.coli bzw. höhere eukaryotische Zellen.
Die Promotoren der PG-Gene von A.nlger sind in der A. nlger-Zelle induzierbar, d. h., die Expression des daran gebundenen Strukturgens, z. B. des Strukturgens mit der Codierung für ein PG- oder ein Fremdgen, wird durch den Zusatz von Pectin oder Pectinabbauprodukten zum Medium induziert. Bei Anwesenheit von genügend Glucose aber ist der Promotor nicht induzierbar, wenn ein A. niger-Stamm, z. B. An8 oder N 593, als Wirt verwendet wird. Das bedeutet, Gene unter der Kontrolle eines A. nlger-PG-Promotors sind in A. nlger „katabolit-reprimiert". Wird jedoch ein anderer Aspergillus-Stamm verwendet, vorzugsweise
A. oryzae oder besser noch A. nldulans, wird ein Gen unter der Kontrolle eines /.. nlger-PG-Promotors konstitutiv ausgeprägt, d. h. auch bei Fehlen von Pectin und/oder bei Anwesenheit von Glucose. Es kann daher vorteilhaft sein, Gene unter der Kontrolle eines A. nlger-PG-Promotors in einem anderen Aspergillus-Wirt als A. nlger, vorzugsweise A.oryzae oder besser noch A. nldulans, auszuprägen, weil beispielsweise dem Nährmedium Glucose anstelle von Pectin als Energie- und Kohlenstoffquelle während der Expression eines gewünschten Gens zugesetzt werden kann.
Wenn für den Aufbau einer Expressionskassette der Erfindung ein Promotor verwendet wird, der nicht von einem PG-Gen der vorliegenden Erfindung abgeleitet wurde, der z. B. ein Strukturgen umfaßt, das eine PG codiert, können andere Wirte als Expressionswirte verwendet werden. Solche geeigneten Wirte sind von dem verwendeten Promotor abhängig und sind z. B. Bakterien, wie E. coil, oder Hefe, wie S. cerevlslae oder Kluyveromyces lactis. Geeignete Wirte und Promotoren für die Herstellung von Polypeptiden nach der Erfindung sind auch die oben für die Transformation als geeignet angegebenen. Es ist nun möglich, eine oder mehrere gewünschte PG überauszuprägen, wofür verschiedene Methoden angewendet werden können. Eine gereinigte einzelne PG kann so hergestellt werden, daß pectinolytisches Enzymgemisch, welche eine PG enthält, herkömmlichen Reinigungsmethoden unterzogen wird. Eine andere Methode zur Produktion oiner einzelnen PG, vorzugsweise von PG I, PG Il oder des Produktes des pgaC-Gens, ist dadurch gekennzeichnet, daß ein geeigneter Wirt, der nicht in der Lage ist, eine PG auszuprägen, oder der PG in einer geringen Menge ausprägt oder der PG nicht unter den für das eingeführte PG-Gen angewendeten Induktionsbedingungen ausprägt, mit einem Hybridvektor transformiert wird, dor ein Strukturgen mit der Codierung für die PG, z. B. PG I, PG Il oder das pgaC-Genprodukt oder ein Fragment von PG mit PG-Aktivität umfaßt, und daß dieses Strukturgen ausgeprägt wird. Wenn ein Wirt, der nicht in der Lage ist, überhaupt eine PG auszuprägen, verwendet wird, kann die entsprechende einzelne PG in reiner Form gewonnen werden, d. h. nichtkontaminiert durch eine andere PG. Es ist auch möglich, im voraus bestimmte Gemische von PG, wahlweise zusammen mit anderen Enzymen, dadurch herzustellen, daß in einem transformierten Wirt nicht nur ein einzelnes, sondern mehr als ein gewünschtes PG-Gen, wahlweise zusammen mit Genen, die andere Enzyme codieren, ausgeprägt werden. Im voraus bestimmte Gemische kann man auch dadurch erhalten, daß ein oder mehrere gewünschte Gene für PG und/oder andere Enzyme, z. B. für Pectinesterasen, Pect.inlyasen, Cellulasen, gemischte Endoglucanasen, Hemicellulasen, Xylanasen, Arabinasen, Galactanasen, α- und ß-Glycodidasen und ähnliche, in einem Wirtsstamm ausgeprägt werden, wahlweise einem mit einem gewissen Hintergrund in der Enzymproduktion. Im voraus bestimmte Gemische von Enzymen kann man auch durch Unterbrechung von bestimmten PG-Genen im Wirt durch „Gen-Unterbrechung" erhalten, eine in Fachkreisen allgemein bekannte Technik, wobei die isolierten PG-Gene der Erfindung eingesetzt werden.
Ein Wirt, der nicht in der Lage is', überhaupt eine PG auszuprägen, ist entweder ein Mikroorganismus ohne ein entsprechendes Gen, z. B. ein PC-Aspergillus-Stamm, ein anderer PG~-Nicht-Asperglllus-Pilz oder jede andere PG~-eukaryotische oder -prokaryotische Zelle, oder ein Aspergillus-Stamm, z. B. A. oryzae oder A. nidulans, dessen Expression von endogenen PG-Genen in einem entsprechend konditionierten Wachstumsmedium unterdrückt wird, die z.B. „katabolit-reprimiert" sind und/oder uninduziert, während der exogene PG-Promotor operativ mit dem gewünschten PG-Strukturgen gekoppelt ist, z. B. ein von A. niger abgeleiteter Promotor, und unter diesen Bedingungen aktiv ist, oder wenn das PG-Gen mit einem anderen Promotor verschmolzen ist.
Andere Promotoren und Stämme, die für die Herstellung der PG geeignet sind, sind die gleichen, wie sie oben in der Beschreibung der Expressionskassetten gegeben wurden.
Die einzelnen PG, die aus einem pectinolytischen Enzymgemisch, vorzugsweise aus einem von Aspergillus niger abgeleiteten pectinolytischen Enzymgemisch und insbesondere aus Rapdase*, gereinigt wurden, und PG, welche durch eine DNA-Sequenz nach der Erfindung codiert werden, und deren Derivate mit PG-Aktivität, insbesondere, wenn sie in einem geeigneten Wirt produziert werden, der mit einem Expressionshybridvektor mit der Codierung für eine solche PG oder deren Derivat mit PG-Aktivität transformiert wurde, und deren physiologisch akzeptable Salze sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Besonders bevorzugt werden PG I, PGII, PG III A, PG III B und PGIV von Aspergillus niger in gereinigter Form. Vorliegende Erfindung betrifft diese Polypeptide, wenn sie nach einer Methode der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf enzymatische Zusammensetzungen, welche eine oder mehrere dieser einzelnen PG und/oder deren Derivat mit PG-Aktivität und/oder deren biologisch akzeptable Salze, wahlweise in einer festgelegten Kombination mit einem oder mehreren geeigneten Enzymen mit einer anderen als PG-Aktivität, umfassen. Enzyme mit einer anderen als PG-Aktivität, die für die Herstellung dieser enzymatischen Zusammensetzungen geeignet sind, sind abbauende und modifizierende Pflanzenzellwandpolymere. Solche Enzyme sind z. B. Pectinesterasen, Pectinlyasen, gemischte Endoglucanasen, Hemicellulasen, Xylanasen, Arabinasen, Galactanasen, α- und ß-Glycodidasen und ähnliche. Vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf die Herstellung dieser enzymatischen Zusammensetzungen auf herkömmliche Weise.
Der Einsatz dieser einzelnen PG und/oder von deren Derivaten mit PG-Aktivität und/oder dieser enzymatischen Zusammensetzungen bei der Verarbeitung von Pflanzenmaterial ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Einzelne PG der Erfindung und/oder deren Derivate mit PG-Aktivität oder enzymatische Zusammensetzungen, welche diese PG oder Derivate umfassen, sind z. B. nützlich bei der Klärung von Gemüse- oder Fruchtsaft, bei der Steigerung des Saftertrages in der Gemüse- oder Fruchtsaftherstellung und des Preßertrages von ölhaltigen Samen oder Früchten, bei der Stabilisierung von Gemüse- oder Fruchtsaft, bei der Verringerung der Viskosität von Gemüse- oder Fruchtsaft, bei der Verflüssigung von Biomasse, bei der Mazerierung, bei der Steigerung der Extraktion von Naturprodukten, wie natürlichen Pigmenten, Aroma- und Geschmacksstoffen, bei der Aufwertung von Biomasse, Nahrungs- oder Futtermitteln, zur Verbesserung der Gewinnung von Cellulosefasern in der Papierzellstoffgewinnung und ähnlichen
Am meisten bevorzugt werden die Ausführungsbeispiele der Erfindung, die anschließend in den Beispielen beschrieben werden.
Abb. 1: Partielle Restriktionskarten der EcoRI-Fragmente der Phage XD und λ E, die aus einer Genombank von A. niger durch Hybridisierung mit den combinierten DNA-Sonden HR 6195 und HR 6196 mit der Codierung für einen Teil des PG Il-Gens gewonnen wurden. Die Zahlen bezeichnen die angenäherten Abstände in kbp von den rechten EcoRI-Orten.
Ampicillinresistenzgen, und die Pfeile geben die von A. nlger abgeleitete DNA an
Abb. 3: Partielle Restriktionskarte von pGW 1900. Zusammengesetzt aus dem pUC9-Vektor und einem 8,6kbp-BamHI-Fragmentdes Phagen PGI-A7.
Abb.4: Klonierungsstrategie für die Plasmide pG IUFN AM 119 und pG Ilss-IFN AM 119
Abb. 5: Schrittweise Herstellung von DNA-Einschüben DNA5 und DNA6 für den Aufbau von pG H-IFN AM 119 bzw. pG Ilss-IFN
AM 119 nach der Methode der Polymerasekettenreaktion (PCR-Methode)
Abb.6: Partielle Restriktionskarte von pGW 1756. pGW 1756 ist das 5,5kbp-Xhol-Bglll-Fragment, welches das A.nlger-NW756-
Sail- bzw. BamHI-Orten des Vektors zerstört
Abb.7: Partielle Restriktionskarte von pGW 1910. pGW1910 ist das 7,8kbp-Bglll-Fragment des Lambdaphagen PG-C20,
eingeschoben in den BamHI-Ort des Vektors pUC9. Es wird die ungefähre Lage des A. nlger-N400-Gens angegeben,
welches das PGC- (pgaC-) Gen codiert.
bis Tris Bis(2-Hydroxyethyl)imino-tris(hydroxymethyl)-methan
kbp Kilobasenpaare
explizit genannt werden, mit NaOH auf einen pH-Wert von 6,0 abgestimmt
Vollmedium Minimalmedium mit 6 g NaNO3 und 10 g Glucose je Liter, plus 2 g Trypicasepenton (BBL), 1 g Casaminosäuren(Difco), 1 g Hefeextrakt (BBL),0,5g Ribonucleinsäurenatriumsalz von Hefe (ICN, Cleveland, USA), 2 ml
Vitaminlösung je Liter, mit NaOH auf einen pH-Wert von 6,0 abgestimmt
Vitaminlösung je 100 ml 10 mg Thiamin, 100 mg Riboflavin, 10 mg Pantothensäure, 2 mg Biotin, 10 mg p-Aminobenzoesäure,100 mg Nicotinamid, 50 mg Pyridoxin-HCI
Probenpuffer 10 % (Vol./Vol.) Glycerol, 10OmM EDTA, pH-Wert 8,0, und 0,01 % Bromphenolblau RNase A RNase A, die in der von Maniatis u. a. beschriebenen Weise behandelt wurde (Ref. 6, S. 451)
(F', traD 36, proAB, laclqZ M15]
Ε» werden folgende Vektoren verwendet:
pGW613
M13mp-Phage
und werden zur Erleichterung der DNA-Sequenzierung designiert, da sie die Klonierung von DNA-Fragmanten an einemvielseitigen Polylinkerort und die Klonierung des gleichen Restriktionsfragmentes in beiden möglichen Orientierungen erlauben.
einzelsträngigen Sonden unter Verwendung des Oligodeoxyribonucleotid-Standardstarters und des Klenow-Fragments der
enthalten, werden in die lacZ-Sequenz eingeschoben. Der Polylinker behält das lacZ-Leseraster bei, und der Vektor gibt dieaüclische Komplementierung eines LacZa-Wirtsstammes, was blaue Plaques auf Platten ergibt, die IPTG und X-gal enthalten.
lacZa-Peptids beeinträchtigen, werden als farblose Plaques aufgezeigt.
pGW635
beschrieben.
einen Mehrfachklonierungsbereich zwischen den Lambda-Armen und dem nichtessentiellen Stuffer-Bereich. Das gestattet es,
die Vektorarme reduziert wird, wenn die interessierende Fremd-DNA eingeschoben wird. Der Vektor nutzt auch den
pEMBL18undpEMBL19
(Ref. 10,22,23).
u.a., Ref. 2) beschrieben wurde, wobei ein modifizierter Ferricyanidtest (Robyt u.a., Ref.3) angewendet wird.
pectinolytischen Enzymen, die von Aspergillus niger (Gist-brocades, Soclin, Frankreich) gewonnen wurden. Es werden 50g des
250COg zentrifugiert, um die Feststoffe zu entfernen, und auf einer Sephadex-G-50-Säule (5cm x 90cm), die im gleichen Pufferäquilibriert worden war, entsalzt.
2,5cm x 30cm). Das entsalzte Enzym wird auf diese Säule gebracht und dann durch Anwendung eineslOOmM-Natriumacetatpuffers, pH-Wert 4,2 bzw. 5,6 (jeweils 400ml) gewaschen. Während PGI und PGII auf die Alginatmatrixadsorbieren, ist das bei den PG III A, III B und IV nicht der Fall.
Die adsorbierten PGI- und PG Il-Proteine von der quervernetzten Alginatsäule werden durch einen linearen Natriumchloridgradienten (0-1 M) in einem lOOmM-Natriumacetatpuffer bei einem pH-Wert von 5,6 eluiert, was eine geringfügige Modifikation des bisher angewendete) < Verfahrensc! stellt (Rombouts u.a., Ref. 1). PGI coeluiert mit PG Il bei etwa 0,5M NaCI.
Die Enzymfraktion, wolche PGI und PG Il enthält, wird anhand eines 20mM-Natriumacetatpuffers, pH-Wert 5,7, dialysiert und einer DEAE-Sephadex-A-50-Säule (2,5cm χ 3Oom) zugeführt, die in dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Die Enzyme werden unter Verwendung eines linearen NaCI-Gradienten (0-0,6M) eluiert. PGI eluiert bei etwa 0,3 M NaCI, PG Il bei etwa 0,2 M. Die Enzymfraktionen, welche PGI und PG Il enthalten, werden getrennt aufgofangen, anhand eines 20mM-Tris-HCI-Puffors, pH-Wert 5,8, dialysiert und auf einer DEAE-Sepharose-Schnellflußsäule Chromatographien, die in dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Bei Anwendung eines NaCI-Gradienten wird PG Il bei etwa 120 mM Natriumchlorid eluiert, PGI bei etwa 25OmM. Aktive Enzymfraktionen, welche PGI oder PG Il enthalten, werden nach der Dialyse anhand eines 2OmM-Natriumacetatpuffers, pH-Wert 5,7, auf ein Endvolumen von 25ml auf einer kleinen DEAE-Sepharose-Schnellflußsäule (1,6cm x 10cm) durch Eluieren mit 1M Natriumchlorid in diesem Puffer konzentriert. Die abschließende Reinigung jedes der beiden Enzyme PGI und PG Il wird durch Gelpermeationschromatographie auf Sephacryl S200 (1,6cm x 90cm) in 0,1 M Natriumacetat, pH-Wert 4,2, erreicht.
PG Il weist eine einzelne Bande bei SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf und hat eine scheinbare Molekülmasse von 38kDa. Die spezifische Aktivität beträgt 2760 Einheiten/mg Protein, bestimmt in einem 0,075 M-Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,2. Bei isoelektrischer Fokussierung zeigt das Enzym Mikroheterogenität. Neben einer ausgeprägten Hauptkomponente bei einem pH-Wert von etwa 5,2, wird eine große Zahl von kleineren Banden im pH-Wert-Bereich von 4,6 bis 5,9 beobachtet.
PGI weist bei SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ebenfalls eine Bande auf. Dieses Enzym hat eine scheinbare Molekülmasse von 55kDa. Die spezifische Aktivität beträgt 555 Einheiten/mg Protein, bestimmt in einem 0,075 M-Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,2. Beim isoelektrischen Fokussieren weist das Enzym auch Mikroheterogenität auf. Im pH-Wert-Bereich von 3,2 bis 3,5 werden mehrore Banden beobachtet.
die in 0,02 M Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,7, äquilibriert worden war. Die Enzyme werden aus der DEAE-Sephadex-Säule miteinem linearen Natriumchloridgradienten (0-1 M) eluiert. PGIVeluiert bei 0,38M Natriumchlorid, PG III A und PJG III BcoeluierenbeiO,5M.
5ml von jeder der beiden Enzymfraktionen werden auf einer Sephacryl-S-200-Säule (1,6cm x 90cm) in 0,1 M
verdünnt und einer MONO Q-Säule (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) zugeführt, die in 0,02 M bis-Tris/HCI-Puffer,pH-Wert 5,8, äquilibriert worden war. Bei Anwendung eines linearen Natriumchloridgradienten von 20ml (0,1-0,4M) eluiert
chromatographiert. Fraktionen mit PG-Aktivität werden zusammengefaßt, anhand eines 0,025M-Piperazin/HCI-Puffers,pH-Wert 6,0, dialysiert, und einer Säule MONO P (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) zugeführt, die in dem gleichen
pH-Wert 3,0, bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,75 ml/min eluiert.
(LKB, Bromna, Schweden), die in 0,05M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,2, äquilibriert worden war,
einzige Bande bei SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und hat eine scheinbare Molekülmasse von 59kDa, bestimmt durch
0,075M Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,2. Bei isoelektrischer Fokussierung zeigt das Enzym eine einzige, scharfe Bande beieinem pH-Wert von 3,7.
scheinbaren Molekülmasse von 32 bzw. 52kDa. Bei SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (15% Polyacrylamidgel) aber weisenbeide Enzyme eine einzige Bande mit einer identischen Molekülmasse von 57 kDa auf. PG III A und PG III B haben eine spezifische
beschriebene Weise gereinigt. Die Eigenschaften dieser gereinigten Enzyme werden in der Tabelle Il zusammengefaßt.
| Enzym | Mr* | I.E.P." | pH-Wert-Optimum |
| (Aktivität) | |||
| PGI | 55 K | 3,2-3,5 | 4,9 |
| PGII | 38 K | 4,6-5,9 | 4,8 |
| PGIIIA | 57 K | 3,3 | 4,3 |
| PGIIIB | 57 K | 3,3 | 4,5 |
| PGIV | 59 K | 3,7 | 4,8 |
a Durch SDS-Gelelektrophorese bestimmter, extrapolierter Wert.
b Isoelektrischer Punkt, durch isoelektrische DOnnschlchtfokuseierung bestimmt.
Alle gereinigten Enzyme haben auf einem 15%igen SDS-Polyacrylamidgel eine scheinbare Molekülmasse im Bereich von 55-59 kDa, ausgenommen nur PGII, die ein viel kleineres Protein zu sein scheint (38 kDa). Der besondere Charakter von PGII wird durch den relativ hohen isoelektrischen Punkt im Vergleich zu den niedrigen Werten des isoelektrischen Punktes, der für die anderen Polygalacturonasen bestimmt wurde, unterstrichen. Das pH-Wert-Optimum aller Polygalacturonast η liegt im gleichen Bereich (4,3-4,9).
Spezifische Antikörper gegen gereinigte PGI und PG Il werden in männlichen weißen Neuseelandkaninchen nach dem von Uitzetter (Ref. 33) beschriebenen Immunisationsschema gezogen.
Wie unten ausgeführt wird, wird zwischen den beiden Antiseren und den fünf gereinigten Polygalacturonasen Kreuzreaktivität beobachtet. Auf ein 10%iges SDS-Polyacrylamidgel werden 0,4 bis '\fi\ig gereinigtes Protein gegeben und nach der Elektrophorese von dem Gel auf eine Nitrocellulosemembran unter Anwendung der von Bowen u.a. (Ref. 37) beschriebenen Methode übertragen. Die Inkubation des Nitrocellulose-Blots mit den spezifischen Antiseren, gefolgt vom Färben mit peroxidasemarkiertem Ziegen-Antikaninchen-lgG, wird nach Uitzetter ausgeführt (Ref. 36). Nach der Inkubation mit dem PG !-spezifischen Antiserum wird ein starkes Signal für PGI und die PG III A, III B und IV festgestellt. PG Il ergibt bei diesem Antikörper ein etwas schwächeres Signal. Die Inkubation des Blots mit PG ll-spezifischem Antiserum ergibt eine Hochintensitätsbande für PGII, für die anderen vier Polygalacturonasen aber nur schwache Banden.
Beispiel 1.3: Bestimmung der Aminosäuresequenz von Cyanogenfragmenten der Polygalacturonase Il Etwa 100pg der PG Il werden in 150μΙ 70%iger Ameisensäure aufgelöst, und ein festen Cyanogenbromid wird in einem einhundertfachen Molüberschuß Methionin zugesetzt (wovon 4 Reste je Enzymmolekül auftreten). Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur in einer verschlossenen Reaktionsphiole 24 Stunden lang ständig gerührt. Nach 24 Stunden wird Wasser
zugesetzt, und das Präparat wird durch Spülen mit N2 getrocknet. Dieser Schritt wird zur Entfernung der Ameisensäure wiederholt.
Nach der Elektrophorese auf 15%igon SDS-Polacrylamidge!en können etwa 10 einzelne Banden durch Coomassie-Brilliantblau gefärbt werden. Sie stellen unvollständig und vollständig gespaltene Fragmente dar. Neben dem intakten Protein, ι. as eine Molekülmasse von 38kDa hat, werden die folgenden Banden beobachtet: 33,30,27,19,17,12,10,7,5,6 und 6kDa. Durch Probenahme in regelmäßigen Abständen während der 24stündigen Reaktionsperiode und durch deren Analyse durch SDS-Polyacrylamidgelslektrophorese wurden die Reihenfolge, in welcher die partiellen und abschließenden Reaktionsprodukte auftreten, sowie deren Position zueinander bestimmt. Das 17 kDa-Fragment ist ein Innenfragment, während das 5 kDa-Fragment sich entweder am C- oder N-Ende befindet. Die Fragmente der 24-Stunden-Behandlung werden dann auf Immobilon-P geblottet, eine Polyvinylidendifluoridmembran (Millipore), nach dem von Matsudaira u.a. (Ref.4) beschriebenen Verfahren. Drei Fragmente werden für die Gasphasensequenzierung verwendet, ein 17 kDa-Fragment und zwei kleinere Fragmente (5 und 6kDa). Aminosäuresequenzen werden mit einem Proteinsequenator der Applied Biosystems, Modell 470A, bestimmt, welcher direkt mit einem Analysator von Applied Biosystems, Modell 120A PTH, verbunden war. Membranfragmente, die 0,5-1 nMol eines bestimmten Peptids enthalten, werden gewaschen, auf den Gasphasensequenator gegeben und nach dem von Amons beschriebenen Programm der Sequenzanalyse unterzogen (Ref. 5)
Für das 5kDa-Fragment wird folgende Sequenz ermittelt:
Position: 1 5
Aminosäure: asp-ser-X-thr-phe-thr-thr-ala-Position: 10 12 13
In Position 3 (X) wird keine Aminosäure festgestellt. Da das angewendete Sequenzierungsprogramm Cysteinreste nur entdeckt, wenn das Protein vorher S-pyridylethyliert wird, ist es wahrscheinlich, daß die Position 3 ein Cystein sein kann (Amons, Ref. 5). In den Positionen 12 und 13 werden Spuren von ala gefunden, wie durch die Klammern angegeben wird. Während sich die Spur in Position 12 eindeutig aus einer unvollständigen Reaktion in dem vorangegangenen Schritt ergibt, stellt das niedrige Signal von ala in der Position 13 die Aminosäure ala in der Position 13 des Peptids dar.
Position: 1 5
Aminosäure: ala-phe-ser-val-gln-ala-asn-Position: 10
Die Spuren von Isoleucin und Threonin, die in den beiden letzten Schritten beobachtet und durch Klammern angegeben werden, c. lultieren eindeutig aus UM.oilständigen Reaktionen in uen vorausgegangenen Schritten.
Beispiel 1.4: Bestimmung der Aminosäuresequenz des N-terminalen Teils von Polygalacturonase I Es werden 100 \ig von PGI, die nach Beispiel 1.1.1 gereinigt worden war, dreimal anhand von 11 Millipore-gefiltertem Wasser dialysiert und lyphilisiert. Die Aminosäuresequenz wird wie im Beispiel 1.3 bestimmt. Für das Enzym wurde folgende N-terminale Aminosäuresequenz bestimmt:
Position: 1 5
Aminoisäure: ala-ser-thr-X-thr-phe-thr-Position: S
Die Cysteinreste im Protein wurden nicht modifiziert und werden folglich nicht entdeckt. Es ist wahrscheinlich, daß Cystein in Position 4 (X) der Sequenz vorhanden ist. Die N-terminale Aminosäuresequenz von PGI weist Homologie mit der Aminosäuresequenz des 5 kDa-Cyanogenbromidfragments von PG Il auf, das aus Rapidase isoliert wurde (Beispiel 1.3), und mit der N-terminalen Aminosäuresequenz von PGII, die aus dem A. niger-Transformanten N 593/pGW 1800-27 (Beispiel 6.3) isoliert wurde. Diese Homologie wird im folgenden Schema unterstrichen, in welchem angenommen wird, daß Cystein in der Position 4 und 3 von PGI- bzw. PG Il-Sequenzen auftritt:
von Polygalacturonase Il wird eingeführt, um die beiden Sequenzen auszurichten.
vorhanden, dafür ist im letzteren Fall eine ähnliche Aminosäure, d. h., eine kleine Hydroxylaminosäure f ι hreonin), vorhanden.
beispielsweise einer partiellen proteolytischen Spaltung, sein können. Es wird geschlußfolgert, daß PGI und PG Il durchverschiedene Gene derselben Familie codiert werden.
Beispiel 1.5: Bestimmung der Aminosäuresequenz von Cyanogenbromldfragmenten von Polygalacturonase I Etwa 100Mg PGI werden in 150μΙ 70%iger Ameisensäure aufgelöst, und es wird festes Cyanogenbromid zugesetzt, um Fragmente i'es Proteins herzustellen, wie das im Beispiel 1.3 beschrieben wurde. Je Enzymmolekül sind 4 Methioninreste vorhanden, κ' cn der Elektrophorese auf 15%igen SDS-Polyacrylamidgelen und dem Färben mit Coomassie-Brilliantblau
werden größere Banden mit einer Molekülmasse von 39,5 35,21,19,5 und 5,5kDa beobachtet.
Die Fragmente zu 21 und zu 5,5 kDa werden unter Anwendung derselben Ausrüstungen und Verfahren wie im Beispiel 1.3 sequenziert.
Die Sequenz für das 21 kDa-Fragment lautet:
Position: 1
Aminosäure: ala-ser-thr-X-thr-phe-thr-. Position: 10
Aminosäure: ser-ala-sur-glu
Es ist wahrscheinlich, daß Cystein in der Position 4 (X) der Sequenz auftritt, ähnlich, wie das in den Beispielen 1.3 und 1.4 ,, beschrieben wurde. Die Sequenz des 21 kDa-Fiagmentes ist identisch mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des intakten PG I-Proteins, die im Beispiel 1.4 beschrieben wurde.
Das 5,5kDa-Fragment hat folgende Sequenz:
Position: 1 5
Aminosäure: ala-asp-gly-ala-val-ile-asp-Position: 10
·< Aminosäure: gly-asp-gly-ser
Es wird-geschlußfolgert, daß das 5,5kDa-Fragment nicht mit dem N-Ende des Proteins übereinstimmt. Grundlage dafür sind die Sequenzdaten.
Beispiel 1.6: Bestimmung der Aminosäuresequenz von einem tryptlschen Peptid PG Il wird durch Dialyse anhand von 0,5%iger Ameisensäure partiell denaturiert und anschließend gefriergetrocknet. Das Enzym (1 mg) wird in 1 ml einer 0,2 M N-Ethylmorpholinacetatpufferlösung, pH-Wert 8,0, suspendiert und dann bei 37"C mit Trypsin (Sigma) inkubiert, das in einem Molverhältnis von 1:50, bezogen auf PGII, zugesetzt wird. Nach 24 Stunden wird das Digerieren durch den Zusatz von Essigsäure (abschließende Konzentration 30%) gestoppt. Das Digerierte wird gefriergetrocknet. Proben des Digerierten werden in 0,1%iger Trifluoressigsäure aufgelöst.die 2,5mM Dithiothreitol enthält, und bei 370C wenigstens eine Stunde gehalten. Unter Anwendung eines Gerätes Spectra Physics SP 8000 HPLC, ausgestattet mit einer Nuclcosil C-18-Säule (4,6mm x 150mm) (Supelco) und einer Vydac-Vorsäule (Chrompack), werden trypische Peptide (Proben zu 100μΙ, die 100-200 μρ Protein enthalten) getrennt. Bei einer Säulentemperatur von 25°C, einer Durchflußgeschwindigkeit von 2 ml/min wird ein linearer Gradient angewei, Jet, der sich in 50min von 100% Lösungsmittel A (0,1 % TFA in Wasser) auf 50% Lösungsmittel A + 50% Lösungsmittel B (0,1 TFA in Acetnitril) ändert. Peptide werden durch UV-Absorption bei 214 nm festgestellt. Eines der Peptide, das spät während des Digerierens freigesetzt wird, scheint von den anderen Spitzen im Chromatogramm bei etwa 21 % Acetnitrli gut abgesetzt zu sein. Dieses Peptid wird durch Spülen mit trockener Luft bei 250C getrocknet und sequenziert. Die Aminosäuresequenz wird nach dem im Beispiel 1 4 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Sequen ί labtet:
Position: 1 5
Aminosäure: thr-ile-ser-gly-ala-thr-gly-Position: 10 14
Aminosäure: ser-val-ser-glu-ile-thr-tyr
Beispiel 2.1: Isolierung von hochmolekulargewichtiger DNA aus A. nlger N 400 Konidiosporen von dem Asperglllus niger-Stamm N 400 werden mit einfer abschließenden Sporendichte von 10e Sporen/ml in 200ml Minimalmedium inokuliert und in I-I-Erlenmeyerkolben 24 Stunden lang bei 28°C mit 300 U/min unter Verwendung eines Drehrüttlers von New Brunswick geschüttelt. Das Mycel wird durch Filtern mit einem Büchner-Trichter mit Myracloth geerntet, mit kalter, steriler Salzlösung gewaschen, in flüssigem Stickstoff gefroren und entweder bei -600C gelagert oder direkt verwendet. Die Methode, die zur Isolierung der DNA für die Herstellung der Genombank angewendet wird, basiert auf dem von Yelton u.a. (Ref. 18) beschriebenen Verfahren.
Für den Aufbau der Bank werden 10g Mycel in flüssigem Stickstoff in Portionen zu 1 g in einem Braun-Mikrodismembrator gemahlen. Das gemahlene Mycel wird auf einen sterilen I-I-Erlenmeyerkolben übertragen, der 200ml Extraktionspuffer (5OmM EDTA, pH-Wert 8,5,0,2% SDS) und 200 μΙ Diethylpyrocarbonat enthält. Das Gemisch wird langsam auf Zimmertemperatur erwärmt und dann für die Dauer von 20min unter gelegentlichem Schütteln bei 680C erhitzt. Die Suspension wird auf Zimmertemperatur abgekühlt und 15min bei 12000 χ g zentrifugiert. Dem Überstand wird ein Volumen von Vie einer 8M Kaliumacetatlösung, pH-Wert 4,2, zugesetzt, und man läßt das Gemisch eine Stunde lang auf Eis. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren (20 min; 16000 χ g; 40C) entfernt. Die Nucleinsäuren werden aus dem Überstand durch Inkubation mit einem 0,6-Volumen von Isopropanol auf Eis für die Dauer von 15min ausgefällt. Die ausgefällte Nucleinsäure wird durch Zentrifugieren (10min; 6000 x g; 40C) aufgefangen, mit70%igem Ethanol gewaschen und kurz getrocknet. Das Pellet wird in 10ml TE, das 20μς/ιηΙ Rnase A (Boehringer, Mannheim) enthält, suspendiert und für die Dauer von 15min bei 370C inkubiert. Die DNA wird mit nucleasefreier Pronase (Konzentration abschließend 1 mg/ml) behandelt (Hochlight, Coinbrock), für die Dauer von einer Stunde bei 370C. Die Pronase-Vorratslösung in TE-Puffer enthält 20 mg/ml E-nzym, das bei 370C für eine Stunde vorinkubiert ist, um Nucleasen zu digerieren.
In 9ml der so gewonnenen DNA-Lösung werden 8,5g CsCI aufgelöst, es werden 0,2 ml 10 mg/ml Ethidiumbromid zugesetzt, und diese Lösung wird entweder für die Dauer von 60 Stunden bei 33000 U/min in einem Beckman-SW41 -Rotor oder für die Dauer
von 40 Stunden bei 45000U/min in einem Beckman-50-Ti-Rotor zentrifugiert. Die DNA-Bande wird aufgefangen, und das Ethidiumbromid wird durch Mehrfachextraktion mit Isopropanol, das mit einer gesättigten Lösung von NaCI in Wasser äquilibriert worden war, entfernt. Es werden 5 Volumen TE zugesetzt, und die DNA-Lösung wird nacheinander mit TE-gesättigtem Phenol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25:24:1 und Chloroform/Isoamylalkohol 24:1 behandelt. Die DNA wird durch den Zusatz von 0,1 Volumen 3 M Natriumacetatlösung, pH-Wert 5,2,2,5 Volumen Ethanol und eine Inkubation bei -20°C über Nacht ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren (1 Stunde, 30000 χ g, 4°C) aufgefangen, mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 400 μΙ TE aufgelöst.
Beispiel 2,2: Partielles Digerieren von A. nlger-N400-DNA mit Mbol und Isolierung der Fragmente Um die Mbol-Konzentration zu bestimmen, welche die größte Menge an DNA-Fragmenten zwischen 13,6 und 23kbp ergibt, werden Portionen zu 1 \ig von A. nigor-N 400-DNA in dem angemessenen Puffer, der vom Lieferer empfohlen wird, mit abnehmenden Mengen von Mbol (0,5 bis 0,001 Einheiten) für die Dauer von einer Stunde bei 37°C in einem Volumen von 10μΙ digeriert. Die Reaktion wird durch den Zusatz von 1 μΙ 0,25 M EDTAgestoppt, und die Proben werden auf ein 0,6%iges Agarosegel in TBE-Puffer, das 1 Mg/ml Ethidiumbromid enthält, übertragen. Angemessene Größenmarker sind ein Gemisch aus Lambda-DNA und Lambda-DNA, digeriert mit BgI III, was Banden von 49,22,8,13,6,9,8,2,3kbp und ein nichtsichtbares Fragment von 0,45kbp ergibt. Die erforderliche Mbol-Konzentration, um einen hohen Ertrag der gewünschten Fragmente von 13,6-23 kbp zu erreichen, beträgt etwa 0,02 Einheiten^g DNA. Demzufolge werden 200Mg der DNA in einem Gesamtvolumen von 2 ml digeriert und in 20 gleiche Aliquote unmittelbar nach dem Zusatz des Enzyms geteilt. Nach einer Stunde bei 370C wird das Digerierte jeweils auf Eis gegeben. Nachdem eine Ι-μΙ-Probe durch den Durchlauf auf einem Gel auf richtiges Digerieren geprüft worden war, wird EDTA bis zu einer Endkonzentration von 25mM zugesetzt, das Enzym wird durch eine Behandlung bei 650C für die Dauer von 10 min wärmeinaktiviert, die Proben werden zusammengefaßt, und die DNA wird ausgefällt, gewaschen, getrocknet und in 400μΙ TE aufgelöst.
Die fragmentierte DNA wird auf einem 0,4%igen präparation Agarosegel (Mittelvertiefung 120 mm χ 1,5 mm) getrennt. Lambda-DNA, die mit BgIII digeriert wurde, wird als Marker verwendet, um die Größe der partiell digerierten DNA-Fragmente nach Elektrophorese bei 4°C und 40V (3 V/cm) zu bestimmen. Der Gelbereich, welcher Fragmente in der korrekten Größe enthält, wird aus dem Gel herausgeschnitten, und die DNA wird aus dem Gel in einem sterilen Dialyserohr in 2ml TBE bei 100V über die Dauer von 2 bis 3 Stunden elektroeluiert. Der Strom wird für die Dauer von 30s umgekehrt, und der Puffer, der die DNA enthält, wird aufgefangen. Anschließend werden die Fragmente durch Ethanolausfällung konzentriert und in 100μΙ TE aufgelöst.
In EMBL4
von 100μΙ für die Dauer von 2 Stunden bei 370C vollständig digeriert. Das Enzym wird durch 10min bei 650C inaktiviert. Die
bei 370C anschließen. Nach dem Zusatz von EDTA auf 25mM und der Inaktivierung des Enzyms dOminütiges Erhitzen boi 65°C)wird die Lösung mit gleichen Volumen von Phenol (TE-gesättigt), Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25:24:1 und Chloroform/
15 Minuten Zentrifugieren bei 12000 x g bei 4°C wird der Niederschlag gründlich mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknetund in 40μΙ TE aufgelöst.
Es ist wesentlich, daß die cos-Orte nach dem Beispiel 2,3 hergestellten Vektors vor der Ligationsreaktion hybridisiert werden. Der Vektor in 10OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5, und 1OmM MgCI2 wird 10min bei 650C erhitzt und dann eine Stunde lang bei 420C hybridisiert. Aus Versuchsligationen wird ermittelt, daß ein Verhältnis von Vektor zu Fragment von annähernd 1:1 (Gewichtsgrundlage) die meisten Rekombinanten ergibt. Die Ligation erfolgte in 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI2, 1OmM DTTund 1mM ATP unterVerwendung von 9,5pg Vektor und 10μg DNA-Fragmente in einem Gesamtvolumen von 100μΙ. DNA-Ligase (BRL) wird bei einer Konzentration von 0,5 Einheiten^g DNAzugesetzt, und das Ligationsgemisch wird über Nacht bei 140C inkubiert. Um auf Ligation zu prüfen, wird eine Probe der ligierten DNA auf ein Agarosegel gegeben. Außerdem wird zur Kontrolle eine Vektormenge von 0,5Mg ohne den Zusatz der Fragmente in einem ö-pl-Volumen ligiert. Das große Volumenligationsgemisch wird durch Ethanolausfällung konzentriert und in 20 μΙ TE vor der In-vitro-Verpackung aufgelöst. Die In-vitro-Verpackung erfolgt mit Promega-Packagene-Extrakten nach den Instruktionen des Herstellers unter Verwendung von ΙΟ-μΙ-Portionen zur Verpackung von 1 μg DNA. Als Kontrolle wird gesondert 1 μΙ des hochmolekulargewichtigen Kontrollphagen Lambda el 857 Sam 7, der mit den Extrakten geliefert wird, gesondert verpackt. Nach dem Verpacken werden 500 μΙ des Phagenlösungspuffers (PSB) und 5 μΙ Chloroform zugesetzt. Die rekombinanten Phagenvorräte können bei 40C gelagert werden. Die gewonnene Bank wird aus zwei getrennten Ligationsexperimenten konstruiert.
Zellen von E. coll NM 539 werden auf einem LB-Medium gezogen, das 0,2% Maltose, 1OmM MgSO4 und 1 mM CaCI2 enthält, bis zu einer optischen Dichte (600 nm) von 1,0. Zu 0,1 ml einer geeigneten Phagenverdünnung in PSB werden Aliquote dieser Kultur zu 0,2ml gegeben. Nach der Adsorption der Phagen für die Dauer von 20 Minuten bei 370C werden 3ml 0,6%iges LB-Top-Agar mit einer Temperatur von 45°C zugegeben, das Gemisch wird auf LB-Agar-Platten plattiert, und diese werden über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Anzahl der plaquebildenden Einheiten (pfu)je ml Phasensuspension beträgt 12 χ 105 und 4,2 x 106pfu/ml bei den beiden nach Beispiel 1.4 hergestellten Phagenvorräten. Nachdem der Hintergrund subtrahiert wurde, welcher aus den Kontrolligationen ohne Fragmente berechnet wurde (17% bzw. 40%), beträgt die absolute Zahl der Rekombinanten 6 χ 106. Die in den Rekombinanten enthaltene DNA ist mehr als 200 Genomen von Aspergillus niger gleichwertig.
Um eine Bankzu verstärken, werden βΟμΙ-Aliquote der beiden Phagenvorräte zur Infektion von E. coll-NM 539-Zellen verwendet, die in LB-Top-Agarose auf LB-Agarplatten plattiert und dann über Nacht bei 37°C inkubiert werden. Die Phagen werden aus der Agarose durch sanftes Schütteln der Platten mit 5ml PSB je Platte für die Dauer von einer Stunde bei Zimmertemperatur eluiert. Der PSB wird aufgefangen, zentrifugiert (10min bei 6000 χ g), um die Bakterien zu entfernen, und es wird Chloroform (0,5% Endkonzentration) zugesetzt. Beide Phagenvorräte, die etwa im gleichen Umfang verstärkt werden, werden dann gemischt (40ml Vorrat), titriert (8 χ 109pfu/ml) und bei 40C aufbewahrt.
Beispiel 3.1: Synthese von Ollgonuclaotidgemlschen mit der Codierung für das 17kDa-Cvanogenbrom!dfragment von Polygalacturonase Il
Die Oligonucleotide zum Prüfen der Genombank von Aspergillus nlger, die nach Beispiel 2 hergertellt wurden, werden unter Anwendung der Phosphoramiditmethode (M. H. Caruthers, Ref. 8) mit einem Oligonucleotidsynthesizer von Applied Biosystems (Modell 280B) synthetisiert. Das *7 kDA-Cyanogenbromidfragment, das im Beispiel 1.2 beschrieben wurde, ist ein innen befindliches Peptid. Daher kann die im Beispiel 1.4 bestimmte Aminosäuresequenz an N-Ende mit einem Methioninrest erweitert werden. Die synthetisierten Oligonucleotide sind komplexe Gemische, da die Degeneration des genetischen Codes berücksichtigt wird. Aus technischen Gründen ist es notwendig, die Anzahl der Nucleotide im Gemisch zu verringern. Um die Oligonucleotide mit der falschen Kombination TG und AC an der Position 10 und 11 auszuschließen und um die Größe des Gemischs zu begrenzen, werden zwei getrennte Gemische von Oligonucleotiden, die der Sequenz im Codierungsstrang entsprechen, unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes synthetisiert. Die Anzahl der erforderlichen Oligonucleotide wird außerdem durch Einführung von Inosin als Taumetbasis an vier verschiedenen Positionen der synthetisierton 29-mere verringert, und so besteht jedes Gemisch aus 16 verschiedenen Oligonucieotiden (Ohtsuka u.a., Ref. 16). Die beiden Gemische, die als HR6195 und HR 6196 bezeichnet werden, stellen DNA dar, welche die folgende Aminosäuresequenz codiert und folgende Zusammensetzung hat:
Aminosäuresequenz: met ala phe ser val gin ala
HR6195: 5'(d) ATG GCI TTR, TCI GTI CAR2 GCI
HR6190: 5'(d)ATG GCI TTR1 AGI GTI CAR2 GCI
| Aminosäuresequenz: | asn | asp | tie |
| HR6195: | AAR1 | GAR1 | AT 3' |
| HR6196: | AAR1 | GAR1 | AT 3' |
worin I Inosin ist, R1T oder C ist und R2 A oder G ist.
Das ö^kDa-Cyanogenbromidfragment, das in Beispiel 1,5 beschrieben wurde, ist ein innen befindliches Peptid, das durch CNBr-Spaltung hergestellt wird. Seine Aminosäuresequenz kann daher am N-Ende mit einem Methioninrest erweitert werden.
Die Anzahl der erforderlichen Oligonucleotide wird durch Einführung von Inosin als Taumelbasis an fünf verschiedenen Stellen der 32-mere, die synthetisiert werden, verringert.
Dadurch wird das Gemisch auf 24 Oligonucleotide begrenzt. Das als HR6298 bezeichnete Gemisch stellt DNA dar, welche die folgende Aminosäuresequenz codiert und folgende Zusammensetzung hat:
| Aminosäuresequenz: | met | ala | asp | giy | ala | val | tie | asp |
| HR 6298: | 5'(d)ATG | GCI | GAR, | GGl | GCI | GTI | ATR2 | GAR1 |
| Aminosäuresequenz: | giy | asp | giy | |||||
| HR 6298: | GGI | GAR1 | GG 3', |
worin I Inosin ist, R, T oder C ist und R2 T, C oder A ist.
Beispiel 3.3: "P-Markierung von Oligonucleotiden
Die lyoph.lisierten Oligonukleotidgemische HR6195, MR6196 und HR6298 werden in Konzentrationen von 29μΜ in Wasser aufgelöst. Proben dieser Lösungen werden zur Herstellung des Reaktionsgemischs zehnfach verdünnt. Das Reaktionsgemisch ist zusammengesetzt aus entweder 20 pMol Oligonucleotidgemisch HR6195, zusammen mit 20 pmol HR6196, oder nur aus 4G pmol HR6298,L4 pmol [V-32P]-ATP(NEN,6000Ci/mmol) und30 EinheitenT4-Polynucleotidkinase(BRL) in 50μΙ Kinasepuffer, der aus 5OmM Trie HCI (pH-Wert 7,6), 1OmM MgCI2,5mM DTT, 0,1 mM EDTA und 0,1 mM Permidin besteht (Maniatis u. a., Ref. 6, S. 122). Die Inkubalion wird bei 37 0C für die Dauer von 30min ausgeführt. Die Reaktion wird durch den Zusatz von 4 μΙ 0,5 M EDTA (pH-Wert 8,0) beendet. Die Reaktionsgemische werden ohne Reinigung zum Prüfen der Genombank (Beispiel 3.4) oder Sondieren von Southern-Blots (Beispiel 3.6) verwundet.
Ein Teil der oben (Beispiel 2) beschriebenen Genombank von dem Aspergillus nlger-Stamm N 400 wird in SM verdünnt, und Portionen zu 0,1 ml, die jeweils etwa 2000pfu enthalten, werden plattiert. Wirtszellen werden durch Inokulierungen von 50ml LB-Medium, ergänzt mit 0,2% Maltose, mit 0,5 ml einer Übernachtkultur von E. coll-NM 539 in LB-Medium, vierstündiges Schütteln mit 250 U/min auf einem Gallenkamp-Orbitalrüttler bei 37 0C, gefolgt vom Zusatz von 0,5 ml 1M MgSO4 und von 0,5 ml 0,5MCaCI2, präpariert. Aliquote zu 0,2 ml dieser Zellen werden jeweils mit einer0,1-ml-Portion der Phagensuspension gemischt, und diese Gemische werden bei Zimmertemperatur eine halbe Stunde lang inkubiert. Dann werden 3ml von 0,7%iger Agarose
in LM-Medium bei 470C zugesetzt, kurz gewirbelt und sofort auf LM-Agar-Platten plattiert. Die Platten werden über Nacht bei 370C inkubiert und 2 Stunden lang bei 4°C abgeschreckt.
Von jeder Platte werden zwei Repliken nach der Plaquehybridisationsmethode von Benton und Davis (Ref.7) hergestellt. Der erste Filter (Schleicher und Schuell BA85) wird oben auf die Platte für 1 min, die zweite Replik für 2mh > gegeben, und die Position der Repliken wird unter Verwendung von Ausziehtusche markiert. Nach Abnahme der Filter werden Me in eine Scha!'; gegeben, in der sich 100ml einer denaturierenden Lösung (1M NaCI, 0,5M NaOH) befinden, Dauer 0,5min, dann iui 1 min in 100ml neutralisierende Lösung (0,5M Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1,5M NaCI). Die Filter werden in eine Schale gegeben, die 3 χ SSC enthält, und werden mit einer behandschuhten Hand vorsichtig gerieben, um Bakterientrümmer zu entfernen, und sie werden mit 3 x SSC gespült. Die Filter werden geblottet, 10 min bei Zimmertemperatur getrocknet und auf einem Whatman-3 MM-Papier in einem Ofen bei 8O0C 2 Stunden lang gebacken.
Die gebackenen Filter werden in 3 χ SSC benetzt, in dieser Lösung eine Stunde lang bei Zimmertemperatur gewaschen und dann auf eine Schale übertragen, in der sich 250ml vorgewärmtes (650C) Prähybridisationsgemisch befinden, das aus 2 x SSC besteht, wenn das Oligonucleotidgemisch HR6195 und HR6196 verwendet wird, und aus 1 χ SSC, wenn das Oligonucleotidgamisch HR6298 verwendet wird, außerdem aus 10 x Denhardts (0,2% BSA, Boehringer-Fraktion V; 0,2% Ficoll 400, Pharmacia; 0,2% Polyvinylpyrrolidon-10, Sigma), 0,1 % SDS und 0,1 mg/ml gescherter und frisch denaturierter Heringsperma-DNA. Die Vorhybridisation erfolgt 5 Stunden lang in einem Rüttelwasserbad bei 650C. Anschließend werden die Filter einmal eine halbe Stunde lang in 250ml vorgewärmten (65°C) Hybridisationsgemisch gewaschen, das mit dem Prä- oder Vorhybridisationsgemisch bis auf den Wegfall der Heringsperma-DNA identisch ist. Dann werden die Filter in eine andere Schale gegeben, die 150 ml des vorgewärmten (650C) Hybridisationsgemische enthält, dem die vorher markierten kombinierten Oligonucleotidgemische HR6195 und HR6196 (Beispiel 3.1) oder das markierte Gemisch HR6298 frisch zugesetzt worden waren. In dem Fall, in welchem HR6195 und HR6196 eingesetzt werden, wird die Schale in das Rüttelwasserbad bei 650C gebracht, der Thermostat wird auf 470C eingestellt, und man läßt die Hybridisation 14 Stunden fortschreiten. Die Filter werden einmal für die Dauer einer halben Stunde in 250ml vorgewärmtem (470C) Hybridisationsgemisch bei 470C gewaschen, gefolgt vom Waschen bei Zimmertemperatur mit zwei Wechseln in 250ml 2 x SSC, jeweils für die Dauer von 45 min. Eine strenge Waschung wird durch Übertragung der Filter auf eine Schale durchgeführt, in der sich 250ml vorgewärmtes (630C) 6 χ SSC, 0,05% Natriumpyrophosphat befinden, und anschließendes Inkubieren in einem Rüttelwasserbad bei 630C für die Dauer von 30 min. Dann werden die Filter bei Zimmertemperatur mit zwei Wechseln in 2 χ SSC für jeweils 30min gewaschen. Die Filter worden an der Luft getrocknet, auf einer Auflage von Whatman-3MM-Papier fixiert, mit einer Plastehülle bedeckt und drei Tage lang bei -600C unter Verwendung eines intensivierenden Schirms einem Kodak-Film XAR5 ausgesetzt.
Auf diese Weise werden von den sechs geprüften Platten 6 positive Signale gewonnen. Positive Plaques werden mit einer sterilen Pasteur-Pipette ausgestanzt, wozu die Platten sorgfältig auf dem Autoradiogramm unter Verwendung der Tuschmarkierungen positioniert werden. Die Stücke des Agars, welche die positiven Plaques enthalten, werden zu 1 ml SM gegeben, und es werden 2,5μΙ Chloroform zugesetzt. Man läßt die Phage bei Zimmertemperatur für die Dauer von einer Stunde bei gelegentlichem Wirbeln diffundieren, und dann wurde über Nacht bei 40C inkubiurt. Das Agar und die Bakterienzelltrümmer werden durch fünfminütiges Zentrifugieren entfernt, es werden 2,5μΙ Chloroform zugesetzt, und die Phagenvorräte werden bei 4°C gelagert.
Die positiven Klone werden als XC bis KG und M bezeichnet. Da die Phagen mit hoher Dichte plattiert sind, werden die positiven Plaque zweimal durch Plattieren auf geringe Dichte und Wiederholung des gesamten Verfahrens der Replikverdopplung, Hybridisierung und Herausnahme der positiven Plaques gereinigt.
In dem Fall, in welchem das Oligonucleotidgemisch HR 6298 verwendet wird, wird die Schale in das Rüttelwasserbad bei 650C gegeben, der Thermostat wird auf 520C eingestellt, und man läßt die Hybridisation 14 Stunden lang ablaufen. Dann werden die Filter einmal in 250ml vorgewärmten (520C) Hybridisationsgemisch für die Dauer einer halben Stunde bei 520C gewaschen, gefolgt vom Waschen bei Zimmertemperatur mit zwei Wechseln von 250ml 2 χ SSC, jeweils über 45 Minuten. Anschließend wird die strenge Waschung durch Übertragung der Filter auf eine Schale durchgeführt, die 250 ml vorgewärmtes (640C) 4 x SSC, 0,05% Natriumpyrophosphat enthält, und anschließendes Inkubieren für eine halbe Stunde in einem Rüttelwasserbad bei 640C. Dann werden die Filter bei Zimmertemperatur mit zwei Wechseln von 2 χ SSC für jeweils 30 min gewaschen. Die Filter werden an der Luft getrocknet, auf einer Auflage von Whatman-3MM-Papier fixiert, mit einer Plasthülle abgedeckt und drei Tage lang unter Verwendung eines intensivierenden Schirms bei -6O0C einem Kodak-Film XAR 5 ausgesetzt.
Auf diese Weise erhält man von den sechs geprüften Platten neun positive Signale. Positive Plaque werden mit einer sterilen Pasteur-Pipette unter sorgfältiger Positionierung der Platten auf dem Autoradiogramm unter Nutzung der Tuschmarkierungen ausgestanzt. Die Stücke des Agars, die positive Plaques enthalten, werden zu 1 ml SM gegeben, und es werden 2,5 μΙ Chloroform zugesetzt. Man läßt die Phage bei Zimmertemperatur unter gelegentlichem Wirbeln eine Stunde lang aus dem Agar diffundieren, und anschließend wird über Nacht bei 40C inkubiert. Das Agar und die Bakterienzelltrümmer werden durch fünfminütiges Zentrifugieren entfernt, es werden 2,5μΙ Chloroform zugesetzt, und die Phagenvorräte werden bei 4°C gelagert. Die positiven Klone werden PG Ι-λ 1-9 bezeichnet. Die positiven Plaques werden weiter durch Plattieren in geringer Dichte gereinigt, unter Verwendung des 1,2kbp-BamHI/EcoRI-Frag.T\entes von pGW 1803 (siehe Beispiel 3,8) als heterologe Sonde für die Hybridisation, die bei 6O0C ausgeführt wird, während das Waschen ebenfalls bei 6O0C in 2 χ SSC ausgeführt wird.
Um DNA aus den rekombinanten Klonen zu isolieren, werden die Phage zuerst verstärkt. Zu diesem Zweck worden E. coll-LE 392-Wirtszellen bis iu einer optischen Dichte (600 nm) von 1,0 in LB-Medium, das mit 1OmM MgSO4 und 0,2% Maltose ergänzt war, gezogen. Dann werden gesondert 50 μΙ der Vorräte der gereinigten Phage plattiert, wie das im Beispiel 2,5 beschrieben wurde. Nach der über Nacht ausgeführten Inkubation be! 370C wurden die Phage aus den nichtkonfluenten Platten dadurch eluiert, daß 5 ml SM über die Platten gestrichen und diese unter sanften Schütteln zwei Stunden lang inkubiert wurden. Die aluierten Phage werden geerntet, und es wird 0,1 ml Chloroform zugesetzt. Man läßt das Gemisch kurz wirbeln, und Zelltrümmer werden durch Zentrifugieren entfernt. Der Überstand wird gewonnen, es wird Chloroform auf 0,3% zugesetzt, und das resultierende Plattenlysat wird bei 40C gelagert.
Um für die Isolierung der Phagen-DNA annähernd konfluente Platten zu erhalten, werden Portionen zu 10 μΙ der Plattenlysate mit E. coll-LE392-Wirtszellen plattiert. Nach der Inkubation über Nacht bei 370C wird die Agaroseoberschicht von drei annähernd konfluenten Platten abgeschabt. Diese Schichten werden kombiniert, es werden 20ml SM und 0,4ml Chloroform zugegeben, und das resultierende Gemisch wird 30min bei 370C geschüttelt. Zelltrümmer und Agarose werden durch Zentrifugieren
entfernt, der Überstand wird gewonnen und sein Volumen mit SM auf 18ml abgestimmt. Es wird ein gleiches Volumen von 2M NaCI, 20% PEG 6000 (BDH, Poole, GB) in SM zugesetzt, und die Lösungen werden gemischt und auf Eis qesetzt. Nach 75min werden die Phagen pelletiert, dazu wird bei 12000 x g bei 4°C 20min zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert, und die restliche Flüssigkeit wird mit einem Kleenex-Gewebe entfernt. Das Pellet wird wieder in 3ml SM suspendiert und anschließend mit 3ml Chloroform extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit RNase A (67 pg/ml) und DNase I (33μς/ηΊΐ) 20min lang bei 370C behandelt. Dann wird dieses Gemisch durch den Zusatz von 2 ml Phenol, Wirbeln, den Zusatz von 1 ml Chloroform, erneutes Wirbeln und Trennen der beiden Phasen durch Zentrifugieren extrahiert. Die wäßrige Phase wird zweimal zusätzlich, mit 3ml Phenol/Chloroform (1:2) bzw. 3ml Chloroform, extrahiert. Dann wird die DNA aus der wäßrigen Phase durch den sequentiellen Zusatz von 0,3ml 3M Natriumacetatpuffer (pH-Wert 5,2) und 6ml Ethanol ausgefällt. Dieses Gemisch läßt man bei 40C 16 Stunden stehen, dann wird die DNA durch Zentrifugieren (10min, 12000 χ g, 40C) gewonnen. Das Pellet wird in 0,4 ml TE-Puffer aufgelöst, es wird RNase A biszu 200μ9/ΓηΙ zugesetzt und bei 370C eint Stunde lang inkubiert. Die DNA wird ausgefällt, dazu werden 38μΙ 3 M Natriumacetatpuffer (pH-Wert 5,2) und 0,8ml Ethanol bei 4°C zugesetzt, Sauer eine Stunde. Die DNA wird durch Zentrifugieren gewonnen und anschließend in 100μΙ ΊΈ-Puffei aufgelöst.
Aus den positiven Phagen, welche die PG Il-Gensequenzen enthalten, werden AD und λΕ für die weitere Analyse ausgewählt. Zuerst wird durch Restriktionsanalyse ermittelt, daß beide Phagen Einschöbe enthalten, welches aui demselben Bereich des A. nlger-Genoms abgeleitet sind, und dann v/ird eine partielle Restriktionskarte von XE konstruiert.
Es werden 2 μρ der Phagen-DNA mit 20 Einheiten EcoRI oder BamHI f^er der Kombination dieser Enzyme in einem Volumen von 100μΙ 3 Stunden lang bei 370C in dem vom Hersteller (BRL) empfohlenen Puffer und bei Anwesenheit von 0,8mg/mI RNase A digeriert. Dann werden 10μΙ eines 3 M Nntriumacetatpuffers (pH-Wert 5,2) zugesetzt, und das Gemisch wird mit 80 μΙ Chloroform extrahiert. Die DNA wird aus der wäßrigen Phase durch den Zusatz von 250 μΙ Ethanol ausgefällt, und das Gemisch wird 1 Stunde auf Eis gegeben. Die DNA wird durch Zentrifugieren aufgefangen, in 25μΙ von 1 x Probenpuffer aufgelöst und bei 650C 10min erhitzt. Die Proben werden auf einem 0,7%igen Agarosegel unter Verwendung von 1 μg Lambda-DNA (BRL), die mit Hindill als Giößenmarkern digeriert wurde, behandelt. Das Gel wird auf einer UV-Durchleuchtungsvorrichtung unter Verwendung eines Polaroidfilms 667 fotografiert. Die DNA wird auf eine Nitrocellulose-Membran von Schleicher und Schuell BA85 nach der Methode von Southern (1975) übertragen, wie das von Maniatis u. a., S. 382-386 (Ref. 6) beschrieben wurde. Dann wird die Membran gebacken und mit den kombinierten, markierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisiert, wie das im Beispiel 3.3 beschrieben wurde.
Fragmentlängen werden aus der Fotografie und den Autoradiogrammen durch Vergleich mit den bekannten Markerbanden berechnet. Die Größe von Fragmenten, die kleiner als 5kbp sind und nach dem Digerieren der DNA, die aus den Phagen AD und AE isoliert wurde, mit EcoRI, BamHI bzw. der Kombination dieser Enzyme ermittelt wurde, wird in der Tabelle III gegeben. Bei der Auflösungskraft des eingesetzten Elektrophoresesystems ist es nicht sinnvoll, Fragmente von größerer Länge zu vergleichen. Wie aus dem Vorhandensein einiger Bande mit reduzierter Intensität in den EcoRI-Aufschließungen, die in derTabelle III gezeigt werden, hervorgeht, hat EcoRI die DNA nicht vollständig digeriert. Die Fragmente, welche in der EcoRI/BamHI-Doppelaufschließung, nicht aber in einer der Einzelaufschließungen vorhanden sind, haben mit denen der BamHI-Fragmente im gleichen Größenbereich vergleichbare Intensitäten. Sie müssen daher vollständig digerierte Produkte darstellen. Die Fragmente, die mit den kombinierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisieren, sind im Falle von AE ein Fragment, das größer als 10kbp ist, in der BamHI-Aufschließung, ein 7,4kbp-EcoRI-Fragment und ein Fragment, das größer als 10 kbp ist, in der EcoRI-Aufschließung und ein 2,8kbp-Fragment sowie ein Fragment, das größer als 10 kbp ist, in der BamHI/EcoRI-Doppelaufschließung.
Im Falle von AD sind die Fragmente, welche mit den kombinierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisieren, die folgenden: ein Fragment, das größer als 10kbp ist, in der BamHI-Aufschließung, ein 5,8kbp-Fragment und ein Fragment, das größer als 10kbp ist, in der EcoRI-Aufschließung und ein 1,2kbp-Fragment sowie ein Fragment, das größer als 10kbp ist, in der BamHI/EcoRI-Doppelaufschließung. Wenn mehr Fragmente beobachtet werden, z. B. in den Aufschließungen mit EcoRI, wird das größere Fragment als ein Produkt betrachtet, das sich aus einer partiellen Spaltung ergibt. Die Hybridisation von Fragmenten gleicher Größe, die von AD und AE gewonnen wurden, mit den Oligonucleotidgemischen wird nicht beobachtet. Aus den Unterschieden in den oben aufgeführten Phagen AD und AE wird geschlußfolgert, daß die Phage AD und AE nicht identisch sind. Tabelle III führt jedoch zwei EcoRI-Fragmente, drei BamHI-Fragmente und wenigstens vier BamHI-EcoRI-Fragmente auf, die in AD und AE die gleiche Größe haben. Diese Phagen müssen ihren Ursprung in den Einschüben dieser Phagen haben, da der Vektor keine EcoRI- oder BamHI-Orte enthält, ausgenommen die BamHI-Orte, die zum Einfügen der Fragmente von Aspergillus-DNA in den Vektor verwendet wurden, und die EcoRI-Orte, welche diese BamHI-Orte flankieren und damit auch den Einschub flankieren (Frischauf u. a., Ref. 9). Es wird daher geschlußfolgert, daß die Einschübe der Phagen AD und AE aus demselben Bereich des A. nlger-Genoms abgeleitet wurden. In Verbindung mit der Tatsache, daß das relevante hybridisierende BamHI-EcoRI-Fragment von AD kleiner als das entsprechende Fragment von AE ist, z. B. 1,2 kbp im Vergleich zu 2,8kbp, und unter der Annahme, daß die beobachteten Unterschiode im Restriktionsmuster nicht das Ergebnis eines Klonierungsartefakts sind, ergibt sich, daß der EcoRI-Ort des hybridisierenden 1,2 kbp-BamHI-EcoRI-Fragmentes von AD nicht von A. Niger-DNA abgeleitet wird und einer der EcoRI-Orte ist, welche den Einschub dieses Phagen flankieren. Außerdem ergibt sich daraus, daß sich der Einschub von AD in einer Richtung höchstens 1,2 kbp über die Folge hinaus erstreckt, welche mit dem Oligonucleotidgemisch hybridisiert. Außerdem wird gefolgert, daß die Sequenz von AE, die mit dem Oligonucleotidgemisch hybridisiert, sich innerhalb von 1,2 kbp vom BamHI-Ort an die Grenze des hybridisierenden 2,8kbp-BamHI-EcoRI-Fragmentes befindet (Abb. 1).
| XD | λΕ |
| 4,4 | 4,4 |
| 2,8 | |
| 2,4 | |
| 2,2 | 2,2 |
| 1.6 | 1,6 |
| 1,5 | 1,5 |
| 1,2 | |
| 0,84 | 0,84 |
| 0,72 | 0,72 |
| 0,68 |
Angenäherte Größe der Fragmente (in kbp), die kleiner als 5kbp sind und nach dem Digerieren von DNA, die aus den Phagen AD und XE isoliert wurde, mit den Restriktionsenzymen EcoRI, BamHI bzw. der Kombination dieser Enzyme gewonnen werden. (P) bezeichnet Fragmente, die wahrscheinlich aus einer partiellen Spaltung resultieren.
XD λΕ AD XE
3,8 . 3,8
3,5(Pi 3,2(P) 2,4 2,4 2,4
2,2 2,2
1,6 1,6
0,98
0,62 0,62 0,62 0,62
Um eine partielle Restriktionskarte von XE zu konstruieren, wird Phagen-DNA mit EcoRI, Xbal, Hindill und allen möglichen Kombinationen dieser Enzyme aufgeschlossen. Das geschieht in zwei Schritten. Zuerst werden 6μg der DNA 105min lang bei 370C entweder bei Anwesenheit oder bei Fehlen von 200 Einheiten EcoRI in einem Volumen voin 200μΙ inkubiert, welches den vom Hersteller (BRL) empfohlenen Puffer und RNase A (2 mg je ml) enthält. Dann werden die Reaktionsgemische mit 100 μΙ Phenol/Chloroform (1:1) und anschließend mit 100μΙ Chloroform extrahiert. DNA wird aus der wäßrigen Phase durch den Zusatz von 0,1 Volumen eines 3M Natriumacetatpuffers und von 2 Volumen Ethanol ausgefällt. Nach dem das Ganze 10min auf Eis gestanden hat, werden die Ausfällungen durch Zentrifugieren aufgefangen. Die Pellets werden in Luft getrocknet und in ΙΟΟμΙ TE-Puffer aufgelöst. Dann werden die Lösungen für nachfolgende Inkubationen, entweder bei Fehlen des Restriktionsenzyms (nur EcoRI-digeriertes Material) oder bei Anwesenheit von Hindill, Xbal oder der Kombination dieser Enzyme, verwendet. Inkubationen werden für 2 Stunden bei 37 0C in einem Volumen von 20 μΙ ausgeführt, das 10 μΙ der jeweiligen DNA-Lösung, RNase A (2 mg/ml), 10 Einheiten des jeweiligen Restriktionsenzyms und den vom Hersteller (BRL) empfohlenen Puffer enthält. Die Inkubation wird durch den Zusatz von 5μΙ des fünffach konzentrierten Probenpuffers gestoppt, und anschließend werden die Proben wie oben beschrieben analysiert.
Auf dem Autoradiogramm wird in den Aufschließungen mit Hindill, Xbal und den Kombinationen dieser zwei Enzyme nur eine einzige hybridisierende Bande, die größer als 10 kbp ist, festgestellt. Eine Bande von etwa dergleichen Größe ist in allen anderen Aufschließungen, wenn auch mit geringerer Intensität, vorhanden, was darauf hinweist, daß die Enzyme die DNA nicht vollständig beschränkt haben. Die zweite und am stärksten hybridisierende Bande in der EcoRI-Aufschließung repräsentiert ein 7,4kbp-Fragment. Diese Bande, die wiederum auf unvollständiges Dispergieren hinweist, ist in den Aufschließungen mit EcoRI und einem zweiten Enzym, wenn auch in geringerer Intensität, vorhanden. Außerdem ergeben die EcoRI/Hindlll-Doppelaufschließung und die EcoRI/Hindlll/Xbal-Dreifachaufschließung ein hybridisierendes Fragment von 3,6 kbp. Ein 4,1 kbp-Fragment, das hybridisierend isi, wird in der Doppelaufschließung mit den Enzymen EcoRI und Xbal festgestellt. Dieses Fragment ist auch in der Dreifachüufschließung mit den Enzymen EcoRI, Hindlll und Xbal vorhanden, aber in sehr geringer Intensität. Im letzteren Fall wird das 4,1 kbp-Fragment als ein partielles Spaltungsprodukt betrachtet.
Es wird geschlußfolgert, daß das 7,4 kbp-EcoRI-Fragment, welches mit den kombinierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisiert, mit jedem einzelnen der Enzyme Xbal, Hindlll oder BamHI gespalten werden kann und daß die Lage des Spaltungsortes dieser Enzyme die in der Abb. 1 gezeigte sein muß. Diese Abbildung gibt nur eine partielle Restriktionskarte, z. B. könnte das 7,4 kbp-EcoRI-Fragment noch mehr als einen Spaltungsort für eines der Enzyme Hindlll, Xbal und BamHI jeweils enthalten, wobei in diesem Fall nur der Ort gezeigt wird, welcher der speziellen Sequenz am nächsten liegt, die mit den kombinierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisiert.
Mit dem Phagen XD wird keine Xbal- oder Hindlll-AufschlieSung vorgenommen, es wird jedoch angenommen, daß die Xbal· und Hindlll-Restriktionsorte wie im Phagen XE angeordnet sind.
Aus den neun positiven Klonen, welche PGI-Gensequenzen tragen, werden die vier Phagen PGI-X4, -X5, -X6 und -X7 für die weitere Analyse ausgewählt. Zuerst wird ermittelt, daß die Phagen Einschübe enthalten, die aus demselben Bereich des A. nlger-Genoms abgeleitet wurden, und anschließend wird eine partielle Restriktionskarte von X5 hergestellt, wie das oben für die PGII-Gensequenz beschrieben wurde, welche die Phagen D und E enthält. Die DNA wird mit Restriktionsenzymen (Enzyme siehe Tabelle IV) nach den Empfehlungen der Enzymhersteller digeriert. Die Fragmente werden auf einem Agarosegel getrennt und auf Nitrocellulose geblottet, wie das oben beschrieben wurde. Dann wird die Membran gebacken und mit einem vorher einer Nick-Translation unterzogenen 1,2kb-BamHI/EcoRI-Fragment der Strukturgencodierung für PGII hybridisiert. Dieses Fragment wird vom Plasmid pGW 1803 abgeleitet, das im Beispiel 3.8 beschrieben wird. Das Fragment wird aus Scheiben eines Agarosegels isoliert, und 50 ng des Fragments werden einer Nick-Translation unterzogen, wie das von Maniatis u. a. (S. 109-112; Ref. 6) beschrieben wurde. Bevor die der Nick-Translation unterzogene DNA dem Hybridisationsgemisch zugesetzt wird, wird sie 10 min lang in einem siedenden Wasserbad denaturiert. Die Nitrocellulosefilter werden mit den radioaktiven Sondeh hybridisiert, wie das im Beispiel 3.8 beschrieben wird, wobei aber die Vorhybridisations- und die Hybridisationstemperatur jeweils 6O0C betragen. Dann werden die Membranen bei 600C unter Verwendung einer Reihe von vorgewärmtem Puffern gewaschen. Zuerst werden die Membranen in 6 χ SSC gespült und zweimal eine halbe Stunde lang in Hybridisationspuffer gewaschen. Dann werden die Filter nacheinander in 4 x SSG und 2 χ SSC für 30min je Puffer gewaschen. Diese Puffer enthalten beide 0,1% SDS und 0,1% Na4P2O? χ 10HjO. Nach der letzten Waschung werden die Membranen kurz in 0,1 χ SSC gespült und dann trocknen lassen, anschließend werden sie einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Die verwendete Sonde stellt einen kleinen Teil des PG Il-Promotorbereichs (200bp) und einen großen Teil der Codierungssequenz dar. Unter den beschriebenen Hybridisationsbedingungen ergibt diese Sonde starke Signale bei allen oben isolierten Phagen (siehe Beispiel 3.4), welche PGI-Sequenzen enthalten.
Fragmentlängen werden aus der Fotografie und den Autoradiogrammen durch Vergleich mit den bekannten Markerbanden ermittelt. In der Tabelle IV werden die hybridisierenden Fragmente und ihre angenäherte Größe aufgeführt.
Die angenäherte Größe der hybridisierenden Fragmente (kbp), die nach dem Digerieren der DNA, die aus PGI λ4-7 isoliert wurde, mit den Restriktionsenzymen EcoRI, BamHI, Xhol und den Kombinationen dieser Enzyme sowie mit dem BamHI/Bglll gewonnen wurden
| Restriktionsenzym | Phage | λ5 | A6 | λ7 |
| A4 | 8,6 | 23 | 8,6 | |
| BamHI | 8,6 | 6,4 | 6,4 | 6,4 |
| EcoR! | 6,4 | 6,4 | 6,4 | 6,4 |
| EcoRI/BamHI | 6,4 | >23 | £23 | a 23 |
| Xhol | 2:23 | 2,0 | 2,0 | 2,0 |
| Xhol/EcoRI | 2,0 | 7,5 | >23 | 7,5 |
| BamHI/Bglll | 7,5 | |||
Aus der Tabelle IV geht hervor, daß alle Phagen ein EcoRI-Fragment von 6,4 kbp und ein Xhol/EcoRI-Fragment von 2,0kbp enthalten, während eine EcoRI/BamHI-Doppelaufschließung auch zu einem 6,4kbp führt. Die Pagen λ4, λ5 und λ7 haben auch identische Fragmente, wenn sie mit BamHI (8,6kbp) und BamHI/Bglll (7,5 kbp) digeriert werden. Der Vektor enthält keine BamHI-Orte mit Ausnahme der BamHI-Orte, dii zu Einfügen der Fragmente von Aspergillus-DNA verwendet werden (Frischauf u. a„ Ref.9). Die Einschübe dieser drei Phagen werden daher als vom gleichen Bereich des A. nlger-Genoms abgeleitet betrachtet. Um eine partielle Restriktionskarte zu schaffen, wird A5-Phagen-DNA auch mit Kpnl, Smal, Sstl und Sail und mit BamHI in Verbindung mit diesen Enzymen digeriert. Außerdem wird eine Bglll/Xhol-Aufschließung analysiert. Alle diese Inkubationen werden für die Dauer von 3 Stunden bei 370C, ausgenommen Saml (300C), in einem Volumen von 20μΙ ausgeführt, das 1 pg Phagen-DNA enthält. Die Fragmente, die bei 6O0C mit der PGII-Sonde hybridisieren, werden in der Tabelle V aufgeführt.
Die angenäherte Größe der hybridisiernden Fragmente (kbp), die nach dem Aufschließen von DNA, die aus PG Ι-λ5 isoliert wurde, mit den Restriktionsenzymen BgIII, Kpnl, Smal, Sstl, Sail und mit Kombinationen von BamHI mit diesen Enzymen oder mit Xhol gewonnen wurden. Aufgeführt wird auch eine Doppelaufschließung von Bglll/Xhol.
| Fragmentlänge | (kbp) | Fragmentlänge | (kbp) |
| Restriktionsenzym | 8,6 | Restriktionsenzym | |
| BamHI | 9,7 | 7,5 | |
| BgIII | 5,1; 2,7 | BamHI/Bgll | 4,2 |
| Kpnl | 6,4 | BamHI/Xhol | 3,0 |
| EcoRI | 4,7 | Bglll/Xhol | 4,8; 2,8 |
| Smal | 9,9 | BamHI/Kpnl | 8,3 |
| SStI | 8,9 | BamHI/Sstl | 8,5 |
| Sail | BamHI/Sall | ||
Eine Restriktionskarte von PGI-A5 kann aus den hybridisierenden Fragmenten aufgebaut werden, woraus geschlußfolgert werden kann, daß sich das Gen mit der Codierung für Polygalacturonase I am 8,6 kbp-BamHI-Fragment befindet.
Die relevanten EcoRI-Xba!-Fragmente der Phagen AD und AE werden in pEMBL-Vektoren eingefügt (Dente und Cortese, Ref. 10), was die Plasmide pGW1803 bzw. pGW1800 ergibt.
Aus der Abb. 1 und dem Beispiel 3.5 wird abgeleitet, daß der Phage AD ein 2,5 kbp-EcoRI-Xbal-Fragment haben muß, das mit einem Teil des 4,1 kbp-EcoRI-Xbal-Fragmentes des Phagen AE identisch ist. Es werden 6 \ig der AD-DNA mit 60 Einheiten Xbal für die Dauer von 2 Stunden bei 37°C in einem Volumen von 200μΙ in dem von BRL empfohlenen Puffer plus RNase A (1,5mg/ml) digeriert. Dann wird die NaCI-Konzentration auf 14OmM abgestimmt, konzentrierter Reaktionspuffer wird zugesetzt, um die Volumensteigerung zu kompensieren, es werden 60 Einheiten EcoRI zugegeben, und die Inkubation wird 2,5-Stunden in einem Volumen von 230 μΙ weitergeführt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit 100μΙ Chloroform extrahiert, und die DNA wird aus der wäßrigen Phase durch den Zusatz von 0,1 Volumen von 3 M Natriumacetatpuffer (pH-Wert 5,2) und 2 Volumen Ethanol ausgefällt. Nach der Inkubation bei 40C für die Dauer von 16 Stunden wird die DNA durch Zentrifugieren gewonnen, das Pellet wird an der Luft getrocknet und dann in dem gleichen Puffer aufgelöst. Die Restriktionsfragmente werden auf einer 0,6%igen, niedrigschmelzenden Agarose (BRL)-GeI in 0,5 χ TBE-Puffer, der Ethidiumbromid enthielt, getrennt. Die DNA-Fragmente werden unter UV-Licht sichtbar gemacht, und es wird eine Gel-Scheibe, die das 2,5 kbp-EcoRI-Xbal-Fragment enthält, isoliert. Phagen-AE-DNA wird mit den Restriktionsenzymen Xbal und EcoRI im wesentlichen so inkubiert, wie das oben beschrieben wurde. Nach der Extraktion mit Chloroform wird die DNA ausgefällt, durch Zentrifugieren pelletiert, in dem gleichen Puffer aufgelöst und einer Elektrophorese auf einem 0,6%igen Agarosegel in 1 x TBE-Puffer unterzogen. Es wird eine Gel-Scheibe, die das 4,1 kbp-Xbal-Eco-RI-Fragment enthält, gewonnen und bei -2O0C gelagert. Auf den Boden eines 0,5-ml-Mikrozentrifugeteströhrchens, das 60μΙ des hohen TE-Puffers (10OmM Tris-HCI, pH-Wert 8,0,1OmM EDTA) enthält, wird ein Stopfen aus silanisierter Glaswolle gegeben. Die Gel-Scheibe wird aufgetaut, in das Teströhrchen gegeben und das Röhrchen in flüssigem Stickstoff gefroren. In den Boden des kleinen Röhrchens wird ein kleines Loch gestoßen, und es wird in ein
1 ,S-ml-Mikrozentrifugenteströhrchen gegeben, und der Puffer und die DNA aus der Gel-Scheibe werden durch Zentrifugieren aufgefangen. Die Reste der Gel-Scheibe werden in 50 μΙ des hohen TE-Puf fers erneut suspendiert, diese Suspension wird wieder in flüssigem Stickstoff gefroren, und der Puffer wird durch Zentrifugieren aufgefangen. Die Eluate werden dann kombiniert und mit 100μΙ Chloroform extrahiert. Die DNA wird aus der wäßrigen Phase ausgefällt, durch Zentrifugieren aufgefangen und in 40 μΙ TE-Puffer aufgelöst. Die DNA-Konzentration wird durch Agarosegelelektrophorese bestimmt, gefolgt von der Sichtbarmachung der Bande unter UV-Licht, wobei 1 μρ der mit Hindlll digerierten Lambda-DNA (BRL) als Referenz verwendet werden. Die Vektoren pEMBL18 und pEMBL19 werden durch sequentielle Aufschließung mit Xbal und EcoRI unter den vom Hersteller (BRL) empfohlenen Bedingungen hergestellt. Die Extraktion der DNA mi onol, Phenol/Chloroform (1:1) und Chloroform und die Ausfällung der DNA mit Ethanol werden so ausgeführt, wie das von Maniatis u.a. (Ref. 6) beschrieben wurde, wobei aber der Isoamylälkohol aus der Chloroformlösung weggelassen wurde und die für die Ausfällung der DNA angewendete Temperatur 40C beträgt.
DNA-Fragmente werden an den jeweiligen Vektor in einem Reaktionsvolumen von 25μΙ ligiert, welches den von BRL empfohlenen Puffer plus ATP (1 mM), 1,5 Einheiten T4-DNA-Ligase (BRL), 10Ong der Vektor-DNA enthält, die auf oben beschriebene Weise hergestellt wurde, und das relevante Restriktionsfragment. Xbal und EcoRI, digeriert mit pEMBL18, werden für die Konstruktion von pGW 1800 plus einer äquimolaren Menge des gereinigten 4,1 kbp-Xbal-Fragmentes von AE verwendet. Das Reaktionsgemisch wird 16 Stunden lang bei 160C inkubiert, dann wird die Reaktion durch den Zusatz von 125 μΙ destilliertem Wasser und Gefrieren gestoppt. Xbal· und EcoRI-digeriertes pEMBL19 wird für die Konstruktion von pGW 1803 verwendet. In diesem Fall wird die Agarose-Scheibe, welche das 2,5kbp-Xbal-EcoRI-Fragment von D enthält, bei 60°C geschmolzen, und ein Volumen von 4 μΙ, das ca. 15 ng der DNA enthält, wird zu 11 μΙ destilliertem Wasser gegeben, worauf die anderen Komponenten des Reaktionsgemische zugesetzt werden. Man läßt die Ligationsreaktion 14 Stunden bei 20cC ablaufen, dann wird eine zusätzliche Einheit T4-DNA-Ligase zugesetzt. Die Reaktion wird weitere 7 Stunden fortgesetzt, und anschließend wird die Reaktion der oben beschriebenen Weise entsprechend beendet.
Es werden 15μΙ des resultierenden Reaktionsgemische eingesetzt, um E. coil zu transformieren, wie das im M 13-Klonierungs-/ Dideoxysequenzierungshandbuch von BRL (S.30-33; Ref. 11) beschrieben wird, wobei aber E. coil DH 5aF' und E. coll JM109 bis zu einem OD6M-Wert von 0,7 bzw. 0,9 g>. ogen werden, bevor die Kolben auf Eis gesetzt werden. Der erstgenannte Stamm wird unter Verwendung des Ligationsreaktionsgemischs mit dem Fragment von AD transformiert, der letztgenannte Stamm wird unter Einsatz des Ligationsreaktionsgemischs mit dem Fragment AE transformiert. Nach dem Wärmeschock werden die Zellen zwei Minuten auf Eis inkubiert, dann wird 1 ml LB-Medium zugesetzt, und die Zellen werden bei 37 0C eine Stunde lang inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei geringer Geschwindigkeit pelletiert, 1 ml des Überstandes wird entfernt, und die Zellen werden sanft erneut suspendiert. Dann werden die 73llen auf LB-Agarplatten plattiert, welche ΙΟΟμρ/ml Ampilicillin enthalten und aufweiche eine IPTG/X-Gallösung (= 200μΙ H20,30 μΙ Dimethylformamid, das 2% X-GaI enthält, und 20μΙ einer Lösung von 24 mg/ml IPTG in Wasser) gestrichen wurde. Die Platten werden über Nacht bei 370C inkubiert. Mehrere einzelne weiße Kolonien werden verwendet, um Übernachtkulturen in LB-Medium, das durch 0,1 % Glucose und 75μρ/(Τ)Ι Ampicillin ergänzt war, herzustellen. Diese Kulturen werden zur Plasmidisolierung verwendet, wobei die Mini-Präparationsmethode von Holmes und Quigley (Ref. 12) angewendet werden. Die Plasmide werden mit mehreren Restriktionsenzymen nach den Empfehlungen des Herstellers (BRL) und bei Anwesenheit von RNAse A (0,5 mg/ml) digeriert, und die Produkte werden auf Agarosegel analysiert. Plasmide, die zur Bildung von Xbal-EcoRI-, BamHI-EcoRI- und Hindill-Fragmenten der erwarteten Größe führen, werden ausgewählt, und die E. coll-Zellen, die sie in sich tragen, werden bei -20°C auf Glycerol gehalten.
Es werden zwei neue Plasmide konstruiert. pGW1800 ist das 4,1 kbp-Xbal-EcoRI-Fragment des Phagen AE, eingefügt in den Vektor pEMBL18. pGW1803 ist das 2,5 kbp-Xbal-EcoRI-Fragment des Phagen AD, eingefügt in den Vektor pEMBL19.
Das Verhältnis zwischen pGW 1800 und pGW 1803 wird durch erweiterte Restriktionsanalyse bestätigt. Die spezielle Sequenz, die mit den kombinierten Oligonucleotiden HR6195 und HR6196 hybridisiert, wird als ein spezieller Bereich von pGW1803 bezeichnet. Das Fehlen von Klonierungsartefakten, wie Deletionen oder Ligationen von A. nlger-abgeleiteten DNA-Fragmenten, wird durch Vergleich der Restriktionsfragmente bestimmt, die von Plasmid pGW1800 bzw. von A. nlger-N 400-DNA gewonnen wurden.
pGW1800 und pGW 1803 werden im E. coll-Stamm JM109 bzw. DH5aF' vermehrt, und Plasmid-DNA wird aus 250ml Übernachkulturen in LB-Modium, das mit 0,1 % Glucose und 100μg/ml Ampicillin ergänzt wurde, gewonnen, wie das von Maniatis u.a. (S.90-91; Ref.6) beschrieben wurde, und schließlich wieder in TE-Puffer suspendiert. Da pGW 1800 auch zur Transformation von A. niger eingesetzt wird, wird es durch Bandenkennzeichnung in einem Cäsiumchloridgradienten gereinigt. Zu 2,5ml DNA-Lösung in TE werden 3,3g CsCI und 1 ml Ethidiumbromid (10mg je ml in Wasser) zugesetzt. Das Zentrifugieren erfolgt in einem Beckmane-Rotor VTi 65.2 bei 200C für die Dauer von 16 Stunden mit45000U/min. Von den beiden unter UV-Licht sichtbaren, fluoreszierenden Banden wird die untere, welche kovalent geschlossene, ringförmige Plasmid-DNA enthält, durch seitliches Punktieren des Röhrchens gewonnen. Die DNA-Lösung (etwa 1 ml) wird fünfmal mit wassergesättigtem Butanol gewaschen, um das Ethidiumbromid zu entfernen. Dann wird das Volumen mit Wasser auf 15ml gebracht, und die DNA wird durch den Zusatz von 30 ml Ethanol ausgefällt. Die DNA wird durch Zentrifugieren aufgefangen, und dann wird das Pellet einmal mit 75%igem Ethanol gewaschen und anschließend in TE-Puffer aufgelöst und bei -2O0C aufbewahrt. pGW1803 wird nicht aus einem CsCI-Gradienten isoliert, sondern einem schnelleren Verfahren unterzogen. RNase A wird 4ml DNA-Lösung bis zu einer Konzentration von 10Opg/ml zugesetzt, und dieses Gemisch wird bei 370C eine Stunde lang inkubiert und anschließend mit einem gleichen Volumen von Phenol, Phenol/Chloroform (1:1) und Chloroform extrahiert. Dann wird die DNA aus der wäßrigen Phase durch den Zusatz von 0,4ml 3M Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,2 und 8ml Ethanol ausgefällt. Die DNA wird durch Zentrifugieren aufgefangen, das resultierende Pellet wird mit 75%igem Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet und anschließend in TE-Puffer aufgelöst.
A. nlger-DNA wird nach einem Verfahren hergestellt, das gegenüber dem für die Isolierung von Pflanzen-RNA angewendeten (Slater, Ref. 21) leicht modifiziert ist. Mycel wird mit Salzlösung gewaschen, in flüssigem Stickstoff gefroren, und 2,5g werden unter Anwendung eines Mikrodismembrationsgerätes (Braun) aufgespalten. Das Mycelpulver wird mit frisch zubereitetem Extraktionspuffiir extrahiert. Der Extraktionspuffer wird folgendermaßen hergestellt: 5m Triiosopropylnaphthalensulfonsäure (TNS, 20mg/ml) werden mit 5ml p-Aminosalicylsäure (PAS, 120mg/ml) und 2,5ml 5 x RNB-Puffer gemischt (5 x RNB enthält
121,1g Tris, 73,04g NaCI und 95,1 g EGTA in 11, pH-Wert 8,5). Nach dem Zusatz von 7,5ml Phenol wird der Extraktionspuffer 10min lang bei 550C äquilibriert. Der warme Puffer wird dann dem Mycelpulver zugesetzt, und die Suspension wird 2 min lang gemischt. Dann werden 5ml Chloroform zugesetzt, und es wird 2 min lang gemischt. Die Phasen werden durch Zentrifugieren (10 Minuten, 10000 x g) getrennt, und die wäßrige Phase wird ein weiteres Mal mit 10ml Phenol/Chloroform (1:1) und dann zweimal mit Chloroform extrahiert.
Die wäßrige Phase enthält sowohl RNA als auch DNA. Die DNA wird mit 2 Volumen Ethanol bei Zimmertemperatur ausgefällt und durch Zentrifugieren (10min, 10000 χ g) aufgefangen, zweimal durch wiederholtes Auflösen in destilliertem, sterilen Wasser und erneutes Ausfällen mit Ethanol gewaschen. RNA wird durch den Zusatz von RNase A (20Mg/ml) zur abschließenden Lösung entfernt.
Um physikalische Karten von pGW1800 und pGW1803zu konstruieren, werden verschiedene Reaktionsgemische hergestellt, welche etwa 1 Mg der Plasmid-DNA, RNase A in einer Konzentration von 1 mg/ml (nur bei pGW 1803), den von BRL empfohlenen relevanten Puffer und 10 Einheiten eines Restriktionsenzyms enthalten, wobei verschiedene Enzyme für die einzelnen Reaktionsgemische gewählt werden. In mehreren Fällen wird eine Kombination von zwei verschiedenen Enzymen gewählt, oder Plasmid-DNA wird durch ein bestimmtes Enzym oder eine Kombination von Enzymen beschränkt, gefolgt von der Ausfällung der DNA bei Anwesenheit von Natriumacetat und Ethanol und anschließende Wiederaufnahme der DNA durch Zentrifugieren, wobei dieses Material dann als Substrat für ein zweites oder drittes Restriktionsenzym verwendet wird. Die Reaktionsgemische werden bei 370C eine Stunde lang inkubiert, dann wird die Reaktion durch den Zusatz von fünffach konzentriertem Probenpuffer gestoppt, und dann werden die Reaktionsprodukte auf einem 1%igen Agarosegel in TBE-Puffer analysiert. Aus der berechneten Größe der speziellen Fragmente wird die Position der einzelnen Restriktionsenzymorte im Verhältnis zu einem Bezugspunkt, der willkürlich am eindeutigen Xbal-Ort gewählt wird, abgeleitet. Die Restriktionskarte von pGW1800wird in der Abb.2 gegeben. Die Restriktionskarte von der A. nlger-abgeleiteten DNA von pGW 1803 (nicht gezeigt) ist mit der Karte von pGW 1800 vom Xbal-Ort in der Position 1 bis zum Hincll-Ort in der Position 2000 identisch. pGW 1803 enthält jedoch keinen Bglll-Ort, der in Position 2400 in pGW1800 vorhanden ist. Das 0,4 kbp-Hincll-Bglll-Fragment von pGW1800 wies die gleiche elektrophoretische Mobilität wie das Hincll-EcoRI-Fragment von pGW1803 auf, das sich am Ende der von A. nlger abgeleiteten Einschub-DNA befindet. Es wird geschlußfolgert, daß die von A. nlger abgeleitete DNA von pGW1803 mit der von A. nlger abgeleiteten DNA von pGW 1800 zwischen dem Xbal-Ort in Position 1 und einer Stelle, die sehr dicht beim Bglll-Ort in der Position 2400 liegt, diesen aber nicht einschließt, identisch ist. Folglich stellt die abgeleitete Größe des EcoRI-Xbal-Fragmentes des Phagen XD von 2,5kbp (Beispiel 3.6) eine geringe Überschätzung dar.
Um die spezielle Sequenz zu lokalisieren, welche mit den kombinierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisiert, wird pGW1803-DNA beschränkt, und die resultierenden Fragmente werden in der oben beschriebenen Weise getrennt. Dann wird die DNA auf eine Nitrocellulosemembran übertragen und mit den kombinierten und markierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisieren lassen, wie das oben beschrieben wurde. Die Fragmente, die mit den kombinierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisieren, sind ein 0,64 kbp-Hincll-Fragment in der Hincll-Aufschließung und ein 0,62 kbp-Ncol-EcoRI-Fragment in der Ncol/EcoRI-Doppelaufschließung. Es wird geschlußfolgeri, daß die spezielle Sequenz, welche mit den kombinierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisiert, sich zwischen dem Ncol-Ort in der Position 1750 und dem Hincll-Ort in der Position 2000 der Restriktionskarte von pGW 1803 befindet, wobei diese Koordinaten mit der gleichen Sequenz auf der Restriktionskarte von pGW1800 übereinstimmen. Das Fehlen von Klonierungsartefakten wird durch den Vergleich der Restriktionsfragmente von pGW 1800 mit den Restriktionsfragmenten ermittelt, die von A. nlger N400-DNA gewonnen wurden. Aufschließungen von pGW 1800 werden in der oben beschriebenen Weise hergestellt. Aufschließungen der chromosomalen DNA des Stammes N 400 werden bei 370C in einem Reaktionsvolumen von 200μΙ vorgenommen, das aus 2μΙ DNA, 0,5mg/ml RNase A, einem von BRL gelieferten Reaktionspuffer (REact-Puffer 2 für Xhol, Xbal, EcoRV und BgIII, REact-Puffer 4 für Kpnl und REact-Puffer 3 für EcoRI und Sail) und 90 Einheiten des jeweiligen Enzyms besteht. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden inkubiert und dann mit 100μΙ Chloroform extrahiert. Anschließend wird die ÜNA aus der wäßrigen Phase durch den Zusatz von 20μ| eines 3 M Natriumacetatpuffers, pH-Wert 5,2, und von 0,5ml Ethanol, gefolgt vom Stehenlassen auf Eis für die Dauer von 45 min, ausgefällt. Danach wird die DNA durch Zentrifugieren wiederaufgenommen und an Luft getrocknet. Die DNA wird im Probenp-jffer aufgelöst, und diese Proben und die Aufschließungen von pGW1800 und Lambda-DNA-Größenmarker werden auf ein 0,7%iges Agarosegel in TBE-Puffer gegeben. Nach der Elektrophorese wird das resultierende Muster dokumentiert, und die DNA in den Bahnen mit den Aufschließungen der chromosomalen A. niger-DNA wird auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, beides in der oben beschriebenen Art und Weise. Die Membran wird gebacken und in zwei Teile geschnitten, die mit unterschiedlichen Sonden hybridisiert werden.
Die für die Hybridisation verwendeten Sonden sind die einer Nick-Translation unterzogenen EcoRV-Bglll-Fragmente zu 1,45kbp und 2,05kbp von pGW 1800. Die Fragmente werden vorher aus den Scheiben eines Agarosegels isoliert, wie das oben beschrieben wurde, und 100 ng der Fragmente werden in getrennten Reaktionen einer Nick-Translation unterzogen, wie das von Maniatis u.a. (S. 109-112; Ref.6) beschrieben wurde. Vor dem Zusatz zum Hybridisationsgemisch wird die der Nick-Translation unterzogene DNA 10min in einem siedenden Wasserbad denaturiert.
Dh gebackenen Nitrocellulosefilter werden in 3 x SSC benetzt und dann auf gesonderte Schalen übertragen, in denen sich 100ml vorgewärmter (680C) Hybridisationspuffer befindet, der aus 6 χ SSC, 1OmM EDTA, 0,1 mg je ml frisch zugesetzter, gescherter und denaturierter Heringssperma-DNA, 0,1 % Na4P2O7 x 10H20,0,5%SDS und 5x Denhardts (0,1 % BSA, Boehringer, Fraktion V, 0,1 % Ficoll 400, Pharmacia, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon-10, Sigma) besteht. Die Vorhybridisation erfolgt zwei Stunden lang bei 680C in einem Schüttelwasserbad, und dann wird der Hybridisationspuffer durch frischen Puffer (75ml) ersetzt, dem anschließend eine der Nick-Translation unterzogene Sonde zugesetzt wird. Man läßt die Hybridisation bei 680C wenigstens 16 Stunden weitergehen. Dann werden die Membranen bei 68°C unter Verwendung einer Reihe von vorgewärmten Puffern gewaschen, die alle 0,1 % SDS und 0,1 % Na4P2O7 χ 10H2O, aber eine abnehmende Menge SSC enthalten. Zuerst werden die Membranen in4 x SSC gespült und dann zweimal fürdie Dauer von 10min in4 x SSC gewaschen.
Dann werden die Filter nacheinander für jeweils 30min in4 χ SSC, 2 χ SSC, 0,5 χ SSC, 0,2 χ SSC und 0,1 χ SSC gewaschen. Nach der letzten Waschung werden die Membranen kurz in 0,1 x SSC gespült und dann trocknen lassen, danach werden sie einem Röntgenfilm exponiert.
Die Membran, die mit dem 1,45 kbp-EcoRV-Bglll-Fragment sondiert wird, enthält die folgenden hybridisierenden Fragmente: ein 2,4 kbp-Fragment in der Xhol-Aufschließung, ein 2,8 kbp- und ein 1,2 kbp-Fragment in der Kpnl-Aufschließung und ein 1,3
kbp-Fragment in der Bglll/EcoRV-Doppelaufschließung. Die Membran, die mit dem 2,05 kbp-EcoRV-Bglll-Fragmeni sondiert wird, enthält die folgenden Fragmente: ein großes Fragment von etwa 11 kbp in der EcoRI/Sall-Doppelaufschließung, 2,3 kbp- und 2,1 kbp-Fragmente in der Xhol-Aufschließung, 2,3kbp- und 1,4kbp-Fragmente in der Xho/Xbal-Doppelaufschließung, 1,2kbp-Fragmente in der Kpnl-Aufschließung und ein 2,0kbp-Fragment in der EcoRV/Bglll-Doppelaufschließung. Für vier der hybridisierenden Fragmente können aus der Restriktionskarte von pGW1800 nur das Vorhandensein und eine Minimalgröße abgeleitet werden, d. h. Fragmente, die Homologie mit einer eingesetzten Sonde aufweisen, deren eines Ende aberaußerhalb der Sequenz liegt, die in pGW1800 vorhanden ist. Diese Fragmente sind im Falle der 2,05kbp-EcoRV-Bglil-Sonde die Fragmente in der EcoRI/Sall-Aufschließung, das 2,1 kbp-Fragment in der Xhol-Aufschließung und das 3,2 kbp-Fragment in der Kpnl-Aufschließung und im Falle der 1,45 kbp-EcoRI-Bglll-Sonde das 2,8 kbp-Fragment in der Kpnl-Aufschließung. Diese Fragmente sind alle kleiner als die Minimalgröße, die aus der Restriktionskarte von pGW1800 gefolgert wird. Die unterschiedlichen hybridisierenden Fragmente von genomischer A. nlger-DNA können mit Fragmenten in Korrelation gebracht werden, die In den Aufschließungen von pGW1800 vorhanden sind, und alle haben eine berechnete Größe, die der Größe sehr nahekommt, die aus der Restriktionskarte von pGW1800 hergeleitet wurde. Es wird geschlußfolgert, daß die von A. niger abgeleitete DNA von pGW 1800 eine glaubhafte Darstellung eines Teils des A. nlger-N 400-Genoms ist.
Das 8,6 kbp-BamHI-Restriktionsfragm6nt des Phagen PGI-X7, das mit PGII-Codierungssequenzen hybr.disiert (siehe Tabelle IV, Beispiel 3.6), wird in den pUC9-Vektor eingefügt (Vieira, J. und Messing, J., 1982, Gene 19,259-268), was die Plasmide pGW 1900 (siehe Abb.3) und pGW1901 ergibt, die den Einschub in entgegengesetzten Richtungen haben. Zu ^l5μg PGI-A7 OMA in 5μΙ TE-Puffer werden 1 μΙ Spermidin einer 10 mM Vorratslösung, 20 Einheiten BamHI, der von BRL empfohlene Reaktion^puffer und steriles, destilliertes Wasser zu einem Endvolumen von 30μΙ gegeben. Den digerierten Proben wird ein Viertel Beladungspuffer zugesetzt (Beladungspuffer = 0,25% Bromphenolblau; 0,25% Xylolcyanol und 15% Ficoll 400 in H2O). Die Reaktionsfragmente werden auf einem 0,6%igem Agarosegel in 1 χ TAE-Puffer, der Ethidiumbromid enthält, getrennt (50 x TAE-Puffer = 252g Tris, 57,1 ml Essigsäure und 100ml 0,5M EDTA, pH-Wert 8,0, je Liter).
Die DNA-Fragmente werden unter UV-Licht sichtbar gemacht, und es wird eine Gelscheibe isoliert, welche das 8,6 kbp-BamHI-Fragment enthält. DNA-Fragmente werden nach herkömmlichen Methoden elektrophoretisch isoliert. Das Eluieren erfolgt bei 100V für die Dauer von einer Stunde. Die DNA wird aufgefangen und mit 2 Volumen Ethanol ausgefällt. Nach dem Zentrifugieren in einer Eppendorf-Zentrifugo für die Dauer von 30 Minuten wird die Ausfällung aufgefangen, in einem Gerät Speedvac getrocknet und in 10μΙ TE-Puffer aufgelöst. Vektor pUC9 (1 μς) wird unter Verwendung von 10 Einheiten BamHI bei 370C für die Dauervon 1,5 Stunden unter Verwendung des empfohlenen BRL-Puffers in einem Reaktionsgesamtvolumen von 20 μΙ linearisiert. Anschließend wird 1 μΙ CIP-Lösung (etwa 2 Einheiten) zugesetzt, und das Gemisch wird 30min lang bei 37"C inkubiert. Der linearisierte Vektor wird auch durch Elektrophorese präpariert. Er wird in 20μΙ TE aufgelöst, das entspricht einer DNA-Konzentration von etwa BOng/μΙ.
In der Ligationsreaktion werden 1 μΙ des linearisierten und ClP-behandelten pUC9-Vektors (50ng) und 4μΙ des BamHI-Fragments (etwa 100ng) mit 1,2 Einheiten T4-DNA-Ligase in einem angomessenen Ligasepuffer ligiert. Das abschließende Reaktionsvolumen beträgt 10ml. Man läßt die Reaktion 14 Stunden bei 140C ablaufen, dann wird das Gemisch mit TE auf 50 μΙ verdünnt.
Zum Transformieren von E. coil in der im M 13-Klonierungs-/Dideoxysec inzierungshandbuch von BRL (S. 30 bis 33; Ref. 11} beschriebenen Art und Weise we 'den 50 μΙ der resultierenden Ligationsreaktionsgemische eingesetzt, wobei aber E. coli-DH 5aF' auf einen OD66o-Wert von 0,5 bis 0,7 bezogen wird, bevor die Kolben auf Eis gesetzt werden. Nach dem Wärmeschock werden die Zellen zwei Minuten lang auf Eis inkubiert, dann wird 1 ml LB-Medium zugesetzt, und die Zellen werden bei 37°C eine Stunde lang inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit pelletiert, 1 ml des Überstandes wird entfernt, und die Zellen werden sanft erneut suspendiert. Dann werden die Zellen auf LB-Agarplatten plattiert, welche 1(^g/ml Ampicillin enthalten und aufweiche eine IPTG/X-Gallösung (= 200 μΙ H20,30 μΙ Dimethylformamid, das 2% X-GaI enthält, und 20μΙ einer Lösung von 24 mg/ml von IPTG in Wasser) gestrichen worden war. Die Platten wurden über Nacht bei 370C inkubiert. Mehrere einzelne weiße Kolonien werden zur Herstellung von Übernachtkulturen in LB-Medium verwendet, das mit 0,1 % Glucose und 75μς/ηιΙ Ampicillin ergänzt war. Diese Kulturen werden zur Isolierung von Plasmid unter Anwendung der Mini-Präparationsmethode von Holmes und Quigley (Ref. 12) verwendet. Die Plasmide werden mit verschiedenen Restriktionsenzymen digeriert, unter Beachtung der Empfehlungen des Herstellers (BRL) und bei Anwesenheit von RNase A (0,5 mg/ml), und die Produkte werden auf einem Agarosegel analysiert. Plasmide, welche BamHI-Fragmente der erwarteten Größe ergeben, werden ausgewählt, und die E. coll-Zellen, welche diese tragen, werden bei -20°C auf Glycerol gehalten. Die neuen Plasmide pGW 1900 (das in der Abb. 3 gezeigt wird) und pGW 1901, welche den Einschub in entgegengesetzter Richtung tragen, werden für weitere Experimente verwendet.
pGW1900 wird im E. coli-Stamm DH 5aF' vermehrt, und die Plasmid-DNA wird aus 250ml Übernachtkulturen in LB-Medium gewonnen, das mit 0,1 % Glucose und 100 pg/ml Ampicillin ergänzt wurde, wie das von Maniatis u. a. (S. 90-91; Ref. 6) beschrieben wurde, und schließlich wieder in TE-Puffer suspendiert. Da pGW1900 auch zur Transformation von A. nlger verwendet wird, wird es durch Bandenbestimmung in einem Cäsiumchloridgradienten gereinigt. Zu 2,5ml DNA-Lösng in TE werden 3,3g CsCI und 1 ml Ethidiumbromid (10mg/ml Wasser) gegeben. Das Zentrifugieren erfolgt in einem Beckmanr.®-Rotor VTi 65,2 bei 200C für die Dauervon 16 Stunden mit 45000U/min. Von den beiden unter UV-Licht sichtbaren, fluoreszenten Banden wird die untere, welche kovalent geschlossene, ringförmige Plasmid-DNA enthält, durch seitliches Punktieren des Röhrchens gewonnen. Die DNA-Lösung (etwa 1ml) wird fünfmal mit wassergesättigtem Butanol extrahiert, um das Ethidiumbromid zu entfernen. Dann wird das Volumen mit Wasser auf 15ml gebracht, und die DNA wird durch den Zusatz von 30ml Ethanol ausgefällt. Die DNA wird durch Zentrifugieren aufgefangen, und das Pellet wird einmal mit 75%igem Ethanol gewaschen und anschließend in TE-Puffor aufgelöst und bei -20°C aufbewahrt.
Außerdem wird aus einer pGW1900-Kpnl-Aufschließung ein 2,7 kbp-Kpnl-DNA-Fragment elektrophoretisch aus einer Agaraosegel-Scheibe isoliert und in pEMBL18eingefügt(Dente und Cortese, Ref. 10), was die Plasmide pGW1902 (siehe Abb. 4) bzw. PGW1903 ergibt.
Um eine physikalische Karte von pGW 1900 und pGW 1902 zu konstruieren, werdon verschiedene Reaktionsgemische präpariert, die etwa 1 \ig Plasmid-DNA, den relevanten, von BRL empfohlenen Puffer und 10 Einheiten eines Restriktionsenzyms oder einer
Kombination von zwei verschiedenen Restriktionsenzymen enthalten. Die Reaktionsprodukte werden auf 1%iges Agarosegel in TAE-Puffer analysiert. Aus der berechneten Größe von speziellen Fragmenten wird die Position der einzelnen Restriktionsenzymorte in den Abbildungen 3 bzw. 4 bestimmt.
Die genomische DNA von A. nlger NW756 wird durch Southern-Blot-Analyse unter Verwendung des pgall-Gens von A. niger N400 (d. h., des 1,2 kbp-BamHI-Bglll-Fragmentes von pGW 1800) als Sonde analysiert. Gegenüber der Beschreibung in Beispiel 7.1 wurden zwei Modifikationen vorgenommen. In diesem Fall werden Restriktionsenzyme gewählt, weiche innerhalb der strukturellen Komponente des A. niger-N400-pgall-Gens schneiden, und die Hybridisationsbedingungen sind strenger, d.h., es gelten die im Beispiel 7.2 beschriebenen „homologen" Bedingungen. In der BamHI-Aufschlitüung wird nur ein einzelnes hybridisierendes Fragment von 3,3 kbp festgestellt. Unter diesen Hybridisationsbedingungen wird eine einzelne Sequenz festgestellt, und diese wird daher als das pgail-Gen von A. nlger NW756 definiert. Es wird ein einzelnes hybridisierendes Hincll-Fragment von 3.3 kbp beobachtet, was auf das Fehlen eines Hincll-Ortes im Strukturgen hinweist. Das hybridisierende Xhol-Bglll-Fragment ist 5,5kbp. Diese Ergebnisse stimmen nicht mit den im Beispiel 3.7 gegebenen Date η und der DNA-Sequenz von pgall von A. niger N400, die in der Sequenzaufstellung unter der SEQ ID NO. 2 gegeben wird, überein. Es wird daher geschlußfolgert, daß das pgall-Gen von A. nlger NW756 nicht mit dem pgall-Gen von A. niger N400 identisch ist.
Mit geringfügigen Modifikationen wird eine Genombank von A. nlger NW756 nach der Beschreibung für den Stamm N 400 im Beispiel 2 geschaffen. Sau3Al wird anstelle des Isoschizomers Mbol zur Restriktion der Asperglllus-DNA verwendet. Die Bank des Stammes NW756 wird im Lambda-Vektor EMBL3 konstruiert, der ein enger Verwandter von EMBL4 ist (Ref. 9). EMBL3-DNA, die bereits mit BamHI und EcoRI digeriert und mit Phosphatase behandelt war, wurde von Promega bezogen. Ein Teil der resultierenden Bank wird plattiert, und es werden Plaque-Hyoridisierungen hergestellt, wie das im Beispiel 3.3 beschrieben wurde. Dann werden die Filter mit dem 1,2 kbp-BamHI-EcoRI-Fragment von pGW 1803 unter Anwendung der im Beispiel 7.2 beschriebenen homologen Bedingungen hybridisiert. Positive Phagen werden in einem wiederholten Sichtungsschritt gereinigt, und anschließend wird die DNA dieser Phagen gereinigt, wie das im Peispiel 3.4 beschrieben wurde. Die DNA wird einer Restriktionsanalyse unter Verwendung der Enzyme BgIII und Xhol unterzogen. Dann wird das 5,5 kbp-Xhol-Bglll-Fragment eines der positiven Phagen, welche dieses Fragment enthalten, in der Art und Weise isoliert, die im Beispiel 3.6 beschrieben wurde. Dieses f /agment wird dann in BamHI- und Sall-digeriertes pEMBL18 ligiert, und das resultierende Ligationsgemisch wird zur Transformation von E. coli JM109 verwendet (Beispiel 3.6). Dann werden die Transformationen durch Koloniehybridisierung unter „heterologen" Bedingungen analysiert, wie das im Beispiel 7.3 beschrieben wird. Die Plasmid-DNA eines positiven Klons wird gereinigt und anschließend zur Konstruktion einer physikalischen Karte verwendet (Beispiel 3.7). Die Restriktionskarte von pGW1756 wird in der Abb.6 gezeigt. pG\ V1756 ist das 5,5 kbp-Xhol-Bglll-Fragment, welches das A. niger-NW756-pgall-Gen, eingefügt in den Vektor pEMBL 18, enthalt.
sofort plattiert werden, wie das im M 13-Klonierungs-/Dideoxysequenzierungshandbuch Ji>.34; Ref. 11) von BRL beschriebenwurde. Die Isolierung der einzelsträngigen DNA-Matrizen aus den rekombinanten Phagen erfolgt nach der Beschreibung von
anschließend als eine Glycerolkultur bei -20°C aufbewahrt.
ermitteln zu können. Getrennte Übernacht-Kulturen in YT-Medium werden aus E. coil JM109 und aus dem relevanten Klonhergestellt, im letzteren Fall wird ein Teil der Glycerolkultur als Inokulum verwendet.
lang bei 370C in einem Orbitalschüttelapparat inkubiert. Dann werden 20ml der Übernachtkultur des relevanten Klons zugesetzt,und die Inkubation in dem Orbitalschüttelapparat wird 5 Stunden weitergeführt. Die replikative Form der DNA wird dann ausdiesen Zellen isoliert, wie das oben für pGW1803 beschrieben wurde. Diese DNA wird dann mit Hindill, Pstl, BamHI bzw. Ncoldigeriert. Die BamHI- und Ncol-digerisrte DNA wird dann mit Sail digeriert, anschließend mit Phenol/Chloroform (1:1) und
von 5 Einheiten T4-DNA-Polymerase (BRL) in dem von Maniatis u. a. (S. 117; Ref.6) beschriebenen Puffer und bei Anwesenheitvon jeweils 0,1 mM dCTP, d/ ΓΡ, dGTP und dTTP gefüllt. Die Reaktionsgemische mit einem Volumen von 25μΙ werden 5 Minutenlang bei 370C inkubiert, dann werden 5 μΙ 0,5 M EDTA, pH-Wert 8,0, zugesetzt, und die Gemische werden anschließend mit Phenolextrahiert. Die kleinen, in den so gewonnenen vier DNA-Präparaten vorhandenen DNA-Fragmente werden durch Elektrophoresein einem 0,7%igen, niedrigschmelzenden Agarosegel (BRL) entfernt, und Gelscheiben, die große Fragmente enthalten, v/erdenisoliert. Diese DNA-Fragmente werden anschließend unter Verwendung von T4-DNA-Ligase zirkularisiert. Die resultierenden
verwendet.
u. t., Ref. 29), und die Plasmid-DNA wird anschließend auf die im Beispiel 3.8 beschriebene Weise isoliert, wobei aber allen
dann zum Gewinnen von Subklonen verwendet, welche eine Sequenzanalyse von dem Bcll-Ort aus erlauben.
empfohlenen Bedingungen sequenziert. In einigen Fällen werden die so ermittelten Sequenzierungsdaten für die
Programmierung der Synthese spezieller Oligonucleotide nach der Methode von Caruthers (Ref. 8) verwundet. Diese Oligonucleotide sind HR 6425, das 5'Id)CAAGAACGTCACCATCGAACa' ist, HR 6439, das 5'Id)GAATTGCTCACGGTGGAGTGa' ist und HR6/40, das
5'Id)ACTTGGGClTCTTCTTTCCG3' ist. Diese Oligonucleotide werden anschließend als spezieile Sequenzierungsp, imer für die relevanten Matrizen verwendet. Der Primer HR6439 ergibt zwei sich überlagernde Sequenzierungsleitern, wenn er mit M IS-Matrizen verwendet wird, und daher wird dieser Primer für die Doppelstrangsequenzierung von alkali-denaturiertem pGW 1800 nach den Anweisungen von Pharmacia verwendet.
Die Sequenz des Gens, welches PGII (pgall) codiert, die sich auf pGW1800 befindet, wird aus beiden Strängen der DNA gewonnen. Die Sequenzierung in der stromabwärts führenden Richtung (vom Xbal-Ort in der Position 1 in der Richtung des Pvull-Ortes an etwa Position 3028) erfolgt von den Orten von Xbald), EcoRV (etwa 334), Hindll) (etwa 557), Pstl (etwa 827), Bell (etwa 1056Γ, BamHI (etwa 1158), Hincll (etwa 1344 und etwa 1974), Kpnl (etwa 1565 und etwa 2706), Ncol (etwa 1749) bzw. BgIII (etwa 2379 aus, während der Primer HR 6425 zum Sequonzieren des Bereichs des Bglll-Ortes verwendet wird. Die Sequenzierung in der entgegengesetzten Richtung erfolgt von den Orten von Pvull (etwa 3028 und etwa 1442), Kpnl (etwa 2706 und etwa 1565), BgIII (etwa 2379), Hincll (etwa 1974), BamHI (etwa 1158), Bell (etwa 1056), Pstl (etwa 827), Hindill (etwa 557) bzw. EcoRV (etwa 334) aus, während die Primer HR6439 und HR644C zum Sequenzieren über die Orte von Hincll (etwa 1974) bzw. Kpnl (etwa 1565) verwendet werden.
Die Sequenz von pgall wird in der Sequenzaufstellung unter SEQ ID NO. 2 gegeben. Die Sequenz zu 3031 bp beginnt mit dem ersten Nucleotid des Xbal-Ortes an der Posi'.ion 1 in pGW1800 und endet am letzten Nucleotid des Pvull-Ortes, der in der angenäherten Kartenposition 3050 in der Restriktionskarte von pGW 1800 angegeben wird. Das pgall-Gen umfaßt 1356 Nucleotide des Promotorbereiches, 1138 Nucleotide des strukturellen Teils (einschließlich eines mutmaßlichen Introns von 52 Nucleotiden) und 537 Nucleotide des Transkriptionsterminatorbereichs.
Die Sequenz unmittelbar unterhalb der Signalsequenz und des Xhol-Spc Hortes codiert eine Aminosäuresequenz, die vollständig mit der Sequenz übereinstimmt, die für das 5 kDa-Fragment von Polygalacturonase Il unter der Voraussetzung ermittelt wird, daß Cystein in der Position 3 vorhanden ist (Beispiel 1.3).
Die DNA-Sequenz codiert ein Leader-Peptid von 27 Aminosäuren, wobei Arginin die letzte Aminosäure vor der Sequenz des reifen Proteins ist. Dieses Leader-Peptid muß durch proteolytische Spaltung entfernt werden. Da Signalpeptidasespaltungsorte nicht unmittelbar hinter Argininresten und nicht unmittelbar hinter geladenen Aminosäuren generell gefunden werden (von Heijne; Ref. 39), wird das Leader-Peptid in wenigstens zwei proteolytischen Schritten entfernt, d. h„ das Leader-Peptid stellt eine Präpro-Sequenz dar. In diesem Fall schneidet Signalpeptidase die Präsequenz oder das Signalpeptid, während die verbleibende Prosequenz durch eine andere Protease gespalten wird.
Das struktureile Polygalacturonase Il-Gen enthält ein Intron, das höchstwahrscheinlich die Nucleotidsequenz von Position 1987 bis 2038 umfaßt. Diese Sequenz enthält Terminationscodone in allen drei möglichen Leserastern. Das Vorhandensein dieses Introns verändert das Leseraster in einer Art und Weise, die mit den Proteinsequenzierungsdaten konsistent ist, die ermittelt wurden (siehe Beispiel 1). Das Leseraster vor dem Intron wird durch die Aminosäuresequenzen der Cyanogenbromidfragmente (Beispiel 1.3) bestätigt, während das Leseraster nach dem Intron durch die Aminosäuresequenz des tryptischen Peptide TP4 (Beispiel 1.5) bestätigt wird, wobei diese Sequenz auch aus der Nucleotidsequenz von Position ?183 bis 2225 abgeleitet werden kann. Der 5'-Spit;iiiungsort des Introns, GTAAGC, ähnelt der Pilz-5'-Spleißungsconsensus-Sequenz GTPuNGT, während der 3'-Spleißi!iigsort TAG vollständig mit dem Pilzconsensus-3'-Spleißungsort PyAG übereinstimmt (Ref. 41).
Beispiel 4.2: Das Polygalacturonase I-Gen (pgal) von A. niger N400
Geeignete Restriktionsfragmente werden aus pGW1900 und pGW1902 nach Agarosegel-Elektrophorese isoliert, wie das im Beispiel 3.9 beschrieben wurde. Diese werden in die Vektoren M 13mp 18RF und M 13mp19RF nach dem M13 Klonierungs-/ Dideoxysequenzierungshandbuch von BRL (Ref. 11) ligiert. Kompetente Zellen werden hergestellt, wie das im Pharmacia-Handbuch für das M 13-Klonierungs-/Sequenzierungssystem beschrieben wurde. Die Transformation von E. coil JM101 wird so ausgeführt, wie das von Messing u.a., Ref. 30, beschrieben wurde. Die Isolierung von einzelsträngigen DNA-Matrizen aus rekombinanten Phagen erfolgt nach herkömmlichen Methoden (z.B. Ref. 11, S. 29-34). Die resultierenden Klone werden unter Verwendung des T7-Sequenzierungs™-Satzes von Pharmacia (Uppsala, Schweden) unter Anwendung der vom Hersteller empfohlenen Bedingungen sequenziert.
pGW 1900 wird vom EcoRI-Ort in der angenäherten Kartenposition 5750 bis zum Call-Ort in der angenäherten Kartenposition 3900, der sich dicht am Hindlll-Ort in der angenäherten Kartenposition 3790 befindet, sequenziert. Unter Anwendung der Methode von Caruthers (Ref. 8) werden mehrere Oligonucleotide (304-307) synthetisiert. Diese Oligonucleotide haben folgende Sequenzen:
Nummer304 5'(d) TTCAGCCCAA G CGTCAATCC 3'
Nummer 305 5'(d) ACCTGAACGACTTCACCATC3'
Nummer306 5'(d) T C T G T A G G A C G T C T 6 G T T G 31
Nummer307 5'(d) TGGCAGTAAAACCACCTAAC3'
Sie werden als spezielle Sequenzierungs-Primer für die relevanten Matrizen verwendet.
Das Oligonucleotid Nr. 307 wird für die Doppelstrangsequenzierung von alkali-denaturiertem pGW 1900 nach den Anweisungen für den T7-Sequenzierungs™-Satz verwendet. Die vollständige Sequenz für das pgal-Gen wird in der Sequenzaufstellung der der SEQ ID NO. 1 gegeben. Die Sequenz basiert auf den mit beiden Strängen ermittelten Sequenzierungsdaten.
Die pgl-Sequenz zu 2495bp beginnt mit dem ersten Nucleotid des EcoRI-Ortes an der angenäherten Kartenposition 6280 in pGW1900 und endet 12 Nucleotide jenseits des letzten Nucleotids desClal-Ortes dicht am Hindlll-Ort, der bei 3880 angegeben ist.
Die pgal-Sequenz umfaßt 909 Nucleotide des Promotorbereichs, 1218 Nucleotide des strukturellen Teils, einschließlich zwei mutmaßlicher Introns zu 52bp (Intron A) und 62 bp (Intron B), und 366 Nucleotide des Transkriptionsterminatorbereiches.
Die Aminosäuresequenzen, die für die reife Polygalacturonase I (siehe Beispiel 1,4) und für das Cyanogenbromidfragment zu 21 kDa (siehe Beispiel 1.i jrmittelt wurden, stimmen vollkommen mit der Aminosäuresequenz überein, die aus der Nucleotidsequenz abgeleitet werden kann und die in Position 1003 beginnt. Die DNA-Sequenz codiert also ein Leadsr-Peptid von
31 Aminosäuren, wobei Lysin die letzte Aminosäure vor Beginn des reifen Proteins ist. Aus ähnlichen Gründen, wie sie für PGII gegeben wurden, wobei das Leader-Peptid mit einem Argininrest endet, sollt dieses PGI-Leader-Peptid eine Präprosequenz dar, die ebenfalls in wenigstens zwei proteolytischen Schritten entfernt wird
Die Sequenz, welche mit dem Oligonucleotidgemisch hybridisiert, wird als Sonde verwendet und beginnt in Position 1277 der Nucleotidsequenz. Es bosteht vollständige Übereinstimmung zwischen der N-terminalen Aminosäuresequenz, die für das Cyanogenbromidpeptidfragment zu 5,5kDa im Beispiel 1 bestimmt wurde, und der mutmaßlichen Aminosäuresequenz auf der Grundlage der Nucleotidsequenz.
Das Polygalacturonase I-Strukturgen enthält zwei Introns. Intron A umfaßt die Nucleotidsequenz von Position 1138 bis 1189. Die 5'-Spleißungsstelle GTATGT stimmt mit der Pilz-ö'-Spleißungsstellen-Consensus-Sequenz GT Pu NGT überein (Ref. 41), während die Lariatsequenz GC TAAC und die 3'-Spleißungsstelle TAG auch mit den bekannten Consensus-Sequenzen Pu CT Pu AC und Py AG übereinstimmen. Das Vorhandensein dieses Introns ändert das Leseraster auf eine Art und Weise, die mit den Proteinsequenzdaten konsistent ist, die mit dem bereits lozierten 5,5kDA-Cyanogenbromidfragment (siehe Beispiel 1) ermittelt wurden. Das zweite Intron (B) umfaßt die Nucleotidsequenz 1610 bis 1671. Sowohl die Lariatsequenz als auch der 3'-Spleißungsort stimmen mit den bekannten Consensus-Sequenzen überein. Der 5'-Spleißungsort GCACGA stimmt nicht mit der Consensus-Sequenz GT Pu GNT überein, aber GC am 5'-Spleißungsort sowie ein A in Position +6 im Verhältnis zum 5'-Spleißungsort wurden in einigen anderen Genen gefunden (Ref. 41 und 43).
a) Es ändert das Leseraster, während in den beiden anderen Leserastern ein vorzeitiger Stopp auftritt.
b) Das Intron in pgall tritt in der gleichen Position auf, und die Aminosäuresequenz, welche diesem Intron vorausgeht, Asn-Ser-Gly-Giu, ist in beiden Proteinen identisch. Ein Bereich mit starker Homologie wird auch zwischen den Aminosäuresequenzen festgestellt, die von den Nucleotidsequenzen abgeleitet werden, die sich dem mutmaßlichen Intron unmittelbar anschließen:
PG Il Asn-Ile-Trp-Phe-Thr Gly-Gly-Thr-Cys PG I Ser-Ile-Ser-Phe-Thr Gly-Gly-Thr-Cys
PG Il Ile-Gly-Gly-His-Gly-Leu-Ser-Ile-Gly PG I Ser-Gly-Gly-His-Gly-Leu-Ser-Ile-Gly.
miteinander verwandt, wie das im Beispiel 1.2 beschrieben wurde.
unterscheiden, zeigt, daß ein hohes Maß an Homologie vorhanden ist. Diese Daten zoigen eindeutig, daß die Gencodierungenfür die PG eng miteinander verwandt sind und Glieder einer Polygalacturonasegenfamilie sind.
Beispiel 5.1: Vermehrung und Reinigung der zur Transformation von A. niger verwendeten Plasmide Plasmid ρGW635, dos eine verkürzte Version von pGW613 ist (Goosen u.a., Ref. 13) und das auch das pyrA-Gen enthält, und Plasmid pGW 1800, welches das Polygalacturonase Il-Gen enthält, werden in E. coil MH1 bzw. JM109 vermehrt. Plasmid pGW1900 wird in E. coil DH5aF' vermehrt. Plasmid-DNA wird von 250ml Übernachtkulturen gewonnen, wie das von Maniatis u.a. (S.90-91; Ref. 6) und im Beispiel 3.7 beschrieben wurde.
Beispiel 5.2: Herstellung von Protoplasten und Transformation des urldlnauxotrophen mutanten A. niger-Stammes N 593 Der A. nlger-Stamm N 593 (cspA, pyrA), der ein Abkömmling des Elternstammes N400 ist, wurde durch positive Selektion anhand des toxischen 5-fluororotinsäureartigen Analogs in Hefe gewonnen (Boeke u.a., Ref. 14) bei Vorhandensein von Uridin, wie das von Goosen u.a. (Ref. 13) beschrieben wurde.
Flüssiges Minimalmedium, das mit 0,5% Hefeextrakt, 0,2% Casaminosäuren, 1OmM Uridin (Janssen Chemie) und 5OmM Glucose ergänzt ist, wird mit 106 Konidiosporen von A. niger N 593 je ml geimpft und 20 Stunden lang bei 3O0C in einem New Brunswick-Orbitalschüttelapparat inkubiert. Das Mycel wird durch Filtrieren durch Miracloth gewonnen, mit isoosmotischem Minimalmedium (STC) mit der folget den Zusammensetzung gewaschen: 1,33M Sorbitol, 1OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,5OmM CaCI2. Eine Menge von 1 g des Mycels wird in 20ml STC erneut suspendiert. Innerhalb ven 2 Stunden werden aus dem Mycel Protoplaste durch den Zusatz von 150mg filtersterilisiertem Novozym 234 (Novo Industries, Dänemark) und Inkubieren des Gemischs bei 30°C in einer Schüttelmaschine, die mit 95 U/min arbeitet, freigesetzt. Die Protoplaste werden von dem restlichen Mycel durch Filtrieren unter Verwendung eines Trichters mit einem Stöpsel aus Glaswolle getrennt. Dann wird kaltes STC bis zu einem Volumen von 40ml zugesetzt, und das Gemisch wird für die Dauer von 10min auf Eis gegeben. Die Protoplaste werden durch Zentrifugieren (10min, 2500U/min) gewonnen, und das Pellet wird wieder in 5ml STC suspendiert. Die Protoplaste werden ein weiteres Mal pelletiert und schließlich in 1 ml kaltem STC wieder suspendiert.
Zur Transformation werden 5 χ 108 Protoplaste in 200μΙ aufgenommen, die dann zusammen mit 1 Mg pGW 635 und 20 pg pGW1800 oder pGW1900 inkubiert werden. Nach dem Zusatz von Plasfnid-DNA zu den Protoplasten werden 50 μΙ PCT(IOmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,50 mM CaCI2,25% PEG 6000) zugesetzt, und dieses Inkubationsgemisch wird 20min auf Eis gehalten. Dann werden weitere 2ml PCT zugesetzt, und das Gemisch wird weitere 5min bei Zimmertemperatur inkubiert. Schließlich werden 4ml STC zugesetzt und gemischt. Aliquote dieser abschließenden Transformationslösung zu 1 ml werden mit 4 ml verflüssigtem, isoosmotischem MM-Top-Agar, oas durch 0,95M Sucrose stabilisiert war, gemischt. Das Protoplastgemisch wird sofort auf Agar-Platten, welche das gleiche isoosmotische Minimalmedium enthalten, plattiert, und diese werden bei 3O0C inkubiert. Zu
den angemessenen Kontrollexperimenten gehören ähnlich behandelte Protoplaste ohne Plasmid-DNA und solche auf nichtstabilisiertem Minimalmedium mit 2,5mM Uridin.
Nach drei Tagen Wachstum bei 3O0C erscheinen gut wachsende Transformanten, die Sporen bilden (150 Transformanten/pg pGW635). Außerdem erscheint eine große Zahl von vermutlich abortiven Transformanten. Etwa 300 Transformanten erhält man mit pGW1800 und etwa 100 mit pGW1900. Von jedem der Transformanten mit pGW1800 und pGW1900 werden willkürlich zwanzig Kolonien herausgenommen, es werden Sporen von einzelnen Transformanten genommen und getrennt auf 5OmM-Glucose-Minimalmedium plattiert, um einzelne Kolonien zu erhalten, die ein weiteres Mal gereinigt und anschließend zur Vermehrung der Sporen für die weitere Transformantenanalyse verwendet werden.
Beispiel 5.3: Selektion von polygalacturonase-überproduzlerenden Cotransformanten des A. niger-Stammes N593 durch Haloblldung auf pectlnhaltlgen, festen Medien
Etwa 200 Kolonien, die mit pGW 1800 transformiert worden waren, und etwa 100 Kolonien, die mit pG 1900 transformiert worden waren und die auf die im Beispiel 5.2 beschriebene Weise gewonnen wurden, sind auf eine Zunahme der Polygalacturonaseaktivität nach einem Koloniesichtungsverfahren ohne vorheriges Reinigen geprüft worden. Das zum Sichten verwendeto Medium setzt sich zusammen aus 2% Glucose, 0,5% Apfelpectin (34,8% Veresterungsgrad, Obipektin, Bischoffszell) Minimalmediumsalzen und Sporenelementen; 6g/l NaNO3; 0,2% Hefeextrakt; 0,2% Pepton, 0,004% Triton X-100 und 1,2% Agar. Die Petrischale wird in der Mitte geimpft und 2 Tage lang bei 30°C inkubiert. Die Kolonien werden über Nacht kalt aufbewahrt. Dann wird die Oberfläche der Platte durch Hinzufügen einer Überschicht von 5ml einer 0,05%igen Rutheniumrotlösung gefärbt, und es wird 5 min unter Schütteln inkubiert. Der ungebundene Farbstoff wird dann durch Waschen mit destilliertem Wasser für weitere 5min entfernt. Die Produktion von Polygalacturonase unter diesen Bedingungen wird durch die Größe des gebildeten Hofs angezeigt. Etw<i 50% der auf diese Weise analysierten Transformanten hat eine Polygalacturonaseaktivität, die höher als die des Wildtyps ist.
Zwanzig Kolonien der pGW1800-Transformanten und sieben der pGW1900-Transformanten werden auf der Grundlage der Größe des Hofes, der auf pectinhaltigen, festen Medien gebildet wird, herausgenommen, und nach einer zweiten Sichtung mit diesen positiven Kolonien nach 45 Stunden Wachstum werden jeweils sechs der Transformanten abschließend herausgenommen und auf die im Beispiel 5.2 beschriebene Art und Weise gereinigt.
Beispiel 5.4: Genomanalyse von A. niger-Stammen, die mit Polygalacturonase Il transformiert wurden Transformanten, die nach den Beispielen 5.2 oder 5.3 gewonnen wurden, sowie der Elternwildstamm N402 werden auf einem flüssigen Minima/medium gezogen, das mit 0,5% Hefeextrakt, 0,2% Casaminosäuren, 5OmM Glucose und NaNO3 (6g/l) ergänzt war. Nach 18 Stunc'jn Wachstum bei 30°C wird die DNA extrahiert und auf das Vorhandensein von ^transformierendem Plasmid analysiert. A. nlger-DNA wird wie oben beschrieben isoliert.
Aufschließungen der chromosomalen DNA (2pg) werden bei 370C in einem Reaktionsvolumen von 200μΙ ausgeführt, das aus 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 8,0,1OmM MgCI2,10OmM NaCI und 4mM Spermidin besteht, das auf einen pH-Wert von 7,5 abgestimmt wurde, wozu Tris-Base verwendet wurde, bevur es dem Reaktion.sgemisch zugesetzt wurde. Es werden 20 Einheiten sowohl von EcoRI als auch von Sail zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden lang bei 370C inkubiert, dann werden weitere 20 Einheiten der beiden Enzyme zugesetzt, und die Inkubation wird über weitere 2 Stunden fortgesetzt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch (200μΙ) mit 100μΙ Chloroform extrahiert. Die DNA wird danach aus der wäßrigen Phase durch den Zusatz von 1Ao eines 3M Natriumacetatpuffers, pH-Wert 5,2, und von 2,5 Volumen Ethanol ausgefällt. Nach einer einstündigen Inkubation bei 40C und nach der Zentrifugierung wird das DNA-Pellet luftgetrocknet und in 20 μΙ Probenpuffer ausgelöst. DNA von den Transformanten und von A. niger N402, digeriert mit EcoRI/Sall, wird durch Hybridisation der Southern-Blots in der vorstehend beschriebenen Art und Weise mit dem 1,2 kbp-BamHi/Bglll-Fragment von pGW 1800 als PGII-Sonde analysiert. Es wird eine Cotransformationshäufigksit von mehr a!s 75% ermittelt. Durch Southern-Blotting wurde eine Zahl von 9 Transformanten analysiert. Die Sonde hybridisiert mit einem großen genomischen Fragment in N402. In den genomischen Blots der Transformanten, welche pGW1800-Sequenzen enthalten, wird ein EcoRI-Sal-Einschub zu 4,1 kbp festgestellt. Die Intensität dieser Bande variiert in Abhängigkeit von der Kopienummer. In den analysierten Fällen wird das genomische Fragment, welches das Gen des Wildtyps darstellt, immer gefunden, was auf eine heterologe Integration hinweist. Die Analyse der Produktion von Polygalacturonase Il in einem A. niger-Transformanten, nachstehend als N593/pGW 1800-27 bezeichnet, wird als detailliertes Beispiel (Beispiel 6) gegeben. Aus einer DNA-Verdünnungsserie wird die Kopienummer als wenigstens in der Größenordnung von 20 geschätzt. Neben dem wildtyphybrir'isierenden Fragment und dem 4,1 kbp-Fragmont werden einige andere, kleinere hybridisierende Fragmente in diesem Stamm gefunden, welche Gronzfragmente von Integrationsereignissen Typ Il oder Umstellungen darstellen.
Beispiel 5.5: Produktion von Polygalacturonase Il durch transformierte A. nlger-Stamme und durch A. nlger N402 Zwanzig dar pGW1800-Transformanten, die im Beispiel 5.2 beschrieben wurden, und sechs der im Beispiel 5.3 beschriebenen pGW1800-Transformanten werden auf einem Medium gezogen, das aus einem Minimalsalzmedium besteht, dem Harnstoff (4,2 g/l), 1 % (Gew./Vol.) Apfelpectin (Veresterungsgrad 61,2%) und 1 % (Gew./Vol.) Weizenkleie zugesetzt werden. Die Kulturen werden 43 Stunden lang bei 30°C bei 250U/min in einem Gallenkamp-Orbitalschüttelapparat gezogen, und es werden Kulturfiltrate gewonnen. Das Mycel wird durch Filtrieren über Miracloth unter Verwendung eines Büchner-Trichters entfernt. Der Gehalt dieser Proben an PGII wird durch Western-Blotting bestimmt, das unter Anwendung der alkalischen Phosphatasenachweismethode nach den Anweisungen des Biorad-Instruktionsmanuals ausgeführt wird. Auf der Grundlage der Signale auf den Western-Blots produzierten 70% der 20 Transformanten, die willkürlich aus den im Beispiel 5.2 gewonnenen herausgegriffen wurden, wesentlich mehr Polygalacturonase Il als A. nlger N 402. Die Transformanten, die auf der Grundlage der Hofgröße unter Anwendung der Plattensichtungsmethode ermittelt wurden (siehe Beispiel 5.3), produzieren alle signifikant mehr Enzym als A. nlger N402.
Der A. nlger-Stamm N 402 und drei der Transformanten, die als N 593/pGW 1800-27, N 593/pGW 1800-30 und N 593/pGW 1800-37 bezeichnet werden, werden zur Messung der Polygalacturonaseaktivität ausgewählt. Die drei letztgenannten Stämme stammen aus dem Satz von pGW1800-Transformanten, die im Beispiel 5.2 gewonnen wurden.
N 593/pGW 1800-30 und N 593/pGW 1800-37 enthalten beide mehrere Kopien von pGW 1800, aber weniger Kopien als N 593/ pGW 1800:27. Diese Stämme werden auf einem 1 %igen Pectinmedium (Veresterungsgrad 61,2 %) gezogen, dem 1 % (Gew./Vol.) getrocknete und gemahlene Zuckerrübenpulpe zugesetzt ist, wobei nach den oben beschriebenen Bedingungen gearbeitet wird.
Um reduzierende Zucker und Inhibitoren der PG-Aktivität zu entfernen, wird PGII nach der Fermentierung unter Verwendung von kreuzvernetztem Alginat partiell gereinigt. Ein Milliliter des Kulturfiltrats wird mit 1 ml von 2OmM Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,2, verdünnt und dann einer kleinen Säule mit einem Packungsvolumen von 2 ml kreuzvernetztem Alginat (5,2 ml/g), in diesem Puffer äquilibriert, zugesetzt. Anschließend wird die Säule mit 4ml Natriumac6tatpuffer gewaschen, und dann wird die PGII-Aktivität pulsierend aus der Säule bestimmt, wobei 4 ml voi 2OmM Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,2, verwendet werden, dem 1M NaCI zugesetzt wurden. Die PG-Aktivität in dem Eluat wird dann in der beschriebenen Weise bestimmt (Ref. 2), und aus dem ermittelten Wert wird die PG-Aktivität im Kulturfiltrat errechnet.
Die folgenden PG-Aktivitäten wurden für Kulturfiltrate berechnet, die zwanzig Stunden nach der Inokulation gewonnen wurden: 2,2,5,6,5,8 und 10,8 Einheiten/ml für die Stämme N402, N 593/pGW 1800-30, N 593/pGW 1800-37 bzw. N 593/pGW 1800-27. Für die nach vierzig Stunden gewonnenen Kulturfiltrate lauten diese Werte, in der gleichen Reihenfolge, 2,8,13,7,16,4 und 30,9 Einheiten/ml.
Es hat also den Anschein, daß pGW1800 erfolgreich zur Transformation von A. nlger verwendet werden kann, um eine weit höhere PG-Aktivität zu erzeugen.
Beispiel 5.6: Produktion von Polygalacturonase I durch transformierte A. nlger-Stämme und durch A. nlger N402 und N 593 Siebzehn der pGW1900-Transformanten, die im Beispiel 5.2 beschrieben wurden, und sechs der pGW-Transformanten, die im Beispiel 5.3 beschrieben wurden, sowie A. nlger N 402 und ein pyr+-Transformant von N 593 werden auf einem Medium gezogen, das aus einem Minimalsalzrrediurr n<?teht, dem Harnstoff (4,2g/l), 1 % (Gew./Vol.) Apfelpectin (Veresterungsgrad 61,2%), 1 % Zuckerrübenpulpe zugesetzt werden, u. j Kulturen werden 64 Stunden lang bei 30°C unter Verwendung eines Gallenkamp-Orbitalschüttelapparates, der mit 250 U/min arbeitete, gezogen und zwischendurch werden nach 20 Stunden und nach 39 Stunden Proben des Kulturfiltrats genommen. Der Gehalt dieser Proben an PGI wird wie der PGII-Gehalt im Beispiel 5.5 durch Western-Blotting untersucht.
Auf der Grundlage der Signale auf den Western-Blots kann festgestellt werden, daß von den 23 geprüften Transformanten 65% signifikant mehr PGI als A. nlger N402 produzieren. Die auf dor Grundlage der Hofgröße ausgewählten Transformanten erzeugen alle mehr PGI als A. nlger N 402, und vier von sechs Transformanten sind starke Produzenten. Aus Aktivitätsmessungen geht hervor, daß in diesem Medium die Aktivität nach 20 Stunden höher als nach 39 Stunden ist. Nimmt man 12 verschiedene PGI-transformierte A. niger-Stämme, variiert die Aktivität zwischen 2,8 und 7 Einheiten/ml, während der nichttransformierte Kontrollstamm N402 und ein A. nlger-N 593/pGW635-Transformant 0,5 bzw. 0,8 Einheiten/ml produzieren. Diese Aktivität ist zumindest teilweise das Ergebnis der Wj jdtyppegel für PGI und PGII, während die Steigerung bei den Transformanten das Ergebnis einer stärkeren PGI-Expression ist.
Der A. nlger-Transformant N 593/pGW 1800-27, der im Beispiel 5.4 beschrieben wurde, wird auf Komplettmedium in Petrischalen 3 bis 4 Tage lang bei 300C gezogen, um Konidien zu produzieren. Die Konidien werden in 5ml sterile Salzlösung geerntet, die je Platte 0,005% Tween 80 enthält. Die Sporensuspension wird auf einem Griffin-Schüttelapparat 20min lang gerührt, und nach dem Zählen der Sporen werden 10* Sporen/ml in siliconisierte Erlenmeyerkolben zu 11 Fassungsvermögen, welche 300ml steriles Wachstumsmedium enthielten, gegeben. Dieses Medium ist ein Minimalmedium, das 70 mM Ammoniumchlor. J ais Stickstoffquelle und 1 % (Gew./Vol.) Apfelpectin (Veresterungsgrad 61, %) und 1 % (Gew./Vol.) Zuckerrübenpulpe als Kohlenstoffquellen onthält. Das Mycel wird 43 Stunden bei 3O0C unter Verwendung eines Gallenkamp-Orbitalschüttelapparates, der mit 200U/min arbeitete, gezogen. Nach dem Wachstum wird das Mycel durch Filtrieren durch Miracloth unter Verwendung eines Büchner-Trichters entfernt. Das Kulturfiltrat wird unter Verwendung von 1NNaOH auf einenpH-Wert von 4,2 abgestimmt. In allen weiteren Schritten wird 0,02% Natriumazid zugesetzt, um ein mikrobielles Wachstum zu verhindern.
Beispiel 6.2: Reinigung von Polygalacturonase II, die aus dem A. nlger-Transformanten N593/pGW 1800-27 gewonnen wurde Das Kulturfiltrat (ca. 2,5I) wird einer kreuzvernetzten Alginatsäule (2,5cm X 25cm) zugeführt, die mit 2OmM Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,2, äquilibriert worden war. Nach der Beschickung wird die Säule nacheinander mit einem Bettvolumen des Äquilibrationspuffers, einem Bettvolumen von 2OmM Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,6, einem linearen Salzgradienten zu 1200ml (0-0,5M NaCI) im vorangegangenen Puffer und abschließend mit 275ml einer 1M NaCI-Lösung in dem gleichen Puffer eluiert. Es werden Fraktionen zu je 6ml aufgefangen und auf ihre enzymatische Aktivität geprüft, wie das im B' ,spiel 1.1 beschrieben wurde. Der mittlere Teil der aktiven Fraktionen wird zusammengefaßt und dreimal anhand eine? 2OmM bis-Tris-HCI-Puffers, pH-Wert 6,0, dialysiert. Die endgültige Enzymlösung (475ml) wird dann einer DEAE-Sepharose-Schnellflußsäule (Pharmacia) zugeführt, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Nach dem Waschen wird ein NaCI-Gradient in dem gleichen Puffer angewendet, und die Polygalacturonaseaktivität wird bei etwa 10OmM Natriumchlorid eluiert. Die aktiven Fraktionen werden durch SDS-Poiyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Diese Fraktionen, die einen hohen Gehalt an PGII haben, werden zusammengefaßt (54 ml), anhand von 2OmM bis-Tris-HCI-Puffer, pH-Wert 6,0, dialysiert und weiter auf einer Säule Mono Q (Pharmacia) gereinigt, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Nach der Beschickung wird das Enzym durch Anwendung eines Salzgradienten (0-1M NaCI) eluiert.
Das Enzym wird willkürlich in zwei verschiedenen Pools A und B aufgefangen, die dem 0,2- bis O,26M-Teil des Natriumchloridgradienten und dem 0,26- bis O,34M-Teii des Gradienten entsprechen. Beide Fraktionen enthalten eine einzelne Proteinbande in derselben Position wie PGII, wenn sie einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen werden.
Es werden 200pg der PGII aus den kombinierten Pools A und B, die nach Beispiel 6.2 gereinigt wurden, dreimal anhand von 11 Millipore-filtriertem destillierten- Wasser dialysiert und lyophilisiert. Die Aminosäuresequenz wird so bestimmt, wie das im Beispiel 1.3 beschrieben wurde, unter Verwendung eines Gasphasenproteinsequeriziergerätes von Applied Biosystems, Modell 470A. Für das Enzym wird die folgende N-terminale Aminosäuresequenz bestimmt:
Position: 1 5 10
Aminosäure: aps-ser-X-thr-thr-phe-thr-ala-ala-ala-Position: 15 20
Aminosäure: ala-lys-ala-gly-lys-ala-lys-X-ser-thr-ile
Die Cysteinreste im Protein wurden nicht modifiziert und werden daher nicht festgestellt. Es ist wahrscheinlich, daß sie in der Position 3 (X) und in der Position 18 (X) der Sequenzen auftreten (siehe Beispiel 1.3). Die drei letzten Aminosäurereste werden nur auf niedrigem Pegel festgestellt. Die für dieses reine Enzym ermittelte Sequenz entspricht genau der Aminosäuresequenz des N-Tecminus von PGII, die aus der Nucleotidsequenz des PGII-Gens abgeleitet wurde (siehe Beispiel 4 und Abb.4, Formel II). Die entsprechende Nucleotidsequenz zeigt auch Cysteinreste in den erwarteten Positionen, d.h. bei den Resten 3 und 18. Diese Sequenz entspricht auch der Sequenz, die für das Cyanogenbromidfragment zu 5kDa bestimmt wurde (siehe Beispiel 1.3), und sie entspricht folglich dem N-Terminus von Protein.
Beispiel 6.4: Eigenschaften von Polygalacturonase II, die aus dem Transformanten N593/pGW 1800-27 gereinigt wurdo Dar Enzym, das nach Beispiel 6.2 gereinigt wurde, wurde mit dem Enzym verglichen, das aus Rapidase gereinigt wurde, wie das im b ispiel 1.1 beschrieben wurde. Beide Enzyme haben eine identische scheinbare Molekulmasse von 38kDa auf SDS-Polyatrylamidgelen, und sie reagieren identisch mit polyklonalen Antikörpern, die anhand von PGII gezogen wurden. Ein monoklonaler Antikörper, der nur mit einem kontinuierlichen Epitop von PGII, nicht aber mit PGI, IHA, HIB oder IV reagiert, reagiert auch mit dem nach Beispiel 5.2 gereinigten Enzym. Bei der isoelektrischen Fokussierung weist die nach den Beispielen 6.1 und 6.2 produzierte und gereinigte PGII eine scharfe Bande bei einem pl-Wert auf, der mit dem von PGII identisch ist (pl = 5,2). Auf Grund der Mikroheterogenität von PGII wurde eine Reihe anderer Banden mit niedrigeren pl-Werten beobachtet, wenn mit einem pH-Wert-Gradienten von pH-Wert 3 bis 7 oder von pH-Wert 3-10 gearbeitet wurde. Ähnliche Muster erhält man bei der Verwendung von PGII, die nach Beispiel 6.1 hergestellt worden war.
DNA wird aus A. nlger NW756 unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens isoliert. Die DNA wird mit den Enzymen BamHI, EcoRI und der Kombination dieser Enzyme beschränkt, wie das im Beispiel 5.4 beschrieben wurde. Die DNA-Fragmente werden dann auf einem 0,6%igen Agarose-Gel getrennt, und sie werden anschließend auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, wie das im Beispiel 3.7 beschrieben wurde. Die gebackene Membran wird 2 Stunden lang bei 60°C in einem vorgewärmten Hybridisationspuffer vorhybridisiert, der aus 1 % BSA (Boehringer), 1 mM EDTA, 0,5 M Natriumphosphat, pH-Wert 7,2 (zugesetzt aus einem Vorrat von 1M, der aus 89,0g Na2HPO4 2H2O und 4ml von 85%iger H3PO4 je Liter zusammengesetzt ist) und 7% SDS besteht, wie das von Church und Gilbert (Ref. 38) beschrieben wird, und dem gescherte und denaturierte Heringssperma-DNA bis zu einer Konzentration von 0,1 mg/ml zugesetzt wurde. Das einer Nick-Translation unterzogene 1,2kbp-BamHI-Bglll-Fragmentvon pGW1800, das wie im Beispiel 3.7 hergestellt wurde, wird dann zugesetzt, und man läßt die Hybridisation untersanftem Schütteln 44 Stunden lang bei 600C weitergehen. Dann wird die Membran zweimal mit vorgewärmten (60°C) Hybridisationspuffer (ohne Heringssperma-DNA) für 10min gewaschen. Anschließend wird die Membran zweimal 20min bei 6O0C in einem vorgewärmten Puffer gewaschen, der aus 5x SSC, 0,1 % SDS und 0,1 % Na4P2O7 10H2O besteht. Dann wird die Membran getrocknet und 3 Tage lang bei -600C einem Kodak-Film XAR5 ausgesetzt. Unter diesen Bedingungen wird keine unspezifische Hybridisation beobachtet, was sich aus dem Fehlen eines signifikanten Ausstrichpräparats an hybridisierenden DNA-Fragmenten und außerdem aus dem Fehlen der Hybridisation der Sonde mit Lambda-Größenmarkern ergibt. In jeder Bahn werden mehrere hybridisierende Banden beobachtet, wobei in jeder Bahn eine Bande intensiver als die anderen Banden ist. Diese intensiven Banden stimmen mit dem 3,3kbp-Fragment in der BamHI-Aufschließung, einem größeren Fragment als 20kbp in der EcoRI-Aufschließung und einem 3,3kbp-Fragment in der BamHI/ EcoRI-Doppelaufschließung überein. Die Banden mit der geringeren Intensität stimmten mit den Fragmenten von 17,9,5,6,4 und 2,0 kbp in der BamHI-Aufschließung, den Fragmenten von 15,12,65 und 4,8 kbp in der EcoRI-Aufschließung und den Fragmenten von 7,6,6,4,4,0,3,7 und 2,0kbp in der BamHI/EcoRI-Doppelaufschließung überein.
Aus der Tatsache, daß spezielle Hybridisationssignale beobachtet werden, ergibt sich, daß das PGII-Gen von A. nlger N400 verwendet werden kann, um spezielle Sequenzen in der DNA nachzuweisen, die von A. niger NW756 gewonnen wurde. Es wird angenommen, daß die Fragmente, welche starke Hybridisationssignale ergeben, das PGII-Gen tragen. Im Prinzip kann sich ein schwach hybridisierendes Fragment herausbilden, wenn ein Restriktionsenzym die DNA innerhalb und in der Nähe des Endes des Bereichs schneidet, der mit der verwendeten Sonde homolog ist. Das kann jedoch nicht vollständig die Anzahl der hybridisierenden großen Fragmente erklären, die im vorliegenden Beispiel beobachtet werden. Daraus ergibt sich, daß spezielle DNA-Sequenzen nachgewiesen wurden, die Homologie mit dem PGII-Gen aufweisen, aber nicht mit diesem identisch sind. Es wird angenommen, daß diese DNA-Sequenzen unterschiedliche PG-Gene sind, was mit der Tatsache übereinstimmt, daß Polygalacturonasen Homologie beim Proteinpegel aufweisen (siehe Beispiel 1.4).
Unter Verwendung von E. coli LE?92 werden etwa 1 χ 10* Phagen von der A. nigar-N400-Bank auf 5 Platten plattiert, und von jeder Platte werden drei Nitrocellulose-Replikate gemacht, wie das im Beispiel 3.4 beschrieben wurde, wobei der dritte Filter oben auf einer Platte 5min inkubiert wird. Der erste und der zweite Filter jeder Platte werden unter Bedingungen behandelt, die als „hetarolog" bezeichnet werden.
Der dritte Filter wird strengen Bedingungen unterzogen, die als „homolog" bezeichnet werden. Vorhybridisierung, Hybridisierung und Waschen der Filter werden bei 6O0C unter heterologen Bedingungen und bei 680C unter homologen Bedingungen ausgeführt. Nach dem Backen werden die Filter in 3x SSC benetzt und dann zwei Stunden lang in vorgewärmtem Hybridisationspuffer vorhybridisiert, der aus 10x Denhardt's (siehe Beispiel 3.4), 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,2OmM EDTA, pH-Wert 8,0,1M NaCI, 0,5% SDS und 0,1 % Natriumpyrophosphat besteht, dem 0,1 mg/ml gescherte und denaturierte Heringssperma-DNA frisch zugesetzt werden. Die Filter werden dann einzeln in einen Kolben übertragen, der 50 ml
Hybridisationspuffer, einschließlich Heringssperma-DNA, enthält, welchem vorher das der Nick-Translation unterzogene BamHI-Bglll-Fragment zu 1,2 kbp von pGW 1800 zugesetzt worden war. Man läßt die Hybridisation weitere 40 Stunden ablaufen, und anschließend werden die Filter unter homologen oder heterologen Bedingungen gewaschen. Folgendes sind die homologen Waschbedingungen: Die Filter werden zweimal eine halbe Stunde in 2x SSC, 0,1 % SDS und 0,1 % Natriumpyrophosphat und anschließend zweimal eine halbe Stunde in 0,2x SSC, 0,1 % SDS und 0,1 % Natriumpyrophosphat gewaschen. Folgendes sind die heterologen Bedingungen: Die Filter werden zweimal eine halbe Stunde in Hybridisationspuffer, dann eine halbe Stunde in 4x SSC, 0,1 % SDS und 0,1 % Natriumpyrophosphat und abschließend in 2x SSC, 0,1 % SDS und 0,1 % Natriumpyrophosphat gewaschen. Die Filter werden an Luft getrocknet und 3 Tage lang bei -60°C unter Verwendung intensivierender Schirme einem Kodak-Film XAR 5 exponiert. Die Phagen, welche positive Signale geben, werden wie im Beispiel 3.4 gewonnen.
Auf den Filtern, die den homologen Bedingungen ausgesetzt waren, wurden 7 positive Signale armittelt, die auch an den entsprechenden Positionen auf Filtern vorhanden sind, die heterologen Bedingungen ausgesetzt waren. Diese Signale werden als das Ergebnis von rekombinanten Lambda-Phagen, welche das PGII-Gen tragen, betrachtet. Von diesen Signalen abgesehen, wurden auf den Filtern, die heterologen Bedingungen ausgesetzt waren, 30 positive Signale gewonnen, und diese Signale sind in der entsprechenden Position auf beiden Filtern vorhanden. Die Signalstärke ist bei diesen 30 Signalen unterschiedlich. Die Mehrzahl dieser Signale wird als das Ergebnis von Phagen betrachtet, welche ein von PGIi-Gen verschiedenes PG-Gen enthalten.
Die A. nlger-N 400-Genombank wird ein zweites Mal gesichtet. In der oben beschriebenen Weise werden Plaque-Lifts ausgeführt. Von der Temperatur abgesehen, wird die Hybridisation in der oben beschriebene Art und Weise ausgeführt. Hybridisation und Waschen erfolgen bei einem dor beiden von einer Platte gewonnenen Filter bei 620C, während der andere Filter bei 68"C hybridisiert und gewaschen wird. Nach dem Hybridisieren werden die Filter unter starken SSC-Bedingungen (HSSC-Bedingungen) bei 620C bzw. bei 68°C gewaschen. Folgendes sind die HSSC-Bedingungen: Die Filter werden zweimal 5 Minuten lang in 4x SSC gewaschen, dann werden die Filter zweimal eine halbe Stunde lang in 4x SSC und anschließend zweimal eine halbe Stunde lang in 2x SSC gewaschen, wobei die verwendeten SSC-Lösungen auch 0,1 % SDS und 0,1 % Natriumpyrophosphat enthalten.
Auf den bei 68 0C inkubierten Filtern („homologe" Hybridisationsbedingungen) wurden fünf starke, positive Signale ermittelt, die auch in der entsprechenden Position auf den bei 620C inkubierten Filtern vorhanden sind. Die Restriktionsanalyse eines dieser Phagen nach Beispiel 3.5 zeigt, daß dieser Phage einen Einschub enthält, auf dem sich das Gen mit der Codierung für PGII (pgall) befindet. Es wird daher davon ausgegangen, daß diese fünf Phagen alle pgall enthalten. Außerdem sind auf den bei 620C inkubierten Filtern („heterologe" Hybridisationsbedingungen) 17 positive Signale vorhanden, die auf den entsprechenden, bei 680C inkubierten Filtern nicht oder nu. schwach hybridisieren. Die Signalstärke bei diesen 17 Signalen ist unterschiedlich. Sechzehn Phagen vor der ersten Sichtung und 10 Phagen von der zweiten Sichtung, die nicht pgall enthalten, werden für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Diese Phagen werden unter den Bedingungen gereinigt, die für den ursprünglichen Nachweis angewendet wurden. Die charakterisierten Phagen sind die in der Tabelle VII aufgeführten Phagen und acht zusätzliche Phagen (Nummern 2,3,7,31,33,40,41,42). Die mit 1 bis 30 nummerierten Phagen wurden bei der ersten Sichtung der Bank ermittelt, während die Phagen mit der höheren Zahl bei der zweiten Sichtung ermittelt wurden.
Um zwischen den Phagen zu unterscheiden, welche das Polygalocturonsse I-Gen enthalten, und denen, welche andere, mit Polygalacturonase Il verwandte Sequenzen enthalton, werden Plaque-Lifts der ausgewählten Phagen mit dem vorher einer Nick-Translation unterzogenen 1,8kbp-Hindlll-Fragment von pGW1900 (Beispiel 3.9) hybridisiert. Die Hybridisation erfolgt bei 620C, während auch das Waschen bei 620C unter Verwendung einer Reihe von SSC-Puffern erfolgt, die alle 0,1 % SDS und 0,1% Natriumpyrophosphat enthalten (4 χ SSC, 2 χ SSC, Ix SSC, 0,5x SSC, 0,2 χ SSC und 0,1 χ SSC; Inkubationszeit je Puffer eine halbe Stunde). Unter Anwendung dieser Bedingungen ergeben die Phagen 2,3,7,40,41 und 42 starke Hybridisationssignale, die mit dem Signal vergleichbar sind, das bei dem Phagen PGI-X7 ermittelt wurde, welcher das pgal-Gen trägt (Beispiel 3.6). Die Restriktionsanalyse der DNA, die von einem dieser Phagen ermittelt wurde, zeigt auch, daß dieser Phage einen Einschub enthält, auf dem sich das pgal-Gen befindet. Es wird daher davon ausgegangen, daß diese sechs Phagen alle das pga-Gen enthalten. Die anderen analysierten Phagen (1,8,31,33,35,36,37,38,43) ergeben, wenn überhaupt, nur ein schwaches Hybridisationssignal, und diese Phagen enthalten daher das pgal-Gen nicht.
Um herauszufinden, welche Phagen identische Fragmente enthalten, wird aus den in der Tabelle VII angegebenen Phagen DNA auf die Art und Weise isoliert, die im Beispiel 3.5 beschrieben wurde, und wie im Beispiel 3.6 beschrieben digeriert, und die resultierenden Fragmente werden anschließend durch Southern-Blot-Analyse charakterisiert. Für die Analyse von Hlnf I- und Hlncll-Aufschließungen wird der Agarosegehalt der Gele auf 1 % (Gew./Vol.) erhöht. Southern-Blots weiden bei 60°C mit dom vorher einer Nink-Translation unterzogonen 1,2kbp-BamHI/EroRI-Fragment von pGW1803 hybridisiert, das Waschen erfolgt gleichfalls bei 600C, wobei die oben beschriebenen HSSC-Bedingungen angewendet werden. Die Restriktionsenz> me, die als nützlich für eine anfängliche Klassifikation bei diesen Phagen ermittelt werden, sind eine Kombination von BamHI und BgIII und von Hlnfl und Hincll, wobei die letzteren Enzyme getrennt eingesetzt werden. Hlncll und Hlnfll erzeugen in der Regal kleine Restriktionsfragmente, was im vorliegenden Fall die Möglichkeit, daß die resultierenden hybridisierenden Fragmente neben der pgall-verwandten Sequenz DNA, die vom EMBL4-Vektor abgeleitet wurde, enthalten, auf ein Minimum reduziert wird.
Klassifizierung von PGII-verwandten λ-Phagen auf der Grundlage der Größe der hybridisierenden λ-DNA-Fragmente (kbp), die nach dem Aufschließen von DNA, die aus diesen Phagen isoliert wurde, mit Hincll, Hlnfl und Bglll/BamHI und manchmal mit Sail unter Verwendung des 1,2 kbp BamHI/EcoRI-Fragmentes von pGW 1803 als Sonde ermittelt wurden
tionsenzym
λ-Phagen, die zu den entsprechenden Klassen gehören: 9, 10, 4, 1, 16, 8, 6, 5 17,
43 35, 36 20, 11, 36 27
37 12
| Fragmentlänge (kbp) | 2,4 | 1,75 | 1,3; | 1,3; | 2,3 | 3,0(λ-17) | |
| Hincll | 1,25 | 0,4 | 0,78 | 4,9(λ-27) | |||
| 1,1 | 1,28 | 1,8 | 0,65 | 0,6 | |||
| Hlnfl | 0,7; | ||||||
| 0,3 | 3,1 | 8,7 | 1,7 | 4,1 | 2 23 | ||
| Bglll/BamHI | 7,2; | (λ-4) | (λ-20) | (λ-6) | |||
| 0,56 | |||||||
| (λ-10) | n.d. | 6,8 | 1,3; | n.d. | |||
| Sail | 6,9 | (λ-16; | 0,5 | ||||
| λ-20) | |||||||
a Phagen mit der Nummer 16 und 20 weisen auch ein 1,64kbp-KPnl-Fragment und ein 1,38kbp-Hlncll/Xpnl-Fragment auf. b Phagen der Klasse G hybridisieren unter nicht-strengen Bedingungen nur schwach mit PGII. n. d. = keine Aufschließung ausgeführt.
Aus den in der Tabelle VII aufgezeigten Daten geht hervor, daß bei den meisten Klassen von Phagen mehrere repräsentative Phagen unabhängig voneinander isoliert wurden. Ausgehend von der Tatsache, daß nur eine Auswahl aller hybridisierenden Signale in die anfängliche Sichtung einbezogen wurde, gibt die Anzahl der λ-Phagen, die für die einzelnen Klassen ermittelt wurde (Klasse A: 3; B: 3; C: 4; D: 3; E: 2), an, daß bei einer ähnlichen Frequenz unterschiedliche Gene gefunden werden. Beim Fall von PGI ist diese Zahl größer (6 von 26 analysierten Phagen), während PGII-haltige Phagen an derselben Frequenz (12 von analysierten Phagen) gefunden werden. Die Klasse G hybridisiert schwächer mit beiden Sonden, die entweder vom PGI-Gen oder vom PGIII-Gen abgeleitet wurden. Neben einem hybridisierenden Fragment von 3,0 und 4,9kb in den Phagen mit der Nummer 17 bzw. 27 werden in der Bgll/BamHI-Doppelaufschließung mehrere nichthybridisierende Fragmente gefunden, die in beiden Phagen identisch sind und die von den Einschüben abgeleitet werden, nämlich ein 5,6 kbp-, ein 5,1 kbp-, ein 1,45kbpundein O,57kbp-Fragment. Auch die Hindi- und Hlnfi-Aufschließungen der beiden Phagen sind annähernd die gleichen. Die in diesem Beispiel isolierten Phagen werden folgender, naßen umbenannt:
| A | 9 | λΡΰ-Α9 |
| 10 | λΡβ-ΑΙΟ | |
| 43 | λΡΰ-Α43 | |
| B | 4 | λΡΟ-Β4 |
| 35 | λΡΰ-Β35 | |
| 36 | λΡΟ-Β36 | |
| C | 1 | KPG-C1 |
| 16 | λΡΰ-ΟΙβ | |
| 20 | λΡα-Ο20 | |
| 37 | λΡΟ-Ο37 | |
| D | 8 | KPG-Di |
| 11 | λΡθ-Dn | |
| 12 | KPG-OM | |
| E | 6 | λΡΰ-Ε6 |
| 38 | λΡΰ·Ε38 | |
| F | 5 | K1PG-? S |
| G | 17 | KPG-GVl |
| 27 | KPG-G 27 | |
| nicht bestimmt | 31 | λΡΩ-Χ31 |
| nicht bestimmt | 33 | λΡΰ-Υ33 |
Phage APG-C20 (Beispiel 7.2; Phage 20, Klasse C) wird mit BgIII digeriert, und die resultierenden Fragmente werden auf Agarosegel getrennt. Die Gelscheiben, welche das hybridisierende 7,9kbp-Bglll enthalten, werden gewonnen, und das Fragment wird dann in der beschriebenen Art und Weise isoliert (Beispiel 3.6). Das Bglll-Fragment wird in den BamHI-digerierten und ClP-behandelten (Phosphatase aus Kälberdarm) pUC9 ligiert. Das Ligationsreaktionsgemisch wird zur Transformation von E. coll JM109 (Beispiel 3.6) verwendet. Mehrere der resultierenden weißen Kolonien werden auf YT-Agar gestrichen, das mit Ampicillin ergänzt worden war. Nachdem die Kolonien über Nacht gewachsen sind, werden sie auf einen Nitrocellulosefilter adsorbiert. Die Kolonien auf dem Filter werden dann aufgelöst, und die freigesetzte DNA wird durch Backen fixiert, wie das von
Maniatis u.a. (Ref. 6; S. 314) beschrieben wurde. Die gebackenen Filter werden in 2 χ SSC benetzt, und sie werden vorsichtig mit einer behandschuhten Hand gerieben, um die Bakterienzelltrümmer zu entfernen. Dann werden die Filter mit dem 1,2 kbp-Fragment von pGW 1803 unter Anwendung der heterologen Bedingungen hybridisiert, die im Beispiel 7.2 beschrieben wurden (6O0C, Waschungen mit 2x SSC). Ein positiver Klon wird ausgewählt, und die Plasrnid-DNA wird wie oben gereinigt. Die Plasmid-DN A wird dann für die Restriktionsanalyse verwendet, um eine physikalische Karte herzustellen.
Auf diese Weise wurde ein neues Plasmid konstruiert. pGW1910 (Abb. 7) ist das 7,8kbp-Bgll-Fragment des Phagen APG-C20, eingefügt in den BamHI-Ort des Vektors pUC9. Dieser Subklon umfaßt hybridisierende Fragmente des Phagen APG-C20, z. B. das Smal-Fragment zu 1,1 kbp und das Kpnl-Fragment zu 1,6kbp. Aus der Lage dieser Fragmente auf der physikalischen Karte von pGW 1910 wird abgeleitet, daß dieses Plasmid das vollständige PGC-Gen (pgaC) enthält.
Plasmid pGW1800 mit EcoRI digeriert und wie unten mit T4-Polymerase behandelt. Die Religation dieser DNA und die Transformation von E.coll DH SaF' erlauben die Isolierung eines Plasmids pGW 1800-E, welches das gleiche wie pGW 1800 ist, ausgenommen die Tatsache, daß die EcoRI-Spaltungsstelle deletiert wird.
Plasmid pGW1800-E wird mit BgIII digeriert und mit alkalischer bakterieller Phosphatase (BRL) bei Anwesenheit von 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 8,0, und 5OmM NaCI für die Dauer von einer Stunde bei 65°C behandelt. Die alkalische Phosphatase wird durch Aufschließung mit Proteinase K (Boehringer, Mannheim) und Phenolextraktion inaktiviert. Anschließend wird die DNA mit Ethanol ausgefällt, getrocknet und wieder in Wasser aufgelöst. Dann werden die klebrigen Enden wie unten mit T4-DNA-Polymerase gefOllt.
Plasmid pJDB207-IFN AM 119 (EP205404) wird mit Hindlll und CIaI digeriert. Die klebrigen Enden dieser linearen Fragmente werden mit T4-DNA-Polymerase (Boehringer, Mannhein) bei Anwesenheit von jeweils 0,1 mM dCTP, dGTP, dATP und dTTP plus 67mM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,6,7mM MgCI2,16,7mM (NH4J2SO4 und 5mM DTT 30min lang bei 370C gefüllt. Die Reaktion wird durch Erhitzen auf 650C für die Dauer von 5 min gestoppt. Die Fragmente werden in einem 0,8%igen Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur (BioRad) getrennt, und das 1,0kbp-Fragment, welches den IFN AM 119-Codierungsbereich umfaßt, wird herausgeschnitten, die DNA auf einer Elutip-D-Säule (Schleicher & Schull) gereinigt und mit Ethanol ausgefällt (Schmitt und Lohen, Ref. 34).
Es werden 100 ng des IFN AM 119-Fragmentes und der präparierte pGW1800-E-Vektor zusammen in 5μΙ 2OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmMMgCIj, 1OmMDTT, 1mM ATP und einer Einheit T4-DNA-Ligase (Boehringer, Mannheim) für die Dauer von 2 Stunden bei Zimmertemperatur ligiert. Dieses Gemisch wird in kompetente E. coll-DH5aF'-Zellen übertragen. Ampicillinresistente Transformanten werden durch Restriktionsaufschließung der Plas-nid-DNA gesichtet, um diejenigen zu identifizieren, welche den Plasmid-pGII-IFN AM 119-Vor!äufer tragen.
(Abbildungen 4 und 5)
Es wird die von R. M. Horton u. a. (Ref.35) beschriebene PCR-Methode angewendet, die in der Abb. 5 dargestellt ist.
pGW1800 wird durch Xbal-Aufschließung linearisiert und mit Ethanol ausgefällt. Nach der erneuten Suspension in Wasser werden 100 ng dieser DNA einer Vermehrung durch Polymerasekettenreaktion (PCR-Reaktion) unter Einsatz der Oligonucleotide A und B (Abb. 5) in einer automatischen Wärmezyklusvorrichtung für 25 Zyklen (die jeweils aus 1 min bei 940C, 2 min bei 4O0C und 3 min bei 720C bestehen) unterzöget), gefolgt von 10 Minuten bei 720C. Für jede Reaktion werden 10OpM jedes Nucleotiden und 0,5μΙ derTaq-Polymerase (Perkin Eimer Cetus) in einem Volumen von 100 μΙ unter Verwendung des vom Hersteller empfohlenen Reaktionspuffers eingesetzt. Das ergibt DNA1 (Abb. 5).
Ähnlich behandeltes pGW1800 mit den Oligonucleotiden A und C ergibt DNA2.
Ebenso ergibt pJDB207-IFN AM 119, linearisiert mit BamHI und der PCR mit den Oligonucleotiden D und F oder den Oligonucleotiden E und F unterzogen, DNA3 bzw. PNA4.
Diese Reaktionsgemische werden mit Ethanol ausgefällt, wieder in Wasser aufgelöst, und ein Aliquot wird auf einem Gel geprüft, um die Konzentration der DNA-Fragmente in den Gemischen zu bestimmen.
Unter den gleichen Bedingungen wie oben werden die DNA1 und die DNA4 der PCR mit den Oligonucleotiden A und F unterzogen, was die DNA5 ergibt, und die DNA2 und die DNA3 mit den gleichen Oligonucleotiden, was die DNA6 ergibt (Abb. 5).
Die DNA5 beginnt mit einem BamHI-Ort und endet mit einem EcoRI-Ort, und sie schließt eine perfekte, im Raster befindliche Fusion des ursprünglichen Methioninstartcodons, gekoppelt an ein PGII-Promotorfragment mit dem codierenden Bereich für das reife Hybridinterferon BDBS, ein.
Das BamHI-EcoRI-Fragn-.ent von DNA5 wird in den BamHI-EcoRI-geschnittenen Plasmid-pGII-IFN AM 119-Vorläufer, der im Beispiel 8.1 konstruiert worden ist, ligiert, um das Plasmid pGI-IFN AM 119 zu schaffen.
Ebenso wurde das BamHI-EcoRI-Fragment von DNA6, das eine perfekte, im Raster befindliche Fusion der PGII-Signalsequenz, gekoppelt an ein PGII-Promotorfragment mit dem codierenden Bereich für das reife Hybridinterferon BDBB, enthält, in den pGII-IFN AM 119-Vorläufer eingefügt, >-m das Plasmid pGllss-IFN AM 119zu schaffen.
Der uridinauxotrophe Mutant An8 (= DMS 3917, offenbart in EP278355) wird mit Plasmid pCG 59D7 und pGllss-FN oder pGII-IFN AM119cotransformiert, um Uridinprototrophezu ergeben.
Konidialsporen von A. nfger An 8 werden 4 Tage lang bei 280C in einem Komplettmedium gezogen, bis sie vollständig sporuliert haben. Es werden 2 χ 108 Konidiosporen verwendet, um 200 ml Minimalmedium zu impfen, ergänzt durch 1 g/l Arginin und Uridin.
Nach 20 Stunden Wachstum bei 280C und 180" U/min wird das Mycel durch Filtrieren durch Miracloth geerntet, zweimal mit 10ml 0,8M KCI, 5OmM CaCI2 gewaschen und erneut in 20ml 0,8M KCI, 5OmM CaCI2,0,5mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) suspendiert. Das Gemisch wird in einem Rüttelwasserbad (300C, 50U/min) inkubiert, bis genügend Protoplaste freigesetzt worden sind (nach 90 bis 120min mikroskopisch nachgewiesen). Die Protoplastsuspension wird durch einen Stopfen aus Glaswolle in einem Trichter filtriert, um Mycoltrümmer zu entfernen. Die Protoplaste werden durch sanftes Zentrifugieren
(10min, 2000U/min) bei Zimmertemperatur pelletiert und zweimal mit 10ml 0,8M KCI, 5OmM CaCI2 gewaschen. Abschließendwerden die Protoplaste in 200 bis 500μΙ 0,8M KCI, 5OmM CaCI2 erneut suspendiert, um eine Konzentration von 1 χ 108ZmI zuergeben.
pGII-IFN AM 119- oder pGII-IFN AM 119-DNA, 50 μΙ PCT (10 mM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,5OmM CaCl·,, 25% PEG 6000) inkubiert. Das
5 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Es werden 4 ml 0,8 M KCI, 5OmM CaCI2 zugesetzt, und Aliquote zu 1 ml von derfertigen Transformationslösung werden mit verflüssigtem Minimalagarmedium (Minimalmedium + 1 g/l Arginin + 10g/l
einem Hintergrundwachstum von vielen hundert kleinen, vermutlich abortiven Transformanten.
Es werden Transformanten des Cotransformationsexperimentes (Beispiel 8.3) herausgenommen und auf Interferonexpression analysiert. Die Interferonaktivität wird nach dem Verfahren von Armstrong (J. A.Armsf^ng, Appl. Microbiol. 21,732 (1971)) unter Verwendung von menschlichen CCL-23-Zellen und des Vesicular stomatitis-Virus (VSV) als Eignungsvirus bestimmt. Konidialsporen von Transformanten werden einzeln in 50ml eines Vorkulturmediums (Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, Frankreich!,3g/l,NH4CI22g/l,KH2PO40,5g/l,NaCI0,5g/l,Mg2SO4 7H2O0,5g/l,Ca2SO4 · 2H2O0,5g/l,pH-Wert7,0,1%Arginin) vorkultiviert. Die Vorkultur wird 72 Stunden lang bei 250 U/min und 28°C inkubiert. 10% der Vorkultur werden zum Impfen von M1 ' 1^ Hauptkulturmediums (Sojabohnenmehl 20g/l, Pectin Slow-Satz 5g/l, 1 % Arginin) verwendet. Die Kultur wird 72 bis 96 Stunüuii ι, i 250U/min und 280C gezogen.
Zu verschiedenen Zeitpunkten (alle 20 Stunden) werden Proben genommen, die Zellen werden durch Zentrifugieren pelletiert und durch Gefriertrocknen und Trockenmahlen aufgebrochen. Es werden sowohl der Überstand als auch die Zellextrakte auf Interferonaktivität getestet, wie das oben beschrieben wurde. Die Masse der Interferonaktivität wird, sekretiert in das Medium, in Transformanten gefunden, die pGllss-IFN AM 119 tragen, während sich Transformanten, die pGII-IFN AM 119 tragen, vorwiegend im Zellextrakt befinden.
werden
pGW635 wird in E. coli MH1, pGW1800 in JM109 und PGW1900 in DH5aF'vermehrt.
Beispiel 9.2: Herstellung von Protoplasten und Transformation von urldlnauxotrophen A. nlduians-Mutanten Der A. nldulans-mutanteStammG191 (pyrG,pabaA1,fwA1,uaY9) wurde von Ballance und Turner, 1985 (Ref. 27), beschrieben. Mycel wird bei 37°C und weiter in der Weise gezogen, wie das für A. nlger beschrieben wurde (siehe Beispiel 5.2), wobei aber je Liter Medium 2 mg p-Aminobenzoat zugesetzt werden. Nach dem für A. nlger beschriebenen Verfahren werden Protoplaste hergestellt. Für die Transformation werden 5x10° Protoplaste in 200 μΙ STC aufgenommen, welche dann zusammen mit 1 Mg pGW635 und 20pg pGW1800 oder 25pg pGW1900 inkubiert werden. Die Platten werden drei Tage lang bei 37°C inkubiert. Bei dem Cotransformationsexperiment erhält man etwa 50 Transformanten/Vg pGW635, und in jedem Experiment werden 20 Transformanten auf 50 mM Glucose-Minimalmedium weiter gereinigt. Diese Stämme werden anschließend zur Vermehrung von Sporen für die weitere Analyse verwendet.
A.nidulans
5mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,5, der 0,02% (Gew./Vol.) Natriumazid enthält, über Nacht bei 4°C dialysiert. Die
oder monoklonalen Antikörpern durchgeführt. Die als Kontrolle verwendeten Proben von A.nidulans enthalten kein PGII-kreuzreaktives Material, wie mit monokionalen Antikörpern geprüft wurde.
kleinere Bande mit geringerer Molekülmasse, die höchstwahrscheinlich Abbauprodukte darstellen, beobachtet. Der
verglichen, wie das die Tabelle VIII zeigt.
Polygalacturonaseaktivität von Kulturfiltraten des A.nldulane-Transformanten G191/pGW1800-13und von A.nldulansG191. Die Stämme werden durch Impfen von 10e Sporen/ml bei 300C in Minimalmedium unter Einsatz der definierten N- und C-Quellen und vor. hoher Phosphatase (15g KH2PO4/!) plus 0,1 % Hefeextrakt gezogen.
| Stamm | C-Quelle | N-Quelle | Fermen- | Polygalac |
| tie- | turonase | |||
| rungs- | aktivität | |||
| zeit | (Einh./ml) | |||
| G191 | 3% Glucose | 1% NH4CI | 40 | n.d. |
| G191/pGW635-1 | 3% Glucose | 1% NH4CI | 40 | n.d. |
| G191/pGW1800-13 | 3%D-Glucose | 1% NH4CI | 40 | n.d. |
| G19I | 1% Pektin + | 1% NH4CI | 40 | n.d. |
| 1 % Zuckerrübenpulpe | ||||
| G191/pGW1800-13 | 1% Pektin + | 1 %NH4CI | 40 | 130 |
| 1 %Zuckerrübenpulpe |
n.d. = nicht nachweisbar
Da der Transformant G191 /pGW 1800-13 hohe Pegel an PGII bei Fehlen von pektischen Substanzen synthetisiert, wird auch die PGII-Produktion der anderen A. nldulans G 191/pGW1800-Transformanten weiter analysiert. Zu diesem Zweck werden 19 Transformanten sowie G 191/pGW635-1 in einem Medium gezogen, das aus Minimalmediumsalzen besteht, wobei 0,4% NH4CI als Stickstoffquelle und 5% Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet und Phosphat in hoher Konzentration (15g/l KH2PO4) zugesetzt werden. Kulturfiltrate werden nach 46 und nach 69 Stunden genommen, und sie werden anschließend durch Western-Blotting und Sondierung mit dem monoklonalen Antikörper ohne vorherige Konzentration 1Jna Dialyse der Kulturfiltrate analysiert. Wenigstens 17 der 19 A.nldulans-G191/pGW1800-Transformantensynthetisie en PGII auf dem Glucosemedium, während mit A. nldulans G 191/pGW635-1 kein Signal ermittelt wird. Die Tatsache, daß klare Signale ermittelt werden, impliziert einen hohen Expressionspegel im Vergleich zu A.nlger N402, wenn dieser Stamm unter polygalacturonase-induzierenden Bedingungen gezogen wird, wie das im Beispiel 5.5 beschrieben wird, da nur schwache PGII-Signale auf Western-Blots von Kulturfiltraten des nichttransformierten Stammes ermittelt werden, wenn mit nichtkonzentrierten Filtraten und dem monoklonalen Antikörper gearbeitet wird. Analysiert wird auch die PGII-Produktion von A.niger G191/pG W1800-13 und von sechs anderen G 191/pGW1800-Transformanten, bei denen das oben beschriebene Medium, aber 1 % Zuckerrübenpulpe und 1 % Pektin als Kohlenstoffquelle anstelle von 5% Glucose verwendet werden. Im Gegensatz zu A. nldulans G191 /pGW 1800-13 produzieren diese sechs Transfo-manten weit mehr PGII auf dem Medium mit Pektin und Zuckerrübenpulpe, während mit A. nidulans G191/pGW635-1 erneut kein Signal festgestellt wird.
Die Cotransformanten, die nach Beispiel 9.2 unter Verwendung von pGW 1900 als dem cotransformierenden Plasmid gewonnen wurden, werden auf zwei verschiede ien Medien gezogen. Das erste Medium besteht aus einem Minimalsalzmedium mit hohem Phosphatgehalt, dem NH4CI (4,0g/l), 1 % (Gew./Vol.) Apfelpektin (Veresterungsgrad 61,2%) und 1 % (Gew./Vol.) Zuckerrübenpulpe zugesetzt wurde, während einige Transformanten auch in diesem Medium mit Harnstoff (4,2 g/l) anstelle von NH4CI aus Stickstoffquelle gezogen werden. Der Unterschied besteht bei dem erstgenannten Minimalmedium mit niedrigem Phosphatgehalt (Orig.-S. 28) darin, daß 15g KH2PO4 je Liter anstelle von i,og verwendet werden. Das zweite Medium besteht auch aus einem Minimalsalzmedium mit hohem Phosphatgehalt, dem 0,1 % Hefeextrakt, NH4CI (10g/l) und 3% Glucose als Stickstoff- und Kohlenstoffquelle zugesetzt werden. Bei beiden Medien werden 2 mg/1 p-Aminobenzoat zugesetzt. Die Kulturen werden 42 Stunden lang bei 30°C unter Verwendung eines Gallenkamp-Orbital-Schüttelapparates mit 250U/min gezogen, und Proben des Kulturfiltrats werden nach 20 Stunden und nach 42 Stunden genommen. Bei Western-Blots von A. nidulans G191, der unter ähnlichen Bedingungen wie die Transformanten gezogen wurde, wird kein oder nur wenig Protein nachgewiesen, das mit polyklonalen Antikörpern kreuzreagiert, die anhand von gereinigter Polygalacturonase I gezogen wurden. Im Kulturfiltrat von 75% der Transformanten wird PGI in signifikanten Werten nachgewiesen.
Verwendet man NH4CI anstelle von Harnstoff und einen hohen Phosphatgehalt auch in Komplexmedien, verringert sich der proteolytische Abbau der Polygalacturonase I, die prc duziert wird, erheblich. Auf der Grundlage der Ergebnisse des Western-Blottings und von Aktivitätsmessungen wird angenommen, daß der Transformant G191 /pGW 1900-6 mehr als 1 g Enzym je Liter produzierte, wie aus der Tabelle Vl hervorgeht, da die spezifische Aktivität von PGI550 Einheiten je mg beträgt («ester und Visser, 1990).
Polygalacturonaseaktivitäten von Kulturfiltraten von dem A.nldulans-Transformanten G191 /pGW 1900-6 und dem Kontrollstamm G191/PGW635-1. Die Stämme werden durch Impfen von 10* Sporen/ml bei 3O0C in Minimalmedium unter Verwendung von den angegebenen N- und C-Quellen und einem hohen Phosphatgehalt (15g KHjPO4/!) gezogen
| Stamm | C-Quelle | N-Quelle | Fermen- | Polygalac |
| tie- | turonase· | |||
| rungs- | aktivität | |||
| zeit | (Einh./ml) | |||
| G191/pGW635-1 | 3% Glucose | 0,4% NH4CI | 64 | n.d. |
| G191/pGW635-1 | 3% Pectin + | 0,4% NH4CI | 49 | n.d. |
| 1 %Zuckerrübenpulpe | ||||
| G191/pGW635-1 | 1% Pektin + | 0,4% Harnstoff | 26 | n.d. |
| 1 % Zuckerrübenpulpe | ||||
| G 691/pGW 1900-6 | 3% Glucose | 0,4% NH4CI | 64 | 5 |
| G191/pGW1900-6 | 1% Pektin + | 0,4% NH4CI | 22 | 17 |
| 1 % Zuckerrübenpulpe | ||||
| 1 % Pektin + | 0,4% NH4CI | 26 | 125 | |
| 1 %Zuckerrübenpulpe | ||||
| 1% Pektin + | 0,4% NH4CI | 49 | 570 | |
| 1 % Zuckerrübenpulpe | ||||
| G191/pGW1900-6 | 1% Pektin + | 0,4% Harnstoff | 22 | 125 |
| 1 "/oZuckerrübenpulpe | ||||
| 1% Pektin + | 0,4% Harnstoff | 26 | 225 | |
| 1 % Zuckerrübenpulpe | ||||
| 1 % Pektin + | 0,4% Harnstoff | 49 | 140 | |
| 1 %Zuckerrübenpulpe |
n. d. = nicht nachweisbar
Das pgal- und das pgall-Gen mit der Codierung für Polygalacturonase I bzw. Il werden in A.niger auf glucosehaltigen Medien nicht ausgeprägt, auch nicht in Mehrfachkopietransformanten mit einer hohen Gendosis. Die Expression dieser A. nlger-Gene in A.nldulans-Transformanten, wie in den Stämmen G191 /pGW 1900-6 und G191 /pGW 1900-10 bzw. wie in den Stämmen G191/ pGW1800-13 und G191/pGW 1800-20, weist jedoch darauf hin, daß in A.nldulans die Katabolit-Repression dieser Gene umgangen wird. Das impliziert unterschiedliche Spezifizitäten im Katabolit-Repressionssystem bei diesen unterschiedlichen Aspergillus-Spezies. Das kann dafür genutzt werden, ein bestimmte A. nlger-Polygalacturonaso-Gen in einem unterschiedlichen Wirt, wie A. nldulans, unter Bedingungen auszuprägen, welche die Expression der Polygalactonasen des Wirts selbst vermeiden. Die so gewonnenen Polygalacturonaseenzyme sind praktisch rein.
EinA.nIdulans-TransformantG191/pGW1800-13wirdin 100-ml-Kulturenauf einem 1%igen Zuckerübenpulpe- und 1%igem Pektinmedium gezogen, das die im Beispiel 5.3 beschriebene Zusammensetzung hat, wobei aber anstelle von 1,5g/l 15g/l KH2PO4 eingesetzt werden. Ebenso wird dieser Transformant auch auf Minimalmedium sowohl mit niedrigem als auch mit hohem Phosphatpegel gezogen, wobei 5% oder 1 % Glucose als Kohlenstoffquelle eingesetzt werden. Diese Medien ergeben keinerlei nachweisbare Polygalacturonase Il in A. niger N402, während der Stamm A. nldulans G191 selbst unfähig ist, PG Il herzustellen, wie das im Beispiel 9.3 beschrieben wurde.
In den Proben von Kulturfiltration des A.nidulans-Transformanten G191/pGW1800-13, die nach 72 Stunden und unter Verwendung von 5% Glucose und einem hohen Phosphatgehalt genommen wurden, wird eine PG-Aktivität von etwa 860 Einheiten/ml ermittelt, während bei niedrigem Phosphatgehalt dieser Betrag gleich 550 Einheiten/ml ist. Die geringeren Werte, die beobachtet werden, wenn man mit 1 % Glucose und einem hohen Phosphatgehalt arbeitet, sind vor allem auf eine Zunahme des Proteinstoffumsatzes zurückzuführen, wenn die Kohlenstoffquelle nach 48 Stunden erschöpft ist. Bei 1 % Glucose und niedrigem Phosphatgehalt bleibt das Produktionsniveau während der gesamten Kulturperiode niedrig. Die Proteinmenge, die je Liter Kulturf iltrat bei Verwendung von 5% Glucose und einem hohen Phosphatgehalt ermittelt wird, geht gegen 1 g/l. Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese zeigt, daß das Kulturfiltrat des Transformanten eine Proteinbande mit einer Molekülmasse enthält, welche der von A. niger PGII entspricht.
Beispiel 10.2: Isolierung und Reinigung von PGII aus dem Kulturfiltrat des A.nldulans-Transformanten G191/pGW1800-13 Das Kulturfiltrat (etwa 21), das einen pH-Wert von etwa 4,9 hat, wird fünffach mit destilliertem Wasser verdünnt und dann unter Verwendung von2NNaOHaufeinen pH-Wert von 6,0 gebracht. Um das Enzym zu konzentrieren, wird die Lösung einer Sephadex-Säule DEAE-A50 zu 600ml zugeführt, die in 2OmM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 6,0 voräquilibriert worden war, der in einem Büchner-Trichtsr gehalten wird, um hohe Durchflußgeschwindigkeiten zu ermöglichen. Die gesamte Enzymaktivität wird auf das lonenaustauschmaterial adsorbiert und durch Eluierung mit 1M NaCI in dem gleichen Puffer in 300ml aufgefangen (Gewinnung: 65%). Die Enzymlösung wird dann anhand von 1OmM Bis-Tris-Pufv</r, pH-Wert 6,0, dialysiert und einer Sepharose-Schnellflußsäule DEAE (60ml Bettvolumen) zugeführt, die in dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Die Enzymaktivität wird durch Anwendung eines NaCI-Gradienten von 0-0,5M in einem Puffer bei etwa 0.15M NaCI eluiert (Gesamtgewinn: 57%).
Beispiel 10.3: Eigenschaften von PQII, die aus dem Kulturf lltrat des A. nldulans-Transformanten A. nldulans Q 191/pGW1800-13 gereinigt wurde
PGII, die nach Beispiel 10.2 gereinigt wurde, ist mit dem Enzym verglichen worden, das aus Rapidase gereinigt wurde, wie das im Beispiel 1.1 beschrieben wurde (Fall PGiI). Beide Enzyme haben auf SDS-Polyacrylamidgelen eine identische scheinbare Molekülmasse von 38kDa, und sie reagieren identisch mit polyklonalen Antikörpern und mit dem monoklonalen Antikörper (siehe Beispiel 6.4). Nach der isoelektrischen Fokussierung hat PGII, die durch den A. nldulans-Transformanten produziert und nach Beispiel 10.2 gereinigt wurde, eine weit geringere Mikroheterogenität als das Enzym, das durch A. nlger produziert wurde, da neben der Hauptbande (pl-Wert 5,2) nur eine kleinere Bande festgestellt wird.
Die kinetischen Eigenschaften beider Enzyme wurden durch Messung der Polygalacturonaseaktivität bei 250C in 0,075 M Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,2, bei Variieren der Polygalacturonatkonzentration zwischen 0,2 und 1 mg/ml unter Anwendung eines modifizierten Ferricyanidtests verglichen. F'ir die A.nlger-PGII von Rapidase beträgt Vm,x 2760 Einheiten/mg Protein bei einem Wert Kn, von 0,8 mg/ml Polygalacturonat (USB). Bei der PGII, die von dem Transformanten abgeleitet wurde, ist der Vmix-Wert geringfügig höher, er beträgt 3480 Einheiten/mg Protein, während der Kn,-Wert identisch ist. Schließlich wurde PGII, die aus dem A. nldulans-Transformanten gereinigt wurde, mit Cyanogenbromid nach Beispiel 1.3 behandelt (Fall PGII). Das ergibt ein identisches Muster der Fragmente wie bei PGII, die aus Rapidase gereinigt wurde.
Die Expression des pgall-Gen» von A. nlger NW756 In transformierten A. nlger N 593-StSmmen pGW1756 (Beispiel 3.10) wird zur Transformation von A. nlger N 593 unter Verwendung von pGW635 als dem selektiven Vektor verwendet (siehe Beispiel 5.2). Acht willkürlich herausgegriffene Transformanten werden gereinigt und für die weitere Analyse verwendet. Sie werden auf einem flüssigen Minimalsalzmedium gezogen, dem Ammoniumchlorid (4,0g/l), 1 % Pektin (Veresterungsgrad 61,2%) und 1% getrocknete und gemahlene Zuckerrübenpulpe zugesetzt werden, wobei nach den im Beispiel 5.5 beschriebenen Bedingungen gearbeitet wird. Die PGII-Überproduktion in die Kulturfiltrate der Transformanten wird durch Western-Blotting gezeigt, wobei mit PGII-spezifischen Antikörpern gearbeitet wird. Zwei der PGII-überproduzierenden Transformanten (N593/pGW1756-6und N593/pGW 1756-7) werden ausgewählt, und diese Stämme und der Kontrollstamm N 402 (siehe Beispiel 5.5) werden wieder unter den oben beschriebenen Bedingungen gezogen. Kulturfiltrate erhält man nach 44 Stunden nach Impfung, und die Polygalacturonaseaktivität in den Rohfiltraten wird in der beschriebenen Art und Weise bestimmt (Ref.2), während das Enzymreaktionsgemisch bei einem pH-Wert von4,8 unter Verwendung von 5OmM Natriumacetat gepuffert wird.
Die Ergebnisse zeigen auch, daß das pgall-Gen auf pGW1756 funktional ist und daß dieses Plasmid zur Transformation von
A. nlger zur Überausprägung oder Überexpression von Polygalacturonaseaktivität verwendet werden kann.
Produktion von Polygalacturonase C durch transformierte A. nidulans-StSmme Plasmid pgW1919, welches das pgaC-Gen von A.niger N400 trägt (Beispiel 7.3), wird als das ^transformierende Plasmid in einem Experiment verwendet, das für die Transformation von A. nldulans G191 zur Uridinprototrophie aufgebaut ist, wie das im Beispiel 9.2 beschrieben wurde. Zehn der resultierenden Transformanten werden gereinigt, und sie werden anschließend dazu verwendet, Sporen zur weiteren Analyse zu vermehren. Diese Stämme und G191 /pGW635-1 werden in einem flüssigen Minimalsalzmedium gezogen, das mit 2 mg/ml p-Aminobenzoat, 4,0g/l NH4CI als Stickstoffquelle, 1 % Zuckerrübenpulpe und 1 % Pektin als Kohlenstoffquellen ergänzt wurde, wobei Phosphat in einer hohen Konzentration (15g/l KH2PO4) zugesetzt wurde. Die Impfung erfolgt mit 10° Sporen/ml und die Inkubation )ei 3O0C in einem Gallenkamp-Orbitalschüttelapparat, der mit 250U/ min arbeitet. Kulturfiltrate werden 65 Stunden nach dem Impfen gewonnen, und die Filtrate werden anschließend ohne vorherige Reinigung oder Konzentration analysiert. Western-Blots werden mit einem Gemisch der anhand von PGI und PGII gezogenen Antikörper inkubiert (Beispiel 1.2). Es werden Aktivitätsmessungen (Ref. 2) in einem 5OmM Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,8 der 0,25% Polygalacturonsäure (USB) enthält, vorgenommen.
Ausgehend von den Wrrtern-Blottings, produzieren die meisten der gewonnenen Transformanten große Mengen an Polygalacturonase C (PGC). Dieses Ergebnis wird durch Messung der PG-Aktivität im Überstand der Transformanten und von einem Kontrollstamm (A.nldulans G191, transformiert mit pGW635) bestätigt.
Die Expressfon der pgaA- und pgaD-Gene von A. nlger In transformierten A. nidulans-StS mmen Neben den pgal-, pgall- und pgaC-Genen werden andere Glieder der Polygalacturonase-Gen-Familie von A.niger (Beispiel 7.2) zur Transfermation von A. nldulans verwendet. Im vorliegenden Beispiel werden Klone des Phagen λ anstelle von dessen Subklonen in einem Plasmidvektor verwendet.
Phagen-A-DNA wird aus Plattenlysaten hergestellt, wie das im Beispiel 3.5 beschrieben wurde, und wird dann ein weiteres Mal mit Phenol und Chloroform extrahiert. Für ein Cotransformationsexperiment werden etwa 20pg λ-DNA verwendet, und die DNA wird in etwa gleichen Mengen von 2 Phagen derselben Klasse gewonnen (z.B. APG-A10 in Kombination mit APG-A43 oder APG-D8 in Kombination mit APG-D11). Die Cotransformation von A. nldulans G191 wird wie im Beispiel 9.2 ausgeführt, während die Kontrollen in diesem Fall die Cotransformation mit pGW1900 und APGI-7 getrennt einschließen. Bei Verwendung von A-Phagen-DNA, die in der oben beschriebenen Art und Weise hergestellt worden ist, sind die Transformationshäufigkeiten niedriger als die von Plasmid-DNA, die durch Bandenbildung in Cäsiumchloridgradienten gereinigt wurde.
Die relevanten Transformanten werden gereinigt und so analysiert, wie das für die pGW1910-Transformanten im Beispiel 12 beschrieben wurde. In diesem Fall werden die Transformanten auch auf einem Medium gezogen, das 3% Glucose als Kohlenstoffquelle enthält (hoher Phosphatgehalt, 0,1 % Hefeextrakt, 1 % Ammoniumchlorid).
Unter Verwendung der Phagen der Klasse PG-A bzw. PG-D, die oben genannt wurden, wurden Transformanten A. nldulans-G 191/LambdaA-1 und -G 191/LambdaD-1 gewonnen. Die Polygalacturonaseaktivitäten in den Kulturfiltraten des Zuckerrubenpulpe'/Pektinmediums waren 65 Stunden nach dem Impfen erheblich größer als beim Kontrollstimm G191/ pGW635-1. Die in den Phagen der Klasse A und D vorhandenen pgall-verwandten Sequenzen codieren also Proteine mit Polygalacturonaseaktivität. Ausgehend von den Western-Blots, wird geschlußfolgert, daß diese Genprodukte, die Polygalacturonasen A bzw. D, mit einer ähnlichen elektrophonischen Mobilität wie PGI wandern.
A. nldulans-G 191/LambdaA-1 produziert Polygalacturonase A auch auf dem Medium mit Glucose als Kohlenstoffquelle.
Für ein Cotransformationsexperiment werden etwa 20pg Plasmid-DNA pGII-IFN AM 119 oder pGllss-IFN AM 119 eingese\zt. Die Cotransformation von A. nldulans G191 erfolgt In der im Beispiel 9.2 beschriebenen Art und Weise.
Die relevanten Transformanten werden so gereinigt und analysiert, wie das für die Transformation im Beispiel 8.4 beschrieben wurde. In diesem Fall werden die Transformanten auch auf einem Medium gezogen, das 3% Glucose als Kohlenstoffquelle enthält (hoher Phosphatgehalt, 0,1 % Hefeextrakt, 1 % Ammoniumchlorid).
Zu mehreren Zeitpunkten (alle 20 Stunden) werden Proben genommen, die Zellen werden durch Zentrifugieren pelletiert und
durch Gefriertrocknen und Trockenmahlen aufgebrochen. Der Überstand und die Zellextrakte werden auf Interferonaktivität geprüft {siehe oben). Die Masse der Interferonaktivität wird sekrstiert in das Medium in Transformanten gefunden, die pGII: s-IFN AM 119 tragen, während sie sich bei Transformanten, die pGII-IFNAM 119 tragen, vorwiegend im Zellextrakt nachweisen läßt, was darauf hinweist, daß A. nldulans IFN aus pGII-IFN AM 119 oder pGllss-IFN AM 119 produziert, wenn Glucose als einzige Kohlenstoffquelle verwendet wird.
Die Zelltrennung von Gurkengewebe wird zur Prüfung der mazerierenden Aktivität von A.ni.qer-Polygalacturonasen verwendet. Im örtlichen Gemüseladen wird eine Gurkenfrucht gekauft, und die Oberfläche wird anschließend durch Abwischen mit einem Tuch, das mit Ethanol getränkt war, oder durch einstündiges Abspülen in Javellescher Lauge 'Handelsqualität, auf 0,5% Natriumhypochlorit verdünnt) dekontaminiert. Die Gurke wird dann in Scheiben geschnitten, und das weiche Innere der Gurkenscheibe wird entfernt. Zwei der resultierenden Scheiben (etwa 12g) werden in einen fc'rlenmeyerkolben zu 100ml, der 25ml eines Mazerationspuffers enthält, welchem vorher Polygalacturonase zugesetzt oder nicht zugesetzt wurde, gegeben. Die anschließende Inkubation geht über 24 Stunden unter sanftem, ungerichtetem Schütteln in einem Wasserbad, das über einen Thermostaten bei 300C gehalten wurde. Anschließend werden die Kolben visuell überprüft. Eine vollständige Mazeration erfüllt folgende Kriterien: (i) die Schale der Gurkenfrucht ist im wesentlichen frei von anhaftendem Gewebe, was durch makroskopische Untersuchung gezeigt wird; (ii) der Mazerationspuffer ist stark trüb geworden; (Hi) es besteht eine positive Korrelation zwischen der Zelltrennung und der hohen Trübung des mazerierenden Puffers, wie durch einen hohen Anteil loser Zellen angezeigt wird, die intakt zu sein scheinen, was durch mikroskopische Sichtbarmachung beurteilt wird.
Polygalacturonase Il und Polygalacturonase I, die auf die im Beispiel 1 beschriebene Art und Weise hergestellt worden waren, werden in verschiedenen Puffern geprüft. Mazerationspuffer A (MBA) ist 5OmM Natriumacetat, pH-Wert 4,8. Mazerationspuffer B (MBB) ist ein Phosphateitratpuffer (Ishii [1976], Phytopathology 66, £.281-289). MBB wird durch Mischen von 0,1 M Citronensäure und 0,1 M Na2HPGyLösung hergestellt, bis der gewünschte pH-Wort von 4,5 erreicht ist, und dann wird ein gleiches Volumen destilliertes Wasser zugesetzt, und anschließend wird Rinderserumalbumin biszu einer Endkonzentration von 10 mg/25 ml unter Verwendung einer konzentrierten Lösung von 10mg/ml zugegeben.
Gurkengewebe wird innerhalb von 24 Stunden vollständig mazeriert, wenn 1 pg Polygalacturonase M in MBA eingesetzt wird. In diesem Puffer wird das Gurkengewebe bei Fehlen von Polygalacturonase oder bei Vorhandensein von 1 [ig Polygalacturonase I nicht mazeriert. Die Mazeration von Gurkengewebe in MBB wird bei Fehlen von Polygalacturonase oder bei Vorhandensein von 10pg Polygalacturonase I bzw. Polygalacturonase Il geprüft. Auch in diesem Fall wird bei Fehlen des Enzyms oder bei Vorhandensein von Polygalacturonase I keine Mazeration beobachtet, während Polygalacturonase Il das Gurkengewebe vollständig mazeriert. PGII, die nach Beispiel 10 hergestellt wurde, hat auch mazerierende Eigenschaften.
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Bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM), Mascheroder Weg 16,D- 330Q Braunschweig, wurden folgende Mikroorganismen und Phagen deponiert:
| Mikroorganismus: | DSM-Nr. | Deponierungsdatum |
| Escherichia coli JM109/pGW 1800 | 5505 | 30. August 1989 |
| Escherichia coli DH5aF7pGW 1900 | 5866 | 21.März1990 |
| Escherichia coli DH5aF7pGW1756 | 5942 | 18.Mai1990 |
| Escherichia coli DH5aF7pGW1910 | 5943 | 18.Mai1990 |
| Escherichia coli DH5aF7pGW 1911 | 5944 | 18. Mai 1990 |
| Escherichia coli LE 392 | 5941 | 18. Mai 1990 |
| Phagen | alle 18. Mai 1990 | |
| APG-A9 | 5945 | |
| APG-A10 | 5951 | |
| APG-A43 | 5964 | |
| APG-B4 | 5949 | |
| APG-B35 | 5960 | |
| APG-B 36 | 5961 | |
| APG-CI | 5948 | |
| APG-C16 | 5954 | |
| APG-C 20 | 5956 | |
| APG-C 37 | 5962 | |
| APG-D8 | 5947 | |
| APG-D11 | 5952 | |
| APG-D12 | 5953 | |
| APG-E6 | 5946 | |
| APG-E 38 | 5963 | |
| APG-F5 | 5950 | |
| APG-G17 | 595S | |
| APG-G 27 | 5957 | |
| APG-X31 | 5958 | |
| APG-Y33 | 5959 |
Sequenzaufstellung
SEQ ID NO. 1
Sequenztyp: Nucleotid mit entsprechendem Polypeptid
Sequenzlänge: 2495 Basenpaare
Strangart: Doppelstrang
Topologie: linear
Merkmale: Genpg von 1 bis 909: von 901 bis 963: von 901 bis 1 002: von 1003 bis 2 127: von 1138 bis 1189: von 1610 bis 1671: von 2138 bis 2 130: von 2131 bis 2 495:
gaattcggaa
tcctaaaatt
gaacccctga
tgattcgcgg
cactcgatag
tcagtgcggc
tgagtcccag
ccaaggaccg
attgccgaga
aagcatgttg
atggggcaga
agtggagatg
gaccttcagc
''.'..: uerCodierung für A.nlger N400-Präpro-Polygalacturonase I
codierender Bereich für PGI-Signalpeptid
codierender Bereich für PGI-Präprosequenz
codierender Bereich für reife PGI
3'-nichtcodierender Bereich, Teil des Transkriptionsterminatorbereiches
TAC CAG Tyr GIn 5
GTC VaI
TTC Phe
TCT Ser
GCT Als
CTT Leu
GCC AIa
AAG
Lys
CTT Leu
GCC AIa
AAG Lys
GGC GIy
CCC
Pro
20
GCC AIa
ATCCATGCCT CCGTTAGCGT TGCTTACCAA CCTGGCTÜAA GGTGGATCGG
gaggtatctc
tggaccagtc
tcgttgagat
tccttghct
ttttggccga
acaatcacc
CTG Leu
GCT AIa
TCT Ser
GCC AIa 10
CCT Pro
GCT AIa
TCT Ser
acaacgacgt
aaccagggtc
tcaatcatat
gggtctttgc
tctagtctcg
tgctggtggg
TCTTGGGTCA CTGAGATACG TGCTGTGATG GCGCCCATCG AGGGTCCCCT ACTGCTTTGT TTTCACGTAT GCTCTATCCA TTCTTTCTGT AACCTGTTCT ATG CAC Met His 1
GTC VaI
CGC' Arg
ACC TGC ACC
Thr Cys Thr
35
GGC GIy
GTC VaI 25
TTC PheTCT Ser
TCC Ser
TCC Ser
ACC Thr
CTC
Lou 15
GAG GIu
TCT Ser
40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 440 480
520 560 600 640 680 720 760 800 840 880 918
954
990
1026
GAT Asp
TCT Ser
GTT VaI
GAG ACC GIu Thr 65
GAG GIu
GTC VaI
CTC Leu
GCC AIa
CTG
Leu
55
GAC Asp
AGC GAG Ser GIu 45
AGC Ser
CTG Leu
AGC Ser
TCC Ser
AGC ATC Ser He
AC Me
GAT GCT Asp AIa 70
TCC Ser
GAG GTC GIu VaI 60
GCT AIa
AGC Ser
CCC Pro
GAT AspTGC
Cys
50
GCT AIa
TCC Ser
GGC GIy
GGC TCC
GIy Ser
75
1022
1098
1134
ACC Thr
ATC He
ACC Thr
TTC Phe
GAG
GIu
80
GGC GIy
ACC Thr
ACT ThrTCC Ser
TTC
Phe
85
1177
1216
| TAC Tyr | GGT GIy | AAG Lys | GAA GIu | TGG Trp 90 | TCC Ser | MG Lys | GGC GIy | AGC Ser | CCC Pro | CTG Leu | ATC lie 95 | TTC Phe 220 | CGC Arg | TTC Phe | -49- 297 448 | |
| GGA GIy | GGT GIy | TCT Ser 235 | AAG Lys 100 | GAT Asp | CTG Leu | GGC GIy | ACT Thr | GTC VaI | GGC GIy | ACC Thr 105 | ATG Met | GCC Ala | CTC Leu | GAC Asp | GGC GIy | 1252 |
| 'GGT GIy | GTC VaI | GTG VaI | ATC lie | GAC Asp | GGT GIy | TCC Ser 250 | GAC Asp 115 | GGT GIy | GAT Aäp 240 | TOC Ser | CGC Arg | TGG Trp | ACC Thr | TGG Trp 120 | GAC Asp | 1288 |
| GCT Ala 110 | AAG Lys | AAC Asn | GGT GIy | ACC Thr 125 | AAC Asn | CGC Arg | GGT GIy | GGC GIy | TCC Ser | AAG Lys | ACC Thr 130 | AAG Lys | t 'AGC Ser 255 | CCC Pro | AAG Lys | 1324 |
| AGC Ser | ATG Met | GGT GIy | TAC Tyr 135 | ATC He | CAC His | AGC Ser | GAT Asp | GTT VaI 140 | AAG Lys | GAG GIu | GAC Asp | TCG Ser | TAC Tyr | ACC Thr | TTC Phe 145 | 1360 |
| TTC Phe | GGC GIy | ATC lie | AAC Asn | ATC II» 150 | AAG Lys | AAC Asn | ATC Me | ACT Thr | CCC Pro | GTC VaI 155 | ICT Ser | CAG Gin | GCC Ala | 1396 | ||
| AAG Lys | AGT Ser | GTC VaI 160 | CAG Gin | GCT Ala | ACC Thr | AAC Asn | GTC VaI 165 | CAC His | CTG Leu | AAC Asn | GAC Asp | 1432 | ||||
| ATC lie | ACC Thr | ATC lie | GAC Asp | AAC Asn | TCC Ser 175 | GAC Asp | GGT GIy | GAT Asp | GAC Asp | AAC Asn 180 | GGT GIy | 1468 | ||||
| TTC Phe 170 | CAC His | AAC Asn | ACC Thr 185 | GAC Asp | GGT GIy | TTC Phe | GAC Asp | ATC lie 190 | AGC Ser | GAG GIu | TCT Ser | 1504 | ||||
| GGC GIy | GGT GIy 195 | GTC VaI | TAC Tyr | ATC lie | AGC Ser | GGT GIy 200 | GCT Ala | ACC Thr | GTC VaI | AAG Lys | AAC Asn 205 | 1540 | ||||
| ACC Thr | GAC Asp | GAC Asp | TCiC Cys | ATF lie 210 | GCC Ala | ATC He | AAC Asn | TCT Ser | GGC GIy 215 | GAG GIu | 1576 | |||||
| CAG Gin | GCACGATATC | CCTATTCCAC | TATCATTCCT | TCCATTCATA | 1609 | |||||||||||
| TCGCTAACAA | TCAAACCCAC AG | ATC He | TCT Ser | ACC Thr | 1649 | |||||||||||
| GGC GIy | ACC Thr | TGC Cys 225 | GGT GIy | CAC His | GGT GIy 230 | TCC Sor | ATC He | 1686 | ||||||||
| GGC GIy | GTC VaI | GGT GIy | CGT Arg | GAC Asp | AAC Asn | GTC VaI | AAG Lys 245 | 1722 | ||||||||
| AAC As η | ACC Thr | ATC lie | GAC Asp | ACT Thr | GTC VaI " | AAC Asn | TCC Ser | 1758 | ||||||||
| GCC Ala | GGT GIy 260 | GTC VaI | ATC !ie | ACC Thr 265 | ATC He | AAG Lys | GAG GIu | 1794 | ||||||||
| ACC Thr 270 | GAT Asp | GTC Va! | GAG GIu 275 | ACC Thr | TAC Tyr | AAC Asn 280 | ATC He | 1830 | ||||||||
| 1866 |
| TCC | GGA | ATC | ACC GAC TAC | GGT ATC | GTC | ATC | ATCGATCCAC | ACTTGACATG | -50- 297 448 | 1902 | |
| CAG CTC | Ser | GIy | lie | Thr Asp Tyr | GIy He | VaI | He | TGCCATAGTG | TTAGTGAATA | ||
| Gin Leu | 285 | 290 | GTGAATTTGT | AGCAGAAGTA | |||||||
| GAC | TAC | GAG | AAC GGC TCT | CCC ACC | GGC | ACC | TAATGATGAA | AGATAGAATT | 1938 | ||
| GAG CAG | Asp | Tyr | GIu | Asn GIy Ser | Pro Thr | GIy | Thr | AATAACGGGG | TGAATTAGGG | ||
| GIu Gin | 300 | 305 | AGTTGTCATC | CCTCACACTC | |||||||
| 295 | ACC | GGT | ATC | CCC ATC ACT | GAT GTC | ACC | GTT | ATATCTTCCA | ACCTCTGAAC | 1974 | |
| CCC .TCC | Thr | GIy | lie | Pro He Thr | Asp VaI | Thr | VaI | TAACAAGATT | CTTCTATATC | ||
| Pro Ser | 310 | 315 | |||||||||
| GTC | ACC | GGT | ACT CTC GAG | GAT GAC | GCC | ACC | 2010 | ||||
| GAC GGT | VaI | Thr | GIy | Thr Leu GIu | Asp Asp | AIa | Thr | ||||
| Asp GIy | 320 | 325 | |||||||||
| TAC | ATT | CTC | TGC GGT GAC | GGC TCT | TGC | TCT | 2046 | ||||
| CAG GTC | Tyr | lie | Leu | Cys GIy Asp | GIy Ser | Cys | «er | ||||
| Gin VaI | 335 | 340 | |||||||||
| 330 | ACC | TGG | TCC | GGT GTT GAC | CTC TCT | GGT | GGC | 2082 | |||
| GAC TGG | Thr | Trp | Ser | GIy VaI Asp | Leu Scr | GIy | GIy | ||||
| Asp Trp | 345 | 350 | |||||||||
| AGC | GAT | AAA | TGC GAG AAC | GTT CCT | TCC | GGT | 2118 | ||||
| AAG ACC | Ser | Asp | Lys | Cys UIu Asn | VaI Pro | Ser | GIy | ||||
| Lys Thr | 360 | 3155 | |||||||||
| 355 | TGC | TAA | ATCGTTCCTC CGGATGCGAG GCAACGTCTG | 2160 | |||||||
| GCT TCT | Cys | ||||||||||
| Ala Ser | 368 | ||||||||||
| GGTTGTATAT | 2 200 | ||||||||||
| TAGGACGTCT | GTGGTTI | 2 240 | |||||||||
| TACTAGTTAG | ITAC | 2 280 | |||||||||
| ATAGGAGCTT | TGCTCAATAT | 2320 | |||||||||
| AATGAGTAGA | CTGATAGAGG | 2360 | |||||||||
| TAATACCAGG | tgatgaagtt | 2400 | |||||||||
| CGCGTAGGCT | taggtatata | 2440 | |||||||||
| GAAATCTCTT | CCTCTTTCTT | 2480 | |||||||||
| CACCAGTTGC | CTCCACAGAC | 2495 | |||||||||
| GATGCTTGAT | CTCAA | ||||||||||
SEQIDNO.2
von 1 bis 1 356: Promotorbereichvon 1 357 bis 1 419: codierender Bereich für PGII-Signalpeptidvon 1 357 bis 1 437: codierender Bereich für PGII-Präprosequenzvon 1 438 bis 2 494: codierender Bereich für reife PGIIvon 1 987 bis 2 038: Intronvon 2 495 bis 2 497: Stoppcodon
von 2 498 bis 3 031:3'-nichtcodierender Bereich. Teil des Transkriptionsterminatorbereiches
AACACGCTGG GGTCAGAGCA AACCTTGAAA GAGGGTAATG GGAATAGTGT CAGACATAAA TGCCCCGAGG CGCGCTCGAT TGAGGTTGTT GAAAAAACGT
40 80 120 160 200 240 280 320 360 400
| GCT | ATGACCTTTC | AACAACTAAC | CGCCCCTATC | GTC | CAC | -51- | 440 | 297 448 | |
| AACTTGATGA | Ala 5 | ACCAGTATAG | TCCACCGGAT | TCGCTCACCG | VaI | His | 480 | ||
| CACTGCTGTG | ACC | GCTTCCTCCT | TTTTCGTCAT | CTTTTCCTCT | GAA | GCC | 520 | ||
| TTAGCCAGTG | Thr | CCCCACTCCA | GGTTGCTTGT | TGCCGGCAAG | GIu | AIa | 560 | ||
| TCTTGACTGG | TGATTAGCGA | GCTTTGCGCA | CTATTCCTGA | 25 | GCT | 600 | |||
| CTTTCGACCC | AGC | GAAGGAACGG | ATGGACGCTG | CGCTAGTTTC | GCT | Ala | 640 | ||
| TTTAGCTGTC | Ser | TCTGATAT7A | ACATTGGCTA | CAGACTAGCC | Ala | 680 | |||
| ATCTCGAATC | CGGAATCTGG | CACACAGGGA | GTTTATGGAC | GCT | 720 | ||||
| GATTACGCTC | GGC | TGGAACTAGC | AAAGCACCAT | AATTGCCGCG | ACC | Ala | 760 | ||
| CGTTCATTGG | GIy | TTCAGGCTGC | AGCCTTACTA | ggattagtat | Thr | 800 | |||
| GACCCTGCAT | TCGTACTCGT | ACACTGCAGT | ACCGGCCTGG | CTT | 840 | ||||
| AGCTGTCTTC | ATC | TCAACGATGG | CATCCGCTTC | CTCCAGGACT | CTC | Leu | 880 | ||
| AATCTCGGGA | lie | TGTGAAGGCC | AATTATAGTG | TTGCTTGTTT | Leu | 50 | 920 | ||
| TACGGCTGCT | TCAGCGGTAC | ATACAAACGC | TTCTCTATCT | GAC | 960 | ||||
| ACGTGCCAAT | GGT | GACAATAGGT | TTACCCTCGG | GAGCGGAGCT | ATC | Asp | 1000 | ||
| TGCCCTTTTT | GIy | TCCACCGACA | TGCGCATCCG | TTCCATCACC | He | 1040 | |||
| ttgccttctf | 65 | GTCGGCTGAT | CAGCCACGCA | CGGCTGGTAT | TTC | 1080 | |||
| CGCGGAACCC | ACC | GCCACTCATG | TCGAACTGAG | GTTCACGGGA | TGG | Phe | 1120 | ||
| AAATTAATCG | Thr | TTTGAGACAA | CACCTCAATA | TGAAACGAGG | Trp | 1160 | |||
| AAACGCAATA | CTACATTTCC | TCCAGGGGCT | GTCGGCAGTT | 85 | GCA | 1200 | |||
| ATCCAGGGTC | TTG | CGACCGGAAA | AGATTCGCAA | TAGTCGTGAG | ATC | Ala | 1240 | ||
| ATGAACTTTT | Leu | TJGTACCTGC | ICACACTGAT | GTCTACTTGC | He | 1280 | |||
| TATAAGAACC | ACACTCATTC | AAAATCTTAC | CAACAACACT | ACC | 1320 | ||||
| TCATCATTCC | GGT | TTCTTTTCTA | TTGTTAACAA | TTAATC ATG | TGC | Thr | 1362 | ||
| CCTTCTGTCA | GIy | Met 1 | Cys | ||||||
| TCT CTT | CTC GCC TAC | GGC CTG | GAT | 1398 | |||||
| TCG TTT | CGC | Ser Leu | Leu AIa Tyr 0 | GIy Leu | AGC | Asp | |||
| Ser Phe | Arg | TTC GCT | TCT GCC TCT | CCT ATC | Ser | 110 | 1434 | ||
| GGC GCC | The AIa | Ser AIa Ser | Pro He | GGA | |||||
| GIy Ala | AAG | 20 | GGC | GIy | |||||
| 15 | Lys | TGC ACG | TTC ACC ACC | GCT GCC | GIy | 1470 | |||
| CGA GAC | 125 | Cys Thr | Phe Thr Thr | Ala AIa | CTT | ||||
| Arg Asp | 30 | 35 | Leu | ||||||
| AAG GCG | AAA TGC TCT | ACT ATC | 1506 | ||||||
| AAA GCG | Lys AIa | Lys Cys Ser | Thr He | ||||||
| Lys Ala | 45 | ||||||||
| 40 | GAA GTT | CCA GCT GGA | ACC ACC | 1542 | |||||
| AAC AAC | GIu VaI | Pro Ala GIy | Thr Thr | ||||||
| Asn Asn | 55 | 60 | |||||||
| CTC ACC | AGC GGT ACC | AAG GTC | 1578 | ||||||
| CTG ACC | Leu Thr | Ser GIy Thr | Lys VaI | ||||||
| Lou Thr | 70 | ||||||||
| ACG ACC | TTC CAG TAC | GAA GAA | 1614 | ||||||
| GAG GGC | Thr Thr | Phe GIn Tyr | GIu GIu | ||||||
| GIu GIy | 80 | ||||||||
| 75 | ATC TCC | ATG AGT GGC | GAA CAT | 1650 | |||||
| GGC CCC | He Ser | Met Ser GIy | GIu His | ||||||
| GIy Pro | 90 | 95 | |||||||
| GCC TCC | GGC CAC CTC | ATC AAT | 1686 | ||||||
| GTC ACT | AIa Ser | GIy His Leu | lie Asn | ||||||
| VaI Thr | 105 | ||||||||
| 100 | TGG TGG | GAT GGC AAG | GGA ACC | 1722 | |||||
| GGT GCG | Trp Trp | Asp GIy Lys | GIy Thr | ||||||
| GIy Ala | 115 | 120 | |||||||
| CCC AAG | TTC ΤΓΤ TAC | GCC CAT | 1758 | ||||||
| AAG AAG | Pro Lys | Phe Phe Tyr | Ala His | ||||||
| Lys Lys | 130. | ||||||||
| TCC Ser | ACC Thr | TCG Ser | TCT Ser | ATT lie | ACT Thr 140 | GGC GIy | 5 | GGC GIy | GGA GIy | TTA Leu | AAC Asn | TGG Trp | ATC lie | AAA Lys 145 | AAC Asn | ACC Thr 215 | GGC GIy | -52- 297 448 | 1794 | |
| GAC Asp 135 | CCC Pro | GTC VaI 230 | CTT Leu | ,PG Met 150 | GCG Ala | TTT Phe | CGC Arg | TCC Ser | AGT Ser | GTC VaI | GAG Gin 155 | CTC Leu 225 | GCG Ala | AAT Asn | GAC Asp | ATC lie | GGC GIy | 1830 | ||
| ACC Thr | ACG Thr 160 - | ACC Thr | TlT Phe | ACC Thr | GAT Asp | GTT VaI | CAC His 245 | TCC Ser | ACC Thr 165 | ATC lie | AAT Asn | GTC VaI | AAT Asn | GCG Ala | GAT Asp 170 | AAG Lys | AAC Asn 240 | 1866 | ||
| ATT lie | GAC Asp | GCC Ala | ACC Thr | CAG Gin | GGT GIy 175 | GGA GIy | ATT He | AAG Lys | CAC His | AAC Asn | ACT Thr | AGC Ser | GAT Asp 180 | GCG Ala | TTC Phe | TCC Ser | GAA GIu | 1902 | ||
| GGC GIy | GTT VaI | TCC Ser | GGC GIy 185 | AAC Asn | TCG Ser | GTC VaI | GAG GIu | ATT lie 270 | GGG GIy | GTG VaI 190 | AAT Asn | TCT Ser | ATC He | ATT He | AAG Lys | GCC Ala | ACT Thr | 1938 | ||
| GAT Asp | TGG Trp | TCT Ser | GTC VaI | CAT His | AAC Asn | CAG Gin 200 | TCC Ser | GAT Asp | GAT Asp | GAC Asp | TGT Cys | TCC Ser | CTT Leu | GCG Ala 205 | GTT VaI | ATC Ib 275 | GTC VaI | 1&74 | ||
| CCT Pro 195 | TCT Ser | GAT Asp 290 | GGC GIy | GAG GIu 210 | GTAAGCAGCT | GAC Asp | GGC GIy | CTGCATATAT | GTG VaI 285 | GCTTGATTCG | ATT He | CAG Gin | 2016 | |||||||
| AAC Asn | TAATTATATT | AAC Asn | GATATTCTAT AC | ACT Thr 305 | ATT lie | AAC Asn | ATC lie | ACG Thr | TTC Phe | AAG Lys | CCG Pro 300 | 2056 | ||||||||
| GGC GIy | GTG Va! | TGC Cys | ATT He 220 | AGC Ser | GTG VaI | CAC His | GGT GIy | GTT VaI | TCC Ser | CTG Leu | GAG GIu | 2092 | ||||||||
| TCT Ser | GGC GIy | GAC Asp | AAC Asn 235 | AAC Asn | GGG GIy | GTC VaI | ACT Thr | GAG GIu | 2128 | |||||||||||
| GTC VaI | ATC lie | GAA GIu | ACC Thr | GTG VaI | AAT Asn 250 | 2164 | ||||||||||||||
| AAC Asn | GTC VaI 255 | CGA Arg | ACC Thr | ATC He 260 | GGC GIy | 2 200 | ||||||||||||||
| GGC GIy 265 | GTG VaI | TCC Ser | ACG Thr | TAC Tyr | AAC Asn | 2236 | ||||||||||||||
| ATG Met | GGC GIy | ATC He 280 | TAC Tyr | GGC GIy | GTC VaI | 2272 | ||||||||||||||
| CAG Gin | TAC Tyr | GAA GIu | AAG Lys 295 | CCT Pro | GGT GIy | 2308 | ||||||||||||||
| ACG Thr | GGT GIy | GTC VaI | CAG Gin | GAT Asp | AAG Lys 310 | 2344 | ||||||||||||||
| AGC Ser | ACT Thr 315 | GGT GIy | GAT Asp | AGT Ser 320 | GCT Ala | 2380 | ||||||||||||||
| CTT | CTT TGC | GGG TCT GGT | AGC TGC | TCG | GAC | -53- 297 448 | 2418 | |
| ATC TAT | Leu | Leu Cys | GIy Ser GIy | Ser Cys | Ser | Asp | ||
| lie Tyr | 330 | 335 | ||||||
| 325 | TGG | GAC GAT | GTG AAA GTT | ACC GGG | GGG | AAG | 2452 | |
| TGG ACC | Trp | Asp Asp | VaI Lys VaI | Thr GIy | GIy | Lys | ||
| Trp Thr | 340 | 345 | ||||||
| ACC | GCT TGC | AAG AAC TTC | CCT TCG | GTG | GCC | 2488 | ||
| AAG .TCC | Thr | Ala Cys | Lys Asn Phe | Pro Ser | VaI | AIa | ||
| Lys Ser | 355 | 360 | ||||||
| 350. | TAG | GCTGCTAGGT | TGGTGAGTTG | TAGCCCTAGC | 2 527 | |||
| TCT TGT | ||||||||
| Ser Cys | ||||||||
| 362 | CTGCTTCGTC | TGCTTCGTCT | GCTTCGTCTG | 2 567 | ||||
| TGAAATTCGT | TTCTTCTGCT | TCGTCTGCTT | TGTCTGCTTT | 260/ | ||||
| CTTCGTCTGC | TCCACTTCGT | CCACTTCGAC | TGGTTAGATG | 2647 | ||||
| GTCTGCTTCG | TAGTTTTTAG | AGAGAACAGA | ATATGTACAG | 2 687 | ||||
| GGCCTTGTAA | AGGTGGTACC | GAGTTGTATA | TTTATTTAAA | 2727 | ||||
| TAAGCCTTAG | TCGCGTGTCT | TTATATTTAT | AGCCTTTTAC | 2 767 | ||||
| ATGTTACCTA | AGCTACAGTG | GATTATCTTA | CAGCCCACAC | 2807 | ||||
| ATATATACGG | GGGAACTACG | TGAATGAATG | CTCGGTTAGA | 2847 | ||||
| TCATCGTGCT | CACTGCCACA | ACCAACCAGG | AACCTTGGCA | 2887 | ||||
| AGGCCTTGCT | TGGGCATTTT | TGTCTGGCCC | TATCTCTTTC | 2927 | ||||
| GGTACATGCT | TCTGGATGAG | TCACGGCACG | AGTAGATTGA | 2967 | ||||
| CAGATGGTGG | AACCCGCGCA | TAAAGCATAC | GCCAGAAGTG | 3007 | ||||
| CCGCTACTCC | AAGACAGCCA | GCTG | 3031 | |||||
| CAAGGGATAC | ||||||||
SEQIDNO.3
von 890 bis 952: codierender Bereich für PGII-Signalpep'.id
von 890 bis 970: mutmaßlicher codierender Bereich für PGII-Präprosequenzvon 971 bis 2 027: mutmaßlicher codierender Bereich für reife PGII
von 1 520 bis 1 571: Intronvon 2 028 bis 2 030: Stoppcodon
von 2 031 bis 3 047:3'-nkhtcodierender Bereich, Teil des Transkriptionsterminatorbereiches
ACACTGCAGA ACCCGTTTCC ATTATAGTAC TATGAATCTG
acgctcaaga gaacctgttc
ccaccacggc
cttaagttca
cttaatgtga
aggctgtcgg
gctgaaattg
tgaggtgagt
agaccgatta
TCACCGnGG
AGTGACTAG^
CACTCT(TTT
ATCCCAAGGC ATGGCTGTTT TGTCTTGAGT TCCACCTTGA
GTCC111111
40 80 120 160 200 240 280 320 360
400 440 480 520 560 600
640 680 720 760 8CO 840 880
| TCATTGACC | GGC GIy | CTA Leu | ATG Met | CAC His | TCC Ser | TTT Phe | GCT Ala C | TCT Ser | CTT Leu | CTG Leu | GCC AIa |
| TAC Tyr 10 | CCC Pro | ATC Me | 1 GCC Ala | GCC Ala | AGC Ser 15 | GCC Ala | O ACC Thr | CTC Leu | GCT AIa | TCT Ser 20 | GCC AIa |
| TCC Ser | GCT Ala 35 | GCT Ala | GAA GIu 25 | GCC Ala | CGG Arg | GGA GIy | AGC Ser | TGC Cys 30 | ACC Thr | TTC Phe | AAA Lys |
| ACG Thr | ACC Thr | ATC Me | GCT Ala | GCC Ala | AAA Lys | GCG Ala 40 | GGC GIy | AAG Lys | GCA AIa | GGG GIy | TGC Cys 45 |
| TCT Ser | ACC Thr | ACC Thr 60 | ACC Thr | CTT Leu 50 | GAC Asp | AAC Asn | ATC lie | GAA GIu | GTC VaI 55 | CCC Pro | GCT AIa |
| GGA GIy | AAG Lys | GTC VaI | CTC Leu | GAC Asp | CTG Leu | ACC Thr | GGT GIy 65 | CTC Leu | ACC Thr | AGC Ser | GGT GIy |
| ACG Thr 70 | GAA GIu | GAA GIu | ATC lie | TTC Phe | GAG GIu 75 | GGC GIy | ACC Thr | ACG Thr | ACC Thr | TTC Phe 80 | GAT Asp |
| TAT Tyr | AAA Lys 95 | GAT Asp | TGG Trp 85 | GCA Ala | GGC GIy | CCC Pro | TTG Leu | ATC Me 90 | TCC Ser | ATG Met | AGT Ser |
| GGC GIy | ATC lie | AAC Asn | ATC He | ACC Thr | GTC VaI | ACT Thr 100 | GGT GIy | GCC AIa | TCA Ser | GGC GIy | CAT His 105 |
| CTC Leu | GGG GIy | ACC Thr ι:ί» | TGC Cys | GAC Asp 110 | GGT GIy | GCG Ala | CGG Arg | TGG Trp | TGG Trp 115 | GAC Asp | GGC GIy |
| AAG Lys | GCT Ala | CAT His | AGC Ser | GGA GIy | AAG l.ys | AAG Lys | AAG Lys 125 | CCC Pro | AAG Lys | TTC Phe | TTC Phe |
| TAC Tyr 130 | AAT Asn | ATC lie | GGC GIy | CTT Leu | GAC Asp 135 | TCC Sei | TCG Ser | TCC Ser | ATT He | ACT Thr 140 | GGA GIy |
| TFG Leu | CAG Gin 155 | GCG Ala | AAG Lys 145 | AAC Asn | ACT Thr | CCC Pro | CTT Leu | ATG Met 150 | GCG AIa | TTT Phe | AGT Ser |
| GTT VaI | AAC Asn | AAC Asn | GAT Asp | GAC Asp | <VTC lie | ACT Thr 160 | GCT Leu | ACT Thr | GAC Asp | ATT Me | ACC Thr 165 |
| ATC lie | ACT Thr | G/.r Asp 180 | GCG Ala | GAC Asp 170 | GGT GIy | GAT Asp | ACC Thr | CTG Leu | GGT GIy 175 | GGA GIy | CAC His |
| AAC Asn | AAT Asn | ATC lie | GCG .Ma | TTT Phe | GAT Asp | GTT VaI | GGT GIy 185 | AAC Asn | TCT Ser | GTC VaI | GGT GIy |
| GiG VaI 190 | TGT Cys | CTT Leu | ATC lie | AAA Lys | CCG Pro 195 | TGG Trp | GTC VaI | CAT His | AAC Asn | CAG GIn 200 | GAT Asp |
| GmC Asp | GCG Ala 2C5 | ATC lie | AAC Asu | TCT Ser | GÜC GIy | GAG Giu 210 | GTAAGCAGCT |
916 952
988 1024 1060 1096 1132 1168 1204 1240 1276 1312 1348 1384 1420 1456 1492 1529
| TGG | ATTTGATTTG | CATGTATGTT | GATATTCTAT j | \G | GGC | -55- 297 448 | 1571 | |
| TTGAACATAG | Trp | TTT ACC | AGC GGC ACC | TGC ATT | GGC | GIy | 1607 | |
| AAC ATC | Phe Thr | Ser GIy Thr | Cys He | GIy | ||||
| Asn lie | CTC | 215 | 220 | TTC | ||||
| Leu | TCC ATC | GGT TCT GTC | GGC GGC | CGC | Ser | 1643 | ||
| CAC GGT | 225 | Ser Me | GIy Ser VaI | GIy GIy | Arg | |||
| His GIy | GTT | 230 | TCC | |||||
| VaI | GTC AAG | AAC GTC ACT | ATC GAA | CAC | Ser | 1679 | ||
| AAC AAC. | VaI Lys | Asn VaI Thr | lie GIu | His | ||||
| Asn Asn | AGC | 240 | 245 | AAG | ||||
| 235 | Ser | AAT TCC | GAG AAC GCC | GTC CGG | ATT | Lys | 1715 | |
| ACC GTG | Asn Ser | GIu Asn Ala | VaI Arg | lie | ||||
| Thr VaI | TCT | 250 | 255 | ATC | ||||
| Ser | GGT GCC | ACT GGT TCC | GTG TCT | GAG | lie | 1751 | ||
| ACC GTC | GIy Ala | Thr GIy Ser | VaI Ser | GIu | 270 | |||
| Thr VaI | TCC | 265 | GAT | |||||
| 260 | Ser | AAC ATT | GTC ATG TCC | GGC ATC | TCC | Asp | 1787 | |
| ACA TAC | Asn lie | VaI Met Ser | GIy lie | Ser | ||||
| Thr Tvr | GTC | 275 | 280 | GGC | ||||
| VaI | GTT ATC | CAG CAG GAT | TAC GAG | GAT | G"y | 1823 | ||
| TAC GGC | 285 | VaI lie | Gin Gin Asp | Tyr GIu | Asp | |||
| Tyr GIy | ACG | 290 | ATT | |||||
| Thr | GGT AAG | CCC ACG AAC | GGT GTC | ACT | lie | 1859 | ||
| AAG CCT | GIy Lys | Pro Thr Asn | GIy VaI | Thr | ||||
| Lys Pro | GTC | 300 | 305 | GTG | ||||
| 295 | VaI | AAG CTG | GAG AGC GTG | ACT GGT | ACT | VaI | 1895 | |
| ACG GAT | Lys Leu | GIu Ser VaI | Thr GIy | Thr | ||||
| Thr Asp | AAG | 310 | 315 | GGA | ||||
| Lys | GCT ACT | GAT ATC TAT | CTC CTT | TGC | GIy | 1931 | ||
| GAT AGT | Ala Thr | Asp lie Ty | Leu Leu | Cys | 330 | |||
| Asp Ser | AGC | 325 | GTG | |||||
| 320 | Ser | TGC TCG | GAC TGG ACT | TGG GAC | GAT | VaI | 1967 | |
| TCT GGT | Cys Ser | Asp Trp Thr | Trp Asp | Asp | ||||
| Ser GIy | ACT | 335 | 340 | AAA | ||||
| Thr | GGA GGA | AAG AAG TCT | ACT GCT | TGC | Lys | 2003 | ||
| AAG GTC | 345 | GIy GIy | Lys Lys Ser | Thr Ala | Cys | |||
| Lys VaI | CCT | 350 | ||||||
| Pro | TCG GTG | GCT TCT TGC | TAG GTTAGTAGGT | 2040 | ||||
| AAC TAC | Ser VaI | Ala Ser Cys | ||||||
| Asn Tyr | 360 362 | |||||||
| 355 | TAGCACTTGC | TAACATGCAT | . TCTTGAG | 2080 | ||||
| TGTTCGGTTG | GATTTGTGAA | ATTATCGGTG | TG,.. ..~*AGA | 2120 | ||||
| GGGTCAAATG | AGTAAGATTC | AGTGGTGGCA | GCGTGTATAG | 2160 | ||||
| GATGGTGTCC | TGTTATTTAT | CGCATAACTC | TATATATCAA | 2 200 | ||||
| CTCTATACAA | AAGAGAACCT | GCCTTCAGCC | ACAAATAACC | 2 240 | ||||
| ATACTCGATT | G^AGGTATCA | GATTCCGGGA | ACCCCTACCT | 2280 | ||||
| AAGTTCCTCG | CGTTGCAGAT | AGTTCTGCTG | GTAAATCAGG | 2320 | ||||
| AGCCTTACTC | GAATTACGAT | GCCAGCAAAT | TCACCGCTAC | 2360 | ||||
| ATGGTATGCT | GCATAAAACA | TACGCCAGAA | GTGCAAGGGA | 2400 | ||||
| TCCAACCCGC | CAGCTGTGTC | TTCGCGCAAG | TAACTCTGCA | 2440 | ||||
| TAAAGACAGC | TCTGACATAG | TATAG CATC | TCTTCTACAC | 2480 | ||||
| TAATCCAGTT | TCCCTCTCCA | TAAACTCCCT | CACAGTAATA | 2520 | ||||
| CTTGGCAAAC | TCCCCTTCCC | GCCCTTGGCC | TTAAACGCCG | 2560 | ||||
| AGCGTCTCCC | CGCCGCAGCC | GTTTGAATCT | CCGTAGGCCC | 2600 | ||||
| CCTTCTTCAA | TACTCCCCAT | CCCTAAACTG | CGAATAAATA | 2640 | ||||
| ATTACCAAAG | GCTCCTGCTC | ACGCCAATAC | TCCCCTTTCG | 2680 | ||||
| AAAACATCCC | GTTCGGGTCC | GCTAGAACCT | GATACCGGGC | 2720 | ||||
| TATTCATGTC | ||||||||
| GTCACTATAC | CCATCACCGT | CAGCATCTAC | -56- 297 448 | 2760 | |
| TTTCTTGCCA | TCACGTAAAA | GATAATGATA | AGTAAAACCT | 2800 | |
| TCATCACTCA | AAACGTATTC | ACCACCTCCG | CCGATGAAAC | 2840 | |
| TACCAGAAAC | GACCCCTGAA | TCAGCCGTCT | ATTCCACCGC | 2880 | |
| AATATCACTC | CAAAAACCCC | ATGAACCAGA | TCCCCAAAGT | 2920 | |
| AACGGGTTAA | ACTGATCCAG | GGGAAATCTT | CTTTCCCGCC | 2960 | |
| CATCCTTCAT | GTCTTGTATG | TTAGATAACC | CTCAGAGTCA | 3000 | |
| CCAAAATGGC | GCCATCCGCC | GAATAAGTCG | GCGTAGTCCG | 3040 | |
| GGGAATGTGG | 3047 | ||||
| GCTCGAG | |||||
SEQIDNO.4
Sequenztyp: Nucleotid mit entsprechendem Polypeptid Sequenzlänge: 2304 Strangart: Doppelstrang Topologie: linear Molekültyp: genomisch Organismus-Originalquelle: Aspergillus niger N400 Unmittelbare experimentelle Quelle: pGW1910 (DSM 5943)
Merkmale: Gen pgaC mit der Codierung für A. niger N400-Präpro-Polygalacturonase C Von 1 bis 662: Promotorbereich von 663 bis 710: codierender Bereich für PGC-Signalpeptid von 663 bis 782: mutmaßlicher codierender Bereich für Präprosequenz von 783 bis 1 995: mutmaßlicher codierender Bereich für reife PGC von 927 bis 1 001: Intron von 1 428 bis 1 438: Intron von 1 614 bis 1 666: intron von 1 996 bis 1 998: Stoppcodon von 1 999 bis 2 304: S'-Nichtcodierender Bereich, Teil des Transkriptionsterminatorbereiches
| CCATGGCTGA | ATC | AACTTTGCCC | CTGACCTAGT | CCATTTCATT | CTT | GTG | 40 |
| TTATATAATG | He | CTGATGAGAT | ATGGTTCTTG | CACAACTATG | Leu 5 | VaI | 80 |
| CTTTTCCTCG | GTCGGTGCGT | AATGTATAGT | TCGTGGGTGG | GCT | 120 | ||
| TAAGGAAATT | CCT | CACCGACAGC | AACTCCCAGC | ATAACATGGA | Aia | ACG | 160 |
| GAAGAACCGA | Pro | TGAATGAGCA | GCGACAAACA | TGGTACCACA | Thr | 200 | |
| ATTCTTGAAT | 20 | AAGCATTTAG | ACTCCGGCTT | GGl 11111 CC | GTT | 240 | |
| GTTGCATTGG | CCT | CGCTGGTGTT | GTTCCTGCGC | ACGGTGCAAC | VaI | GCG | 280 |
| CGTTATCTCC | Pro | ACCAATGATT | ACCTGCAGAA | AGCCCATGGC | AIa | 320 | |
| TGCAACCACC | CAGCCGACTT | GAGTCCACCT | AACAGCATAC | AGG | 360 | ||
| TCAGCATACT | TGC | CGATGCTGGG | AATTACTTCA | GGTATGGTCG | Arg | TCC | 400 |
| GCTGAATATG | Cys | CAGTCGATTT | CCGGCGCCAG | GAACAGTCCG | 40 | Ser | 440 |
| GCCCCCTCAC | CACGGACATA | GACCCGCCAC | CAAAACGTCG | GCA | 480 | ||
| ATAGCGGCCT | AGC | CGCTTCGTCA | ACGACCATTT | TGCCCACCCC | AIa | ATC | 520 |
| TGACACCCAG | Ser | GAAAGACGTC | TTCCAATAAC | AATATAAAAG | Ne | E60 | |
| GGCGAGTCTT | GTCCTCTCAC | TTTCCGTCTT | TCGAGTATGC | ACA | 65 | 600 | |
| CTTGCCAGTT | CCCAACTTGA | CTTGAGACCT | CCCATTTCGG | Thr | 640 | ||
| TCATTTGTCA | CCCGCTATAA GA | ATG GTC | CGT CAG | 677 | |||
| Met VaI 1 | Arg GIn | ||||||
| ATC CTG | AGC AGT | CTG CTG GCA | GCT GTT | 713 | |||
| He Leu | Ser Ser | Leu Leu AIa | Ala VaI | ||||
| 10 | 15 | ||||||
| CGC GCG | GCC GAT | CCG GCT CAT | CCC ATG | 749 | |||
| Arg AIa | Ala Asp | Pro Ala His | Pro Met | ||||
| 25 | |||||||
| GAA GCG | GAC GTC | AAT TTG GTT | GAA AAG | 735 | |||
| GIu AIa | Asp VaI | Asn Leu VaI | GIu Lys | ||||
| 30 | 35 | ||||||
| ACT ACT | ACC TTC | TCG GGC TCC | GAA GGT | 821 | |||
| Thr Thr | Thr Phe | Ser GIy Ser | GIu GIy | ||||
| 45 | 50 | ||||||
| AAG GCC | AAG TCG | AAA ACC TCT | TGC TCC | 857 | |||
| Lys AIc | Lys Ser | Lys Thr Ser | Cys Ser | ||||
| 55 | 60 | ||||||
| TAC Tyr | CTG Leu | GGA GIy | TAT Tyr | TCC Ser | GAC Asp | GTG VaI 70 | ACT Thr | GCC Ala | GCC Ala | GTC VaI | CCA Pro | ATGTCTTATT | TCT Ser | GGC GIy 75 | GGA GIy | TAC Tyr | GAG GIu 100 | GCTGACGAT | GTG VaI | TGT Cys | GTG VaI | ACA Thr | ACC Thr | CTGGTAG | GGT GIy | AAC Asn | CAC His | 893 |
| CTT Leu | GAT Asp | CCT Pro 105 | CTC Leu 80 | TCT Ser | GAC Asp | CGT Arg | CTG Leu | AAT Asn | GAT Asp 85 | GGA GIy | ACC Thr | TCT Ser 110 | GGA GIy | ACT Thr | AGT Ser | GAA GIu | CAC His | TC Γ Ser 240 | GGT GIy | 926 | ||||||||
| GTACGTTCCC | GAG GIu | CGGGTGATTC | AGC Ser 120 | CTCACACCCA | GCG Ala | GTG VaI | CTC Leu | GAT Asp | 966 | |||||||||||||||||||
| ATCGCGTCAA | AGC Ser | TAGTACTGGC | TGG Trp | TGACAGATGT ACTAG | GGA GIy | GAG GIu 135 | GGT GIy | AAT Asn 125 | ATC lie 90 | TTC Phe | 1010 | |||||||||||||||||
| CAG Gin | AAA Lys | GAA GIu | ACC Thr 95 | CCC Pro | TTT Phe | TTC Phe | TTC Phe | TAT Tyr | GGC GIy | TGG Trp | GAA GIu | 1046 | ||||||||||||||||
| GGG GIy | ACC Thr | CTT Leu | GTG VaI | ACC Thr | GTT VaI | AAG Lys | AGC Ser | ATC lie 160 | GCC Ala | ATC lie | ACG Thr 115 | 1082 | ||||||||||||||||
| GTC VaI | TCT Ser 165 | GGG GIy | GAG GIu | CAG Gin | GAC Asp | TTC Phe 170 | AGC Ser | ATC lie | TAC Tyr | GGC GIy | GAT Asp | 1116 | ||||||||||||||||
| GGC GIy | GAT Asp | CGC Arg 130 | TGG Trp | ATG Met 180 | GAT Asp | GAT Asp | ATC lie | ACG Thr | GAT Asp | AAT Asn | GGT GIy | 1154 | ||||||||||||||||
| GGT GIy 140 | GAT Asp | ACA Thr | AAG Lys | ACG Thr | AAG Lys 145 | GAC Asp | CTC Leu 195 | GCC Ala | GTG VaI 185 | CAT His 150 | GAC Asp | 1190 | ||||||||||||||||
| TTG Leu | GGC GIy | TCT Ser | TCC Ser 155 | ATC lie | ATC He | (3AA GIu | AGC Ser | ACC Thr | GCC Aia | ATC lie | GAG GIu | 1226 | ||||||||||||||||
| AAC As η | ACA Thr | CCT Pro | GTG VaI | GAA GIu | GTG VaI | TAC Tyr | AAC Asn | CAA Gin 220 | TAT Tyr | GGC GIy | TCC Ser 175 | 1262 | ||||||||||||||||
| ΑΤΓ Thr | GCC Ala 225 | CTT Leu | ACC Thr | TCT Ser | ACT Thr | GAG GIu 230 | GTATGCGTCC | GAT Asp | GAT Asp | AAC Asn | 1298 | |||||||||||||||||
| ACG Thr | ATTGAGAGGA | GGT GIy 190 | GAC Asp | GAGGCGCCTT | GAC Asp | AAT Asn | ACG Thr | 1334 | ||||||||||||||||||||
| GAT Asp 200 | ATT lie | TTC Phe | GAC Asp | AGT Ser 235 | GGG GIy 205 | ATC Me 210 | ACG Thr | 1370 | ||||||||||||||||||||
| ATC lie | GGT GIy | GCC Ala 215 | ATC lie | GAC Asp | TGC Cys | 1406 | ||||||||||||||||||||||
| GTT VaI | ATC He | AAT As η | GGA GIy | CCTGGCACTG | 1447 | |||||||||||||||||||||||
| 1486 | ||||||||||||||||||||||||||||
| TTC Phe | Κ'522 |
| CTG | AAG | TCT | ATT | GGC | TAC | TCT | GTT | GGT | GAC | ACT | GGT | CGG | GAT | TTA | GCA | ATC | GAT | -58- 297 448 | |
| GGC | Leu | Lys | Ser | lie | GIy | Tyr | Ser | VaI | GIy | Asp | Thr | GIy | Arg | Asp | AIa | He | Asp | 1558 | |
| GIy | 250 | 255 | 275 | ||||||||||||||||
| 245 | ACT | GTC | GTC | AAG | AAC | CAT | GTG | ACG | TTT | ATT | GCC | TAT | GAT | GTC | GGC | TCC | GTC | AAT | |
| AAC | Thr | VaI | VaI | Lys | As η | His | VaI | Thr | Phe | lie | AIa | Tyr | Asp | VaI | GIy | Ser | VaI | Asn | 1594 |
| As η | 290 | 260 | 295 | 265 | 285 | ||||||||||||||
| CTC | GAT | AAG | TCC | CAG | ATT | CAA | GGTAAGGGAA | ATT | GAG | AGCATTTGAA | TTT | TCG | GAC | ||||||
| GTT | - Leu | Asp | Lys | Ser | Gin | He | GIn | He | GIu | Phe | Ser | Asp | 1632 | ||||||
| VaI | 270 | 305 | |||||||||||||||||
| CCATCCGTTT | ACC | GCCGTCCTCT | ACC | ACT | ACC | CAG | AAC | TAT | CGT | ||||||||||
| Thr | Thr | Thr | Thr | GIn | As η | Tyr | Arg | 1674 | |||||||||||
| AACGTATGCT | 320 | 310 | |||||||||||||||||
| ATC | GAT | ACC | ATC | CTC | AAC | ATC | GGG | GTA | CCG | AGC | |||||||||
| He | Asp | Thr | He | Leu | Asn | He | GIy | VaI | Pro | Ser | 1710 | ||||||||
| 280 | GGC | ||||||||||||||||||
| GAA | GAT | ACT | TAC | TGT | GIy | GAA | GTA | GTT | GGA | ACG | GCT | ||||||||
| GIu | Asp | Thr | Tyr | Cys | GIu | VaI | VaI | GIy | Thr | Ala | 174S | ||||||||
| GAG | 335 | 300 | |||||||||||||||||
| ACT | GAT | TAC | GGC | TGC | GIu | GAT | TGG | TAC | ATT | GCC | GAT | ||||||||
| Thr | Asp | Tyr | GIy | Cys | Asp | Trp | Ty. | lie | Ala | Asp | 1782 | ||||||||
| 350 | GTC | 355 | 345 | ||||||||||||||||
| GAC | AGC | TCC | AAG | GGC | VaI | AGT | GTC | ACT | TGG | ACT | ATC | ||||||||
| Asp | Ser | Ser | Lys | GIy | Ser | VaI | Thr | Trp | Thr | He | 1818 | ||||||||
| 315 | 365 | CCT | |||||||||||||||||
| ACG | AAT | TTT | GTG | TCC | Pro | AlT | AGC | AGT | GAC | GAC | TGT | ||||||||
| Thr | As η | Phe | VaI | Ser | lie | Ser | Ser | Asp | Asp | Cys | 1854 | ||||||||
| 325 | GAG | 380 | 370 | ||||||||||||||||
| GAA | GCCGTTGTGA | GAT | GAT | TTGGGGGAGA | GIu | TGTTCCCGGG | TGC | GAT | TTG | TGC | |||||||||
| GIu | UTTCGTTTAG | Asp | Asp | CCAGCCCTTT | 330 | CTGTTGAGTG | Cys | Asp | Leu | Cys | 1890 | ||||||||
| CTATACTGTC | 340 | GATTGTGTGT | ACC | GAGATTACTA | 383 | ||||||||||||||
| GGT | GGAAAGAGCA | GGC | AGC | GTGCATCCTA | Thr | TCTTTTATTC | TACTCTGGTC | GGC | |||||||||||
| GIy | GGGGTTGGCC | GIy | Ser | TACTAGTACA | TTGTACCCGA | GCCTGTTCTT | GIy | 1926 | |||||||||||
| GTGAAAGTAA | AGGGCTTACA | TCG | GAATTAGTCC | CCTTGCCCGA | 360 | ||||||||||||||
| GTG | ACAACTTTTA | GTG | ACT | TCAGAGCGCA | Ser | TCGGTCACGT | TTTGCCGGTC | TGC | |||||||||||
| VaI | GTATTGATCA | VaI | Thr | ATGAAGATAA | CTTGG | AGAGTCAACG | Cys | 196? | |||||||||||
| GGC | AGGAGCAAAG | ||||||||||||||||||
| CTT | GTT | CCC | GIy | CATGTTGAAA | TAG | ||||||||||||||
| Leu | VaI | Pro | 1998 | ||||||||||||||||
| 375 | GGG | ||||||||||||||||||
| GIy | |||||||||||||||||||
| 2 038 | |||||||||||||||||||
| 2078 | |||||||||||||||||||
| 2118 | |||||||||||||||||||
| 2158 | |||||||||||||||||||
| 2198 | |||||||||||||||||||
| 2 238 | |||||||||||||||||||
| 2278 | |||||||||||||||||||
| 2304 |
Claims (48)
1. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Mol· iküis, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die ausgewählt wird aus
a) dem Aspergillus niger-DNA-Einschub von pGW1800 oder pGW1900,
b) einer DNA-Sequenz, die auf den codierenden Bereich für die reife PGII oder PGI hybridisiert, welche in einem DNA-Einschub nach a) umfaßt ist und welche ein Strukturgen für ein Polypeptid mit Galacturonase- oder Polygalacturonaseaktivität und wahlweise einen Promotor, einen codierenden Bereich für ein Signal- oder Leader-Peptid und/oder einen Transkriptionsterminator umfaßt,
c) einem Derivat einer DNA-Sequenz nach der Definition in a) oder b) oder
d) einer DNA-Sequenz, welche für eine reife PG oder deren Signalpeptid oder deren Leader-Peptid codiert und welche innerhalb der Bedeutung des genetischen Codes mit Bezug auf eine DNA-Sequenz nach a), b) oder c) degeneriert ist,
dadurch gekennzeichnet, daß es die Schritte umfaßt
a) Isolierung von genomischer DNA aus geeigneten Pilzzellen und Auswahl der gewünschten DNA, z. B. unter Verwendung einer DNA-Sonde oder unter Verwendung eines geeigneten Expressionssystems und Sichten nach dem gewünschten Polypeptid, oder
b) Isolierung von mRNA aus geeigneten Pilzzellen, Auswahl der gewünschten mRNA, z. B. durch Hybridisation mit einer DNA-Sonde oder durch Expression in einem geeigneten ·: Expressionssystem und Sichten nach der Expression des gewünschten Polypeptide, Prägarierung von einzelsträngiger cDNA, die komplementär zu dieser mRNA ist, dann daraus von doppelsträngiger cDNA, oder
c) Isolierung von cDNA aus einer cDNA-Bank und Auswahl der gewünschten cDNA, z. B. unter Verwendung einer DNA-Sonde oder eines geeigneten Expressionssystems und Sichten nach der Expression des gewünschten Polypeptide, oder/und
d) Einbeziehung der doppelsträngigen DNA aus Schritt a), b) oder c) in einen angemessenen Vektor,
e) Transformation von angemessenen Wirtszellen mit dem gewonnenen Hybridvektor,
f) Auswahl von transformierten Wirtszellen, welche die gewünschte DNA enthalten, aus nichttransformierten Wirtszellen oder Vervielfachen der transformierten Wirtszelle und, wenn erforderlich,
g) Isolierung der gewünschten DNA und/oder Umwandlung der DNA in einen Mutanten oder dessen Fragment.
2. Verfahren nach Anspruch 1 für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, welches den Aspergillus niger-DNA-Einschub von pGW1800 oder pGWi900 umfaßt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, welches eine DNA-Sequenz umfaßt, die auf den codierenden Bereich für die reife PGII oder PGI hybridisiert, der von einem DNA-Einschub von pGW 1800 oder pGW 1900 umfaßt wird, der für ein Polypeptid mit Galacturonase- oder Polygalacturonase-Aktivität und/oder ein Signal- oder Leader-Peptid codiert und/oder Promotor- und/oder Transkriptionsterminatoraktivität hat.
4. Verfahren nach Anspruch 1 für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, welches ein Derivat des Aspergillus niger-DNA-Einschubs von pGW 1800 oder pGW 1900 oder einer DNA-Sequenz, die auf den codierenden Bereich für die reife PGII oder PGI hybridisiert, der von einem DNA-Einschub von pGW1800 oder pGW1900 umfaßt wird, der für ein Polypeptid mit Galacturonase- oder Polygalacturonase-Aktivität und/oder ein Signal- oder Leader-Peptid codiert und/oder Promotor- und/oder Transkriptionsterminatoraktivität hat, umfaßt.
5. Verfahren nach Anspruch 4 für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, welches einen Einschub oder dessen Fragment von einem Vektor umfaßt, der aus der Gruppe von Vektoren ausgewählt wird, die aus XPG-A9, -A10,-A 43,-B 4,-B 35,-B 36,-CVC16,-C 20,-C 37,-D 8,-D11, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 und -Y33, pGW1756, pGW1910, pGW1800, pGWi900 und pGW 1756 gebildet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4 für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, welches ein DNA-Fragment umfaßt, das abgeleitet wird vom A. nlger-Einschub von pGW 1800 oder pGW1900 oder einer DNA-Sequenz, die auf den codierenden Bereich für die reife PGII oder PGI hybridisiert, der durch einen der DNA-Einschübe umfaßt wird, und ein Strukturgen und/oder ein Leader- oder
Signalpeptid codiert und/oder eine Sequenz mit Promotor- und/oder Transkriptionsterminatoraktivität umfaßt.
7. Verfahren nach Anspruch 4 für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, welches ein DNA-Fragment mit Promotoraktivität umfaßt, das von einem Einschub eines Vektors abgeleitet wurde, der aus der Gruppe von Vektoren ausgewählt wird, die aus XPG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35, -836,-01,-016, -C 20, -037,-08,-011,-012, -E 6, -E38,-F5, -G17, -G27.-X31 und-Y33,pGW1910, pGW 1800, pGW 1900 und pGW1756 gebildet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 4 für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, welches ein DNA-Fragment mit der Codierung für ein Leader-Peptid umfaßt, das von einem Einschub eines Vektors abgeleitet wird, der aus der Gruppe von Vektoren ausgewählt wird, die aus XPG-A9, -A10, -A43,-B4,-635,-636,-01,-016,-C 20,-C37,-D8,-D11,-012,-E^-ESe1-FB,-G17,-G 27,-X31 und -Y33, pGW1910, pGW1800, pGW1900 und pGW1756 gebildet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 4 für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, welches ein DNA-Fragment mit der Codierung für ein Signalpeptid umfaßt, das von einem Einschub eines Vektors abgeleitet wird, der aus der Gruppe von Vektoren ausgewählt wird, die aus XPG-A9, -A10, -A43, -84, -835, -B36, -CI1 -016, -C20, -C37, -D8, -011,-012, -E6, -E38, -F5, -G17, -G 27, -X31 und -Y33, pGW1910, pGW1800, pGW1900 und pGW1756 gebildet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 4 für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, welches ein DNA-Fragment mit Transkriptionsterminatoraktivität umfaßt, das von einem Einschub eines Vektors abgeleitet wird, der aus der Gruppe von Vektoren ausgewählt wird, die aus XPG-A9, -A10, -A43,-64,-B 35,-B36,-01,-016,-020,-037,-08,-011,-012,-E 6,-E38,-F5,-G17,-G 27,-X31 und -Y33, pGW1910, pGW1800, pGW1900 und pGW 1756 gebildet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 4 für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, welches ein DNA-Fragment umfaßt, das ein Strukturgen für eine Galacturonase oder Polygalacturonase codiert, oder dessen Fragment mit Galacturonase- oder Polygalacturonase-Aktivität, abgeleitet von einem Einschub eines Vektors, der aus der Gruppe von Vektoren ausgewählt wird, die aus XPG-A9, ^10,^43,-84,-835,-836,-01, -016, -C 20, -037,-08,-011,-012,-EO, ^38,-Fo, -G17, -G27,-X31 und -Y33, pGW1910, pGW1800,pGW1900 und pGW1756 gebildet wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1 für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls nach Anspruch 1, welches eine Expressionskassette ist.
13. Vorfahren nach Anspruch 1 für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das ein Hybridvektor ist.
14. Verfahren nach Anspruch 1 für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das aus der Gruppe von Vektoren ausgewählt wird, die aus pGW1800, pGW1900, pGW1756, pGW1910, XPG-A9, XPG-A10, XPG-A43, XPG-B4, XPG-B35, XPG-B 36, XPG-C1, XPG-C16, XPG-C20, XPG-C37, XPG-D8, XPG-D11, XPG-D12, XPG-E 6, XPG-E 38, XPG-F 5, XPG-G17, XPG-G 27, XPG-X31 und XPG-Y33 gebildet wird.
15. Verfahren für die Her./ -llung eines DNA-Moleküls, welches ein Gen für eine PG oder dessen funktionelles Fragment umfaßt, das aus einem PG-produzierenden Fadenpilzstamm isoliert wird, dadurch gekennzeichnet, daß es die Schritte umfaßt
a) Isolierung von genomischer DNA aus geeigneten Pilzzellen und Auswahl der gewünschten DNA, z. B. unter Verwendung einer DNA-Sonde oder unter Verwendung eines geeigneten Expressionssystems und Sichten nach der Expression des gewünschten Polypeptide, oder
b) Isolierung von mRNA aus geeigneten Pilzzellen, Auswahl der gewünschten mRNA, z. B. durch Hybridisieren mit einer DNA-Sonde oder durch Expression in einem geeigneten Expressionssystem und Sichten nach der Expression des gewünschten Polypeptide, Präparierung von einzelständiger cDNA, die komplementär zu dieser mRNA ist, und von doppelsträngiger cDNA au3 dieser oder
c) Isolierung von cDNA aus einer cDNA-Bank und Auswahl der gewünschten cDNA, z. B. unter Verwendung einer DNA-Sonde oder unter Venwendung eines geeigneten Expressionssystems und Sichten nach der Expression des gewünschten Polypeptide, oder/und
d) Einbeziehung der doppelsträngigen DNA aus Schritt a), b) oder c) in einen angemessenen Vektor,
e) Transformation von geeigneten Wirtszellen mit dem gewonnenen Hybridvektor,
f) Auswahl von transformierten Wirtszellen, welche die gewünschte DNA enthalten, aus nichttransformierten Wirtszellen oder Vervielfachung der transformierten Wirtszelle und, wenn erforderlich,
g) Isolierung der gewünschten DNA und/oder Umwandlung der DNA in einen Mutanten oder dessen Fragment.
16. Verfahren nach Anspruch 15 für die Herstellung eines DNA-Moleküls, das aus Aspergilius spec, isoliert wird.
17. Verfahren nach Anspruch 15 für die Herstellung eines DNA-Moleküls, weichesein Einschubeines Hybridvektors ist, der aus der Gruppe von Hybridvektoren ausgewählt wird, die aus pGW1800, pGW 1900, pGW 1756, pGW 1910, XPG-A9, XPG-A10, XPG-A43, XPG-B4, XPG-B35, APG-B36, XPG-C16, XPG-C20, XPG-C37, XPG-D8, XPG-D11, XPG-D12, XPG-E6, XPG-E 38, XPG-F5, XPG-G17, XPG-27, XPG-X31 und XPG-Y33 gebildet wird, oder dessen Fragment, das den Promotorbereich eines PG-Gens oder einen codierenden Bereich für ein Signalpeptid, Leader-Peptid, eine Präpro-PG, PG oder ein Fragment einer PG mit Galacturonase- oder Polygalacturonase-Aktivität oder einen Transkriptionsterminatorbereich eines PG-Gens umfaßt.
18. Verfahren für die Herstellung eines Wirts, der mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die ausgewählt wird aus
a) dem Aspergilius niger-DNA-Einschub von pGW 1800 oder pGW 1900,
b) einer DNA-Sequenz, die auf den codierenden Bereich für die reife PGII oder PGI hybridisiert, die durch einen DNA-Einschub von a) gebildet wird, und welche ein Strukturgen für ein Polypeptid mit Galacturonase- oder Polygalacturonaseaktivität und wahlweise einen Promotor, einen codierenden Bereich für ein Signal- oder Leader-Peptid und/oder einen Transkriptionsterminator umfaßt,
c) einem Derivat einer DNA-Sequenz nach der Definition in a) oder b) oder
d) einer DNA-Sequenz, welche eine reife PG oder deren Signalpeptid oder deren Leader-Peptid codiert und welche innerhalb der Bedeutung des genetischen Codes im Bezug auf eine DNA-Sequenz nach a), b) oder c) degeneriert ist,
dadurch gekennzeichnet, daß eine geeignete Wirtszelle unter transformierenden Bedingungen mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach der vorliegenden Erfindung, insbesondere einem Hybridvektor nach der vorliegenden Erfindung, wahlweise zusammen mit einem Selektionsmarker-Gen, behandelt und wahlweise die Transformanten ausgewählt wird.
19. Verfahren für die Herstellung eines Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, daß ein Struktur-Gen, das in eine Expressionskassette eingefügt wird, welche eine DNA-Sequenz umfaßt, die ausgewählt wird aus
a) dem Aspergilius niger-DNA-Einschub von pGW 1800 oder pGW 1900,
b) einer DNA-Sequenz, die auf den codierenden Bereich für die reife PGII oder PGI hybridisiert, der durch einen DNA-Einschub von a) umfaßt wird, und welche ein Struktur-Gen für ein Polypeptid mit Galacturonase- oder Polygalacturonase-Aktivität und wahlweise einen Promotor, einen codierenden Bereich für ein Signal- oder Leader-Peptid und/oder einen Transkriptionsterminator umfaßt,
c) einem Derivat einer DNA-Sequenz nach der Definition in a) oder b) oder
d) einer DNA-Sequenz, die für eine reife PG oder für deren Signalpeptid oder für deren Leader-Peptid codiert und die innerhalb der Bedeutung des genetischen Codes mit Bezug auf eine DNA-Sequenz nach a), b) oder c) degeneriert ist,
nach herkömmlichen Methoden in einem geeigneten Wirt ausgeprägt und das Polypeptid wahlweise auf herkömmliche Weise isoliert wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß ein Aspergilius nlger-Stamm eingesetzt wird.
21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß ein Aspergilius nidulans-Stamm eingesetzt wird.
22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Struktur-Gen das Hybridinterferon BDBB codiert.
23. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Strukturgen ein Polypeptid mit Galacturonase- oder Polygalacturonase-Aktivität codiert und von einer DNA-Sequenz abgeleitet wird, die ausgewählt wird aus
a) dem Aspergillus-niger-DNA-Einschub von pGW 1800 oder pGW 1900,
b) einer DNA-Sequenz, die auf den codierenden Bereich für die reife PGII oder PGI hybridisiert, der durch einen DNA-Einschub von a) umfaßt wird, und welche ein Struktur-Gen für ein Polypeptid mit Galacturonase- oder Polygalacturonase-Aktivität und wahlweise einen Promotor, einen
codierenden Bereich für ein Signal- oder Leader-Peptid und/oder einen Transkriptionsterminator umfaßt,
c) einem Derivat einer DNA-Sequenz nach der Definition in a) oder b) oder
d) einer DNA-Sequenz, die für eine reife PG oder für deren Signalpeptid oder für deren Leader-Peptid codiert und die innerhalb der Bedeutung des genetischen Codes mit Bezug auf eine DNA-Sequenz nach a), b) oder c) degeneriert ist.
24. Verfahren für die Herstellung einer einzelnen PG1dadurch gekennzeichnet, daß diese PG nach herkömmlichen Methoden aus einer Rohquelle gereinigt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß eine PG in gereinigter Form aus einem Enzymrohgemisch gereinigt wird, das aus Aspergillus niger gewonnen wurde.
26. Verfahren für die Herstellung einer einzelnen Galacturonase oder Polygalacturonase, die durch eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder deren Derivat mit Galacturonase- oder Polygalacturonase-Aktivität codiert wird, und deren biologisch akzeptable Salze.
27. Verfahren für die Herstellung einer enzymatischem Zusammensetzung, weiche ein Polypeptid nach Anspruch 26 oder deren Gemisch, wahlweise in einer festgelegten Kombination mit einem oder mehreren Enzymen mit einer anderen als PG-Aktivität, umfaßt.
28. Verfahren für die Verarbeitung von Pflanzenmaterial, bei welchem ein Polypeptid nach Anspruch 26 oder eine enzymatische Zusammensetzung nach Anspruch 27 eingesetzt wird.
29. Rekombinantes DNA-Molekül, welches eine DNA-Sequenz umfaßt, die ausgewählt wird aus
a) dem Aspergillus niger-DNA-Einschub von pGW1800 oder pGW1900,
b) einer DNA-Sequenz, die auf den codierenden Bereich für die reife PGII oder PGI hybridisiert, welche in einem DNA-Einschub nach a) umfaßt ist und welche ein Strukturgen für den Polypeptid mit Galacturonase- oder Polygalacturonaseaktivität und wahlweise einen Promotor, einen codierenden Bereich für ein Signal- oder Leader-Peptid und/oder einen Transkriptionsterminator umfaßt,
c) einem Derivat einer DNA-Sequenz nach der Definition in a) oder b) oder
d) einer Sequenz, welche für eine reife PG oder deren Signalpeptid oder deren Leader-Peptid codiert und welche innerhalb der Bedeutung des genetischen Codes mit Bezug auf eine DNA-Sequenz nach a), b) oder c) degeneriert ist.
30. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 29, welches den Aspergillus niger-DNA-Einschub von pGW1800 oder pGW1900 umfaßt.
31. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 29, welches eine DNA-Sequenz umfaßt, die auf den codierenden Bereich für die reife PGII oder PGI hybridisiert, der von einem DNA-Einschub von pGW1800 oder pGW1900 umfaßt wird, der für ein Polypeptid mit Galacturonase- oder Polygalacturonase-Aktivität und/oder ein Signal- oder Leader-Peptid codiert und/oder Promotor- und/oder Transkriptionsterminatoraktivität hat.
32. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 29, das ein Derivat des Aspergillus niger-DNA-Einschubs von pGW 1800 oder pGW 1900 oder eine DNA-Sequenz, die auf den codierenden Bereich für die reife PGII oder PGI hybridisiert, der von einem DNA-Einschub von pGW 1800 oder pGW 1900 umfaßt wird, der für ein Polypeptid mit Galacturonase-oder Polygalacturonase-Aktivität und/oder ein Signal- oder Leader-Peptid codiert und/oder Promotor- und/oder Transkriptionsterminatoraktivität hat, umfaßt.
33. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 32, das einen Einschub oder dessen Fragment von einem Vektor umfaßt, der aus der Gruppe von Vektoren ausgewählt wird, die aus XPG-A9, -A10, -A43,-B4,-635,-836,-01,-016,-C 20,-C 37,-08,-011,-012,-Ee, ^38,-Fo,-G17,-G 27,-X31 und -Y33, pGW1756, pGW1910, pGW1800, pGWi900 und pGW1756 gebildet wird.
34. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 32, das ein DNA-Fragment umfaßt, das abgeleitet wird vom A. niger-Einschub von pGW1800 oder pGW1900 oder einer DNS-Sequenz, die auf den codierenden Bereich für die reife PGII oder PGI hybridisiert, der durch einen der DNA-Einschübe umfaßt wird, und ein Struktur-gen und/oder ein Leader- oder Signalpeptid codiert und/oder eine Sequenz mit Promotor- und/oder Transkriptionsterminaioraktivität umfaßt.
35. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 34, das oin DNA-Fragrnent mit Promotoraktivität umfaßt, das von einem Einschub eines Vektors abgeleitet wurde, der aus der Gruppe von Vektoren ausgewählt wird, die aus APG-A9, -A10, ^43,-64,-835,-836,-01,-016,-020,-C 37,-08,-DH, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 und -Y33, pGW1910, pGW1800, pGW1900 und pGW1756 gebildet wird.
36. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 34, dasein DNA-Fragment mit der Codierung für ein Leader-Peptid umfaßt, das von einem Einschub eines Vektors abgeleitet wird, der aus der Gruppe von Vektoren ausgewählt wird, die aus XPG-A9, -A10, -A 43, -B4, -B 35, -B 36, -01,-016, -C 20, -C37, -D8, -D11, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 und -Y33, pGW1910, pGW1800, pGWi900 und pGW 1756 gebildet wird.
37. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 34, das ein DNA-Fragment mit der Codierung für ein Signalpeptid umfaßt, das von einem Einschub eines Vektors abgeleitet wird, der aus der Gruppe von Vektoren ausgewählt wird, die ausXPG-AO, ^10,^43,-84,-835,-836,-01,-016,-020,-037, -D8,-P11,-D12,-E6,-E38,-F5,-G17,-G27,-X31 und-Y33, pGW1910, pGW1800, pGWi900 und pGW 1756 gebildet wird.
38. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 34, das ein DNA-Fragment mit Transkriptionsterminatoraktivität umfaßt, das von einem Einschub eines Vektors abgeleitet wird, der aus der Gruppe von Vektoren ausgewählt wird, die aus XPG-A9, -A10, -A43, -B4, -B35, -B 36, -C1, -016, -C20, -037, -D8, -D11, -D12,-E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 und -Y33, pGWi910, pGW1800,pGWi900 und pGW1756gebildetwird.
39. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 34, das ein DNA-Fragment umfaßt, das ein Strukturgen für eine Galacturonase oder Polygalacturonase oder dessen Fragment mit Galacturonase- oder Polygalacturonase-Aktivität codiert, abgeleitet von einem Einschub eines Vektors, der aus der Gruppe von Vektoren ausgewählt wird, die aus XPG-A9, -A10, -A43, -B4, -B 35, -B36, -01, -016, -C 20, -037,-08,-011,-012, -E 6,-E38,-F5, -G17, -G 27, -X31 und-Y33,pGW1910, pGW1800,pGWi900 und pGW1756 gebildet wird.
40. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 29, das eine Expressionskassette ist.
41. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 29, das ein Hybridvektor ist.
42. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 41, das aus der Gruppe von Vektoren ausgewählt wird, die aus pGW1800, pGW1900, pGW1756, pGWi910, XPG-A9, XPG-AIO, XPG-A43, XPG-B4, XPG-B 35, XPG-B 36, XPG-C1, XPG-C16, XPG-C 20, XPG-C 37, XPG-D 8, XPG-D11, XPG-D12, XPG-E 6, XPG-E38, XPG-F5, XPG-G17, XPG-G 27, XPG-X31 und XPG-Y33 gebildet wird.
43. DNA-Molekül, das ein Gen für eine PG oder dessen funktionelles Fragment umfaßt, das aus einem PG-produzierenden Fadenpilzstamm isoliert wird.
44. DNA-Molekül nach Anspruch 43, das aus Aspergillus spec, isoliert wird.
45. DNA-Molekül nach Anspruch 43, das ein Einschub eines Hybridvektors ist, der aus der Gruppe von Hybridvektoren ausgewählt wird, die aus pGW1800, pGW1900, pGW1756, pGW1910, XPG-A9, XPG-A10, XPG-A 43, XPG-B 4, XPG-B 35, XPG-B 36, XPG-C1, XPG-C16, XPG-C 20, XPG-C 37, XPG-D 8, XPG-D11, XPG-D12, XPG-E6, XPG-E38, XPG-F5, XPG-G17, XPG-G 27, XPG-X31 und XPG-Y33 gebildet wird, oder dessen Fragment, das den Promotorbereich eines PG-Gens oder einen codierenden Bereich für ein Signalpeptid, Leader-Peptid, eine Präpro-PG, PG oder ein Fragment einer PG mit Galacturonase- oder Polygalacturonase-Aktivität oder einen Transkriptionsterminatorbereich eines PG-Gens umfaßt.
46. Wirt, der mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 29 transformiert wird.
47. Einzelne Galacturonase oder Polygalacturonase, die durch eine DNA-Sequenz nach Anspruch 29 oder deren Derivat mit Galacturonase- oder Polygalacturonase-Aktivität codiert wird, und deren biologisch akzeptable Salze.
48. Enzymatische Zusammensetzung, die ein Polypeptid nach Anspruch 47 oder dessen Gemisch, wahlweise in einer festgelegten Kombination mit einem oder mehreren Enzymen mit einer anderen als PG-Aktivität, umfaßt.
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Family Applications (1)
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